KR100419972B1 - 링커 염기서열로 연결된 인간 ｖｅｇｆ의 돌연변이형동형이합체 유전자, 이를 포함하는 발현벡터, 이의형질전환체 및 단백질 - Google Patents

링커 염기서열로 연결된 인간 ｖｅｇｆ의 돌연변이형동형이합체 유전자, 이를 포함하는 발현벡터, 이의형질전환체 및 단백질 Download PDF

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Abstract

본 발명은 링커 서열로 연결된 인간 VEGF(vascular endothelial growth factor)의 돌연변이형 동형이합체 유전자, 이를 포함하는 발현벡터, 이의 형질전환체, 및 이의 단백질에 관한 것이다.
본 발명에 따른 발현벡터 및 이의 단백질은 혈관내피세포의 증식 및 혈관생성에 관여하는 KDR 수용체에 대한 친화력이 매우 높아 만성 허혈성 하지 질환, 동맥경화증 등의 여러가지 심혈관 질환, 버거스씨 병, 및 당뇨병성 족부궤양 등의 허혈성 질환에 대한 치료제로 사용할 수 있다.

Description

링커 염기서열로 연결된 인간 ＶＥＧＦ의 돌연변이형 동형이합체 유전자, 이를 포함하는 발현벡터, 이의 형질전환체 및 단백질{Human VEGF mutant homodimer having a linker, Vector comprising the same, transformants and proteins}
본 발명은 링커 서열로 연결된 인간 VEGF(vascular endothelial growth factor)의 돌연변이형 동형이합체 유전자, 이를 포함하는 발현벡터, 이의 형질전환체, 및 이의 단백질에 관한 것이다.
하지 원위부의 말초혈관 질환으로 인한 만성 허혈성 하지 질환 (chronic ischemic limb disease)으로 하지절단술이 필요한 환자는 미국의 경우 연간 150,000명에 달한다. 유럽의 유러피안 연구 그룹(European Working Group)이 컨센서스 문서(Consensus Document)에서 밝혔듯이 중증의 허혈성 하지질환에서 일차적으로 선택할 수 있는 약물치료법은 아직 없으며, 이들 환자를 대상으로 수술적 재혈관신생화(revascularization)나 경피적 풍선혈관성형술이나 스텐트 삽입술을 고려할 수는 있지만, 불행하게도 많은 환자들은 이런 치료법의 대상이 되지 못하고 있는 실정이다. 현재 이러한 환자들은 혈관을 확장시키기 위한 교감신경 차단술을 받거나, PgE1과 같은 약물에 의한 혈관확장과 항혈소판 작용에 따른 치료 효과를 기대하고 있으나 근원적인 치료가 되지 못하여 결국 사지 절단술을 받게 된다.
상기 만성 허혈성 하지 질환은 수술이나 중재적 시술로 치료가 불가능하지만 신생혈관 생성을 유도하는 치료는 환자의 질환에 대한 근원적인 치료가 될 것으로 기대되며 대상 질환으로는 버거스씨 병, 동맥경화증, 당뇨병성 족부궤양 등이 있다.
VEGF는 혈관내피세포에만 특이성을 갖는 혈관내피세포 성장인자이다. VEGF는 1989년에 클로닝되었고, 태생기 때에는 혈관생성(vasculogenesis)에 관여하며 성인에서는 허혈성 질환, 상처 치유 및 여성의 생산기능 등에 관여하는 것으로 알려져있다. 또한 종양과 같은 질환시에 종양세포의 영양공급과 성장을 위해 종양세포에서 형성되는 VEGF는 45 kDa의 기본(basic), 헤파린-결합(heparin-binding), 동형이합체(homodimeric) 당단백질 (glycoprotein)이다. mRNA의 재조합에 의해 4가지 동위체 121, 165, 189, 및 201(isoform)가 만들어지며, 특히 VEGF 165가 혈관내피세포 성장에 가장 강력한 작용을 하는 것으로 알려져 있다.
