KR20100040805A - Ｖｅｇｆ－ｄ 변이체 및 그의 사용 - Google Patents

Abstract

본 발명은 이량체 접촉면에 하나 이상의 아미노산 변이체를 함유하는 VEGF-D 단백질 및 치료시, 특히 혈관신생의 촉진에서의 그것의 사용이다.

VEGF-D 단백질, 혈관신생, 이량체

Description

ＶＥＧＦ－Ｄ 변이체 및 그의 사용{VEGF-D MUTANTS AND THEIR USE}

본 발명은 VEGF 수용체에서 활성이 증가하는 VEGF-D의 변형체, 및 치료에서의 그의 사용에 관한 것이다.

혈관 내피세포 성장인자들(VEGFs)은 배발생기 동안 혈관신생(angiogenesis)과 림프관신생(lymphangiogenesis)을 유도할 뿐만 아니라 성인기 동안 맥관구조를 유지시키는 주요한 성장 인자이다. 그들의 비정상 발현은 또한 암 및 망막증과 같은 심각한 병리학적 상태에서 발견된다. VEGF-A는 VEGF-B, -C, -D를 포함하는 관련 성장 인자 및 태반 성장 인자 PIGF 뿐만 아니라 Orf 바이러스 유래 VEGF-E 단백질과 뱀독의 다중 상동체의 큰 패밀리에 속한다. 인간의 내인성 VEGF 단백질 패밀리 구성요소들은 mRNA의 선택적 스플라이싱으로 인해 또는 단백질분해 과정으로 인해 몇몇의 동종체로 존재한다. 이러한 변이체들의 혈관신생 효과는 세가지 주요 VEGF 수용체, 뉴로필린, 헤파린 설페이트 프로테오글리칸과 같은 공-수용체 및 세포외 기질의 그밖의 성분들에 대한 그들의 각기 다른 특이성 및 친화성으로 인해 상당히 다양하다.

VEGFR-2는 혈관신생을 조절하는 가장 중요한 수용체이고 주로 내피세포에서 발현된다. 포유류의 VEGFR-2 리간드는 VEGF-A, VEGF-C 및 VEGF-D를 포함한다. VEGFR-2 이외에, VEGF-C 및 -D는 림프관신생을 매개하는 수용체인 VEGFR-3의 리간드이므로 림프의 맥관구조의 형성에 관여한다. VEGF-A는 또한 배형성기 동안 주로 비-시그날링 디코이(decoy) 수용체로서 작용하는 VEGFR-1에 결합한다. 성인 생물체에서, 이 수용체는 대식세포 및 단핵세포와 같은 염증성 세포들의 이동을 매개하는 것으로 알려져 있으나, 혈관신생에서의 그의 역할은 여전히 논란의 여지가 있다.

혈관신생 조절자로서의 그들의 중요성으로 인해, VEGF 패밀리 구성요소들은 다른 병리학적 상태에서의 혈관신생 과정을 조절하기 위한 잠재적 치료제로 제안되어 왔다 (Yla-Herttuala 2003). 생체 내에서, VEGF를 재조합 단백질로 직접 또는 유전자 치료 벡터를 사용하여 세포에 도입하는 것에 의해 혈관신생을 유도하는 연구가 이루어져 왔다 (Markkanen 2005). 몇몇 연구의 연구결과는 VEGF 패밀리 구성요소가 생체 내에서 강한 혈관신생 활성을 가지며 하지 허혈성 질환 및 관상 동맥 질환과 같은 상태에 잠재적으로 유용한 치료제라는 것을 나타낸다. 이러한 성분들 이외에, VEGF-D (VEGF-D^ΔNΔC, 하기 참고) 및 VEGF-A의 성숙 형태는 치료학적 혈관신생을 유도하기에 가장 유망할 것이라는 것이 발견되었다.

