DE69027990T2

DE69027990T2 - Kultur des wachstumsfaktors der vaskularen endothelialzellen und dns, die dafür kodiert

Info

Publication number: DE69027990T2
Application number: DE69027990T
Authority: DE
Inventors: Napoleone San Francisco Ca 94123 Ferrara; David Wai-Hung Foster City Ca 94404 Leung
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1989-05-12
Filing date: 1990-05-09
Publication date: 1997-01-30
Anticipated expiration: 2010-05-10
Also published as: IL154797A0; DK0471754T3; IE901494L; CA2054699A1; IE74169B1; DE69027990D1; JP3117992B2; AU635935B2; IL94128A0; CA2054699C; EP0471754B1; US20070161558A1; AU5657490A; ATE140968T1; PT93996A; EP0471754A1; WO1990013649A1; ES2093025T3; NZ233451A; US5332671A

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf einen Wachstumsfaktor für Gefäßendothelzellen und auf die Mittel und Verfahren seiner Produktion in therapeutisch bedeutsamen Mengen. Ein beträchtlicher Forschungsaufwand wurde in die Aufklärung der Morphologie und Physiologie der Sekretionszellen des vorderen Hypophysenlappen und Pars tuberalis investiert. Doch bis jetzt ist wenig über die Funktion der Follikelzellen oder der stemförmigen Follikelzellen (FC), einer morphologisch gut charakterisierten Population der Granulazellen, bekannt. Die FC's sind sternförmige Zellen, die Zytoplasma-Prozesse zwischen den Sekretionszellen vermitteln.
Ein Verfahren zur Kultivierung von homogenen Populationen von FC's wird von Ferrara et al., Meth. Enz. (Hrsg., Conn, P. M.), Vol 124, pp. 245-253 (Academic Press, New York, 1986) beschrieben. Das Wachstumsverhalten und die Expression der Kuppelformation durch FC's in Kultur und deren Ultrastruktur wurden aufgeklärt (Ferrara et al., Am. J. Physiol., 252: E304-312 (1987)). Zusätzlich wurden FC's als Ionentransportelemente charakterisiert, die möglicherweise an die Regulation der Ionenzusammensetzung und Osmolarität der interstitiellen Flüssigkeit in den Zelisträngen des vorderen Hypophysenlappens beteiligt sind (Ferrara und Gospodarowitz, Biochem. Biophys. Res. Comm., 157: 1376-1382 (1988)). Zusätzlich produzieren FC's den gefäß-bildenden basischen Mitogenfibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) (Ferrara et al., Proc. Nat. Acad. Sci., U.S.A., 84: 5773-5777 (1987)).
Das Gen, das für bFGF kodiert, welches in Abraham et al., EMBO J. 5: 2523-2529 (1986) beschrieben ist, kodiert nicht für ein konventionelles Signalpeptid, das für den extrazellulären Transport von Proteinen entsprechend klassischer Sekretionswege benötigt wird (Walter und Blobel, J. Cell. Biol., 91: 557-561(1981)). Auch das Gen, das für den sauren Fibroblastenwachstumsfaktor (aFGF) kodiert, das in Jaye et al., Science, 233: 541-544 (1986) beschrieben ist, tut dies nicht. Demzufolge wird der Wachstumsfaktor nicht ausreichend ins Medium ausgeschieden (Moscatelli et al., J. Cell Physiol., 129: 273-277 (1986); Klagsburn et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 83: 2448- 2452 (1986)), darauf reagierende Zelltypen sind von exogenem bFGF abhängig, um in Kultur optimal zu gedeihen, auch wenn sie beträchtliche intrazelluläre Konzentrationen des Mitogens enthalten (Neufeld et al., Endocrinology, 121: 597-602 (1987); Schweigerer et al., Endocrinology 120: 796-802 (1987); Schweiger et al., Exp. Eye Res., 46: 71-80 (1988). Es wurde vermutet, daß bFGF in die Basalmembran inkorporiert sein könnte und nur dann in einer löslichen Form freigesetzt werden kann, wenn die Matrix durch die Wirkung spezifischer Enzyme abgebaut wird (Vlodasky et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 2282-2286 (1987)). Ein solcher Mechanismus der Freisetzung läßt vermuten, daß der Wachstumsfaktor vor allem oder nur bei solchen Ereignissen eine Rolle spielt, die einen Abbau der Basalmemebran oder eine Zelllyse, wie z.B. Organ(neu)bildung, Wundheilung oder Gewebsneubildung (Folkman und Klagsburn, Science, 235: 442-447 (1987)) beeinhalten.
Zusätzlich sind sowohl bFGF als auch aFGF stark wirksame Mitogene für Hornhautendothelzellen, Linsenepithelzellen, BHK-21-Fibroblasten, Nebennierenrindenzellen und Keratinozyten (Hornhautzellen) sowie Gefäßendothelzellen (Gospodarowicz et al., Endocrine Reviews, 8: 95-114 (1987); Baird et al., Recent Prog. Horm. Res., 42:143- 186 (1986)).
Ein Gefäßendothelzellenmitogen wurde von Plouet und Gospodarowicz, The International Symposium on the Development of the Vascular System, Madison, WI, April 23-26, 1989, mit dem Titel "Isolation and Characterization of a New Vascular Cell Mitogen: Vasculotropin." isoliert und beschrieben. Vor sehr kurzer Zeit wurde ein Heparin-bindender Endothelzellenwachstumsfaktor, der sogenannte Gefäßendothelwachstumsfaktor (VEGF), identifiziert und aus Medien isoliert, die Rinderhypophysenfollikel- oder sternförmige Follikelzellen enthielten (Ferrara und Henzel, Biophys. Res. Comm., 161: 851(1989)).
Es besteht Bedarf nach einem Wachstumsfaktor, der im Gegensatz zu aFGF und bFGF nicht im Inneren der Ursprungszelle sequestriert, sondern ausgeschieden wird und somit direkt die Zielzellen erreicht. So ein Wachstumsfaktor könnte eine dynamischere Rolle in der physiologischen Regulation der Gefäßendothelzellenentwicklung spielen, und auch im Wachstumszyklus von Blutgefäßen, das in Organen wie dem Corpus luteum stattfindet (Basset, Am. J. Anat., 73: 251-259 (1943)) oder in der tonischen Aufrechterhaltung des differenzierten Status des Endothels in Gefäßsystem.
Es besteht Bedarf nach einem Wachstumsfaktor, der im Gegensatz zu aFGF und bFGF, die bei einem sehr breiten Spektrum von Zellen wirken, spezifisch für Gefäßendothelzellen ist. Eine solche Spezifität könnte für Bedingungen, in denen eine selektive Wirkung auf die Gefäßendothelzellen ohne übermäßiges Wachstum des Bindegewebes gewünscht wird, wie bei Diabetesgeschwüren und traumatischen Gefäßverletzungen, nützlich sein.
Obwohl ein Gefäßendothelzellenwachstumsfaktor, der die oben genannten Ansprüche erfüllt, isoliert und zur darauffolgenden Verwendung gereinigt werden kann, verhindern die relativ niedrige Konzentration des Proteins in FC's und die hohen Kosten die Gewinnung von gereinigtem Wachstumsfaktor in kommmerziellen Mengen, sowohl was den Aufwand als auch die Ausgaben betrifft, die Verwendung in breitem Maßstab.
Daher ist es das Ziel der vorliegenden Erfindung, DNA zu isolieren, die für den Gefäßendothelzellenwachstumsfaktor kodiert, und im Handel verwendbare Mengen des Proteins aus therapeutisch akzeptablen Quellen herzustellen.
Weiters ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, den Gefäßendothelzellenwachstumsfaktor in einer Form zu erhalten, die frei von mit dem nativen Wachstumsfaktor assoziierter Glykosylierung ist.
Es ist ebenfalls ein Ziel der vorliegenden Erfindung, die Aminosäuresequenz und andere Varianten des Gefäßendothelzellenwachstumsfaktors, die die biologische Aktivität des Proteins nicht negativ beeinflussen, bereitzustellen.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, einen Gefäßendothelzellenwachstumsfaktor herzustellen, der vollständig frei von anderen, natürlich vorkommenden Ursprungsproteinen ist.
Diese und andere Ziele der Erfindung werden aus der Beschreibung klar werden.
Die Ziele dieser Erfindung werden durch Expression eines Gens, das für den Gefäßendothelzellenwachstumsfaktor kodiert, in rekombinanter Zellkultur erreicht, ein Verfahren, das im wesentlichen die Bereitstellung von Nukleinsäure, die für den Wachstumsfaktor kodiert, sowie die Transformation von Wirtszellen mit der für den Wachstumsfaktor kodierenden Nukleinsäure, und die Kultivierung der Zellen, zur Expression der Nukleinsäure, die für den Wachstumsfaktor kodiert, in der Wirtszellkultur umfaßt.
In einer spezifischen Ausführungsform schließt diese Erfindung eine isolierte Nukleinsäuresequenz ein, welche eine Sequenz umfaßt, die für einen Gefäßendothelzellenwachstumsfaktor kodiert, der ein Molekulargewicht von etwa 45.000 Daltons unter nicht reduzierenden Bedingungen und etwa 23.000 unter reduzierenden Bedingungen bestimmt mittels SDS-PAGE, aufweist.
In einem weiteren Aspekt dieser Erfindung wird eine isolierte DNA-Sequenz bereitgestellt, die eine Sequenz umfaßt, die mit der tolgenden DNA-Sequenz: 5'- CCTATGGCTGAAGCCGGCCAGAAGCCTCACGAAGTGGTGAAGTTCATGGACGTGTATCA-3' hybridisiert, wenn diese bei 42ºC in 20% Formamid, 5 x SSC, 50 mM Natriumphosphat (pH 6,8), 0,1% Natriumpyrophosphat, 5 x Denhardt-Lösung und 50µg/ml Lachsspermien-DNA inkubiert und mit 2 x SSC, 0,1% SDS bei 42ºC gewaschen wird, worin die genannte (hybridisierende) Sequenz mindestens etwa 10 Nukleotide enthält.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine isolierte DNA-Sequenz bereit, die eine Sequenz umfaßt, die mit der DNA-Sequenz in Fig. 2 hybridisiert, wenn diese bei 42ºC in 50% Formamid, 5 x SSC, 50 mM Natriumphosphat (pH 6,8), 0,1% Natriumpyrophosphat, 5 x Denhardt-Lösung und 50 µg/ml Lachsspermien-DNA inkubiert und mit 2 x SSC, 0,1% SDS bei 42ºC gewaschen wird, worin die genannte, isolierte Sequenz mindestens etwa 10 Nukleotide enthält.
Die DNA-Sequenz könnte auch als eine DNA-Sequenz beschrieben werden, die für einen Gefäßendothelzellenwachstumsfaktor kodiert, der eine Aminosäuresequenz hat, die hinreichend deckungsgleich mit der des Gefäßendothelzellenwachstumsfaktors ist, um diesem die biologische Eigenschaft zu geben, a) selektiv das Wachstum von Gefäßendothelzellen zu fördern, aber nicht das von Rinderhomhautzellen, Linsenepithelzellen, Nebennierenzellen, BHK-21-Fibroblasten oder Keratinozyten, oder b) immunologisch mit einem Antikörper, der gegen wenigstens ein Epitop des zugehörigen Proteins gerichtet ist, kreuzreagieren zu können.
In einer weiteren Ausführungsform bezieht sich diese Erfindung auf 1) markierte DNA- Sequenzen zu Assayzwecken, 2) DNA-Sequenzen, die operabel mit einem Promotor verbunden sind, 3) Expressionsvektoren, die die oben beschriebene DNA-Sequenz umfassen, wenn diese operabel mit Kontrollsequenzen verbunden sind, die von dem durch den Vektor transformierten Wirt erkannt werden, und 4) Wirtszellen, die mit dem oben beschriebenen Vektor transformiert wurden.
Weitere Aspekte dieser Erfindung richten sich auf neue Formen des natürlich vorkommenden Gefäßendothelzellenwachstumsfaktors, einschl ießl ich einem Faktor, der nicht von assozuerter, nativer Glykosylierung begleitet ist, und der mindestens etwa 80% Homologie mit der Aminosäuresequenz des in Fig. 2 oder Fig. 10 gezeigten reifen Proteins hat und der eine oder beide der folgenden biologischen Eigenschaften besitzt, nämlich a) selektiv das Wachstum von Gefäßendothelzellen zu fördern, aber nicht das von Rinderhomhautzellen, Linsenepitheizellen, Nebennierenzellen, BHK-21- Fibroblasten oder Keratinozyten, und/oder b) immunologisch mit einem Antikörper, der gegen wenigstens ein Epitop des zugehörigen Proteins gerichtet ist, kreuzreagieren zu können. Ein solcher Gefäßendothelzellenwachstumsfaktor wird im allgemeinen als Produkt einer Expression in heterologer, rekombinanter Zellkultur erhalten. Der Wachstumsfaktor ist in jeder Form als Komponente einer rekombinanten Zellkultur neu.
In einer weiteren Ausführungsform richtet sich die Erfindung auf pharmazeutische Zusammensetzungen, die zur Förderung des Wachstums von Gefäßendothelzellen nützlich sind, und umfaßt eine therapeutisch wirksame Menge des rekombinant hergestellten Gefäßendothelzellenwachstumsfaktor in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch ein Verfahren zur Behandlung von das Gefäßendothel betreffenden Traumata, das die Verabreichung von wirksamen Mengen der oben beschriebenen pharmazeutischen Zusammensetzung an ein Tier oder einen Menschen, der an besagtem Trauma leidet, einschließt.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Herstellung eines Gefäßendothelzellenwachstumsfaktors und/oder Derivaten davon durch rekombinante Techniken, sowie Produkte und Verfahren, die sich auf eine solche Herstellung beziehen, bereitzustellen.
Der Wachstumsfaktor, der durch das beschriebene Verfahren hergestellt wurde, könnte zur Behandlung von Zuständen dienen, in denen eine selektive Wirkung auf die Gefäßendothelzellen ohne übermäßiges Wachstum des Gewebes wichtig ist, z.B. bei Diabetesgeschwüren und Gefäßverletzungen, die aus einem Trauma, wie subkutanen Wunden, entstanden sind.
Andere Verwendungen des Wachstumsfaktor werden einem Fachmann auf diesem Gebiet klar sein.
Fig. 1 zeigt die Sequenz der Oligonukleotidsonde, die verwendet wurde, um Rinderhypophysenfollikelzel bibliotheken nach cDNA-Klonen für den Wachstumsfaktor zu screenen, sowie den Übereinstimmungsgrad mit der erhaltenen cDNA-Sequenz.
Fig. 2 zeigt die vollständige Nukleotid- und zugehörige Aminosäuresequenz des Rindergefäßendothelzellenwachstumsfaktors vom p.vegf.6-Klon. Die zugehörigen Aminosäuren des Proteins sind unter der DNA-Sequenz dargestellt und sind vom ersten Rest des N-Terminus an numeriert. Negative Aminosäurennummern beziehen sich auf die mutmaßliche Leadersequenz oder das Preprotein, während positive Zahlen sich auf das reife Protein beziehen. Der Ort der Oligonukleotidsonde ist durch Unterstreichen angedeutet.
Fig. 3 zeigt die Konstruktion des Ausgangsexpressionsvektors pF8CIS, der zur Konstruktion des fertigen Expressionsvektors verwendet wurde.
Fig. 4 zeigt die Konstruktion des Zwischenvektors pCIS.8c24D für den Faktor VIII, in der die ClaI-Stelle nicht durch dam-Methylierung hergestellt ist. Es ist auch das Subklonieren von 408 und 416 bp-Fragmenten der kodierenden Bereiche des Faktor VIII zur Konstruktion eines Fusionsplasmids dargestellt.
Fig. 5 zeigt die Konstruktion des Zwischenplasmids pUC.8d28, das den Fusionsbereich einer Faktor VII-Variante in einem pUC-Vektor enthält.
Fig. 6 zeigt die Konstruktion eines Zwischenexpressionsvektors pCIS2.8c28D, der für eine Faktor VIII-Proteinvariante kodiert.
Fig. 7 zeigt die Konstruktion des Expressionsvektors pRK5, in den die für den Gefäßendothelzellenwachstumsfaktor kodierende DNA insertiert wurde.