VEFG는 그의 수용체인 Flt-1(VEGFR-1)과 KDR/Flk-1(VEGFR-2, 이하 'KDR'이라 약칭함)에 결합하여 신호를 전달한다. 상기 수용체는 SH-2라는 도메인을 가지고 있어서 이들을 통하여 신호를 전달하게 되는데, 이들을 경유한 신호들은 PI-3 키나아제, ERK(Extracellular signal-regulated kinase), 포스포리파아제 C (phospholipase C), 그리고 FAK (Focal adhesion kinase)등을 경유하고 이러한 여러 가지 경로에 대하여 많은 연구가 진행 중이다. 혈관내피세포의 증식 및 혈관생성은 VEGF의 세포 내 수용체인 KDR에 의해 주로 이루어지나 VEGF의 KDR에 대한 친화력은 VEGF의 또 다른 수용체인 Flt-1에 비해 약 50배 정도 낮은 것으로 알려졌으며 현재까지 허혈성 질환의 유전자 치료 및 단백질 치료에는 모두 KDR에 대한 친화력이 낮은 정상형 VEGF를 이용한 모델을 사용하고 있어 높은 치료 효과를 보지 못하고 있는 실정이다. 따라서 보다 효율적인 혈관내피세포의 증식 및 이로 인한 혈관생성을 유도하기 위하여 기존의 유전자 치료용 벡터 및 재조합 단백질보다 우수한 발현벡터 및 재조합 VEGF 단백질의 개발에 대한 필요성이 높아지고 있다.
이에, 본 발명자들이 광범위한 연구를 수행한 결과 링커 염기 서열로 연결된인간 VEGF의 돌연변이형 동형이합체 유전자를 포함하는 발현벡터 및 이의 단백질이 KDR에 대한 친화력이 매우 높음을 확인하였으며 본 발명은 이에 기초하여 완성되었다.
본 발명의 목적은 KDR 수용체에 대한 VEGF의 친화력을 높일 수 있는 VEGF의 돌연변이형 동형이합체 유전자를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 KDR 수용체에 대한 VEGF의 친화력을 높일 수 있는 VEGF의 돌연변이형 동형이합체 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체로 부터 생산된 단백질을 제공하는데 있다.
도 1은 pmut-diVEGF165 발현벡터의 개열(cleavage) 지도이다.
도 2는 pVEGF165를 제한효소로 절단한 후 아가로오즈 젤에서 전기영동한 결과를 나타내는 젤사진이다.
도 3은 pmut-diVEGF165를 제한효소로 절단한 후 아가로오즈 젤에서 전기영동한 결과를 나타내는 젤사진이다.
도 4는 VEGF165 단백질을 웨스턴 블러팅(Western blot)한 결과를 나타내는 사진이다.
도 5는 재조합 mut-diVEGF165 단백질의 웨스턴 블러팅한 결과를 나타내는 사진이다.
도 6은 재조합 VEGF165들에 의한 CPAE 세포의 증식 효과를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
본 발명에서는 링커 염기 서열로 연결된 인간 VEGF의 돌연변이형 동형이합체 유전자와 이를 포함하는 발현벡터 pmut-diVEGF165를 제조한다.
정상형 인간 VEGF는 KDR 수용체에 대한 친화력이 Flt-1 수용체와 비교하여 낮으며, 생체 내에서 동형이합체를 형성하는 것으로 알려져 있어 외부적으로 KDR 수용체에만 결합하는 돌연변이형 VEGF 유전자 및 재조합 단백질을 투여하더라도 세포 내에서 정상형과 이형이합체(heterodimer)를 형성할 수 있다. 따라서 본 발명에서는 좀 더 높은 효율로 KDR 수용체에 결합하는 돌연변이형 VEGF 유전자 두개를 인위적인 링커를 사용하여 결합시킴으로써, 인위적으로 돌연변이형 VEGF 동형이합체를 형성시켜 이형이합체의 형성 가능성을 배제하여 보다 효과적으로 혈관내피세포의 증식 및 혈관생성을 유도할 수 있도록 하였다.
본 발명에서 사용한 돌연변이형 VEGF 유전자 mutVEGF165(Shen 등, J. Biol. Chem. 1998, 273 (45) 29979-29985)는 공지의 VEGF 유전자(Science 246, 1989, 1306-1309)를 주형으로 하고, VEGF 유전자의 5' 말단 및 3' 말단, 그리고 유도하고자 하는 돌연변이 부위를 포함하는 각각의 프라이머로 PCR을 수행하여 제조하였으나, 이외에도 공지의 다양한 돌연변이 생산 방법의 사용이 가능하다. 상기 mutVEGF165 두개를 링커로 결합시켜 서열번호 1의 염기 서열을 갖는 mut-diVEGF165 재조합 유전자를 얻은 다음 벡터에 클로닝하여 발현벡터 pmut-diVEGF165(기탁번호: KFCC11211 ; 도 1 참조)를 얻었다. 상기 발현벡터는 공지의 기술, 즉 열충격법, 전기천공법 등을 통해 형질전환용 대장균에 도입시켜 보관하였으며, 상기 대장균 균주E. Coli/pmut-diVEGF165는 2000년 9월 4일자로 한국 미생물 보존센터(KCCM)에 기탁번호 KFCC11211로 기탁되었다.