VEGF는 혈소판-유도 성장 인자 (PDGF)와 구조적 유사성을 공유하며, 더 큰 시스테인 노트 성장 인자 수퍼패밀리에 속하는, VEGF/PDGF 패밀리로 분류된다. 패밀리 구성요소들은 많은 세포외 단백질에서 발견되고 다양한 종 사이에 보존되는 시스테인 노트 모티프를 공유한다. 시스테인 노트 단백질의 특징은 3개의 디설피드 결합에 의해 연결되는 역평형 β-시트의 보존 구조를 함유한다는 것이다. 전형적인 시스테인 노트 성장 인자들은 VEGF/PDGF 패밀리의 경우에 종종 서브유닛간 (intersubunit) 디설피드 결합에 의해 링크되는 이량체(dimer) 형태이다.

VEGF 수용체는 이량체화에 의해 활성화되는 수용체 단백질 타이로신 키나제에 속한다. VEGFR 활성화의 경우, 리간드의 이량체화는 필수적이다. 한 VEGF-A 이량체는 그들의 두 극단에서부터 두 분리된 수용체 단량체에 결합하여, 수용체 이량체화를 유도하여 결과적으로 세포내 타이로신 키나제를 활성화시킨다. 자유롭거나 VEGF 수용체와 결합된 VEGF 패밀리 구성요소의 몇몇 실험적으로 해결된 3D 구조에 의하면, 그들은 모두 매우 유사한 3차 구조를 가지므로 유사한 매카니즘에 의해 수용체 활성화를 유도할 것이다.

VEGF 패밀리에서, VEGF-C 및 VEGF-D는 다른 VEGF에 비해, 높은 1차 염기서열 구조 유사성에 의해 반영되는, 그들 소유의 서브패밀리로 다시 나뉘어질 수 있다. 하기를 포함하는 몇몇 특징들을 특징으로 한다:

1) 그들은 VEGFR-3, 림프관신생 매개 수용체에 결합하는 유일한 VEGF이다; 2) VEGF-A, -B 및 PLGF와 달리, VEGF-C 및 VEGF-D는 긴 단백질전구체(preprotein)로 발현된다. 이러한 형태들은 낮은 수용체-결합 친화도를 가지며, 더 활성 성장 인자로 전환되기 위하여, VEGF-C 및 VEGF-D는 그들의 N-말단 및 C-말단으로부터 단백질가수분해가 진행된다; 3) 패밀리의 다른 구성요소들에 비해, VEGF-D의 성숙한 단백질가수분해 진행된 형태인, VEGF-D^ΔNΔC는 주로 비-공유 결합 이량체 또는 단량체로서, 작은 정도로 공유 결합 디설피드 결합-링크된 이량체로 존재한다는 것이 발견되었다. 이러한 연구들은 또한 VEGF-D^ΔNΔC의 단량체 단편이 이량체 단편에 비해 매우 약한 활성을 가진다는 것을 나타낸다. 이량체의 주요한 비-공유 성질은 다른 VEGF 패밀리 성장 인자에서는 서브유닛간 연결을 형성하는 시스테인 잔기가 VEGF-D 단백질에서 보존되기 때문에 다소 놀랍다.

시스테인 노트 구조와 관련된 VEGF-A의 시스테인은 단백질의 구조 및 기능에서의 그들의 중요성을 연구하기 위한 이전의 연구에서 돌연변이를 일으켰다. 서브유닛간 디설피드 결합은 이러한 시스테인이 알라닌으로 돌연변이화 되는 경우 VEGF-A가 그의 생물학적 활성을 잃어버리므로, 그의 생물학적 기능에 필수적이라는 것이 발견되었다. 보존된 시스테인 (Cys156) 중 하나가 세린으로 전환되는 경우, VEGF-C 변이체는 완전히 그의 VEGFR-2 활성력을 잃어버리게 되지만, 여전히 VEGFR-3을 활성화시킬 수는 있다. VEGF-C 및 VEGF-D의 성숙 형태는 또한 시스테인 잔기를 형성하는 제안된 서브유닛간 디설피드 결합에 가까이 위치하는 비결합 시스테인 잔기를 함유한다. 최근 C. elegan의 pvf -1 유전자가 인간 VEGFR-1 및 -2를 활성화하고 또한 부분적으로 공유 결합 이량체인 VEGF/PDGF 유사체를 코드한다는 것이 알려졌다. 이 단백질은 또한 VEGF-C 및 VEGF-D와 같은, 이량체 접촉면(interface)에 비결합 시스테인을 가진다.

