JP2004339233A - 拮抗的特性を有する血管内皮細胞増殖因子の変異体 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】変異体血管内皮増殖因子ポリペプチドを含むVEGFアンタゴニスト分子であって、天然VEGFアミノ酸配列の第51位及び/又は第61位の少なくとも1つのシステイン残基のアミノ酸置換(ただし、セリン残基への置換は除く)を含み、該アミノ酸置換が別の血管内皮増殖因子ポリペプチドモノマーと適切に二量体化する能力を阻害し、該アンタゴニスト分子が血管内皮増殖因子応答を有意に誘導することなく血管内皮増殖因子レセプターと結合することができるアンタゴニスト分子を、内皮細胞増殖阻害剤又は血管形成阻害剤として使用する。
【選択図】なし
Description
本発明は、血管内皮細胞増殖因子(以下、時にVEGFと称する)の特定の変異体であって、VEGFレセプターの細胞表面にVEGF応答を誘導することなく結合しそして占拠し、それにより天然のVEGFタンパク質の生物学的活性を拮抗する変異体に向けられる。本発明はさらに、そのような変異体VEGFアンタゴニストの製造法および天然のVEGFタンパク質と異なった治療的および薬学的特性を有する薬学的に活性な物質を製造するための、そのような変異体を使用する方法、組成物およびアッセイにも向けられる。
哺乳類血管系の二つの主要細胞成分は内皮細胞と平滑筋細胞である。内皮細胞は哺乳動物の全血管の内面の裏打ちを形成し、血液と組織の間に非血栓形成性界面を構成している。したがって内皮細胞の増殖は新しい毛細管と血管の発達にとって重要な成分であり、そしてまたそのような発達は哺乳類組織の成長および/または再生にとって必須の過程である。
とKDR(キナーゼドメイン領域)によって媒介されることが知られている。DeVriesら,Science 225:989-991(1992)およびTermanら,Oncogene 6:1677-1683(1991)。外傷などにより細胞が酸素欠乏状態になると、それらの細胞内でVEGF生産が増大し、それらがそれぞれのレセプターに結合することにより、最終的な生物学的効果のシグナルとなる。次に、このシグナルは血管透過性を増大させ、細胞が分裂、拡張して新しい血管経路を形成する。このように、天然のVEGFは、血管内皮細胞へ結合することによって機能し血管増殖を誘導する。
上記の研究の成果が本発明の主題である。我々はここに、天然VEGFアミノ酸配列のアミノ酸第51位および/または第60位のシステイン残基の突然変異または修飾が機能して、適切に二量体化する能力を失っているVEGF変異体を生じることをここに示す。具体的には、別のアミノ酸の第51位および/または第60位のシステインの置換またはその部位のシステインの修飾は、ジスルフィド結合の形成にあずかるアミノ酸の能力を阻止する。しかし、これらの変異体は、細胞表面VEGFレセプターにVEGF応答を誘導することなしに結合しそして占拠し、それにより天然VEGF二量体の生物学的活性を効果的に阻害する能力を保持している。
本発明は、血管内皮細胞のVEGFレセプターに結合することが可能であり、それによってそれらの結合部位を占拠し、分裂誘発性、血管新生または他の天然VEGFタンパク質の生物学的活性を阻害することが可能な、天然VEGFの変異体を提供する。したがって、本発明の新規アンタゴニスト分子は、望ましくない過剰な血管新生によって特徴付けられる、例えば腫瘍、および特に充実性悪性腫瘍、慢性関節リウマチ、乾癬、アテローム硬化、糖尿病性のおよびその他の網膜症、水晶体後部線維増殖症、加齢性黄斑変性、血管新生緑内障、血管腫、甲状腺増殖症(グレーヴス病を含む)、角膜およびその他の組織移植、および慢性炎症が含まれる疾患または障害の処置に有用である。本発明のアンタゴニストはさらに、脳腫瘍に関連する水腫、悪性のメイグス症候群に関連する腹水、肺炎症、ネフローゼ症候群、心膜液(心膜炎に関連するもの)および胸水などの望ましくない血管透過性によって特徴付けられる疾患または障害の処置についても有用である。
本発明の新規VEGF変異体ポリペプチドは、適切に二量体化することができないように天然のVEGFアミノ酸配列内のシステイン残基における少なくとも1つのアミノ酸突然変異を作出することにより、組換え的に生じさせることができる。典型的な突然変異には、例えば、置換、挿入、および/または欠失が含まれる。目的のシステイン残基を、ジスルフィド結合にあずかることができないように化学的に修飾することもできる。