본 발명에서는 링커로서 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3을 발현하는 서열번호 7의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 합성하여 사용하였는데 이외에도 단백질의 구조를 변형하지 않는 다른 링커를 사용하는 것도 가능하다.
본 발명에서는 바람직한 실시예의 하나로 pEGFP-N1 벡터(Clontech)의 외래 유전자 삽입 부위에 상기 mut-diVEGF165 재조합 유전자를 삽입하였다. 그러나 상기 발현 벡터의 제조에 이용된 pEGFP-N1 벡터 이외에도 발현의 목적에 따라 다른 발현 벡터를 이용할 수 있다. 또한 발현 벡터의 외래 유전자 삽입 부위에 삽입되는 유전자의 크기, 염기서열 등도 공지의 기술에 의해 다양하게 변화시킬 수 있다.
상기에서 제조된 발현벡터 pmut-diVEGF165를 동물세포주에 도입하여 형질전환체를 얻는데, 본 발명에서는 CHO(Chinese hamster ovary) 등의 동물세포주에 상기 발현 벡터를 도입하여 제조할 수 있으며, 그 도입 방법은 공지의 기술, 즉 열충격법, 전기천공법 등을 통해 도입할 수 있고, 상기 동물세포주 CHO 이외에도 COS-7(Monkey, African green), NIH/3T3(Mouse fibroblast), BHK-21(Baby Hamster Kidney, Syrian golden), Hela (Human carcinoma), Vero(Monkey kidney, African green), 및 C127(Mouse) 등의 다양한 형질전환용 동물세포주가 사용될 수 있다.
상기 동물세포주 형질전환체 내에서 재조합 돌연변이형 VEGF를 과발현시켜 재조합 돌연변이형 VEGF 단백질을 얻었다.
상기 단백질은 서열번호 2로 기재된 바와 같이 371개의 아미노산 서열을 가진다.
상기에서 얻어진 재조합 돌연변이형 VEGF 단백질의 생리활성을 측정한 결과 정상형 VEGF165 보다 돌연변이형 재조합 VEGF, 특히 본 발명에 따른 돌연변이형 단일체 2개를 링커로 연결한 mut-diVEGF165에서 발현된 동형이합체가 혈관내피세포의 증식에 대한 활성이 상당히 높은 것으로 나타났다(도 6 참조).
결과적으로 각종 허혈성 질환에 대한 VEGF165를 이용한 유전자 치료 및 단백질 치료에 정상형 VEGF 보다 본 발명에서 제조한 mut-diVEGF165 발현벡터 및 재조합 돌연변이형 동형이합체 mut-diVEGF165 단백질이 매우 효과적으로 사용될 수 있음을 확인하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 좀 더 구체적으로 살펴보지만, 이에 본 발명의 범주가 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
정상형 인간 VEGF 유전자의 클로닝 및 발현벡터 제조
Trizol(GIBCO사)을 사용하여 인간 전골수구성 백혈병(promyelocytic leukemia) 세포주인 HL60(한국세포주은행)으로부터 제조사가 제시한 프로토콜의 방법으로 전체 RNA를 분리하였고, 분리한 RNA를 주형으로 하여 공지의 방법으로 역전사 효소(reverse transcriptase)을 사용하여 cDNA를 합성하였다(Sambrook 등, Molecular cloning, 1989). 상기 cDNA 250 ng을 주형으로 서열번호 3으로 표시되는 순방향 프라이머(VEGF5Bg) 및 서열번호 4로 표시되는 역방향 프라이머(VEGF3E)를 각각 20 pmol씩 사용하여 PCR 버퍼 (dNTP 2.5 mM, 중합효소 2.5 유닛, 10×중합효소 버퍼(500 mM KCl, 100 mM Tris·Cl, 15 mM MgCl2,0.1% 젤라틴))상에서 PCR을 수행하였다. 상기 PCR은 PCR 사이클러(Perkin Elmer사)를 사용하여 먼저 94℃에서 5분을 수행한 후에 94℃에서 20초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초의 과정을 30회 수행하였고, 마지막으로 72℃에서 10분 수행하여 결과물을 얻었다. 상기 결과물을 0.9% 아가로즈젤에 전기영동한 결과 495bp 크기의 DNA 절편을 얻었음을 확인하였고, 증폭된 절편을 pGEM-T(Promega사)벡터에 클로닝하여 pGEM-VEGF165벡터를 얻었다.
