HU223438B1 - Új növekedési faktor és ezt kódoló génszekvencia - Google Patents

Új növekedési faktor és ezt kódoló génszekvencia Download PDF

Info

Publication number
HU223438B1
HU223438B1 HU9800377A HUP9800377A HU223438B1 HU 223438 B1 HU223438 B1 HU 223438B1 HU 9800377 A HU9800377 A HU 9800377A HU P9800377 A HUP9800377 A HU P9800377A HU 223438 B1 HU223438 B1 HU 223438B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
lake
pro
iii
seq
leu
Prior art date
Application number
HU9800377A
Other languages
English (en)
Inventor
Sean Grimmond
Nicholas Kim Hayward
Catharina Larsson
Magnus Nordenskjold
Gunther Weber
Original Assignee
Amrad Operations Pty. Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from AUPN1457A external-priority patent/AUPN145795A0/en
Priority claimed from AUPN6647A external-priority patent/AUPN664795A0/en
Priority claimed from AUPN7274A external-priority patent/AUPN727495A0/en
Application filed by Amrad Operations Pty. Ltd. filed Critical Amrad Operations Pty. Ltd.
Publication of HUP9800377A1 publication Critical patent/HUP9800377A1/hu
Publication of HUP9800377A3 publication Critical patent/HUP9800377A3/hu
Publication of HU223438B1 publication Critical patent/HU223438B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

A találmány általánosan egy vaszkuláris endoteliális növekedésifaktor-szerű tulajdonságokkal rendelkező izolált molekulára és egy ezt kódológénszekvenciára vonatkozik. A molekula számos, növelt vagy csökkentérrendszeri és/vagy vaszkuláris permeabilitást igénylő állapotokkezelésében, megelőzésében és/vagy diagnosztizálásában használatosterápiás készítmény és diagnosztikum kifejlesztésében hasznosítható. Atalálmány szerinti molekula a primer és a központi neuronok hasznoseffektora, és képes asztroglia proliferációt is kiváltani. A találmánya fenti tulajdonságú rekombináns molekula előállítására, és amolekulát tartalmazó gyógyszerkészítményre is vonatkozik. ŕ