발명의 요약

본 발명은 단백질 골격으로서 성숙 VEGF-D 형태인 VEGF-D^ΔNΔC (Achen 1998, Stacker 1999)을 사용하여, 다른 VEGF에서 서브유닛간 디설피드 다리 형성에 관여하는 시스테인뿐 아니라 VEGF-D의 비결합 접촉면 시스테인 잔기가 각각 알라닌으로 돌여변이화되는 연구를 기반으로 한다. VEGF-D는 더 활성화되기 위하여 단백질가수분해가 진행되지만, 이 단백질가수분해 진행된 형태는 주로 비-공유 결합 이량체 또는 단량체로 존재한다. 성숙 VEGF-D, VEGF-D^ΔNΔC의 공유 이량체화의 증가는 돌연변이에 의해 VEGF-D의 이량체-형성 접촉면을 변경하는 하는 것에 의해 달성될 수 있다는 것이 발견되었다. 또한, VEGF-D^ΔNΔC 단백질에서 Cys25를 다양한 다른 아미노산으로 치환하는 것은 공유 이량체의 형성을 증가시키고 또한 VEGF 수용체에서의 단백질의 활성을 현저하게 증가시킨다는 것이 발견되었다. 본 발명은 VEGF 수용체 활성화를 위하여, VEGF 리간드의 공유 이량체화가 선호되는 실현을 기반으로 한다. 따라서, 본 발명은 이량체 접촉면이 변경되도록, 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되는 것에 의해 변형된 VEGF-D 단백질이다.

바람직한 구현예의 설명

본 발명은 이량체 접촉면이 변경되도록, 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하는 것에 의해 변경된 VEGF-D 단백질이다. 이 정의는 VEGF-D 단백질의 이량체 접촉면에 영향을 미치는 어느 아미노산 변이체, 즉, VEGF-D 이량체 형성에 중요한 아미노산을 포함한다. 이량체 접촉면은 이량체화될 때, 다른 VEGF-D 단백질에 결합하는 VEGF-D 단백질의 영역이다. 바람직하기는, 이량체 접촉면의 형상은 바뀐다. 이것은 단백질 3-차원 구조에 영향을 주는 변이체로 인해 발생한다. 변이체화된 아미노산은 단백질이 이량체화될 때, 다른 아미노산에 결합되는 아미노산일 수 있다. 이량체 접촉면을 바꿀 수 있는 아미노산의 예는 VEGF-D^ΔNΔC의 Cys25이다.

본 발명의 VEGF-D 단백질 야생-형 단백질에 비해 단백질의 이량체화 특성이 변경되도록 변이체를 함유한다. 바람직하기는, 본 발명의 VEGF-D 변이체는 야생-형 VEGF-D에 비해 더 높은 이량체 대 단량체의 비를 가진다. 따라서, 본 발명에서, VEGF-D 단백질은 단량체, 이량체, 또는 그들의 혼합물로 존재할 수 있다. 바람직하기는, VEGF-D 단백질은 실질적으로 이량체로 존재한다.