상기에서 클로닝한 DNA 절편이 VEGF165 유전자인지 확인하기 위하여 서열 분석한 다음 공지의 정상형 VEGF165 유전자의 서열(Keyt. 등, J. Biol. Chem. 1996, 271 (10) 5638-5646)과 비교 분석하였고, 증폭된 DNA 절편이 VEGF165 유전자를 암호화하고 있음을 확인하였다.
상기 pGEM-VEGF165벡터 VEGF165 유전자를 Bgl II와 EcoR I으로 절단한 다음 EGFP(Enhanced Green Fluorescent protein)가 제거된 발현벡터 pEGFP-N1 벡터(Clontech 사)의 Bgl II와 EcoR I 부위에 삽입하여 pVEGF165 발현벡터를 얻었다(도 2 참조).
실시예 2
PCR을 통한 VEGF 돌연변이체 mutVEGF165의 제조
KDR에 결합하나 flt-1에는 결합하지 않는 돌연변이형 VEGF(Shen, B-Q 등, J. Biol. Chem. 273 (45), 1998, 29979-29985)를 제조하기 위하여, 먼저 서열번호 5로 표시되는 순방향 프라이머(KRK5)와 서열번호 6으로 표시되는 역방향 프라이머(KRK3)를 사용하여 PCR을 수행하였다.
먼저, 상기 서열번호 3(VEGF5Bg), 및 6(KRK3)으로 표시되는 프라이머를 사용하여 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 얻은 DNA 절편 및 서열번호 4(VEGF3E), 및 5(KRK5)로 표시되는 프라이머를 사용하여 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 얻은 DNA 절편을 혼합한 후 주형으로 하고 서열번호 3으로 표시되는 순방향프라이머(VEGF5Bg)와 서열번호 4로 표시되는 역방향 프라이머(VEGF3E)를 사용하여 다시 실시예 1과 동일한 방법으로 PCR을 수행하였다.
그 결과 574 bp크기의 mutVEGF165 유전자를 얻었으며 증폭된 PCR 산물은 서열분석을 통하여 정상형 VEGF의 63, 64, 67번째의 아미노산이 각각 아스파라긴 산(aspartic acid), 글루탐산(glutamic acid), 및 글루탐산에서 리신(lysine), 아르기닌(arginine), 리신으로 치환된 아미노산 서열을 갖는다. 상기 mutVEGF165 유전자를 Bgl II와 EcoR I으로 이중절단하고 CMV(cytomegalovirus) 프로모터 하에 발현시키기 위하여 pEGFP-N1 발현벡터(Clontech 사)의 Bgl II와 EcoR I 부위에 삽입하여 발현벡터 pmutVEGF165를 완성하였다.
실시예 3
링커를 통한 돌연변이형 VEGF의 결합 발현 유도
생체 내에서 돌연변이형 VEGF가 동형이합체를 형성할 수 있도록 mutVEGF165 두 유전자를 각각 Bgl II와 EcoR I으로 절단하고, (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3을 발현하는 서열번호 7의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 합성한 후 mutVEGF165 두 유전자 사이에 링커로 삽입하였다. 다음으로 상기 mutVEGF165-링커-mutVEGF165 재조합 유전자를 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 pEGFP-N1 발현벡터에 삽입하여 발현벡터 pmut-diVEGF165를 제작하였다(도 1 및 3 참조)
실시예 4
돌연변이형 VEGF 발현벡터들의 세포 내로의 도입
상기의 발현벡터 pVEGF165, pmutVEGF165, pmut-diVEGF165 각각으로 CHO(한국세포주은행) 세포주를 형질전환시켰다. 먼저 10% FBS, 및 100 ㎍/ ㎖ 항생물질을 포함한 RPMI 배지(GIBCO 사)에서 유지된 CHO 세포주를 6-웰 플레이트에 웰당 3 × 105개씩 접종하여 준비한 후, 24시간이 지난 시점에서 발현벡터 2 ㎍과 리포펙타민(lipofectamine; GIBCO 사) 4 ㎕를 시럼과 항생물질을 함유하지 않은 RPMI 배지 200 ㎕와 혼합하여 45 분간 실온에 방치하였다. 상기 발현벡터 함유 혼합물의 전체 부피가 1 ㎖이 되도록 배지를 첨가한 후 준비된 CHO 세포주의 배지에 넣는다. 세포를 37℃ CO2배양기에서 5시간 동안 추가 배양한 후 배지를 교환하고, 48시간 동안 추가 배양한 후 세포 및 배양배지를 회수하였다.