Description

KIVONAT
A találmány általánosan egy vaszkuláris endoteliális növekedésifaktor-szerű tulajdonságokkal rendelkező izolált molekulára és egy ezt kódoló génszekvenciára vonatkozik. A molekula számos, növelt vagy csökkent érrendszeri és/vagy vaszkuláris permeabilitást igénylő állapotok kezelésében, megelőzésében és/vagy diagnosztizálásában használatos terápiás készítmény és diagnosztikum kifejlesztésében hasznosítható. A találmány szerinti molekula a primer és a központi neuronok hasznos effektora, és képes asztroglia proliferációt is kiváltani.
A találmány a fenti tulajdonságú rekombináns molekula előállítására, és a molekulát tartalmazó gyógyszerkészítményre is vonatkozik.
A leírás terjedelme 76 oldal (ezen belül 52 lap ábra)
HU 223 438 B1
HU 223 438 Β1
A találmány általánosan egy vaszkuláris endoteliális növekedésifaktor-szerű tulajdonságokkal rendelkező izolált molekulára és egy ezt kódoló génszekvenciára vonatkozik. A molekula számos, növelt vagy csökkent érrendszeri és/vagy vaszkuláris permeabilitást igénylő állapotok kezelésében, megelőzésében és/vagy diagnosztizálásában használatos terápiás készítmény és diagnosztikum kifejlesztésében hasznosítható. A találmány szerinti molekula a primer és a központi neuronok hasznos effektora, és képes asztroglia proliferációt is kiváltani.
A nukleotid- és aminosavszekvenciákra vonatkozó szekvenciaazonosító számokat, melyekre a leírásban hivatkozunk, a leírás végén adjuk meg.
A leírás során, hacsak a szövegkörnyezetből másképp nem adódik, a „tartalmaz” szó vagy változatai, mint például a „tartalmazzák” vagy „tartalmazó”, úgy értelmezendő, hogy valami magában foglal egy meghatározott elemet vagy egységet, vagy az elemek vagy egységek csoportját, de nem zár ki más egyéb elemet, egységet, vagy elemek vagy egységek csoportját.
A vaszkuláris endoteliális növekedési faktor (melyre ezután „VEGF”-ként hivatkozunk), amelyet vazoaktív permeabilitási faktorként is ismerünk, egy szekretált, kovalensen kapcsolt homodimer glikoprotein, mely specifikusan aktiválja az endoteliális szöveteket (Senger D. R., Van De Water L., Brown L. F., Nagy J. A., Yeo K. T., Berse B., Jackman R. W., Dvorak A. M., Dvorak H. F (1993) Cancer Metastasis Rév., 12, 303-324). A VEGF-nek számos funkciót tulajdonítanak, például részt vesz normális angiogenezisben, ez magában foglalja a sárgatest képzését (Yan Z., Weich
H. A., Bemart W., Breckwoldt M., Neulen J. (1993) J. Clin. Endocrinol. Metab. 77, 1723-1725) és placenta kialakulását (Sharkey A. M., Chamock-Jones D. S., Boocock C. A., Brown K. D., Smith S. K, (1993) J. Repród. Fertil. 99, 609-615), a vaszkuláris permeabilitás szabályozását (Senger és munkatársai, 1993, fentebb), a gyulladásos angiogenezist (Sunderkotter C., Steinbrink K., Goebeler M., Bhardway R., Sorg E. (1993) J. Leukocyt., Bioi. 55, 410-422) és az autotranszplantációt (Dissen G. A., Lara Η. E., Fabrenbach W. H., Costa Μ. E., Ojeda S. R. (1994) Endocrinology 134, 1146-1154) és humán betegségeket, például a tumorkiváltó angiogenezist (Folkman J. és Shing Y. (1992) J. Bioi. Chem. 267, 10931-10934), a reumatoid artritiszt (Koch A. E., Harlow L. A., Haines G. K. Amento E. P., Unemoti E. N., Wong W. L., Popé R. M., Ferrara N., (1994) J. Immunoi. 152, 4149-4156) és a retinopátiával összefüggő diabéteszt (Folkman J. és Shing Y. (1992) J. Bioi. Chem. 267, 10931-10934).
A VEGF tehát egy fontos molekula, mely a VEGFen vagy aktivitásain alapuló terápiás, profilaktikus és diagnosztikai szerek kutatásának potenciálisan értékes céljává teszi. Szükség van a homológok vagy egyéb rokon molekulák azonosítására is, hogy azokat a VEGF alternatívájaként vagy a VEGF-fel együtt alkalmazhassuk.
A találmányhoz vezető munkában a feltalálók a sokszoros endokrin neoplázia I. típusú érzékenységi génjét (MEN1) keresték. Meglepő módon felfedeztük, hogy egy génszekvencia, mely lehetséges ΜΕΝ 1-ként nem kerülhetett szóba, egy új növekedési faktor, mely némileg hasonlít a VEGF-hez. Továbbá a találmány szerinti növekedési faktor a primer és központi neuronok egyik effektor molekulája.
Következésképpen a találmány egyik tárgya egy olyan aminosavszekvenciát tartalmazó proteinszerű molekula, mely:
(i) egy olyan aminosavszekvenciát tartalmaz, mely legalább körülbelül 15%-ban hasonlít a 2. azonosító számon bemutatott szekvenciához és (ii) legalább körülbelül 5%-ban eltér a 2. azonosító számon bemutatott szekvenciától.
A találmány egy másik tárgya egy biológiailag izolált, a következő tulajdonságokkal rendelkező proteinszerű molekula, mely (i) egy olyan aminosavszekvenciát tartalmaz, mely legalább körülbelül 15%-ban hasonlít és legalább körülbelül 5%-ban eltér a 2. azonosító számon bemutatott szekvenciától;
(ii) legalább egy, a VEGF-fel közös tulajdonságot mutat.
A találmány egy biológiailag izolált, a következő tulajdonságokkal rendelkező proteinszerű molekulára is vonatkozik:
(i) egy olyan aminosavszekvenciát tartalmaz, mely legalább körülbelül 15%-ban hasonlít és legalább körülbelül 5%-ban eltér a 2. azonosító számon bemutatott szekvenciától;
(ii) a következő tulajdonságok legalább egyikét mutatja:
(a) képes a vaszkuláris endoteliális sejtek indukálására (b) képes kölcsönhatásba lépni az flt-l/flk-1 receptorcsaláddal; és/vagy (c) képes indukálni a sejtmigrációt, a sejttúlélést és/vagy képes az alkalikus foszfatáz intracelluláris szintjének növelésére.
A „biológiailag izolált” azt jelenti, hogy a molekula a biológiai forrásból kiindulva legalább egy tisztítási lépésen átesik. Előnyösen az, hogy a molekula biológiailag tiszta, azt is jelenti, hogy egy elegy legalább körülbelül 20%, még előnyösebben legalább körülbelül 40%, ennél is előnyösebben legalább körülbelül 65%, még ennél is előnyösebben legalább körülbelül 80-90% molekulát vagy többet tartalmaz az elegyben lévő egyéb vegyületekhez képest, tömeg, aktivitás alapján vagy egyéb megfelelő módszerrel meghatározva.
A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja a molekulát rekombináns formában biztosítja.
A találmány ezen aspektus szerint egy olyan aminosavszekvenciát tartalmazó rekombináns molekulát biztosít, mely (i) legalább körülbelül 15%-ban hasonlít a 2. azonosító számon bemutatott szekvenciához és (ii) legalább 5%-ban eltér a 2. azonosító számon bemutatott szekvenciától.
A találmány egy ezzel összefüggő megvalósítási módja egy olyan rekombináns molekulára irányul, mely a következő tulajdonságokkal rendelkezik:
HU 223 438 Bl (i) egy olyan aminosavszekvenciát tartalmaz, mely legalább körülbelül 15%-ban hasonlít és legalább körülbelül 5%-ban eltér a 2. azonosító számon bemutatott szekvenciától;
(ii) legalább egy, a VEGF-fel közös tulajdonságot mutat.
A találmány egy másik megvalósítási módja a következő tulajdonságokkal rendelkező rekombináns molekulára vonatkozik:
(i) egy olyan aminosavszekvenciát tartalmaz, mely legalább körülbelül 15%-ban hasonlít és legalább körülbelül 5%-ban eltér a 2. azonosító számon bemutatott szekvenciától;
(ii) a következő tulajdonságok legalább egyikét mutatja:
(a) képes a vaszkuláris endoteliális sejtek indukálására (b) képes kölcsönhatásba lépni az flt-l/flk-1 receptorcsaláddal; és/vagy (c) képes indukálni a sejtmigrációt, a sejttúlélést, és/vagy képes az alkalikus foszfatáz intracelluláris szintjének növelésére.
A találmány szintén magában foglalja azokat a genomiális vagy részleges genomiális kiónokat, melyek olyan fehérjeszerű molekulát kódolnak, mely legalább körülbelül 15%-ban hasonlít és legalább körülbelül 5%-ban eltér az 1. azonosító számú szekvenciától.
A 2. azonosító számú szekvenciában bemutatott aminosavszekvencia a humán VEGF-nek (ezután „VEGF165”-ként hivatkozunk rá) felel meg. Következésképpen a találmány szerinti molekula VEGF-szerű, vagy a VEGF egy homológja, de olyan aminosavszekvenciát tartalmaz, mely hasonló, de nem azonos a VEGF aminosavszekvenciájával. Bár a találmányt egy humán VEGF-szerű molekulát alkalmazva szemléltetjük, értelemszerűen a találmány magában foglalja a többi emlősből, mint például a haszonállatokból (például juhokból, disznókból, lovakból és szarvasmarhákból), hobbiállatokból (például kutyákból és macskákból) és laboratóriumi tesztállatokból (például egerekből, patkányokból, nyulakból és tengerimalacokból), valamint nem emlős állatokból, például madarakból (például baromfi) halakból és kétéltűekből származó homológ molekulákat és kódolószekvenciákat. A legelőnyösebb megvalósítási módban a VEGF-szerű molekula humán eredetű, és egy 1 lql3 kromoszómán elhelyezkedő gén kódolja. A találmány tehát kiteljed az adott VEGF-szerű molekulát kódoló genomiális szekvenciára vagy részére.
Előnyösen, a százalékos hasonlóság a 2. azonosító számú szekvenciában bemutatott aminosavszekvencia egészéhez vagy részéhez legalább körülbelül 30%-os, előnyösebben legalább körülbelül 40%-os, még előnyösebben legalább körülbelül 50%-os, ennél is előnyösebben legalább körülbelül 60-70%-os, még ennél is előnyösebben legalább körülbelül 80-95%-os.
Egy különösen előnyös megvalósítási módban a találmány szerinti VEGF-szerű molekula a 4. azonosító számú szekvenciában bemutatott aminosavszekvenciát vagy egy részét, fragmensét, származékát vagy analógját tartalmazza. Különösen előnyös, ha a hasonlóság 19-20% és 29-30% körüli. A származékok, melyekre utaltunk, a splice-variánsokat is magukban foglalják. Következésképpen a találmány kiterjed a SOM 175 splicevariánsára is. Találmány szerinti splice-variánsok azok a variánsok, amelyek lényegében a 6. azonosító számú szekvencia, 8. azonosító számú szekvencia és/vagy a
10. azonosító számú szekvencia legalább egyikében bemutatott aminosavszekvenciával rendelkeznek, vagy ezek mutánsai, származékai vagy további splice-variánsai, de a variánsok nem korlátozódnak kizárólag ezekre.
Egy másik megvalósítási mód a következő jellemzőkkel bíró rekombináns molekulát szolgáltatja:
(i) aminosavszekvenciája lényegében olyan, mint amit a 4. azonosító számú szekvenciában bemutatunk, vagy legalább körülbelül 15%-ban hasonlít ahhoz vagy részéhez, feltéve, hogy legalább körülbelül 5%-ban eltér a 2. azonosító számú szekvenciában bemutatott aminosavszekvencia egészétől vagy részétől;
(ii) legalább egy, a VEGF-fel közös biológiai tulajdonságot mutat.
Egy másik megvalósítási mód a következő jellemzőkkel bíró rekombináns molekulát szolgáltatja:
(i) aminosavszekvenciája lényegében olyan, mint amit a 6. azonosító számú szekvenciában bemutatunk, vagy legalább körülbelül 15%-ban hasonlít ahhoz vagy részéhez, feltéve, hogy legalább körülbelül 5%-ban eltér a 2. azonosító számú szekvenciában bemutatott aminosavszekvencia egészétől vagy részétől;
(ii) legalább egy, a VEGF-fel közös biológiai tulajdonságot mutat.
Egy másik megvalósítási mód a következő jellemzőkkel bíró rekombináns molekulát szolgáltatja:
(i) aminosavszekvenciája lényegében olyan, mint amit a 8. azonosító számú szekvenciában bemutatunk, vagy legalább körülbelül 15%-ban hasonlít ahhoz vagy részéhez, feltéve, hogy legalább körülbelül 5%-ban eltér a 2. azonosító számú szekvenciában bemutatott aminosavszekvencia egészétől vagy részétől;
(ii) legalább egy, a VEGF-fel közös biológiai tulajdonságot mutat.
Egy másik megvalósulási mód a következő jellemzőkkel bíró rekombináns molekulát szolgáltatja:
(i) aminosavszekvenciája lényegében olyan, mint amit a 10. azonosító számú szekvenciában bemutatunk, vagy legalább körülbelül 15%-ban hasonlít ahhoz vagy részéhez, feltéve, hogy legalább körülbelül 5%-ban eltér a 2. azonosító számú szekvenciában bemutatott aminosavszekvencia egészétől vagy részétől;
(ii) legalább egy, a VEGF-fel közös biológiai tulajdonságot mutat.
A VEGF ezen tulajdonságai a következő jellemzők legalább egyikét foglalják magukban:
(a) képes a vaszkuláris endoteliális sejtek indukálására, (b) képes kölcsönhatásba lépni az flt-l/flk-1 receptorcsaláddal;
(c) képes indukálni a sejtmigrációt, a sejttúlélést és/vagy képes az alkalikus foszfatáz intracelluláris szintjének növelésére.
HU 223 438 Β1
A találmány szerint a hasonlóság előnyösen legalább körülbelül 40%-os, még előnyösebben legalább körülbelül 50%-os, és ennél is előnyösebben legalább körülbelül 65%-os.
A találmány egy további tárgya egy olyan peptidffagmentum, mely a 4. azonosító számú szekvenciában bemutatott aminosavszekvencia egy részének vagy egy splice-variánsának, például a 6. azonosító számú szekvenciában, a 8. azonosító számú szekvenciában vagy a 10. azonosító számú szekvenciában bemutatottnak, vagy ezek kémiai ekvivalensének felel meg. A találmány szerinti biológiailag izolált vagy rekombináns molekula lehet természetesen glikozilált, vagy tartalmazhat egy megváltozott glikozilációs mintázatot, attól a sejttől függően, melyből izolálták vagy amelyben szintetizálták. Például ha rekombináns módon prokariótákban termelnénk, a molekula glikozilálatlan lenne. A molekula lehet teljes hosszúságú, a természetben előforduló formában, vagy lehet csonkolt vagy egyéb származék.
A találmány még egy másik tárgya az itt leírt VEGF-szerű molekulát kódoló nukleinsavmolekula. Még jellemzőbben, a találmány egy olyan nukleinsavmolekulát biztosít, mely lényegében a 3. azonosító számú szekvenciaként bemutatott nukleotidszekvenciát tartalmazza, vagy legalább 15%-ban hasonlít annak egészéhez vagy részéhez, vagy kevéssé szigorú körülmények között képes hibridizálni a 3. azonosító számú szekvenciaként bemutatott nukleotidszekvencia reverz komplementeréhez, feltéve, hogy a nukleotidszekvencia legalább 15%-ban hasonlít és legalább 30%-ban eltér a 3. azonosító számú szekvenciában bemutatott nuklkeotidszekvenciától. A 3. azonosító számú szekvenciában bemutatott nukleotidszekvenciát „SOM175”nek is nevezzük. Előnyösen a százalékos eltérés körülbelül 35%, még előnyösebben körülbelül 39% és ennél is előnyösebben körülbelül 40-50% vagy nagyobb.
Abból a célból, hogy meghatározzuk a körülmények szigorúságát, referenciaként Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T., (1989) Molekuláris klónozás - Laboratóriumi kézikönyvére hivatkozunk (Molecular Cloning: A Laboratory Manual) - 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.), a 9.47-9.51 oldalakra, mely referenciaként épül be a leírásba, és ahol a bemutatott mosási lépések a nagyon szigorú körülményeknek felelnek meg. A kevésbé szigorú körülményeket úgy határozzuk meg, hogy az eljárás 4-6 xSSC/0,1-0,5 vegyes% SDS-ben történik 37-45 °C-on 2-3 órán át.
A hibridizációban részt vevő nukleinsav forrásától és koncentrációjától függően, a szigorú körülmények egy másik alternatív feltételei is alkalmazhatóak, például a közepesen szigorú körülményeknek tekintjük a következőket: 1-4xSSC/0,25-0,5 vegyes% SDS-t, 45 °C-on vagy magasabb hőmérsékleten, 2-3 órán át, vagy nagyon szigorú körülményeknek tekintjük a 0,1 -1 χ SSC/0,1 vegyes% SDS-t, 60 °C-on 1-3 órán át.
A találmány magában foglal egy olyan nukleinsavmolekulát, mely egy VEGF-szerű molekulát kódol, mely, ahogy fentebb leírtuk, legalább 15%-os nukleotidszekvencia-homológiával rendelkezik a 3. azonosító számú szekvenciához viszonyítva. Előnyösen a homológiaszint legalább körülbelül 40%, még előnyösebben 60-70% körüli.
A találmány továbbá a humán VEGF egérfélékben megtalálható homológjára („mVRF”-nek nevezzük) vonatkozik. Az mVRF hozzávetőleg 85%-ban azonos és 92%-os aminosavmaradék-konzervációval rendelkezik a teljes kódoló régióban összehasonlítva a humán VEGFfel. Az mVRF-et lényegében a 9. ábrán bemutatott nukleotidszekvenciát tartalmazó nuklelinsavmolekula kódolja.