가수분해가 진행된 VEGF-D, VEGF-D^ΔNΔC의 염기서열은 SEQ ID NO: 1로 제공된다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 VEGF-D^ΔNΔC (SEQ ID NO: 1) 단백질을 포함하고, 여기서 하나 이상의 Cys 잔기가 다른 아미노산으로 치환된다. 이 변이체는 야생-형 VEGF-D^ΔNΔC에 비해 이량체 대 단량체의 비를 증가시킬 수 있다. 바람직한 구현예에서, 염기서열의 아미노산 25 (Cys25)은 다른 아미노산으로 치환된다. 바람직하기는, 아미노산은 Leu, Ile, Val, Ala, Ser, Phe, Trp 및 Asn로부터 선택된다. 더 바람직하기는, 아미노산은 Leu, Ile 및 Val로부터 선택된다.

본 발명의 VEGF-D 단백질, 또는 본 발명의 VEGF-D 단백질을 코드화하는 뉴클레오티드 염기서열을 포함하는 발현 벡터는 혈관신생의 촉진을 위한 약제의 제조에 사용될 수 있다. 혈관신생의 촉진은 신체 조직의 다양한 질병을 치료하거나 예방하는데 유용할 수 있다. 신체 조직은 관상 동맥 또는 정맥, 또는 림프 채널과 같은 혈관일 수 있다. 신체 조직을 또한 눈, 귀, 폐, 신장, 근육, 심근, 뇌, 난소, 전립선, 자궁, 태반 및 피부와 같은 기관일 수 있다. 기관 또는 다른 조직들은 또한 예를 들면, 환자들이 이식된 신장 또는 동맥 또는 정맥 이식편을 제공받는 것에 의해 이식될 수 있다.

본 발명의 VEGF-D 단백질, 또는 상기 정의된 바와 같은 발현 벡터는 상처의 치료에 유용할 수 있다. 추가적 구현예에서, 그것들은 빈혈 또는 관상 동맥 질병의 치료 또는 예방에 유용할 수 있다. 다른 구현예에서, 그것들은 신경 장애의 치료에 유용할 수 있다.

치료적 사용을 위하여, 본 발명의 펩티드는 제형화될 수 있고, 당업계의 당업자들에게 알려진, 과정, 및 성분들을 사용하는 것에 의해 투여될 수 있다. 펩티드의 적절한 투여량은 치료받을 환자의 상태, 화합물의 효능, 투여 경로 등과 같은 일반적인 요인들을 고려하여 숙련자에 의해 선택될 수 있다. 투여의 적합한 경로는 구강, 정맥, 복강, 근육, 비강 및 피하를 포함한다.

도 1은 포유류 VEGF 패밀리 구성요소의 VEGF 유사체 도메인 염기서열을 갖는 VEGF-D^ΔNΔC 아미노산 염기서열의 정렬을 나타낸다. VEGF-D^ΔNΔC 염기서열에 있는 시스테인 잔기들과 변이된 시스테인 잔기들을 강조하였다.

도 2는 VEGF-D^ΔNΔC의 유사체 모델에서 변이된 시스테인 잔기들의 위치를 나 타낸다. 변이된 시스테인 아미노산 잔기들은 VEGF-D^ΔNΔC 염기서열에서의 그들의 위치에 따라 명명하였다.

하기의 연구는 본 발명을 예시한다.

구조체의 클로닝 및 바이러스 생성

이 연구에서 사용되는 VEGF-D^ΔNΔC 유전자는 아미노산 93-201에 상응하는 야생-형 VEGF-D 염기서열의 뉴클레오티드 277-603를 포함한다. 여기서 사용된 넘버링은 도 1에서 나타낸 바와 같이 VEGF-D^ΔNΔC 염기서열을 기초로 한다. N-말단 IL-3 시그날 염기서열 및 플래그-태그 (Flag-tag)를 코딩하는 염기서열 및 C-말단 6xHis를 코딩하는 염기서열을 VEGF-D^ΔNΔC 염기서열에 융합하였다. pEntry-VEGF-D^ΔNΔC 플라스미드를 주형으로 하여 quikchange 부위-지정 돌연변이 유발을 사용하여 변이체 VEGF-D^ΔNΔC 단백질을 코드화하는 플라스미드를 생성하였다. 인간 VEGF-A₁₂₁ cDNA를 BP-반응을 사용하여 pDonr201 벡터 (Invitrogen)로 클로닝하였다. 그 다음, Entry 클론의 코딩 염기서열을 LR 반응 (Laitinen 2005)을 사용하여 pBVboostFG 시스템 벡터로 클로닝하였다. 재조합 바쿨로바이러스가 이전에 기술한 바와 같이 생성되었다.