その他の更なる態様では、本発明は、本発明の複製可能な発現ベクターでトランスフェクトされ、それらベクターを発現することが可能な宿主細胞に向けられる。
更なる別の態様では、本発明は、腫瘍の増殖の抑制など、抗血管新生が望まれる適応症を処置するための、薬学的に許容し得る担体と混合した治療上有効量の本発明のアンタゴニスト分子を含む組成物に向けられる。本発明の別の態様は、治療上有効量の上記組成物を投与することを含む処置の方法に向けられる。
本明細書で使用する、「血管内皮細胞増殖因子」または「VEGF」とは、米国特許5,332,671に定義される天然の哺乳類増殖因子をいい、第1図のヒトアミノ酸配列、およびそのような増殖因子の、天然に存在するアレル形態および処理を施された形態を含む。VEGFタンパク質は、モノマー形態またはマルチマー(例えば二量体)形態のいずれかで存在し得る。「適切な二量体化」は、天然VEGFモノマー間で普通に起こる二量体化である。
Asp D アスパラギン酸 Ile I イソロイシン
Thr T スレオニン Leu L ロイシン
Ser S セリン Tyr Y チロシン
Glu E グルタミン酸 Phe F フェニルアラニン
Pro P プロリン His H ヒスチジン
Gly G グリシン Lys K リジン
Ala A アラニン Arg R アルギニン
Cys C システイン Trp W トリプトファン
Val V バリン Gln Q グルタミン
Met M メチオニン Asn N アスパラギン
酸性残基:アスパラギン酸、グルタミン酸
塩基性残基:リジン、アルギニン、ヒスチジン
II.非荷電アミノ酸
親水性残基:セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン
脂肪族残基:グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン
非極性残基:システイン、メチオニン、プロリン
芳香族残基:フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン
「置換(的)」変異体は、対応する配列中の少なくとも1つのアミノ酸残基が除去され、その代わりに同じ位置に異なるアミノ酸が挿入されているものをいう。
置換はただ一つ(分子中のただ1個のアミノ酸が置換されている)でもよく、複数(同じ分子中の2またはそれ以上のアミノ酸が置換されている)でもよい。
本明細書において「細胞」「細胞系」および「細胞培養」という用語は相互交換可能に使用され、これらはいずれも子孫を包含する。したがって「形質転換体」または「形質転換細胞」という用語は、最初の対象細胞とそこから派生する培養を、その継代数にかかわらず包含する。また、すべての子孫は、意図的な突然変異または偶然の突然変異により、そのDNAの内容が正確には同一でない場合もあると解される。元の形質転換細胞中で選択の対象としたものと同じ機能を持つ突然変異体子孫が含まれる。明確な指定を意図する場合は、その文脈から明らかになるだろう。
1.グリコシル化
本発明のVEGF変異体は、N結合を介してグリコシル化される可能性を持ち、しかも天然VEGF分子では通常はグリコシル化されていないアミノ酸配列を少なくとも1つは持ちうる。
a. 付加的な突然変異
本明細書に記載のVEGF変異体を簡略化して呼ぶ場合、番号は第1Aおよび1B図に示した推定成熟VEGFタンパク質のアミノ酸配列に沿ってアミノ酸残基/位置を表わすことを注記しておく。
本発明のVEGF変異体に関しては、例えば、様々なアミノ酸残基に対して化学的修飾を行うことができる。
VEGFのアミノ酸配列変異体およびその変異体は、DNAの突然変異によって調製することもできる。そのような変異体には、例えば、図1に示すアミノ酸配列内の残基の欠失、挿入または置換がある。最終構築物が所望の活性を持つ限り、欠失、挿入および置換を任意に組み合せて施すことにより、最終構築物を得ることもできる。明らかに、変異体をコードするDNAに施される突然変異は、その配列を読み枠外に置いてはならず、また二次mRNA構造を形成しうる相補領域を生み出さないことが好ましい(EP 75,444A参照)。
そのようなクローンを選択した後、突然変異したタンパク質領域を取り出し、タンパク質生産に適したベクター(一般的には、適当な宿主の形質転換に使用しうるタイプの発現ベクター)に入れる。