Fig. 8 zeigt die Konstruktion des Expressionsvektors pRK5.vegf.6, der zur Transformation von Säugetierwirtszellen für die Herstellung des Wachstumsfaktor verwendet wurde.
Fig. 9 zeigt die Auswirkungen des Gefäßendothelzellenwachstumsfaktors auf das Wachstum von verschiedenen Zelltypen. CEC, Homhautzellen; BAC, Rindernebennierenzellen; KTC, Keratinozyten; LEC, Linsenepithelzellen; BHK-21, Babyhamsternierenzellen, Klon 21; ACC, Nebennierenkapillarendothelzellen; BBC, Rinderhirnkapillarendothelzellen; HUVE, menschliche Nabelschnurgefäßzellen; FBAE, Aortaendothelzellen von Jungrindern und Aortaendothelzellen von erwachsenen Rindern. Die Zellen wurden in deren jeweils zum Wachstum geeignete Medien verteilt, mit der maximalen Konzentration an Wachstumsfaktor inkubiert und nach 4-5 Tagen gezählt. Die Meßwerte sind als Prozent eines Vergleichswerts angegeben.
Fig. 10 zeigt die vollständige Nukleotid- und zugehörige Aminosäuresequenz des menschlichen Gefäßendothelzellenwachstumsfaktors vom p.vegf.21-Klon. Die zugehörigen Aminosäuren des Proteins sind unterhalb der DNA-Sequenz dargestellt und sind vom ersten Rest des N-Terminus weg numeriert. Negative Aminosäurennummern beziehen sich auf die mutmaßliche Leadersequenz oder das Präprotein, während positive Zahlen sich auf das reife Protein beziehen.
Fig. 11 zeigt die Konstruktion des Expressionsvektors p.vegf.21, der zur Transformation von Säugetierwirtszellen für die Herstellung des Wachstumsfaktor verwendet wurde.
Fig. 12 zeigt einen Vergleich der Aminosäuresequenzen des b) Rinder-VEGF und h) menschlichen VEGF, wobei die umrahmten Aminosäuren homologe Bereiche angeben.
Wie hier verwendet, bezieht sich "Gefäßendothelzellenwachstumsfaktor" oder "VEGF" auf einen Säugetierwachstumsfaktor, der ursprünglich aus Rinderhypophysenfollikelzellen stammt und die Aminosäuresequenz in Fig. 2 aufweisen, zusammen mit Analoga und Varianten davon, die die biologische Aktivität des korrespondierenden nativen VEGF aufweisen, einschließlich der menschlichen Aminosäuresequenz in Fig. 10. Die biologische Aktivität des nativen VEGF wird auch von jeder Variante oder jedem Analogon davon gezeigt, die in der Lage sind, selektiv das Wachstum von Gefäßendothelzellen, aber nicht von Rinderhomhautzellen, Linsenepithelzellen, Nebennierenzellen, BHK-21-Fibroblasten oder Kerati nozyten zu fördern, oder immunologisch mit einem Antikörper, der gegen wenigstens ein Epitop des korrespondierenden Proteins gerichtet ist, kreuzreagieren zu können.
Analoga oder Varianten sind Moleküle, in denen die Aminosäuresequenz, die Glykosylierung oder andere Merkmale des nativen VEGF kovalent oder nicht kovalent modifiziert wurden. Es können die Varianten also ein Molekulargewicht von etwa 45 kD (bestimmt mittels SDS-PAGE ohne Reduktionsmittel, wie z.B. β-Mercaptoethanol oder Dithiothreitol) haben oder auch nicht. Z.B. hat unglykosyliertes VEGF mit einer nativen, reifen Sequenz in einer nicht reduzierenden SDS-PAGE ein niedrigeres Molekulargewicht. Aminosäuresequenzvarianten umfassen nicht nur Allele der Sequenz in Fig. 2, sondern auch vorbestimmte Mutationen davon. Im allgemeinen haben Aminosäuresequenzvarianten eine Aminosäuresequenz mit wenigstens etwa 80% Homologie, typischer mit wenigstens etwa 90% Homologie, zu der des nativen VEGF in Fig. 2, einschließlich Varianten mit mindestens etwa 95% Homologie, wie die menschliche Sequenz, die in Fig. 10 gezeigt ist. Von nun an bedeutet der Ausdruck VEGF entweder die native Sequenz oder eine Variante davon, wenn nicht anders erwähnt.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch VEGF, der die Rinder-VEGF- Aminosäuresequenz, die in Fig. 2 abgebildet ist, analoge VEGF-Proteine anderer Arten, wie z.B. von Mensch, Pferd, Schwein, Ei, Hund, Maus und Katze stammende VEGF und dergleichen, und biologisch aktive Aminosäuresequenzvarianten dieser VEGF-Moleküle, einschließlich von Allelen und in vitro hergestellten, kovalenten Derivaten der VEGF- Proteine, die deren biologische Aktivität zeigen.
Der Ausdruck "ein das Gefäßendothel betreffendes Trauma" bezieht sich auf Traumata, wie Verletzungen der Blutgefäße oder des Herzens, einschließlich der Gefäßnetzwerke der Organe, denen ein Tier oder Mensch, vorzugsweise ein Säugetier, und besonders vorzugsweise, ein Mensch unterworfen ist. Beispiele solcher Traumata sind Wunden, Einschnitte und Geschwüre, besonders vorzugsweise Diabetesgeschwüre und Wunden oder Verletzungen der Blutgefäße oder des Herzens. Dieses Trauma umfaßt auch sowohl durch interne Ereignisse hervorgerufene Bedingungen als auch jene, die durch ein von außen wirkendes Agens wie z.B. ein Pathogen hervorgerufen sind, wenn diese durch Förderung des Gefäßendothelzellenwachstums verbessert werden können.
Derivate und Aminosäuresequenzvarianten des VEGF sind sowohl aufgrund ihrer biologischen Aktivität, die sich auf die therapeutische Verwendbarkeit bezieht, wie hierin bereits erwähnt, als auch aufgrund deren Fähigkeit, sich an anti-VEGF-Antikörper zu binden, verwendbar. Die Derivate und Varianten, die letztere Eigenschaften besitzen, dienen zur Reinigung von Antikörpern oder, in markierter Form, als Reagentien in Immunoassays für VEGF, unabhängig davon, ob solche Derivate und Varianten ihre therapeutische biologische Aktivität behalten.
Diese Erfindung umfaßt auch kovalente Modifikationen. Varianten von VEGF- Fragmenten mit bis zu etwa 100 Resten können konventionell durch in vitro-Synthese hergestellt werden. Solche Modifikationen können durch die Reaktion eines Zielaminosäurenrestes des gereinigten oder rohen Proteins mit einem organischen Derivatisierungsmittel, das in der Lage ist, mit bestimmten Seitenketten oder endständigen Resten zu reagieren, in das Molekül eingeführt werden. Die resultierenden kovalenten Derivate werden in Programmen, die versuchen, für die biologische Aktivität wichtige Reste zu identifizieren, verwendet.
Cystein-Reste werden im allgemeinen mit α-Halogenacetaten (und zugehörigen Ammen) zur Reaktion gebracht, wie Chloressigsäure oder Chloracetamid, und ergeben Carboxymethyl- oder Carboxyamidomethylderivate. Cystein-Reste werden auch durch Reaktion mit Bromtrifluoraceton, α-Brom-β-(5-imidazolyl)propionsäure, Chloracetylphosphat, N-Alkylmaleimiden, 3-N itro-2-pyridyldisulfid, Methyl-2-pyridyldisulfid, p- Chlormercuribenzoat, 2-Chlormercuri-4-nitrophenol oder Chlor-7-nitrobenz-2-oxa-1,3- diazol derivatisiert.
Histidin-Reste werden durch Reaktion mit Diethylpyrocarbonat bei pH 5,5-7,0 derivatisiert, da dieses Agens relativ spezifisch für die Histidylseitenkette ist. Parabromphenacylbromid kann auch verwendet werden, vorzugsweise wird die Reaktion in 0,1 M Natriumkakodylat bei pH 6,0 durchgeführt.
Lysin- und aminoterminale Reste werden mit Succin- oder anderen Carbonsäurenanhydriden zur Reaktion gebracht. Diese Derivatisierungsmittel bewirken eine Ladungsumkehr der Lysin-Reste. Andere geeignete Derivatisierungsmittel für α-Amino- Gruppen enthaltende Reste umfassen Imidoester wie Methylpicolinimidat; Pyridoxalphosphat; Pyridoxal; Chlorborhydrid; Trinitrobenzolsulfonsäure; O-Methylisoharnstoff; 2,4-Pentandion und die Transaminase-katalysierte Reaktion mit Glyoxylat.
Arginyl-Reste werden durch die Reaktion mit einem oder mehreren gebräuchlichen Reagentien modifiziert, darunter Phenylglyoxal, 2,3-Butandion, 1,2-Cyclohexandion und Ninhydrin. Die Derivatisierung der Arginin-Reste erfordert aufgrund des hohen pKa der Guanidin-funktionalen Gruppe eine Reaktion in alkalischem Milieu. Desweiteren könnten diese Reagentien sowohl mit den Lysingruppen wie auch mit der &epsi;- Aminogruppe des Arginins reagieren.
Die spezifische Modifikation der Tyrosin-Reste an sich wurde, mit besonderem Interesse für die Einführung von Spektralmarkern an Tyrosin-Resten durch Reaktionen mit aromatischen Diazoniumverbindungen oder Tetranitromethan, vielfach studiert. Am gebräuchlichsten ist die Verwendung von N-Acetylimidazol und Tetranitromethan um O-Acetyl-Tyrosinarten bzw. 3-Nitroderivate zu erhalten. Tyrosin-Reste werden mit ¹²&sup5;I oder ¹³¹I jodiert, um markierte Proteine zur Verwendung in Immunoassays herzustellen, wobei das oben beschriebene Chloramin T-Verfahren angewendet wird.
Carboxyl-Seitengruppen (Aspartat oder Glutamat) werden selektiv durch die Reaktion mit Carbodiimiden (R'-N-C-N-R') wie 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinyl-(4-ethyl))carbodiimid oder 1-Ethyl-3-(4-azonium-4,4-dimethylpentyl)carbodiimid modifiziert. Desweiteren werden Aspartat- und Glutamat-Reste durch die Reaktion mit Ammoniumionen in Asparagin- und Glutamin-Reste übergeführt.
Bifunktionale Derivatisierungsmittel dienen zur Quervernetzung des VEGF mit einer wasserunlösliche Trägermatrix oder -oberfläche zur Verwendung im Reinigungs verfah ren zur von anti-VEGF-Antikörpern. Gebräuchliche verwendete Vernetzungsmittel umfassen z. B. 1,1-Bis(diazoacetyl)-2-phenylethan, Glutardialdehyd, N-Hydroxysuccinimidester z.B. Ester mit 4-Azidosalicylsäure, homobifunktionale Imidoester, einschließlich Disuccinimidester wie 3,3'-Dithiobis(succinimidylpropionat) und bifunktionale Maleimide wie Bis-N-maleimido-1,8-octan. Derivatisierungsmittel wie Methyl-3-[(p- azidophenyl)dithio]propioimidat ergeben photoaktivierbare Zwischenprodukte, die in der Lage sind, in Gegenwart von Licht Vernetzungen zu ergeben. Alternativ werden wasserunlösliche, reaktive Matrizen wie Bromcyan-aktivierte Kohlenhydrate und deren reaktive Substrate, die in den US. Pat. Nr. 3.969.287; 3.691.016; 4.195.128; 4.247.642; 4.229.537 und 4.330.440 beschrieben werden, zur Proteinimmobilisierung verwendet.
Glutamin- und Asparagin-Reste werden häufig zum zugehörigen Glutamat- und Aspartat-Rest deaminiert. Alternativ werden diese Reste unter schonenden sauren Bedingungen deaminiert. Diese Erfindung umfaßt alle Formen dieser Reste.
Andere Modifikationen umfassen die Hydroxylierung von Prolin und Lysin, die Phosphorylierung von Hydroxylgruppen von Serin- oder Threonin-Resten, die Methylierung der α-Aminogruppen von Lysin-, Arginin- und Histidinseitenketten (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 [1983]), die Acetylierung des N-terminalen Amins und, in einigen Fällen, die Amidierung der C-terminalen Carboxylgruppe.
Aminosäuresequenzvarianten von VEGF können auch durch Mutationen in der DNA hergestellt werden. Solche Varianten umfassen z.B. Deletionen oder Insertionen oder Substitutionen von Resten innerhalb der Aminosäuresequenz, die in Fig. 2 gezeigt wird. Jede Kombination von Deletion, Insertion und Substitution kann durchgeführt werden, um ein fertiges Konstrukt mit der gewünschten Aktivität zu erhalten. Klarerweise dürfen die Mutationen, die in der für die Variante kodierenden DNA durchgeführt werden, die Sequenz nicht aus dem Leserahmen werfen, und vorzugsweise nicht komplementäre könnten.
Auf dem genetischen Niveau werden diese Varianten normalerweise durch stellenspezifische Mutagenese der Nukleotide in der für den VEGF kodierenden DNA hergestellt, und ergeben somit eine für die Variante kodierende DNA und anschließend wird diese in rekombinanten Zellkulturen exprimiert. Typischerweise weisen die Varianten dieselbe biologische Aktivität wie das natürlich vorkommende Analogon auf.
Während die Stelle zur Einführung einer Aminosäuresequenzvariante vorbestimmt ist, muß die Mutation an sich nicht vorherbestimmt sein. Z. B. kann zur Optimierung der Durchführung einer Mutation an einer bestimmten Stelle eine statistische Mutagenese am Zielcodon oder -bereich durchgeführt werden und die exprimierten VEGF-Varianten nach der optimalen Kombination der gewünschten Aktivität gescreent werden. Die Techniken zur Herstellung von Substitutionsmutationen an bestimmten Stellen in der DNA sind wohlbekannt, z.B. stellenspezifische Mutagenese.
Die Herstellung von VEGF-Varianten wird in Übereinstimmung damit vorzugsweise durch stellenspezifische Mutagenese der DNA, die für eine zuvor hergestellte Variante oder eine nicht modifizierte Version des Proteins kodiert, erreicht. Die stellenspezifische Mutagenese ermöglicht die Herstellung von VEGF-Varianten durch die Verwendung von spezifischen, für die DNA-Sequenz der gewünschten Mutation kodierenden Oligonukleotidsequenzen, sowie eine ausreichende Anzahl von benachbarten Nukleotiden, um eine Primersequenz von genügender Größe und Sequenzkomplexität bereitzustellen, die einen stabilen Duplex (Paar) an beiden Seiten der zu überbrückenden Deletionsverbindungsstelle ergibt. Typischerweise wird ein Primer von etwa 20-25 Nukleotiden Länge bevorzugt, mit etwa 5-10 Resten an beiden Seiten der Verbindungsstelle der zu verändernden Sequenz. Im allgemeinen ist die Technik der stellenspezifischen Mutagenese durch Publikationen wie z. B. Adelman et al., DNA 2: 183 (1983) im Fachgebiet wohlbekannt.
Wie bemerkt werden wird, verwendet die stellenspezifische Mutagenesetechnik typischerweise einen Phagenvektor, der sowohl in Einstrang- wie auch in Doppelstrangform existiert. Typische in der stellenspezifischen Mutagenese verwendete Vektoren umfassen Vektoren wie z.B. den M13-Phagen, wie in Messing et al., Third Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA, Hrsg. A. Walton, Elsevier, Amsterdam (1981) veröffentlicht. Diese Phagen sich leicht im Handel erhältlich und im allgemeinen ist deren Gebrauch einem Fachmann auf diesem Gebiet wohlbekannt. Alternativ können Plasmidvektoren mit einem einsträngigen Phagenreplikationsursprung (Vieira et al., Meth. Enzymol., 153: 3 [1987]) zur Herstellung einer einsträngigen DNA verwendet werden.