곤충 세포 배양에서의 단백질 발현 및 정제

재조합 단백질을 72시간 동안 진동배양기에서 재조합 바쿨로바이러스 (MOI 5) 감염된 High Five 세포에서 발현시켰다. 단백질들을 BD Talon Metal Affinity Resin (BD Biosciences Clontech)를 사용하여 정화된 배양 배지로부터 정제하였다. 3 ml 수지를 실온에서 2 시간 동안 배지에서 교반하고 상기 수지를 수거하여 크로마토그래피 컬럼에 옮겼다. pH 7,0에서 30OmM NaCI, 30ml 5OmM Sodium Phosphate를 사용하여 세정하였다. 재조합 단백질을 5OmM HEPES, 2OmM NaCI, 200 mM 이미다졸을 사용하여 pH7.4에서 용출하였다. 단백질을 5OmM HEPES, 2OmM NaCI, pH7.4에서 투석하여 이미다졸을 제거하였다. 단백질 농도는 DC 단백질 분석 키트 (BioRad)를 사용하여 표준으로 측정하고, 측정된 단백질 농도를 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 재조합 인간 VEGF-A165는 R&D 시스템에서 시판한다.

포유류 세포에서의 단백질 발현

293T 세포들을 제조사의 지시에 따라 Roche의 FugeneHD 형질감염제를 사용하여 pBVboostFG 시스템 벡터로 일시적으로 형질감염하였다. 조절된 배지를 형질감염 후 52h-72h가 지난 후에 수거하였다. 배지내 VEGF-D 단백질의 수준을 R&D 시스템으의 인간 VEGF-D 면역분석에 의해 정량화하였다.

SDS - PAGE 및 웨스턴 블롯팅

정제된 단백질을 Silver Snap Stain KitII (Pierce) 또는 Page Blue Protein Staining Solution (Fermentas)로 겔을 염색하는, 변성 및 비-변성 조건에서 SDS-PAGE에 이해 분석하였다. 대체적으로, 단백질을 니트로셀룰로스 막으로 옮기고 VEGF-D 모노클로날 항체 (MAB286, R&D Systems)를 사용하여 관찰하였다.

시험관 연구

Ba/F3-R2 (Achen 1998) 및 Ba/F3-R3 (Achen 2000) 세포 생존 분석을 96-웰 플레이트로 웰 마다 18000 세포들을 평판배양하고, 재조합 단백질 또는 연속 희석으로 일시적으로 형질감염된 293T 세포들로부터 조정된 배지를 첨가하여 수행하였다. 세포의 생존력을 48h 후에 정량화하였다. 20 μl Cell Titer Blue Reagent (Promega)를 각 웰에 첨가하고; 플레이트를 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. Wallac Victor2 1420 Multilabel Counter (Perkin Elmer Biosystems)를 사용하여 형광을 읽었다.