アミノ酸配列欠失は、通常、約1〜30残基、より好ましくは1〜10残基の範囲であり、一般的には連続的である。
元の残基 典型的置換
Ala(A) gly;ser
Arg(R) lys
Asn(N) gln;his
Asp(D) glu
Cys(c) ser
Gln(Q) asn
Glu(E) asp
Gly(G) ala;pro
His(H) asn;gln
Ile(I) leu;val
Leu(L) ile;val
Lys(K) arg;gln;glu
Met(M) leu;tyr;ile
Phe(F) met;leu;tyr
Ser(S) thr
Thr(T) ser
Trp(W) tyr
Tyr(Y) trp;phe
Val(V) ile;leu
望ましい変異VEGF分子は、組換え法を含む任意の技術で調製することができる。また本明細書において、単離されたDNAとは、3'-および/または5'-隣接領域を伴うもしくは伴わない化学合成されたDNA、cDNA、染色体DNAまたは染色体外DNAを意味するものと解される。本明細書に記載の望ましいVEGFは、組換え細胞培養での合成によって作成されることが好ましい。
本明細書に開示するベクターと方法は、広範囲にわたる原核生物および真核性物を宿主細胞とする使用に適している。
所望のコード配列と制御配列を含有する好適なベクターの構築には、一般的な連結技術が使用される。単離されたプラスミドまたはDNA断片を切断し、加工処理し、望ましい形態に再連結することにより、必要なプラスミドを調製する。
切断した断片のサイズ分離は、Goeddelら,Nuleic Acids Res.8,4057(1980)に記載の6%ポリアクリルアミドゲルを用いて行なうことができる。
使用しうるその他の技術については実施例の前の節に記述する。
本発明のVEGFアンタゴニストには、血管内皮に関係する数多くの治療的用途がある。このような用途には、例えば、内皮細胞増殖および血管新生の調節に使用することができる形成された物品への組み込みが含まれる。さらに、これら物品によって腫瘍の侵入と転移を調節することができる。本発明のポリペプチドがそれに対して使用し得る、その他の障害については上に記載している。
上述の適応症に対して、治療すべき特定の疾患または障害、個々の患者の状態、VEGFアンタゴニストの送達部位、投与法、およびその他実施者の知る因子を考慮して、良好な医療行為に合致する方法で変異VEGFアンタゴニスト分子を製剤化し、投与する。したがって、本明細書においてVEGFの「治療上有効な量」とは、処置される状態の緩和または治癒、もしくはその悪化の予防または軽減に有効な量であり、具体的には、血管内皮の増殖をin vivoで実質的に阻害するに足る量である。
ゲル化に有用なポリエチレングリコールは、一般に、適当な粘度を持つように混合された低分子量および高分子量ポリエチレングリコールの混合物である。例えば、分子量400〜600のポリエチレングリコールと分子量1500のものとの混合物は、ペーストが得られるように適当な比率で混合すると、この目的に有効である。
本発明の化合物は、医薬的に有用な組成物を製造するための既知の方法に従って、本発明のVEGFアンタゴニストを医薬的に許容できる担体賦形剤と混合することにより、製剤化することができる。好ましい担体賦形剤とそれらの製剤は、ヒト血清アルブミンなどの他のヒトタンパク質を含めて、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences,16版,1980,Mack Publishing Co.,Osloら編(その開示は参考文献とし本明細書の一部を構成する)などに記述されている。本明細書に記載のVEGFアンタゴニストは非経口的に、あるいは有効な形態で血流にそれを確実に送達する他の方法によって投与することができる。
しかし、一般に注入法が利用できず、また根底にある疾患が一般に重篤であるため、緊急医療施設に関係する用途では、静脈内ボーラスのように多少大きい初期投与量を与えることが一般に望ましいだろう。
