DE69727149T2

DE69727149T2 - Varianten des vaskulären endothelzellwachsumsfaktors mit antagonistischer wirkung

Info

Publication number: DE69727149T2
Application number: DE69727149T
Authority: DE
Inventors: A. Bruce KEYT; Hung Francis NGUYEN; Napoleone Ferrara
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1996-10-17
Filing date: 1997-10-10
Publication date: 2004-10-28
Anticipated expiration: 2017-10-11
Also published as: US20070238659A1; AU718327B2; CA2267661C; ATE257485T1; JP2004339233A; PT931092E; JP2000507456A; EP0931092B1; WO1998016551A3; AU5152398A; WO1998016551A2; US6750044B1; EP0931092A2; DE69727149D1; DK0931092T3; ES2214640T3; US20040152636A1; CA2267661A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft spezielle Varianten des Gefäßendothelzellen-Wachstumsfaktors (hiernach manchmal als VEGF bezeichnet), der Zelloberflächen-VEGF-Rezeptoren bindet und besetzt, ohne eine VEGF-Reaktion zu induzieren, wodurch die biologische Aktivität des nativen VEGF-Proteins antagonisiert wird. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Verfahren zum Herstellen solcher VEGF-Antagonisten-Varianten und Verfahren, Zusammensetzungen und Tests, die solche Varianten zur Produktion pharmazeutisch aktiver Materialien mit therapeutischen und pharmakologischen, sich vom nativen VEGF-Protein unterscheidenden Eigenschaften einsetzen.
Hintergrund der Erfindung
Die beiden Hauptzellkomponenten des Säugetier-Gefäßsystems sind die Endothel- und Glattmuskelzellen. Endothelzellen bilden Auskleidung der inneren Oberfläche aller Blutgefäße im Säugetier und stellen eine nicht-thrombogene Grenzfläche zwischen Blut und Gewebe dar. Daher ist die Vermehrung von Endothelzellen eine wichtige Komponente für die Entwicklung neuer Kapillaren und Blutgefäße, die ihrerseits ein notwendiger Prozess für das Wachstum und/oder die Regenerierung von Säugetiergeweben ist.
Ein Protein, von dem gezeigt worden ist, dass es eine äußerst wichtige Rolle bei der Unterstützung der Endothelzellen-Vermehrung und -Angiogenese spielt, ist der Gefäßendothelzellen-Wachstumsfaktor (VEGF). VEGF ist ein Heparin-bindender, Endothelzellen-spezifischer Wachstumsfaktor, der ursprünglich aus Medium identifiziert und gereinigt wurde, das durch Rinder-Hypophysen-Follikel- oder Follikelstern- (FS-) Zellen konditioniert war. Ferrara und Henzel, Biochem. Biophys. Res. Comm. 161, 851–858 (1989). Natürlich vorkommendes VEGF ist ein dimeres Protein mit einer scheinbaren Molmasse von ungefähr 46 kDa, wobei jede Untereinheit eine scheinbare Molmasse von ungefähr 23 kDa aufweist. Die normale Dimerisierung zwischen individuellen nativen VEGF-Monomeren erfolgt über die Bildung von Disulfidbindungen zwischen den Cysteinresten, die sich an der Aminosäureposition 51 einer monomeren Einheit befinden, die an den Cysteinrest an Aminosäure-Position 60 der anderen monomeren Einheit binden, und umgekehrt. Human-VEGF wird in einer Vielzahl von Geweben in mehreren homodimeren Formen exprimiert (121, 165, 189 und 206 Aminosäuren je Monomer), wobei jede Form als Ergebnis alternativer Spleißung eines einzelnen RNA-Transkripts hervorgeht. Beispielsweise ist VEGF₁₂₁ ein lösliches Mitogen, das Heparin nicht bindet, wogegen die längeren VEGF-Formen Heparin mit fortschreitend höherer Affinität binden.
Biochemische Analysen haben gezeigt, dass das native VEGF-Dimer eine starke mitogene Spezifität für Gefäßendothelzellen zeigt. Beispielsweise unterstützten Medien, die durch Human-VEGF-cDNA transfizierte Zellen konditioniert waren, die Vermehrung von Kapillar-Endothelzellen, wogegen durch Kontrollen konditionierte Medien dies nicht taten. Leung et al., Science 246, 1306 (1989). Demnach fördert das native VEGF-Dimer bekanntermaßen die Gefäßendothelzellen-Vermehrung und -Angiogenese, einen Prozess, der die Bildung neuer Blutgefäße aus bereits bestehendem Endothel umfasst. Als solches kann nativer VEGF für die therapeutische Behandlung zahlreicher Leiden zweckdienlich sein, bei denen eine wachstumsfördernde Aktivität auf die Gefäßendothelzellen von Bedeutung ist, beispielsweise bei Geschwüren, Gefäßverletzungen und Myokardinfarkt.
Die Endothelzellen-Vermehrungsaktivität des VEGF-Dimers wird bekanntermaßen von zwei hochaffinen Tyrosinkinase-Rezeptoren, flt-1 (FMS-artige Tyrosinkinase) und KDR (Kinase-Domänen-Region), vermittelt, die nur an der Oberfläche von Gefäßendothelzellen vorkommen. DeVries et al., Science 225, 989–991 (1992) und Terman et al., Oncogene 6, 1677–1683 (1991). Da Zellen aufgrund von Trauma und dergleichen an Sauerstoff verarmen, steigt die VEGF-Produktion in solchen Zellen, worin das erzeugte VEGF-Protein anschließend an seine entsprechenden Zelloberflächenrezeptoren bindet, um die letztendliche biologische Wirkung zu signalisieren. Das Signal erhöht dann die Gefäßdurchlässigkeit, und die Zellen teilen sich und wachsen, um neue Gefäßwege zu bilden. Folglich ist es die Funktion von nativem VEGF, die Gefäßvermehrung über die Bindung an Endothelzellen-spezifische Rezeptoren zu induzieren.
Obwohl die VEGF-induzerte Gefäßendothelzellen-Vermehrung unter gewissen Umständen erwünscht ist, sind Gefäßendothelzellen-Vermehrung und -Angiogenese ebenfalls wichtige Komponenten einer Reihe von Krankheiten und Störungen. Solche Krankheiten und Störungen umfassen Tumorwachstum und Metastase, Rheumatoidarthritis, Psoriasis, Atherosklerose, diabetische Retinopathie, retrolentale Fibroplasie, neovaskuläres Glaukom, altersbedingte Macula-Degeneration, Hämangiome, Immunabstoßung von transplantiertem Hornhautgewebe und anderen Geweben und chronische Entzündung. Offensichtlich möchte man bei Individuen, die an irgendeiner dieser Störungen leiden, über ein Mittel für die Hemmung oder zumindest für eine wesentliche Verminderung der Endothelzellen-Vermehrungsaktivität des nativen dimeren VEGF-Proteins verfügen.
Über ein Mittel zur Hemmung der nativen VEGF-Aktivität zu verfügen ist aus einer Reihe von Gründen wichtig. Beispielsweise scheint im speziellen Fall des Tumorzellenwachstums die Angiogenese für den Übergang von Hyperplasie zu Neoplasie und für die Bereitstellung von Nahrung für den wachsenden massiven Tumor entscheidend. Folkman et al., Nature 339, 58 (1989). Angiogenese ermöglicht es Tumoren auch, mit dem Gefäßbett des Wirts in Kontakt zu stehen, was einen Weg für die Metastasierung von Tumorzellen bereitstellen kann. Beweise für die Rolle der Angiogenese bei der Tumormetastase werden beispielsweise von Untersuchungen geliefert, die eine Korrelation zwischen der Anzahl und Dichte von Mikrogefäßen in histologischen Schnitten invasiver Human-Brustkarzinome und der tatsächlichen Anwesenheit entfernter Metastasen zeigen. Weidner et al., New Engl. J. Med. 324, 1 (1991). Folglich ist einer der möglichen Mechanismen für die wirksame Behandlung neoplastischer Tumoren die Hemmung oder wesentliche Verminderung der Endothelzellenvermehrenden und -angiogenen Aktivität des nativen dimeren VEGF-Proteins. Daher ist es angesichts der Rolle, die VEGF-induziertes Gefäßendothelzellen-Wachstum und -Angiogenese bei vielen Krankheiten und Störungen spielen, wünschenswert, ein Mittel zur Herabsetzung oder wesentlichen Hemmung einer oder mehrerer der biologischen Wirkungen des nativen VEGF-Proteins, beispielsweise der mitogenen oder angiogenen Wirkung davon, zu besitzen. Folglich basiert die vorliegende Erfindung auf Forschung, die die Identifizierung neuer VEGF-Varianten-Polypeptide beabsichtigt, die zur Hemmung einer oder mehrerer der biologischen Aktivitäten des nativen VEGF fähig sind. Im Speziellen basiert die vorliegende Erfindung auf der Identifizierung von VEGF-Varianten, die zur Bindung und Belegung von Zelloberflächen-VEGF-Rezeptoren fähig sind, ohne eine typische VEGF-Reaktion zu induzieren, wodurch die Wirkungen des nativen VEGF wirksam herabgesetzt und wesentlich gehemmt werden. Es ist postuliert worden, dass man, wenn man solche VEGF-Varianten herstellen könnte, solche Varianten in Fällen der Tumorbehandlung verwenden könnte, um die Tumoren für eine vorgesehene Rückbildung auszuhungern.
Es war ein weiteres Ziel dieser Forschung, VEGF-Varianten zu produzieren, die die Fähigkeit verlieren, über die Bildung kovalenter Cystein-Cystein-Disulfidbindungen richtig zu dimerisieren. Solche Varianten umfassen Varianten-VEGF-Monomere, denen die Fähigkeit fehlt, über die Bildung von Cystein-Cystein-Disulfidbindungen zu dimerisieren, und Varianten-VEGF-Monomere, die über die Bildung von zumindest einer Cystein-Cystein-Disulfidbindung dimerisieren könnten, worin sich jedoch zumindest eine Disulfidbindung von derjenigen unterscheidet, die im nativen VEGF-Dimer existiert. Solche Varianten besitzen die Fähigkeit, Zelloberflächen-VEGF-Rezeptoren ohne Induktion einer VEGF-Reaktion zu binden und diese zu belegen, wodurch sie mit nativem VEGF um die Bindung an die Rezeptoren konkurrieren und die biologische Aktivität des nativen VEGF-Dimers antagonistisch hemmen.
Pötgens et al., J. Biol. Chem. 269, 52 (1994), zeigten eine verminderte Dimerisierung von VEGF-Mutanten durch Substitution der Cysteinreste 2 bis 5 des VEGF der Wildform durch Serinreste. Jedoch zeigten die resultierenden, gebildeten Monomere nach wie vor eine partielle Aktivität an VEGF-Rezeptoren.
Als weitere Ziele können die VEGF-Varianten der vorliegenden Erfindung in Testsystemen verwendet werden, um kleine Agonisten- und Antagonistenmoleküle für eine beabsichtigte therapeutische Verwendung zu entdecken.
Die Ergebnisse der oben beschriebenen Forschung sind der Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Die Erfinder beweisen hierin, dass die Mutation oder Modifizierung der Cysteinreste an Aminosäurepositionen 51 und/oder 60 der nativen VEGF-Aminosäuresequenz die Funktion erfüllt, VEGF-Varianten zu produzieren, die die Fähigkeit zur richtigen Dimerisierung verlieren. Im Speziellen unterbindet die Substitution von Cystein an Positionen 51 und/oder 60 durch eine andere Aminosäure oder die Modifizierung des Cysteins an dieser Stelle die Fähigkeit dieser Aminosäure, die Bildung einer Disulfidbindung einzugehen. Diese Varianten behalten jedoch die Fähigkeit bei, an Zelloberflächen-VEGF-Rezeptoren zu binden und diese zu belegen, ohne eine VEGF-Reaktion zu induzieren, wodurch die biologische Aktivität des nativen VEGF-Dimers wirksam gehemmt wird.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt Varianten des nativen VEGF-Proteins bereit, wie sie in den Ansprüchen definiert sind, die zur Bindung an einen VEGF-Rezeptor an der Oberfläche von Gefäßendothelzellen fähig sind, wodurch diese Bindungsstellen belegt und die mitogenen, angiogenen oder anderen biologischen Eigenschaften des nativen VEGF-Proteins gehemmt werden. Die neuen Antagonistenmoleküle der vorliegenden Erfindung sind daher für die Behandlung von Krankheiten oder Störungen zweckdienlich, die durch unerwünschte, übermäßige Gefäßbildung gekennzeichnet sind, einschließlich beispielsweise Tumoren und insbesondere massiver bösartiger Tumoren, Rheumatoidarthritis, Psoriasis, Atherosklerose, diabetischer und anderer Retinopathien, retrolentaler Fibroplasie, altersbedingter Macula-Degeneration, neovaskulärem Glaukom, Hämangiome, Schilddrüsen-Hyperplasien (einschließlich Basedow-Krankheit), Hornhaut- oder anderer Gewebetransplantation und chronischer Entzündung. Die Antagonisten der vorliegenden Erfindung sind ferner auch zur Be handlung von Krankheiten oder Störungen zweckdienlich, die durch unerwünschte Gefäßdurchlässigkeit gekennzeichnet sind, wie z. B. mit Gehirntumoren verbundene Ödeme, mit Malignitäten verbundene Bauchwassersucht, Meigs-Syndrom, Lungenentzündung, nephrotisches Syndrom, Perikarderguss (wie z. B. jener, der mit Perikarditis verbunden ist) und Pleuraerguss.
Die Varianten-VEGF-Polypeptide der Antagonistenmoleküle der vorliegenden Erfindung umfassen Aminosäuremodifizierungen von zumindest einem Cysteinrest, der an Aminosäurepositionen 51 und/oder 60 der nativen VEGF-Aminosäuresequenz vorhanden ist, worin die Modifizierung dieses/r Cysteinreste(s) bewirkt, dass das Polypeptid unfähig ist, mit einem anderen VEGF-Polypeptid richtig zu dimerisieren.
Die neuen VEGF-Variantenpolypeptide der vorliegenden Erfindung können rekombinant erzeugt werden, indem zumindest eine Aminosäuremutation an einem Cysteinrest in der nativen VEGF-Aminosäuresequenz erzeugt wird, so dass die Variante zur richtigen Dimerisierung unfähig ist. Typische Mutationen umfassen beispielsweise Substitutionen, Insertionen und/oder Deletionen. Der/die Cysteinrest(e) von Interesse kann/können auch chemisch modifiziert werden, so dass er/sie zur Eingehung einer Disulfidbindung unfähig ist/sind.
In anderen Ausführungsformen betrifft die vorliegende Erfindung isolierte Nucleinsäuresequenzen, die für neue VEGF-Antagonistenmoleküle der vorliegenden Erfindung kodieren, und replizierbare Expressionsvektoren, die diese Nucleinsäuresequenzen umfassen.
In weiteren Ausführungsformen betrifft die vorliegende Erfindung Wirtszellen, die mit den replizierbaren Expressionsvektoren der vorliegenden Erfindung transfiziert und zur Expression dieser Vektoren fähig sind.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung zum Behandeln von Indikationen, worin eine Anti-Angiogenese er wünscht ist, wie z. B. bei der Arretierung von Tumorwachstum, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge des Antagonistenmoleküls der vorliegenden Erfindung, das mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger compoundiert ist. Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines VEGF-Antagonisten der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Krankheiten und Störungen, die durch unerwünschte übermäßige Gefäßbildung oder unerwünschte Gefäßdurchlässigkeit gekennzeichnet sind.
In Erweiterung der grundlegenden Voraussetzung der Entdeckung und Mutagenese des nativen VEGF-Polypeptids zur Herstellung von Varianten-VEGF-Polypeptiden betrifft die vorliegende Erfindung alle damit verbundenen, davon hergeleiteten Ausführungsformen, einschließlich rekombinanter DNA-Materialien und Verfahren zum Herstellen solcher Varianten, Materialien und Informationen für das Compoundieren solcher Varianten in eine pharmazeutisch fertig gestellte Form und Tests unter Verwendung solcher Varianten, um auf Kandidaten zu screenen, die agonistische oder antagonistische Eigenschaften in Bezug auf das native VEGF-Polypeptid aufweisen.
Kurzbeschreibung der Abbildungen
Die 1A und 1B stellen die Aminosäure- sowie DNA-Sequenz für ein natives VEGF-Protein mit 165 Aminosäuren dar. Vorhergesagte Aminosäuren des Proteins sind unter der DNA-Sequenz gezeigt und sind vom ersten Rest des N-Terminus der Proteinsequenz ausgehend nummeriert. Negative Aminosäurenummern beziehen sich auf die angenommene Leadersignalsequenz oder das angenommene Prä-Protein, während positive Nummern sich auf das mutmaßliche reife Protein beziehen.
2 ist eine schematische Grafik, die das native VEGF-Dimermolekül, welches Disulfidbindungen zwischen den Cysteinresten an den Aminosäurepositionen 51 und 60 bzw. 60 und 51 der monomeren Einheiten aufweist, das Varianten-Polypeptid C51D, worin der Cysteinrest an der Aminosäureposition 51 durch einen Asparaginsäurerest substituiert worden ist, was in der Bildung eines versetzten Dimers resul tiert, das Varianten-Polypeptid C60D, worin der Cysteinrest an der Aminosäureposition 60 durch einen Asparaginsäurerest substituiert worden ist, was in der Bildung eines versetzten Dimers resultiert, und das Varianten-Polypeptid C51D, C60D zeigt, worin die Cysteinreste an beiden Aminosäurepositionen 51 und 60 durch Asparaginsäurereste substituiert worden sind, wodurch Disulfidbindungsausbildung und Dimerisierung verhindert werden.
3 ist eine Grafik, die die Bindungsprofile des nativen VEGF-Dimers („
"), des versetzten, aus dem Varianten-VEGF-Polypeptid C60D gebildeten Dimers („⎕"), des versetzten, aus dem Varianten-VEGF-Polypeptid C51D gebildeten Dimers („o") und des monomeren VEGF-Variantenpolypeptids C51D, C60D („Δ") an den KDR-Rezeptor zeigen. Die Daten sind als Verhältnis von gebundenem zu freiem Polypeptid über die picomolare (pM) Konzentration des unmarkierten Kompetitors dargestellt.
4 ist eine Grafik, die die Bindungsprofile des nativen VEGF-Dimers („
") und des monomeren VEGF-Variantenpolypeptids C51D, C60D ("
") an den KDR-Rezeptor zeigt. Die Daten sind als Verhältnis von gebundenem zu freiem Polypeptid über die nanomolare (nM) Konzentration des unmarkierten VEGF-Kompetitors dargestellt.
5 ist eine Grafik, die die Bindungsprofile des nativen VEGF-Dimers („
"), des versetzten, aus dem Varianten-VEGF-Polypeptid C60D gebildeten Dimers („
"), des versetzten, aus dem Varianten-VEGF-Polypeptid C51D gebildeten Dimers („o") und des monomeren VEGF-Variantenpolypeptids C51D, C60D ("
") an den FLT-1-Rezeptor zeigen. Die Daten sind als Verhältnis von gebundenem zu freiem Polypeptid über die nanomolare (nM) Konzentration des unmarkierten VEGF-Kompetitors dargestellt.
6 ist eine Grafik, die die Bindungsprofile des nativen VEGF-Dimers („
") und des monomeren VEGF-Variantenpolypeptids C51D, C60D („
") an den FLT-1-Rezeptor zeigt. Die Daten sind als Verhältnis von gebundenem zu freiem Polypeptid über die nanomolare (nM) Konzentration des unmarkierten VEGF-Kompetitors dargestellt.
7 ist eine Grafik, die die Fähigkeit des nativen VEGF-Dimers („
"), des versetzten, aus dem Varianten-VEGF-Polypeptid C60D gebildeten Dimers („o"), des versetzten, aus dem Varianten-VEGF-Polypeptid C51D gebildeten Dimers („Δ") und des monomeren VEGF-Variantenpolypeptids C51D, C60D („⎕") nachweist, in Endothelzellen Mitogenese zu stimulieren. Die Daten sind als Gesamtzahl von Endothelzellen über die picomolare (pM) Konzentration des eingesetzten Polypeptids dargestellt.
8 ist eine Grafik, die die Fähigkeit des monoklonalen Anti-VEGF-Antikörpers A461 („
") oder des monomeren VEGF-Variantenpolypeptids C51D, C60D („
") nachweist, das VEGF-induzierte Wachstum von Endothelzellen zu hemmen. Die Daten sind als Gesamtzahl von Endothelzellen über das Verhältnis von Antikörper oder Monomerhemmstoff zum eingesetzten VEGF dargestellt.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Wie hierin verwendet, bezieht sich „Gefäßendothelzellen-Wachstumsfaktor" oder „VEGF" auf einen nativen Säugetier-Wachstumsfaktor, wie er im US-Patent 5.332.671 definiert ist, einschließlich der in 1 gezeigten Human-Aminosäuresequenz und natürlich auftretender Allele und prozessierter Formen solcher Wachstumsfaktoren. VEGF-Proteine können entweder in monomerer oder in multimerer (z. B. dimerer) Form vorliegen. „Richtige Dimerisierung" ist diejenige Dimerisierung, die normalerweise zwischen nativen VEGF-Monomeren auftritt.
Der Begriff „nativ" bezieht sich in Bezug auf ein VEGF-Protein auf natürlich auftretendes VEGF-Protein einer beliebigen Human- oder Nicht-Human-Spezies, mit oder ohne initiierendem Methionin, ob aus einer nativen Quelle gereinigt, synthstisiert, durch rekombinante DNA-Technologie oder durch irgendeine Kombination dieser und/oder anderer Verfahren hergestellt. Native VEGF-Proteine liegen in der Natur als dimere Moleküle vor, worin die monomeren Einheiten davon kovalent über die Bildung von Cystein-Cystein-Disulfidbindungen verbunden sind. Natives VEGF umfasst speziell das native Human-VEGF-Protein mit der in 1 gezeigten Aminosäuresequenz und besitzt die Fähigkeit, die Vermehrung von Gefäßendothelzellen in vivo zu induzieren.
Der Begriff „Variante" bezieht sich in Bezug auf ein VEGF-Protein auf ein VEGF-Protein, das zumindest eine Aminosäuremutation oder -modifizierung (d. h. Änderung) im Vergleich zu einem nativen VEGF-Protein besitzt und dem eine oder mehrere der biologischen Aktivitäten eines nativen VEGF-Proteins fehlen kann/können oder auch nicht. Durch „Aminosäuremodifizierungen" erzeugte Varianten-VEGF-Proteine können beispielsweise durch Substituieren, Deletieren, Insertieren und/oder chemisches Modifizieren von zumindest einer Aminosäure in der nativen VEGF-Aminosäuresequenz erzeugt werden. Verfahren zum Erzeugen solcher VEGF-Varianten werden unten beschrieben.
Der Ausdruck „monomere Variante", „monomerer Antagonist" oder grammatikalische Entsprechungen davon beziehen sich auf ein Varianten-VEGF-Protein mit zumindest einer Aminosäureänderung im Vergleich zu einem nativen VEGF-Monomer, worin die Aminosäureänderung so agiert, dass die Dimerbildung zwischen den monomeren Einheiten verhindert wird. Folglich sind die „monomeren Varianten" oder „monomeren Antagonisten" der vorliegenden Erfindung jene VEGF-Varianten, die unfähig sind, über die Bildung von Cystein-Cystein-Disulfidbindungen zu dimerisieren. Monomere Varianten des nativen VEGF-Proteins besitzen jedoch üblicherweise die Fähigkeit, Zelloberflächen-VEGF-Rezeptoren zu binden und zu belegen, ohne eine mitogene und/oder angiogene VEGF-Reaktion zu induzieren, obgleich die Bindungsaffinität der monomeren Variante an diesen Rezeptoren von der eines nativen VEGF-Proteins abweichen kann.
Der Ausdruck „versetztes Dimer", „versetzter Antagonist" oder grammatikalische Entsprechungen davon beziehen sich auf ein Varianten-VEGF-Protein mit zumindest einer Aminosäureänderung im Vergleich zu einem nativen VEGF-Protein und das die Fähigkeit beibehält, über die Bildung von zumindest einer Cystein-Cystein-Disulfid- Bindung zu dimerisieren, wobei sich jedoch zumindest einer der gebildeten Disulfidbindungen von derjenigen unterscheidet, die im nativen dimeren VEGF-Protein vorliegt.
Ein „funktionelles Derivat" eines Polypeptids ist eine Verbindung, die eine qualitative biologische Aktivität oder das Fehlen einer solchen mit einem anderen Polypeptid gemeinsam hat. Folglich ist beispielsweise ein funktionelles Derivat einer VEGF-Antagonistenverbindung der vorliegenden Erfindung eine Verbindung, die eine qualitative biologische Aktivität mit einem ursprünglichen Polypeptid-Antagonisten gemeinsam hat, beispielsweise die Fähigkeit, an Zelloberflächen-VEGF-Rezeptoren ohne Induzieren einer VEGF-Reaktion zu binden, wodurch diese Rezeptoren belegt werden und die native VEGF-Aktivität gehemmt wird. „Funktionelle Derivate" umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Aminosäuresequenzvarianten des Varianten-VEGF-Proteins der vorliegenden Erfindung, Fragmente von Polypeptiden aus irgendeiner Tierspezies (einschließlich Menschen), Derivate von Human- oder Nicht-Human-Polypeptiden und deren Fragmente und Polypeptid-Analoga nativer Polypeptide, unter der Voraussetzung, dass sie eine biologische Aktivität oder das Fehlen einer solchen mit einem entsprechenden Varianten-VEGF-Protein gemeinsam haben. „Fragmente" umfassen Regionen innerhalb der Sequenz eines reifen Polypeptids. Der Begriff „Derivat" wird verwendet, um Aminosäuresequenzvarianten und kovalente Modifizierungen eines Polypeptids zu definieren.
„Identität" oder „Homologie" in Bezug auf ein Polypeptid und/oder seine funktionellen Derivate ist hierin als prozentueller Anteil von Aminosäureresten in der Kandidatsequenz definiert, die mit den Resten eines entsprechenden Polypeptids, erforderlichenfalls nach Angleichung der Sequenz und Einführung von Lücken zur Erzielung der maximalen prozentuellen Homologie, identisch sind, wobei jegliche konservative Substitutionen nicht als Teil der Sequenzidentität berücksichtigt werden. Weder N- oder C-terminate Extensionen noch Insertionen sollen dahingehend ausgelegt werden, als dass sie die Identität oder Homologie herabsetzen. Verfahren und Computerprogramme zur Angleichung sind auf dem Gebiet der Erfindung wohl bekannt.
Der Ausdruck „biologische Aktivität" ist im Zusammenhag mit der Definition funktioneller Derivate als der Besitz von zumindest einer mit einem anderen Polypeptid qualitativ gemeinsamen Funktion definiert. Die funktionellen Derivate der Polypeptid-Antagonisten der vorliegenden Erfindung sind durch ihre qualitative Fähigkeit vereinigt, an einen VEGF-Rezeptor ohne Induzieren einer VEGF-Reaktion zu binden, wodurch die Bindung von nativem VEGF an dieser Stelle verhindert und dann wieder die biologische Aktivität des nativen VEGF-Proteins gehemmt wird.
Der Begriff „Antagonist" wird verwendet, um sich auf ein Molekül zu beziehen, das eine biologische Aktivität eines nativen VEGF-Proteins hemmt. Vorzugsweise hemmen die VEGF-Antagonistenverbindungen hierin die Fähigkeit von VEGF, die Gefäßendothelzellen-Vermehrung zu induzieren. Bevorzugte Antagonisten hemmen im Wesentlichen die Gefäßendothelzellen-Vermehrung vollständig.
Für gewöhnlich beziehen sich die Begriffe „Aminosäure" und „Aminosäuren" auf alle natürlich auftretenden L-α-Aminosäuren. In manchen Ausführungsformen können jedoch entweder D-Aminosäuren oder nicht-natürlich substituierte Aminosäuren in den Polypeptiden oder Peptiden der vorliegenden Erfindung vorhanden sein, um Konformationseinschränkungen zu erleichtern. Um beispielsweise die Disulfidbindungsbildung und -stabilität zu erleichtern, kann ein D-Aminosäure-Cystein an einem Terminus oder beiden Termini eines funktionellen Peptid-Derivats oder Peptid-Antagonisten des nativen VEGF-Proteins bereitgestellt werden. Die Aminosäuren sind entweder durch Einzelbuchstaben- oder durch die Dreibuchstaben-Bezeichnungen definiert:
Diese Aminosäuren können nach chemischer Zusammensetzung und Eigenschaften ihrer Seitenketten klassifiziert werden. Sie werden grob in zwei Gruppen eingeteilt, geladen und ungeladen. Jede dieser Gruppen ist in Untergruppen unterteilt, um die Aminosäuren genauer zu klassifizieren:
I. Geladene Aminosäuren