A találmány szerinti VEGF-szerű molekulák egy sor terápiás és/vagy diagnosztikai alkalmazás kifejlesztésében hasznosíthatók önmagukban vagy más molekulákkal, például a VEGF-fel kombinációban. A találmány tehát kiterjed a VEGF-szerű molekulát vagy részeit, ffagmenseit, származékait, homológjait vagy analógjait egy vagy több gyógyászatilag elfogadható hordozóval és/vagy oldószerrel együtt tartalmazó gyógyszerkészítményekre. Továbbá, a találmány kiterjed a 3. azonosító számú szekvenciában bemutatott nukleinsavszekvenciát, vagy egy olyan nukleinsavszekvenciát tartalmazó vektorokra is, mely legalább körülbelül 15%-ban, még előnyösebben körülbelül 40%-ban, és ennél is előnyösebben 60-70%-ban hasonlít, de legalább 30%-ban és még előnyösebben 39%-ban eltér attól, továbbá a találmány kiterjed a vektorokat tartalmazó gazdasejtekre is. Továbbá, a találmány kiterjed a 3. azonosító számú szekvencián alapuló ribozimokra és antiszensz molekulákra, valamint a VEGF-szerű molekulákat semlegesítő antitestekre is. Az ilyen molekulák a hatások javításában, például az angiogenezishez vagy a tumorok vaszkularizációjához vezető VEGF-szerű gének overexpressziójában lehetnek hasznosak.
A találmány egy másik aspektusból az asztroglia proliferáció indukálási eljárására vonatkozik emlősökben, ahol az említett eljárás során az említett emlősnek a következő tulajdonságokkal rendelkező rekombináns proteinszerű molekulát adjuk be hatásos mennyiségben:
(i) a 2. azonosító számú szekvenciában bemutatott szekvenciához legalább körülbelül 15%-ban hasonló és legalább 5%-ban eltérő aminosavszekvenciát tartalmaz;
(ii) legalább egy, a vaszkuláris endoteliális növekedési faktorral (VEGF) közös tulajdonságot mutat, és a beadást az asztroglia proliferáció indukálásához megfelelő időben és körülmények között végezzük el.
Előnyösen a rekombináns proteinszerű molekula a
3. vagy 6. azonosító számú szekvenciában bemutatott aminosavszekvenciát tartalmazza.
A találmány egy további tárgya a neurontúlélést és/vagy -proliferációt elősegítő eljárás, ahol az említett eljárás során az említett emlősnek egy olyan rekombináns proteinszerű molekulát adunk be hatásos mennyiségben, mely (i) egy, a 2. azonosító számú szekvenciában bemutatott szekvenciához legalább körülbelül 15%-ban hasonló és legalább körülbelül 5%-ban eltérő aminosavszekvenciát tartalmaz;
HU 223 438 Β1 (ii) legalább egy, a vaszkuláris endoteliális növekedési faktorral (VEGF) közös tulajdonságot mutat, és a beadást az asztroglia proliferáció indukálásához megfelelő időben és körülmények között végezzük el.
Előnyösen a rekombináns proteinszerű molekula a
3. vagy 6. azonosító számú szekvenciában bemutatott aminosavszekvenciát tartalmazza.
A találmány szintén magában foglalja a VEGF-szerű molekula elleni antitesteket és a VEGF-szerű molekulát kódoló génhez alkalmazható nukleinsavpróbákat, melyek diagnosztikai ágensekként használhatók.
A találmányt a továbbiakban a következő, nem korlátozó jellegű ábrákra és/vagy példákra hivatkozva írjuk le. Az ábrák ismertetése:
1. ábra: A VEGF 165 nukleotidszekvenciája (1.
azonosító számú szekvencia) és az ennek megfelelő aminosavszekvencia (2. azonosító számú szekvencia).
2. ábra: A SOM175 nukleotidszekvenciája (3. azonosító számú szekvencia) és az ennek megfelelő aminosavszekvencia (4. azonosító számú szekvencia).
3. ábra: A SOM 175 fehérjeszekvenciával végzett
BLAST-keresés eredményei
4. ábra: A VEGF cDNS és a SOM175 cDNS
BESTFIT-illesztése.
5. ábra: A VEGF165 sokszoros illesztése a
SOM175-tel és splice-variánsaival nukeotidszinten.
6. ábra: A VEGF165 sokszoros illesztése a
SOM175-tel és splice-variánsaival aminosavszinten.
7. ábra: A SOM 175 és splice-variánsainak diagramos bemutatása.
8. A. ábra: A humán SOM 175 genomiális szerkezetének diagramos ábrázolása az exon/intron térkép bemutatásával.
8. B. ábra: A humán SOM 175 genomiális szerkezetének diagramos ábrázolása az exon/intron határok bemutatásával.
9. ábra: Az mVRF cDNS kiónokból származó nukleotid- és megjósolt peptidszekvenciák. A nukleotidok számozását a bal oldalon adjuk meg, az iniciációs kodon A-jától kezdve. Az aminosavakat jobb oldalon számoztuk, a megjósolt érett fehérje első gyökétől kezdve, miután a feltételezett szignálpeptidet eltávolítottuk. A váltakozó splicing-on átesett régiókat vastagon aláhúztuk, és mindegyik az mRNS-ből kapott peptidszekvenciát is tartalmazza. Félkövér betűkkel jelöltünk meg egy potenciális poliadenilációs szignált. Az mVRF(67 és az mVRFl86 startés stopkodonjait aláhúztuk, és a 3’ UTR-ben lévő polimorf AC-ismétlődést téglalappal jelöljük. Az intron/exon határok helyzetét kis nyíllal jelöljük.
10. ábra: A humán és az egérfélék VRF protein izoformáinak BESTFIT-illesztése. A: mVRF167 és hVRF,67. B: mVRF186 és hVRF186 abból a pontból kiindulva, ahol a szekvenciák a megfelelő 167 aminosavas izoformáktól eltérnek. Az aminosavazonosságokat függőleges vonalakkal és a konzerválódott aminosavakat kettősponttal jelöljük. Egy nyíl jelöli a humán és az egér-VRF megjósolt szignálpeptid-hasítási helyét.
11. ábra: Az mVRF167 és az mVEGF188 peptidszekvenciák BESTFIT-illesztése (Breier G. Albrecht U., Sterrer S. és Risau W. (1992) Development 114, 521-532). Egy nyíl jelzi az mVEGF szignálpeptid hasítási helyét. Az aminosavazonosságokat függőleges vonalakkal és a konzervatív helyettesítéseket kettősponttal jelöljük. Az aminosavak számozása olyan, mint amit a
9. ábra magyarázatában leírtunk.
12. ábra: A VRF (egy általános VRF gént mutatunk be, mivel az egér és a humán homológ intron/exon szerveződése majdnem azonos) és a humán VEGF/PIGF/PDGF géncsalád egyéb tagjai közötti összehasonlítás. Az exonokat téglalapokkal jelöltük. A fehérjekódoló régiókat és a nem átíródó régiókat sűrűn vonalkázott, illetve üres szakaszokkal jelöljük. A VRF-ben a vonalkázott régiók a VRF,86 izoforma alternatív splicingje által kialakult járulékos 3’ UTR-szekvenciát jelölik. Mindegyik gén potenciális változó scplicing termékeit bemutatjuk.
13. ábra: Egy mVRF cDNS kiónnal hibridizált, különböző felnőtt egérszövetekből származó (ahogy azt jelöltük) össz-RNS Northern foltjának autoradiogramja. Mindegyik mintában egy 1,3 kb-os nagy transzkriptumot mutattunk ki.
14. ábra: Egér-mVRF és -mRNS expressziós mintázatát illusztráló film autoradiogramok (A-C) és sötét hátterű mikrogramok. Az E14 egérembrióban (A) pozitív jelek vannak jelen a kialakuló szív (Ha) és az agykéreg (Cx) felett. Egy alacsony háttérjel a metszetben lévő többi szövetben is jelen van. Az E17 embrióban (B) a szív (Ha) tisztán látható egy erős hibridizációs jelnek köszönhetően. Egy azonos erősségű jel van jelen a barna zsírszövet (Fa) fölött a háton és a mellkas körül. Egy mérsékelt hibridizációs jel van a gerincvelő (SC) és a nyelv (T) fölött. A háttérjel lecsökkent összehasonlítva az E14 embrióval. A fiatal felnőtt egérben (C-D) pozitív jelek vannak a szív (Ha) és a mellkas körüli zsírszövet (Fa) felett, míg például a tüdők (Lu) nem jelölődtek. A szív feletti hibridizációs jel egyenletesen oszlik el a teljes jobb kamra felett, beleértve a papilláris izmokat (D). Az El7-ben, ahol a szívet a hidegpróba feleslegével hibridizáltuk, pozi5
HU 223 438 Β1 tív szignál nincs jelen (E). Skálacsíkok=0,5 mm (A), 1,2 mm (Β), 1 mm (C),
0,3 mm (D), 0,1 mm (E).
15. ábra: Sötét (A és C) és világos hátterű (B és D) mikrogramok, melyek az mVRF mRNS 5 expressziót mutatják egérzsírszövetben (A-B) és -gerincvelőben (C-D). Egy erős hibridizációs jel van jelen a zsír felett (A), ahogy azt az erős jelződés mutatja a szudánfeketével festett metszeteken (B). 10 Szintén van egy gyenge jel a vázizomban (M az A-B-ben). A felnőtt gerincvelőben (C) az mVRF-próbák egy neuronos festődési mintázatot adnak a szürkeállomány felett. A toluidinfestés megmutatta, hogy 15 a ventrális szarvban lévő motoneuronok (D) , a dorzális szarv mélyebben fekvő részeiben és a központi csatorna körül lévő intemeuronok (nem mutatjuk) erősen pozitívok az mVRF mRNS-re. Skálacsí- 20 kok=0,l mm (A), 0,1 mm (B), 0,25 mm (C), 0,015 mm (D).
16. ábra: A VEGF hatása 8 napos csirkeembrióérzőneuronokra, a %-os túléléssel, a %-os neuritkinövéssel és az átlagos neurit- 25 hosszal (pm) meghatározva.
17. ábra: A VEGF és a SOM 175 hatásai a csirkegliára. CNS gliát, perifériás gliát és a CNS oligodendrocitákat vizsgáltunk.
18. ábra: Különböző SOM 175 fehérjék hatása az 30 egér asztrogliasejtjeire. 3H (cpm)
1. FGF-2 (10 ng/ml) pozitív kontroll
2. SOMAX6* 1 ng/ml
3. SOMAX6 10 ng/ml
4. SOMAX6 100 ng/ml 35
5. SOMAX6 1000 ng/ml
6. SOMAX6* 1000 ng/ml, heparin nélkül *
**
7. SOMX6** 1 ng/ml
8. SOMX6* 10 ng/ml
9. SOMX6 100 ng/ml
10. SOMX6 1000 ng/ml
11. SOMX6 1000 ng/ml, heparin nélkül a 6. exon nélküli SOM175-öt jelöli a SOMI75-öt jelöli
19. ábra: Különböző SOM 175 fehérjék hatása az egér oligodendrogliasejtjeire. 3H (cpm)
1. FGF-2 (10 ng/ml) pozitív kontroll
2. SOMAX6* 1 ng/ml
3. SOMAX6 10 ng/ml
4. SOMAX6 100 ng/ml
5. SOMAX6 1000 ng/ml
6. SOMAX6* 1000 ng/ml, heparin nélkül
7. SOMX6** 1 ng/ml
8. SOMX6* 10 ng/ml
9. SOMX6 100 ng/ml
10. SOMX6 1000 ng/ml
11. SOMX6 1000 ng/ml, heparin nélkül a 6-os exon nélküli SOM175-öt jelöli a SOM175-öt jelöli
20. ábra: Különböző SOM 175 fehérjék hatása az egér előagysejtjeire. %-os túlélés
1. FGF-2 (10 ng/ml) pozitív kontroll
2. SOMAX6* 1 ng/ml
3. SOMAX6 10 ng/ml
4. SOMAX6 100 ng/ml
5. SOMAX6 1000 ng/ml
6. SOMAX6* 1000 ng/ml, heparin nélkül
7. SOMX6** 1 ng/ml
8. SOMX6* 10 ng/ml
9. SOMX6 100 ng/ml
10. SOMX6 1000 ng/ml
11. SOMX6 1000 ng/ml, heparin nélkül a 6-os exon nélküli SOM175-öt jelöli a SOM175-öt jelöli
1. táblázat
A szekvenciaazonosító számok összefoglalása
1. azonosító számú szekvencia a VEGF 165 nukleotidszekvenciája
2. azonosító számú szekvencia a VEGF 165 aminosavszekvenciája
3. azonosító számú szekvencia a SOM 175 (VEGF-szerű molekula) nukleotidszekvenciája
4. azonosító számú szekvencia a SOM175 aminosavszekvenciája
5. azonosító számú szekvencia 6. exon nélküli VEGF 165 nukleotidszekvenciája
6. azonosító számú szekvencia a 6. exon nélküli VEGF165 aminosavszekvenciája
7. azonosító számú szekvencia a 6. és 7. exon nélküli VEGF 165 nukleotidszekvenciája
8. azonosító számú szekvencia a 6. és 7. exon nélküli VEGF 165 aminosavszekvenciája
9. azonosító számú szekvencia a 4. exon nélküli VEGF 165 nukleotidszekvenciája
10. azonosító számú szekvencia a 4. exon nélküli VEGF165 aminosavszekvenciája
11. azonosító számú szekvencia oligonukleotid
12. azonosító számú szekvencia oligonukleotid
13. azonosító számú szekvencia oligonukleotid
14. azonosító számú szekvencia oligonukleotid
A leírásban (igénypontokban) alkalmazott „szélsőségesen szigorú” kifejezés a következő körülményekre utal: (0,l-l)xSSC/0,l t% SDS, 60 °C, 1-3 óra.
1. példa: Humán cDNS klánok
Az eredeti SOM175 cDNS-t úgy izoláltuk, hogy a gQ humán magzatiagy-könyvtárat (ÁzapII, Stratagene) a
HU 223 438 Β1
D11S750 kozmiddal (Larsson C., Weber G., Kvanta E., Lewis C., Janson M., Jones C., Glaser T., Evans G., Nordenskjold M., (1992) Hűm. Génét. 89, 187-193) szkríneltük. A plazmidot „ in vivő ” hasítottuk, és egyetlen 1,1 kb-os cDNS-t kaptunk. Szintén izoláltunk há- 5 rom független SOM 175 cDNS kiónt egy humán magzatilép-könyvtárból (Stratagene, Unizap) próbaként a fentebb említett SOM 175 inszertumot alkalmazva. Három kiónt kaptunk: SOM175-4A, -5A és -6A.
A SOM 175-5A egy olyan váltakozó splicingon átesett 10 klón, melyből a 4. exon hiányzik (SOM175-e4). Ezeket a könyvtárszkríneléseket a könyvtár gyártója (Stratagene) által javasolt hibridizációs körülményeket és SOM 175 random primerizált inszertumát alkalmazva hajtottuk végre.
Szintén izoláltunk két részleges humán SOM 175 cDNS-t egy A2058 humán melanóm-asejtvonal XGTll könyvtárból (Clontech). A cDNS könyvtár szkríneléseket Church és Gilbert által leírt hibridizációs körülményeket alkalmazva hajtottuk végre (Church G. és Gilbert W. (1984) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 18, 1991-1995). Minden esetben a próbát a SOM 175 (18f-700r)-ből származó PCR termék random primerizálásával állítottuk elő.
Egér-cDNS-klönok
Humán SOM175-öt alkalmaztunk egy egér újszülött teljes agy-cDNS-könyvtárának (Unizap, Stratagene) szkrínelésére. Négy nem kiméra kiónt izoláltunk: Ml75-A, B, C, D. Mindegyik klón részleges cDNS volt, és az M175-C néhány intront tartalmazott. 30 Ezek közül a cDNS-ek közül háromból hiányzott a 6. exon.
Egy másik, Ml-nek nevezett kiónt teljesen megszekvenáltunk, és úgy találtuk, hogy a teljes nyitott leolvasási keretet, valamint az 5’ UTR egy részét és a teljes 3’ 35 UTR-t tartalmazta.
2.példa: DNS-szekvencia-analízis
A cDNS klón (SOM175) teljes szekvenciáját összeállítottuk, és a 2. ábrán mutatjuk be a megfelelő ami- 40 nosavszekvenciával együtt. Ezt a szekvenciát nyitott leolvasási keretekre szkríneltük a MAP programot (GCG, University of Wisconsin) használva. Egyetlen 672 bp-os nyitott leolvasási keretet figyeltünk meg (lásd a 2. ábrát). Úgy tűnik, hogy van egy kicsi 5’ nem 45 átíródó régió (2 bp). A 3’ nem átíródó régió teljesnek tűnik, mivel tartalmaz egy poliadenilációs szignált és egy poli-A farkat.
Adatbázisos homológiakereséseket hajtottunk végre a BLAST algoritmust alkalmazva (NCBI, USA). Ez az analízis homológiát tárt fel a VEGF néhány emlősformájával (lásd a 3. ábrát). A SOM 175 és a humán VEGF 165 közötti homológia mértékét BESTFIT programmal (GCG, University of Wisconsin; lásd a 4. és 5. ábrát) határoztuk meg. A nukleotidhomológiát 69,7%nak értékeltük, és a fehéqehomológiával kapcsolatban 33,3% azonosságot és 52,5%-os konzerválódást becsültünk a BESTFIT-analízist használva. A nukleotidszekvencián végzett BLAST-analízis kimutatta, hogy majdnem teljesen illeszkedik az EST06302 humán expresszált szekvenciarésszel (humán expressed seqence tag, Adams M. D., Soares Μ. B., Kerlavage A. R., Fields 15 C, Venter J. C., (1993) Natúré Génét., 4, 373-380).
Ezek az adatok azt jelzik, hogy a SOM 175 egy olyan növekedési faktort kódol, mely szerkezetileg hasonlít a VEGF-re. Mindkét génnél a start- és a stopkodon hasonló helyzetűnek mutatkozott, és elkülönült ho20 mológiablokkokat alkotott. Mind a 8 cisztein és a többi olyan VEGF aminosavgyök, melyről úgy gondoljuk, hogy részt vesz a dimerizációban, konzerválódott. Ezek a gyökök a cisztein-47, prolin-70, cisztein-72, valin-74, arginin-77, cisztein-78, glicin-80, cisztein-81, cisztein25 82, cisztein-89, prolin-91, cisztein-122, cisztein-124, melyeket a 6. ábrán mutatunk be. Mivel adott a szerkezeti konzerváció a VEGF és a SOM 175 géntermék között, lehetséges, hogy van funkcionális hasonlóság is. Feltételeztük, hogy a SOM 175 egy VEGF-szerű molekulát kódol, melynek néhány tulajdonsága azonos a VEGF-fel, de vannak saját egyedi tulajdonságai is. A VEGF 165 nukleotidszekvenciáját és a megfelelő aminosavszekvenciát az 1. ábrán mutatjuk be.
3. példa
A VEGF165 család és a SOM175 család (fehéq'e) közötti százalékos hasonlóságot és különbözőséget a Clustar eljárást alkalmazva analizáltuk (MegAlign Software, DNASTAR, Wisconsin). Az eredményeket a 2.1. és 2.2. táblázatban mutatjuk be. A SOM 175 alternatív splicingon átesett formáit SOM175-e6-ként rövidítjük, azokban az esetekben, melyekben a teljes 6. exon hiányzik; SOM175-e6-nak és 7-nek, melyeknél a teljes 6. és 7. exon kivágódott; és SOM175-e4-nek azokban az esetekben, melyekben a teljes 4. exon hiányzik. A SOM 175 splicingon átesett formáit a 7. ábrán mutatjuk be. Az intron/exon határokat bemutató SOM 175 genomiális térképet a 8A. és 8B. ábrán mutatjuk be.
2.1. táblázat
A) Százalékos hasonlóság a SOM 175 splice-variánsok és a humán VEGF 165 között
VEGF 165 SOM 175 SOM175-e6 SOM175-e6&7 SOM175-C4
VEGF 165 *** 34,9 39,7 41,4 37,0
SOM 175 **♦ 98,9 95,1 99,2
SOM175-e6 ♦ ** 98,8 84,0
SOM175-e6&7 *** 80,3
SOM175-e4 **♦
HU 223 438 Bl
B) Százalékos nukleotiddivergencia a SOM 175 splice-variánsok és a humán VEGF165 között
VEGF 165 SOM 175 SOM175-e6 SOM175-e6&7 SOM175-e4
VEGF165 *** 41,7 41,6 41,7 41,8