から入手した。G25セファデックスカラム(PD−10)と125I標識プロテインAはそれぞれPharmacia(ニュージャージー州ピスカタウェイ)とAmersham(イリノイ州アーリントンハイツ)から入手した。ウシ血清アルブミン(BSA)とウサギIgG抗ヒトIgG(Fc特異的)は、それぞれCappel(ノースカロライナ州ダーラム)とCalbiochem(カリフォルニア州ラジョラ)から購入した。プラスミドベクター(pRK5)、コンピテント大腸菌細胞(DH5aとCJ236)、合成オリゴヌクレオチド、細胞培養培地、精製されたCHO由来のVEGF165、VEGF165に対するモノクローナル抗体(Mate A4.6.1、2E3、4D7、SC3およびSF8)とポリクローナル抗体は、Genentech,Inc:(カリフォルニア州サウスサンフランシスコ)で調製された。FLT-1、flkIおよびKDRレセプター-IgGキメラの構築、発現および精製は、Parkら,J.Biol.Chem. 269,25646-25654(1994)に記述されている通りとした。
ウシ下垂体濾胞細胞[Ferraraら,Meth.Enzymol.(前掲)とFerraraら,Am.J.Physiol.(前掲)に記述されているようにして得た]から全RNAを抽出し[Ullrichら,Science 196,1313−1317(1977)]、そのポリアデニル化mRNA画分をオリゴ(dT)-セルロースクロマトグラフィーによって単離した。Avivら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69,1408-1412(1971)。dT12−18またはランダムヘキサマーdN6でプライミングすることにより、cDNAを調製した[Wickensら,J.Biol.Chem. 253,2483-2495(1978)]。AmershamのcDNAキットを用いて二本鎖cDNAを合成し、非対象EcoRIリンカー[Norrisら,Gene 7,355-362(1979)]を用いてEkoRIメチラーゼ処理の必要を避けた点以外は既述のようにして[Huynhら,DNA Cloning Techniques,A Practical Approach,Glover編(IRL,オックスフォード,1985)]、得られたcDNAをEcoRIで切断したlgt10にサブクリーニングした。
5'-CCTATGGCTGAAGGCGGCCAGAAGCCTCACGAAGTGGTGAAGTTCATGGACGTGTATCA-3'
の合成オリゴヌクレオチドプローブと、20%ホルムアミド、5×SSC、50mMリン酸ナトリウムpH6.8、0.1%ピロリン酸ナトリウム、5×デンハルト溶液および50mg/mlサケ精子DNA中、42℃でハイブリッド形成させ、2×SSC、0.1%SDS中42℃で洗浄した。
最終発現ベクターpRK5.vegf.6を、I.vegf.6とpRK5から構築した。pRK5とpRK5.vegf.6の構築について以下に詳述する。
A.1. pF8CISの構築
出発プラスミドpF8CISの最初の三要素構築を以下に説明する。
1) 最終ベクターのアンピシリン耐性マーカーと複製起点は、プラスミドpML(Lusky,M.およびBotchen,M.,Nature,293,79[1981])の変種である出発プラスミドpUC13pMLから得た。pUC13pMLは、pUC13(Vieira,J.およびMessing,J.,Gene,19,259(1981))のポリリンカーをpMLのEcoRIおよびHindIII部位に移植することによって構築した。もう1つの出発プラスミドpUC8-CMVは、CMVエンハンサー、プロモーターおよびスプライス供与配列の供給源である。pUC8-CMVは、CMVエンハンサー、プロモーターおよびスプライス供与配列の約800ヌクレオチドをpUC8の平滑末端化したPstIおよびSphI部位に挿入することによって構築した。Vieira,J.およびMessing,J.,前掲。合成BamHI-HindIIIリンカー(New England Biolabsから市販されている)をBamI付着末端に連結してHindIII部位を作成した。この連結の後、HindIII-HincII消化を行なった。この消化により、CMVエンハンサー、プロモーターおよびスプライス供与部位を含有する約800bpの断片が得られた。ゲル単離の後、この800bp断片をpUC13pMLの2900bp断片に連結した。pF8CISの構築に必要な断片は、上記中間体プラスミドをSalIとHindIIIで消化することによって得た。この3123bp断片は、pUC13pML由来の複製起点、アンピシリン耐性マーカーと、エンハンサー、プロモーターおよびスプライス供与部位を含むCMVの制御配列とを含有する。
1 5' AGTAGCAAGCTTGACGTGTGGCAGGCTTGA...