Saure Reste: Asparaginsäure, Glutaminsäure
Basische Reste: Lysin, Arginin, Histidin

II. Ungeladene Aminosäuren

Hydrophile Reste: Serin, Threonin, Asparagin, Glutamin
Aliphatische Reste: Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin
Nicht-polare Reste: Cystein, Methionin, Prolin
Aromatische Reste: Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan

Der Begriff „Aminosäuresequenzvariante" oder „Aminosäureänderung" bezieht sich auf Moleküle, die zumindest einen Unterschied in ihrer Aminosäuresequenz im Vergleich zu einer anderen Aminosäuresequenz, für gewöhnlich zur nativen Aminosäuresequenz, aufweisen.
„Substitutions"-Varianten sind jene, bei denen zumindest ein Aminosäurerest einer entsprechenden Sequenz entfernt und stattdessen eine andere Aminosäure an derselben Position insertiert ist. Die Substitutionen können einzelne sein, wo nur eine Aminosäure im Molekül substituiert worden ist, oder sie können mehrfach sein, wo zwei oder mehrere Aminosäuren im selben Molekül substituiert worden sind.
„Insertions"-Varianten sind jene, in die eine oder mehrere Aminosäuren in unmittelbarer Nachbarschaft zu einer Aminosäure an einer bestimmten Position in einer entsprechenden Sequenz insertiert sind. Unter unmittelbarer Nachbarschaft zu einer Aminosäure wird die Bindung an die funktionelle α-Carboxy- oder α-Aminogruppe der Aminosäure verstanden.
„Deletions"-Varianten sind jene, in denen eine oder mehrere Aminosäuren einer entsprechenden Aminosäuresequenz entfernt sind. Für gewöhnlich weisen Deletionsvarianten eine oder zwei in einer bestimmten Region des Moleküls deletierte Aminosäuren auf.
Der Ausdruck „isoliert" bedeutet, dass eine Nucleinsäure oder ein Polypeptid identifiziert wird und von verunreinigenden Nucleinsäuren oder Polypeptiden, die in der Tier- oder Human-Quelle der Nucleinsäure oder des Polypeptids vorhanden sind, getrennt wird.
Hybridisierung wird vorzugsweise unter „stringenten Bedingungen" durchgeführt, worunter Folgendes verstanden wird: (1) Einsetzen niedriger Ionenstärke und hoher Temperatur zum Waschen, z. B. 0,015 Natriumchlorid/0,0015 M Natriumcitrat/0,1 Natriumdodecylsulfat bei 50°C, oder (2) Einsetzen eines Denaturierungsmittels, wie z. B. Formamid, während der Hybridisierung, zum Beispiel 50 Vol.-% Formamid mit 0,1% Rinderserumalbumin/0,1% Ficoll/0,1% Polyvinylpyrrolidon/50 nM Natriumphosphatpuffer bei pH 6,5 mit 750 mM Natriumchlorid, 75 mM Natriumcitrat bi 42°C. Ein weiteres Beispiel ist die Verwendung von 50% Formamid, 5 × SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M Natriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 6/8), 0,1% Natriumpyrophosphat, 5 × Denhardt-Lösung, ultraschallbehandelte Lachsspermien-DNA (50 μg/nl), 0,1% SDS und 19% Dextransulfat bei 42°C, mit Waschschritten bei 42°C in 0,2 SSC und 0,1% SDS. Noch ein weiteres Beispiel ist die Hybridisierung unter Verwendung eines Puffers von 10% Dextransulfat, 2 × SSC (Natriumchlorid/Natriumci trat) und 50% Formamid bei 55°C, gefolgt von einem hoch stringenten Waschschritt bestehend aus EDTA enthaltendem 0,1 × SSC bei 55°C.
„Transfektion" bezieht sich auf das Aufnehmen eines Expressionsvektors durch eine Wirtszelle, ob nun irgendwelche kodierenden Sequenzen tatsächlich exprimiert werden oder nicht. Zahlreiche Transfektionsverfahren sind dem gewöhnlich Fachkundigen bekannt, z. B. CaPO₄ und Elektroporation. Die erfolgreiche Transfektion wird im Allgemeinen erkannt, wenn irgendein Anzeichen der Tätigkeit dieses Vektors in der Wirtszelle auftritt.
Unter „Transformation" wird das Einführen von DNA in einen Organismus verstanden, so dass die DNA entweder als extrachromosomales Element oder als chromosomaler Integrant replizierbar ist. In Abhängigkeit von der verwendeten Wirtszelle wird die Transformation unter Anwendung von Standardtechniken durchgeführt, die für solche Zellen geeignet sind. Die Calciumbehandlung unter Einsatz von Calciumchlorid, wie sie von S. N. Cohen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110 (1972), und Mandel et al., J. Mol. Biol. 53, 154 (1970), beschrieben wird, wird allgemein für Prokaryoten oder andere Zellen verwendet, die wesentliche Zellwandbarrieren enthalten. Für Säugetierzellen ohne solche Zellwände wird das Calciumphosphat-Präzipitationsverfahren von F. Graham und A. van der Eb, Virology 52, 456–457 (1978), bevorzugt. Allgemeine Aspekte von Säugetierzellen-Wirtssystem-Transformationen sind von Axel im US-Patent Nr. 4.399.216, erteilt am 16. August 1983, beschrieben worden. Transformationen in Hefe werden typischerweise nach dem Verfahren von P. Van Solingen et al., J. Bact. 130, 946 (1977), und C. L. Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 3829 (1979), durchgeführt. Jedoch können andere Verfahren zum Einführen von DNA in Zellen, wie z. B. durch Kerninjektion oder durch Protoplastenfusion, ebenfalls verwendet werden.
„Ortsgerichtete Mutagenese" ist eine Standardtechnik auf dem Gebiet der Erfindung und wird unter Verwendung eines synthetischen Oligonucleotidprimers durchgeführt, der zu einer zu mutierenden einzelsträngigen Phagen-DNA mit Ausnahme von be grenzten Fehlpaarungen, die die gewünschte Mutation darstellen, komplementär ist. Zusammenfassend wird das synthetische Oligonucleotid als Primer verwendet, um die Synthese eines Strangs zu steuern, der zur einzelsträngigen Phagen-DNA komplementär ist, und die resultierende doppelsträngige DNA wird in ein Phagen-unterstützendes Wirtsbakterium transformiert. Kulturen der transformierten Bakterien werden in Top-Agar ausplattiert, was die Plaque-Bildung aus Einzelzellen ermöglicht, die den Phagen beherbergen. Theoretisch werden 50% der neuen Plaques den Phagen enthalten, der die mutierte Form als Einzelstrang aufweist; 50% werden die ursprüngliche Sequenz aufweisen. Plaques von Interesse werden durch Hybridisieren mit Kinase-behandeltem synthetischen Primer bei einer Temperatur hybridisiert, die die Hybridisierung einer exakten Paarung erlaubt, bei der jedoch die Fehlpaarungen mit dem ursprünglichen Strang ausreichen, um die Hybridisierung zu verhindern. Plaques, die mit der Sonde hybridisieren, werden dann selektiert, sequenziert und kultiviert, und die DNA wird gewonnen.
„Operativ gebunden" bezieht sich auf eine Nebeneinanderstellung, so dass die normale Funktion der Komponenten ausgeführt werden kann. Folglich bezieht sich eine kodierende Sequenz, die an Kontrollsequenzen „operativ gebunden" ist, auf eine Konfiguration, worin die kodierende Sequenz unter der Kontrolle dieser Sequenzen exprimiert werden kann und worin die gebundenen DNA-Sequenzen zusammenhängend sind und, im Falle eines Sekretionsleaders, zusammenhängend sind und sich in Lesephase befinden. Beispielsweise ist DNA für eine Präsequenz oder einen Sekretionsleader operativ an DNA für ein Polypeptid gebunden, wenn sie als ein Präprotein exprimiert wird, das an der Sekretion des Polypeptids beteiligt ist; ein Promotor oder Enhancer ist operativ an eine kodierende Sequenz gebunden, wenn er die Transkription der Sequenz beeinflusst; oder eine Ribosombindungsstelle ist operativ an eine kodierende Sequenz gebunden, wenn sie so positioniert ist, dass die Translation erleichtert wird. Die Bindung wird durch Ligation an zweckdienlichen Restriktionsstellen erzielt. Wenn solche Stellen nicht vorkommen, dann werden synthetische Oligonucleotidadaptoren oder -linker gemäß herkömmlicher Praxis verwendet.
„Kontrollsequenzen" beziehen sich auf DNA-Sequenzen, die für die Expression einer operativ gebundenen kodierenden Sequenz in einem bestimmten Wirtsorganismus notwendig sind. Die Kontrollsequenzen, die beispielsweise für Prokaryoten geeignet sind, umfassen einen Promotor, gegebenenfalls eine Operatorsequenz, eine Ribosombindungssstelle und möglicherweise andere, bisher schlecht verstandene Sequenzen. Eukaryotische Zellen setzen bekanntermaßen Promotoren, Polyadenylierungssequenzen und Enhancer ein.
„Expressionssystem" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die eine gewünschte kodierende Sequenz und Kontrollsequenzen in operativer Verbindung enthalten, so dass mit diesen Sequenzen transformierte Wirte fähig sind, die kodierten Proteine zu produzieren. Um die Transformation zu bewirken, kann das Expressionssystem auf einem Vektor enthalten sein; jedoch kann die relevante DNA dann auch in das Wirtschromosom integriert werden.
Wie hierin verwendet, werden „Zelle", „Zelllinie" und „Zellkultur" wechselseitig verwendet, und alle derartigen Bezeichungen umfassen die Nachkommenschaft. Folglich umfasst „Transformanten" oder „transformierte Zellen" die primäre gegenständliche Zelle und davon hergeleitete Kulturen ohne Berücksichtigung der Anzahl von Transfers. Es versteht sich ferner, dass aufgrund beabsichtigter oder unbeabsichtigter Mutationen nicht alle Nachkommen bezuüglich des DNA-Gehalts identisch sein müssen. Mutierte Nachkommen, die dieselbe Funktionalität wie jene aufweisen, auf die in der ursprünglich transformierten Zelle gescreent worden ist, sind mit umfasst. Wo eindeutige Benennungen beabsichtigt sind, werden sie aus dem Kontext klar hervorgehen.
„Plasmide" sind durch ein kleines p gekennzeichnet, dem Großbuchstaben und/oder Zahlen vorangehen und/oder folgen. Die Ausgangsplasmide hierin sind im Handel erhältlich, sind uneingeschränkt öffentlich zugänglich oder können aus solchen erhältlichen Plasmiden nach publizierten Verfahren konstruiert werden. Außerdem sind andere gleichwertige Plasmide auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und dem gewöhnlich Fachkundigen üblicherweise offensichtlich.
„Verdau" von DNA bezieht sich auf die katalytische Spaltung der DNA mit einem Enzym, das nur an bestimmten Stellen in der DNA einwirkt. Solche Enzyme werden Restriktionsenzyme genannt, und die Stellen, für die jedes davon spezifisch ist, werden Restriktionsstellen genannt. Die verschiedenen hierin verwendeten Restriktionsenzyme sind im Handel erhältlich, und es werden deren Reaktionsbedingungen, Cofaktoren und andere Bedürfnisse verwendet, wie sie von den Enzymlieferanten ermittelt worden sind. Restriktionsenzyme werden üblicherweise durch Abkürzungen benannt, die aus einem Großbuchstaben bestehen, gefolgt von anderen Buchstaben, die den Mikroorganismus darstellen, aus dem jedes Restriktionsenzym ursprünglich erlangt worden ist, und einer anschließenden Zahl, die das spezielle Enzym bezeichnet. Im Allgemeinen werden ungefähr 1 mg Plasmid oder DNA-Fragment mit ungefähr 1–2 Units Enzym in ungefähr 20 μl Pufferlösung verwendet. Geeignete Puffer und Substratmengen für bestimmte Restriktionsenzyme sind vom Hersteller spezifiziert. Für gewöhnlich wird eine Inkubation von ungefähr 1 Stunde bei 37°C verwendet, kann aber gemäß den Anleitungen des Herstellers variieren. Nach der Inkubation wird Protein durch Extraktion mit Phenol und Chloroform entfernt und die verdaute Nucleinsäure aus der wässrigen Fraktion durch Präzipitation mit Ethanol gewonnen. Dem Verdau mit einem Restriktionsenzym folgt in seltenen Fällen eine Hydrolyse der terminalen 5'-Phosphate mit bakterieller Alkalischer Phosphatase, um zu verhindern, dass die beiden restriktionsgespalteten Enden eines DNA-Fragments „zirkularisieren" oder eine geschlossene Schleife bilden, die die Insertion eines anderen DNA-Fragments an der Restriktionsstelle verhindern würde. Wenn nicht anders angegeben, folgt dem Verdau von Plasmiden keine 5'-terminate Dephosphorylierung. Verfahren und Reagenzien zur Dephosphorylierung sind die herkömmlichen (T. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York, Cold Spring Harbor Laboratory, S. 133–134 (1982)).
Unter "Gewinnung" oder "Isolierung" eines gegebenen DNA-Fragments aus einem Restriktionsverdau wird die Trennung des Verdaus am Polyacrylamid- oder Agarosegel mittels Elektrophorese, Identifizierung des Fragments von Interesse durch Vergleich seiner Mobilität gegenüber derjenigen von Markery-DNA-Fragmenten bekannten Molekulargewichts, Entfernung des das gewünschte Fragment enthaltenden Gelabschnitts und Trennung des Gels von DNA verstanden. Dieses Verfahren ist allgemein bekannt. Siehe beispielsweise R. Lawn et al., Nucleic Acids Res. 9, 6103–6114 (1981), und D. Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980).
„Ligation" bezieht sich auf den Prozess der Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen zwei doppelsträngigen Nucleinsäurefragmenten (T. Maniatis et al. (1982), siehe oben, S. 146). Wenn nicht anders angegeben, kann die Ligation unter Verwendung bekannter Puffer und Bedingungen mit 10 Units T4-DNA-Ligase („Ligase") je 0,5 mg ungefähr äquimolarer Mengen der zu ligierenden DNA-Fragmente erzielt werden.
Unter „Herstellung" von DNA aus Transformanten wird das Isolieren von Plasmid-DNA aus mikrobieller Kultur verstanden. Wenn nicht anders angegeben, kann das Alkali/SDS-Verfahren von Maniatis et al. (1982), siehe oben, S. 90, angewendet werden.
„Oligonucleotide" sind kurzkettige einzel- oder doppelsträngige Polydesoxynucleotide, die durch bekannte Verfahren (wie z. B. Phosphotriester-, Phosphit- oder Phosphoramidit-Chemie unter Anwendung von Festphasentechniken, wie sie in der EP-A-266.032, veröffentlicht am 4. Mai 1988, beschrieben werden, oder über Desoxynucleosid-N-Phosphonat-Zwischenverbindungen, wie beschrieben von Froehler et al., Nucl. Acids Res. 14, 5399–5407 (1986)) chemisch synthetisiert werden. Sie werden dann an Polyacrylamidgelen gereinigt.
Die Abkürzung „KDR" bezieht sich auf die Kinase-Domänenregion des VEGF-Moleküls, ob es sich um ein natives VEGF-Molekül oder eine Variante davon handelt. Es ist diese Region, die bekanntermaßen an den Kinase-Domänenregion-Rezeptor bindet.
Die Abkürzug „FLT-1" bezieht sich auf die FMS-artige Tyrosinkinase-Bindungsdomäne, die bekanntermaßen an den entsprechenden flt-1-Rezeptor bindet. Diese Rezeptoren existieren an den Oberflächen von Endothelzellen.
B. Allgemeine Verfahren
1. Glykosylierung
Die VEGF-Varianten der vorliegenden Erfindung können zumindest eine Aminosäuresequenz enthalten, bei der die Möglichkeit besteht, über eine N-Bindung glykosyliert zu werden, und die normalerweise im nativen VEGF-Molekül nicht glykosyliert ist.
Die Einführung einer N-gebundenen Glykosylierungsstelle in die Variante erfordert eine Tripeptidylsequenz der Formel: Asparagin-X-Serin oder Asparagin-X-Threonin, worin Asparagin der Akzeptor und X irgendeine der zwanzig genetisch kodierten Aminosäuren außer Prolin ist, das die Glykosylierung verhindert. Siehe D. K. Struck und W. J. Lennarz, in: The Biochemistry of Glycoproteins and Proteoglycans, W. J. Lennarz (Hrsg.), Plenum Press, S. 35 (1980); R. D. Marshall, Biochem. Soc. Symp. 40, 17 (1974) und R. J. Winzler, in: Hormonal Proteins and Peptides, C. I. Li (Hrsg.), Academic Press, New York, S. 1–15 (1973). Die Aminosäuresequenzvariante hierin wird durch Substituieren der Aminosäure(n) an der/den geeigneten Stelle(n) durch geeignete Aminosäuren modifiziert, um die Glykosylierung zu bewirken.
Wenn O-gebundene Glykosylierung einzusetzen ist, tritt die O-glykosidische Bindung in Tierzellen zwischen N-Acetylgalactosamin, Galactose oder Xylose und einer von mehreren Hydroxyaminosäuren, am häufigsten Serin oder Threonin, jedoch in man chen Fällen einem 5-Hydroxyprolin- oder 5-Hydroxylysin-Rest auf, der in der geeigneten Region des Moleküls platziert ist.
Glykosylierungsmuster für Proteine, die von Säugetieren produziert werden, sind ausführlich in The Plasma Proteins: Structure, Function and Genetic Control, F. W. Putnam (Hrsg.), 2. Aufl., Bd. 4, Academic Press, New York, S. 271–315 (1984), beschrieben, wobei deren Offenbarung als Ganzes hierin durch Verweis aufgenommen ist. In diesem Kapitel werden Asparagin-gebundene Oligosaccharide, einschließlich ihrer Unterteilung in zumindest drei Gruppen, die als komplexe Strukturen, Strukturen mit hohem Mannosegehalt und Hybridstrukturen bezeichnet werden, sowie O-glykosidisch gebundene Oligosaccharide erörtert.
Die chemische und/oder enzymatische Kopplung von Glykosiden an Proteine kann unter Verwendung einer Reihe von aktivierten Gruppen erzielt werden, wie sie beispielsweise von Aplin und Wriston in CRC Crit. Rev. Biochem. S. 259–306 (1981) beschrieben werden, wobei deren Offenbarung hierin durch Verweis aufgenommen ist. Die Vorteile der chemischen Kopplungstechniken sind, dass sie relativ einfach sind und den komplizierten Enzymmechanismus nicht benötigen, die für natürliche O- und N-gebundene Glykosylierung notwendig ist. In Abhängigkeit von der verwendeten Kopplungsart kann/können der/die Zucker an (a) Arginin oder Histidin, (b) freie Carboxygruppen, wie z. B. jene der Glutaminsäure oder Asparaginsäure, (c) freie Sulfhydrylgruppen, wie z. B. jene von Cystein, (d) freie Hydroxygruppen, wie z. B. jene von Serin, Threonin oder Hydroxyprolin, (e) aromatische Reste, wie z. B. jene von Phenylalanin, Tyrosin oder Tryptophan, oder an (f) die Amidgruppe von Glutamin gebunden werden. Diese Verfahren sind ausführlicher in WO 87/05330, veröffentlicht am 11. September 1987, beschrieben, wobei deren Offenbarung hierin durch Verweis aufgenommen ist.
Glykosylierungsmuster für Proteine, die von Hefe produziert werden, werden ausführlich von Tanner und Lehle, Biochim. Biophys. Acta 906(1), 81–99 (1987), und von Kukuruzinska et al., Annu. Rev. Biochem. 56, 915–944 (1987), beschrieben, wobei deren Offenbarung hierin durch Verweis aufgenommen ist.
2. Aminosäuresequenzvarianten
a. Weitere Mutationen
Zum Zwecke der Kurzbezeichnung der hierin beschriebenen VEGF-Varianten wird angemerkt, dass sich die Zahlen auf den/die Aminosäurerest/position entlang der Aminosäuresequenzen des mutmaßlichen reifen, in den 1A und 1B gezeigten VEGF-Proteins beziehen.
Die vorliegende Erfindung betrifft Varianten von VEGF, wo solche Varianten Modifizierungen in der Aminosäuresequenz aufweisen, die die Fähigkeit der monomeren VEGF-Einheiten beeinflussen, richtig zu dimerisieren. Diese Varianten weisen die Fähigkeit auf, an Zelloberflächen-VEGF-Rezeptoren zu binden und diese zu belegen, ohne die Gefäßendothelzellen-Vermehrung und -Angiogenese wesentlich zu aktivieren, wodurch die biologische Aktivität des nativen VEGF gehemmt wird. Im Speziellen können Aminosäuremodifizierungen an den Aminosäurepositionen 51 und/oder 60 durchgeführt werden, wobei jede davon die Fähigkeit des VEGF-Varianten-Monomers beeinflusst, richtig zu dimerisieren. Darüber hinaus können zusätzliche Varianten auf Basis dieser ursprünglichen Varianten durch Mittel hergestellt werden, die auf dem Gebiet der Erfindung wohl bekannt sind und ohne vom beabsichtigten Schutzumfang der vorliegenden Erfindung abzuweichen.
In Bezug auf VEGF-Varianten der vorliegenden Erfindung können beispielsweise kovalente Modifizierungen an verschiedenen der Aminosäurereste vorgenommen werden.
b. DNA-Mutationen
Aminosäuresequenzvarianten von VEGF und Varianten davon können auch durch Mutationen in der DNA hergestellt werden. Solche Varianten umfassen beispielsweise Deletionen, Insertionen oder Substitutionen von Resten innerhalb der in 1 gezeigten Aminosäuresequenz. Es kann auch jede Kombination von Deletion, Insertion und Substitution vorgenommen werden, um zum endgültigen Konstrukt zu gelangen, unter der Voraussetzung, dass das endgültige Konstrukt die gewünschte Aktivität aufweist. Klarerweise dürfen die Mutationen, die in der für die Varianten kodierenden DNA vorgenommen werden, die Sequenz nicht aus dem Leseraster bringen und erzeugen vorzugsweise keine komplementären Regionen, die eine sekundäre mRNA-Struktur produzieren könnten (siehe EP 75.444 A ).
Auf der genetischen Ebene werden diese Varianten für gewöhnlich durch ortsgerichtete Mutagenese von Nucleotiden in der für VEGF kodierenden DNA, wodurch für die Variante kodierende DNA produziert wird, und anschließendes Exprimieren der DNA in rekombinanter Zellkultur hergestellt.
Während die Stelle zur Einführung einer Aminosäuresequenzvariation vorherbestimmt ist, muss die Mutation an sich nicht vorherbestimmt sein. Um beispielsweise die Leistungsfähigkeit einer Mutation an einer gegebenen Stelle zu optimieren, kann Zufallsmutagenese am Ziel-Codon oder an der Ziel-Region durchgeführt und die exprimierten VEGF-Varianten auf die optimale Kombination der gewünschten Aktivität gescreent werden. Techniken zum Herstellen von Substitutionsmutationen an vorherbestimmten Stellen in DNA mit einer bekannten Sequenz sind wohl bekannt, beispielsweise ortsgerichtete Mutagenese.
Die Herstellung von VEGF-Varianten in Übereinstimmung hiemit wird vorzugsweise durch ortsgerichtete Mutagenese von DNA erzielt, die für eine früher hergestellte Variante oder nicht-variante Version des Proteins kodiert. Ortsgerichtete Mutagenese ermöglicht die Produktion von VEGF-Varianten über die Verwendung spezifischer Oligonucleotidsequenzen, die für die DNA-Sequenz der gewünschten Mutation sowie für eine ausreichende Anzahl von benachbarten Nucleotiden kodieren, um eine Pri mersequenz ausreichender Größe und Sequenzkomplexität bereitzustellen, um eine stabile Doppelhelix an beiden Seiten der durchquerten Deletionsverbindung zu bilden. Typischerweise wird ein Primer einer Länge von 20 bis 25 Nucleotiden bevorzugt, wobei ungefähr 5 bis 10 Reste an beiden Seiten der Verbindung der Sequenz verändert werden. Im Allgemeinen ist die Technik der ortsgerichteten Mutagenese auf dem Gebiet der Erfindung wohl bekannt, für welche Veröffentlichungen, wie z. B. Adelman et al., DNA 2, 183 (1983), deren Offenbarung hierin durch Verweis aufgenommen ist, als Beispiele dienen.
Wie von Fachleuten anerkannt wird, setzt die ortsgerichtete Mutagenesetechnik typischerweise einen Phagenvektor ein, der in einzelsträngiger sowie doppelsträngiger Form existiert. Typische, für die ortsgerichtete Mutagenese zweckdienliche Vektoren umfassen Vektoren, wie z. B. den M13-Phagen, wie er von Messing et al., Third Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA, A. Walton (Hrsg.), Elsevier, Amsterdam (1981), offenbart wird, wobei deren Offenbarung hierin durch Verweis aufgenommen ist. Diese Phagen sind im Handel leicht erhältlich, und ihre Verwendung ist dem Fachkundigen auf dem Gebiet der Erfindung wohl bekannt. Alternativ dazu können Plasmidvektoren, die einen einzelsträngigen Phagen-Replikationsstartpunkt enthalten (Veira et al., Meth. Enzymol. 153, 3 (1987)), eingesetzt werden, um einzelsträngige DNA zu erhalten.
Im Allgemeinen wird ortsgerichtete Mutagenese, die hiermit im Einklang steht, durchgeführt, indem zuerst ein einzelsträngiger Vektor erhalten wird, der innerhalb seiner Sequenz eine DNA-Sequenz umfasst, die für das relevante Protein kodiert. Ein Oligonucleotidprimer, der die gewünschte mutierte Sequenz trägt, wird hergestellt, und zwar im Allgemeinen synthetisch, beispielsweise nach dem Verfahren von Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 5765 (1978). Dieser Primer wird dann mit dem einzelsträngigen, die Proteinsequenz enthaltenden Vektor anelliert und mit DNA-polymerisierenden Enzymen, wie z. B. E.-coli-Polymerase-I-Klenow-Fragment, behandelt, um die Synthese des die Mutation tragenden Stranges zu vervollständigen. Folglich wird ein Heteroduplex gebildet, worin ein Strang für die ursprüngliche, nicht mutierte Sequenz kodiert und der zweite Strang die gewünschte Mutation trägt. Dieser Heteroduplex-Vektor wird dann verwendet, um geeignete Zellen, wie z. B. JM101-Zellen, zu transformieren, und es werden Klone selektiert, die rekombinante Vektoren umfassen, die die mutierte Sequenzanordnung tragen.
Nachdem ein solcher Klon selektiert worden ist, kann die mutierte Proteinregion entfernt und in einen geeigneten Vektor zur Proteinproduktion eingebaut werden, im Allgemeinen in einen Vektor einer Art, die für die Transformation eines geeigneten Wirts eingesetzt werden kann.
c. Mutationsarten
Aminosäuresequenzdeletionen liegen im Allgemeinen im Bereich von 1 bis 30 Resten, bevorzugter 1 bis 10 Resten, und sind typischerweise zusammenhängend.
Aminosäuresequenzinsertionen umfassen amino- und/oder carboxyterminale Fusionen von einem Rest bis zu Polypeptiden von im Wesentlichen unbeschränkter Länge sowie Intrasequenzinsertionen einzelner oder mehrerer Aminosäurereste. Intrasequenzinsertionen (d. h. Insertionen innerhalb der reifen VEGF-Sequenz) können im Allgemeinen im Bereich von ungefähr 1 bis 10 Resten, bevorzugter 1 bis 5 Resten, liegen. Ein Beispiel einer terminalen Insertion umfasst eine Fusion einer Signalsequenz, ob heterolog oder homolog bezüglich der Wirtszelle, an den N-Terminus des Varianten-VEGF-Moleküls, um die Sekretion des Varianten-VEGF aus rekombinanten Wirten zu erleichtern.