Im allgemeinen wird in Übereinstimmung dazu die stellenspezifische Mutagenese durchgeführt, indem zuerst ein einsträngiger Vektor hergestellt wird, der in seiner DNA- Sequenz eine für das relevante Protein kodierende Sequenz umfaßt. Ein Oligonukleotidprimer, der die gewünschte mutierte Sequenz aufweist, wird im allgemeinen synthetisch hergestellt z.B. nach dem Verfahren von Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 75: 5765 (1978). Dieser Primer wird dann mit dem einsträngigen, Proteinsequenz-enthaltenden Vektor verbunden, und mit DNA-polymerisierenden Enzymen versetzt, wie z.B. dem E.coli Polymerase I Klenow-Fragment, um die Synthese des mutationsenthaltenden Strangs zu vervollständigen. Dementsprechend bildet sich ein Heteroduplex, in dem ein Strang für die ursprüngliche, nicht mutierte Sequenz kodiert und der zweite Strang die gewünschte Mutation enthält. Dieser Heteroduplexvektor wird dann zur Transformation geeigneter Zellen wie JM101-Zellen verwendet, und jene Klone ausgewählt, die den rekombinanten Vektor mit der mutierten Sequenzzusammenstellung enthalten.
Nachdem so ein Klon ausgewählt ist, kann der mutierte Proteinbereich entfernt und in einen zur Proteinproduktion geeigneten Vektor gegeben werden, im allgemeinen in einen Expressionsvektor des Typs, der zur Transformation eines geeigneten Wirts verwendet werden kann.
Aminosäurensequenzdeletionen reichen im allgemeinen von 1 bis 30 Resten, vorzugsweise von 1 bis 10 Resten und sind typischerweise benachbart.
Aminosäuresequenzinsertionen umfassen amino und/oder carboxy-terminale Fusionen von einem Rest bis zu Polypeptiden von im wesentlichen ungekürzter Länge, sowie auch Intrasequenzinsertionen von einzelnen oder mehreren Aminosäure-Resten. Intrasequenzinsertionen (d.h. Insertionen innerhalb der reifen VEGF-Sequenz) können im allgemeinen etwa von 1 bis 10 Resten, vorzugsweise von 1 bis 5 Resten, reichen. Ein Beispiel einer terminalen Insertion umfaßt die Fusion einer Signalsequenz, entweder heterolog oder homolog mit der Wirtszelle, mit dem N-Terminus des VEGF-Moleküls, um die Ausscheidung des reifen VEGF aus rekombinanten Wirten zu erleichtern.
Die dritte Gruppe von Varianten sind jene, in denen wenigstens ein Aminosäurerest, und vorzugsweise nur einer, des VEGF-Moleküls entfernt wurde und ein anderer Rest an seiner Stelle insertiert wurde. Solche Substitutionen werden vorzugsweise in Übereinstimmung mit der folgenden Tabelle 1 gemacht, wenn es abschließend notwendig ist, die Charakteristika des VEGF-Moleküls fein abzuwandeln. Tabelle 1
Deutliche Änderungen in Funktion und immunologischer Identität werden durch eine Auswahl von weniger konservativen Änderungen als jenen in Tabelle 1 erhalten, d.h.die Auswahl von Resten, die sich deutlicher in ihrem Effekt auf a) die Erhaltung der Struktur des Polypeptidgerüsts im Substitutionsbereich z.B. Faltblatt- oder Helix-Konformation, b) die Ladung oder Hydrophobie des Moleküls an der Zielsteile oder c) die Sperrigkeit der Seitenkette auswirken. Die Substitutionen, bei denen im allgemeinen die größten Änderungen in den VEGF-Eigenschaften erwartet werden, sind jene, in denen a) Glycin und/oder Prolin (P) durch eine andere Aminosäure ersetzt wird oder deletiert oder insertiert wird; b) ein hydrophiler Rest, z.B. Serin oder Threonin durch (oder für) einen hydrophoben Rest, z.B. Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, Valin oder Alanin substituiert wird; c) ein Cystein-Rest durch (oder für) einen anderen Rest substituiert wird; d) ein Rest mit einer elektropositiven Seitenkette, z.B. Lysin, Arginin oder Histidin, durch (oder für) einen Rest mit einer elektronegativen Seitenkette, z.B. Glutamin oder Asparagin substituiert wird; oder e) ein Rest mit einer sperrigen Seitenkette z.B. Phenylalanin durch (oder für) einen ohne Seitenkette z.B. Glycin substituiert wird.
Die meisten Deletionen, Insertionen und im besonderen Substitutionen lassen keine radikalen Änderungen in den Charakteristika des VEGF-Moleküls erwarten. Doch da es schwierig ist, die exakten Auswirkungen der Substitution, Deletion oder Insertion vor ihrer Durchführung vorauszusagen, wird ein Fachmann auf diesem Gebiet erwarten, daß die Effekte durch Routinescreeningassays herausgefunden werden. Z.B. wird typischerweise eine Variante durch stellenspezifische Mutagenese der nativen, für VEGF kodierenden Nukleinsäure hergestellt, die Nukleinsäurenvariante in rekombinanter Kultur exprimiert und möglicherweise aus der Zellkultur gereinigt, z.B. durch Immunoaffinitätsadsorption an einer aus Kaninchen stammenden, polyklonalen anti- VEGF-Säule (um die Variante durch Bindung an zumindest ein verbliebenes Immunepitop zu adsorbieren).
Da VEGF dazu tendiert, Dimere zu bilden, umfaßt die vorliegende Erfindung die Bereitstellung von Hetero- und Homodimeren, worin eine oder beide Untereinheiten Varianten sind. Wenn beide Untereineiten Varianten sind, können die Unterschiede in der Aminosäuresequenz die selben oder für jede Untereinheitenkette unterschiedlich sein. Heterodimere können leicht hergestellt werden, indem man Wirtszellen mit DNA, die für beide Untereinheiten kodiert, transformiert und, falls notwendig, das gewünschte Heterodimer reinigt, oder indem man die Untereinheiten getrennt synthetisiert, die Untereinheiten dissoziiert (z.B. durch eine Behandlung mit einem chaotropen Mittel wie Harnstoff Guanidinhydrochlorid, und dergleichen), die dissoziierten Untereinheiten mischt und dann die Untereinheiten reassoziiert, indem man das chaotrope Agens abdialysiert.
Die Aktivität des Zellysats oder der gereinigten VEGF-Varianten wird dann in einem passenden Screeningassay nach der gewünschten Eigenschaft gescreent. Z.B. wird eine Änderung im immunologischen Charakter des VEGF-Moleküls, wie z.B. die Affinität für einen bestimmten Antikörper, durch einen kompetetiven Immunoassay bestimmt. Änderungen in der Verstärkung oder Unterdrückung des Gefäßendothelzellenwachstums durch die betroffenen Mutanten werden durch einen geeigneten Assay gemessen. Modifikationen von Proteineigenschaften wie Redox- oder thermische Stabilität, Hydrophobie, Anfälligkeit für proteolytischen Abbau oder die Tendenz, mit Trägern oder zu Multimeren zu aggregieren, werden mittels dem Fachmann auf diesem Gebiet wohlbekannten Verfahren untersucht.
Das gewünschte VEGF-Molekül kann durch jedes Verfahren, einschließlich rekombinanter Verfahren hergestellt werden. Isolierte DNA bedeutet hier ebenso chemisch synthetisierte DNA, cDNA, chromosomale oder extrachromosomale DNA mit oder ohne flankierende 3'- und/oder 5'-Bereiche. Vorzugsweise wird hier der gewünschte VEGF durch Synthese in rekombinanter Zellkultur hergestellt.
Für eine solchen Synthese ist es zuerst notwendig, für VEGF kodierende Nukleinsäure zu erhalten. Für ein VEGF-Molekül kodierende DNA kann aus Rinderhypophysenfollikelzellen durch a) Herstellung einer cDNA-Bibliothek aus diesen Zellen, b) Durchführung einer Hybridisierungsanalyse mit markierter, für VEGF oder Fragmente davon (bis zu oder mehr als 100 Basenpaare in der Länge) kodierender DNA, um homologe Sequenzen enthaltende Klone in der Bibliothek zu detektieren, und c) Analyse der Klone durch Restriktionsenzymanalyse und Nukleinsäuresequenzierung, um Klone mit der vollen Länge zu identifizieren, erhalten werden. DNA, die in der Lage ist, mit einer für VEGF kodierenden DNA unter schonenden Bedingungen zu hybridisieren, dient zur Identifikation von für VEGF kodierender DNA. Sowohl schonende als auch nicht schonende Bedingungen werden weiter unten definiert. Wenn Klone mit der vollen Länge in der cDNA-Bibliothek nicht vorhanden sind, können passende Fragmente aus den verschiedenen Klonen unter Verwendung der hier erstmals veröffentlichten Nukleinsäuresequenz information gewonnen werden und an in den Klonen gemeinsame Restriktionsstellen ligiert werden, um einen für VEGF kodierenden Klon voller Länge zusammenzustellen. Alternativ dazu stellen Genombibliotheken die gewünschte DNA bereit. Die letztlich bestimmte Sequenz der DNA, die für Rinder- VEGF kodiert, wird in Fig. 2 gezeigt. Die Sequenz der DNA, die für den menschlichen VEGF kodiert, und die letztlich durch Sondierung einer menschlichen Leukämiezelllinie bestimmt wurde, wird in Fig. 10 gezeigt.
Wenn diese DNA einmal identifiziert und aus der Bibliothek isoliert wurde, wird sie in einen replizierbaren Vektor zur weiteren Klonierung oder zur Expression ligiert.
In einem Beispiel eines rekombinanten Expressionssystems wird ein für VEGF kodierendes Gen in Säugetierzellen durch Transformation mit einem Expressionsvektor, der die für den VEGF kodierende DNA umfaßt, exprimiert. Vorzugsweise werden Wirtszellen transformiert, die in der Lage sind, solche Verfahren durchzuführen und damit der VEGF im Kulturmedium oder Periplasma der Wirtszelle erhalten wird, d.h. ein ausgeschiedenes Molekül erhalten wird.
Die hier veröffentlichten Vektoren und Verfahren sind geeignet zur Verwendung in Wirtszellen aus einem weiten Bereich von prokaryotischen und eukaryotischen Organismen.
Im allgemeinen werden anfangs natürlich Prokaryoten für das Klonieren von DNA- Sequenzen und die Konstruktion der in dieser Erfindung verwendbaren Vektoren bevorzugt. Z.B. E. coli K12 Stamm MM294 (ATCC Nr.31.446) ist besonders brauchbar.
Andere mikrobielle Stämme, die verwendet werden könnten umfassen E. coli Stämme wie E. coli B und E. coli X1776 (ATCC Nr.27.325). Diese Beispiele sollen natürlich anschaulich und nicht einschränkend sein.
Prokaryoten können auch zur Expression verwendet werden. Die zuvor genannten Stämme, sowie E. coli Stämme W3110 (F&supmin;, λ&supmin;, prototroph, ATCC Nr.27.325), K5772 (ATCC Nr. 53.635) und SR101, Bacillus-Stämme wie Bacillus subtilis, und andere Enterobakteriaceaen wie Salmonella typhimunum oder Serratia marcescens, und verschiedene Pseudomonas-Spezies können verwendet werden.
Im allgemeinen werden Plasmidvektoren, die Replicon und Kontrollsequenzen enthalten, die von einer mit der Wirtszelle kompatiblen Spezies stammen, in Verbindung mit diesen Wirten verwendet. Der Vektor beinhaltet normalerweise eine Replikationsstelle, sowie markierende bzw. kennzeichnende Sequenzen, die in der Lage sind, pHänotypische Selektion in transformierten Zellen zu bewirken. Z.B. wird E. coli typischerweise mit pBR322 transformiert, einem Plasmid, das aus einer E. coli-Spezies stammt (siehe z.B. Bolivar et al., Gene 2: 95 [1977]). pBR322 enthält Gene zur Ampicillin- und Tetracyclinresistenz und erleichtert somit die Identifikation transformierter Zellen. Das pBR322-Plasmid oder andere mikrobielle Plasmide oder Phagen müssen auch Promotoren enthalten, die vom mikrobiellen Organismus zur Expression seiner eigenen Proteine verwendet werden, oder müssen dahingehend modifiziert werden.
Die Promotoren, die in der rekombinanten DNA-Konstruktion am gebräuchlichsten sind, umfassen die β-Laktamase (Penicillinase) und Laktose-Promotorsysteme (Chang et al., Nature 375: 615 [1978]; Itakura et al., Science 198: 1056 [1977]; Goeddel et al., Nature 281: 544 [1979]) und ein Tryptophan-(trp)-Promotorsystem (Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8: 4057 [1980]; EP-A-0036.776). Während diese die am häufigsten verwendeten darstellen, wurden auch andere mikrobielle Promotoren entdeckt und verwendet und Details bezüglich deren Nukleotidsequenz wurden veröffentlicht, und befähigen somit einen Fachmann, diese funktionell mit Plasmidvektoren zu ligieren (siehe, z.B. Siebenlist et al., Cell 20: 269 [1980]).
Zusätzlich zu Prokaryoten können auch eukaryotische Mikroben, wie Hefekulturen verwendet werden. Saccharomyces cerevisiae, oder normale Backhefe, ist der am häufigsten verwendete eukaryotische Organismus, obwohl eine Vielzahl anderer Stämmen allgemein verfügbar ist. Zur Expression in Saccharomyces wird normalerweise das Plasmid Yrp7 verwendet, z.B. (Stinchcomb et al., Nature 282: 39 [1979]; Kingsman et al., Gene 7: 141 [1979]; Tschemper et al., Gene 10: 157 [1980]). Dieses Plasmid enthält bereits das trp1-Gen, das einen Selektionsmarker eines mutanten Hefestammes, nämlich die fehlende Fähigkeit, auf Tryptophan zu wachsen, aufweist, z.B. ATCC Nr 44.076 oder PEP4-1 (Jones, Genetics 85: 12 [1977]). Das Vorhandensein der trp1-Lesion als ein Charakteristikum des Wirtshefezellengenoms bietet durch das Wachstum ohne Tryptophan ein wirkungsvolles Umfeld zur Detektion von Transformationen.
Passende Promotorsequenzen in Hefevektoren umfassen die Promotoren für 3- Phosphoglycerat-Kinase (Hitzeman et al., J. biol. Chem. 255: 2073 [1980]) oder andere glykolytische Enzyme (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7 :149 [1968]; Holland et al., Biochemistry 17: 4900 [1978]), wie Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvat-Decarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphat- Isomerase, 3-Phosphoglycerat-Mutase, Pyruvat-Kinase, Triosephosphat-Isomerase, Phosphoglucose-Isomerase und Glucokinase. Bei der Konstruktion passender Expressionsplasmide werden die mit diesen Genen assoziierten Terminationssequenzen ebenfalls in den Expressionsvektor und zwar 3' von der zu Exprimieren gewünschten Sequenz ligiert, um Polyadenylierung der mRNA und Termination ergeben. Andere Promotoren, die den zusätzlichen Vorteil einer durch das Wachstum regulierten Transkription haben, sind die Promotorbereiche für die Alkohol-Dehydrogenase 2, Isocytochrome C, saure Phosphatase, mit dem Stickstoffmetabolismus assoziierte Abbauenzyme, die zuvor erwähnte Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase und Enzyme, die für die Maltose- und Galaktoseverwertung verantwortlich sind. Jeder Plasmidvektor, der Hefe-kompatible Promotoren, Replikationsursprung und Terminationssequenzen beinhaltet, ist geeignet.
Zusätzlich zu Mikroorganismen können auch aus multizellulären Organismen stammende Zellkulturen als Wirte verwendet werden. Im Prinzip kann mit jeder solcher Zellkultur gearbeitet werden, sowohl mit Kulturen aus Wirbeltieren als auch aus von Wirbellosen. Doch das Interesse konzentrierte sich auf Wirbeltierzellen und die Vermehrung von Wirbeltierzellen in Kultur (Gewebekultur) wurde in den vergangenen Jahren zum Routineverfahren [Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Patteson (Hrsg.), (1973)]. Beispiele solcher verwendbarer Wirtszelllinien sind VERO- und HeLa- Zellen, Eierstockzelllinien aus chinesischen Hamstern (CHO), und W138, BHK, COS-7, 293 und MDCK-Zelllinien. Expressionsvektoren für solche Zellen umfassen normalerweise (falls notwendig) einen Replikationsursprung, einen Promotor, der sich vor den zu exprimierenden Genen befindet, gemeinsam mit den notwendigen Ribosombindestellen, RNA-Spleißstellen, Polyadenylierungsstellen und Transkriptionsterminationssequenzen.