31 GATCTGGCCATACACTTGAGTGACAATGA...
60 CATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGT...
88 GTCCACTCCCAG 3'
1 3' CAGGTGAGGGTGCAGCTTGACGTCGTCGGA 5'
DNAポリメラーゼI(クレノー断片)で合成断片を補充し、二本鎖断片を作成した。Wartell,R.M.およびW.S.Reznikoff,Gene,9,307(1980)。次に、PstIとHindIIIの二重消化を行なった。この合成リンカーをpUC13(VeiraおよびMessing,前掲)のPstIおよびHindIII部位にクローニングした。上記合成オリゴヌクレオチドを含有するクローン、標識pUCIg.10を、PstIで消化した。この断片に、PstI-ClaIリンカーを使用してClaI部位を加えた。HindIIIによる消化の後、Ig可変領域スプライス受容部位とIgイントロンの一部を含む118bp断片をゲル単離した。
pCIS2.8c28Dは、因子VIIIの73kdサブユニットに結合した因子VIIIの90kdサブユニットからなる。この90kdはアミノ酸1〜740、73kdサブユニットはアミノ酸1690〜2332を含む。この構築物は、次に挙げる断片の3要素連結によって調製した:a)pF8CISの12617bp ClaI-SstII断片(dam-株から単離し、BAP処理したもの)、b)pF8CISの216bp SstII-PstI断片、およびc)キナーゼ処理した短いPstI-ClaI合成オリゴヌクレオチド。
得られたプラスミドpCIS2.8c28Dは、4要素連結によって構築した。融合プラスミドをBamIとPstIで切断し、443bp断片を単離した。4要素連結の残りの3断片は、1)pSVEFVIII(欧州特許公開番号160,457)の1944bp ClaI-BamHI、2)pSVEFVIIIの2202bp BamI-XbaI断片をさらにPstIで部分的消化し、1786bpPstI-XbaI断片を単離したもの、および3)pCIS2.8c24Dの5828bp XbaI-ClaI BAP断片である。pCIS2.8c28Dの正確な融合接合領域中に生じる変異の翻訳されたDNA配列を決定した。これは相関する。
pRK5を構築する際の出発プラスミドはpCIS2.8c28Dとした。第1節から第6節までの塩基番号はpCIS2.8c28Dを指し、CMVプロモーターの前にあるEcoRI部位の最初のTを塩基1とする。サイトメガロウイルスの初期プロモーターとイントロンおよびSV40起点とポリAシグナルを別々のプラスミドにのせた。
2. 部位特異的突然変異誘発法によってSP6(Green,MRら,Cell 32,681-694[1983])プロモーターを挿入するために、pCMVE/Pから一本鎖DNAを調製した。SP6プロモーターの-69から+5までの配列を含有する合成110マー(Nucleic Acids Res.,12,7041[1984]参照)を、CMVE/P配列に対応するオリゴマーの両側の18bp断片と共に使用した。突然変異誘発を一般的な技術で行い、標識110マーを用いて、高および低ストリンジェンシーでスクリーニングした。6つの候補クローンを選択し、配列決定した。陽性クローンを同定し、pCMVE/PSP6と名づけた。
3. 例えばSP6 RNAポリメラーゼを加え、適当なサイズのRNAを調べることによってSP6プロモーターを調べたところ、活性であることがわかった。
4. pCMVE/P(第1段階)とpCMVE/PSP6(第2段階)中のpUC118のClal部位(912)からSmaI部位までの位置を包含するように、Cla-NotI-Smaアダプターを合成した。このアダプターをpUC118のClaI-SmaI部位に連結し、正しいクローンをスクリーニングした。このリンカーを両方配列決定し、クローンをpCMVE/PSP6-LおよびpCMVE/P-Lと名づけた。
5. pCMVE/PSP6-LをSmaI(リンカー/pUC118接合部にある)とHindIII(pUC118中)で切断した。下記pSVORAADRI 11のHpaI(5573)-HindIII(6136)断片をpCMVE/PSP6-LのSmaI-HindIIIに挿入した。この連結物をスクリーニングし、クローンを単離して、pCMVE/PSP6-L-SVORAADRIと名づけた。