Die dritte Gruppe von Varianten sind jene, in denen zumindest ein Aminosäurerest im VEGF-Molekül und vorzugsweise nur eine entfernt und stattdessen ein anderer Rest eingesetzt worden ist. Solche Substitutionen werden vorzugsweise gemäß der folgenden Tabelle 1 durchgeführt, wenn eine Feinmodulierung der Eigenschaften eines VEGF-Moleküls oder einer Variante davon erwünscht ist. Tabelle 1

Ursprünglicher Rest	Beispielhafte Substitutionen
Ala (A)	Gly; Ser
Arg (R)	Lys
Asn (N)	Gln; His
Asp (D)	Glu
Cys (C)	Ser
Gln (Q)	Asn
Glu (E)	Asp
Gly (G)	Ala; Pro
His (N)	Asn; Gln
Ile (I)	Leu; Val
Leu (L)	Ile; Val
Lys (K)	Arg; Gln; Glu
Met (M)	Leu; Tyr; Ile
Phe (F)	Met; Leu; Tyr
Ser (S)	Thr
Thr (T)	Ser
Trp (W)	Tyr
Tyr (Y)	Trp; Phe
Val (V)	Ile; Leu

Wesentliche Änderungen der Funktion oder immunologischen Identität werden durch Wählen von Substitutionen hergestellt, die weniger konservativ als jene in Tabelle I sind, d. h. durch Wählen von Resten, die sich stärker unterscheiden, und zwar in ihrer Wirkung auf die Erhaltung (a) der Struktur des Polypeptidgerüsts im Bereich der Substitution, beispielsweise als Faltblatt- oder Helixkonformation, (b) der Ladung oder Hydrophobie des Moleküls an der Zielstelle oder (c) der Sperrigkeit der Seitenkette. Diejenigen Substitutionen, von denen im Allgemeinen erwartet wird, dass sie die größten Veränderungen der biologischen Eigenschaften hervorrufen, sind jene, bei denen (a) Glycin und/oder Prolin deletiert oder insertiert oder durch eine andere Aminosäure substituiert wird; (b) ein hydrophiler Rest, z. B. Seryl oder Threonyl, durch einen hydrophoben Rest, z. B. Leucyl, Isoleucyl, Phenylalanyl, Valyl oder Alanyl substituiert wird oder umgekehrt; (c) ein Cysteinrest durch irgendeinen anderen Rest substituiert wird oder umgekehrt; (d) ein Rest mit einer elektropositiven Seitenkette, z. B. Lysyl, Arginyl oder Histidyl, durch einen Rest mit einer elektronegativen Ladung, z. B. Glutamyl oder Aspartyl, substituiert wird oder umgekehrt; (e) ein Rest mit einer elektronegativen Seitenkette durch einen Rest mit einer elektropositiven Seitenkette substituiert wird oder umgekehrt; oder (f) ein Rest mit einer sperrigen Seitenkette, z. B. Phenylalanin, durch einen substituiert wird, der eine solche Seitenkette nicht besitzt, z. B. Glycin, oder umgekehrt.
Von den meisten Deletionen und Insertionen, und insbesondere Substitutionen, wird nicht erwartet, dass sie drastische Veränderungen der Eigenschaften des VEGF-Moleküls oder einer Variante davon hervorrufen. Wenn es jedoch schwierig ist, die genaue Wirkung der Substitution, Deletion oder Insertion vor deren Durchführung vorherzusagen, wird der Fachkundige anerkennen, dass die Wirkung durch routinemäßige Screeningtests beurteilt werden kann. Beispielsweise wird eine Variante typischerweise durch ortsspezifische Mutagenese der für natives VEGF kodierenden Nucleinsäure, Expression der Varianten-Nucleinsäure in rekombinanter Zellkultur und gegebenenfalls durch Reinigung aus der Zellkultur, beispielsweise durch Immunaffinitätsadsorption an einer polyklonalen Kaninchen-Anti-VEGF-Säule (um die Variante durch ihre Bindung an zumindest ein verbleibendes Immunepitop zu absorbieren) hergestellt.
Da VEGF zur Aggregation zu Dimeren neigt, ist hierin vorgesehen, Hetero- und Homodimere bereitzustellen, worin eine oder beide Untereinheiten Varianten sind. Wo beide Untereinheiten Varianten sind, können die Änderungen der Aminosäuresequenz für jede Untereinheitenkette dieselben oder verschieden sein. Heterodimere werden leicht durch Cotransformieren von Wirtszellen mit DNA, die für beide Untereinheiten kodiert, und, wenn nötig, durch Reinigen des gewünschten Heterodimers oder durch getrenntes Synthetisieren der Untereinheiten, Dissoziieren der Unterein heiten (z. B. durch Behandlung mit einem chaotropen Mittel, wie z. B. Harnstoff, Guanidin-Hydrochlorid oder dergleichen), Mischen der dissoziierten Untereinheiten und anschließendes Reassoziieren der Untereinheiten durch Wegdialysieren des chaotropen Mittels hergestellt.
Ebenfalls im Schutzumfang der Mutanten enthalten sind hierin so genannte Glyko-Scan-Mutanten. Diese Ausführungsform macht sich die Kenntnis so genannter Glykosylierungsstellen zunutze, die durch die Sequenz -NX(S/T) festgelegt sind, worin N die Aminosäure Asparagin darstellt, X irgendeine Aminosäure außer Prolin und vermutlich Glycin darstellt und die dritte Position entweder durch die Aminosäure Serin oder Threonin besetzt sein kann. Folglich kann, wo angebracht, eine solche Glykosylierungsstelle eingeführt werden, so dass eine Spezies hergestellt wird, die Glykosylierungsgruppierungen an dieser Position enthalten. Gleichermaßen kann eine bestehende Glykosylierungsstelle durch Mutation entfernt werden, um eine Spezies zu produzieren, der eine Glykosylierung an dieser Stelle fehlt. Es versteht sich wiederum, dass diese wie bei den anderen in dieser Erfindung vorgesehenen Mutationen an der/den Aminosäureposition(en) 51 und/oder 60 der nativen VEGF-Aminosäuresequenz gemäß der grundlegenden Voraussetzung der vorliegenden Erfindung eingeführt werden, und sie können an anderen Stellen außerhalb dieser Aminosäurepositionen innerhalb des Gesamtmoleküls eingeführt werden, solange das Endprodukt sich insgesamt nicht von den Eigenschaften der ursprünglichen VEGF-Variante unterscheidet.
Die Aktivität des Zelllysats oder der gereinigten VEGF-Variante wird dann in einem geeigneten Screeningtest auf die gewünschten Eigenschaften gescreent. Beispielsweise kann die Bindung an den Zelloberflächen-VEGF-Rezeptor routinemäßig durch Einsetzen wohl bekannter VEGF-Bindungstests, wie zum Beispiel jenen, die in den untenstehenden Beispielen beschrieben sind, getestet werden. Eine Änderung des immunologischen Charakters des VEGF-Moleküls, wie z. B. Affinität für einen gegebenen Antikörper, wird durch einen Immuntest der kompetitiven Art gemessen. Änderungen der Verstärkung oder Unterdrückung des Gefäßendothel-Wachstums durch die Kandidat-Varianten werden durch den geeigneten Test gemessen (siehe untenstehende Beispiele). Modifizierungen solcher Proteineigenschaften, wie Redox- oder Thermostabilität, Hydrophobizität, Empfindlichkeit für proteolytischen Abbau oder die Neigung zur Aggregation mit Trägern oder zu Multimeren, werden mittels Verfahren getestet, die dem gewöhnlich Fachkundigen wohl bekannt sind.
3. Rekombinante Expression
Das gewünschte Varianten-VEGF-Molekül kann durch jegliche Technik, einschließlich durch rekombinante Verfahren, hergestellt werden. Desgleichen wird hierin unter einer isolierten DNA chemisch synthetisierte DNA, cDNA, chromosomale oder extrachromosomale DNA mit oder ohne 3'- und/oder 5'-flankierenden Regionen verstanden. Vorzugsweise wird die gewünschte VEGF-Variante hierin durch Synthese in rekombinanter Zellkultur hergestellt.
Für eine solche Synthese ist es zunächst notwendig, Nucleinsäure zu beschaffen, die für ein VEGF-Molekül kodiert. Für ein VEGF-Molekül kodierende DNA kann aus Rinder-Hypophysen-Follikelzellen durch (a) Herstellen einer cDNA-Bibliothek aus diesen Zellen, (b) Durchführen einer Hybridisierungsanalyse mit markierter DNA, die für VEGF oder Fragmente davon (bis zu mehr als 100 Basenpaaren Länge), um Klone in der homologe Sequenzen enthaltenden Bibliothek zu entdecken, und (c) Analysieren der Klone mittels Restriktionsenzymanalyse und Nucleinsäuresequenzierung zur Identifizierung von Volllängen-Klonen erhalten werden. DNA, die für ein VEGF-Molekül aus einem Säugetier kodiert, das kein Rind ist, kann ebenfalls auf ähnliche Weise durch Screening von Endothel- oder Leukämie-Zelllinien erhalten werden. DNA, die zur Hybridisierung an eine für VEGF kodierende DNA unter niedrigen Stringenzbedingungen fähig ist, ist zur Identifizierung von für VEGF kodierender DNA zweckdienlich. Hoch- sowie niedrig-stringente Bedingungen sind weiter unten definiert. Falls Volllängen-Klone in einer cDNA-Bibliothek nicht vorhanden sind, dann können geeignete Fragmente aus den verschiedenen Klonen unter Verwendung der hierin offenbarten Sequenzinformation erstmals gewonnen werden und an Restrikti onsstellen, die den Klonen gemeinsam sind, ligiert werden, um einen Volllängen-Klon zu assemblieren, der für das VEGF-Molekül kodiert. Alternativ dazu stellen genomische Bibliotheken üblicherweise die gewünschte DNA bereit.
Wenn diese DNA einmal identifiziert und aus der Bibliothek isoliert ist, wird sie in einem replizierbaren Vektor für weitere Klonierung oder für die Expression ligiert.
In einem der Beispiele eines rekombinanten Expressionssystems wird ein für VEGF kodierendes Gen durch Transformation mit einem Expressionsvektor, der für VEGF kodierende DNA umfasst, in Säugetierzellen exprimiert. Es ist vorzuziehen, Wirtszellen zu transformieren, die dazu fähig sind, eine solche Prozessierung zustande zu bringen, dass der VEGF im Kulturmedium oder im Periplasma der Wirtszelle erhalten wird, d. h. dass ein sekretiertes Molekül erhalten wird.
a. Zweckdienliche Wirtszellen und Vektoren
Die hierin offenbarten Vektoren und Verfahren sind zur Verwendung in Wirtszellen über ein weites Spektrum prokaryotischer und eukaryotischer Organismen geeignet.
Im Allgemeinen sind Prokaryoten für die anfängliche Klonierung von DNA-Sequenzen und die Konstruktion der in der Erfindung zweckdienlichen Vektoren natürlich bevorzugt. Beispielsweise ist der E.-coli-K12-Stamm MM 294 (ATCC-Nr. 31.446) besonders zweckdienlich. Andere mikrobielle Stämme, die verwendet werden können, umfassen E.-coli-Stämme, wie z. B. E.-coli B und E.-coli X1776 (ATCC-Nr. 31.537). Diese Beispiele sind selbstverständlich illustrierend und nicht einschränkend.
Prokaryoten können auch zur Expression verwendet werden. Die oben genannten Stämme sowie E.-coli-Stämme W3110 (F-, Lambda-, prototrophische, ATCC-Nr. 27.325), K5772 (ATCC-Nr. 53.635) und SR101, Bacilli, wie z. B. Bacillus subtilis, und andere Enterobacteriaceae, wie z. B. Salmonella typhimurium oder Serratia marcescans, und verschiedene Pseudomonas-Spezies können verwendet werden.
Im Allgemeinen werden Plasmidvektoren, die Replikon- und Kontrollsequenzen enthalten, die von Spezies hergeleitet sind, die mit der Wirtszelle kompatibel sind, in Verbindung mit diesen Wirten verwendet. Der Vektor trägt für gewöhnlich eine Replikationsstelle sowie Markersequenzen, die fähig sind, für eine phänotypische Selektion in transformierten Zellen zu sorgen. Beispielsweise wird E. coli typischerweise unter Verwendung von pBR322, einem aus einer E.-coli-Spezies hergeleiteten Plasmid (siehe z. B. Bolivar et al., Gene 2, 95 (1977)) transformiert. pBR322 enthält Gene für Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenz und stellt daher ein einfaches Mittel zur Identifizierung transformierter Zellen bereit. Das pBR322-Plasmid oder ein anderes mikrobielles Plasmid oder ein Phage muss auch Promotoren enthalten oder dahingehend modifiziert werden, dass es/er Promotoren enthält, die vom mikrobiellen Organismus zur Expression seiner eigenen Proteine verwendet werden können.
Diese in der rekombinanten DNA-Konstruktion am häufigsten verwendeten Promotoren umfassen die β-Lactamase- (Penicillinase-) und Lactose-Promotorsysteme (Chang et al., Nature 375, 615 (1978); Itakura et al., Science 198, 1056 (1977); Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979)) und ein Tryptophan- (trp-) Promotorsystem (Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980); EP-Anmeldung 0036.776). Während diese die am häufigsten verwendeten werden, sind andere mikrobielle Promotoren entdeckt und genützt worden, und Einzelheiten betreffend ihrer Nucleotidsequenzen sind publiziert worden, was es einem geschulten Fachmann ermöglicht, sie funktionell mit Plasmidvektoren zu ligieren (siehe z. B. Siebenlist et al., Cell 20, 269 (1980)).
Zusätzlich zu Prokaryoten können eukaryotische Mikroorganismen, wie z. B. Hefekulturen, verwendet werden. Saccharomyces cerevisiae oder gewöhnliche Bäckerhefe ist unter den eukaryotischen Mikroorganismen der am häufigsten verwendete, obgleich eine Reihe anderer Stämme allgemein erhältlich sind. Zur Expression in Saccharomyces wird beispielsweise das Plasmid YRp7 (Stinchcomb et al., Nature 282, 39 (1979); Kingsman et al., Gene 7, 141 (1979); Tschemper et al., Gene 10, 157 (1980)) häufig verwendet. Dieses Plasmid enthält bereits das trp1-Gen, das einen Selektionsmarker für einen mutierten Hefestamm bereitstellt, dem die Fähigkeit zum Wachstum auf Tryptophan fehlt, beispielsweise ATCC-Nr. 44.076 oder PEP4-1 (Jones, Genetics 85, 12 (1977)). Die Gegenwart der trp1-Läsion als Charakteristikum des Hefewirtszellengenoms stellt dann eine effektive Umgebung zum Detektieren der Transformation durch Wachstum in Abwesenheit von Tryptophan dar.
Geeignete Promotorsequenzen in Hefevektoren umfassen die Promotoren für 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255, 2073 (1980)) oder andere glykolytische Enzyme (Ness et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149 (1968); Holland et al., Biochemistry 17, 4900 (1978)), wie z. B. Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvat-Decarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphat-Isomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphat-Isomerase, Phosphoglucose-Isomerase und Glucokinase. Bei der Konstruktion geeigneter Expressionsplasmide werden die mit diesen Genen assoziierten Terminationssequenzen auch in den Expressionsvektor 3' der Sequenz, deren Expression erwünscht ist, ligiert, um für Polyadenylierung der mRNA und Termination zu sorgen. Andere Promotoren, die den zusätzlichen Vorteil der durch Wachstumsbedingungen kontrollierten Transkription aufweisen, sind die Promotorregion für Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, Saure Phosphatase, mit dem Stickstoffmetabolismus assoziierte Abbauenzyme und die oben erwähnte Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase und Enzyme, die für die Maltose- und Galactoseverwertung verantwortlich sind. Jeglicher Plasmidvektor, der einen Hefe-kompatiblen Promotor, Replikationsstartpunkt und Terminationssequenzen enthält, ist geeignet.
Zusätzlich zu Mikroorganismen können von vielzelligen Organismen hergeleitete Kulturen von Zellen als Wirte verwendet werden. Im Prinzip ist eine jede solche Kultur, ob sie aus einer Vertebraten- oder aus einer Invertebraten-Kultur stammt, praktikabel. Jedoch hat das größte Interesse an Vertebraten-Zellen bestanden, und die Vermehrung von Vertebraten-Zellen in Kultur (Gewebekultur) ist in den letzten Jahren zu einem Routineverfahren geworden (Tissue Culture, Academic Press, Kruse und Pat terson (Hrsg.) (1973)). Beispiele solcher zweckdienlicher Wirtszelllinien sind VERO- und HeLa-Zellen, Chinahamster-Eierstock- (CHO-) Zelllinien und W138-, BHK-, COS-7-, 293- und MDCK-Zelllinien. Expressionsvektoren für solche Zellen umfassen (falls notwendig) für gewöhnlich einen Replikationsstartpunkt, einen vor dem zu exprimierenden Gen befindlichen Promotor gemeinsam mit jeglichen notwendigen Ribosombindungsstellen, RNA-Spleißstellen, Polyadenylierungsstellen und Transkriptionsterminationssequenzen.
Zur Verwendung in Säugetierzellen werden die Kontrollfunktionen auf den Vektoren häufig durch Virusmaterial bereitgestellt. Beispielsweise sind die für gewöhnlich verwendeten Promotoren von Polyoma, Adenovirus2 und am häufigsten vom Simian-Virus 40 (SV40) hergeleitet. Die frühen und späten Promotoren des SV40-Virus sind besonders zweckdienlich, da beide aus dem Virus leicht als Fragment erhältlich sind, das auch den viralen SV40-Replikationsstarpunkt enthält (Fiers et al., Nature 273, 113 (1978)). Kleinere und größere SV40-Fragmente können ebenfalls unter der Voraussetzung verwendet werden, dass die sich von der HindIII-Stelle zur BglI-Stelle erstreckende, im viralen Replikationsstartpunkt befindliche Sequenz von ungefähr 250 bp enthalten ist. Weiters ist es auch möglich und häufig wünschenswert, normalerweise mit der gewünschten Gensequenz assoziierte Promotor- und Kontrollsequenzen unter der Voraussetzung zu nützen, dass solche Kontrollsequenzen mit den Wirtszellsystemen kompatibel sind.