Zur Verwendung in Säugetierzellen werden die Kontrollfunktionen auf den Expressionsvektoren oft durch virales Material zur Verfügung gestellt. Z.B. stammen oft verwendete Promotoren vom Polyoma-Virus, Adenovirus2 und am häufigsten von Simian Virus 40 (SV40). Die frühen und späten Promotoren des SV40-Virus sind besonders nützlich, da beide leicht als Fragment, das auch den Replikationsursprung des SV40-Virus enthält, aus dem Virus erhalten werden [Fiers et al., Nature 273: 113 (1978)]. Kleinere oder größere SV40-Fragmente können auch verwendet werden, vorausgesetzt, daß eine ca 250 bp-Sequenz eingeschlossen ist, die von der HindIII-Stelle bis zur BglI-Stelle , die sich im viralen Replikationsursprung gefindet, reicht. Desweiteren ist es möglich und oft wünschenswert, Promotor- und Kontrollsequenzen, die normalerweise mit der gewünschten Gensequenz assoziiert sind, zu verwenden, vorausgesetzt, daß diese Kontrollsequenzen mit dem Wirtszellsystem kompatibel sind.
Ein Replikationsursprung kann entweder durch Konstruktion des Vektors, mit dem Ziel, einen exogenen Ursprung einzufügen, wie den von SV40 oder einen aus anderer viraler (z.B. Polyoma-Virus, Adeno-Virus, VSV, BPV) Herkunft stammenden, oder durch die chromosomalen Replikationsmechanismen der Wirtszellen bereitgestellt werden. Wenn der Vektor in das Wirtszellenchromosom integriert wird, ist letzteres oft ausreichend.
Durch Zellkulturen werden zufriedenstellende Mengen an Protein hergestellt; Verbesserungen, unter Verwendung eine sekundären, kodierenden Sequenz dienen jedoch zur weiteren Steigerung des Produktionsniveaus. Eine sekundäre kodierende Sequenz umfaßt Dihydrofolat-Reduktase (DHFR), die durch einen extern kontrollierten Parameter wie Methotrexat (MTX) beeinflußt wird, und erlaubt somit eine Kontrolle der Expression durch die Kontrolle der Methotrexatkonzentration.
Bei der Auswahl einer bevorzugten Wirtszelle zur Transfektion durch die Vektoren dieser Erfindung, die sowohl für VEGF als auch für DHFR kodierende Sequenzen umfassen, wird vorzugsweise ein Wirt entsprechend der Art des verwendeten DHFR- Proteins ausgesucht. Wenn Wildform-DHFR-Protein verwendet wird, wird vorzugsweise eine Wirtszelle ausgewählt, der DHFR fehlt, und die somit die Verwendung der für DHFR kodierenden Sequenz als Marker für eine erfolgreiche Transfektion in Selektivmedien, denen Hypoxanthin, Glycin und Thymidin fehlen, erlaubt. In diesem Fall ist die Eierstockzelllinie von chinesischen Hamstern (CHO) eine geeignete Zelllinie, der die DHFR-Aktivität fehlt, wobei die Herstellung und Vermehrung von Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77:4216 (1980) beschrieben wurde.
Andrerseits, wenn DHFR-Protein mit geringer Bindungsaffinität für MTX als Kontrollsequenz verwendet wird, ist es nicht notwendig, Zellen ohne DHFR zu verwenden. Da die mutierte DHFR gegen Methotrexat resistent ist, kann MTX- enthaltendes Medium als Selektionsmittel verwendet werden, vorrausgesetzt, daß die Wirtszellen selbst Methotrexat-empfindlich sind. Es zeigte sich, daß die meisten eukaryotischen Zellen, die in der Lage sind, Methotrexat zu absorbieren, Methotrexat empfindlich sind. Eine solche verwendbare Zelllinie ist eine CHO-Linie, CHO-K1 (ATCC Nr. CCL 61).
Die Konstruktion von passenden Vektoren, die die gewünschten kodierenden und kontrollierenden Sequenzen enthalten, benützt Standardl igationsverfah ren. Isolierte Plasmide oder DNA-Fragmente werden gespalten, zurechtgeschnitten und in der gewünschten Form erneut ligiert, um die notwendigen Plasmide herzustellen.
Wenn stumpfe Enden benötigt werden, kann das Präparat 15 min lang bei 15ºC mit 10 Units der Polymerase 1 (Klenow) behandelt werden, dann mit Phenol-Chloroform extrahiert und mit Ethanol ausgefällt werden.
Die Trennung der gespaltenen Fragmente nach der Größe kann unter Verwendung von 6%-igem Polyacrylamidgel durchgeführt werden, wie von Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8: 4057 (1980) beschrieben.
Um die richtigen Sequenzen in konstruierten Plasmiden durch Analyse zu bestätigen, werden die Ligationsgemische typischerweise zur Transformation von E. coli K12 Stamm 294 (ATCC 34.466) oder anderen passenden E. coli-Stämmen verwendet, und erfolgreiche Transformanten je nach Eignung durch Ampicillin- oder Tetracyclinresistenz ausgewählt. Die Plasmide werden aus den Transformanten gewonnen und durch Restriktionskartierung und/oder DNA-Sequenzierung nach dem Verfahren von Messing et al., Nucleic Acids Res. 9:309 (1981) oder nach dem Verfahren von Maxam et al., Methods of Enzymology 65: 499 (1980) analysiert.
Nach der Einführung der DNA in die Zelle des Säugetierwirts und der Selektion im Medium nach stabilen Transfektanten, wird die Amplifikation der für das DHFR-Protein kodierenden Sequenzen durch das Wachstum von Wirtszellkulturen bei Vorhandensein von etwa 20.000-500.000 pM Konzentrationen an Methotrexat, einem kompetitiven Hemmstoff der DHFR-Aktivität, durchgeführt. Der effektive Konzentrationsbereich ist natürlich stark von der Art des DHFR-Gens und den Charakteristika der Wirts abhängig. Klarerweise können keine allgemein definierten unteren und oberen Grenzen mit Sicherheit angegeben werden. Es können auch geeignete Konzentrationen anderer Folsäurenanaloga oder von anderen, DHFR hemmenden Verbindungen verwendet werden. Doch MTX selbst ist gängig, leicht erhältlich und wirksam.
Andere verwendbare Techniken werden in einem Abschnitt direkt vor den Beispielen beschrieben.
Die hier beschriebenen VEGF-Moleküle haben eine Anzahl von mit dem Gefäßendothel assozierten, therapeutischen Verwendungen. Solche Verwendungen umfassen die Behandlung von Traumen des Gefäßnetz(werks), hinsichtlich der aufgezeigten schnellen Förderung der Vermehrung der die Traumen umgebenden Gefäßendothelzellen durch VEGF. Beispiele solcher Traumen, die derartig behandelt werden könnten, umfassen chirurgische Eingriffe, insbesondere diejenigen, die das Herz, Wunden, einschließlich Risse, Schnitte und Verletzungen der Blutgefäße, und Oberflächengeschwüre, bei denen das Gefäßendothel betroffen ist, wie Diabetes-, Haemophilie(Bluter)- und Krampfadergeschwüre, sind aber nicht auf diese eingeschränkt. Andere physiologische Bedingungen, die durch die selektiven mitogenen Eigenschaften des VEGF verbessert werden könnten, sind hier ebenfalls eingeschlossen.
Für die traumatischen Anwendungen, auf die oben hingewiesen wurde, wird das VEGF- Molekül in eine Form gebracht und in einer Art verabreicht, die mit guter medizinischen Praxis in Einklang steht und die die spezifischen Krankheiten, die zu behandeln sind, die Verfassung des individuellen Patienten, der Anwendungsort des VEGF, das Verfahren der Verabreichung und andere, dem Anwender bekannte Faktoren in Betracht zieht. Daher ist, wie hier verwendet, die "therapeutisch wirksame Menge" an VEGF eine Menge, die entweder wirksam den behandelten Zustand verhindert, die Verschlechterung desselben bremst, oder den behandelten Zustand mildert oder heilt, insbesondere jene Menge, die zur Förderung des Gefäßendothelwachstums in vivo ausreicht.
VEGF-Aminosäurensequenzvarianten und Derivate, die immunologisch mit Antikörpern gegen natives VEGF kreuzreagieren, dienen in Immunoassays für VEGF als Standards, oder in markierter Form als kompetitive Reagentien.
Das VEGF wird zur Lagerung und Verabreichung hergestellt, indem VEGF mit dem gewünschten Reinheitsgrad mit physiologisch akzeptablen Trägern, Excipienten oder Stabilisatoren gemischt wird. Solche Materialien sind für Empfänger bei den verwendeten Dosen und Konzentrationen nicht toxisch. Wenn das VEGF wasserlöslich ist, kann es in einem Puffer, wie Phosphatpuffer oder anderen organischen Säure-Salz- Puffern, vorzugsweise bei einem pH von etwa 7 bis 8, vorliegen. Wenn eine VEGF- Variante nur teilweise in Wasser löslich ist, kann diese als Mikroemulsion in einer Form gemeinsam mit einem nichtionischen Tensid, wie Tween, Pluronics oder PEG, z.B. Tween 80, bei einem Anteil von 0,04-0,05% (w/v) eingesetzt werden, um seine Löslichkeit zu erhöhen.
Wahlweise können andere Zugaben wie Antioxydantien, z.B. Ascorbinsäure; Polypeptide mit niedrigem Molekulargewicht, z.B. Polyarginin oder Tripeptide; Proteine wie Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere wie Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren wie Glycin, Glutaminsäure, Asparaginsäure oder Arginin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate einschließlich Zellulose oder deren Derivate, Clucose, Mannose oder Dextrine; Chelatbildner wie EDTA; und Zuckeralkohole wie Mannit oder Sorbit beigegeben werden.
VEGF zum Zweck der therapeutischen Verabreichung muß steril sein. Die Sterilität wird leicht durch Filtration durch Sterilfiltrationsmembranen (z.B. 0,2 µm Membranen) erreicht. Das VEGF wird normalerweise in lyophilisierter Form oder als wässrige Lösung, wenn es sehr stabil gegen thermische und oxidative Denaturierung ist, gelagert.
Der pH von VEGF-Präparaten liegt typischerweise von etwa 6 bis 8, obwohl unter bestimmten Umständen auch höhere und niedrigere pH-Werte geeignet sein können. Es versteht sich, daß die Verwendung von bestimmten der vorher genannten Excipienten, Träger oder Stabilisatoren eine Salzbildung des VEGF's ergibt.
Wenn das VEG parenteral verwendet wird, werden die therapeutischen Zusammensetzungen, die das VEGF enthalten, im allgemeinen in einen Behälter gegeben, der eine sterile Zugangsöffnung besitzt, z.B. eine Lösungsbeutel oder eine Phiole für intravenöse Lösungen, die einen mit einer hypodermischen Injektionsnadel durchstechbare Stopfen aufweisen.
Im allgemeinen sollte man, wenn es die Krankheit erlaubt, das VEGF zur stellenspezifischen Verabreichung herstellen und dosieren. Das ist im Fall von Wunden und Geschwüren gebräuchlich.
Formulierungen mit Langzeitfreisetzung können ebenfalls hergestellt werden, und umfassen die Herstellung von Mikrokapseln und implantierbaren Vorrichtungen. Zur Herstellung von Zusammensetzungen zur Langzeitfreisetzung von VEGF wird das VEGF vorzugsweise in eine biologisch abbaubare Matrix oder Mikrokapsel eingebaut. Ein geeignetes Material für diesen Zweck ist Polylactid, obwohl andere Polymere von Poly(α-hydroxycarbonsäuren), wie Poly-D-(-)-3-hydroxybuttersäure (EP-A-133.988) verwendet werden können. Andere biologisch abbaubare Polymere umfassen Polylaktone, Polyacetale, Polyorthoester oder Polyorthocarbonate. Die wichtigste Überlegung dabei muß sein, daß der Träger selbst oder seine Abbauprodukte im Zielgewebe nicht toxisch sind und die Bedingungen nicht weiter verschlechtern. Dies kann durch Routinescreening der Zielkrankheit im Tiermodell, oder wenn solche Modelle nicht erhältlich sind, in normalen Tieren, bestimmt werden.
Beispiele für Zusammensetzungen mit Langzeitfreisetzung finden sich in US Patent Nr. 3.773.919, EP-A-58.481, US Patent Nr.3.887.699, EP-A-158.277, Kanadisches Patent Nr. 1.176.565, U. Sidman et al., Biopolymers 22: 547 [1983] und R. Langer et al., Chem. Tech. 12: 98 [1982].
Wenn es örtlich (lokal) verabreicht wird, wird das VEGF passenderweise mit anderen Zutaten wie Trägern und/oder Zusätzen kombiniert. Es gibt bei der Art solcher anderer Zusätze keine Einschränkungen, außer daß sie pharmazeutisch akzeptabel und hinsichtlich deren geplanter Verabreichung wirkungsvoll sein müssen und daß sie nicht die Aktivität der aktiven Zusätze der Zusammensetzung verringern dürfen. Beispiele geeigneter Vehikel umfassen Salben, Creme(n), Gele oder Suspensionen, mit oder ohne Kollagen. Die Zusammensetzungen können auch in transdermale Pflästerchen, Pflaster und Bandagen imprägniert (eingearbeitet, damit getränkt) sein, vorzugsweise in flüssiger oder halb-flüssiger Form.
Um eine Gelanwendung zu erhalten, wird das VEGF, das in Form einer flüssigen Zusammensetzung vorliegt, mit einer wirksamen Menge eines wasserlöslichen Polysaccharids oder eines synthetischen Polymers, wie Polyethylenglycol vermischt, damit es zur lokalen Verabreichung ein Gel mit der richtigen Viskosität bildet. Das verwendbare Polysaccharid umfaßt z.B. Zellulosederivate, wie veretherte Zellulose, einschließlich Alkylzellulose, Hydroxyalkylzellulose und Alkylhydroxyalkylzellulose, z.B. Methylcellulose, Hydroxyethylzellulose, Carboxymethylzellulose, Hydroxypropylmethylzellulose und Hydroxypropylzellulose; Stärke und fraktionierte Stärke; Agar-Agar; Alginsäure und Alginate; Gummi arabicum; Pullulan; Agarose; Carrageen; Dextrane; Dextrine; Fruktane; Inulin; Mannane; Xylane; Arabinane; Chitosane; Glykogene; Glukane und synthetische Biopolymere; sowie Gummisorten wie Xanthangummi; Guargummi; Johannisbrot(frucht)gummi; Gummi arabicum; Traganthgummi und Karayagummi; und Derivate und Mischungen davon. Das bevorzugtes Geliermittel dabei ist eines, das biologischen Systemen gegenüber inert und nicht toxisch, einfach herzustellen, nicht zu flüssig (zerlaufend) oder viskos ist, und das das darin enthaltene VECF nicht destabilisiert.
Vorzugsweise ist das Polysaccharid ein verethertes Zellulosederivat, mehr vorzugsweise eines das wohldefiniert, gereinigt und in US-Patenten aufgezählt ist, z.B. Methylcellulose und Hydroxyalkylzellulosederivate, wie Hydroxypropylzellulose, Hydroxyethylzellulose und Hydroxypropylmethylzellulose. Ganz besonders bevorzugt ist dabei Methylcellulose.
Das zur Gelierung gebräuchliche Polyethylenglycol ist typischerweise eine Mischung aus Polyethylenglycolen mit niedrigem und hohem Molekulargewicht, um die richtige Viskosität zu erhalten. Z.B. wäre ein Gemisch eines Polyethylenglycols mit einem Molekulargewicht von 400-600 mit einem Polyethylenglycol mit einem Molekulargewicht von 1500 zu diesem Zweck geeignet, wenn diese im richtigen Verhältnis gemischt werden, um eine Paste zu ergeben.