결과

재조합 VEGF-D^ΔNΔC 단백질의 생성: VEGF-D의 성숙형, VEGF-D^ΔNΔC의 가능한 분자간 디설피드 결합-형성 시스테인 (Cys44 및 Cys53) 및 비결합 시스테인 잔기 (Cys25)를 각각 알라닌 잔기에 의해 개별적으로 치환하였다. 구조체를 VEGF-D^ΔNΔC25A, VEGF-D^{ΔNΔ C}44A 및 VEGF-D^{ΔNΔ C}53A로 명명하였다. 재조합 단백질을 BVboostFG 바쿨로바이러스 발현 시스템을 사용하여 High Five 곤충 세포주에서 생성하고 고정화된 금속 친화력 크로마토그래피를 사용하여 배양 배지로부터 정제하였다. 모든 구조체를 연속적으로 발현하고 웨스턴 블로팅에 의해 관찰한 바와 같이 정제하였다. 그러나, 아마도 열화 또는 응집 및 투석 카세트에 비특이적 결합으로 인해, VEGF-D^{ΔNΛ C}44A 단백질을 그 다음 투석 동안 반복적으로 손실하였다. 또한, 이 단백질의 발현 수준이 다른 VEGF 단백질에 비해 낮으므로, 이 변이체는 단백질 폴딩을 방해하거나 안정성을 줄일 수 있다. 인간 VEGF-A₁₂₁ 재조합 단백질을 대조로서 사용하기 위해 마찬가지로 생성하고 정제하였다.

공유 이량체 형성: VEGF-D^ΔNΔC, VEGF-D^{ΔNΔ C}25A 및 VEGF-D^{ΔNΔ C}53A의 공유 이량체 형성력을 비-환원 조건에서 SDS-PAGE에 의해 평가하였다. VEGF-D^ΔNΔC는 부분적으로 공유 이량체 되었으나, VEGF-D^{ΔNΔ C}25A은 천연 형태에 비해 증기량의 공유 결합된 이량체를 형성하였다. 예상한 바와 같이, VEGF-D^{ΔNΔ C}53A의 공유 이량체 형성이 방해받았다.

변이체 Gly51->Cys 또는 Cys25->Leu를 함유하는 VEGF-D 단백질; 변이체 Arg 22->Leu 및 Cys25->Leu를 함유하는 VEGF-D; 및 변이체 Arg22->Ile 및 Cys25->Leu를 함유하는 VEGF- D는 모두 VEGF-D^ΔNΔC에 비해 증가된 이량체 대 단량체 비를 나타내었다. 예상한 바와 같이, VEGF-D 이량체 접촉면에서의 특정 변형은 확실히 단백질의 다중화 상태를 바꿀 수 있다.

시험관에서의 활성 평가: 정제된 VEGF-D^ΔNΔC, VEGF-D^{ΔNΔ C}25A 및 VEGF-D^ΔNΔC53A의 생물학적 활성을 VEGFR-2/EpoR 또는 VEGFR-3/EpoR 융합 수용체를 발현하는 세포를 사용하여 Ba/F3 세포 생존 분석을 사용하여 측정하였다. 두 분석에서, VEGF-D^{ΔNΔ C}C53A 변이체는 VEGF 수용체 활성화 능력을 완전히 잃는다는 것이 발견되 었으나, VEGF-D^{ΔNΔ C}25A 변이체는 천연 VEGF-D^{ΔNΔ C}에비해 약 10배 높은 활성을 가졌다. 곤충 세포 배지 및 일시적으로 형질감염된 293T 세포로부터 조정된 배지로부터 정제된 단백질들은 유사한 활성을 가진다는 것을 발견하였고, VEGF-D^{ΔNΔ C}25A 변이체의 활성 증가는 생산 시스템과 관계없다.

어떤 아미노산이 VEGF-D^ΔNΔC에서 Cys25를 치환하기에 가장 적합한 것인지 연구하기 위하여, 몇몇 변이체 형태를 Cys25를 치환한 다른 아미노산으로 발생시켰다. 아미노산을 다른 화학적 특성들을 포함하기 위하여 선택하였다. 293T 세포의 일시적 형질감염을 사용하여 조정된 배지를 생성하였고, 단백질의 활성을 VEGFR-2/EpoR 또는 VEGFR-3/EpoR 융합 수용체를 발현하는 Ba/F3 세포를 사용하여 세포 생존 분석법으로 측정하였다. 각 단백질을 세개의 다른 농도: 10, 100 및 1000 ng/ml에서 분석하였다. Cys25를 치환하는 소수성 아미노산 (Leu, Ile, Val)을 갖는 변이체 형태가 가장 높은 VEGFR-2 및 VEGFR-3 이량체화 활성을 가지는 것으로 발견되었다. 천연 VEGF-D^ΔNΔC에 비해 증가된 활성은 또한 Cys25를 치환하는 하기의 아미노산: Ala, Ser, Phe, Trp 및 Asn으로 알 수 있었다. Gly으로 Cys25의 치환은 성장 인자의 불활성화를 야기하였다.