a)SV40起点とポリAシグナルをpCIS2.8c28DからXmnI(5475)-HindIII(6136)断片として単離し、pUC119(VieiraおよびMessing,前掲に記載)のHindIII部位からSmaI部位までにクローニングした。このクローンをpSVORAAと名づけた。
b)EcoRIによる部分消化とクレノーによる充填により、5716のEcoRI部位を除去した。充填後の自己連結によって得たコロニーをスクリーニングし、正しいクローンを単離して、pSVORAADRI 11と名づけた。EcoRI部位の欠失を配列決定で調べたところ、正しいことがわかった。
c)pSVORAADRI 11のHpaI(5573)-HindIII(6136)断片を単離し、pCMVE/PSP6-L(上記4参照)に挿入した。
6. pCMVE/PSP6-L-SVOrAADRI(第5段階)を9999のEcoRIで切断し、平滑末端化し、自己連結させた。EcoRI部位を持たないクローンを同定し、pRKと名づけた。
7. pRKをSmaIとBamIで切断した。これをクレノーで充填し、再連結した。コロニーをスクリーニングした。陽性クローンを同定し、pRKDBam/Sma3と名づけた。
8. pRKDBam/Sma3のHindIII部位を、コンバーターを用いてHpaI部位に変換した。(コンバーターとは、ある制限部位を他の制限部位に変えるために使用されるDNAの断片をいう。この場合は、一端がHindIII付着末端に相補的で、他端がHpaIの認識部位を持つ。)陽性クローンを同定し、pRKDBam/Sma,HIII-HapI 1と名づけた。
9. pRKBam/Sma,HIII-HpaI 1をPstIとNotIで切断し、そこにEcoRI-HindIIIおよびHindIII-EcoRIリンカーを連結した。各リンカーについてクローンを発見した。しかし、沢山のHpaIコンバーターが入り過ぎていることもわかった(2以上のコンバーターPvuI 1部位を生む)。したがって、これらのクローンをHpaIで切断し、自己連結させる必要があった。
10. RI-HIIIクローン3とHIII-RIクローン5をHpaIで切断し、希釈し、自己連結させた。陽性体を同定した。そのRI-HIIIクローンをpRK5と名づけた。
クローンI.vegf.6をEcoRIで処理し、そのEcoRI挿入物を単離し、EcoRIによるpRK5の消化とその大断片の単離によって得たpRK5のベクター断片に連結した。これら断片の2要素連結により、発現ベクターpRK5.vegf.6を得て、VEGFコード配列がプロモーターに対して正しい向きにあるものをスクリーニングした。
基本pRK5ベクターの構築に関するさらなる詳細は、1994年7月26日に発行された米国特許5,332,671から得ることができ、この特許は、参考のため本明細書の一部を特別に構成する。
VEGF165のcDNAを含有するベクターSDVF165を得た。VEGF165のcDNAを、Hind IIIとEco RIによる制限消化によってSDVF165から単離した。この単離された挿入物を、pRK5プラスミド中にEco RI部位とHind III部位が存在することを利用して、pRK5プラスミドに連結した。得られたプラスミドをコンピテントCJ236大腸菌細胞に形質転換して、部位特異的突然変異用の鋳型を作成した。次に、これに対応する突然変異部位を含むオリゴヌクレオチドを調製し(下記参照)、Bio-Rad Muta-Gene突然変異誘発キットを用いて、試験管内部位特異的突然変異誘発操作を既知の手法に従って行なった。配列決定によって突然変異部位が最終発現ベクターに組込まれたこと確認した後、一過性発現のために、得られたベクターを293ヒト腎臓細胞にトランスフェクションした。
最終突然変異産物を作成するために、以下のオリゴヌクレオチドを調製した。
こうして前記表1の左列に示したオリゴヌクレオチドによる挿入体を製造し、「突然変異」と題する左列の下に示した表示に従ってVEGF分子の対応する突然変異体を製造した。化合物の命名は慣例的命名法に従ったものである。そこで最初の化合物についてはその突然変異体は「C51D」と記する。これはVEGF分子で第51位のアミノ酸のシステイン(C)残基が第51位にアスパラギン酸(D)を挿入するように突然変異したことを意味する。