Der Begriff "wasserlöslich", wie er bei den Polysacchariden und Polyethylenglycolen angewendet wird, schließt kolloidale Lösungen und Dispersionen ein. Im allgemeinen wird die Löslichkeit von Zellullosederivaten durch den Substitutionsgrad der Ethergruppen bestimmt, und die hier verwendbaren stabilisierenden Derivate sollten eine ausreichende Anzahl solcher Ethergruppen pro Anhydroglucoseeinheit in der Zellullosekette aufweisen, um den Derivaten Wasserlöslichkeit zu verleihen. Ein Ethersubstitutionsgrad von mindestens 0,35 Ethergruppen pro Anhydroglucoseeinheit ist im allgemeinen ausreichend. Zusätzlich können die Zellullosederivate in der Form von Metallsalzen, z.B. Li&supmin;, Na&supmin;, K&supmin; oder Cs-Salzen sein.
Wenn Methylzellulose im Gel verwendet wird, bildet sie vorzugsweise etwa 2-5%, mehr vorzugsweise etwa 3% des Geis und das VEGF ist in einer Menge von etwa 300- 1000 µg pro ml Gel vorhanden.
Die im Gel zu verwendende Dosis ist von den oben beschriebenen Faktoren abhängig. Als allgemeiner Vorschlag wird VEGF in eine Form gebracht und an die Zielstelle oder das Zielgewebe in einer Dosis verabreicht, die die Aufrechterhaltung einer VEGF- Konzentration von mehr als 0,1 ng/ml bis zu einer Maximaldosis, die wirksam aber nicht übermäßig toxisch ist, gewährleistet. Die Konzentration innerhalb des Gewebes sollte, wenn möglich durch kontinuierliche Infusionen, Langzeitfreisetzung örtliche Auftragung oder Injektionen in empirisch bestimmten Frequenzen aufrechterhalten werden.
Diese Erfindung umfaßt auch die Kombination der VEGF-Therapie mit anderen neuen oder gebräuchlichen Therapien (z.B. Wachstumsfaktoren wie aFGF, bFGF, PDGF, IGF, NGF, anabole Steroide, EGF oder TGF-α) zur Verstärkung der Aktivität eines der Wachstumsfaktoren, inklusive VEGF, bei der Förderung der Zellvermehrung und -reparatur. Es ist nicht notwendig, daß solche Mitbehandlungsarzneimittel an sich in die Zusammensetzungen in dieser Erfindung eingeschlossen sind, obwohl dies gebräuchlich sein wird, wenn diese Arzneimittel proteinartig sind. Solche Zumischungen werden geeigneterweise in der selben Art und zu den selben Zwecken wie das VEGF allein verabreicht. Das verwendbare molare Verhälnis von VEGF zu solchen sekundären Wachstumsfaktoren ist typischerweise 1:0,1-10, wobei ungefähr äquimolare Mengen bevorzugt werden.
Um die Beispiele und Ansprüche zu vereinfachen, werden oft vorkommende Verfahren durch kurze Absätze erklärt.
"Transfektion" bezieht sich auf die Aufnahme eines Expressionsvektors durch eine Wirtszelle, unabhängig davon, ob eine kodierende Sequenz tatsächlich exprimiert wird oder nicht. Ein Fachmann aut diesem Gebiet kennt verschiedene Verfahren der Transfektion, z.B. CaPO&sub4; oder Elektroporation. Die erfolgreiche Transfektion wird im allgemeinen erkannt, wenn ein Anzeichen der Funktion des Vektors innerhalb der Wirtszelle auftritt.
"Transformation" bedeutet die Einbringung von DNA in einen Organismus, sodaß diese DNA, entweder als extrachromosomales Element oder nachchromosomaler Integration, replizierbar ist. Abhängig von der Wirtszelle wird die Transformation unter Verwendung von für solche Zellen geeigneten Standardverfahren durchgeführt. Die Kalzium- Behandlung unter der Verwendung von Kalziumchlorid, wie von Cohen, S.N. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 69: 2110 (1972) und Mandel et al., J. Mol. Biol. 53: 154 (1970) wird im allgemeinen für Prokaryoten oder andere, starke Zellwände enthaltende Zellen verwendet. Für Säugetierzellen ohne solche Zellwände wird das Kalziumphosphat- Fällverfahren von Graham, Fig.. und van der Eb, A., Virology, 52: 456-457 (1978) bevorzugt. Allgemeine Aspekte von Säugetierzellenwi rtssystemtransformationen wurden von Axel in U.S.-Patent 4.399.216, vom 16. August, 1983 beschrieben. Transformationen in Hefe werden typischerweise nach den Verfahren von Van Solingen, P. et al., J. Bactl., 130, 946 (1977) und Hsiao, C.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 76: 3829 (1979) durchgeführt. Es können aber auch andere Verfahren zur Einbringung von DNA in Zellen wie Kern-Injektion oder Protoplastenfusion verwendet werden.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Ausdruck "Hybridisieren unter strengen Bedingungen" - dieses Verfahren wird verwendet, um bestimmte DNA-Sequenzen, die diese Erfindung umfaßt, zu beschreiben - auf die Hybridisierung unter Bedingungen geringer ionischer Stärke und hoher Waschtemperatur, z.B. 0,15 M NACl / 0,015 M Natriumcitrat / 0,1% Natriumdodecylsulfat bei 50ºC, oder alternativ das Vorhandensein von denaturierenden Agentien wie Formamid, z.B. 50% (v/v) Formamid mit 0,1% Rinderserumalbumin / 0,1% Ficoll / 0,1% Polyvinylpyrrolidon / 50 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 6,5 mit 750 mM NACl, 75 mM Natriumcitrat, bei 42ºC zur Hybridisierung. " Hybridisierung unter schonenden Bedingungen" bezieht sich auf die Hybridisierung bei 42ºC in 20% Formamid, 5 x SSC, 50 mM Natriumphosphat pH 6,8, 0,1 % Natriumpyrophosphat, 5 x Denhardt-Lösung und 50 µg/ml LachsspermienDNA und das Waschen mit 2 x SSC, 0,1% SDS bei 42ºC.
"Stellenspezifische Mutagenese" ist ein Standardverfahren auf dem Gebiet und wird unter Verwendung eines synthetischen Oligonukleotidprimers, der komplementär zu einer einsträngigen Phagen-DNA ist, die zu beschränkten Fehlstellen mutiert werden soll, was dann die gewünschte Mutation darstellt, durchgeführt. Kurz gesagt, es wird das synthetische Oligonukleotid als Primer zur direkten Synthese eines zum Phagen komplementären Strangs verwendet, und die erhaltene Doppelstrang-DNA wird in ein Phagen-verträgliches Wirtsbakterium transformiert. Kulturen der transformierten Bakterien werden auf Agar ausplattiert, um eine Plaquebildung von einzelnen, den Phagen tragenden Zellen zu ermöglichen. Theoretisch enthalten 50% der neuen Plaques den Phagen, der als Einzelstrang die mutierte Form aufweist; 50% weisen die Originalsequenz auf. Die Plaques werden an einen durch Kinase behandelten, synthetischen Primer bei einer Temperatur hybridisiert, die eine Hybridisierung von exakten Übereinstimmungen gestattet, aber bei der Fehlstellen gegenüber dem Originalstrang ausreichen, um eine Hybridisierung zu verhindern. Plaques, die dann mit der Sonde hybridisieren, werden ausgewählt und kultiviert und die DNA wiedergewonnen.
"Operabel verbunden" bezieht sich auf eine Aneinanderreihung (der Gene in einem Vektor), indem die normale Funktion der Komponenten gegeben ist. Eine kodierende Sequenz, die "operabel" mit Kontrollsequenzen "verbunden" ist, bezieht sich auf eine Konfiguration, worin die kodierende Sequenz unter Kontrolle dieser Sequenzen exprimiert werden kann und worin die verbundenen DNA-Sequenzen benachbart sind und, im Fall eines Ausscheidungsleaders, benachbart und in Lesefolge sind. Z.B. ist die DNA für eine Präsequenz oder einen Ausscheidungsleader operabel mit der DNA für ein Polypeptid verbunden, wenn diese als Preprotein, das bei der Ausscheidung des Polypeptids teilnimmt, exprimiert wird; ein Promotor oder Enhancer ist operabel mit einer kodierenden Sequenz verbunden, wenn er die Transkription der Sequenz bewirkt; oder eine Ribosombindestelle ist operabel mit einer kodierenden Sequenz verbunden, wenn sie so positioniert ist, daß sie die Translation erleichtert. Das Verbinden ("linken") wird durch Ligation an gebräuchlichen Restriktionsstellen durchgeführt. Wenn solche Stellen nicht vorhanden sind, werden synthetische Oligonukleotidadapter oder -linker verwendet, wie es der gängigen Praxis entspricht.
"Kontrollsequenzen" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die zur Expression einer operabel verbundenen kodierenden Sequenz in einem bestimmten Wirtsorganismus notwendig sind. Die Kontrollsequenzen, die für Prokaryoten geeignet sind, umfassen z.B. einen Promotor, eventuell eine Operatorsequenz, eine Ribosombindestelle und möglicherweise andere Sequenzen, deren Funktion jetzt noch schlecht verstanden wird. Von eukaryotischen Zellen weiß man, daß diese Promotoren, Polyadenylationssignale und Enhancer verwenden.
"Expressionssystem" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die die gewünschte kodierende Sequenz und Kontrollsequenzen operabel verbunden haben, sodaß Wirte, die mit diesen Sequenzen transformiert wurden, in der Lage sind, die kodierten Proteine herzustellen. Um eine Transformation zu bewirken, kann das Expressionssystem in einen Vektor eingeschlossen sein; die relevante DNA kann aber auch in das Wirtschromosom integriert sein.
Wie hier verwendet, sind "Zelle", "Zelllinie" und "Zellkultur" untereinander austauschbar und all diese Bezeichnungen umfassen auch deren Nachkommenschaft. "Transformanten" oder "transformierte Zellen" umfaßt die oben genannten Zellen und die daraus stammenden Kulturen, ungeachtet der Anzahl an Transfers. Man versteht darunter auch, daß dieser Inhalt aufgrund von geplanten oder ungeplanten Mutationen nicht völlig identisch im DNA-Gehalt sein muß. Mutante Nachkommen, die dieselbe Funktionalität aufweisen wie die, nach der in den Originalzellen gescreent wurde, sind hier ebenfalls eingeschlossen. Wo bestimmte Bezeichnungen beabsichtigt sind, wird dies aus dem Kontext klar sein.
"Plasmide" werden mit einem kleinen p, vor und/oder nach dem Großbuchstaben und/oder Zahlen stehen, bezeichnet. Die Plasmide, die hier am Beginn verwendet wurden, sind im Handel sowie öffentlich ohne Einschränkungen erhältlich oder sie können aus solchen Plasmiden nach veröffentlichten Verfahren konstruiert werden. Zusätzlich sind auch andere gleichwertige Plasmide im Fachgebiet bekannt und werden dem Fachmann klar sein.
"Spaltung" von DNA bezieht sich auf die katalytische Spaltung der DNA mit einem Enzym, das nur an bestimmten Stellen in der DNA wirkt. Solche Enzyme werden Restriktionsenzyme genannt und die Stellen, für die jedes davon spezifisch ist, werden Restriktionsstellen genannt. Die verschiedenen hier verwendeten Restriktionsenzyme sind im Handel erhältlich und die Reaktionsbedingungen, Kofaktoren und andere Erfordernisse wurden, wie von den Enzymlieferanten angegeben, verwendet. Restriktionsenzyme werden gebräuchlicherweise mit Abkürzungen bezeichnet, die aus einem Großbuchstaben, gefolgt von anderen Buchstaben, bestehen, wobei diese zusammen den Mikroorganismus bezeichnen, aus dem das Restriktionsenzym ursprünglich erhalten wurde, und einer Zahl, die dieses bestimmte Enzym bezeichnet. Im allgemeinen wird etwa 1 pg Plasmid oder DNA-Fragment mit etwa 1-2 Units Enzym in etwa 20 µl Pufferlösung verwendet. Geeignete Puffer und Substratmengen für die bestimmten Restriktionsenzyme werden vom Hersteller angegeben. Normalerweise oird etwa 1 Stunde bei 37ºC inkubiert, aber dies kann übereinstimmend mit den Herstellerangaben variieren. Nach der Inkubation wird das Protein durch eine Extraktion mit Phenol und Chloroform entfernt, und die gespaltene Nukleinsäure wird aus der wässrigen Fraktion durch Alkoholfällung wiedergewonnen. Auf die Spaltung mit einem Restriktionsenzym folgt manchmal eine Hydrolyse der terminalen 5'-Phosphate mit bakterieller alkalischer Phosphatase, um die zwei restriktionsgespaltenen Endstücke des DNA-Fragments daran zu hindern, einen "Ring" oder eine geschlossene Schleife zu bilden, die eine Insertion eines anderen DNA-Fragments an der Restriktionsstelle verhindern würde. Wenn nicht anders erwähnt, folgt auf die Spaltung von Plasmiden keine terminale 5'-Dephosphorylierung. Die Verfahren und Reagentien zur Dephosphorylierung sind gebräuchlich (T. Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) S.133-134).
Die "Wiedergewinnung" oder "Isolierung" eines bestimmten DNA-Fragments aus einerm Restriktionsdigest bedeutet das Auftrennen des Digests durch Elektrophorese in einem Polyacrylamid- oder Agarosegel, die Identifikation des Fragments von Interesse durch einen Vergleich seiner Mobilität mit der von Marker-DNA-Fragmenten mit bekanntem Molekulargewicht, die Entfernung des Gelabschnitts, der das gewünschte Fragment enthält und die Gewinnung der DNA aus dem Gel. Dieses Verfahren ist allgemein bekannt. Z.B. bei R. Lawn et al., Nucleic Acids Res. 9: 6103-6114 (1981) und D. Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8: 4057 (1980).
Die "Southern-Analyse" ist ein Verfahren, mit dem das Vorhandensein von DNA- Sequenzen oder DNA-enthaltenden Zusammensetzungen durch Hybridisierung mit einem bekannten, markierten Oligonukleotid oder DNA-Fragment bestätigt wird. Hier bedeutet, falls nicht anders erwähnt, die Southern-Analyse eine Trennung der Spaltunglösungen in 1% Agarose, Denaturierung und den Transfer auf Nitrozellulose nach dem Verfahren von E. Southern, J. Mol. Biol. 98: 503-517 (1975), und Hybridisierung wie von T.Maniatis et al., Cell 15: 687-701(1978).
"Ligation" bezieht sich auf das Verfahren der Ausbildung von Phosphodiesterbindungen zwischen zwei Doppelstrangnukleinsäurefragmenten (T. Maniatis et al., 1982, siehe oben S.146). Wenn nicht anders erwähnt, wird die Ligation unter Verwendung von bekannten Puffern und Bedingungen mit 10 Units der T4 DNA-Ligase ("Ligase") pro 0,5 µg von annähernd äquimolaren Mengen der zu ligierenden DNA-Fragmente durchgeführt.
"Präparat" von DNA aus Transformanten bedeutet die Isolation von Plasmid-DNA aus mikrobieller Kultur. Wenn nicht anders erwähnt, wird das alkalische / SDS- Verfahren von Maniatis et al., 1982, siehe oben, S. 90 verwendet.
"Oligonukleotide" sind kurze, Einzel- oder Doppelstrangpolydesoxynukleotide, die chemisch durch bekannte Verfahren synthetisiert wurden (wie Phosphotriester, Phosphit oder Phosphoramid-Chemie, unter der Verwendung von Festphasenverfahren wie in EP- A-266.032 vom 4.Mai 1988, oder über Desoxynukleosid-H-Phosphonat als Zwischenprodukte wie von Froehler et al., Nucl. Acids Res., 14: 5399-4507 [1986] beschrieben). Diese werden dann in Polyacrylamidgelen gereinigt.
Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung der besten jetzt bekannten Verfahren zur Umsetzunng der vorliegenden Erfindung, sind aber nicht einschränkend.