상기 결과는 VEGF 패밀리의 다른 구성요소에서 디설피드 다리를 형성하는 보존된 시스테인이 VEGF-D^ΔNΔC의 기능에 매우 필수적이라는 것을 나타내었다. 더 중요 하게는, 또한 VEGF-D^ΔNΔC의 이량체 접촉면으로부터 비결합 시스테인 (Cys25)을 제거하는 것은 실질적으로 혈관 내피 성장 인자 수용체 2 및 수용체 3 활성화 관점에서, VEGF-D^ΔNΔC 단백질의 활성을 개선한다는 것을 발견하였다. 따라서, 이러한 신규한 VEGF-D^ΔNΔC의 Cys25 변이체는 재조합 단백질로 사용되거나 유전자 치료에 의해 투여되는 그의 야생-형 선행자 (predecessor)에 비해 치료적 혈관신생에 더 유효한 전달물질이 될 수 있다는 것이 입증되었다. 예를 들면, 본 발명의 VEGF-D 단백질을 코드화하는 뉴클레오티드 염기서열을 포함하는 발현 벡터가 유전자 치료에 사용될 수 있다.

참고 문헌

SEQUENCE LISTING <110> Ark Therapeutics Ltd <120> VEGF-D MUTANTS AND THEIR USE <130> REP08206WO <150> GB0710457.3 <151> 2007-05-31 <160> 6 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Fragment <400> 1 Phe Tyr Asp Ile Glu Thr Leu Lys Val Ile Asp Glu Glu Trp Gln Arg 1 5 10 15 Thr Gln Cys Ser Pro Arg Glu Thr Cys Val Glu Val Ala Ser Glu Leu 20 25 30 Gly Lys Ser Thr Asn Thr Phe Phe Lys Pro Pro Cys Val Asn Val Phe 35 40 45 Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Glu Glu Ser Leu Ile Cys Met Asn Thr 50 55 60 Ser Thr Ser Tyr Ile Ser Lys Gln Leu Phe Glu Ile Ser Val Pro Leu 65 70 75 80 Thr Ser Val Pro Glu Leu Val Pro Val Lys Val Ala Asn His Thr Gly 85 90 95 Cys Lys Cys Leu Pro Thr Ala Pro Arg His Pro Tyr Ser 100 105 <210> 2 <211> 95 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Fragment <400> 2 Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro 1 5 10 15 Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu 20 25 30 Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys 35 40 45 Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile 50 55 60 Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly 65 70 75 80 Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys 85 90 95 <210> 3 <211> 94 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Fragment <400> 3 Lys Val Val Ser Trp Ile Asp Val Tyr Thr Arg Ala Thr Cys Gln Pro 1 5 10 15 Arg Glu Val Val Val Pro Leu Thr Val Glu Leu Met Gly Thr Val Ala 20 25 30 Lys Gln Leu Val Pro Ser Cys Val Thr Val Gln Arg Cys Gly Gly Cys 35 40 45 Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gln His Gln Val 50 55 60 Arg Met Gln Ile Leu Met Ile Arg Tyr Pro Ser Ser Gln Leu Gly Glu 65 70 75 80 Met Ser Leu Glu Glu His Ser Gln Cys Glu Cys Arg Pro Lys 85 90 <210> 4 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Fragment <400> 4 Glu Ile Leu Lys Ser Ile Asp Asn Glu Trp Arg Lys Thr Gln Cys Met 1 5 10 15 Pro Arg Glu Val Cys Ile Asp Val Gly Lys Glu Phe Gly Val Ala Thr 20 25 30 Asn Thr Phe Phe Lys Pro Pro