Ein Replikationsstartpunkt kann entweder durch Konstruktion des Vektors bereitgestellt werden, so dass er einen exogenen Startpunkt enthält, wie er z. B. aus der SV40- oder einer anderen viralen (z. B. Polyoma, Adeno, VSV, BPV) Quelle hergeleitet werden kann, oder er kann durch den chromosomalen Wirtszellen-Replikationsmechanismus bereitgestellt werden. Falls der Vektor in das Wirtszellenchromosom integriert wird, ist letzteres häufig ausreichend.
Ausreichende Proteinmengen werden von Zellkulturen produziert; jedoch dienen Verfeinerungen unter Verwendung einer sekundären kodierenden Sequenz dazu, die Produktionsmengen noch weiter zu erhöhen. Eine der sekundären kodierenden Sequenzen umfasst Dihydrofolat-Reductase (DHFR), die von einem extern kontrollierten Parameter, wie z. B. Methotrexat (MTX), beeinflusst wird, was folglich die Kontrolle der Expression durch Kontrolle der Methotrexatkonzentration erlaubt.
Bei der Wahl einer bevorzugten Wirtszelle zur Transfektion durch die Vektoren der Erfindung, die für VEGF- und DHFR-Protein kodierende DNA-Sequenzen umfassen, ist es angebracht, den Wirt entsprechend der Art des eingesetzten DHFR-Proteins zu wählen. Wenn DHFR-Protein der Wildform eingesetzt wird, ist die Wahl einer DHFR-defizienten Wirtszelle zu bevorzugen, was folglich die Verwendung der für DHFR kodierenden Sequenz als Marker für erfolgreiche Transfektion in Selektivmedium erlaubt, dem Hypoxanthin, Glycin und Thymidin fehlt. Eine geeignete Wirtszelle ist in diesem Fall die hinsichtlich DHFR-Aktivität defiziente Chinahamster-Eierstock(CHO-) Zelllinie, die wie von Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980), beschrieben hergestellt und vermehrt wird.
Andererseits ist es, falls DHFR-Protein mit niedriger Bindungsaffinität für MTX als die kontrollierende Sequenz verwendet wird, nicht notwendig, DHFR-defiziente Zellen zu verwenden. Da das mutierte DHFR gegen Methotrexat resistent ist, können MTX enthaltende Medien als Selektionsmittel unter der Voraussetzung verwendet werden, dass die Wirtszellen selbst gegen Methotrexat empfindlich sind. Die meisten eukaryotischen Zellen, die zur Absorption von MTX fähig sind, scheinen gegen Methotrexat empfindlich zu sein. Eine solche erfolgreiche Zelllinie ist eine CHO-Linie, CHO-K1 (ATCC-Nr. CCL 61).
b. Typische einsetzbare Verfahren
Die Konstruktion von geeigneten, die gewünschten kodierenden und Kontrollsequenzen enthaltenden Vektoren setzt standardmäßige Ligationstechniken ein. Isolierte Plasmide oder DNA-Fragmente werden in der gewünschten Formgespalten, maßgeschneidert und neu ligiert, um die benötigten Plasmide herzustellen.
Falls stumpfe Enden benötigt werden, kann das Präparat für 15 Minuten bei 15°C mit 10 Units Polymerase I (Klenow) behandelt, mit Phenol-Chloroform extrahiert und mit Ethanol präzipitiert werden.
Die Trennung der gespaltenen Fragmente nach Größe kann unter Verwendung von 6-prozentigen Polyacrylamidgelen durchgeführt werden, wie von Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980), beschrieben wird.
Für die Analyse zur Bestätigung korrekter Sequenzen in konstruierten Plasmiden werden die Ligationsgemische typischerweise verwendet, um E.-coli-K12-Stamm 294 (ATCC-Nr. 31.446) oder andere geeignete E.-coli-Stämme zu transformieren, und erfolgreiche Transformanten gegebenenfalls mittels Ampicillin- oder Tetracyclin-Resistenz selektiert. Plasmide aus den Transformanten werden hergestellt und durch Restriktionskartierung und/oder DNA-Sequenzierung nach dem Verfahren von Messing et al., Nucleic Acids Res. 9, 309 (1981), oder nach dem Verfahren von Maxam et al., Methods of Enzymology 65, 499 (1980), analysiert.
Nach Einführung der DNA in den Säugetierzellenwirt und Selektion auf stabile Transfektanten im Medium wird die Amplifikation der für DHFR-Protein kodierenden Sequenzen durch Züchten von Wirtszellkulturen in Gegenwart von ungefähr 20.000 bis 500.000 nM Methotrexat, einem kompetitiven Hemmstoff der DHFR-Aktivität, bewirkt. Der wirksame Konzentrationsbereich hängt natürlich im höchsten Maße von der Natur des DHFR-Gens und den Eigenschaften des Wirts ab. Klarerweise können allgemein definierte obere und untere Grenzwerte nicht festgesetzt werden. Geeignete Konzentrationen anderer Folsäure-Analoga oder anderer Verbindungen, die DHFR hemmen, könnten ebenfalls verwendet werden. MTX selbst ist jedoch zweckdienlich, leicht erhältlich und wirksam.
Andere einsetzbare Techniken sind in einem Abschnitt unmittelbar vor den Beispielen beschrieben.
4. Verwendungen und Formulierung
Die Varianten-VEGF-Antagonisten der vorliegenden Erfindung bieten eine Reihe therapeutischer Verwendungen, die mit dem Gefäßendothel in Verbindung stehen. Solche Verwendungen umfassen beispielsweise Einmischen in gebildete Fabrikate, die zur Modulierung von Wachstum und Angiogenese von Endothelzellen verwendet werden können. Außerdem kann mit diesen Fabrikaten Tumorinvasion und Metastase moduliert werden. Andere Störungen, für die die Polypeptide der vorliegenden Erfindung Verwendung finden können, sind oben erörtert.
Für die oben genannten Indikationen wird das Varianten-VEGF-Antagonistenmolekül üblicherweise in einer Weise formuliert und dosiert, die mit guter Heilpraxis im Einklang steht, wobei die spezielle zu behandelnde Krankheit oder Störung, der Zustand des individuellen Patienten, die Verabreichungsstelle des VEGF-Antagonisten, das Verabreichungsverfahren und andere dem praktischen Arzt bekannte Faktoren berücksichtigt werden. Für die Zwecke hierin ist die „therapeutisch wirksame Menge" von VEGF eine Menge, die wirksam ist, um das behandelte Leiden entweder zu verhindern, die Verschlimmerung derselben zu vermindern, zu lindern oder zu heilen, insbesondere jene Menge, die ausreicht, um das Wachstum von Gefäßendothel in vivo im Wesentlichen zu hemmen.
VEGF-Aminosäuresequenzvarianten und -derivate, die immunologisch mit Antikörpern gegen natives VEGF kreuzreagieren, sind in Immuntests für VEGF als Standards oder, wenn markiert, als kompetitive Reagenzien zweckdienlich.
Der VEGF-Antagonist wird zur Lagerung oder Verabreichung durch Mischen des VEGF-Antagonisten mit dem gewünschten Reinheitsgrad mit physiologisch annehmbaren Trägern, Exzipienten oder Stabilisatoren hergestellt. Solche Materialien sind für Empfänger in den eingesetzten Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch. Wenn der VEGF-Antagonist wasserlöslich ist, kann er in einem Puffer, wie z. B. Phosphat oder organischem Salz, vorzugsweise bei einem pH von ungefähr 7 bis 8 formuliert werden. Wenn eine VEGF-Variante nur teilweise in Wasser löslich ist, kann er als Mikroemulsion durch seine Formulierung mit einem nichtionischen Tensid, wie z. B. Tween, Pluronics oder PEG, z. B. Tween 80, in einer Menge von 0,04–0,05% (Gew./Vol.) hergestellt werden, um seine Löslichkeit zu erhöhen.
Gegebenenfalls können andere Inhaltsstoffe, wie z. B. Antioxidantien, z. B. Ascorbinsäure; niedermolekulare (weniger als ungefähr zehn Reste) Polypeptide, z. B. Polyarginin oder Tripeptide; Proteine, wie z. B. Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere, wie z. B. Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren, wie z. B. Glycin, Glutaminsäure, Asparaginsäure oder Arginin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate, einschließlich Cellulose oder ihrer Derivate; Glucose, Mannose oder Dextrine; chelatierende Mittel, wie z. B. EDTA; und Zuckeralkohole, wie z. B. Mannitol oder Sorbitol, zugegeben werden.
Der für therapeutische Verabreichung zu verwendende VEGF-Antagonist muss steril sein. Sterilität wird leicht durch Filtration durch sterile Filtrationsmembranen (z. B. 0,2-μm-Membranen) erzielt. Das VEGF wird für gewöhnlich in lyophilisierter Form gelagert oder als wässrige Lösung, falls es höchst stabil gegen thermische und oxidative Denaturierung ist. Der pH der VEGF-Antagonist-Präparate liegt typischerweise von 6 bis 8, obgleich höhere oder niedrigere pH-Werte in bestimmten Fällen ebenfalls geeignet sein können. Es versteht sich, dass die Verwendung bestimmter vorhergehender Exzipienten, Träger oder Stabilisatoren üblicherweise in der Bildung von Salzen des VEGF-Antagonisten resultiert.
Falls der VEGF-Antagonist parenteral zu verwenden ist, werden therapeutische Zusammensetzungen, die den VEGF-Antagonisten enthalten, in einen Behälter mit einer sterilen Füllöffnung gegeben, beispielsweise in eine(n) intravenöse(n) Infusionsbeutel/Flasche mit einem von einer Subkutankanüle durchstechbaren Stopfen.
Im Allgemeinen sollte man, wo es die Störung erlaubt, das VEGF für ortsgerichtete Abgabe formulieren und dosieren. Dies ist im Falle von ortsspezifischen massiven Tumoren zweckdienlich.
Retard-Formulierungen können ebenfalls hergestellt werden und umfassen die Bildung von Mikrokapseln und implantierbarer Fabrikate. Zum Herstellen von VEGF-Antagonist-Retard-Zusammensetzungen wird der VEGF-Antagonist vorzugsweise in eine bioabbaubare Matrix oder Mikrokapsel inkorporiert. Ein geeignetes Material für diesen Zweck ist ein Polylactid, obgleich andere Polymere von Poly-(α-hydroxycarbonsäuren), wie z. B. Poly-D-(-)-3-hydroxybuttersäure ( EP 133.988 A ) verwendet werden können. Andere bioabbaubare Polymere umfassen Poly(lactone), Poly(acetale), Poly(orthoester) oder Poly(orthocarbonate). Die Ausgangsbetrachtung muss hier sein, dass der Träger selbst oder seine Abbauprodukte im Zielgewebe nicht toxisch sind und das Leiden nicht weiter verschlimmern werden. Dies kann durch Routinescreening in Tiermodellen der Zielstörung oder, falls solche Modelle nicht verfügbar sind, in normalen Tieren ermittelt werden. Zahlreiche wissenschaftliche Publikationen dokumentieren solche Tiermodelle.
Für Beispiele von Retard-Zusammensetzungen siehe US-Patent Nr. 3.773.919, EP 58.481 A , US-Patent Nr. 3.887.699, EP 158.277 A , Kanadisches Patent Nr. 1176565, U. Sidman et al., Biopolymers 22, 547 (1983), und R. Langer et al., Chem. Tech. 12, 98 (1982).
Bei topischer Anwendung wird der VEGF-Antagonist in geeigneter Weise mit anderen Bestandteilen kombiniert, wie z. B. Trägern und/oder Adjuvantien. Es bestehen keine Einschränkungen bezüglich der Beschaffenheit solcher anderer Bestandteile mit der Ausnahme, dass sie pharmazeutisch annehmbar und für ihre beabsichtigte Verabreichung wirksam sein müssen und die Aktivität der aktiven Bestandteile der Zusammensetzung nicht abbauen können. Beispiele geeigneter Vehikel umfassen Salben, Cremen, Gele oder Suspensionen, mit oder ohne gereinigtem Collagen. Die Zusammensetzungen können auch in transdermale Pflaster, Pflaster und Verbände, vorzugsweise in flüssiger oder halbflüssiger Form, imprägniert werden.
Um eine Gelformulierung zu erhalten, kann der in einer flüssigen Zusammensetzung formulierte VEGF-Antagonist mit einer wirksamen Menge eines wasserlöslichen Polysaccharids oder synthetischen Polymers, wie z. B. Polyethylenglykol, gemischt werden, um ein Gel der geeigneten Viskosität für topische Anwendung zu bilden. Polysaccharide, die verwendet werden können, umfassen beispielsweise Cellulosederivate, wie z. B. veretherte Cellulosederivate, einschließlich Alkylcellulosen, Hydroxyalkylcellulosen und Alkylhydroxyalkylcellulosen, beispielsweise Methylcellulose, Hydroxyethylcellulose, Carboxymethylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose und Hydroxypropylcellulose; Stärke und fraktionierte Stärke; Agar; Alginsäure und Alginate; Gummi arabicum; Pullulan; Agarose; Karrageen; Dextrane; Dextrine; Fructane; Inulin; Mannane; Xylane; Arabinane; Chitosane; Glycogene; Glucane; und synthetische Biopolymere; sowie Gummi, wie z. B. Xanthangummi; Guargummi; Johannisbrotkernmehl; Gummi arabicum; Tragantgummi und Karayagummi; und Derivate und Gemische davon. Das hierin bevorzugte Gelierungsmittel ist eines, das gegenüber biologischen Systemen inert, nicht-toxisch, einfach herzustellen und nicht zu dünnflüssig oder viskos ist und den darin gehaltenen VEGF-Antagonisten nicht destabilisiert.
Vorzugsweise ist das Polysaccharid ein verethertes Cellulosederivat, bevorzugter eines, das wohldefiniert, gereinigt und in der USP eingetragen ist, z. B. Methylcellulose und die Hydroxyalkylcellulosederivate, wie z. B. Hydroxypropylcellulose, Hydroxyethylcellulose und Hydroxypropylmethylcellulose. Hierin insbesondere bevorzugt ist Methylcellulose.
Das für die Gelierung zweckdienliche Polyethylenglykol ist typischerweise ein Gemisch aus nieder- und hochmolekularen Polyethylenglykolen, um die geeignete Viskosität zu erhalten. Beispielsweise ist ein Gemisch eines Polyethylenglykols mit einem Molekulargewicht von 400–600 mit einem Polyethylenglykol mit einem Moleku largewicht von 1.500 üblicherweise für diesen Zweck wirkungsvoll, wenn sie in einem geeigneten Verhältnis gemischt werden, um eine Paste zu erhalten.
Der Ausdruck „wasserlöslich" umfasst bei Anwendung auf Polysaccharide und Polyethylenglykole kolloide Lösungen und Dispersionen. Im Allgemeinen ist die Löslichkeit der Cellulosederivate durch den Substitutionsgrad von Ethergruppen bestimmt, und die hierin zweckdienlichen stabilisierenden Derivate sollten eine ausreichende Menge solcher Ethergruppen je Anhydroglukoseeinheit in der Cellulosekette aufweisen, um die Derivate wasserlöslich zu machen. Ein Grad an Ethersubstitution von zumindest 0,35 Ethergruppen je Anhydroglukoseeinheit ist im Allgemeinen ausreichend. Außerdem können die Cellulosederivate in Form von Alkalimetallsalzen, beispielsweise Li-, Na-, K- oder Cs-Salzen, vorliegen.
Wenn Methylcellulose im Gel eingesetzt wird, umfasst es vorzugsweise ungefähr 2–5%, bevorzugter ungefähr 3% des Gels, und der VEGF-Antagonist ist in einer Menge von ungefähr 300–1.000 mg je ml Gel vorhanden.
Die einzusetzende Dosierung hängt von den oben beschriebenen Faktoren ab. Als allgemeiner Vorschlag wird der VEGF-Antagonist in einer Dosis formuliert und der Zielstelle oder dem Gewebe zugeführt, die in der Lage ist, im Gewebe eine VEGF-Antagonistenkonzentration von mehr als ungefähr 0,1 ng/cm³ bis zu einer maximalen Dosis, die wirksam, jedoch nicht übermäßig toxisch ist, zu etablieren. Diese Konzentration innerhalb des Gewebes sollte wenn möglich durch Dauerinfusion, verzögerte Freisetzung, topische Anwendung oder Injektion in empirisch ermittelten Abständen aufrechterhalten werden.
5. Pharmazeutische Zusammensetzungen
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können nach bekannten Verfahren formuliert werden, um pharmazeutisch zweckdienliche Zusammensetzungen herzustellen, wodurch die VEGF-Antagonisten hiervon in Beimengung mit einem pharma zeutisch annehmbaren Trägervehikel kombiniert werden. Geeignete Trägervehikel und ihre Formulierung, einschließlich anderer Human-Proteine, z. B. Human-Serumalbumin, werden beispielsweise in Remington's Pharmaceutical Sciences, Oslo et al. (Hrsg.), 16. Aufl., Mack Publishing Co. (1980), beschrieben, deren Offenbarung hiermit durch Verweis aufgenommen ist. Die VEGF-Varianten hierin können parenteral oder durch beliebige andere Verfahren verabreicht werden, die deren Zufuhr in die Blutbahn in wirksamer Form sicherstellen.
Für die klinische Verabreichung der VEGF-Antagonisten hiervon besonders gut geeignete Zusammensetzungen, die bei der praktischen Umsetzung der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, umfassen beispielsweise sterile wässrige Lösungen oder sterile hydratisierbare Pulver, wie z. B. lyophilisiertes Protein. Es ist im Allgemeinen wünschenswert, in die Formulierung eine geeignete Menge eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes aufzunehmen, im Allgemeinen in einer Menge, die ausreicht, um die Formulierung isotonisch zu machen. Ein pH-Regulator, wie z. B. Arginin-Base, und Phosphorsäure werden typischerweise ebenfalls in ausreichenden Mengen aufgenommen, um einen geeigneten pH, im Allgemeinen von 5,5 bis 7,5, aufrechtzuerhalten. Darüber hinaus kann es zur Verbesserung der Lagerfähigkeit oder Stabilität wässriger Formulierungen auch wünschenswert sein, weitere Mittel, wie z. B. Glycerin, aufzunehmen. Auf diese Weise werden Varianten-t-PA-Formulierungen für parenterale Verabreichung und insbesondere für intravenöse Verabreichung geeignet gemacht.
Dosierungen und gewünschte Medikamentkonzentrationen pharmazeutischer Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können in Abhängigkeit von der speziell vorgesehenen Verwendung variieren. Beispielsweise können „Bolus"-Dosen typischerweise mit anschließenden Verabreichungen eingesetzt werden, die verabreicht werden, um einen ungefähr konstanten Blutspiegel, vorzugsweise in der Größenordnung von ungefähr 3 μg/ml, aufrechtzuerhalten.