BEISPIEL I

Reinigung von nativem VEGF

Primäre Kulturen von Rinderhypophysen-FC's wurden erhalten und angelegt, wie zuvor beschrieben (Ferrara et al., Meth. Enzym., siehe oben; Ferrara et al., Am. J. Physiol., siehe oben. Bei Konfluenz wurden die Zellen in Großmaßstab-Gewebekulturplatten (Applied Sci., San Francisco, CA) übergeführt, in Gegenwart von nach Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit niedrigem Glucosegehalt, das mit 10% Rinderfötenserum, 2 mM Glutamin und Antibiotika versetzt war. Kurz nach Konfluenz wurden die Kulturen gründlich mit PBS gewaschen um Serumkomponenten zu entfernen. Die Zellen wurden dann in serumfreien Medien, bestehend aus DMEM mit Transferrin (10 g/ml), Insulin (5 µg/ml), Seien (108 M), 2 mM Glutamin und Antibiotika, inkubiert. Nach 3-4 Tagen wurde die Medien entnommen und durch frisches, serumfreies Medium ersetzt. Die gesammelten Medien wurden zentrifugiert ( 1000 x g, 15 min bei 4ºC) und bei -70ºC gelagert. Die konditionierten Medien wurden dann alle 3 oder 4 Tage über einen Zeitraum von 6 Wochen gesammelt. Es konnte gezeigt werden, daß die Medien, die durch die FC's konditioniert wurden, die Vermehrungsrate von Mikrogefäßendothelzellen mit niedriger Dichte steigern.
Ansätze mit vier bis sechs Litern von konditionierten Medien (CM) wurden einer Ammonsulfatfällung unterzogen. Ammonsulfat (500 g/l) wurde unter konstantem Rühren zugegeben, bis das Salz vollständig in Lösung war. Nach 8-12 Stunden in einem kalten Raum wurde das Material zentrifugiert (20.000 x g, 45 min bei 4ºC). Der Überständ wurde verworfen und das Pellet wieder in 1 mM Tris/HCl, pH 7,2, 50 mM NACl suspendiert und bei 4ºC gegen den selben Puffer 8-12 Stunden lang dialysiert. Das Endvolumen war 50-60fach geringer als das Originalvolumen.
Das konzentrierte CM wurde auf eine H-S-Säule [Shing et al., Science, 223: 1296-1299 (1984)] (10 ml), die vorher mit 10 mM Tris/HCl, pH 7,2, 50 mM NACl äquilibriert worden war, aufgegeben. Die Säule wurde dann mit dem selben Puffer gewaschen, bis die Absorption bei 280 nm vernachlässigbar war und dann schrittweise mit 10 mM Tris/HCl, pH 7,2 , mit 0,15, 0,9 bzw. 3 M NACl, eluiert. Die Flußrate betrug 1,5 ml/min. Es wurden 1,5 ml Fraktionen gesammelt und Aliquote davon, die mit 0,2% Gelatin in PBS verdünnt waren, auf deren Mitogenaktivität an Endothelzellen getestet. Annähernd 90% der biologische Aktivität wurden mit 0,9 M NACl eluiert. Die Bioaktivität wurde durch 5-minütiges Erhitzen der Fraktionen auf 65ºC nicht beeinträchtigt und fiel um 25- 30% bei 2-stündigem Zusatz von 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) (pH 2). Eine Chromatofokussierung unter Verwendung einer Mono P-Säule zeigte, daß der isoelektrische Punkt des Wachstumsfaktors etwa 8,5 ist.
Die bioaktivsten H-S-Fraktionen (0,9 M NACl) wurden 4fach mit 0,10/0 TFA in Wasser verdünnt und auf eine Vydac C4 HPLC-Säule (10 x 250 mm), die vorher mit 0,10/0 TFA / 20% Acetonitril äquilibriert wurde, aufgegeben. Die Säule wurde mit einem linearen Acetonitrilgradienten (20-45% in 115 min) bei einer Flußrate von 2 ml/min eluiert. Die Absorption bei 210 nm wurde beobachtet. 2 ml Fraktionen wurde in 0,2% Gelatin in PBS zum Assay für Endothelzellen verdünnt. Die Bioaktivität wurde als einzelner Peak bei etwa 29% Acetonitril eluiert. Ein silbereingefärbtes [Morissey, Anal. Biochem., 117: 307-310 (1981)] SDS-PAGE-Gel der bioaktivsten Fraktionen zeigte das Vorhandensein von drei oder vier Banden.
Die bioaktivsten Fraktionen wurden gesammelt, zweifach mit 0,1% TFA in Wasser verdünnt und auf eine zweite Vydac C4 HPLC-Säule (4,6 x 250 mm), die vorher mit 0,1% TFA / 20% 2-Propanol äquilibriert wurde, aufgegeben. Die Säule wurde mit einem linearen 2-Propanolgradienten (20-45% in 113 min) eluiert. Die Flußrate betrug 0,6 ml/min. Aliquote der Fraktionen wurden für die Bioassays verdünnt. Der Rest der Fraktionen wurde in einem Speed-Vac für die SDS/PAGE [Laemmli, Nature, 227: 680- 685 (1970)] und die Strukturanalyse getrocknet. Ein einzelner Bioaktivitätspeak, der mit einem bestimmten Peak im Absorptionsprofil übereinstimmte, wurde erhalten.
Die Peakfraktionen aus dem zweiten Reverse-Phase-Schritt zeigten eine einzelne Bande in einer silbereingefärbten SDS-PAGE, mit einem daraus erhaltenen Molekulargewicht von etwa 23.000 unter reduzierenden Bedingungen. Die Stärke der Färbung der Bande stimmte gut mit der Mitogenaktivität im Bioaktivitätsprofil überein. Da frühere Experimente, die ein Molekularsieb mit einer TSK G 3000 SW-Säule verwendeten, ein Molekulargewicht im Bereich von 40-43.000 vermuten ließen, wurde die Möglichkeit, daß der Faktor unter nativen Bedingungen ein Dimer ist, in Betracht gezogen. Dies wurde sehr stark nahegelegt durch die Tatsache, daß das gereinigte Material ein Molekulargewicht von etwa 45.000 in einer silbergefärbten SDS-PAGE unter nicht reduzierenden Bedingungen aufweist.
Aus Rindernebennieren und aus Gehirnen stammende Gefäßendothelzellen und Rindernebennierenzellen wurden erhalten und angelegt wie von Ferrara et al., Proc. Natl. Acad. Sci., siehe oben; Schweigerer et al., Endocrinology, siehe oben; beschrieben. Rinderaortaendothelzellen aus erwachsenen Rindern oder Rinderföten, menschliche Nabelschnurgefäßzellen, Rinderhornhautendothelzellen, Linsenepithelzellen, BHK-21- Fibroblasten und menschliche Keratinozyten wurden kultiviert und wie von Schweigerer et al., Exp. Eye Res., siehe oben; Jaffe et al., J. Cm. Inv., 51: 46a (1972); Folkman in Pathobiology of the Endothelial Cell, Nossel and Vogel, Hrsg, S.79-93 (Academic Press, New York, 1972); D'Amore et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 3068-3072 (1981); Neufeld et al., Reg. Pept., 13: 293-305 (1986); Pheel and Ham, In Vitro, 16: 526-538 (1985) beschrieben, erhalten. Für Bioassays wurden die Zellen in deren Wachstumsmedien bei einer Dichte von 2 x 10&sup4;/ 35 mm Platte oder 1 x 10&sup4;/ Napf in 12 Mehrfachnapfplatten verteilt. Die Fraktionen wurden den Zellen in Aliquoten von 5 µl/ml zugegeben. Nach 4-5 Tagen wurden die Zellen durch Zusatz von Trypsin dissoziiert und in einem Coultercounter gezählt.
Wie in Fig. 5 gezeigt wird, wurde deutliche Aktivität nur in Zelltypen aus dem Gefäßendothel beobachtet, wie Rinderaortaendothelzellen aus Föten oder erwachsenen Rindern, Rindergehirnkapillarendothelzellen und menschlichen Nabelschnurgefäßendothelzellen. Im Gegensatz dazu zeigten Nebennierenzellen, Linsenepithelzellen, Homhautendothelzellen, BHK-21 Fibroblasten und Keratinozyten keine deutliche Mitogenwirkung.
Annähernd 20 pMol Protein aus den bioaktivsten Fraktionen, die beim zweiten C4- Schritt erhalten wurden, wurden direkt auf einen Gasphasenprotein-sequenzierer Model 470A (Applied Biosystems) aufgegeben. Die Edmanabbauzyklen wurden mit einer on- line HPLC-Säule durchgeführt und die Aminosäurederivate auf dem HPLC- Chromatogramm identifiziert (Henzel et al., J. Chromatograph. 404: 41-52 (1987).
Die Gasphasenmikrosequenzierung ergab unzweifelhaft eine Aminosäuresequenz mit einem einzelnen N-Terminus. Die ersten 39 Reste sind: Ala-Pro-Met-Ala-Glu-Gly-Gly- Gln-Lys-Pro-His-Glu-Val-Val-Lys-Phe-Met-Asp-Val-Tyr-Gln-Arg-Ser-Phe-Cys-Arg-Pro-Ile- Glu-Thr-Leu-Val-Asp-Ile-Phe-Gln-Glu-Tyr-Pro. Diese Sequenz wurde aus mehreren N- terminalen Sequenzläufen des intakten Moleküls bestimmt. Eine Computersuche ergab, daß eine solche Sequenz keine deutliche Homologie zu einem vorher bekannten Protein zeigt.
Die Dosis-Reaktion-Kurve zeigt für den gereinigten Wachstumsfaktor eine halbmaximale Wirkung auf die Vermehrung von Nebennierenendothelzellen bei 100-150 pg/ml und eine maximale Wirkung bei 1-1,2 ng/ml. Diese Werte stammen aus der Proteinsequenzierung und zeigten gute Übereinstimmung mit jenen, die durch Vergleich der relativen Intensitäten der Banden mit Standardbanden in der silbergefärbten SDS/PAGE erhalten wurden.
Tabelle 1 faßt die Reinigungsschritte der wachstumsfördernden Aktivität und die zugehörige Ausbeute an Bioaktivität zusammen. Tabelle 1 Zusammenfassung der Reinigung von VEGF aus 6 L konditioniertem Medium
a CM ist konditioniertes Medium; AS ist Ammoniumsulfatprecipitat; HS ist Heparinsepharose; R-P 1 ist Reverse-Phase-HPLC Schritt 1, Lind R-P 2 ist Reverse-Phase-HPLC Schritt 2.
* Die Proteinkonzentration wurde durch einen Biorad-Kit bestimmt.
** Die Proteinkonzentration wurde durch den Vergleich der relativen Intensitäten der Banden mit Standardbanden in der silbergefärbten SDS-PAGE bestimmt.
# Die Proteinkonzentration wurde durch Sequenzierung bestimmt.

BEISPIEL II

Isolierung von VEGF cDNA

Die gesamte RNA wurde aus Rinderhypophysenfollikelzellen [die erhalten wurden, wie in Ferrara et al., Meth. Enzymol., siehe oben; und Ferrara et al., Am. J. Physiol., siehe oben, beschrieben] extrahiert [Ullrich et al., Science, 196:1313-1317 (1977)] und die polyadenylierte m-RNA-Fraktion durch oligo(dT)-Zellulosechromatographie isoliert (Aviv et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69: 1408-1412 (1972)). Die cDNA wurde durch Primen mit dT&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub8; oder ein statistisches Hexamer dN&sub6; hergestellt (Wickens et al., J. Biol. Chem. 253: 2483-2495 (1978)). Die doppelsträngige cDNA wurde unter der Verwendung eines cDNA-Kits von Amersham synthetisiert und die entstandene cDNA in EcoRI-gespaltenen λgt10 subkloniert wie beschrieben (Huynh et al., in DNA Cloning Techniques, A Practical Approach, Glover Hrsg., (IRL, Oxford, 1985), außer daß asymmetrische EcoRI-Linker (Norris et al., Gene 7: 355-362 (1979)) verwendet wurden, um zu vermeiden, daß eine EcoRI-Methylasebehandlung notwendig ist.
Der rekombinante Phage wurde auf E. coli C600 Hfl [Huynh et al., siehe oben] und Kopien davon auf Nitrocellulosefiltern ausplattiert (Benton et al., Science, 196: 180-182 (1977)). Diese Kopien wurden mit einer ³²P-markierten [Taylor et al., Biochim. Biophys. Acta, 442: 324-330 (1976)] synthetischen Oligonukleotidsonde der folgender Sequenz:
5'-CCTATGCCTGAAGGCGGCCAGAAGCCTCA
CGAAGTGCTCAAGTTCATGGACGTGTATCA-3'
bei 42ºC in 20% Formamid, 5 x SSC, 50 mM Natriumphosphat pH 6,8, 0,1% Natriumpyrophosphat, 5 x Denhardt-Lösung und 50 µg/ml Lachsspermien-DNA hybridisiert und in 2 x SSC, 0,1% SDS bei 42ºC gewaschen. Fig. 1 zeigt einen Vergleich zwischen dieser Sonde und der tatsächlich erhaltenen cDNA-Sequenz, wobei die Sternchen homologe Nukleotide anzeigen.
Ein positiver Klon mit der Bezeichnung λ.vegf.6 wurde identifiziert. Dieser Klon wurde, mit ³²P markiert, als Sonde verwendet, um eine oligo-dT-geprimte menschliche Placenta cDNA-Bibliothek zu screenen, und positive Klone erhalten. Bei einem Screening einer menschlichen Hypophysen-cDNA-Bibliothek mit der selben Sonde wurden keine positiven Klone detektiert.
Die gesamte Nukleotidsequenz des Klons λ.vegf.6 wurde mit dem Didesoxyoligonukleotidkettenabbruchverfahren [Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463- 5467 (1977)] nach der Subklonierung in den Vektor pRK5 bestimmt. Die erhaltene Sequenz, gemeinsam mit der zugehörigen Aminosäuresequenz, einschließlich der Signalsequenz, wird in Fig. 2 gezeigt.

A. Konstruktion von pRK5

A1. Konstruktion von pF8CIS

Die anfängliche Konstruktion des Ausgangsplasmids pF8CIS aus 3 Teilen wird unten beschrieben und in Fig. 3 gezeigt.
1) Der Ampicillinresistenzmarker und der Replikationsursprung wurden aus dem Ausgangsplasmid pUC13pML, einer Variante des Plasmids pML (Lusky, M. and Botchen, M., Nature, 293: 79 [1981]), erhalten. pUC13pML wurde durch den Transfer des Polylinkers von pUC13 (Vieira, J. and Messing, J., Gene, 19: 259 (1982)) an die EcoRI und HindIII-Stellen von pML konstruiert. Ein zweites anfangs verwendetes Plasmid pUC8-CMV war der Ursprung der CMV-Enhancer-, Promotor- und Spleißdonorsequenzen. pUC8-CMV wurde durch die Insertion von ca 800 Nukleotiden (für die CMV-Enhancer-, Promotor- und Spleißdonorsequenzen) an die stumpfen PstI- und SphI-Stellen von pUC8 konstruiert (Vieira, J. and Messing, J., siehe oben). Synthetische BamHI-HindIII-Linker (im Handel von den New England Biolabs erhältlich) wurden mit dem kohäsiven BamHI-Ende ligiert und ergaben eine HindIIIStelle. An diese Ligation anschließend wurde eine HindIII-HindIII-Spaltung durchgeführt. Diese Spaltung ergab ein Fragment von etwa 800 bp, das die CMV-Enhancer-, -Promotor- und -Spleißdonorstellen enthielt. Nach der Isolierung mit einem Gel wurde dieses 800 bp-Fragment mit einem 2900 bp-Stück von pUC13pML ligiert. Das zur Konstruktion von pF8CIS benötigte Fragment wurde durch eine Spaltung des oberen als Zwischenprodukt auftretenden Plasmids mit SalI und HindIII erhalten. Dieses 3123 bp- Stück enthielt die Ampicillinresistenzmarker, den Replikationsursprung von pUC13pML und die Kontrollsequenzen aus dem CMV, einschließlich der Enhancer-, Promotor- und Spleißdonorstellen.
2) Die Intron und Spleißakzeptorsequenz der variablen Ig-Bereiche wurde unter Verwendung eines synthetischen Oligomers, wie im Mittelteil der Fig. 4 gezeigt, konstruiert. Ein 99-Mer und ein 30-Mer wurden chemisch synthetisiert, wobei die Ig- Intron und Spleißakzeptorstelle (Bothwell et al., Nature, 290: 65-67 [1981]) die folgende Sequenz aufweisen:
DNA-Polymerase 1 (Klenow-Fragment) füllte die synthetischen Stücke auf und erzeugte ein doppelsträngiges Fragment (Wartell, R.M. und WS. Reznikoff, Gene, 9: 307 (1980)). Darauffolgte eine doppelte Spaltung mit PstI und HindIII. Dieser synthetische Linker wurde an den PstI- und HindIII-Stellen in pUC13 (Vieira and Messing, siehe oben) kloniert. Der Klon, der das synthetische Oligonukleotid enthielt, der pUClg.10 genannt wurde, wurde mit PstI gespalten. Eine ClaI-Stelle wurde an dieses Fragment unter Verwendung eines PstI-ClaI-Linkers angefügt. Nach einer Spaltung mit HindIII wurde ein 118 bp-Stück, das einen Teil der Introns und den Spleißakzeptor des variablen Ig- Bereichs enthielt, mit einem Gel isoliert.
3) Der dritte Teil des Konstruktionsschemas ersetzte das Hepatitisoberflächenantigen am 3'-Ende durch die Polyadenylierungsstelle und die Transkriptionsabschlußstelle der frühen Bereiche von SV40. Ein Vektor, pUC.SV40, der die SV40-Sequenzen enthält, wurde an der BamHI-Stelie in pUC8 insertiert, wie von Vieira und Messing, siehe oben, beschrieben. pUC.SV40 wurde dann mit EcoRI und HpaI gespalten. Ein 143 bp-Fragment, das die SV40-Polyadenylierungssequenz enthielt, wurde mit einem Gel aus dieser Spaltlösung isoliert. Zwei zusätzliche Fragmente wurden nach einer Spaltung von pSVE.8c1D mit einem Gel isoliert (EP-A-160.457). Das 4,8 kb-Fragment, das durch Spaltung mit EcoRI und ClaI entstand, enthielt die SV40- DHFR-Transkriptionseinheit, den Replikationsursprung von pML und den Ampicillinresistenzmarker. Das 7,5 kb-Fragment, das bei einer nachfolgenden Spaltung mit ClaI und HpaI entstand, enthielt die cDNA für den Faktor VIII. Eine Ligation der drei Teile ergab pSVE.8c24d. Diese Zwischenplasmid wurde mit ClaI und SalI gespalten und ergab ein 9611 bp-Fragment, das die cDNA für den Faktor VIII mit einer SV40-Poly-A- Stelle, gefolgt von der SV40-DH FR-Transkriptionseinheit, enthielt.
Die Abschlußligation aus drei Teilen, um pF8CIS zu erhalten, verwendete: a) das 3123 bp SalI-HindIII-Fragment, das den Replikationsursprung, den Ampicillinresistenzmarker, und die CMV-Enhancer-, -Promotor- und -Spleißdonorstellen enthielt; b) das 118 bp HindIII-ClaI-Fragment , das die aus Ig stammenden Intron und Spleißakzeptorstelle enthielt; und c) ein 9611 bp ClaI-SalI-Fragment, das die cDNA für den Faktor VIII, die SV40-Polyadenylierungstelle und die SV40-DHFR-Transkriptionseinheit enthielt.