Cys Val Ser Val Tyr Arg Cys Gly Gly 35 40 45 Cys Cys Asn Ser Glu Gly Leu Gln Cys Met Asn Thr Ser Thr Ser Tyr 50 55 60 Leu Ser Lys Thr Leu Phe Glu Ile Thr Val Pro Leu Ser Gln Gly Pro 65 70 75 80 Lys Pro Val Thr Ile Ser Phe Ala Asn His Thr Ser Cys Arg Cys Met 85 90 95 Ser Lys <210> 5 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Fragment <400> 5 Glu Thr Leu Lys Val Ile Asp Glu Glu Trp Gln Arg Thr Gln Cys Ser 1 5 10 15 Pro Arg Glu Thr Cys Val Glu Val Ala Ser Glu Leu Gly Lys Ser Thr 20 25 30 Asn Thr Phe Phe Lys Pro Pro Cys Val Asn Val Phe Arg Cys Gly Gly 35 40 45 Cys Cys Asn Glu Glu Ser Leu Ile Cys Met Asn Thr Ser Thr Ser Tyr 50 55 60 Ile Ser Lys Gln Leu Phe Glu Ile Ser Val Pro Leu Thr Ser Val Pro 65 70 75 80 Glu Leu Val Pro Val Lys Val Ala Asn His Thr Gly Cys Lys Cys Leu 85 90 95 Pro Thr <210> 6 <211> 95 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Fragment <400> 6 Glu Val Val Pro Phe Gln Glu Val Trp Gly Arg Ser Tyr Cys Arg Ala 1 5 10 15 Leu Glu Arg Leu Val Asp Val Val Ser Glu Tyr Pro Ser Glu Val Glu 20 25 30 His Met Phe Ser Pro Ser Cys Val Ser Leu Leu Arg Cys Thr Gly Cys 35 40 45 Cys Gly Asp Glu Asn Leu His Cys Val Pro Val Glu Thr Ala Asn Val 50 55 60 Thr Met Gln Leu Leu Lys Ile Arg Ser Gly Asp Arg Pro Ser Tyr Val 65 70 75 80 Glu Leu Thr Phe Ser Gln His Val Arg Cys Glu Cys Arg Pro Leu 85 90 95

Claims (14)

1. 이량체 접촉면이 변경되도록, 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산에 의해 치환하는 것에 의해 변형된 VEGF-D 단백질.
2. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 아미노산은 Cys를 포함하는 것인 단백질.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 변형된 VEGF-D^ΔNΔC (SEQ ID NO: 1)인 것인 단백질.
4. 제3항에 있어서, 상기 VEGF-D^ΔNΔC의 Cys25 잔기가 다른 아미노산에 의해 치환되어 있는 것인 단백질.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다른 아미노산이 Leu, Ile, Val, Ala, Ser, Phe, Trp 또는 Asn인 것인 단백질.
6. 제5항에 있어서, 상기 다른 아미노산이 Leu, Ile 또는 Val인 것인 단백질.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 실질적으로 이량체로서 존재하는 것인 VEGF-D 단백질.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 치료에 사용하기 위한 단백질.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 혈관신생의 촉진을 위한 단백질.
10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 빈혈 또는 관상 동맥 질환의 예방 또는 치료를 위한 단백질.
11. 혈관신생 촉진 약물의 제조를 위한, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 단백질의 용도.
12. 빈혈 또는 관상 동맥 질환의 예방 또는 치료를 위한, 제11항에 따른 용도.
13. 유전자 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 VEGF 단백질을 코드화하는 뉴클레오티드 염기서열을 포함하는 발현 벡터.
14. 혈관신생의 촉진에 사용하기 위한, 제13항에 따른 발현 벡터.

Images