SOMI 75 *** 0,2 0,2 0,0
SOM175-e6 *** 0,0 0,2
SOM175-e6&7 *** 0,3
SOM175-e4 ***
2.2. táblázat
A) Százalékos aminosavazonosság a SOM 175 splice-variánsok és a humán VEGF165 között
VEGF 165 SOM 175 SOM175-e6 SOM175-e6&7 SOM175-e4
VEGF 165 *** 31,4 42,3 33,5 40,6
SOMI 75 *** 74,7 73,7 99, 1
1 SOM175-e6 76,8 99,1
SOM175-e6&7 **♦ 99,1
1 SOM175-e4 ♦♦♦
B) Százalékos aminosavdivergencia a SOM 175 splice-variánsok és a humán VE6F165 között
VEGF 165 SOM 175 SOM175-e6 SOM175-e6&7 SOM175-e4
VEGF 165 *** 65,7 55,4 54,6 57,4
SOM 175 *** 19,9 4,2 0,0
1 SOM175-e6 *** 0,0 0,0
| SOM175-e6&7 0,0
1 SOM175-e4 ♦♦♦
4. példa: Bioesszék a SOMI 75 funkciójának meghatározására
Esszéket végzünk annak értékelésére, hogy a SOM 175 hasonló aktivitásokkal rendelkezik-e, mint a VEGF az endoteliális sejtfunkcióban, az angiogenezisben és a sebgyógyulásnál. Egyéb, receptorkötési megoszlási tanulmányokon alapuló esszéket is végrehajtunk.
Endoteliális sejtfunkció esszék
Endoteliális sejt proliferáció: Endoteliális sejt növekedési esszék, melyeket Ferrara N. és Henzel W. J. (1989) Biochem. Biophys. Rés. Commun. 161, 851-858, valamint Gospodarowicz D, Abraham J. A. és Schilling J. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 7311-7315, írtak le.
Vaszkuláris permeábilitási esszé: Ezt az esszét, mely a Miles-tesztet alkalmazza tengerimalacokban, úgy hajtjuk végre, ahogy azt Miles A. A. és Miles E. M. (1952;/. Physiol. (Lond) 118: 228-257, leírták.
Sejtadhéziós esszé: A SOM175-nek a polimorfok endoteliális sejtekhez történő adhéziójára gyakorolt hatását elemezzük.
Kemotaxis: Ezt a standard Boyden-kamra kemotaxis esszét alkalmazva hajtjuk végre.
Plazminogén aktivátor esszé: Endoteliális sejteket tesztelünk plazminogén aktivátor és plazminogén aktivátor inhibitor termelésre SOM 175 hozzáadása mellett (Pepper M. S., Ferrara N, Őrei L., Montesano R. (1991) Biochem. Biophis. Rés. Commun. 181, 902-906).
Endoteliális sejtmigrációs esszé: A SOM 175 azon képességét, hogy stimulálja-e az endoteliális sejtek migrációját és ércsővé alakulását, Montestano és munkatársai által leírt módon vizsgáljuk (Montesano R., Vassalli
J. D., Baird A., Guillemin R és Őrei L. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 7297-7301).
Angiogenezis esszé
Csirke allantoiszburok-membránjában mérjük az angiogén válasz SOM 175 indukcióját, ahogy azt OZUS Leung D. W., Cachianes G., Kuang W-J., Goeddel D. V. és Ferrara N. (1989) Science 246: 1306-1309, leírták.
A SOM 175 lehetséges neurotróf hatását a következő esszéket alkalmazva vizsgáljuk:
Neuritkinövési esszé és génindukció (PC12 sejtek)
A PC 12 sejtek [egy feokromocitóma (mellékvese velőállományának daganata) sejtvonal] válaszreakciót mutatnak az NGF-re és más neurotróf faktorokra, azáltal, hogy kialakulnak a szimpatikus neuronok jellemzői, melyek magukban foglalják a korai és késői gének indukcióját és a neuritok kialakítását. Ezeket a sejteket SOM175-tel kezeljük, és a válaszreakciót nyomon kö8
HU 223 438 Β1 vetjük (Drinkwater C. C., Suter U. Angst C. és Shooter E. M. (1991) Proc. Roy. Soc. Lond. (B sorozat), 246, 307-313; Drinkwater C. C., Barker P. A., Suter U. és Shooter E. M. (1993) J. Bioi. Chem., 268, 23202-23207).
A perifériás idegrendszerből (PNS) tenyésztett neuronok
A következő neuronok primer tenyészeteit SOM 175tel kezeljük, és nyomon követjük a válaszreakciókat:
- érző neuronok az idegtaréj és a hátsó ideggyök ganglionjaiból
- szimpatikus neuronok a szimpatikus lánc ganglionjaiból
- a csomós ganglionok érző neuronjaiból származó kezdemények
- a gerincvelő mozgató neuronjai
Az esszéket Suter U., Angst C., Tien C-L., Drinkwater C. C., Lindsay R. M. és Shooter E. M. (1992) J. Neurosci., 12, 306-318; Tischer E., Mitchell R., Hartman T., Silva M., Gospadarowicz D., Fiddes J. C. és Abraham J. (1991) J. Bioi. Chem. 266, 11947-11954, és Martinou J. C., Martinou I. és Kató A. C. (1992) Neuron, 8, Ί3Ί-Ί4Α írták le.
Ahol in vitro válaszreakciót figyelünk meg, in vivő esszéket hajtunk végre olyan tulajdonságok vizsgálatára, mint például a felvétel és az ellentétes irányú transzport, oly módon ahogy azt Hendry I. A., Murphy M., Hilton D. J., Nicola N. A. és Bartlett P. F. (1992) J. Neurosci. 12, 3427-3434, leírta.
Idegregeneráció (PNS)
Ahol a SOM 175 neurotróf hatásait megfigyeltük, elemezzük a lehetséges szerepét az axonjuktól megfosztott érző neuronok, szimpatikus neuronok és motoneuronok regenerációjában Ottó D., Frotscher M. és Unsicker K. (1989) J. Neurosci. Rés., 22, 83-91; Yip N. K., Rich K. M., Lampe P. A. és Johnson E. M. Jr. (1984) J. Neurosci. 4, 2986-2992 és Hendry I. A. és Campbell J. (1976)7. Neurocytol., 5, 351-360, módszerével.
A SOMI 75 CNS neuronokra gyakorolt hatásai
A SOM 175 azon képességét, hogy elősegíti-e a központi idegrendszer neuronjainak a túlélését, úgy analizáljuk, ahogy azt Hagg T., Quon D., Higaki J. és Varon S. (1992) Neuron, 8, 145-158; Williams L. R., Varon S., Peterson G. M., Wictorin K., Fischer W., Bjorklund A és Gage F. H. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 9231-9235; Hefti S. (1986) J. Neurosci., 6, 2155-2162 és Kromer A. F, (1987) Science, 235, 214-216, leírták.
Sebgyógyulás
A SOM 175 azon képességét, hogy segíti-e a sebgyógyulást, a legtöbb klinikailag fontos és hozzáférhető modellen teszteljük, ahogy azt Schilling és munkatársai (1959) Surgery, 46: 702- 710, leírták és Hunt és munkatársai (1967) Am. J. Surgery, 114: 302-307, alkalmazták.
A hemopoietikus rendszer
A hemopoietikus rendszer specifikus sejtpopulációinak számos in vitro és in vivő esszéje hozzáférhető, és ezeket a következőkben vázlatosan ismertetjük:
Őssejtek
Egérfélék
Egy sor új in vitro egérfélék őssejtjére vonatkozó esszét fejlesztettünk ki, FSC-tisztított sejteket alkalmazva.
(a) Őssejtek újratermelése
Ezek azok a sejtek, melyek képesek a letálisan besugárzott egércsontvelőt újratermelni, és Lin~, Rhhi, Ly6A/E+, c-kit+ fenotípusúak. A tesztanyagot ezeken a sejteken önmagában vagy több faktorral együtt inkubálva vizsgáljuk, melyet a sejtproliferáció 3H-timidin beépüléses mérésével követünk.
(b) Késői állapotú őssejtek
Ezek azok a sejtek, melyek összehasonlítva kisebb csontvelő-újratermelést mutattak, de képesek Dl3 CFUS-t létrehozni. Ezek a sejtek is Lin~, Rhhi, Ly-6A/E+, ckit+ fenotípusúak. A tesztanyagot egy adott időn át inkubáljuk ezekkel a sejtekkel, letálisan besugárzott recipiensekbe injekciózzuk, és a Dl3 lépkolóniák számát számláljuk.
(c) Progenitorban dús sejtek
Ezek azok a sejtek, melyek in vitro válaszreakciót mutatnak egyetlen növekedési faktorra, és Lin~, Rhhi, Ly-6A/E+, c-kit+ fenotípusúak. Ez az esszé megmutatja, hogy vajon a SOM 175 képes-e közvetlenül hatni a hemopoietikus progenitor sejtekre. A tesztanyagot ezekkel a sejtekkel agartenyészetben inkubáljuk, és a kolóniák számát 7-14 nap után számláljuk meg.
Ateroszklerózis
A simaizomsejtek döntő szerepet játszanak az ateroszklerózis kifejlődésében vagy iniciációjában azáltal, hogy fenotípusán meg kell változniuk ahhoz, hogy az összehúzódási állapotból a szintézis állapotába kerüljenek. A makrofágok, endoteliális sejtek, Tlimfociták és vérlemezkék mindegyike szerepet játszik az ateroszklerotikus plakkok kialakulásában oly módon, hogy hatással vannak a simaizomsejtek növekedésére és fenotípusos változásaira. Egy olyan in vitro esszét alkalmazunk a SOM175 simaizomsejtekre gyakorolt hatásának vizsgálatára, mely a simaizomsejtek proliferációs rátáját és fenotípusos változásait méri egy többsejtes környezetben. A rendszer egy módosított Rose-kamrát alkalmaz, melyben különböző sejttípusok vannak beágyazva a szemben álló fedőlemezekre.
A SOM175 hatása a csontra
A SOM 175 azon képességét, hogy hogyan szabályozza az oszteoblasztok proliferációját, oly módon vizsgáljuk, ahogy azt Lowe C., Comish J., Callon K., Martin T. J. és Reid I. R. (1991) J. Boné Mineral Rés., 6, 1277-1283, leírták. A csontreszorpcióra gyakorolt hatását Lowe C., Comish J., Martin T. J. és Reid I. R. (1991) Calcif. Tissue Int., 49, 394-397, által leírt módon vizsgáltuk. Az oszteoblasztmigrációra és az intracelluláris molekulák változásaira (például a cAMP-akkumulációra, alkalikusfoszfatáz-szintekre) gyakorolt hatásait úgy analizáljuk, ahogy azt Midy V. és Plouet J. (1994) Biochem. Biophys. Rés. Commun., 799:380-386, leírták.
HU 223 438 Β1
Vázizomsejtekre gyakorolt hatások
A SOM 175 mioblasztok proliferációjára és a miotubulusok kialakulására gyakorolt hatásai úgy határozhatóak meg, ahogy azt Ewton D. Z. és Florini J. R. (1980) Endocrinology, 106: 577-583; és Gospadarowicz D., Weseman J., Morgan J. S. és Lindstrom J. (1976) J. CellBiol., 70:395 -405; leírták.
5. példa: Egérfélék VE6F-jének klónozása cDNS-ek izolálása
Egérfélék VRF-jének (mVRF) kiónjait szelektáltunk egy lambda Zap újszülött teljes agy-cDNSkönyvtárából (Stratagene). A nagy sűrűségű szűrőkről (5 x1ο4 pfú/lemez) primer fágot azonosítottunk egy 682 bp-os 32P-vel jelölt próbával, melyet PCR-rel egy hVRF cDNS-ből (pSOM175) állítottunk elő, melyet fentebb leírtunk. A hibridizációt és a nejlonmembránok (Hybond-N) szigorú körülmények közötti mosását 65 °C-on, olyan körülmények között hajtottuk végre, melyeket Church és Gilbert (1984, lásd fentebb) írtak le. A pozitív plakkokat felszúrtuk, tisztítottuk és in vivő kivágtuk, hogy olyan bakteriális telepeket képezzünk, melyek a cDNS kiónokat pBluescript SK-ban tartalmazzák.
Genomiális kiónok izolálása
Genomiális kiónokat izoláltunk egy lambda Fix II vektorba (Stratagene) klónozott SV/129 egértörzskönyvtárból. A nagy sűrűségű szűrőket (5 χ 104 pfú/szűrő) egy 563 bp-os 32P-vel jelölt próbával szkríneltük, melyet az mVRF cDNS 233-798-as nukleotidrégiójának (lásd a 9. ábrát) PCR-amplifíkációjával hoztunk létre. A pozitív kiónokat kivágtuk, és újra szkríneltük 400-800 pfu-t tartalmazó szűrőkkel. Nagyméretű fágkészítményeket készítettünk QIAGEN lambda-kitet vagy ZnCl2-tisztítást alkalmazva [Santos M. A. (1991) Nucleic Acids Rés. 19, 5442)
Nukleotidszekvenálás és -analízis
A cDNS-eket mindkét szálon megszekvenáltuk több vektoralapú és belső prímért alkalmazva az Applied Biosystems Incorporated (ABI) festékterminátor szekvenáló kitjeivel a gyártó útmutatásait követve. A szekvenciákat egy ABI Model 373A automata DNSszekvenálóval analizáltuk. A peptidhomológiaillesztéseket a BESTFIT programot (GCG, Wisconsin) alkalmazva hajtottuk végre.
Az exon/intron határok azonosítása
Az exon határok és a határoló régiók azonosítását templátként egér genomiális DNS-t vagy mVRF genomiális lambda-klónokat használó PCR-rel hajtottuk végre. A PCR-ben az intronok azonosításához használt primerek a hVRF-szekvenciából származtak, és 5-10 °Cos, a becsült Tm alatti anneálási hőmérsékletet alkalmaztunk, hogy figyelembe vegyük a lehetséges humánegér szekvenciaeltéréseket. Az összes PCR terméket méret szerint elkülönítettük agaróz-gélelektroforézissel, és géltisztításnak vetettük alá QIAquick spinoszlopokat (Qiagen) alkalmazva, és az intron/exon határokat közvetlenül ezekből a termékekből szekvenáltuk meg. Továbbá, néhány splice-illesztést is megszekvenáltunk az mVRF szubklónozott genomiális fragmenseiből. Az intron/exon határokat úgy azonosítottuk, hogy összehesonlítottuk a cDNS-t a genomiális DNSszekvenciákkal.
Northern analízis
Össz-sejt-RNS-t készítettünk friss normál felnőttegér-szövetekből (agy, vese, máj, izom) Chomczynski P. és Sacchi N. (1987) Analyt. Biochem. 162, 156-159, módszerét alkalmazva. Az össz-DNS 20 pgját elektroforetizáltuk, egy nejlonmembránra (Hybond N., Amersham) vittük át, és standard körülmények között (Church G. és Gilbert W. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 18, 1991-1995) hibridizáltuk. A szűrőket 65 °C-on 0,1 x SSC (20 χ SSC az 3M NaCL/0,3M trinátrium-citrát), 0,1% SDS-ben mostuk, és röntgenfilmre exponáltuk a szűrőket felerősítve, -70 °C-on 1-3 napon át.
Az m VRF cDNS-ek jellemzése
Egérfélék VRF homológjait izoláltunk egy egérfélék könyvtárának hVRF cDNS kiónnal történő szkrínelésével. Öt kiónt, melyek mérete 0,8-1,5 kb közötti volt, kinyertünk és megszekvenáltunk. A cDNSszekvenciákat összeillesztettük, hogy egy teljes 1041 bp hosszúságú cDNS-szekvenciát adjon, mely a teljes nyitott leolvasási keretet (621 vagy 564 bp, a splice-alaktól függően, lásd lentebb) és a 3’ UTR (379bp), valamint az 5’ UTR 163 bp-ját lefedi (lásd 9. ábra).
A megjósolt iniciációs kodon a hVRF startkodonjának helyzetéhez illeszkedik. Egy másik, kereten kívüli ATG-t lokalizáltunk a -47-es helyzetben, és két terminációs kodont figyeltünk meg upstream irányban (-9-es, illetőleg -33-as pozíciók) a feltételezett iniciációs kodonnal helyes leolvasási keretben.
Úgy tűnik, hogy a hVRF megjósolt N-terminális szignálpeptidje az mVRF-ben 81%-os egyezéssel (17/21 aminosav) van jelen. Ezek az adatok azt sejtetik, hogy az érett mVRF úgy szekretálódik és elképzelhetően úgy működik, mint egy növekedési faktor.
Hasonlóan a hVRF-hez, két nyitott leolvasási keretet (ORF) mutattunk ki a könyvtár szkrínelésével izolált cDNS-ekben. Úgy találtuk, hogy az öt klón közül négy alternatív splicing-on esett át, és hiányzik belőlük egy 10 bp-os, a hVRF 6. exonjával homológ ffagmens. Meghatároztuk az mVRF két izoformájának megjósolt peptidszekvenciáját és a megfelelő humán izoformákhoz illesztettük (10. ábra).
Az mVRF186-ot kódoló érett mRNS egy 621 bp-os ORF-et tartalmaz olyan kódolószekvenciákkal, melyek a +622-es helyzetben végződnek, a 7. exon végénél (9. ábra). A kisebbik mRNS, mely az mVRF167-et kódolja, valójában a +622-es TAG helytől downstream irányban végződik, melynek egy leolvasási keret az oka, amelyet a 10 bp-os 6. exon splicing általi kivágódása és egy stopkodon (TGA) beépülése eredményezett a +666-os helyzetben, a 8. exon kezdetének közelében (9. ábra).
Az mVRFlg6 fehéije erősen homológ a VEGF amino- és központi részével, még a karboxilvég teljesen eltérő, és alaninban gazdag. Az mVRF167 szintén rendelkezik ezekkel a hasonlóságokkal és megtartja a homoló10
HU 223 438 Β1 giát a mVEGF-hez jobbra a C-terminális felé (11. ábra). Az mVRF(67 összhomológiája a hVRF167hez 85% azonosság illetőleg 92%-os hasonlóság volt (10. ábra). Hasonlóan az mVRF167 és az mVEGF (Breier és munkatársai, 1992, fentebb) közötti hasonlóság 49%-os azonosság illetőleg 71 %-os konzervatív aminosavhelyettesítés volt (11. ábra).
Az mVRF cDNS-ben nem volt jelen a hitelesen elismert gerinces poliadenilációs szignál (AATAAA) (Bimstiel M. L., Busslinger M. és Strub K. (1985) Cell 41, 349-359), sőt mindkét egér és humán VRF cDNS-ben hasonló helyzetben egy szorosan illeszkedő GATAAA szekvencia volt jelen (9. ábra). Szemben a hVRF-fel, úgy találtuk, hogy az MVRF egy AC dinukleotidismétlődést tartalmaz a 3’ UTR szélső 3’ végén (998—1011-es nukleotidhelyzet, 9. ábra). Ennek az ismétlődő régiónak a polimorfizmusát figyeltük meg néhány mVRF cDNS-ben, ahol a dinukleotidok száma 7 és 11 között változott.
Az m VRF genomiális jellemzése
Az intron/exon határokat olyan primereket alkalmazva térképeztük, melyeket a megfelelő hVRF határokkal homológ szekvenciák szegélyeztek. Az mVRF I., III., IV. és VI. intronja kisebb volt mint a hVRF közbenső szekvenciái. A teljes genomiális szekvenciát összeállítottuk az mVRF 5’ UTR-étől az VI. intronig, mely a legnagyobb közbenső régió (2,2 kb), az mVRF amplifikállt intronjainak és klónozott genomiális részeinek megszekvenálásával. A genomiális szerkezetben csak egyetlen nagy különbség volt az mVRF és a hVRF között, és ez az volt, hogy az mVRF 7. exon/VI. intron közötti határa 10 bázispárral lejjebb helyezkedett el a cDNS-szekvenciához viszonyítva, ezért a 7. exon az mVRF-ben 10 bpral hosszabb volt minta hVRF megfelelő exonja.