Jedoch ist es für die Verwendung in Verbindung mit medizinischen Notfallversorgungseinrichtungen, wo eine Infusionsmöglichkeit im Allgemeinen nicht verfügbar ist, und wegen der im Allgemeinen kritischen Eigenschaft der zugrunde liegenden Krankheit im Allgemeinen wünschenswert, etwas höhere Anfangsdosen, wie z. B. einen intravenösen Bolus, bereitzustellen.
Für die verschiedenen therapeutischen Indikationen, die sich auf die Verbindungen hiervon beziehen, werden die VEGF-Antagonisten üblicherweise in einer Weise formuliert und dosiert, die mit guter medizinischer Praxis im Einklang steht, wobei die speziell zu behandelnde Störung, der Zustand des individuellen Patienten, die Verabreichungsstelle, das Verabreichungsverfahren und andere den praktischen Ärzten in der einschlägigen Wissenschaft bekannte Faktoren berücksichtigt werden. Folglich ist für die Zwecke hierin die „therapeutisch wirksame Menge" der VEGF-Moleküle hiervon eine Menge, die wirksam ist, um das behandelte Leiden entweder zu verhindern, die Verschlimmerung derselben zu vermindern, zu lindern oder zu heilen, insbesondere jene Menge, die ausreicht, um das Wachstum von Gefäßendothel in vivo zu hemmen. Im Allgemeinen wird eine Dosierung eingesetzt, die in der Lage ist, im Gewebe, das das Ziel für die behandelte therapeutische Indikation ist, eine Konzentration des VEGF-Antagonisten hiervon zu etablieren, die höher ist als ungefähr 0,1 ng/cm³ bis zu einer maximalen Dosis, die wirksam, jedoch nicht übermäßig toxisch ist. Es ist vorgesehen, dass die Intra-Gewebe-Verabreichung das Mittel der Wahl für bestimmte therapeutische Indikationen für die Verbindungen hiervon ist.
Die folgenden Beispiele beabsichtigen lediglich, die beste derzeit bekannt Art und Weise zur praktischen Umsetzung der Erfindung zu illustrieren, jedoch ist die Erfindung nicht als auf die Einzelheiten solcher Beispiele eingeschränkt zu betrachten.
Beispiel 1
Materialien – Muta-gene-Phagemid-in-vitro-Mutagenese-Set, Meerrettich-Peroxidase-konjugiertes, für Maus-IgG spezifisches Ziegen-IgG, vorgefärbte Low-range-MW- Standards und Trans-Blot-Transfer-Medium (reine Nitrocellulosemembran) wurden von BioRad Laboratories (Richmond, CA) bezogen. Qiagen-Plasmid-Tip-100-Set und Sequenase Version 2.0 stammten von Qiagen (Chatsworth, CA) bzw. United States Biochemical (Cleveland, OH). SDS-Gele (4–20% Gradientenpolyacrylamid) und vorgeschnittenes Blottingpapier stammten von Integrated Separations Systems (Natick, MA). SDS-Probenpuffer (x-Konzentrat) und verschiedene Restriktionsenzyme stammten von New England Biolabs (Beverly, MA). O-Phenylendiamin-, Citrat-Phosphat-Puffer-, Natriumdodecylsulfat- und H₂O₂-Substrattabletten wurden von Sigma (St. Louis, MO) bezogen. BufferEZE formula 1 (Transferpuffer) und X-OMat-AR-Röntgenfilm stammten von Eastman Kodak Co. (Rochester, NY). Maxosorb- und Immunlon-1-Mikrotiterplatten wurden von Nunc (Kamstrup, Dänemark) bzw. Dynatech (Chantilly, VA) bezogen. Zellkulturplatten (12-Napf) und Kulturmedien (mit Kälberserum) stammten von Costar (Cambridge, MA) bzw. Gibco (Grand Island, NY). Polyethylen-20-sorbitanmonolaurat (Tween 20) stammte von Fisher Biotech (Fair Lawn, NJ). G25-Sephadex-Säulen (PD-10) und ¹²⁵I-markiertes Protein A stammten von Pharmacia (Piscataway, NJ) bzw. Amersham (Arlington Heights, IL). Rinderserumalbumin (BSA) und Kaninchen-IgG-Anti-Human-IgG (Fc-spezifisch) wurden von Cappel (Durham, NC) bzw. Calbiochem (La Jolla, CA) bezogen. Plasmidvektor (pRK5), kompetente E.-coli-Zellen (DH5a und CJ236), synthetische Oligonucleotide, Zellkulturmedium, gereinigtes CHO-hergeleitetes VEGF₁₆₅, monoklonale (Mates A4.6.1, 2E3, 4D7, SC3 und SF8) und polyklonale Antikörper gegen VEGF₁₆₅ wurden bei Genentech Inc. (South San Francisco, CA) hergestellt. Konstruktion, Expression und Reinigung von FLT-1-, flkI- und KDR-Rezeptor-IgG-Chimären erfolgten wie von Park et al., J. Biol. Chem. 269, 25646–25654 (1994), beschrieben.
Ortsgerichtete Mutagenese und Expression von VEGF-Varianten – Ortsgerichtete Mutagenese wurde unter Verwendung des Muta-Gene-Phagemid-in-vitro-Mutagenese-Sets gemäß dem Verfahren von Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. 82, 488–492 (1985), und Kunkel et al., Methods Enzymol. 154, 367–382 (1987), durchgeführt. Ein cDNA für die VEGF₁₆₅-Isoform enthaltender Plasmidvektor, pRK5, wurde für die Mutagenese und vorübergehende Expression verwendet. Der pRK5-Vektor ist ein modi fizierter pUC118-Vektor und enthält einen CMV-Enhancer und -Promotor (Nakamaye et al., Nucleic Acids Res. 14, 9679–9698 (1986), und Vieira et al., Methods Enzymol. 155, 3–11 (1987)). Die mutierte DNA wurde unter Verwendung des Qiagen-Plasmid-Midi-Sets Tip 100 gereinigt und die Sequenz der Mutationen mittels Sequenase Version 2.0 Set verifiziert. Die mutierte DNA wurde durch Restriktionsenzymverdau wie von Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Teil I, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, C5.28–5.32 (1989), beschrieben analysiert.
Die vorübergehende Transfektion von Human-Fötalnieren-„293-Zellen" wurde in 6-Napf-Platten unter Anwendung des modifizierten Calciumphosphatpräzipitationsverfahrens wie früher beschrieben (Jordan et al., Bio/Technology, Manuskript in Vorbereitung (1994); Chen et al., Mol. Cell. Biol. 7, 2745–2752 (1987); Gorman et al., DNA and Protein Engineering Techniques 2, 3–10 (1990); Graham et al., Virology 52, 456–467 (1973)) durchgeführt. Zusammenfassend wurden ungefähr 1,2 × 10⁶ Zellen über Nacht bei 37°C in Gegenwart von 15 μg präzipitierter DNA inkubiert. Der Zellkulturüberstand wurde durch serumfreies Medium ersetzt und die Zellmonoschichten für 72 Stunden bei 37°C inkubiert. Konditioniertes Medium (3 ml) wurde geerntet, zentrifugiert, aliquotiert und bis zur Verwendung bei –70°C gelagert.
Quantifizierung von VEGF₁₆₅-Varianten mittels ELISA – Ein früher beschriebener radioimmunometrischer Test (Aiello et al., N. Engl. J. Med. 331, 1480–1487 (1994)) wurde für die Quantifizierung von VEGF-Mutanten durch das folgende Verfahren adaptiert. Einzelne Näpfe einer 96-Napf-Mikrotiterplatte wurden mit 100 μg einer 3-μg/ml-Lösung eines polyklonalen Anti-VEGF₁₆₅-Antikörpers in 50 mM Natriumcarbonatpuffer, pH 9,6, über Nacht bei 4°C beschichtet. Der Überstand wurde verworfen und die Näpfe 4-mal mit 0,03% Tween 80 enthaltendem PBS gewaschen. Die Platte wurde in Testpuffer (0,5% BSA, 0,03% Tween 80, 0,01% Thimerosal in PBS) für eine Stunde (300 μl/Napf) bei Raumtemperatur geblockt und die Näpfe dann gewaschen. Verdünnte Proben (100 μl) und VEGF₁₆₅-Standard (im Bereich von 0,1 bis 10 ng/ml) wurden jedem Napf zugegeben und für eine Stunde bei Raumtemperatur un ter sanftem Schütteln inkubiert. Der Überstand wurde verworfen und die Näpfe gewaschen. Eine Lösung (100 μl mit 1 μg/ml) des monoklonalen Anti-VEGF-Maus-Antikörpers 5F8 wurde zugegeben und die Mikrotiterplatte bei Raumtemperatur für eine Stunde unter sanftem Schütteln inkubiert. Nach dem Verwerfen des Überstands wurde die Platte gewaschen und Meerrettich-Peroxidase-konjugiertes, für Maus-IgG spezifisches Ziegen-IgG (100 μl) in einer Verdünnung von 1 : 25.000 sofort jedem Napf zugegeben. Die Platte wurde für eine Stunde bei Raumtemperatur unter sanftem Schütteln inkubiert, worauf der Überstand verworfen, die Näpfe gewaschen und durch Zugabe von Ortho-Phenylendiamin (0–04%), H₂O₂ (0,012%) in 50 mM Citrat-Phosphat-Puffer, pH 5, (100 μl) entwickelt und dann bei Raumtemperatur für 10 Minuten im Dunkeln inkubiert wurden. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 50 μl 4,5 N H₂SO₄ zu jedem Napf gestoppt und die Absorption bei 492 nm in einem Mikrotiterplattenlesegerät (SLT Labs) gemessen. Die Konzentrationen der VEGF₁₆₅-Varianten wurden durch Interpolation einer Standardkurve unter Anwendung nichtlinearer Regressionsanalyse quantifiziert. Zu Vergleichzwecken wurde ein zweiter ELISA entwickelt, der ein duales monoklonales Format einsetzte. Der Test war dem oben beschriebenen ELISA ähnlich mit der Ausnahme, dass ein neutralisierender monoklonaler Antikörper (Mab A4.6.1) verwendet wurde, um die Mikrotiterplatten zu beschichten (Kim et al., Growth Factors 7, 53–64 (1992)).
Immunoblotting von VEGF-Mutanten – Aliquote von konditioniertem Zellmedium (16 μl), das VEGF oder VEGF-Mutante (ungefähr 10 ng) enthielt, wurden zu x SDS-Probenpuffer (4 μl) zugegeben und bei 90°C für 3 Minuten erhitzt, bevor sie auf SDS-Polyacrylamidgele (4 bis 20% Acrylamid) aufgegeben wurden. Vorgefärbte MW-Standards (10 μl) wurden auf die äußeren Bahnen der SDS-Gele geladen. Die Gele wurden bei 25 mA für 90 Minuten bei 4°C gefahren. Die Gele wurden in einen Bio-Rad-Tankblotter, der BufferEZE mit 0,1% SDS enthielt, für 90 Minuten bei 250 mA bei 25°C auf Nitrocellulosepapier transferiert. Die Nitrocellulose wurde vor der Verwendung für 10 Minuten in Transferpuffer mit 0,1% SDS vorgetränkt. Die transferierten Immunblots wurden in PBS über Nacht mit 1,0% BSA und 0,1% Tween 20 (Blockpuffer) bei 4°C geblockt. Eine Lösung, die 5 Maus-Anti-VEGF-Mabs (A.4.6.1, 5C3, 5F8, 4D7 und 2E3) enthielt, wurde mit 2 μg/ml jedes Mab in Blockpuffer hergestellt und als Primärantikörper verwendet. Die Primärantikörperlösung wurde mit den Immunblots für 4 Stunden bei 25°C unter sanftem Schütteln inkubiert, dann 3-mal für 10 Minuten in Blockpuffer bei 25°C gewaschen. ¹²⁵I-markiertes Protein A wurde auf 10⁴ cpm/ml (Endkonzentration) in Blockpuffer verdünnt und mit den Immunblots für 60 Minuten unter sanftem Schütteln bei 25°C inkubiert. Die Immunblots wurden 3-mal für 10 Minuten in Blockpuffer bei 25°C gewaschen, dann auf Filterpapier getrocknet und auf Kodak-X-Omat-Film gelegt, und zwar mit zwei Verstärkerfolien bei –70°C für 3 Tage.
Herstellung von ¹²⁵I-markiertem VEGF₁₆₅ – Die Radiomarkierung von CHO-hergeleitetem VEGF₁₆₅ wurde unter Anwendung einer Modifizierung des Chloramin-T-katalysierten Iodierungsverfahrens (Hunter et al., Nature 194, 495–496 (1962)) durchgeführt. In einer typischen Reaktion wurden 10 μl 1 M Tris-HCl, 0,01% Tween 20 bei pH 7,5 zu 5 μl Natrimiodid-125 (0,5 mCi, 0,24 nmol) in einem verschlossenen Reaktionsgefäß zugeben. Zu dieser Reaktion wurden 10 μl CHO-hergeleitetes VEGF₁₆₅ (10 μg, 0,26 nmol) zugegeben. Die Iodierung wurde durch Zugabe von 10 μl (1 mg/ml) Chloramin T mit in 0,1 M Natriumphosphat, pH 7,4, gestartet. Nach 60 Sekunden wurde die Iodierung durch Zugabe von Natriummetabisulfit (20 μl, 1 mg/ml) in 0,1 M Natriumphosphat, pH 7,5, terminiert. Das Reaktionsgefäß wurde nach jeder Zugabe gevortext. Das Reaktionsgemisch wurde auf eine PD-10-Säule (G25 Sephadex) aufgegeben, die mit 0,5% BSA, 0,01% Tween 20 in PBS voräquilibriert war. Es wurden Fraktionen gesammelt und auf Radioaktivität mit einem Gamma-Szintillationszähler (LKB Modell 1277) gezählt. Typischerweise betrug die spezifische Radioaktivität des iodierten VEGF 26 +/- 2,5 μCi/μg, was einem ¹²⁵I je zwei Molekülen VEGF₁₆₅-Dimer entsprach.
VEGF₁₆₅-Rezeptorbindungstest – Der Test wurde in 96-Napf-Immunoplatten (Immu-Ion-1) durchgeführt; jeder Napf wurde über Nacht bei 4°C mit 100 μl einer Lösung beschichtet, die 10 μg/ml Kaninchen-IgG-Anti-Human-IgG (Fc-spezifisch) in 50 mM Natriumcarbonatpuffer, pH 9,6, enthielt. Nach dem Verwerfen des Überstands wur den die Näpfe dreimal in Waschpuffer (0,01% Tween 80 in PBS) gewaschen. Die Platte wurde für eine Stunde in Testpuffer (0,5% BSA, 0,03% Tween 80, 0,01% Thimerosal in PBS) geblockt (300 μl/Napf). Der Überstand wurde verworfen und die Näpfe gewaschen. Es wurde ein Cocktail mit konditioniertem Zellmedium hergestellt, das VEGF₁₆₅-Mutanten in variierenden Konzentrationen (100 μl), ¹²⁵I-radiomarkiertes VEGF₁₆₅ (ungefähr 5 × 10³ cpm in 50 μl) enthielt, der mit VEGF-Rezeptor-IgG-Chimärenprotein, FLT-1, IgG, flk-1-IgG oder KDR-IgG (3–15 ng/ml, Endkonzentration, 50 μl) in Mikroröhrchen gemischt wurde. Aliquote dieser Lösung (100 μl) wurden in vorbeschichtete Mikrotiterplatten gegeben und für 4 Stunden bei Raumtemperatur unter sanftem Schütteln inkubiert. Der Überstand wurde verworfen, die Platte gewaschen und die einzelnen Mikrotiternäpfe mittels Gamma-Szintigraphie (LKB Modell 1277) gezählt. Die kompetitive Bindung zwischen unmarkiertem VEGF₁₆₅ (oder VEGF₁₆₅-Mutanten) und ¹²⁵I-markiertem VEGF₁₆₅ an die FLT-1-, Flk-1- oder KDR-Rezeptoren wurde aufgetragen und unter Verwendung eines Vierparameter-Anpassungsprogramms (Kaleidagraph, Adelbeck Software) analysiert. Die scheinbaren Dissoziationskonstanten für jede VEGF-Mutante wurden aus der zur Erzielung von 50% Hemmung (IC₅₀) erforderlichen Konzentration abgeschätzt.
Test für Gefäßendothelzellen-Wachstum – Die mitogene Aktivität von VEGF-Varianten wurde durch Verwendung von Nebennierenrinden-Rinder-Endothel- (ACE-) Zellen als Zielzellen wie früher beschrieben (Ferrara et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 161, 851–859 (1989)) bestimmt. Zusammenfassend wurde Zellen dünn (7.000 Zellen/Napf) in 12-Napf-Platten ausplattiert und über Nacht in mit 10% Kälberserum, 2 mM Glutamin und Antibiotika ergänztem „Dulbecco's modified Eagle's"-Medium inkubiert. Das Medium wurde am nächsten Tag ausgetauscht und die eingeimpften Zellen mit VEGF oder VEGF-Mutanten, die in Konzentrationen im Bereich von 100 ng/ml bis 10 pg/ml in Kulturmedium verdünnt waren, in zweifacher Ausführung überschichtet. Nach Inkubation für 5 Tage bei 37°C wurden die Zellen mit Trypsin abgelöst und mittels Coulter-Zähler quantifiziert.
Isolierung von VEGF-cDNA
Gesamt-RNA wurde aus Rinder-Hypophysenfollikelzellen (erhalten wie von Ferrara et al., Meth. Enzymol., siehe oben, und Ferrara et al., Am. J. Physiol., siehe oben) extrahiert (Ullrich et al., Science 196, 1313–1317 (1977)) und die polyadenylierte mRNA-Fraktion mittels Oligo(dT)-Cellulosechromatographie isoliert. Aviv et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 1408–1412 (1972). Die cDNA wurde durch Primen mit dT_12–18 oder einem Zufallshexamer dN₆ hergestellt (Wickens et al., J. Biol. Chem. 253, 2483–2495 (1978)).
Die doppelsträngige cDNA wurde unter Verwendung eines cDNA-Sets von Amersham synthetisiert und die resultierende cDNA in EcoRI-gespaltenes Igt10 wie beschrieben subkloniert (Huynh et al., DNA Cloning Techniques, A Practical Approach, Glover (Hrsg.), IRL, Oxford (1985)), außer dass asymmetrische EcoRI-Linker (Norris et al., Gene 7, 355–362 (1979)) verwendet wurden, wodurch die Notwendigkeit für die EcoRI-Methylase-Behandlung vermieden wurde.
Die rekombinanten Phagen wurden auf E.coli C600 Hfl (Huynh et al., s. o.) und Replika auf Nitrozellulosefilter ausplattiert. Benton et al., Science 196, 180–182 (1977). Diese Replika wurden mit einer ³²P-markierten (Taylor et al., Biochim. Biophys. Acta 442, 324–330 (1976)) synthetischen Oligonucleotidsonde der folgenden Sequenz hybridisiert:
5'-CCTATGGCTGAAGGCGGCCAGAAGCCTCACGAAGTGGTGAAGTTCATGGACGTGTATCA-3'
und zwar bei 42°C in 20% Formamid, 5 × SSC, 50 mM Natriumphosphat, pH 6,8, 0,1% Natriumpyrophosphat, 5 × Denhardt-Lösung und 50 mg/ml Lachsspermien-DNA, und in 2 × SSC, 0,1% SDS bei 42°C gewaschen.
Ein positiver, als I.vegf.6 bezeichneter Klon wurde identifiziert. Dieser mit ³²P markierte Klon wurde als Sonde verwendet, um eine Oligo-dT-geprimte Human-Plazenta-cDNA-Bibliothek zu screenen, und es wurden positive Klone beobachtet. Wenn ei ne Human-Hypophysen-cDNA-Bibliothek mit demselben markierten Klon gescreent wurde, wurden keine positiven Klone detektiert.
Die vollständige Nucleotidsequenz des Klons I.vegf.6 wurde mit dem Didesoxyoligonucleotid-Kettenterminationsverfahren (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463–5467 (1977)) nach Subklonierung in den pRK5-Vektor bestimmt. Die erhaltene Sequenz, gemeinsam mit der zugeschriebenen Aminosäuresequenz, einschließlich der Signalsequenz.
Expression des für VEGF kodierenden Gens in Säugetierzellen
Der endgültige Expressionsvektor pRK5.vegf.6 wurde aus I.vegf.6 und pRK5 konstruiert. Die Konstruktion von pRK5 und pRK5.vegf.6 ist unten ausführlich beschrieben.
A. Konstruktion von pRK5
A.1. Konstruktion von pF8CIS
Die anfängliche dreiteilige Konstruktion des Ausgangsplasmids pF8CIS wird unten beschrieben.