A.2. Konstruktion von pCIS2.8c28D

pCIS2.8c28D umfaßt eine 90 kd Untereinheit des Faktor VIII, die mit einer 73 kd Untereinheit des Faktor VIII verbunden ist. Die 90 kd umfassen die Aminosäuren 1 bis 740 und die 73 kd Untereinheit die Aminosäuren 1690 bis 2332. Dieses Konstrukt wurde durch eine Ligation der folgenden drei Fragmente hergestellt: a) das 12617-bp ClaI-SstII-Fragment von pF8CIS (isoliert aus einem Ausgangs-Stamm und BAP- behandelt); b) das 216 bp SstII-PstI-Fragment vom pF8CIS; und c) ein kurzes synthetisches, PstI-ClaI-Oligonukleotid, das mit einer Kinase behandelt wurde (siehe Fig. 5, wo ein Sternchen die veränderten Nukleotide bezeichnet).
Fig. 4 zeigt auch das Subklonieren der 408 bp BamHI-HindIII- und 416 bp BamHI-PstI- Fragmente von pSVEFVIIII (EP-A-160.457), die die 5'- und 3'-DNA-Bereiche des Faktor VIII enthielten, und die fusioniert wurden, um pCIS3.8c28D zu ergeben.
Fig. 5 zeigt die Ligation aus drei Teilen, die zur Konstruktion des Fusionsbereichs von pCIS2.8c28D verwendet wurde. Zwei verschiedene Fragmente, A und B, wurde in den selben pUC1 18 BamHI-PstI BAP-Vektor kloniert. Das A-Fragment war das 408 bp BamHI-HindIII-Fragment von pUC408BH und das B-Fragment war ein HindIII-PstI- Oligonukleotid. Das doppelsträngige Oligonukleotid wird in Fig. 6 dargestellt. Während die gesamte DNA-Sequenz an den terminalen Restriktionsstellen in Fig. 5 gezeigt wird, umfaßt das gegenwärtige Oligonukleotid jene Basen, die durch die Linien an den Restriktionsstellen bezeichnet werden, nicht. Dieses Oligonukleotid wurde ohne Zusatz von Kinase verwendet, um seine Polymerisation während der Ligation zu verhindern.
Nach der Ligation der A- und B-Fragmente in den Vektor, wie in Fig. 5 dargestellt, wurden die erwarteten Verbindungssequenzen durch DNA-Sequenzierung der von den Nucleotiden umschlossenen Bereiche bestätigt.
Das entstandene Plasmid, pCIS2.8c28D, wurde, wie in Fig. 6 gezeigt, durch eine Ligation von 4 Teilen konstruiert. Das Fusionsplasmid aus Fig. 5 wurde mit BamHI und PstI geschnitten und das 443 bp-Fragment isoliert. Die verbleibenden drei Fragmente der Ligation aus 4 Teilen waren: 1) 1944 bp ClaI-BamHI(-Fragment) von pSVEFVIII (EP- A-160.457); 2) ein 2202 bp BamHI-XbaI-Fragment von pSVEFVIII, das weiter mit PstI gespalten wurde und dann wurde das 1786 bp PstI-XbaI-Fragment isoliert, und 3) das 5828 bp XbaI-ClaI-BAP-Fragment von pClS2.8c24d aus Fig. 5. Die translatierte DNA- Sequenz der genau im Fusionsbereich von pClS2.8c28D entstandenen Variante wurde bestimmt und stimmte mit der in Fig. 5 gezeigten Sequenz überein.

A.3. Konstruktion von pRK5

Die Konstruktion von pRK5 wird in Fig. 7 dargestellt. Das Anfangsplasmid zur Konstruktion von pRK5 war pClS2.8c28D. Die Basenzahlen in den Abschnitten 1 bis 6 beziehen sich auf pClS2.8c28D, wobei Base eins für das erste T der EcoRI-Stelle, die vor dem CMV-Promotor kommt, steht. Der frühe Zytomegalievirus-Promotor und das frühe Zytomegalievirus-Intron sowie der SV40-Ursprung und das Poly-A-Signal wurden auf getrennte Plasmide gegeben.
1. Der frühe Zytomegalievirus-Promotor wurde als EcoRI-Fragment aus pClS2.8c28D (9999-1201) an die EcoRI-Stelle von pUC118 kloniert, wie oben beschrieben. Zwölf Kolonien wurden genommen und auf deren Orientierung (Richtung) gescreent, in der die einzelsträngige DNA aus pUC118 eine Sequenzierung von der EcoRI-Stelle bei 1201 zur EcoRI-Stelle bei 9999 erlauben würde. Dieser Klon wurde pCMVE/P genannt.
2. Einzelsträngige DNA wurde aus pCMVE/P gemacht, um einen SP6-Promotor (Green, MR et al., Cell, 32: 681-694 [1983]) durch stellenspezifische Mutagenese zu insertieren. Ein synthetisches 110-Mer, das die Sequenzen -69 bis +5 des SP6-Promotor (siehe Nucleic Acis Res. 12: 7041 [1984], Fig. 1) wurde zusammen mit 18 bp-Fragmenten an jedem Ende des Oligomers, übereinstimmend mit den CMVE/P-Sequenzen verwendet. Die Mutagenese wurde mit Standardverfahren durchgeführt und unter Verwendung eines markierten 110-Mer's bei schonenden und strengen Bedingungen gescreent. Sechs potentielle Klone wurden ausgewählt und sequenziert. Ein positiver Klon wurde identifiziert und pCMVE/PSP6 genannt.
3. Der SP6-Promotor wurde überprüft und erwies sich als aktiv, z.B. durch Zugabe von SP6-RNA-Polymerase und Prüfen auf RNA der passenden Größe.
4. Ein ClaI-NotI-Adapter wurde synthetisiert, um den Abstand von der ClaI-Stelle (912) zu der SmaI-Stelle von pUC118 in pCMVE/P (Schritt 1) und pCMVE/PSP6 (Schritt 2) zu überbrücken. Dieser Adapter wurde in die ClaI-SmaI-Stelle von pUC118 ligiert und auf korrekte Klone gescreent. Der Linker wurde in beiden sequenziert und die Klone pCMVE/PSP6-L und pCMVE/P-L genannt.
5. pCMVE/PSP6-L wurde mit SmaI (bei der Linker/pUC118-Verbindung) und HindIII (in pUC118) geschnitten. Ein HpaI-(5573)-bis-HindIII-(6136)-Fragment von pSVORAAΔRI 11, das weiter unten beschrieben ist, wurde in SmaI-HindIII von pCMVE/PSP6-L insertiert. Diese Ligation wurde gescreent und ein Klon isoliert und pCMVE/PSP-L- pSVORAAΔRI genannt.
a) Der SV40-Ursprung und das Poly-A-Signal wurde als XmnI (5475) - HindIII (6136)-Fragment aus pCIS2.8c28D isoliert und in die HindIII- bis SmaI-Stellen von pUC119 (in Vieira and Messing, siehe oben, beschrieben) kloniert. Der Klon wurde pSVORAA genannt.
b) Die EcoRI-Stelle bei 5716 wurde durch teilweise Spaltung mit EcoR und Auffüllen mit Klenow entfernt. Die nach dem Auffüllen aus der Selbstligation erhaltenen Kolonien wurden gescreent und der korrekte Klon isoliert und pSVORAAΔRI 11 genannt. Die entfernte EcoRI-Stelle wurde durch Sequenzierung überprüft und erwies sich als korrekt.
c) Das HpaI(5573)-bis-HindIII(6136)-Fragment von pSVORAAΔRI 11 wurde isoliert und in pCMVE/PSP-L (siehe 4, oben) insertiert.
6. pCMVE/PSP-L-SVORAAΔRI (Schritt 5) wurde mit EcoRI bei 9999 geschnitten, abgestumpft und mit sich selbst ligiert. Ein Klon ohne EcoRI-Stelle wurde identifiziert und pRK genannt.
7. pRK wurde mit SmaI und BamHI geschnitten. Dieses wurde mit Klenow aufgefüllt und wieder ligiert. Die Kolonien wurden gescreent. Ein positiver Kolon wurde identifiziert und pRKΔBam/Sma3 genannt.
8. Die HindIII-Stelle von pRKΔBam/Sma3 wurde unter Verwendung eines Konverters (ein Konverter ist ein DNA-Stück, das verwendet wird, um eine Restriktionsstelle in eine andere überzuführen. In diesem Fall wäre ein Ende komplementär zu einem kohesiven HindIII-Ende und das andere Ende hätte eine HpaI-Erkennungsstelle) in eine HpaI - Stelle übergeführt. Ein positiver Klon wurde identifiziert und pRKΔBam/Sma, HIII-HpaI 1 genannt.
9. pRKΔBam/Sma, HIII-HpaI 1wurde mit PstI und NotI geschnitten und ein EcoRI- HindIII-Linker und HindIII-EcoRI-Linker hineinligiert. Es konnte Klone für jeden Linker gefunden werden. Es wurde aber auch entdeckt, daß sich zu viele HpaI-Konverter verbunden hatten (zwei oder mehr Konverter erzeugen eine PvuII-Stelle). Daher mußten diese Klone mit HpaI geschnitten und mit sich selbst ligiert werden.
10. RI-HIII-Klon 3 und HIII-RI-Klon 5 wurden mit HpaI geschnitten, verdünnt und mit sich selbst ligiert. Positive Klone wurden identifiziert. Der RI-HIII-Klon wurde pRK5 genannt.

B. Konstruktion von pRK5.vegf.6

Fig. 8 zeigt die Konstruktion von pRKS.vegf.6. Der Klon λ.vegf.6 wurde mit EcoRI behandelt und das EcoRI-Insert isoliert und in das Vektorfragment von pRK5, das nach einer Spaltung von pRK5 mit EcoRI und Isolierung des großen Fragments erhalten wurde, ligiert. Diese Ligation der zwei Fragmente ergab den Expressionsvektor pRKS.vegf.6, der nach der korrekten Orientierung der für VEGF kodierenden Sequenz hinsichtlich des Promotors gescreent wurde.

C. Expression des für VEGF kodierenden Gens

Menschliche Embryonalnierenzellen, die mit dem Adenovirus E I a dn E I b (2935) transformiert wurden, sind von Graham et al., J. Gen. Virol. 36: 59-73 (1977) beschrieben worden. Diese Zellen wurden mit dem oben beschriebenen Expressionsvektor pRK5.vegf.6 nach dem Kalziumphosphatverfahren von Gorman, in DNA Cloning, D.M. Glover, Hrsg. (IRC Press, Oxford, 1985), Vol 2. S. 143-190, transfiziert. Nach 24 Stunden wurden die Zellen in ein serumfreies Medium für eine zusätzliche 48-stündige Inkubation übergeführt. Dieses serumfreie Medium wurde dann gewonnen und der Überstand davon auf VEGF-Aktivität untersucht.

BEISPIEL III

In vitro Assay auf VEGF-Aktivität

Der Überstand der transformierten Zellen, der in Beispiel II C (oben) hergestellt wurde, wurde unter Verwendung der selben Zelllinien, die auch in dem oben beschriebenen Proteinreinigungsverfahren zum Einsatz kamen, auf VEGF-Bioaktivität untersucht. Es wurden Fraktionen des Überstands in 5 µl/ml Aliquoten den verschiedenen Zelltypen, die in Näpfen in deren Wachstumsmedien verteilt waren, zugegeben. Nach 4-5 Tagen wurden die Zellen durch Zusatz von Trypsin dissoziiert und in einem Coultercounter gezählt. Die VEGF enthaltenden Zellüberstände bewirkten die Förderung des Wachstums von Aortaendothelzellen aus erwachsenen Rindern und Rinderföten, Rindergehirnkapillarendothelzellen und menschlichen Nabelschnurgefäßendothelzellen, hingegen bewirkten sie keine Wachstumsförderung bei Nebennierenzellen, Linsenepithelzellen, Hornhautendothelzellen, BHK-21-Fibroblasten und Keratinozyten.

In vivo Assay auf Aktivität

Die Huhnchorioallantoismembran (aus Eiern, im Handel erhältlich) wurde als ein in vivo System verwendet, um die angiogenen Eigenschaften des VEGF zu untersuchen. Die Chorioallantoismembran wurde mit dem "falschen Luftsack"-Verfahren entfernt, wie von Hamburger, V., A Manual of Experimental Embryology, Univ. of Chicago Press, S. 143-145 (1942) und von Phillis, R. and Dumar, S., Int. J. Cancer, 23: 82 (1972) beschrieben. Eine 2 cm² große Öffnung wurde in die Eischale von 8 Tage alten, befruchteten Eiern geschnitten. Das gereinigte VEGF nativen Ursprungs, wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde getrocknet und in PBS wieder suspendiert (50 ng). Diese Suspension oder eine Kontrolllösung mit PBS alleine wurde in 10 µl Aliquoten, die 100 µg Sephadex G50 Perlen enthielten, aufgetragen. Nach 72 Stunden wurden die Eier untersucht und die neovaskuläre Reaktion überprüft.
Eine deutliche angiogene Reaktion mit radialem Wachstum der Blutgefäße hin zu den Sephadexperlen (85% der Embryos positiv, n=59) wurde in mit VEGF behandelten Eiern beobachtet, aber nicht in den Kontrolleiern (10% der Embryos positiv, n=50). Es ist zu erwarten, daß dieser Effekt auch mit rekombinantem VEGF gesehen werden kann.