Az mVRF-ben a 6. és 7. exon szomszédos, ahogy az a humán homológok esetében is megtalálható. Az erős homológia az mVRF és a hVRF 6. exonja között (10. ábra) azt sejteti, hogy ez a szekvencia nem egy megőrződött intronszekvencia, hanem inkább a VRF186 izoforma funkcionális része.
Az általános exon/intron szerkezet konzerválódott a VEGF géncsalád különböző tagjai (VEGF, PIGF, hVRF) között, és ezért nem meglepő, hogy az mVRF gén általános genomiális szerveződése nagyon hasonlít ezekhez a génekhez (12. ábra).
A korábbi összehasonlító térképezési vizsgálatok kimutatták, hogy az 1-es típusú humán sokszoros endokrin neoplázia betegség lókusza a 1 lql3 kromoszómán illeszkedik az egér 19-es kromoszómájának proximális szegmensével (Rochell J. M., Watson M. L., Oakey R. J. és Seldin M. F. (1992) Genomics 14, 26-31). Mivel a hVRF gént a humán MEN1 lokusz (lásd fentebb) 1 kb-án belülinek térképeztük, a legvalószínűbb, hogy a egérfélék VRF génje a 19-es kromoszóma centromerjének közelébe esik.
Az m VRF expressziós vizsgálatai
Felnőttegér-szövetekből (izom, szív, tüdő és máj) származó RNS Northern analízise azt mutatta, hogy az expresszió mindenütt előfordul, és elsődlegesen egy hozzávetőleg 1,3 kb méretű fő sávként fejeződik ki (14. ábra). Ez némiképp különbözik a hVRF-nél megfigyelt mintázattól, ahol két fő csíkot, egy 2,0 kb-osat és egy 5,5 kb-osat azonosítottunk mindegyik vizsgált szövetben. Az 1,3 kb-os egérfélék mRNS-e valószínűleg a rövidebb humán transzkriptumnak felel meg, és méretváltozását legvalószínűbb, hogy a hozzá tartozó 5’UTR-ek hosszának eltérése okozza.
6. példa: Egérfélék VEGF-expressziójaprenatális és posztnatális egerekben
Időzített vemhes (n=4) és fiatal felnőtt (n=2) egereket (C57 beltenyésztett törzs, ALAB, Svédország) szén-dioxiddal megöltünk, és a fontos szöveteket kiemeltük és lefagyasztottuk. A szöveteket -70 °C-on tartottuk további felhasználásig. Két gesztációs kort alkalmaztunk ebben a vizsgálatban 8 napos (E8), 14 napos, és E17 embrionális kort.
In situ hibridizációs hisztokémia
In situ hibridizációt hajtottunk végre egy már korábban leírt módon (Dagerlind A., Friberg K., Beán A. J. és Hokfelt T. (1992) Histochemistry 98, 39-49). Röviden, egy kriosztátban (Microm, Németország) keresztirányú metszeteket (14 pm) vágtunk, Probe-On lemezekre (Fisher Scientific, USA) olvasztottunk, és fekete zárt dobozokban tároltuk -70 °C-on a felhasználásig. Az mVRF-et kódoló mRNS-sel komplementer szintetikus 42-mer oligonukleotidok szekvenciája ACCACCACCTCCCTGGCATGTGGCACGTGCATAAACG (11. azonosító számú szekvencia) (komplementer a 120-161. nukleotidokkal) és
AGTTGTTTGACCACATTGCCCATGAGTTCCATGCTCAGAGGC (12. azonosító számú szekvencia) (komplementer a 162-203. nukleotidokkal) volt. A két alternatív splice alak detektálásához a GATCCTGGGGCTGGAGTGGGATGGAGTGATGTCAGCTGG (13. azonosító számú szekvencia) (komplementer az xxx-xxx nukleotidokkal) és GCGGGCAGAGGATCCTGGGGCTGTCTGGCCTCACAGCACT (14. azonosító számú szekvencia) volt. A próbákat 3’ végükön dezoxi-adenozin-alfa[tio]trifoszfáttal [35S] (NEN, USA) jelöltük terminális transzferázt alkalmazva (IBI, USA) 7-10χ 108 cpm/pg specifikus aktivitással, és a metszetekhez hibridizáltuk előkezelés nélkül 16-18 órán át 42 °C-on. A hibridizációs elegy tartalmazott 50 tf% formamidot, 4xSSC-t (1 xSSC=l,15 M NaCl és 0,015 M nátrium-citrát), 1 χ Dendhardt-oldatot (0,02% poli(vinil-pirrolidon), 0,02% BSA és 0,02% Ficoll), 1 tf% szarkozilt (N-lauroil-szarkozin, Sigma), 0,02 M foszfátpuffert (pH 7,0), 10 vegyes% dextrán-szulfátot (Pharmacia, Svédország), 250 pg/ml élesztő- tRNS-t (Sigma), 500 pg/ml hődenaturált lazacsperma- DNS-t (Sigma), és 200 mM ditiotreitolt (DTT; LKB, Svédország). A kontrollmetszeteken a próbák mindegyikét úgy ellenőriztük, hogy hússzoros fölöslegben jelöletlen próbát adtunk a hibridizációs elegyhez. Valamint a szomszédos metszetekhez egy olyan próbát adtunk, melyek nem tartoztak ehhez a vizsgálathoz, és eltérő expressziós mintázatot mutattak. A hibridizációt követően a metszeteket néhányszor 1 χ SSC-ben mostuk 55 °Con, etanolban víztelenítettük és NTB2 „nuclear track”
HU 223 438 Bl emulzióba (Kodak, USA) tettük. 3-5 hét múlva a metszeteket D-19 előhívóban előhívtuk (Kodak, USA) és fedőlemezzel lefedtük. Néhány esetben a metszeteket az emulzióba helyezés előtt egy autoradiográfiás filmmel (Beta-max autoradiográfiás film Amersham Ltd., Nagy Britannia) helyeztük szembe.
Az összes vizsgált szövet közül négy különböző próba azonos hibridizációs mintát adott. Egér-VRF-expressziót mutattunk ki már az E8 embrióban is, melynél a pozitív jelölődés leginkább az idegcsőnek megfelelő szerkezeteknél volt kimutatható. Az E14 egérembrió szagittális metszeteiben a legerősebb hibridizációs jel a szív és az idegrendszer, különösen az agykéreg felett volt megtalálható (14A. ábra). Az összes többi szövetben egy alacsonyabb szintű expresszió volt jelen. Egy későbbi gesztációs korban, az E17-nél egy magas mVRF mRNS jel csak a szívnél és a barna zsírszövetnél volt jelen a háton és a nyak körül (14B. ábra). Tisztán látható pozitív jel volt jelen a gerincvelő szürkeállományában és a nyelvben (14B. ábra).
Az expresszió az agykéregben tisztán láthatóan lecsökkent összehasonlítva a 14 napos metszettel. Az E14 embrióban látható gyenge háttérexpresszió, például az izomban, lecsökkent ebben a gesztációs korban. Erős mVRF mRNS hibridizációs jel kizárólag a szív és a barna zsírszövet felett volt jelen a fiatal felnőtt egérben (14C. ábra). A szív feletti szignál egyenletesen oszlott el a teljes kamrafal felett, magában foglalva a papilláris izmokat (14D. ábra). Hidegpróba feleslegével hibridizált szívszövet metszeteken a háttérjelen kívül nem mutattunk ki specifikus jelölődést (14E. ábra).
A szíven kívül mVRF mRNS jelek voltak jelen bizonyos szövetekben a mellkason kívül, mely morfológiailag a barna zsírszövethez hasonlított. Ezt szudánfekete festéssel igazoltuk, mellyel erős festődést mutattunk ki ugyanezeken a területeken (15A. és 15B. ábra). A felnőtt egér gerincvelőjének keresztmetszetein az mVRF próbák idegsejt-festődési mintázatot mutattak a szürkeállomány felett (15C. ábra). Toluidinnal történő festés megmutatta, hogy a ventrális szarvban lévő mozgató neuronok (15C. és 15D. ábra) és a dorzális szarv mélyebben fekvő részein és a központi csatorna körül elhelyezkedő intemeuronok (15C. ábra) azok, melyeknél nagymértékű pozitív mVRF mRNS jel volt.
7. példa: A VEGP és a SOMI 75 fehérjék hatása csirke érző neuronjaira
A VEGF és a SOM 175 fehérjék hatását a 8. embrionális nap korú csirke érző neuronjaira, Nurcombe és munkatársai módszere szerint határoztuk meg (Nurcombe és munkatársai (1992) Development 116: 1175-1183). A neuronesszét a 48. órában olvastuk le 2000 sejtet alkalmazva vizsgálati üregenként. Az eredményeket 3H-timidin-számlálással kaptuk. A neuronok százalékos túlélését, a neuritkinövést és a pm-ben mért átlagos neurithosszt úgy határoztuk meg, hogy pozitív kontrollként NGF-et alkalmaztunk, és a VEGF különböző koncentrációit és heparin jelenlétében lévő VEGF-et, és heparin és 5 μΜ 5’-fluor-uracil (5FU) jelenlétében lévő VEGF-et alkalmaztunk. 5 FU elpusztítja a gliasejteket.
Az eredményeket a 16. ábrán mutatjuk be. Az eredmények azt mutatják, hogy a VEGF hatásos a neurontúlélés elősegítésében, de ehhez a gliasejtek jelenlétére van szükség. A 17. ábra bemutatja 3 csirkegliatípuson a VEGF és a SOM 175 hatásának eredményét. A tesztelt gliasejtek CNS glia, perifériális gliasejtek és CNS oligodendrociták voltak. Mindegyik sejttenyészetben 10 pg/ml heparint alkalmaztunk, és az esszét a 24. órában olvastuk le. Az eredményeket a 3Htimidin mennyiségmérésével kaptuk 2000 sejtet alkalmazva üregenként. Az eredmények azt mutatták, hogy a központi és a perifériás neuronoknál az asztroglia proliferációját a SOM 175 jelentősen stimulálta heparin jelenlétében, de a csirkeoligodendrociták a megoszlás mértékének jelentéktelen növekedését mutatták.
8. példa: A SOMI 75 fehérjék hatásai egér primer és központi neuronjaira
A 7. példa eredményei azt mutatják, hogy a VEGF izoformája hatással van a csirke primer és központi neuronjaira az asztrogliasejtek közreműködésével. Hasonló kísérleteket hajtottunk végre egérsejteken.
Tenyésztési körülmények
Az összes in vitro kísérlethez neuronokat és gliasejteket preparáltunk és tenyésztettünk a „Methods in Neurosciences (2. kötet): Cell Culture”, szerkesztő: P. M. Conn, Academic Press, San Diego, 1990, 33-46. oldalain leírt módszerek szerint az asztrogliasejtek esetén és a 87-102. oldalakon leírtak szerint a központi neuronok esetén.
A sejteket 24 üreges tenyésztőclusterekbe (Nunc) helyeztük, poli-L-omitinnal (0,1 mg/ml, 1 óra) fedtük, 2000 sejt/üreg sűrűségnél. 48 órás tenyésztés után a neuronokat összeszámoltuk az üregekben inverz fázisú fény alatt, ismert módszereket alkalmazva (Maruta és munkatársai (1993) Growth Factors 8: 119-134), és a gliasejteket a [3H]-timidin-felvétellel mértük, hogy nyomonkövessük a sejtmegoszlás mértékét. A tenyészközegben mindig volt heparin (10 pg/ml, alacsony molekulatömegű frakció, Sigma Chemical Corp.), kivéve ahol ezt jelezzük. Az idegsejttenyészeteket 5 mM 5fluor-2-dezoxi-uridinnel (Sigma) egészítettük ki, hogy gátoljuk a háttér-glianövekedést.
3H-timidin-beépülési esszé a gliasejt-proliferáció vizsgálatára
A sejteket 14 órán át 3H-timidinnel (specifikus aktivitás 103 pCi/pg) adagokban kezeltük egy 0,1 mCi/ml törzskoncenttrátumból standard tápközegben, a végső inkubációs térfogat 20 μΐ/üreg volt. Az üregek tartalmát összegyűjtöttük, és nitrocellulóz papírra (Titertek, Flow) abszorbeáltuk. A fennmaradó adherens sejteket tripszin/verzénnel (CSL Limited, Victoria, Ausztrália) történő 5 perces inkubálással távolítottuk el. Ezt az eljárást kétszer hajtottuk végre. A nitrocellulóz lemezeket egy standard Titertek gyűjtőben (Flow) mostuk, először desztillált vizet majd metanolt alkalmazva. A nitrocellulóz lemezeket megszárítottuk, szcintillációs folyadékot (5 tf% TritonX-t tartalmaz) adtunk hozzá, és a lemezeket egy szcintillációs számlálóban mértük.
HU 223 438 Β1
A legnagyobb aktivitást az 6. exon nélküli SOMI 75 preparátumaival (SOMAX6) láttuk az egér- asztrogliasejttenyészetekben, ahol szignifikáns proliferációstimulus volt, amikor heparinnal együtt alkalmaztuk (17. ábra). Az oligodendrogliasejtek proliferációjához kicsi stimulust adott (17. ábra), és az izolált előagyneuronok túlélési válaszának nagyon kevéssé felismerhető felszabadulását okozta (18. ábra). A standard hiba mindegyik grafikon minden egyes pontjánál kevesebb mint 8% volt.
A neuronok életképessége fenntartható a gliasejtproliferáció elősegítésével. Továbbá, a S0MAX6 az asztrogliaproliferációt jól indukálja, és lehet, hogy az asztroglia-végtalpacska kialakulásával együtt fejeződik ki a központi idegrendszer endoteliális sejtjeiben.
A szakterületen jártas szakemberek tudják, hogy az itt leírt találmánynak egyéb változatai és módosításai is lehetségesek, mint amit kifejezetten leírtunk. Érthető, hogy a találmány magában foglalja az összes ilyen változatot és módosítást. A találmány szintén magában foglalja az összes olyan lépést, jellemzőt, készítményt és vegyületet, és az említett lépések vagy jellemzők közül bármely kettőnek vagy többnek bármely és minden kombinációját, melyre a leírásban önmagában vagy együttesen hivatkoztunk vagy megjelöltünk.
3. táblázat
Egérfélék VRF gén splice-illesztései
5’UTR*... 1. exon >223 bp CCCAGgtacgtgcgt I. intron 495 bp
ttccccacatGCCCC 2. exon 43 bp GAAAGgtaataatag II. intron 288 bp
ctgcccacagTGGTG 3. exon 197 bp TGCAGgtaccagggc III. intron 196 bp
ctgagcacagATCCT 4. exon 74 bp TGCAGgtgccagccc IV. intron 182 bp
ctcttttcagACCTA 5. exon 36 bp GACAGattcttggtg V. intron 191 bp
ctcctcctagGGTTG 6. exon 101 bp (nincs intron)
CCCACTCCAGCCCA 7. exon 135 bp TGTAGgtaaggagtc VI. intron ~2200 bp
cactccccagGTGCC 8. exon 394 bp AGAGATGGAGACACT
A kis- és nagybetűk az exon- illetőleg az intronszekvenciákat jelölik.
* Azt jelzi, hogy az 1. exon 5’ végét még nem határoztuk meg.
Szekvencialista (1) Általános információk:
(i) Bejelentő:
(USA-n kívüli országokban): AMRAD OPERATIONS PTY. LTD. (csak az USA-ban): Hayward N. és Weber G.
(ii) A találmány címe: Új növekedési faktor és ezt kódoló génszekvencia (iii) A szekvenciák száma: 14 (iv) Levelezési cím:
(A) Cím: Davies Collison Cave (B) Utca: 1 Little Collison Street (C) Város: Melbume (D) Állam: Victoria (E) Ország: Ausztrália (F) Postai irányítószám: 3000 (v) Számítógéppel feldolgozható forma:
(A) Hordozó típusa: floppy lemez (B) Számítógép: IBM PC kompatibilis (C) Operációs rendszer: PC-DOS/MS-DOS (D) Szoftver: Patentln Release #1.0, Version #1.25 (vi) A bejelentés adatai:
(A) Bejelentés száma: PCT (B) Bejelentés napja: 1996. február 22.
(vi) Korábbi bejelentés adatai:
(A) Bejelentés száma: AU PN1457 (B) Bejelentés napja: 1995. márc. 2.
(A) Bejelentés száma: AU PN6647 (B) Bejelentés napja: 1995. nov. 20.
(A) Bejelentés száma: AU PN7274 (B) Bejelentés napja: 1995. dec. 22.
HU 223 438 Β1 (viii) Meghatalmazott/képviselő adatai:
(A) Név: Hughes Dr. E. John L.
(C) Hivatkozási/lista szám: EJH/EK (ix) Telekommunikációs információk:
(A) Telefon: +61 3 9254 2777 (B) Telefax: +61 3 9254 2770 (2) Információk az 1. azonosító számú szekvenciához:
(i) Szekvenciajellemzők:
(A) Hossza: 649 bázispár (B) Típusa: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: DNS (ix) Jellemző:
(A) Név/Kulcs: CDS (B) Elhelyezkedés: 17...589 (xi) A szekvencia leírása: 1. azonosító számú szekvencia:
TCGGGCCTCC GAAACC ATG AAC TTT CTG CTG TCT TGG GTG CAT TGG AGC 49
Me t Asn Phe Leu Leu Ser Trp Va1 His Trp Ser
5 10
CTT GCC TTG Leu CTG Leu 15 CTC TAC CTC CAC CAT GCC Al a AAG Ly s TGG TCC CAG GCT GCA 97
Leu Al a Leu Tyr Leu Hi s Hi s 20 Trp Ser Gin 25 Al a Al a
CCC ATG GCA GAA GGA GGA GGG CAG AAT CAT CAC GAA GTG GTG AAG TTC 145
Pro Me t Al a 30 Glu Gly Gly Gly Gin 35 Asn Hi s Hi s Glu Val 40 Val Ly s Phe
ATG GAT GTC TAT CAG CGC AGC TAC TGC CAT CCA ATC GAG ACC CTG GTG 193
Me t Asp 45 Val Ty r Gin Arg Ser 50 Tyr Cy s Hi s Pro I le 55 Glu Thr Leu Val
GAC ATC TTC CAG GAG TAC CCT GAT GAG ATC GAG TAC ATC TTC AAG CCA 241
Asp 60 I le Phe Gin Glu Tyr 65 Pro As p Glu I le Glu 70 Tyr 11 e Phe Ly s Pro 75
TCC TGT GTG CCC CTG ATG CGA TGC GGG GGC TGC TGC AAT GAC GAG GGC 289
Ser Cy s Val Pro Leu 80 Me t Arg Cy s Gly Gly 85 Cy s Cy s Asn As p Glu 90 Gly
CTG GAG TGT GTG CCC ACT GAG GAG TCC AAC ATC ACC ATG CAG ATT ATG 337
Leu Glu Cy s Val 95 Pro Thr Glu Glu Ser 100 Asn I le Thr Me t Gin 105 I le Me t
CGG ATC AAA CCT CAC CAA GGC CAG CAC ATA GGA GAG ATG AGC TTC CTA 385
Arg I le Ly s 110 Pro Hi s Gin Gly Gin 115 Hi s I le Gly Glu Me t 120 Ser Phe Leu
CAG CAC AAC AAA TGT GAA TGC AGA CCA AAG AAA GAT AGA GCA AGA CAA 433
Gin Hi s 125 Asn Ly s Cy s Glu Cy s 130 Arg Pro Ly s Ly s Asp 135 Arg Al a Arg Gin
GAA AAT CCC TGT GGG CCT TGC TCA GAG CGG AGA AAG CAT TTG TTT GTA 481
Glu 140 As n Pro Cy s Gly Pro 145 Cy s Ser Glu Arg Arg 150 Ly s Hi s Leu Phe Val 155
HU 223 438 Β1
CAA GAT CCG CAG ACG TGT AAA TGT TCC TGC AAA AAC ACA GAC TCG CGT
Gin Asp Pro Gin Thr 160 Cy s Lys Cy s Ser Cy s 165 Ly s Asn Thr As p Ser 170 Arg
TGC AAG GCG AGG CAG CTT GAG TTA AAC GAA CGT ACT TGC AGA TGT GAC
Cy s Lys Al a Arg Gin Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cy s Arg Cy s Asp
175 180 185
529
577
AAG CCG AGG CGG TGAGCCGGGC AGGAGGAAGG AGCCTCCCTC AGCGTTTCGG Lys Pro Arg Arg
190
GAACCAGATC TCTCACCAGG (2) Információk a 2. azonosító számú szekvenciához:
(i) Szekvenciajellemzők:
(A) Hossza: 191 aminosav (B) Típusa: aminosav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: protein (xi) A szekvencia leírása: 2. azonosító számú szekvencia:
629
649
Me t 1 Asn Phe Leu Leu 5 Ser Trp Va 1 Hi s Trp 10 Ser Leu Al a Leu Leu 15 Leu