1) Der Ampicillin-Resistenzmarker und Replikationsstartpunkt des endgültigen Vektors wurde vom Ausgangsplasmid pUC13pML, einer Variante des Plasmids pML (M. Lusky und M. Botchen, Nature 293, 79 (1981)) hergeleitet. pUC13pML wurde durch Übertragen des Polylinkers von pUC13 (J. Vieira und J. Messing, Gene 19, 259 (1982)) auf die EcoRI- und HindIII-Stellen von pML konstruiert. Ein zweites Ausgangsplasmid, pUC8-CMV, war die Quelle der CMV-Enhancer-, -Promotor- und -Donor-Spleißsequenz. pUC8-CMV wurde durch Insertieren von ungefähr 800 Nucleotiden der CMV-Enhancer-, -Promotor- und -Donor-Spleißsequenz in die stumpfen PstI- und SphI-Stellen von pUC8 konstruiert. J. Vieira und J. Messing, oben zitiert. Synthetische BamHI-HindIII-Linker (im Handel von New England Biolabs erhältlich) wurden an das kohäsive BamHI-Ende ligiert, wodurch eine HindIII-Stelle erzeugt wurde. Nach dieser Ligation wurde ein HindIII-HincII-Verdau durchgeführt. Dieser Verdau lieferte ein Fragment von ungefähr 800 bp, das CMV-Enhancer, -Promotor und -Donor-Spleißstelle enthielt. Nach der Gelisolierung wurde dieses 800-bp-Fragment an ein 2.900-bp-Stück von pUC13pML ligiert. Das für die Konstruktion von pF8CIS erforderliche Fragment wurde durch Verdau des obigen Zwischenplasmids mit SalI und HindIII erhalten. Dieses 3.123-bp-Stück enthielt den Resistenzmarker für Ampicillin, den Replikationsstartpunkt von pUC13pML und die Kontrollsequenzen für das CMV, einschließlich Enhancer, Promotor und Donor-Spleißstelle.
2) Das Intron der variablen Ig-Region und die Akzeptor-Spleißsequenz wurden unter Verwendung eines synthetischen Oligomers konstruiert. Es wurden ein 99-Mer und ein 30-Mer chemisch synthetisiert, die die folgende Sequenz für das IgG-Intron und die Akzeptor-Spleißstelle aufweisen (Bothwell et al., Nature 290, 65–67 (1981)):
DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) füllte das synthetische Stück auf und erzeugte ein doppelsträngiges Fragment. R. M. Wartell und W. S. Reznikoff, Gene 9, 307 (1980). Dem folgte ein Doppelverdau mit PstI und HindIII. Dieser synthetische Linker wurde an den PstI- und HindIII-Stellen in pUC13 kloniert (Veira und Messing, oben zitiert). Die das synthetische, pUCIg.10 genannte Oligonucleotid enthaltenden Klone wurden mit PstI verdaut. Eine ClaI-Stelle wurde diesem Fragment durch Verwendung eines PstI-ClaI-Linkers angefügt. Nach Verdau mit HindIII wurde ein 118-bp-Stück, das einen Teil des Ig-Introns und den Spleißakzeptor der variablen Ig-Region enthielt, gelisoliert.
3) Der dritte Teil des Konstruktionsschemas ersetzte das Hepatitis-Oberflächen-Antigen-3'-Ende durch die Polyadenylierungsstelle und Transkriptionsterminationsstelle der frühen Region von SV40. Ein Vektor, pUC.SV40, der die SV40-Sequenzen enthält, wurde in pUC8 an der von Vieira und Messing (oben zitiert) beschriebenen BamHI-Stelle insertiert. pUC.SV40 wurde dann mit EcoRI und HpaI verdaut. Ein die SV40-Poladenylierungssequenz enthaltendes 143-bp-Fragment wurde aus diesem Verdau gelisoliert. Zwei weitere Fragmente wurden nach Verdau von pSVE.8c1D gelisoliert (EP-A-160.457). Das durch EcoRI- und Cla1-Verdau erzeugte 4,8-bp-Fragment enthält die SV40-DHFR-Transkriptionseinheit, den Replikationsstartpunkt von pML und den Ampicillin-Resistenzmarker. Das nach Verdau mit ClaI und HpaI produzierte 7,5-bp-Fragment enthält die cDNA für Faktor VIII. Die dreiteilige Ligation lieferte pSVE.8c24D. Dieses Zwischenplasmid wurde von ClaI und SalI verdaut, um ein 9611-bp-Fragment zu liefern, das die cDNA für Faktor VIII mit einer SV40-Poly-A-Stelle, gefolgt von der SV40-DHFR-Transkriptionseinheit enthält.