실시예 5
재조합 돌연변이형 VEGF 단백질의 분리
상기 실시예 4에서 얻어진 각각의 세포 및 배양배지로부터 공지의 방법으로 단백질을 분리 및 정량하고(Sambrook J. 등, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) 그 중 30 ㎍의 단백질을 SDS-PAGE로 분획하고 웨스턴 블러팅하였다. 상기 웨스턴 블러팅에서는 PVDF 막, 안티VEGF 항체, ECL 키트(Amersham 사)를 사용하여 제조사인 아머샴 사의 방법으로 VEGF165, 및 재조합 VEGF165 단백질들의 발현정도를 측정하였다. 그 결과 42 KDa부분에서 밴드가 확인되어 재조합 VEGF165 단백질의 발현이 성공적으로 이루어졌음을 알 수 있었으며(도 4 및 5 참조), 분자량의 경우 예상보다 약간 증가하였는데 이는 아마도당쇄화(glycosylation)에 의한 것으로 생각된다.
실시예 6
재조합 돌연변이형 VEGF 단백질의 활성 검정
20% FBS(Fetal Bovine Serum)가 포함된 RPMI 배지(GIBCO 사)에서 유지된 CPAE(calf pulmonary artery endothelial cell; ATCC) 세포주를 먼저 96-웰 플레이트에 1 × 104의 농도로 접종한 후 상기 실시예 4에서 얻어진 정상형 VEGF 및 돌연변이형 재조합 VEGF 배양액을 각각 첨가하여 5일간 추가 배양하였다. 상기 배양액 내에는 각각 80 pg 정상형 VEGF165, 2 pg mutVEGF165, 0.3 pg mut-diVEGF165이 함유되었다.
다음으로 셀타이터 96TM 비-동위성 세포 증식 검정 키트(CellTiter 96TM Non-Radioactive Cell Proliferation Assay kit; Promega 사)를 사용하여 세포 증식 검정법(Cell proliferation assay)을 수행하였다. 정상형 VEGF 및 돌연변이형 재조합 VEGF 배양액을 처리한 각각의 96-웰에 MTT(3-4,5-dimethylthiaxol-2yl-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 15 ㎕를 첨가하여 37℃에서 CO2배양기에서 4시간 동안 처리한 후 키트내 종결액을 웰당 100 ㎕씩 첨가하고 37℃에 1시간 동안 방치하였다. 상기 96-웰 플레이트를 ELISA 인식기(reader)로 옮긴 후 570 nm에서 OD값을 측정하여 혈관내피세포의 증식정도를 알아보았다.
그 결과, 정상형 VEGF와 재조합 VEGF들이 CPAE 세포의 증식을 유도함을 관찰 할 수 있었으며, 처리한 재조합 단백질의 농도를 비교해 볼 때 (80 pg 정상형VEGF165, 2 pg mutVEGF165, 0.3 pg mut-diVEGF165 처리), 정상형 VEGF165 보다는 돌연변이형 재조합 VEGF, 특히 돌연변이형 단일체(monomer)를 링커로 연결한 동형이합체 mut-diVEGF165가 혈관내피세포의 증식에 대한 활성이 상당히 높은 것으로 나타났다(도 6 참조).
상기 실시예에서 본 바와 같이, 본 발명에 따른 발현벡터 및 이의 단백질은 혈관내피세포의 증식 및 혈관생성에 관여하는 KDR 수용체에 대한 친화력이 매우 높아 만성 허혈성 하지 질환, 동맥경화증 등의 여러가지 심혈관 질환, 버거스씨 병, 및 당뇨병성 족부궤양 등의 허혈성 질환에 대한 치료제로 사용할 경우 높은 치료 효과를 나타낼 수 있다.

Claims (5)

  1. 서열번호 1의 인간 VEGF의 돌연변이형 동형이합체 유전자.
  2. 서열번호 1의 인간 VEGF의 돌연변이형 동형이합체 유전자를 포함하는 발현벡터 pmut-diVEGF165(기탁번호: KFCC11211).
  3. 제2항에 따른 발현벡터 pmut-diVEGF165(기탁번호: KFCC11211)로 형질전환된 CHO(Chinese hamster ovary).
  4. 삭제
  5. 제3항에 따른 형질전환체로 부터 발현된 서열번호 2의 mut-diVEGF165 단백질.
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