Tyr Leu Hi s Hi s 20 Al a Lys Trp Ser Gin 25 Al a Al a Pro Me t Al a 30 Glu Gly
G1 y Gly Gin 35 Asn Hi s Hi s Glu Val 40 Val Lya Phe Me t Asp 45 Va 1 Tyr Gin
Arg Ser 50 Tyr Cy s Hi s Pro I le 55 Glu Thr Leu Va 1 As p 60 I le Phe Gin Glu
Tyr 65 Pro Asp Glu 11 e Glu 70 Tyr I le Phe Lys Pro 75 Ser Cy s Va 1 Pro Leu 80
Me t Arg Cy s Gly Gly 85 Cy s Cy s Asn As p Glu 90 G1 y Leu Glu Cy s Va 1 95 Pro
Thr Glu Glu Ser 100 As n I le Thr Me t Gin 105 I le Me t Arg I le Ly s 110 Pro Hi s
Gin Gly Gin 115 Hi s I le Gly Glu Me t 120 Ser Phe Leu Gin Hi s 125 Asn Lys Cy s
Glu Cy s 130 Arg Pro Ly s Lys As p 135 Arg Al a Arg Gin Glu 140 Asn Pro Cy s Gly
Pro 145 Cy s Ser Glu Arg Arg 150 Lys Hi s Leu Phe Va 1 155 Gin Asp Pro Gin Thr 160
Cy s Ly s Cy s Ser Cy s 165 Ly s Asn Tn r As p Ser 170 Arg Cy s Ly s Al a Arg 175 Gin
Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cy s Arg Cy s As p Ly s Pro Arg Arg
180 185 190
HU 223 438 Β1 (2) Információk a 3. azonosító számú szekvenciához:
(i) Szekvenciajellemzók:
(A) Hossza: 1094 bázispár (B) Típusa: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: DNS (ix) Jellemző:
(A) Név/Kulcs: CDS (B) Elhelyezkedés: 3...624 (xi) A szekvencia leírása: 3. azonosító számú szekvencia:
CC ATG AGC CCT CTG CTC CGC CGC CTG CTG CTC GCC GCA CTC CTG CAG 47
Me t Ser Pro Leu Leu Arg Arg Leu Leu Leu Alá Alá Leu Leu Gin
10 15
CTG GCC CCC GCC CAG GCC CCT GTC TCC CAG CCT GAT GCC CCT GGC CAC 95
Leu Al a Pro Al a Gin 20 Al a Pro Va 1 Ser Gin 25 Pro As p Al a Pro Gly 30 Hi s
CAG AGG AAA GTG GTG TCA TGG ATA GAT GTG TAT ACT CGC GCT ACC TGC 143
Gin Arg Lys Val 35 Va 1 Ser Trp I le As p 40 Val Tyr Thr Arg Alá 45 Thr Cy s
CAG CCC CGG GAG GTG GTG GTG CCC TTG ACT GTG GAG CTC ATG GGC ACC 191
Gin Pro Arg 50 Glu Val Val Val Pro 55 Leu Thr Val Glu Leu 60 Me t Gly Thr
GTG GCC AAA CAG CTG GTG CCC AGC TGC GTG ACT GTG CAG CGC TGT GGT 239
Val Al a 65 Ly s Gin Leu Val Pro 70 Ser Cys Val Thr Val 75 Gin Arg Cys Gly
GGC TGC TGC CCT GAC GAT GGC CTG GAG TGT GTG CCC ACT GGG CAG CAC 287
Gly 80 Cys Cys Pr o As p As p 85 Gly Leu Glu Cys Va 1 90 Pro Thr Gly Gin Hi s 95
CAA GTC CGG ATG CAG ATC CTC ATG ATC CGG TAC CCG AGC AGT CAG CTG 335
Gin Va 1 Arg Me t Gin 100 I le Leu Me t I le Arg 105 Tyr Pro Ser Ser Gin 110 Leu
GGG GAG ATG TCC CTG GAA GAA CAC AGC CAG TGT GAA TGC AGA CCT AAA 383
Gly Glu Me t Ser 115 Leu Glu Glu Hi s Ser 120 Gin Cy s Glu Cys Arg 125 Pro Lys
AAA AAG GAC AGT GCT GTG AAG CCA GAC AGG GCT GCC ACT CCC CAC CAC 431
Ly s Ly s Asp 130 Ser Al a Val Lys Pro 135 As p Arg Al a Al a Thr 140 Pro Hi s Hi s
CGT CCC CAG CCC CGT TCT GTT CCG GGC TGG GAC TCT GCC CCC GGA GCA 479
Arg Pro 145 Gin Pro Arg Ser Val 150 Pro Gly Trp Asp Ser 155 Al a Pro Gly Al a
CCC TCC CCA GCT GAC ATC ACC CAT CCC ACT CCA GCC CCA GGC CCC TCT 527
Pro 160 Ser Pro Al a As p I le 165 Thr Hi s Pro Thr Pro 170 Al a Pro Gly Pro Ser 175
GCC CAC GCT GCA CCC AGC ACC ACC AGC GCC CTG ACC CCC GGA CCT GCC 575
Al a Hi s Alá Al a Pro Ser Thr Thr Ser Al a Le u Thr Pro Gly Pro Al a
180 185 190
HU 223 438 Β1
GCT GCC GCT GCC GAC GCC GCA GCT TCC TCC GTT GCC AAG GGC GGG GCT T Alá Alá Alá Alá Asp Alá Alá Alá Ser Ser Val Alá Lys Gly Gly Alá
195 200 205
AGAGCTCAAC CCAGACACCT GCAGGTGCCG GAAGCTGCGA AGGTGACACA TGGCTTTTCA GACTCAGCAG GGTGACTTGC CTCAGAGGCT ATATCCCAGT GGGGGAACAA AGGGGAGCCT GGTAAAAAAC AGCCAAGCCC CCAAGACCTC AGCCCAGGCA GAAGCTGCTC TAGGACCTGG GCCTCTCAGA GGGCTCTTCT GCCATCCCTT GTCTCCCTGA GGCCATCATC AAACAGGACA GAGTTGGAAG AGGAGACTGG GAGGCAGCAA GAGGGGTCAC ATACCAGCTC AGGGGAGAAT GGAGTACTGT CTCAGTTTCT AACCACTCTG TGCAAGTAAG CATCTTACAA CTGGCTCTTC CTCCCCTCAC TAAGAAGACC CAAACCTCTG CATAATGGGA TTTGGGCTTT GGTACAAGAA CTGTGACCCC CAACCCTGAT AAAAGAGATG GAAGGAAAAA AAAAAAAAAA (2) Információk a 4. azonosító számú szekvenciához:
(i) Szekvenciajellemzők:
(A) Hossza: 207 aminosav (B) Típusa: aminosav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: protein (xi) A szekvencia leírása: 4. azonosító számú szekvencia:
624
684
744
804
864
924
984
1044
1094
Me t 1 Ser Pro Leu Leu 5 Arg Arg Leu Leu Leu 10 Al a Al a Leu Leu Gin 15 Leu
A1 a Pro A1 a Gin 20 Al a Pro Va 1 Ser Gin 25 Pro As p Al a Pro Gly 30 Hi s Gin
Arg Ly s Val 35 Val Ser Trp Ile As p 40 Va 1 Tyr Thr Arg Al a 45 Thr Cy s Gin
Pro Arg 50 Glu Val Val Val Pro 55 Leu Thr Val Glu Leu 60 Me t Gly Thr Val
A1 a 65 Ly s G1 n Leu Va 1 Pro 70 Ser Cy s Val Thr Va 1 75 Gin Arg Cy s Gly Gly 80
Cy s Cy s Pro Asp As p 85 Gly Leu Glu Cy s Va 1 90 Pro Thr Gl y Gl n Hi s 95 Gin
Val Arg Me t Gin 100 Ile Leu Me t Ile Arg 105 Tyr Pro Ser Ser Gin 110 Leu Gly
Glu Me t Ser 115 Leu Glu Glu Hi s Ser 120 Gl n Cy s Gl u Cy s Arg 125 Pro Ly s Lys
Lys Asp 130 Ser A1 a Val Lys Pr o 135 Asp Arg Al a Al a Thr 140 Pro Hi s His Arg
Pro 145 Gin Pro Arg Ser Val 150 Pro Gly Trp Asp Ser 155 Al a Pro Gly Al a Pro 160
Ser Pro A1 a Asp Ile 165 Th r Hi s Pro Thr Pro 170 Al a Pro Gly Pro Ser 175 Al a
Hi s A1 a Alá Pro 180 Ser Thr Thr Ser Al a 185 Leu Thr Pro Gly Pro 190 Al a Al a
A1 a A1 a A1 a 195 As p Al a Al a Al a Ser 200 Ser Val Al a Ly s Gly 205 Gly Al a
HU 223 438 BI (2) Információk az 5. azonosító számú szekvenciához:
(i) Szekvenciajellemzők:
(A) Hossza: 993 bázispár (B) Típusa: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: DNS (ix) Jellemző:
(A) Név/Kulcs: CDS (B) Elhelyezkedés: 3...566 (xi) A szekvencia leírása: 5. azonosító számú szekvencia:
CC ATG AGC CCT CTG CTC CGC CGC CTG CTG CTC GCC GCA CTC CTG CAG 47
Me t Ser Pro Leu Leu Arg Arg Leu Leu Leu Alá Alá Leu Leu Gin
10 15
CTG Leu GCC A1 a CCC GCC CAG GCC CCT GTC TCC CAG CCT GAT GCC CCT GGC CAC 95
Pro A1 a G1 n 20 A1 a Pro Va 1 Ser Gin 25 Pro Asp A1 a Pro Gly 30 Hi s
CAG AGG AAA GTG GTG TCA TGG ATA GAT GTG TAT ACT CGC GCT ACC TGC 143
Gin Arg Ly s Va 1 35 Val Ser Trp I le Asp 40 Va 1 Tyr Thr Arg A1 a 45 Thr Cy s
CAG CCC CGG GAG GTG GTG GTG CCC TTG ACT GTG GAG CTC ATG GGC ACC 191
Gin Pro Arg 50 Glu Val Val Val Pro 55 Leu Thr Val Glu Leu 60 Me t Gly Thr
GTG GCC AAA CAG CTG GTG CCC AGC TGC GTG ACT GTG CAG CGC TGT GGT 239
Val A1 a 65 Ly s Gin Leu Val Pro 70 Ser Cy s Val Thr Val 75 Gin Arg Cy s Gly
GGC TGC TGC CCT GAC GAT GGC CTG GAG TGT GTG CCC ACT GGG CAG CAC 287
Gly 80 Cy s Cy s Pro As p Asp 85 Gly Leu Glu Cy s Va 1 90 Pro Thr Gly Gin Hi s 95
CAA GTC CGG ATG CAG ATC CTC ATG ATC CGG TAC CCG AGC AGT CAG CTG 335
Gin Va 1 Arg Me t Gin 100 I le Leu Me t I le Arg 105 Tyr Pro Ser Ser Gin 110 Leu
GGG GAG ATG TCC CTG GAA GAA CAC AGC CAG TGT GAA TGC AGA CCT AAA 383
Gly Glu Me t Ser 115 Leu Glu Glu Hi s Ser 120 Gin Cy s Glu Cy s Arg 125 Pro Ly s
AAA AAG GAC AGT GCT GTG AAG CCA GAT AGC CCC AGG CCC CTC TGC CCA 431
Ly s Ly s Asp 130 Ser A1 a Val Ly s Pro 135 Asp Ser Pro Arg Pro 140 Leu Cy s Pro
CGC TGC ACC CAG CAC CAC CAG CGC CCT GAC CCC CGG ACC TGC CGC TGC 479
Arg Cy s 145 Thr Gin Hi s Hi s Gin 150 Arg Pro Asp Pro Arg 155 Thr Cy s Arg Cy s
CGC TGC CGA CGC CGC AGC TTC CTC CGT TGC CAA GGG CGG GGC TTA GAG 527
Arg 160 Cy s Arg Arg Arg Ser 165 Phe Leu Arg Cy s Gin 170 Gly Arg G1 y Leu Glu 175
CTC Le u AAC Asn CCA Pro GAC As p ACC Thr 180 TGC Cy s AGG Arg TGC Cy s CGG Arg AAG Ly s 185 CTG Leu CGA Arg AGG Arg TGACACATGG 576
HU 223 438 Bl
CTTTTCAGAC TCAGCAGGGT GACTTGCCTC AGAGGCTATA TCCCAGTGGG GGAACAAAGG GGAGCCTGGT AAAAAACAGC CAAGCCCCCA AGACCTCAGC CCAGGCAGAA GCTGCTCTAG GACCTGGGCC TCTCAGAGGG CTCTTCTGCC ATCCCTTGTC TCCCTGAGGC CATCATCAAA CAGGACAGAG TTGGAAGAGG AGACTGGGAG GCAGCAAGAG GGGTCACATA CCAGCTCAGG GGAGAATGGA GTACTGTCTC AGTTTCTAAC CACTCTGTGC AAGTAAGCAT CTTACAACTG GCTCTTCCTC CCCTCACTAA GAAGACCCAA ACCTCTGCAT AATGGGATTT GGGCTTTGGT ACAAGAACTG TGACCCCCAA CCCTGATAAA AGAGATGGAA GGAAAAAAAA AAAAAAA (2) Információk a 6. azonosító számú szekvenciához:
(i) Szekvenciajellemzők:
(A) Hossza: 188aminosav (B) Típusa: aminosav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: protein (xi) A szekvencia leírása: 6. azonosító számú szekvencia:
636
696
756
816
876
936
993
Me t 1 Ser Pro Leu Leu 5 Arg Arg Leu Leu Leu 10 A1 a A1 a Leu Leu Gin 15 Leu
A1 a Pro A1 a Gin 20 A1 a Pro Val Ser Gin 25 Pro As p A1 a Pro Gly 30 Hi s Gin
Arg Ly s Val 35 Val Ser Trp I le As p 40 Va 1 Tyr Thr Arg A1 a 45 Thr Cy s Gin
Pro Arg 50 Glu Val Val Val Pro 55 Le u Thr Val Glu Leu 60 Me t Gly Thr Val
A1 a 65 Ly s Gin Leu Val Pro 70 Ser Cys Val Thr Val 75 G1 n Arg Cys Gly Gly 80
Cy s Cy s Pro As p Asp 85 Gly Leu Glu Cy s Va 1 90 Pro Thr Gly Gin Hi s 95 Gin
Val Arg Me t Gin 100 I le Leu Me t I le Arg 105 Tyr Pro Ser Ser Gin 110 Leu Gly
Glu Me t Ser 115 Leu Glu Glu Hi s Ser 120 Gin Cy s Glu Cys Arg 125 Pro Ly s Ly s
Ly s Asp 130 Ser A1 a Val Ly s Pro 135 As p Ser Pro Arg Pro 140 Leu Cy s Pro Arg
Cy s 145 Thr Gin Hi s Hi s Gin 150 Arg Pro As p Pro Arg 155 Thr Cy s Arg Cys Arg 160
Cy s Arg Arg Arg Ser 165 Phe Leu Arg Cy s Gin 170 Gly Arg Gly Leu Glu 175 Leu
Asn Pro Asp Thr 180 Cys Arg Cy s Arg Ly s 185 Leu Arg Arg
(2) Információk a 7. azonosító számú szekvenciához:
(i) Szekvenciajellemzők:
(A) Hossza: 858 bázispár (B) Típusa: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: DNS
HU 223 438 Β1 (ix) Jellemző:
(A) Név/Kulcs: CDS (B) Elhelyezkedés: 3.. .431 (xi) A szekvencia leírása: 7. azonosító számú szekvencia:
CC ATG AGC CCT CTG CTC CGC CGC CTG CTG CTC GCC GCA CTC CTG CAG 47
Me t Ser Pro Leu Leu Arg Arg Leu Leu Leu Alá Alá Leu Leu Gin
1 5 10 15
CTG GCC CCC GCC CAG GCC CCT GTC TCC CAG CCT GAT GCC CCT GGC CAC 9 5
Leu Alá Pro Alá Gin Alá Pro Val Ser Gin Pro Asp Alá Pro Gly His
20 25 30
CAG AGG AAA GTG GTG TCA TGG ATA GAT GTG TAT ACT CGC GCT ACC TGC 143
Gin Arg Lys Val Val Ser Trp Ile Asp Val Tyr Thr Arg Alá Thr Cys
35 40 45
CAG CCC CGG GAG GTG GTG GTG CCC TTG ACT GTG GAG CTC ATG GGC ACC 191
Gin Pro Arg Glu Val Val Val Pro Leu Thr Val Glu Leu Me t Gly Thr
50 55 60
GTG GCC AAA CAG CTG GTG CCC AGC TGC GTG ACT GTG CAG CGC TGT GGT 239
Val Alá Lys Gin Leu Val Pro Ser Cys Val Thr Val Gin Arg Cys Gly
65 70 75
GGC TGC TGC CCT GAC GAT GGC CTG GAG TGT GTG CCC ACT GGG CAG CAC 287
Gly Cys Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gin His
80 85 90 95
CAA GTC CGG ATG CAG ATC CTC ATG ATC CGG TAC CCG AGC AGT CAG CTG 335
Gin Val Arg Met Gin Ile Leu Me t I 1 e Arg Tyr Pro Ser Ser Gin Leu
100 105 110
GGG GAG ATG TCC CTG GAA GAA CAC AGC CAG TGT GAA TGC AGA CCT AAA 383
Gly Glu Me t Ser Leu Glu Glu His Ser Gin Cys Glu Cys Arg Pro Lys
115 120 125
AAA AAG GAC AGT GCT GTG AAG CCA GAT AGG TGC CGG AAG CTG CGA AGG 431
Lys Lys Asp Ser Alá Val Lys Pro Asp Arg Cys Arg Lys Leu Arg Arg
130 135 140
TGACACATGG CTTTTCAGAC TCAGCAGGGT GACTTGCCTC AGAGGCTATA TCCCAGTGGG 491
GGAACAAAGG GGAGCCTGGT AAAAAACAGC CAAGCCCCCA AGACCTCAGC CCAGGCAGAA 551
GCTGCTCTAG GACCTGGGCC TCTCAGAGGG CTCTTCTGCC ATCCCTTGTC TCCCTGAGGC 611
CATCATCAAA CAGGACAGAG TTGGAAGAGG AGACTGGGAG GCAGCAAGAG GGGTCACATA 671
CCAGCTCAGG GGAGAATGGA GTACTGTCTC AGTTTCTAAC CACTCTGTGC AAGTAAGCAT 731
CTTACAACTG GCTCTTCCTC CCCTCACTAA GAAGACCCAA ACCTCTGCAT AATGGGATTT 791
GGGCTTTGGT ACAAGAACTG TGACCCCCAA CCCTGATAAA AGAGATGGAA GGAAAAAAAA 851
AAAAAAA 858
(2) Információk a 8. azonosító számú szekvenciához:
(i) Szekvenciajellemzők:
(A) Hossza: 143 aminosav (B) Típusa: aminosav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: protein
HU 223 438 Β1 (xi) A szekvencia leírása: 8. azonosító számú szekvencia:
Me t 1 Ser Pro Leu Leu 5 Arg Arg Leu Leu Leu 10 Al a Al a Leu Leu Gin 15 Leu
Al a Pro Al a Gin 20 Al a Pro Val Ser Gin 25 Pro As p Al a Pro Gly 30 Hi s Gin
Arg Ly s Val 35 Val Ser Trp I le As p 40 Val Tyr Thr Arg Al a 45 Thr Cys Gin
Pro Arg 50 Glu Val Val Val Pro 55 Leu Thr Val Glu Leu 60 Me t Gly Thr Val
Al a 65 Lys Gin Leu Val Pro 70 Ser Cys Val Thr Val 75 Gin Arg Cy s Gly Gly 80
Cys Cy s Pro Asp As p 85 Gly Leu Glu Cys Va 1 90 Pro Thr Gly Gin Hi s 95 Gin
Val Arg Me t Gin 100 I 1 e Leu Me t I le Arg 105 Tyr Pro Ser Ser Gin 110 Leu Gly
Glu Me t Ser 115 Leu G1 u Glu Hi s Ser 120 Gin Cys Glu Cys Arg 125 Pro Lys Ly s
Ly s As p Ser Al a Va 1 Lys Pro As p Arg Cy s Arg Ly s Leu Arg Arg
130 135 140 (2) Információk az 9. azonosító számú szekvenciához:
(i) Szekvenciajellemzők:
(A) Hossza: 910 bázispár (B) Típusa: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: DNS (ix) Jellemző:
(A) Név/Kulcs: CDS (B) Elhelyezkedés: 3...305 (xi) A szekvencia leírása: 9. azonosító számú szekvencia:
CC ATG AGC CCT CTG CTC CGC CGC CTG CTG CTC GCC GCA CTC CTG CAG 47
Me t Ser Pro Leu Leu Arg Arg Leu Leu Leu Alá Alá Leu Leu Gin
10 15
CTG GCC CCC GCC CAG GCC CCT GTC Val TCC Ser CAG Gin 25 CCT GAT GCC CCT GGC CAC 95
Leu Al a Pro Al a Gin 20 Al a Pro Pro Asp Alá Pro Gly 30 Hi s
CAG AGG AAA GTG GTG TCA TGG ATA GAT GTG TAT ACT CGC GCT ACC TGC 143
Gin Arg Ly s Val Val Ser Trp I le Asp Val Tyr Thr Arg Al a Thr Cys
35 40 45
CAG CCC CGG GAG GTG GTG GTG CCC TTG ACT GTG GAG CTC ATG GGC ACC 191
Gin Pro Arg Glu Va 1 Val Val Pro Leu Thr Va 1 Glu Leu Me t Gly Thr
50 55 60
GTG GCC AAA CAG CTG GTG CCC AGC TGC GTG ACT GTG CAG CGC TGT GGT 239
Va 1 Al a Ly s Gin Leu Val Pro Ser Cys Va 1 Thr Va 1 Gin Arg Cy s Gly
70 75
HU 223 438 Β1
GGC TGC TGC CCT GAC GAT Asp 85 GGC CTG GAG TGT GTG CCC ACT GGG CAG CAC Gly Gin His 95 287
Gly 80 Cy s Cy s Pro Asp Gly Leu Glu Cy s Va 1 90 Pro Thr
CAA GTC CGG ATG CAG ACC TAAAAAAAAG GACAGTGCTG TGAAGCCAGA 335
Gin Val Arg Me t Gin Thr
100
CAGGGCTGCC ACTCCCCACC ACCGTCCCCA GCCCCGTTCT GTTCCGGGCT GGGACTCTGC 395
CCCCGGAGCA CCCTCCCCAG CTGACATCAC CCATCCCACT CCAGCCCCAG GCCCCTCTGC 455
CCACGCTGCA CCCAGCACCA CCAGCGCCCT GACCCCCGGA CCTGCCGCTG CCGCTGCCGA 515
CGCCGCAGCT TCCTCCGTTG CCAAGGGCGG GGCTTAGAGC TCAACCCAGA CACCTGCAGG 575
TGCCGGAAGC TGCGAAGGTG ACACATGGCT TTTCAGACTC AGCAGGGTGA CTTGCCTCAG 635
AGGCTATATC CCAGTGGGGA ACAAAGAGGA GCCTGGTAAA AAACAGCCAA GCCCCCAAGA 695
CCTCAGCCCA GGCAGAAGCT GCTCTAGGAC CTGGGCCTCT CAGAGGGCTC TTCTGCCATC 755
CCTTGTCTCC CTGAGGCCAT CATCAAACAG GACAGAGTTG GAAGAGGAGA CTGGGAGGCA 815
GCAAGAGGGG TCACATACCA GCTCAGGGGA GAATGGAGTA CTGTCTCAGT TTCTAACCAC 875
TCTGTGCAAG TAAGCATCTT ACAACTGGCT CTTCC 910 (2) Információk a 10. azonosító számú szekvenciához:
(i) Szekvenciajellemzők:
(A) Hossza: 101 aminosav (B) Típusa: aminosav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: protein (xi) A szekvencia leírása: 10. azonosító számú szekvencia:
Me t 1 Ser Pro Leu Leu 5 Arg Arg Leu Leu Leu 10 Al a Al a Leu Leu Gin 15 Leu
Al a Pro Al a Gin 20 Al a Pro Val Ser Gin 25 Pro Asp Al a Pro Gly 30 Hi s Gin
Arg Ly s Val 35 Val Ser Trp I le As p 40 Val Tyr Thr Arg Al a 45 Thr Cy s Gin
Pro Arg 50 Glu Val Va 1 Va 1 Pro 55 Leu Thr Val Glu Leu 60 Me t Gly Thr Val
Al a 65 Ly s Gin Leu Va 1 Pro 70 Ser Cy s Val Thr Val 75 Gin Arg Cy s Gly Gly 80
Cy s Cy s Pro As p Asp 85 Gly Leu Glu Cy s Val 90 Pro Thr Gly Gin Hi s 95 Gin
Va 1 Arg Met Gin Thr 100 (2) Információk all. azonosító számú szekvenciához:
(i) Szekvenciajellemzők:
(A) Hossza: 42 bázispár (B) Típusa: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: oligonukleotid (xi) A szekvencia leírása: 11. azonosító számú szekvencia:
ACCACCACCT CCCTGGGCTG GCATGTGGCA CGTGCATAAA CG 42
HU 223 438 Β1 (2) Információk a 12. azonosító számú szekvenciához:
(i) Szekvenciajellemzők:
(A) Hossza: 42 bázispár (B) Típusa: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: oligonukleotid (xi) A szekvencia leírása: 12. azonosító számú szekvencia:
AGTTGTTTGA CCACATTGCC CATGAGTTCC ATGCTCAGAG GC 42 (2) Információk a 13. azonosító számú szekvenciához:
(i) Szekvenciajellemzők:
(A) Hossza: 38 bázispár (B) Típusa: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: oligonukleotid (xi) A szekvencia leírása: 13. azonosító számú szekvencia:
GATCCTGGGG CTGGAGTGGG ATGGATGATG TCAGCTGG 38 (2) Információk a 14. azonosító számú szekvenciához:
(i) Szekvenciajellemzők:
(A) Hossza: 40bázispár (B) Típusa: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: oligonukleotid (xi) A szekvencia leírása: 14. azonosító számú szekvencia:
GCGGGCAGAG GATCCTGGGG CTGTCTGGCC TCACAGCACT 40