Die endgültige dreiteilige Ligation zur Hervorbringung von pF8CIS verwendete: a) das 3123-bp-SalI-HindIII-Fragment, das den Replikationsstartpunkt, den Ampicillin-Resistenzmarker und den CMV-Enhancer, -Promotor und -Donor-Spleißstelle enthält; b) das 118-bp-HindIII-ClaI-Fragment, das das Ig-Intron und die Akzeptor-Spleißstelle enthält; und c) ein 9611-bp-ClaI-SalI-Fragment, das die cDNA für Faktor VIII, die SV40-Polyadenylierungsstelle und die SV40-DHFR-Transkriptionseinheit enthält.
A.2. Konstruktion von pCIS2.8c28D
pCIS2.8c28D umfasst eine 90-kd-Untereinheit von Faktor VIII, die an eine 73-kd-Untereinheit von Faktor VIII gebunden ist. Die 90-kd-Untereinheit umfassen die Aminosäuren 1 bis 740 und die 73-kd-Untereinheit die Aminosäuren 1.690 bis 2.332. Dieses Konstrukt wurde durch dreiteilige Ligation der folgenden Fragmente hergestellt: a) das 12.617-bp-ClaI-SstII-Fragment von pF8CIS (aus einem dam -Stamm isoliert und BAP-behandelt); b) das 216-bp-SstII-PstI-Fragment aus pF8CIS; und c) ein kurzes synthetisches PstI-ClaI-Oligonucleotid, das Kinase-behandelt war.
Zwei unterschiedliche Fragmente, A und B, wurden in denselben pUC118-BamHI-PstI-BAP-Vektor kloniert. Das A-Fragment war das 408-bp-BamHI-HindIII-Fragment von pUC408BH, und das B-Fragment war ein HindIII-PstI-Oligonucleotid. Dieses Oligonucleotid wurde ohne Kinase-Behandlung verwendet, um seine Polymerisation während der Ligation zu verhindern.
Nach der Ligation der A- und B-Fragmente in den Vektor wurden die erwarteten Verbindungssequenzen mittels DNA-Sequenzierung der von den Nucleotiden umfassten Regionen bestätigt.
Das resultierende Plasmid, pCIS2.8c28D, wurde mit einer vierteiligen Ligation konstruiert. Das Fusionsplasmid wurde mit BamHI und PstI geschnitten und das 443-bp-Fragment isoliert. Die verbleibenden drei Fragmente der vierteiligen Ligation waren: 1) 1.944-bp-ClaI-BamHI von pSVEFVIII (EP-A-160.457); 2) ein 2.202-bp-BamHI-XbaI-Fragment von pSVEFVIII, das mit PstI teilweise weiter verdaut wurde, und das 1.786-bp-PstI-XbaI-Fragment wurde isoliert, und 3) das 5.828-bp-XbaI-ClaI-BAP-Fragment von pCIS2.8c24D. Die translatierte DNA-Sequenz der resultierenden Variante in der exakten Fusionsverbindungsregion von pCIS2.8c28D wurde ermittelt, und sie korreliert.
A.3. Konstruktion von pRK5
Das Ausgangsplasmid zur Konstruktion von pRK5 war pCIS2.8c28D. Die Basennummern in Absätzen 1 bis 6 beziehen sich auf pCIS2.8c28D, wobei die Base Eins des ersten T der EcoRI-Stelle dem CMV-Promotor vorangeht. Früher Promotor und Intron von Cytomegalovirus und Startpunkt und Poly-A-Signal von SV40 wurden auf gesonderten Plasmiden untergebracht.