BEISPIEL IV

Screening der menschlichen Leukämiezelllinienbibliothek

Eine cDNA-Bibliothek wurde folgendermaßen hergestellt. Die menschliche Leukämiezelllinie HL60 (ATCC Nr. CCL240) wurde in Rollflaschen gezüchtet. Die Zellzählung ergab 0,8x10&sup6; Zellen / ml. Die Zellen wurden in RPMI1640 (im Handel erhältlich) und Kalbfötenserum gezüchtet. Zur Induktion wurden die Zellen ausgespült (in die Länge gezogen?) und in 500 ml RPMI1640 in Rollflaschen wieder suspendiert. 500 µl von 1000 X (1000 mal 1 X) lnducer wurde zugegeben, wobei 1 X Inducer Phorbolmyristatacetat (PMA) mit 50 ng/ml, LPS mit 100 µ9/ml, Indomethacin mit 10&supmin;³ M und Cyclohexamid mit 100 µg/ml ist. Nach 4 Stunden Wachstum wurden die Zellen pelletiert.
Die gesamte RNA wurde extrahiert (Cathala et al., DNA, 2: 329-335 (1983)) und die polyadenylierte mRNA-Fraktion durch Oligo(dT)-Zellulosechromatographie isoliert, wie oben beschrieben. Die cDNA wurde durch Primen mit statistischen Hexameren dN&sub6; hergestellt (Okayama and Berg, Molecular and Cellular Biology, 2: 161 (1982); Gubler and Hoffman, Gene, 25: 263 (1983)). Die doppelsträngige cDNA wurde unter Verwendung eines cDNA-Kits von Invitrogen synthetisiert und Linker mit stumpfen Enden zugegeben, mit einer EcoRI-Stelle am Ende, und im inneren BstXI- und NotI- Stellen. Die entstandene cDNA wurde mit stumpfen Enden in EcoRI-gespaltenen λgt10 igiert.
Der rekombinante Phage wurde auf E. coli C600 Hf1 ausplattiert und Kopien davon auf Nitrocellulosefiltern angelegt, wie oben beschrieben, wobei dies eine Bibliothek von 1x10&sup6; Klonen darstellt. Diese Kopien werden mit dem Klon λ.vegf.6, der die ganze Länge des Rinder-VEGF umfaßt und mit ³²p markiert ist [Taylor et al., siehe oben], unter strengen Bedingungen bei 42ºC in 50% Formamid, 5 x SSC, 50 mM Natriumphosphat pH 6,8, 0,1% Natriumpyrophosphat, 5 x Denhardt-Lösung und 50 µg/ml Lachsspermien-DNA hybridisiert. Das Hybridisierungsgemisch wurde in 0,2 x SSC, 0,1% SDS bei 42ºC gewaschen.
Fünf hybridisierende Klone wurden wie oben beschrieben sequenziert, einer davon wurde λ.vegf.21 genannt. Die gesamte Nukleotidsequenz des Klons λ.vegf.21 wird gemeinsam mit der zugehörigen Aminosäuresequenz, einschließlich der Signalsequenz, in Fig. 10 gezeigt.

Expression des für den menschlichen VEGF kodierenden Gens in Säugetierzellen

Der Abschlußexpressionsvektor p.vegf.21 wurde aus λ.vegf.21 und pCIS.CXRHN konstruiert. pClS.CXRHN ist ein Derivat von pRK5, in dem ein unterschiedlicher Satz Restriktionsstellen, ClaI, XhoI, EcoRI, HindIII und NotI in den Polylinkerbereich von pRK5 unter der Verwendung von synthetischer DNA folgender Sequenz eingeführt wurde:
5'-CGATTCTCGAGAATTCAAGCTTGCGGCCGC-3'
3'-TAAGAGCTCTTAAGTTCGAACGCCGGCGAGCT-5'.
Diese wurde durch die Spaltung von pRK5 mit ClaI und HindIII, Isolierung des Vektorfragments und Ligation davon unter Verwendung von T4-Ligase mit der oben gezeigten DNA-Sequenz eingeführt.
Fig. 11 zeigt die Konstruktion von p.vegf.21, die analog zu der von pRK5.vegf.6 ist, wobei Ä.vegf.21 anstelle von Ä.vegf.6 verwendet wurde. Im Detail wurde der Klon λ.vegf.21 mit EcoRI behandelt, das EcoRI-lnsert wurde isoliert und in das Vektorfragment von pCIS.CXRHN, das durch die Spaltung von pCIS.CXRHN mit EcoRI und nachfolgender Isolierung des großen Fragments entstanden ist, ligiert. Die Ligation dieser zwei Fragmente ergab den Expressionsvektor p.vegf.21, der nach der korrekten Orientierung der für VEGF kodierenden Sequenz, hinsichtlich des Promotors, gescreent wurde.

Expression des für den menschlichen VEGF kodierenden Gens

293er Zellen wurden mit dem oben beschriebenen Expressionsvektor λ.vegf.21 nach dem Kalziumphosphatverfahren von Gorman, in DNA Cloning, D.M. Clover, Hrsg. (IRC Press, Oxford, 1985) Vol.2 , S. 143-190, transfiziert. Nach 24 Stunden wurden die Zellen für eine weitere 48-stündige Inkubation in serumfreies Medium übergeführt. Dieses serumfreie Medium wurde dann gewonnen und der Überstand auf VEGF- Aktivität untersucht.

BEISPIEL V

In vitro Assay auf VEGF-Aktivität

Der Überstand aus den transformierten Zellen, der im oben beschriebenen Beispiel IV hergestellt worden war, wurde auf VEGF-Bioaktivität nach dem selben Verfahren wie in Beispiel III untersucht. Die menschliches VEGF enthaltenden Zellüberstände bewirkten eine Förderung der Vermehrung von Rindernebennierenkapillarendothelzellen. Dies zeigt, daß der Wachstumsfaktor nicht nur ein Endothelzellmitogen ist, sondern auch in der Lage ist, die gesamte Ereigniskette auszulösen, die zur Bildung neuer Blutgefäße führt, was auch den enzymatischen Abbau der Basalmembranen und die Chemotaxie erfordert.
Zusammenfassend wurde die Identität der Nukleinsäuresequenzen, die für menschliches und Rinder-VEGF kodieren, aufgeklärt, wobei sich zeigte, daß VEGF ein Dimer ist, das aus zwei Untereinheiten mit dem selben Molekulargewicht (je 23.000) besteht. Menschliches und Rinder-VEGF zeigen zu etwa 95% Homologie in deren Aminosäuresequenzen, einschließlich des Signalpeptids, was auf die Konservierung des Moleküls während der Evolution anzeigt. Menschlicher VEGF hat eine zusätzliche Aminosäure aufgrund der Insertion eines Glycin-Restes in Position 8, siehe Fig. 12. Sowohl der menschliche als auch der Rinder-VEGF sind in der Lage, in reiner Form die Vermehrung von vaskulären Endothelzellen in Konzentrationen zwischen etwa 25 pg/ml und 1-1,2 ng/ml anzuregen. Diese Werte entsprechen, bei einem Molekulargewicht von 45.000, 0,55 pMol und 22-26 pM und sind damit im selben Bereich wie jene, die aus Rinder-VEGF stammen (Gospodarowicz et al., Endocrine Reviews, siehe oben). Es zeigte sich, daß sich VEGF von dem in jüngster Zeit gereinigtem [Miyazono et al., J. Bio; Chem., 262: 4098-4113 (1987)] und kloniertem [Ishikawa et al., Nature, 338: 557-561 (1989)] Endothelzellenwachstumsfaktor, der aus menschlichen Blutplättchen (PD-ECGF) isoliert wurde, unterscheidet. Obwohl PD- ECGF und VEGF das selbe Molekulargewicht aufweisen, unterscheiden sie sich in deren N-terminaler Sequenz, der Sekundärstruktur und der biologischen Wirkung. Anders als VEGF ist PD-ECGF aus einer einzelnen Polypeptidkette aufgebaut und es zeigte sich auch, daß PD-ECGF nur ein Zehntel der Wirkung bei der Förderung des Endothelzellenwachstums aufweist. Zusätzlich bindet sich PD-ECGF nicht an Heparinsepharose und ist ein saures Protein, während sich VEGF an Heparin bindet und einen basischen isoelektrischen Punkt besitzt.
Die Fähigkeit von VEGF, sich an Heparin zu binden, könnte Auswirkungen in seiner in vivo Funktion und Regulation haben. Heparinsulfate sind wesentliche Komponenten der extrazellulären Matrix und es wird angenommen, daß diese eine wesentliche Rolle in der Bestimmung der Begegnung von Zielzellen mit an Heparin-bindenden Wachstumsfaktoren spielen.
Das Vorhandensein von VEGF in Hypophysenfollikelzellen läßt sehr stark vermuten, daß diese Zellen Bedeutung in der Entwicklung, Organisation und Erhaltung einer unterschiedlichen Stufe des komplexen Mikrogefäßsystems der Adenohypophyse (Hypophysenvorderlappen) haben.
Es ist zur Zeit unbekannt, ob VEGF in anderen Organen als der Hypophyse exprimiert wird. Doch hinsichtlich der grundlegenden Bedeutung des Gefäßendothelzellenwachstums und deren Angiogenese in einer großen Anzahl von normalen und pathologischen Vermehrungen, ist die Verteilung von VEGF wahrscheinlich mehr verbreitet.
Eine Computersuche der gesamten Aminosäuresequenz von VEGF zeigte deutliche (21- 25%) Homologien mit der B-Kette des menschlichen PDGF und dem Produkt des sis- Onkogens. Ein geringerer Grad an Homologie wurde auch mit der A-Kette von PDGF erhalten. Die Bereiche, die die deutlichste Homologie aufwiesen, lagen zwischen Gly 54 und Arg 175 in der PDCF B-Kette und zwischen Gly 7 und Arg 128 in VEGF. Interessanterweise sind alle acht Cystein-Reste, die in den A- und B-Ketten von PDGF gefunden wurden, in VEGF konserviert. VEGF enthält jedoch noch weitere acht Cystein- Reste.
Diese Homologien lassen eine gemeinsamen Ursprung aus einem ehemaligen Vorläufergen für das sis-Protoonkogen und das für den Rinder-VEGF kodierende Gen vermuten. Während PDGF an einer Vielzahl verschiedener Zelltypen von mesenchymen Ursprung aktiv und bei Endothelzellen inaktiv ist, zeigt sich, daß VEGF ein hochspezialisiertes Molekül ist, das für die Gefäßendothelzellen spezifisch ist. Dies läßt vermuten, daß der Unterschied in der Struktur zwischen dem Produkt des sis- Protoonkongens und VEGF auch von einem deutlichen funktionellen Unterschied begleitet wurde.
Der cDNA für VEGF steht ein klassisches Signalpeptid voran, was darauf hinweist, daß VEGF ein Ausscheidungsprotein ist, im Gegensatz zu anderen Endothelzellmitogenen wie aFGF, bFGF und PD-ECGF. Dies läßt stark vermuten, daß die Anwesenheit von VEGF in Medien, die von Follikelzellen konditioniert wurden, einen echten Ausscheidungsvorgang darstellt und nicht das Ergebnis von Zelilyse oder Zelltod. VEGF könnte auch eine Rolle als löslicher Vermittler des Endothelzellenwachstums und der Angiogenese spielen. Es konnte durch Northernblots gezeigt werden, daß VEGF in Follikelzellen von einer einzelnen 3,7 kb m-RNA kodiert wird.

Claims

1) Isolierte Nukleinsäuresequenz, die eine Sequenz umfaßt, die für folgendes kodiert: Wachstumsfaktor für Gefäßendothelzellen mit einem Molekulargewicht von ca. 45.000 unter nicht reduzierenden Bedingungen und ca. 23.000 unter reduzierenden Bedingungen, bestimmt mittels SDS-PAGE, und mit einer Aminosäuresequenz des reifen Proteins, die in Figur 2 oder Figur 10 gezeigt ist, oder einer Aminosäuresequenz mit mindestens ca. 80% Homologie zur Aminosäuresequenz des reifen Proteins, die in Figur 2 oder Figur 10 gezeigt ist, wobei der Wachstumsfaktor eine oder beide der folgenden Eigenschaften besitzt: a) selektive Förderung des Wachstums von Gefäßendothelzellen oder b) immunologische Kreuzreaktion mit einem Antikörper, der gegen wenigstens ein Epitop des korrespondierenden Proteins gerichtet ist, jedoch vorausgesetzt, daß ein solcher Wachstumsfaktor nicht der Wachstumsfaktor für Meerschweinchen-Gefäßendothelzellen ist.

2) Sequenz nach Anspruch 1, worin der Wachstumsfaktor vom Rind stammt.

3) Sequenz nach Anspruch 1, worin der Wachstumsfaktor vom Menschen stammt.

4) Sequenz nach Anspruch 1, die eine DNA-Sequenz ist.

5) Sequenz nach Anspruch 4, die für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80% Homologie zur Aminosäuresequenz des reifen Proteins, die in Figur 2 gezeigt ist, aufweist und die biologische Eigenschaft besitzt, selektiv das Wachstum von Gefäßendothelzellen zu fördern.

6) Sequenz nach Anspruch 5, die für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz mit mindestens 90% Homologie zur Aminosäuresequenz des reifen Proteins, die in Figur 2 gezeigt ist, aufweist und die biologische Eigenschaft besitzt, selektiv das Wachstum von Gefäßendothelzellen zu fördern.

7) Sequenz nach Anspruch 6, die für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz mit mindestens 95% Homologie zur Aminosäuresequenz des reifen Proteins, die in Figur 2 gezeigt ist, aufweist und die biologische Eigenschaft besitzt, selektiv das Wachstum von Gefäßendothelzellen zu fördern.

8) Isolierte DNA-Sequenz, die mit der Nukleotid-Kodiersequenz hybridisiert, welche in Figur 2 für den reifen Rinderwachstumsfaktor für Gefäßendothelzellen gezeigt ist, durch deren Inkubation bei 42ºC in 50% Formamid, 5xSSC, 50 mM Natriumphosphat (pH 6,8), 0,1% Natriumpyrophosphat, 5x Denhardt-Lösung, und 50 g/ml Lachsspermien-DNA und Waschen bei 42ºC mit 0,2x SSC, 0,1% SDS bei 42ºC und welche isolierte DNA-Sequenz für ein Polypeptid kodiert, das die biologische Eigenschaft besitzt, selektiv das Wachstum von Gefäßendothelzellen zu fördern.

9) Expressionsvektor, umfassend DNA-Sequenzen nach einem der Ansprüche 4 bis 8, die operabel mit Steuersequenzen verbunden sind, welche von einem Wirt erkannt werden, der mit dem Vektor transformiert ist.

10) Vektor nach Anspruch 9, der ein Plasmid ist.

11) Wirtszelle, die mit dem Expressionsvektor nach Anspruch 9 transformiert ist.

12) Wirtszelle nach Anspruch 11, die eukaryotisch ist.

13) Wirtszelle nach Anspruch 12, die eine Säugetierzelle ist.

14) Verfahren zur Herstellung von Wachstumsfaktor für Gefäßendothelzellen, umfassend eine Kultivierung der Zellen nach Anspruch 11, um den Wachsturnsfaktor in der Wirtszellenkultur zu exprimieren.

15) Verfahren nach Anspruch 14, weiters umfassend den Schritt der Gewinnung des Wachstumsfaktors aus der Wirtszellenkultur.

16) Verfahren nach Anspruch 15, worin der Wachstumsfaktor aus dem Wirtszellenkulturmedium gewonnen wird.

17) Isolierte DNA, umfassend jene Nukleotid-Kodiersequenz, die in Figur 2 für den reifen Wachstumsfaktor für Rinder-Gefäßendothelzellen gezeigt ist.

18) Isolierte DNA, umfassend jene Nukleotid-Kodiersequenz, die in Figur 10 für den reifen Wachstumsfaktor für Menschen-Gefäßendothelzellen gezeigt ist.

19) Menschlicher Gefäßendothelzellenwachstumsfaktor, der nicht von assoziierter, nativer Glykosylierung begleitet ist, umfassend jene Aminosäuresequenz des reifen Proteins, die in Figur 10 gezeigt ist.

20) Menschlicher Gefäßendothelzellenwachstumsfaktor, der vollständig frei von Ursprungsproteinen ist und der die Aminosäuresequenz des reifen Proteins, die in Figur 10 gezeigt ist, umfasst.

21) Pharmazeutische Zusammensetzung, die zur Förderung des Wachstums von Gefäßendothelzellen geeignet ist, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge des Wachstumsfaktors nach Anspruch 19 oder 20 in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.

22) Zusammensetzung nach Anspruch 21, worin die Zusammensetzung weiterhin einen anderen Zellwachstumsfaktor umfaßt.

23) Zusammensetzung nach Anspruch 21, worin die Zusammensetzung isotonisch ist.

24) Zusammensetzungen nach Anspruch 21, worin die Zusammensetzung sterilfiltriert ist.

25) Verwendung des Zellwachstumsfaktors nach einem der Ansprüche 19 oder 20 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Traumata, die das Gefäßendothel betreffen.

26) Verwendung nach Anspruch 25, worin zur Herstellung des Medikaments auch ein weiterer Zellwachstumsfaktor eingesetzt wird.

27) Verwendung nach Anspruch 25, worin das Medikament zur Behandlung von Diabetesgeschwüren oder von Blutgefäß- oder Herzwunden bestimmt ist.

28) Verwendung nach Anspruch 25, worin das Medikament zur Verabreichung an den Menschen bestimmt ist.