Claims (36)

1. Izolált polipeptid, mely a következő tulajdonságok; közül legalább egy tulajdonsággal rendelkezik:
(i) képes a vaszkuláris endoteliális sejtek szaporodásának indukálására (ii) képes kölcsönhatásba lépni az flt-l/flk-1 receptorcsaláddal; és/vagy (iii) képes indukálni a sejtmigrációt, a sejttúlélést és/vagy az alkalikus foszfatáz intracelluláris szintjének növelését, és tartalmaz
a) egy aminosavszekvenciát, amelyet a SEQ ID No: 3 nukleotidszekvencia vagy egy olyan nukleotidszekvencia kódol, amely a SEQ ID No: 3mal vagy ennek komplementer alakjával szélsőségesen szigorú körülmények között hibridizálni képes; vagy
b) a SEQ ID No: 4 szerinti aminosavszekvenciát, vagy ennek a polipeptidnek egy csonkolt alakja, amely az (i)—(iii) tulajdonságok közül legalább egyikkel rendelkezik.
2. Az 1. igénypont szerinti izolált polipeptid, amely olyan aminosavszekvenciát tartalmaz, amelyet a SEQ ID No: 3 nukleotidszekvencia kódol.
3. Az 1. igénypont szerinti izolált polipeptid, amely olyan aminosavszekvenciát tartalmaz, amelyet a SEQ ID No: 5 nukleotidszekvencia kódol.
4. Az 1. igénypont szerinti izolált polipeptid, amely olyan aminosavszekvenciát tartalmaz, amelyet a SEQ ID No: 7 nukleotidszekvencia kódol.
5. Az 1. igénypont szerinti izolált polipeptid, amely olyan aminosavszekvenciát tartalmaz, amelyet a SEQ ID No: 9 nukleotidszekvencia kódol.
6. Az 1. igénypont szerinti izolált polipeptid, amely a SEQ ID No: 4 aminosavszekvenciát tartalmazza.
7. Az 1. igénypont szerinti izolált polipeptid, amely a SEQ ID No: 6 aminosavszekvenciát tartalmazza.
8. Az 1. igénypont szerinti izolált polipeptid, amely a SEQ ID No: 8 aminosavszekvenciát tartalmazza.
9. Az 1. igénypont szerinti izolált polipeptid, amely a SEQ ID No: 10 aminosavszekvenciát tartalmazza.
10. Az 1 -9. igénypontok bármelyike szerinti izolált polipeptid, amely humán eredetű.
11. Az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti izolált polipeptid, amely képes indukálni az asztrogiális szaporodást.
12. Az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti izolált polipeptid, amely képes elősegíteni a neuronok túlélését és/vagy szaporodását emlősökben.
HU 223 438 Β1
13. Izolált nukleinsavmolekula, amely a SEQ ID No: 3 nukleotidszekvenciát, vagy egy olyan nukleotidszekvenciát tartalmaz, amely a SEQ ID No: 3 nukleotidszekvenciával vagy ennek komplementer alakjával rendkívül szélsőséges körülmények között hibridizálni képes.
14. A 13. igénypont szerinti izolált nukleinsavmolekula, amely a SEQ ID No: 3 nukleotidszekvenciát tartalmazza.
15. A 13. igénypont szerinti izolált nukleinsavmolekula, amely a SEQ ID No: 5 nukleotidszekvenciát tartalmazza.
16. A 13. igénypont szerinti izolált nukleinsavmolekula, amely a SEQ ID No: 7 nukleotidszekvenciát tartalmazza.
17. A 13. igénypont szerinti izolált nukleinsavmolekula, amely a SEQ ID No: 9 nukleotidszekvenciát tartalmazza.
18. A 13. igénypont szerinti izolált nukleinsavmolekula, amely a SEQ ID No: 4 szerinti aminosavszekvenciával rendelkező polipeptidet vagy ennek csonkolt alakját kódolja, amely a következő tulajdonságok közül legalább egy egyikkel rendelkezik:
(i) képes a vaszkuláris endoteliális sejtek szaporodásának indukálására (ii) képes kölcsönhatásba lépni az flt-l/flk-1 receptorcsaláddal; és/vagy (iii) képes indukálni a sejtmigrációt, a sejttúlélést és/vagy az alkalikus foszfatáz intracelluláris szintjének növelését.
19. A 13. igénypont szerinti izolált nukleinsavmolekula, amely egy, a SEQ ID No: 4 aminosavszekvenciával rendelkező polipeptidet kódol.
20. A 13. igénypont szerinti izolált nukleinsavmolekula, amely egy, a SEQ ID No: 6 aminosavszekvenciával rendelkező polipeptidet kódol.
21. A 13. igénypont szerinti izolált nukleinsavmolekula, amely egy, a SEQ ID No: 8 aminosavszekvenciával rendelkező polipeptidet kódol.
22. A 13. igénypont szerinti izolált nukleinsavmolekula, amely egy, a SEQ ID No: 10 aminosavszekvenciával rendelkező polipeptidet kódol.
23. A 13-22. igénypontok bármelyike szerinti izolált nukleinsavmolekula, amely a következő tulajdonságok közül legalább egy tulajdonsággal rendelkező polipeptidet kódol:
(i) képes a vaszkuláris endoteliális sejtek szaporodásának indukálására (ii) képes kölcsönhatásba lépni az fkt-l/flk-1 receptorcsaláddal; és/vagy (iii) képes indukálni a sejtmigrációt, a sejttúlélést és/vagy az alkalikus foszfatáz intracelluláris szintjének növelését, vagy ennek egy csonkolt alakját kódolja, amely az (i)—(iii) tulajdonságok közül legalább egyikkel rendelkezik.
24. A 23. igénypont szerinti izolált nukleinsavmolekula, amely egy olyan polipeptidet kódol, amely továbbá képes az asztrogliális szaporodás indukálására.
25. A 23. igénypont szerinti izolált nukleinsavmolekula, amely egy olyan polipeptidet kódol, amely továbbá képes a neuronok túlélésének és/vagy szaporodásának elősegítésére emlősökben.
26. A 13-25. igénypontok bármelyike szerinti izolált nukleinsavmolekula vagy az általa kódolt polipeptid, ahol a molekula vagy a polipeptid humán eredetű.
27. A 13-26. igénypontok bármelyike szerinti izolált nukleinsavmolekula által kódolt polipeptid elleni izolált semlegesítő antitest.
28. Az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid elleni izolált semlegesítő antitest.
29. Eljárás az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy alkalmas gazdaszervezetben, amelyet a polipeptid szintézisének megfelelő körülmények között tenyésztünk, kifejezünk egy nukleinsavmolekulát, amely az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti polipeptidet kódolja.
30. Antiszensz molekula, amely hibridizál egy, a 13-26. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsavmolekulához vagy ennek komplementeréhez.
31. Készítmény, amely egy, az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti polipeptidet, egy vagy több gyógyászatilag elfogadható vivőanyagot és/vagy hígítót tartalmaz.
32. A 13-26. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsavmolekulát tartalmazó gazdasejt.
33. Egy olyan polipeptid alkalmazása, amely a következő tulajdonságok közül legalább egy tulajdonsággal rendelkezik:
(i) képes a vaszkuláris endoteliális sejtek szaporodásának indukálására (ii) képes kölcsönhatásba lépni az fkt-l/flk-1 receptorcsaláddal; és/vagy (iii) képes indukálni a sejtmigrációt, a sejttúlélést; és/vagy az alkalikus foszfatáz intracelluláris szintjének növekedését, és tartalmaz
a) egy aminosavszekvenciát, amelyet a SEQ ID No: 1, 3, 5, 7 vagy 9 nukleotidszekvencia, vagy egy olyan nukleotidszekvencia kódol, amely a SEQ ID No: 1, 3, 5, 7 vagy 9-cel, vagy ennek komplementer alakjával szélsőségesen szigorú körülmények között hibridizálni képes; vagy
b) a SEQ ID No: 2,4, 6, 8 vagy 10 szerinti aminosavszekvenciát, vagy e polipeptid csonkolt alakjának, amely az (í)—(iii) tulajdonságok közül legalább egyikkel rendelkezik, alkalmazása gyógyszer előállítására, amely az asztrogliális szaporodást indukálja, emlősben.
34. A 33. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a polipeptid egy olyan aminosavszekvenciát tartalmaz, amelyet a SEQ ID No: 3; SEQ ID No: 5; SEQ ID No:
7 vagy a SEQ ID No: 9 nukleotidszekvencia kódol.
35. A 33. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a polipeptid a SEQ ID No: 4; SEQ ID No: 6; SEQ ID No:
8 vagy a SEQ ID No: 10 aminosavszekvenciát tartalmazza.
36. A 33-35. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a polipeptid vagy az azt kódoló nukleotidszekvencia humán eredetű.
HU 223 438 Β1
Int. Cl.7: C 12 N 15/12
52/1
HU 223 438 Β1
Int. Cl.7: C 12 N 15/12
1 TCGGCCTCC GAAACC ATG AAC TTT CTG
Met Asn Phe Leu
50 CTT GCC TTG CTG CTC TAC CTC CAC Leu Alá Leu Leu Leu Tyr Leu His
98 CCC Pro ATG GCA GAA GGA GGA GGG CAG Met Alá Glu Gly Gly Gly Gin 30 35 146 ATG GAT GTC TAT CAG CGC AGC TAC Met Asp Val Tyr Gin Arg Ser Tyr 45 50 194 GAC ATC TTC CAG GAG TAC CCT GAT Asp Ile Phe Gin Glu Tyr Pro Asp 60 65 242 TCC TGT GTG CCC CTG ATG CGA TGC Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys 80 290 CTC GAG TGT GTG CCC ACT GAG GAG Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu 95 338 CGG ATC AAA CCT CAC CAA GGC CAG Arg ily Lys Pro His Gin Gly Gin 110 115
1.(i) ábra
HU 223 438 Β1
Int. Cl.7: C 12 N 15/12
52/3
CTG TCT TGG GTG CAT TGG AGC 49
Leu Ser Trp Val His Trp Ser
5 10
CAT GCC AAG TGG TCC CAG GCT GCA 97
I • His Alá Lys Trp Ser Gin Alá Alá 20 25
AAT CAT CAC GAA GTG GTG AAG TTC 145
Asn His His Glu Val 40 Val Lys Phe TGC CAT CCA ATC GAG ACC CTG GTG 193 Cys His Pro Ile 55 Glu Thr Leu Val GAG ATC GAG TAC ATC TTC AAG CCA 241 Glu Ile Glu 70 Tyr Ile Phe Lys Pro 75 GGG GGC TGC TGC AAT GAC GAG GGC 289 Gly Gly 85 Cys Cys Asn Asp Glu 90 Gly TCC AAC ATC ACC ATG CAG ATT ATG 337 Ser 100 Asn Ile Thr Met Gin 105 Ile Met CAC ATA GGA GAG ATG AGC TTC CTA 385 His Ile Gly Glu Met 120 Ser Phe Leu
1.(ii) ábra
HU 223 438 Β1
Int Cl.7: C 12 N 15/12
52/4
386 CAG CAC AAC Gin His Asn 125 AAA TGT Lys Cys GAA Glu TGC Cys 130 AGA Arg 434 GAA AAT CCC TGT GGG CCT TGC TCA Glu Asn Pro Cys Gly Pro Cys Ser 140 145 482 CAA GAT CCG CAG ACG TGT AAA TGT Gin Asp Pro Gin Thr Cys Lys Cys
160
530 TGC AAG GCG AGG CAG CTT GAG TTA Cys Lys Alá Arg Gin Leu Glu Leu
175
578 AAG CCG AGG CGG TGAGCCGGGC AGGAG Lys Pro Arg Arg
190
630 GAACCAGATC TCTCACCAGG
1.(iii) ábra
HU 223 438 BI
Int. Cl.7: C 12 N 15/12
52/5
CCA AAG AAA GAT AGA GCA AGA CAA 433
Pro Lys Lys Asp 135 Arg Alá Arg Gin GAG CGG AGA AAG CAT TTG TTT GTA 481 Glu Arg Arg 150 Lys His Leu Phe Val 155 TCC TGC AAA AAC ACA GAC TCG CGT 529 Ser Cys 165 Lys Asn Thr Asp Ser 170 Arg AAC GAA CGT ACT TGC AGA TGT GAC 577 Asn 180 Glu Arg Thr Cys Arg 185 Cys Asp
GAAGG AGCCTCCCTC AGCGTTTCGG 629
649
1. (iv) ábra
HU 223 438 Β1
Int. Cl.7: C 12 N 15/12
52/6
52/7 52/8 | 2. (i) ábra 2. (ii) ábra 52/9 52/10 2. (iii) ábra 2.(iv) ábra 52/11 52/12 2.(v) ábra 2.(vi) ábra
HU 223 438 BI
Int. Cl.7: C 12 N 15/12
52/7
1 CC ATG AGC CCT CTG CTC CGC CGC I
Met Ser Pro Leu Leu Arg Arg
1 5
48 CTG GCC CCC GCC CAG GCC CCT GTC Leu Alá Pro Alá Gin Alá Pro Val
96 CAG AGG AAA GTG GTG TCA TGG ATA Gin Arg Lys Val Val Ser Trp He
144 CAG CCC CGG GAG GTG GTG GTG CCC · Gin Pro Arg Glu Val Val Val Pro
50 55
192 GTG GCC AAA CAG CTG GTG CCC AGC Val Alá Lys Gin Leu Val Pro Ser
65 70
240 GGC TGC TGC CCT GAC GAT GGC CTG Gly Cys Cys Pro Asp Asp Gly Leu
80 85
288 CAA GTC CGG ATG CAG ATC CTC ATG Gin Val Arg Met Gin Ile Leu Met
100
336 GGG GAG ATG TCC CTG GAA GAA CAC Gly Glu Met Ser Leu Glu Glu His
115
2.(i) ábra
HU 223 438 Β1
Int. Cl.7: C 12 N 15/12
52/8
CTG CTG CTC GCC GCA CTC CTG CAG 47
Leu Leu Leu Alá Alá Leu Leu Gin
10 15
TCC CAG CCT GAT GCC CCT GGC CAC 95
Ser Gin Pro Asp Alá Pro Gly His
GAT GTG TAT ACT CGC Asp Val Tyr Thr Arg
TTG ACT GTG GAG CTC Leu Thr Val Glu Leu
TGC GTG ACT GTG CAG Cys Val Thr Val Gin
GAG TGT GTG CCC ACT Glu Cys Val Pro Thr 90
ATC CGG TAC CCG AGC Ile Arg Tyr Pro Ser
105
AGC CAG TGT GAA TGC Ser Gin Cys Glu Cys 120
GCT ACC TGC 143 Alá Thr Cys
ATG GGC ACC 191
Met Gly Thr
CGC TGT GGT 239
Arg Cys Gly
GGG CAG CAC 287
Gly Gin His
AGT CAG CTG 335
Ser Gin Leu
110
AGA CCT AAA 383
Arg Pro Lys
125
2.(ii) ábra
HU 223 438 Β1
Int. Cl.7: C 12 N 15/12
52/9
384 AAA AAG GAC AGT GCT GTG AAG CCA Lys Lys Asp 130 Ser Alá Val Lys Pro 135 432 CGT CCC CAG CCC CGT TCT GTT CCG Arg Pro Gin Pro Arg Ser Val Pro 145 150 480 CCC TCC CCA GCT GAC ATC ACC CAT Pro Ser Pro Alá Asp Ile Thr His
160 165
528 GCC CAC GCT GCA CCC AGC ACC ACC Alá His Alá Alá Pro Ser Thr Thr
180
576 GCT GCC GCT GCC GAC GCC GCA GCT Alá Alá Alá Alá Asp Alá Alá Alá
195
2. (iii) ábra
HU 223 438 Β1
Int. Cl.7: C 12 N 15/12
52/10
GAC AGG GCT GCC ACT CCC CAC CAC 431
Asp Arg Alá Alá Thr Pro His His
140
GGC TGG GAC TCT GCC CCC GGA GCA 479
Gly Trp Asp Ser 155 Alá Pro Gly Alá CCC ACT CCA GCC CCA GGC CCC TCT 527 Pro Thr Pro 170 Alá Pro Gly Pro Ser 175 AGC GCC CTG ACC CCC GGA CCT GCC 575 Ser Alá 185 Leu Thr Pro Gly Pro 190 Alá TCC TCC GTT GCC AAG GGC GGG GCT T 624 Ser 200 Ser Val Alá Lys Gly 205 Gly Alá
2. (iv) ábra
HU 223 438 Β1 Int. Cl.’: C 12 N 15/12
52/11
AGAGCTCAAC CCAGACACCT GCAGGTGCCG
GACTCAGCAG GGTGACTTGC CTCAGAGGCT
GGTAAAAAAC AGCCAAGCCC CCAAGACCTC GCCTCTCAGA GGGCTCTTCT GCCATCCCTT j GAGTTGGAAG AGGAGACTGG GAGGCAGCAA
GGAGTACTGT CTCAGTTTCT AACCACTCTG
CTCCCCTCAC TAAGAAGACC CAAACCTCTG
CTGTGACCCC CAACCCTGAT AAAAGAGATG
2.(v) ábra
HU 223 438 Β1
Int. Cl.7: C 12 N 15/12
52/12
GAAGCTGCGA AGGTGACACA TGGCTTTTCA 684
ATATCCCAGT GGGGGAACAA AGGGGAGCCT 744
AGCCCAGGCA GAAGCTGCTC TAGGACCTGG 804
GTCTCCCTGA GGCCATCATC AAACAGGACA 864
GAGGGGTCAC ATACCAGCTC AGGGGAGAAT 924
TGCAAGTAAG CATCTTACAA CTGGCTCTTC 984
CATAATGGGA TTTGGGCTTT GGTACAAGAA 1044
GAAGGAAAAA AAAAAAAAAA 1094
2. (vi) ábra
HU 223 438 Β1
Int. Cl.7: C 12 N 15/12
52/13
52/14 52/15 3. (i) ábra 3. (ii) ábra
HU 223 438 Β1
Int. Cl.7: C 12 N 15/12
52/14
VEGF HUMÁN VEGF HUMÁN VASZKULÁRIS ENDOTÉLIÁLIS (VASZKULÁRIS 215 AA.
HOSSZ = 215
PONTSZÁM= 181 (92,4 BIT'), AZONOSSÁGOK = 33/75 (44%),
VÁRT · = 6,46-20, POZITÍVOK = 48/75
KÉRDÉS: TÁRGY: 31 HQRKWSWIDVYTRATCQPREVWPLTVEL 36 +++ W +DVY R+ C+P E +V + E NHHEWKFMDVYQRSYCHPIETLVDIFQEY KÉRDÉS: 91 PTGQHQVRMQILMIR 105 PT + + MQI+ 1+ TÁRGY: 96 PTEESNITMQIMRIK 110 PONTSZÁM = 76 (38,8 BIT ) , : VÁRT. = 0,0011,
AZONOSSÁGOK = 12/19 (63%), POZITÍVOK = 16/19
KÉRDÉS: 110 QLGEMSLEEHSQCECRPKK 128 ++GEMS +H+ CECRPKK
TÁRGY’: 116 HIGEMSFLQHNKCECRPKK 134
PONTSZÁM= 72 (36,8 BIT ) , . VÁRT = 0.0046,
AZONOSSÁGOK = 14/21 (66%), POZITÍVOK= 15/21
KÉRDÉS: 202 RCQGRGLELNPDTCRCRKLRR 222
RC +R LELN TCRC K RR
TÁRGY: 195 RCKARQLELNERTCRCDKPRR 215
PONTSZÁM= 46 (23,5 BIT, ) , VÁRT. =47.,
AZONOSSÁGOK = 6/10 (60%), POZITÍVOK = 9/10
KÉRDÉS: 187 DPRTCRCRCR 196
DP+TC+C C+
TÁRGY: 181 DPQTCKCSCK 190
3.(i) ábra
HU 223 438 Β1
Int. Cl.7: C 12 N 15/12
52/15
NÖVEKEDÉSI FAKTOR PREKURZOR (VEGF)
P = 6,4e-20 (64%)
MGTVAKQLVPSCVTVQRCGGCCPDDGLECV 90 + PSCV + RCGGCC D+GLECV
PDEIEYIFKPSCVPLMRCGGCCNDEGLECV 95
POISSON P(2) = 9rle-12 (84%)
POISSON P(3) = 3,6e-18 (71%)
POISSON P(4) = 7,3e-10 (90%)
3. (ii) ábra
HU 223 438 Bl
Int. Cl.7: C 12 N 15/12
52/16
52/17 52/18 4. (i) ábra 4.(íi) ábra 52/19 52/20 4. (iii) ábra 4.(iv) ábra
HU 223 438 Β1
Int. Cl.7: C 12 N 15/12
52/17
Gap súlyozás Hossz súlyozás Minőség
Arány
Százalékos hasonlóság
3,00 Átlagos illeszkedés 0,100 Átlagos eltérés
Ιθθζ 9 Hossz:
0,175 Gapok
Százalékos 69,703 azonosság:
1,000 -0,900 739 30
69,703
2 8 ATGAGCCCTCTGCTCCGCCGCCTGC mi i mm i 11
17 ATGAACTTTCTGCT.....GTCT. .
68 TGCAGCTGGCCCCCGCCCAGGCCCC
III III II I III III
57 TGCTGCTCTACCTCCACCATGCCAA
118 CACCAGAGGA............. ..
Illll
106 AGAAGGAGGAGGGCAGAATCATCAC
140 GTGTATACTCGC.GCTACCTGCCAG ii ni iii mi min
152 GTCTATCAGCGCAGCTA.CTGCCAT
194 T. . . . GA.....CTGTGGAGCTCAT
I II III III II
201 TCCAGGAGTACCCTGATGAGATCGA
235 CCCAGCTGCGTGACTGTGCAGCGCT
II III III I II III I
239 CCATCCTGTGTGCCCCTGATGCGAT
285 CCTGGAGTGTGTGCCCACTGGGCAG
1111111 i 11!111111111 I II
289 CCTGGAGTGTGTGCCCACTGAGGAG
4.(i) ábra
HU 223 438 Bl
Int. Cl.7: C 12 N 15/12
52/18 TGCTCGCCGCACT..........CC 1 II III 1 1 ...TGGGTGCATTGGAGCCTTGCCT 67 56 TGTCTCCCAGCCTGATGCCCCTGGC 1 1 1 1 1 1 Ifi III Ilii 117 11 1 1 1 1 III III Ilii GTGGTCCCAGGCTGCA.CCCATGGC 105 .AAGTGGTG....TCATGGATAGAT 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 III 147 11111111 1 1 1 1 1 III GAAGTGGTGAAGTTCATG....GAT 151 CCCCGGGAG...GTGGTGGTGCCCT II III 1 1 1 1 1 1 II 193 II III 111111 II CCAATCGAGACCCTGGTGGACATCT 200 GGGCACCGTGGCCAAACAGCTGGTG 1 1 1 1 1 III 1 234 1 11 1 1 III 1 GTACATCTT. . . CAA.........G 238 GTGGTGGCTGCTGCCCTGACGATGG 1 II 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 284 1 II 1 1 11 11 1 1 1 111 1 1 1 II GCGGGGGCTGCTGCAATGACGAGGG 288 CACCAAGTCCGGATGCAGAT..... 1 1 II 1 1 1 1 1 1 1 1 329 II II 11111111 TCCAACATCACCATGCAGATTATGC 338 4.(ii) ábra
HU 223 438 BI
Int. Cl.7: C 12 N 15/12
52/19
330 CCTCATGATCCGGTACC I
IMII I
339 GGATCAAACCTCA C
369 GTCCCTGGAAGAACACAGCCAGTGT
III II Ilii Ilin.
376 GAGCTTCCTACAGCACAACAAATGT
419 GTGCTGTGAAGCCAGACAGGGCTGC
I III lllll I
423 G........AGCAAGACAAG.....
469 CGTTCTGTTCCGGGCTGGGACTCTG '
I II II III II
443 ...TGTGGGCCTTGCTCAGA.....
519 CATCACCCATCCCACTCCAGCCCCA
468 ......................... ·
569 GC..........ACCACCAGCGCCC
II III
469 GCATTTGTTTGTACAA.........
609 TGCCGACGCCGCAGCTTCCTCCGTT
Ilii I III II Ilii
509 TG. CAAAAACACAGACTC. . GCGTT
657 AACCCAGACACCTGCAGGTGCCGGA
III I
554 AACGAACGTACTTGCAGATGTGACA
4. (iii) ábra
HU 223 438 Β1
Int. Cl.7: C 12 N 15/12
52/20
CGAGCAGTCAGC . . . TGGGGGAGAT
I II I Ilii I II mii
CAAG. . GCCAGCACATAGGAGAGAT
GAATGCAGACCTAAAAAAAAGGACA
Ilii Ilii III III II II I
GAATGCAGACC. . .AAAGAAAGATA
CACTCCCCACCACCGTCCCCAGCCC
I Ilii
...........AAAATCCC......
CCCCCGGAGCACCCTCCCCAGCTGA
Ilin I
...GCGGAGAA..............
GGCCCCTCTGCCCACGCTGCACCCA
I
........................A
TGACCCCCGGACCTGCCGCTGCCGC
II II I III II II I . GATCCGCAGACGTGTAAATGTTCC
GCCAAGGGCGGGGC..TTAGAGCTC
II Ilii III I III I
GC..AAGGCGAGGCAGCTTGAGTTA
AGCTGCGAAGGTGA
AGCCGAGGCGGTGA
4. (iv) ábra
368
375
418
422
468
442
518
467
568
468
608
508
656
553
695
592
HU 223 438 Bl
Int. Cl.7: C 12 N 15/12
52/21
1 52/22 52/23 52/24 í 5. (i) ábra 5(ii) ábra 5. (iii) ábra 52/25 52/26 52/27 5.(iv) ábra 5.(v) ábra 5.(vi) ábra
HU 223 438 Β! Int.Cl.’: C 12N 15/12
52/22
165SOMSQ.MSF.msf MSF:687 Type: D 1995. június 20, kedd Check:3140
VEGF165 SOMI75
SOM175-e6
SOM175-e6&7
SOM175-e4
ATGAACTTTCTGCTGTCTTGGGTG
ATGAGCCCTCTGCTCCGCCGCCTG
ATGAGCCCTCTGCTCCGCCGCCTG
ATGAGCCCTCTGCTCCGCCGCCTG
ATGAGCCCTCTGCTCCGCCGCCTG
VEGF165 SOMI75
SOM175-e6
SOM175-e6&7
SOM175-e4
CACCCATGGCAGAAGGAGGAGGGC
TGCCCCTGGCCACCAGAGGAAAGT
TGCCCCTGGCCACCAGAGGAAAGT
TGCCCCTGGCCACCAGAGGAAAGT
TGCCCCTGGCCACCAGAGGAAAGT
VEGF165 SOMI75
SOM175-e6
SOM175-e6&7
SOM175-e4
161
CCAATCGAGACCCTGGTGGACATC GTGGTGGTGCCCTTGACTG.TGGA GTGGTGGTGCCCTTGACTG.TGGA GTGGTGGTGCCCTTGACTG.TGGA GTGGTGGTGCCCTTGACTG.TGGA
VEGF165
SOM175
SOM175-e6
SOM175-e6&7
SOM175-e4
241
GATGCGATGCGGGGGCTGCTGCAA
GCAGCGCTGTGGTGGCTGCTGCCC
GCAGCGCTGTGGTGGCTGCTGCCC
GCAGCGCTGTGGTGGCTGCTGCCC
GCAGCGCTGTGGTGGCTGCTGCCC
5.(i) ábra
HU 223 438 Β1
Int. Cl.7: C 12 N 15/12
52/23
CATTGGAGCCTTGCCTTGCTGCTCTACC
CTGCTCGCCGCACTCCTGCAGCTGGCCC
CTGCTCGCCGCACTCCTGCAGCTGGCCC
CTGCTCGCCGCACTCCTGCAGCTGGCCC
CTGCTCGCCGCACTCCTGCAGCTGGCCC
AGAATCATCACGAAGTGGTGAAGTTCAT
GGTGTCATGGATAGATGTGTATACTCGC
GGTGTCATGGATAGATGTGTATACTCGC
GGTGTCATGGATAGATGTGTATACTCGC
GGTGTCATGGATAGATGTGTATACTCGC
TTCCAGGAGTACCCTGATGAGATCGAGT GCTCATGGGCACCGTGGCCAAAC..AGC GCTCATGGGCACCGTGGCCAAAC..AGC GCTCATGGGCACCGTGGCCAAAC..AGC GCTCATGGGCACCGTGGCCAAAC..AGC
TGACGAGGGCCTGGAGTGTGTGCCCACT
TGACGATGGCCTGGAGTGTGTGCCCACT
TGACGATGGCCTGGAGTGTGTGCCCACT
TGACGATGGCCTGGAGTGTGTGCCCACT
TGACGATGGCCTGGAGTGTGTGCCCACT
5.(ii) ábra
HU 223 438 Β1
Int. Cl.7: C 12 N 15/12
52/24
TCCACCATGCCAAGTGGTCCCAGGCTG. CCGCCCAGGCCCCTGTCTCCCAGCCTGA CCGCCCAGGCCCCTGTCTCCCAGCCTGA CCGCCCAGGCCCCTGTCTCCCAGCCTGA CCGCCCAGGCCCCTGTCTCCCAGCCTGA
160
GGATGTCTATCAGCGCAGCTACTGCCAT
G.....CTACCTGC. CAGCC. CCGGGAG
G.....CTACCTGC . CAGCC . CCGGGAG
G.....CTACCTGC. CAGCC. CCGGGAG
G.....CTACCTGC. CAGCC. CCGGGAG
240
ACATCTTCAAGCCATCCTGTGTGCCCCT
TGGTGCCCAG......CTGCGTGACTGT
TGGTGCCCAG......CTGCGTGACTGT
TGGTGCCCAG......CTGCGTGACTGT
TGGTGCCCAG......CTGCGTGACTGT
320
GAGGAGTCCAACATCACCATGCAGATTA GGGCAGCACCAAGTCCGGATGCAGATCC GGGCAGCACCAAGTCCGGATGCAGATCC GGGCAGCACCAAGTCCGGATGCAGATCC GGGCAGCACCAAGTCCGGATGCAGA. . .
5. (iii) ábra
HU 223 438 B1
Int. Cl.7: C 12 N 15/12
52/25
VEGF165 SOMI 7 5
SOMl75-e6
SOM175-e6&7
SOMl75-e4
VEGF165 SOMI 7 5
SOM175-e6
SOM175-e6&7
SOM175-e4
VEGF165 SOMI 7 5
SOMl75-e6
SOM175-e6&7
SOMl75-e4
VEGF165 SOMI75
SOM175-E6
SOM175-e6&7
SOM175-e4
VEGF165
SOM175
SOM175-e6
SOM175-e6&7
SOM175-e4
321
TGCGGATCAAACCTCACCAAGGCC TCATGATCCGG...TACCCGAGCA TCATGATCCGG...TACCCGAGCA TCATGATCCGG...TACCCGAGCA
401
AAGAAAGATAG........AGCAA
AAAAAGGACAGTGCTGTGAAGCCA
AAAAAGGACAGTGCTGTGAAGCCA
AAAAAGGACAGTGCTGTGAAGCCA
AAAAAGGACAGTGCTGTGAAGCCA
481
...........AAGCA........
CTCTGCCCCCGGAGCACCCTCCCC
CTCTGCCCCCGGAGCACCCTCCCC
561
A...............GATCCGCA
GCACCACCAGCGCCCTGACCCCCG
GCACCACCAGCGCCCTGACCCCCG
GCACCACCAGCGCCCTGACCCCCG
641
TTGAGTTAAACGAACGTACTTGCA
TAGAGCTCAACCCAGACACCTGCA
TAGAGCTCAACCCAGACACCTGCA
TAGAGCTCAACCCAGACACCTGCA
5.(iv) ábra
HU 223 438 Β1
Int. Cl.7: C 12 N 15/12
52/26
AGCACATAGGAGAGATGAGCTTCCTACA
GTCAGCTGGGGGAGATGTCCCTGGAAGA
GTCAGCTGGGGGAGATGTCCCTGGAAGA
GTCAGCTGGGGGAGATGTCCCTGGAAGA
GACAAGAA....AATCCCTGTGG.....
GACAGGGCTGCCACTCCCCACCACCGTC
GATAG.......................
GATAG.......................
GACAGGGCTGCCACTCCCCACCACCGTC
AGCTGACATCACCCATCCCACTCCAGCC ..........................cc
AGCTGACATCACCCATCCCACTCCAGCC
GACGTGTAAATGTTCCTGCAAAAAC. AC GACCTGCCGCTGCCGCTGCCGACGCCGC GACCTGCCGCTGCCGCTGCCGACGCCGC
GACCTGCCGCTGCCGCTGCCGACGCCGC
687
GATGTGACAAGCCGAGGCGGTGA GGTGCCGGAAGCTGCGAAGGTGA GGTGCCGGAAGCTGCGAAGGTGA . GTGCCGGAAGCTGCGAAGGTGA GGTGCCGGAAGCTGCGAAGGTGA
5. (v) ábra
HU 223 438 Bl
Int. Cl.7: C 12 N 15/12
52/27
400
GCACAACAAATGTGAATGCAGACC. . .A ACACAGCCAGTGTGAATGCAGACCTAAA ACACAGCCAGTGTGAATGCAGACCTAAA ACACAGCCAGTGTGAATGCAGACCTAAA ......................CCTAAA
480
.........GCCTTGCTCAGAGCGGAGA
CCCAGCCCCGTTCTGTTCCGGGCTGGGA
CCCAGCCCCGTTCTGTTCCGGGCTGGGA
560
.........TTTGTT.....TGTAC. .A
CCAGGCCCCTCTGCCCACGCTGCACCCA
CCAGGCCCCTCTGCCCACGCTGCACCCA
CCAGGCCCCTCTGCCCACGCTGCACCCA
640
AGACTCG. . CGTTGCAAGGCGAGGCAGC AGCTTCCTCCGTTGCCAAGGGCGGGGCT AGCTTCCTCCGTTGCCAAGGGCGGGGCT
AGCTTCCTCCGTTGCCAAGGGCGGGGCT
5.(vi) ábra
HU 223 438 Β1
Int. Cl.7: C 12 N 15/12
52/28
6.(i) ábra cn
KJ
KJ to
6.(ii) ábra
52/30
6.(iii) ábra cn
KJ •X.
ω
CM CM rfj · 0 · co ·
5 · tó 0 g tó g <
co ·
5 · « q >
5 tó CO tó
2 tó
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 tó tó 2 0 tó > tó E-. > > 0 0 co CO tó tó tó > tó tó H Oí >< tó ω H > tó
Q 0 tó g ΪΗ J tó tó tó < < tó tó Q Q tó tó >
CO
O tó
HU 223 438 Bl Int. Cl7; C 12 N 15/12 tó tó
Q < 0 > tó co u co tó
W ►J rií
O <
w < q < 0 < tó < < tó tó tó < <
tó <
tó tó tó 0 tó tó 0 tó tó tó tó cm tó F< co · tó tó CO tó 2 · 0 0 Q < 2 tó ω w f-t CO > tó 0 0 2 e-» 5 tó
< · 0 · co · 2 .· tó 0 tó tó tó <
•j tó >h o<
tó tó tó tó
2 tó
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 tó tó g 0 tó > tó E-* > > 0 0 CO CO tó tó tó > tó tó H 0 tó w << H > tó E-<
52/29
• g • q • g co tó • tó O CO • Ε-» EH tó · • < 2 tó . tó tó: tó tó 0 0 ’ O Q co tó · • tó 0 0 1 • tó tó tó · • > 0 0 • < E^ H . co 0 tó • q tó tó • tó Q Q
<4 tó 0 2 co ω w tó tó
tó tó 0 > a w 2 CO tó H tó w g g H tó tó tó
tó E-< 0 co CO tó 0 < tó *í 0 tó tó tó tó tó
Q 0 tó g tó
tó tó tó tó tó tó tó tó 0 0 W W 0 0 tó 0 2 CO tó g
tó tó 2 co
0 > tó E*· H tó
Ο» tó tó W tó tó > ’ tó ’ tó * g tó
tó 0 tó 2 ' tó g W 0 co Eh xl lej tó tó
Ό •H >
:O
K
Sin r-irtó rj 0 2 W O 5 co τ5 •<-C >
:O in μ ιοιη tó rH O g W O > CO in
KO
Ό
-H >
:O
M in
ΗΓ tó *-i 0 2 W O > co
Sin rCC tó d 0 2 w o > co g tó
'3 •3 σ N N •Η (0 cn > W cn :O O 0 •e.n3
«s >
V£)U J
ΗΓtó *-í 0 g w o > co
101 r-irtó
O g tó O > co '3
N cn cn o
x:
£m tó í 0 2 w o > co
0 tó 'p
M cn w o x: Jtn «-ΐΓ* tó H 0 g w o > co io'
HU 223 438 Β1
Int. Cl.7: C 12 N 15/12
52/30 o in <£> in t-1 in CM cH t—1 r-1 ω ω £ £ w ω
0 Οι ο in r* r—I t—I
Eh <y 0
Ch o t-H CM o in kő m o rr- r* t—I CM cn cm r-l CM
04 04
Q 04
U) 0 £ £ W W 0 0
Q 0
w ω h j ex 04 w w H tó £ ex > < H £ 04 04 ex 0 -04 04 04 £ 0 0 0 04 Eh £ CX 0 0 ex 04 q 04 0 0 S Y A T £ >4 tó £ 04 tó Eh S Y A T tó £ tó £ £ H tó £| CX Η η H £ Q O* Eh D V Y D V Y I M R I L M C S E S P A D V Y D V Y
04 04
H £ κ o* ex ω 0 0 CX 04 £ > 04 · tó tó Η H £ £ £ J
S H £ 5 tó 0 £ H 04 3 tó 0
Η H ex CX| £ £
A
Eh £
Eh
H
Q • (ii) ábra
ΙΟ
£ £ tó £ 04 £ tó tó Q £
0 0 tó tó • tó
W £ κ ex
Eh £
H > 04 04 > > H > • 04 0 0 £ σ £ < > > £ ex • < Eh Eh w £ £ 0 • tó ω £ • M tó Q £ ex ex q £ £ £ ex • Q £ 04 £ 0 £ 5 £ CX £ 0 • 2 £ £
£ 0 CX 04 0 < 0 Q 0 04 w ex < ω £ >
H E-< 04 04 > > O 0 W W A J 0 0
0 £ £ Eh Eh 04 £ 0 04 04 > CX 04 > > 0 0 < 0 0 £ 0 A w ω 04 0 04 A A CX £ C w ex 0 0 04 £ 0 < ω £ Q £ 04 0 a > Q Q
0 04 > 0
04 tó £ 04 W & CX 04
CX 0 < 0 tó CX
HU 223 438 Β1
Int. Cl.7: C 12 N 15/12
52/31
4-> 3 (0 3 fd rd Φ -H Λ O 4-1 Φ 4-> 4-> 'fd N 'fd >1 3 Φ •n ftí •d r—| -d N Ό Ü í—1 N • Φ •d ül 3 Φ Ül 44 λ: 0 'Φ Φ £ Φ Φ d 'fd > 'Γ1 4-1 Φ N >1 Λί d Φ N •d CM Λί tP Φ X-X 'Φ 1—1 ül d 00 :3 o N X 43 :3 Φ 4-1 43 oi 3 Φ d 44 £ 01 N -rí Ψ4 Φ O Ή 'Φ Φ d CL 4-> ül Ό 4-1 44 Φ fd χ—X O rd ω 3 Ό 44 o¥> Ό 4-1 £ 00 d •rí · fd σι 4-1 4-1 0 1 Φ rd Λί Φ 4-> σι fd 0 43 3 0 3 i—1 1 —' 4-1 Ό •d Φ Ό 4-> m Ift 3 Ό tn · Φ 43 3 N (0 f-1 ül £ i—1 0 — 4-1 O '3 fd b-i 0 'fd W d N 4-1 > 0 1 4-1 > > Φ ül Φ 'fd fd ω oY> 'fd d M-4 -d X >1 1—1 oi > Γ- -H Φ fd i O Φ σι td o • CM Cp N Cu 4-» '3 3 4-1 > Ό 3 >10 Φ d 4-> fd 1—1 rd o σ> q o i—1 Γ-d 3 £ Φ oi Φ O 44 O P4 00 :3 *o <d fd d O 4-1 £ 43 xr 1 d d 43 'Φ 3 1 0 fd r- 3 Φ Λί Ό -d in KO 43 3 1 •d 4-1 φ -d CM N £ Φ 44 ftí 3 o >1 □ fd fd íd ül 44 3 > -d •d '0 i—i 'fd fd 0 o φ •rí 4-J i—1 i—1 4-1 φ N -d 1—1 rd W 1 4-1 i—1 'd fd cp ftí £ -d ü fd σι > ÓP Φ 0 rd > 4-1 d 3 > rd O i—1 Ό 3 3 - Φ Φ 'fd fd O =3 3 0 00 £ 4-1 £ > 01 fd rd d 0 ül CM r- r—1 Φ -d Λί 'fd n fd Φ tn fd r- 1 σι 4-1 44 Ό Φ 4-> ω i 44 4-1 43 1 3 1 '(0 Ό 0 N 'd ül 'fd fd >1 Φ 3 •d 3 •sr -d 44 £ oi rd O •d 3 fd Cp n -d Φ •d CM Oi:O O 0 43 σι 3 '3 üi Φ 44 i—1 r—1 Ό íd > Ό td 3 Ül 4-1 N o rd tP 0 'fd οι i—1 > o rd :0 N ül d ül 0 <d ω 4-1 Φ 0 44 *O ül -d Λ'Φ £ > > rd -n £ i—1 O d -d Ο 0 'd 44 φ rd 0 :3 N 44 44 O CM 43 4-> Φ 4-» — φ 43 rd fd Φ Φ Γ- σι CM (d 3 •—1 4-1 Φ >i 3 s. Γ 00 rd w > N o N in -Q 3 .d N 1 o Γ l 1 0 d oi N fd fd r- Φ φ ül 3 r~ 1 3 3 1 Φ Φ 'fd £ rd 3 ül £ Φ •d 1 3 •d •d oY5 N > d i—1 4-1 Φ :O > Φ 3 -d Φ Φ O 3 4-> fd 4-1 s N 3 V 4-1 • · 4-1 •d 3 4-> 4-> O Ο N 'fd 4-1 -.3 o Φ Ό 44 N N N td -d N N ί-1 r4 ül d >1 co i—1 :O ül fd 01 o CP ül ül 'Φ N Íd tP Φ :3 >Ι'Φ N -d d d •H •d rd d 4-> Φ Ό tP d O CL. <d o o
(0
HU9800377A 1995-03-02 1996-02-22 Új növekedési faktor és ezt kódoló génszekvencia HU223438B1 (hu)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AUPN1457A AUPN145795A0 (en) 1995-03-02 1995-03-02 A novel growth factor and a genetic sequence encoding same
AUPN6647A AUPN664795A0 (en) 1995-11-20 1995-11-20 A novel growth factor and a genetic sequence encoding same
AUPN7274A AUPN727495A0 (en) 1995-12-22 1995-12-22 A novel growth factor and a genetic sequence encoding same-II
PCT/AU1996/000094 WO1996027007A1 (en) 1995-03-02 1996-02-22 A novel growth factor and a genetic sequence encoding same