1. Der frühe Cytomegalovirus-Promotor wurde als ein EcoRI-Fragment aus pCIS2.8c28D (9.999–1.201) in die EcoRI-Stelle des oben beschriebenen pUC118 kloniert. Zwölf Kolonien wurden gewählt und hinsichtlich der Ausrichtung gescreent, in welcher die aus pUC118 hergestellte einzelsträngige DNA die Sequenzierung von der EcoRI-Stelle bei 1.201 bis zur EcoRI-Stelle bei 9.999 ermöglichen würde. Dieser Klon wurde pCMVE/P genannt.
2. Einzelsträngige DNA wurde aus pCMVE/P hergestellt, um einen SP6- (M. R. Green et al., Cell 32, 681–694 (1983)) Promotor mittels ortgerichteter Mutagenese zu insertieren. Ein synthetisches 110-Mer, das die Sequenzen von –69 bis +5 des SP6-Promotors enthielt (siehe Nucleic Acids Res. 12, 7041 (1984)), wurde gemeinsam mit 18-bp-Fragmenten an beiden Enden des den CMVE/P-Sequenzen entsprechenden Oligomers verwendet. Die Mutagenese wurde mittels Standardtechniken durchgeführt und unter Verwendung des 110-mers bei hoher und niedriger Stringenz gescreent. Sechs potentielle Klone wurden selektiert und sequenziert. Ein positiver Klon wurde identifiziert und pCMVE/PSP6 genannt.
3. Der SP6-Promotor wurde überprüft und erwies sich als aktiv, beispielsweise durch Zugeben von SP6-RNA-Polymerase und Überprüfen auf RNA richtiger Größe.
4. Ein Cla-NotI-Sma-Adaptor wurde synthetisiert, um den Ort von der ClaI-Stelle (912) zur SmaI-Stelle von pUC118 in pCMVE/P (Schritt 1) und pCMVE/PSP6 (Schritt 2) zu umfassen. Dieser Adaptor wurde in die ClaI-SmaI-Stelle von pUC118 ligiert, und es wurde auf korrekte Klone gescreent. Der Linker wurde in beiden sequenziert, und die Klone wurden pCMVE/PSP6-L und pCMVE/P-L genannt.
5. pCMVE/PSP6-L wurde mit SmaI (an Linker-pUC118-Verbindung) und HindIII (in pUC118) geschnitten. Ein HpaI-(5.573)→HindIII-(6136)-Fragment aus unten beschriebenem pSVORAADRI 11 wurde in SmaI-HindIII von pCMVE/PSP6-L insertiert. Diese Ligation wurde gescreent, und es wurde ein Klon isoliert und pCMVE/PSP6-L-SCORAADRI genannt.
a) Startpunkt und Poly-A-Signal von SV40 wurde als XmnI-(5.475)-HindIII-(6.136)-Fragment aus pCIS2.8c28D isoliert und in die HindIII→SmaI-Stellen von pUC119 kloniert (beschrieben in Vieira und Messing, oben zitiert). Dieser Klon wurde pSVORAA genannt.
b) Die EcoRI-Stelle bei 5.716 wurde durch Teilverdau mit EcoRI und Auffüllen mit Klenow entfernt. Die aus der Selbst-Ligation nach Auffüllung erhaltenen Kolonien wurden gescreent und der korrekte Klon isoliert und pSVORAADRI 11 genannt. die deletierte EcoRI-Stelle wurde durch Sequenzierung überprüft und erwies sich als korrekt.
c) Das HpaI-(5.573)→HindIII-(6.136)-Fragment von pSVORAADRI 11 wurde isoliert und in pCMVE/PSP6-L (siehe 4 oben) insertiert.
6. pCMVE/PSP6-L-SVOrAADRI (Schritt 5) wurde mit EcoRI bei 9.999 geschnitten, abgestumpft und selbst-ligiert. Ein Klon ohne eine EcoRI-Stelle wurde identifiziert und pRK genannt.
7. pRK wurde mit SmaI und BamHI geschnitten. Dieses wurde mit Klenow aufgefüllt und neu ligiert. Die Kolonien wurden gescreent. Ein positiver Klon wurde identifiziert und pRKDBam/Sma3 genannt.
8. Die HindIII-Stelle von pRKDBam/Sma3 wurde in eine HpaI-Stelle unter Verwendung eines Konverters umgewandelt. (Ein Konverter ist ein DNA-Stück, das zur Umwandlung einer Restriktionsstelle in eine andere verwendet wird. In diesem Fall wäre ein Ende komplementär zu einem kohäsiven HindIII-Ende, und das andere Ende hätte eine Erkennungsstelle für HpaI) Ein positiver Klon wurde identifiziert und pRKDBam/Sma, HIII-HpaI 1 genannt.
9. pRKDBam/Sma, HIII-HpaI 1 wurde mit PstI und NotI geschnitten, und es wurden ein EcoRI-HindIII-Linker und HindIII-EcoRI-Linker hineinligiert. Es wurden Klone für beide Linker gefunden. Jedoch wurde ebenfalls ermittelt, dass zu viele der HpaI-Konverter eingebaut wurden (zwei oder mehr Konverter erzeugen eine PvuII-Stelle). Daher mussten diese Klone mit HpaI geschnitten und selbst-ligiert werden.
10. RI-HIII-Klon 3 und HII-RI-Klon 5 wurden mit HpaI geschnitten, verdünnt und selbst-ligiert. Es wurden Positive identifiziert. Der RI-HIII-Klon wurde pRK5 genannt.

B. Konstruktion von pRK5.vegf.6
Der Klon I.vegf.6 wurde mit EcoRI behandelt und das EcoRI-Insert isoliert und in das Vektorfragment von pRK5 ligiert, das durch Verdau von pRK5 mit EcoRI und Isolierung des großen Fragments erhalten wurde. Die zweiteilige Ligation dieser Fragmente lieferte den Expressionsvektor pRK5.vegf.6, der auf die korrekte Ausrichtung der für VEGF kodierenden Sequenz bezüglich des Promotors gescreent wurde.
Weitere die Konstruktion des grundlegenden pRK5-Vektors betreffende Einzelheiten können dem US-Patent Nr. 5.332.671, erteilt am 26. Juli 1994, entnommen werden, wobei das Patent hierin ausdrücklich durch Verweis aufgenommen ist.
Beispiel 2
Das folgende Beispiel beschreibt ausführlich die allgemein eingesetzte Verfahrensweise, um die verschiedenen VEGF-Mutanten herzustellen, die von der vorliegenden Erfindung umfasst sind. Der grundlegende Expressionsvektor wurde wie folgt hergestellt:
Es wurde der die cDNA von VEGF₁₆₅ enthaltende Vektor SDVF₁₆₅ erhalten. Die cDNA für VEGF₁₆₅ wurde aus SDVF₁₆₅ durch Restriktionsverdau mit HindIII und EcoRI isoliert. Dieses isolierte Insert wurde in das pRK5-Plasmid ligiert, wobei die darin existierenden EcoRI- und HindIII-Stellen zunutze gemacht wurden. Das resultierende Plasmid wurde in kompetente E.-coli-CJ236-Zellen transformiert, um ein Templat für ortsgerichtete Mutagenese herzustellen. Das entsprechende Oligonucleotid, das die mutierte Stelle enthielt, wurde dann hergestellt (siehe unten) und der ortsgerichtete Mutagenese-Schritt in vitro im Einklang mit bekanten Verfahren unter Verwendung des Muta-Gene-Mutagenese-Sets von BioRad durchgeführt. Nach einer Sequenzierung, um zu ermitteln, dass die mutierte Stelle in den endgültigen Expressionsvektor eingebaut war, wurde der resultierende Vektor in 293-Human-Nierenzellen für die vorübergehende Expression transfiziert.
Die folgenden Oligonucleotide wurden hergestellt, um das endgültige mutierte Produkt herzustellen.
Tabelle 1
Auf diese Weise in Übereinstimmung mit der Insertion von Oligonucleotiden hergestellt, ist in der obigen Tabelle 1 dargestellt, die in der linken Spalte sind an der entsprechenden Mutation im VEGF-Molekül in Übereinstimmung mit der Bezeichnung, die in der linken, „Mutation" genannten Spalte vergeben wurde, hergestellt. Die Benennung der Verbindung steht im Einklang mit der Namensgebungskonvention. Folglich wird die Mutation für den ersten Eintrag „C51D" genannt. Dies bedeutet, dass an der Aminosäureposition 51 des VEGF-Moleküls der Cystein- (C-) Rest mutiert wurde, um an dieser 51-Position eine Asparaginsäure (D) zu insertieren.
2 ist eine Grafik, die das native VEGF-Dimer und gewisse der Varianten-VEGF-Polypeptide der vorliegenden Erfindung zeigt. Wie in 2 gezeigt ist, dimerisiert das VEGF-Molekül über die Bildung von Disulfidbindungen zwischen dem Cystein an der Aminosäureposition 51 an einem Monomer und dem Cystein an der Aminosäureposition 60 am anderen Monomer und umgekehrt. Die Umwandlung des Cysteinrests an der Aminosäureposition 51 oder 60 in Asparaginsäure (C51D bzw. C60D) verhindert die richtige Dimerisierung und die Bildung versetzter Dimermoleküle. Die Umwandlung beider Cysteinreste an Aminosäurepositionen 51 und 60 (C51D, C60D) verhindert die Dimerbildung gänzlich.
Bindung von VEGF-Varianten an VEGF-Rezeptoren – Natives VEGF-Dimer und die VEGF-Varianten-Polypeptide, die in 2 gezeigt sind, wurden auf ihre Fähigkeit hin untersucht, an die KDR- und FLT-1-Rezeptoren zu binden. Rezeptorbindungstests wurden wie oben beschrieben durchgeführt. Die für die Bindung an den KDR-Rezeptor erhaltenen Ergebnisse sind in den 3 und 4 dargestellt.
Wie in 3 gezeigt ist, behielten alle der drei getesteten VEGF-Varianten-Polypeptide die Fähigkeit bei, an den KDR-Rezeptor zu binden, obgleich keines davon eine Bindungsaffinität zeigte, die so hoch war wie die des nativen VEGF-Dimer-Proteins. Die in 3 dargstellten Ergebnisse beweisen auch, dass das monomere Varianten-Polypeptid C51D, C60D die Fähigkeit beibehält, an den KDR-Rezeptor zu binden, jedoch tut es dies mit einer verminderten Bindungsaffinität im Vergleich zum nativen Dimer oder zu zwei getesteten versetzten Dimeren. 4 beweist, dass die Bindungsaffinität der monomeren C51D-, C60D-Variante für den KDR-Rezeptor ungefähr um das 500fache niedriger als die des nativen dimeren VEGF-Proteins ist. Folglich beweisen diese Ergebnisse, dass jedes der getesteten VEGF-Varianten-Polypeptide die Fähigkeit beibehält, an den KDR-Rezeptor zu binden, obgleich mit einer niedrigeren Bindungsaffinität.
Die 5 und 6 zeigen die erhaltenen Ergebnisse, wenn die Bindung der Polypeptide von 2 an den FLT-1-Rezeptor gemessen wurde. Die in 5 dargestellten Ergebnisse beweisen, dass alle getesteten Varianten ihre Fähigkeit beibehalten, an den FLT-1-Rezeptor zu binden, obgleich mit verminderten Bindungsaffinitäten im Vergleich zum nativen VEGF-Dimer. 6 beweist, dass die Bindungsaffinität der monomeren C51D-, C60D-Variante für den FLT-1-Rezeptor um ungefähr das 140fache niedriger ist als die des nativen VEGF-Dimers. Folglich beweisen diese Ergebnisse, dass jedes der getesteten VEGF-Varianten-Polypeptide die Fähigkeit beibehält, an den FLT-1-Rezeptor zu binden, obgleich mit einer niedrigeren Bindungsaffinität.
Stimulierung der Mitogenese durch VEGF und seinen Varianten – Da von den in 2 dargestellten VEGF-Varianten gezeigt wurde, dass sie zur Bindung des KDR- sowie des FLT-1-Rezeptors fähig sind, wurden diese Varianten auf ihre Fähigkeit hin getestet, Mitogenese in Endothelzellen zu stimulieren. Die Mitogenese-Stimulationstests wurden wie oben beschrieben durchgeführt. Die Ergebnisse aus diesen Tests sind in 7 dargestellt.
Wie in 7 gezeigt ist, zeigen die getesteten VEGF-Varianten (versetzte Dimere C51D und C60D sowie die monomere Variante C51D, C60D) eine hemmende Wirkung auf die mitogene Stimulierung von Endothelzellen, während das native VEGF-Dimer-Molekül zur wirksamen Stimulierung der Mitogenese in Endothelzellen fähig ist. Diese Ergebnisse beweisen, dass die richtige Dimerisierung zwischen den Cysteinresten an Aminosäurepositionen 51 und 60 des nativen VEGF-Polypeptids für eine wirksame mitogene Stimulierung von Endothelzellen essentiell ist. An sich beweisen diese Daten, dass Aminosäuremodifizierungen, die die Fähigkeit von monomeren VEGF-Einheiten zerstört, richtig zu dimerisieren, die mitogene Aktivität des Moleküls hemmen. Wenn man bedenkt, dass diese Varianten-Moleküle dazu fähig sind, an VEGF-Rezeptoren zu binden und diese zu belegen, ohne eine „Nativ-VEGF-artige" mitogene Reaktion zu induzieren, könnten solche Varianten-Moleküle als wirksame Antagonisten der VEGF-Aktivität dienen.
Fähigkeit des C51D-, C60D-Monomers, das VEGF-induzierte Endothelzellen-Wachstum zu hemmen – Das monomere C51D-, C60D-Polypeptid wurde in Tests eingesetzt, die zur Messung der Fähigkeit des Monomers entworfen waren, das VEGF-induzierte Wachstum von Endothelzellen zu hemmen. Zusammenfassend wurden Endothelzellen in Gegenwart von 3 ng/ml VEGF und variierenden Mengen von entweder monoklonalem A461-Anti-VEGF-Antikörper oder monomerem C51D-, C60D-Polypeptid kultiviert. Die Ergebnisse, die die hemmenden Wirkungen jedes Hemmstoffs auf das Endothelzellen-Wachstum nachweisen, sind in 8 dargestellt.
Die in 8 dargestellten Ergebnisse beweisen, dass sowohl der monoklonale A461-Anti-VEGF-Antikörper als auch das monomere C51D-, C60D-Polypeptid substantielle hemmende Wirkungen auf das VEGF-induzierte Endothelzellen-Wachstum zeigen. Diese hemmenden Wirkungen erhöhen sich mit der Erhöhung des Verhältnisses von Hemmstoff zu VEGF. Als solches fungiert das monomere C51D-, C60D-Polypeptid, um die Endothel-wachstumsaktivierende Wirkung von VEGF zu hemmen.
Anschließende Bemerkungen
Die vorangehende Beschreibung beschreibt in ausführlicher Weise spezielle Verfahren, die eingesetzt werden können, um die Erfindung praktisch umzusetzen. Mit der detaillierten Beschreibung spezifischer Verfahren haben Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung ausreichend Know-how, um alternative verlässliche Verfahren zu entwickeln, die dieselbe Information durch Verwendung der Ergebnisse der vorliegenden Erfindung erreichen. Somit, wie detailliert auch immer das Vorhergehende im Text erscheinen mag, sollte das aber nicht so ausgelegt werden, als dass es den gesamten Schutzumfang davon einschränkt; vielmehr ist der Geltungsbereich der vor liegenden Erfindung nur durch die regelkonforme Auslegung der angefügten Ansprüche zu bestimmen.

Claims

VEGF-Antagonistenmolekül, umfassend eine Gefäßendothel-Wachstumsfaktor-Polypeptidvariante, wobei die Polypeptidvariante eine Aminosäuremodifikation zumindest eines Cysteinrests an Position 51 und/oder 60 der nativen VEGF-Aminosäuresequenz umfasst, worin die Aminosäuremodifikation die Fähigkeit der Polypeptidvariante hemmt, richtig mit einem anderen Gefäßendothel-Wachstumsfaktor-Polypeptidmonomer zu dimerisieren, worin das Antagonistenmolekül fähig ist, sich an Gefäßendothel-Wachstumsfaktor-Rezeptoren zu binden, ohne eine signifikante Gefäßendothel-Wachstumsfaktor-Reaktion zu induzieren.
Antagonistenmolekül nach Anspruch 1, worin die Aminosäuremodifikation eine Substitution des zumindest einen Cysteinrests durch eine andere Aminosäure ist, die nicht fähig ist, eine Disulfidbindung einzugehen.
Antagonistenmolekül nach Anspruch 2, worin Cystein durch Asparaginsäure substituiert ist.
Antagonistenmolekül nach Anspruch 3, das die Substitution C51D umfasst.
Antagonistenmolekül nach Anspruch 3, das die Substitution C60D umfasst.
Antagonistenmolekül nach Anspruch 1, worin die Aminosäuremodifikation eine chemische Modifikation des zumindest einen Cysteinrests ist, die den Cysteinrest unfähig macht, eine Disulfidbindung einzugehen.
Antagonistenmolekül nach Anspruch 1, das weitere Aminosäuremodifikationen enthält, die die grundlegenden biologischen Eigenschaften ansonsten nicht beeinflussen.
Isolierte Nucleinsäuresequenz, die eine Sequenz umfasst, die für ein VEGF-Antagonistenmolekül nach Anspruch 1 kodiert.
Replizierbarer Expressionsvektor, der fähig ist, in einer Transformantenwirtszelle ein Nucleinsäure nach Anspruch 8 zu exprimieren.
Wirtszellen, die mit einem Vektor nach Anspruch 9 transformiert sind.
Wirtszellen nach Anspruch 10, die China-Hamster-Eierstockzellen sind.
Stoffzusammensetzung, die ein VEGF-Antagonistenmolekül nach Anspruch 1 mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger compoundiert umfasst.
VEGF-Antagonist nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Verwendung in einem medizinischen Behandlungsverfahren.
Verwendung eines VEGF-Antagonisten nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Erkrankungen oder Störungen, die durch unerwünschte übermäßige Gefäßbildung oder unerwünschte Gefäßdurchlässigkeit gekennzeichnet sind.
Verwendung nach Anspruch 14, worin die Erkrankung oder Störung ein Tumor, ein massiver bösartiger Tumor, primärchronische Polyarthritis, Psoriasis, Atherosklerose, diabetische oder eine andere Retinopathie, retrolentale Fibroplasie, altersbedingte Macula-Degeneration, neovaskuläres Glaukom, Hämangiome, Schilddrüsen-Hyperplasien, Basedow-Krankheit, Hornhaut- oder andere Gewebetransplantation, chronische Entzündungen, mit Gehirntumoren verbundene Ödeme, mit Malignität verbundene Bauchwassersucht, Meigs-Syndrom, Lungenentzündung, Nierenentzündungssyndrom, Perikarderguss oder Pleuraerguss ist.