VEGF変異体のVEGFレセプターへの結合−第2図に示す天然VEGF二量体およびVEGF変異体ポリペプチドの、KDRおよびFLT−1レセプターとの結合能を試験した。レセプター結合アッセイは前記のごとく行なった。KDRレセプターとの結合について得られた結果を第3および第4図に示す。
VEGFおよびその変異体による有糸分裂誘発刺激−上記の通り、第2図に示したVEGF変異体はKDRおよびFLT−1両レセプターとの結合能があることが示されたので、これら変異体の内皮細胞に対する有糸分裂誘発能について試験した。細胞分裂促進アッセイは上記のごとく行なった。このアッセイの結果を第7図に示す。
C51D、C60DモノマーのVEGF誘発内皮細胞増殖阻害能−該モノマーの、内皮細胞のVEGF誘発増殖阻害能を測定するために計画されたアッセイにはC51D、C60Dモノマーポリペプチドを用いた。簡単には、内皮細胞を3ng/mL VEGFと、異なる量のA461抗VEGFモノクローナル抗体またはC51D、C60Dモノマーポリペプチドいずれかの存在下で培養した。各インヒビターの上皮細胞増殖阻害効果を示す結果を第8図に示す。
上記の説明は本発明の実施に使用できる具体的方法を詳述したものである。これらの具体的方法を詳述しおえたので、当業者には、本発明の成果を利用して同じ知見を得るのに確実な代替法を案出する方法が十分にわかるだろう。しかし上述の詳細は、その全範囲を限定するものではなく、本発明の範囲は添付の請求の範囲の適法な解釈によってのみ決定されるべきである。ここに引用した文書はすべて特に参考文献として本明細書の一部を構成するものとする。
Claims (4)
- 変異体血管内皮増殖因子ポリペプチドを含むVEGFアンタゴニスト分子であって、天然VEGFアミノ酸配列の第51位及び/又は第60位の少なくとも1つのシステイン残基のアミノ酸置換(ただし、セリン残基への置換は除く)を含み、該アミノ酸置換が別の血管内皮増殖因子ポリペプチドモノマーと適切に二量体化する該変異体ポリペプチドの能力を阻害し、該アンタゴニスト分子が血管内皮増殖因子応答を有意に誘導することなく血管内皮増殖因子レセプターと結合することができるアンタゴニスト分子を含んでなる、内皮細胞増殖阻害剤。
- 変異体血管内皮増殖因子ポリペプチドを含むVEGFアンタゴニスト分子であって、天然VEGFアミノ酸配列の第51位及び/又は第60位の少なくとも1つのシステイン残基のアミノ酸修飾(ただし、セリン残基への置換は除く)を含み、該アミノ酸修飾が別の血管内皮増殖因子ポリペプチドモノマーと適切に二量体化する該変異体ポリペプチドの能力を阻害し、該アンタゴニスト分子が血管内皮増殖因子応答を有意に誘導することなく血管内皮増殖因子レセプターと結合することができるアンタゴニスト分子を含んでなる、内皮細胞増殖阻害剤。
- 変異体血管内皮増殖因子ポリペプチドを含むVEGFアンタゴニスト分子であって、天然VEGFアミノ酸配列の第51位及び/又は第60位の少なくとも1つのシステイン残基のアミノ酸置換(ただし、セリン残基への置換は除く)を含み、該アミノ酸置換が別の血管内皮増殖因子ポリペプチドモノマーと適切に二量体化する該変異体ポリペプチドの能力を阻害し、該アンタゴニスト分子が血管内皮増殖因子応答を有意に誘導することなく血管内皮増殖因子レセプターと結合することができるアンタゴニスト分子を含んでなる、血管形成阻害剤。
- 変異体血管内皮増殖因子ポリペプチドを含むVEGFアンタゴニスト分子であって、天然VEGFアミノ酸配列の第51位及び/又は第60位の少なくとも1つのシステイン残基のアミノ酸修飾(ただし、セリン残基への置換は除く)を含み、該アミノ酸修飾が別の血管内皮増殖因子ポリペプチドモノマーと適切に二量体化する該変異体ポリペプチドの能力を阻害し、該アンタゴニスト分子が血管内皮増殖因子応答を有意に誘導することなく血管内皮増殖因子レセプターと結合することができるアンタゴニスト分子を含んでなる、血管形成阻害剤。
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