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP9800377A1 HUP9800377A1 (hu) 1998-06-29
HUP9800377A3 HUP9800377A3 (en) 2000-12-28
HU223438B1 true HU223438B1 (hu) 2004-07-28

Family

ID=27157841

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9800377A HU223438B1 (hu) 1995-03-02 1996-02-22 Új növekedési faktor és ezt kódoló génszekvencia

Country Status (16)

Country Link
US (1) US20070135344A1 (hu)
EP (1) EP0815221B1 (hu)
JP (2) JPH11500139A (hu)
KR (1) KR100414615B1 (hu)
CN (1) CN1194090C (hu)
AT (1) ATE252600T1 (hu)
BR (1) BR9607628A (hu)
CA (1) CA2214439C (hu)
DE (1) DE69630442T2 (hu)
ES (1) ES2206558T3 (hu)
FI (1) FI120153B (hu)
HK (1) HK1002963A1 (hu)
HU (1) HU223438B1 (hu)
NO (1) NO320839B1 (hu)
NZ (2) NZ301611A (hu)
WO (1) WO1996027007A1 (hu)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5928939A (en) 1995-03-01 1999-07-27 Ludwig Institute For Cancer Research Vascular endothelial growth factor-b and dna coding therefor
WO1996039421A1 (en) * 1995-06-06 1996-12-12 Human Genome Sciences, Inc. Human vascular endothelial growth factor 3
PT848755E (pt) 1995-09-08 2003-12-31 Genentech Inc Proteina relacionada com o vegf
DE69634412T3 (de) 1995-09-29 2013-07-04 Vegenics Pty Ltd Regulierte gene und ihre verwendungen
AU1116297A (en) 1995-11-08 1997-05-29 Immunex Corporation Flk-1 binding protein
US6994989B1 (en) 1995-11-08 2006-02-07 Immunex Corp. FLK-1 binding proteins
DK0956339T3 (da) 1996-08-23 2006-01-30 Licentia Oy Rekombinant vaskulær endotelcellevækstfaktor D (VEGF-D)
JP2001524828A (ja) * 1997-04-25 2001-12-04 コラテラル・セラピューティクス 切断型ｖｅｇｆ関連蛋白質
JP2002502608A (ja) 1998-02-06 2002-01-29 コラテラル・セラピューティックス・インコーポレイテッド 血管新生促進因子である血管内皮細胞成長因子：ｖｅｇｆの変異体
ATE451389T1 (de) 1998-11-10 2009-12-15 Ludwig Inst Cancer Res Von blutplättchen abstammender wachstumsfaktor d, dafür kodierende dns und deren verwendungen
US7105481B2 (en) 1998-11-10 2006-09-12 Ludwig Institute For Cancer Research Method for stimulating connective tissue growth or wound healing
JP4739526B2 (ja) 1998-12-07 2011-08-03 ザイモジェネティクス， インコーポレイテッド 成長因子相同体ｚｖｅｇｆ３
US6783953B1 (en) 1998-12-22 2004-08-31 Janssen Pharmaceutica N.V. Vascular endothelial growth factor-X
AUPQ568100A0 (en) * 2000-02-16 2000-03-09 Amrad Operations Pty. Limited A method for producing recombinant molecules
US7026462B2 (en) 2000-12-07 2006-04-11 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of angiogenesis with zinc finger proteins
US7067317B2 (en) 2000-12-07 2006-06-27 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of angiogenesis with zinc finger proteins
US7981863B2 (en) * 2001-09-19 2011-07-19 Neuronova Ab Treatment of Parkinson's disease with PDGF
US7358085B2 (en) 2005-02-28 2008-04-15 Sangamo Biosciences, Inc. Anti-angiogenic methods and compositions
CN100448892C (zh) * 2006-08-02 2009-01-07 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 抗肿瘤血管内皮生长因子受体vegf－r2抗原及其编码基因与应用

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5073492A (en) * 1987-01-09 1991-12-17 The Johns Hopkins University Synergistic composition for endothelial cell growth
US5332671A (en) * 1989-05-12 1994-07-26 Genetech, Inc. Production of vascular endothelial cell growth factor and DNA encoding same
US5219739A (en) * 1989-07-27 1993-06-15 Scios Nova Inc. DNA sequences encoding bVEGF120 and hVEGF121 and methods for the production of bovine and human vascular endothelial cell growth factors, bVEGF120 and hVEGF121
US5194596A (en) * 1989-07-27 1993-03-16 California Biotechnology Inc. Production of vascular endothelial cell growth factor
US5338671A (en) * 1992-10-07 1994-08-16 Eastman Kodak Company DNA amplification with thermostable DNA polymerase and polymerase inhibiting antibody
ES2249762T3 (es) * 1994-03-08 2006-04-01 Human Genome Sciences, Inc. Factor de crecimiento del endotelio vascular 2.
US5607918A (en) * 1995-03-01 1997-03-04 Ludwig Institute For Cancer Research Vascular endothelial growth factor-B and DNA coding therefor
US5928939A (en) * 1995-03-01 1999-07-27 Ludwig Institute For Cancer Research Vascular endothelial growth factor-b and dna coding therefor

Also Published As

Publication number Publication date
HUP9800377A3 (en) 2000-12-28
BR9607628A (pt) 1999-11-30
FI973571A0 (fi) 1997-09-01
DE69630442D1 (de) 2003-11-27
HK1002963A1 (en) 1998-09-30
DE69630442T2 (de) 2004-08-19
WO1996027007A1 (en) 1996-09-06
CN1224464A (zh) 1999-07-28
JPH11500139A (ja) 1999-01-06
NZ301611A (en) 2000-02-28
JP2001037493A (ja) 2001-02-13
NO974035L (no) 1997-11-03
KR100414615B1 (ko) 2004-05-27
ATE252600T1 (de) 2003-11-15
NO320839B1 (no) 2006-01-30
KR19980702702A (ko) 1998-08-05
FI120153B (fi) 2009-07-15
EP0815221B1 (en) 2003-10-22
CN1194090C (zh) 2005-03-23
FI973571A (fi) 1997-10-30
ES2206558T3 (es) 2004-05-16
CA2214439A1 (en) 1996-09-06
JP3683778B2 (ja) 2005-08-17
NZ337634A (en) 2001-06-29
HUP9800377A1 (hu) 1998-06-29
NO974035D0 (no) 1997-09-02
US20070135344A1 (en) 2007-06-14
EP0815221A1 (en) 1998-01-07
EP0815221A4 (en) 1998-12-09
CA2214439C (en) 2002-12-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20070135344A1 (en) Novel growth factor and a genetic sequence encoding same
KR100924183B1 (ko) 신규 섬유아세포 성장 인자 (ｆｇｆ23) 및 그의 이용 방법
CA2160937C (en) Survival motor neuron (smn) gene: a gene for spinal muscular atrophy
Schaeren‐Wiemers et al. Identification of new oligodendrocyte‐and myelin‐specific genes by a differential screening approach
US5814478A (en) Tyrosine kinase receptors and ligands
JP4403443B2 (ja) Ｌｙ６ｈ遺伝子
Heller et al. Analysis of function and expression of the chick GPA receptor (GPAR α) suggests multiple roles in neuronal development
KR100227240B1 (ko) 섬모형 신경성인자 수용체
US6413740B1 (en) Tyrosine kinase receptors and ligands
EP0960937B1 (en) Novel semaphorin gene: semaphorin y
PT97821A (pt) Processo de preparacao de sequencias de acido nucleico e de aminoacidos de cntfr de preparacao de sistemas de ensaio e de composicoes farmaceuticas,e processo de diagnostico e de identificacao de moleculas homologas a cntf e cntfr
AU707513B2 (en) A novel growth factor and a genetic sequence encoding same
US7160991B1 (en) Vascular endothelial growth factor polypeptides
KR20030074588A (ko) 글리코실화 ｖｅｇｆ-ｂ 및 가용성 ｖｅｇｆ-ｂ 의 양을증가시키는 방법
WO1998022504A1 (fr) Nouveaux genes de semaphorine (i)
PL185293B1 (pl) Izolowany polipeptyd, izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, sposób otrzymywania polipeptydu, cząsteczka antysensowna, środek farmaceutyczny, komórka gospodarza oraz wektor
US6291651B1 (en) Antibodies to a novel src-family kinase
US5952213A (en) Src-family kinase and methods of use thereof
JP2000300264A (ja) リンパ−造血細胞の増殖を抑制するタンパク質
CA2455413A1 (en) Mammalian neuralized family transcriptional regulators and uses therefor
WO1997017982A1 (en) Methods and compositions for hair growth promotion
US6268216B1 (en) Reagents and methods for the screening of compounds useful in the treatment of neurological diseases
US6384204B1 (en) Reagents and methods for the screening of compounds useful in the treatment of neurological diseases
CA2357987A1 (en) Genetic sequence related to bone diseases

Legal Events

Date Code Title Description
HFG4 Patent granted, date of granting

Effective date: 20040510