FI120153B - Uusi kasvutekijä ja sitä koodaava geenisekvenssi - Google Patents

Description

* «

Uusi kasvutekijä ja sitä koodaava geenisekvenssi - En ny växtfaktor och en for denna kodande gensekvens

Esillä oleva keksintö koskee yleisesti ottaen eristettyä molekyyliä, jolla on verisuon-5 ten endoteelin kasvutekijän kaltaisia ominaisuuksia, ja sitä koodaavaa geenisekvenssiä. Molekyyliä voidaan käyttää kehitettäessä erilaisia terapeuttisia ja diagnostisia aineita, joita voidaan käyttää hoidettaessa, ehkäistäessä ja/tai diagnosoitaessa tiloja, jotka vaativat lisääntynyttä tai vähentynyttä verisuonittumista ja/tai verisuonten permeabiliteettia. Esillä olevan keksinnön mukaista molekyyliä voidaan käyttää 10 myös primaaristen ja sentraalisten hermosolujen efektorina ja se pystyy indusoimaan astrogliasolujen proliferaatiota.

Bibliograafiset yksityiskohdat julkaisuista, joihin kirjoittaja tässä patenttiselityksessä viittaa, on koottu selityksen loppuun. Nukleotidi- ja aminohapposekvenssien, joihin tässä selityksessä viitataan, sekvenssien identifiointinumerot (SEQ ID NO) määri-15 tellään kirjallisuusviitteiden jälkeen.

Koko tässä selityksessä, jollei yhteys muuta edellytä, sana "käsittää" tai sellaiset variaatiot kuin "käsittävät" tai "käsittäen" ovat tarkoitetut sisältämään jonkin mainitun osan tai kokonaisuuden tai osien tai kokonaisuuksien ryhmän, mutta ei sulkemaan pois mitään muuta osaa tai kokonaisuutta tai osien tai kokonaisuuksien ryhmää.

• · ;·. 20 Verisuonten endoteelin kasvutekijä (tästedes nimellä "VEGF", vascular endothelial • · · ! ^ growth factor), joka tunnetaan myös vasoaktiivisena läpäisevyystekijänä, on sekre- ;;V toituva, kovalenttisesti sitoutunut homodimeerinen glykoproteiini, joka aktivoi spe-• · · ♦1 sifisesti endoteelikudoksia (Senger et ai, 1993). VEGF:n ominaisuuksiksi on luettu : ** joukko toimintoja, kuten esimerkiksi osallistuminen normaaliin angiogeneesiin, cor-··» : 25 pus luteumin muodostuminen (Yan et ai, 1993) ja istukan kehittyminen mukaanluettuina (Sharkey et ai, 1993), verisuonten läpäisevyyden säätelyyn (Senger et ai, 1993), tulehdukselliseen angiogeneesiin (Sunderkotter et ai., 1994) ja autotransplan-:1·1: taatioon (Dissen et ai, 1994) ja ihmisen sellaisiin tauteihin kuten kasvaimia edistä- .1. vään angiogeneesiin (Folkman & Shing, 1992), nivelreumaan (Koch et ai, 1994) ja • · *···[ 30 diabetekseen liittyvään retinopatiaan (Folkman & Shing, 1992).

• · # , VEGF on siis tärkeä molekyyli ja se tekee siitä potentiaalisesti arvokkaan kohteen • · tutkittaessa VEGF:ään tai sen vaikutuksiin perustuvia terapeuttisia, profylaktisia ja ** diagnostisia aineita. Tarpeen olisi myös tunnistaa homologeja tai muuten läheisesti VEGF:ää muistuttavia molekyylejä, joita voitaisiin käyttää VEGF.n vaihtoehtona tai VEGF:n yhteydessä.

2

Työssä, joka johti esillä olevaan keksintöön, tekijät etsivät mahdollista geeniä, joka koodaisi multippeliendokriinineoplasia tyyppi I:tä. (MENI). Yllättävästi keksinnön 5 tekijät havaitsivat, että eräs geenisekvenssi, joka oli hylätty MENI-geenin ehdokkaana, oli kuitenkin uusi kasvutekijä, joka oli jonkin verran samankaltainen VEGF.n kanssa. Lisäksi esillä olevan keksinnön mukainen kasvutekijä on primaarisiin ja sentraalisiin neuroneihin vaikuttava molekyyli.

Niinpä esillä olevan keksinnön eräs aspekti käsittää biologisesti eristetyn proteiini-10 molekyylin, joka käsittää aminohapposekvenssin, joka: (i) on vähintään noin 15-prosenttisesti samankaltainen kuin SEQ ID NO:2:ssa esitetty aminohapposekvenssi; ja (ii) on vähintään 5-prosenttisesti erilainen kuin SEQ ID NO:2:ssa esitetty aminohapposekvenssi.

15 Toinen esillä olevan keksinnön aspekti koskee biologisesti eristettyä proteiinimole-kyyliä, jolla on seuraavat ominaisuudet: (i) se käsittää aminohapposekvenssin, joka on vähintään noin 15-prosenttisesti samankaltainen, mutta vähintään 5-prosenttisesti erilainen kuin koko SEQ ID NO:2:ssa esitetty aminohapposekvenssi tai osa siitä, *:**: 20 (ii) sillä on vähintään yksi VEGF:n kanssa yhteinen ominaisuus.

• · • · · | . Esillä olevan keksinnön eräs läheisesti siihen liittyvä aspekti koskee biologisesti i:V eristettyä proteiinimolekyyliä, jolla on seuraavat ominaisuudet: • · · ; ·* (i) se käsittää aminohapposekvenssin, joka on vähintään noin 15-prosenttisesti sa- : ’* mankaltainen, mutta vähintään noin 5-prosenttisesti erilainen kuin SEQ ID NO:2:ssa • · · ·.· ; 25 esitetty aminohapposekvenssi; (ii) sillä on vähintään yksi seuraavista ominaisuuksista: (a) kyky indusoida verisuonten endoteelisolujen proliferaatiota; : T: (b) kyky olla vuorovaikutuksessaflt-1 Iflk-1 -reseptoriperheen kanssa; (c) kyky indusoida solujen migratoitumista, solujen eloonjäämistä ja/tai alkalisen • · *···' 30 fosfataasin solunsisäisen tason nousua.

• · "Biologisesti eristetty" tarkoittaa, että molekyyli on käynyt läpi ainakin yhden vai- • · .VI heen, jossa se on puhdistettu jostakin biologisesta lähteestä. Molekyyli on edullisesti • ** myös biologisesti puhdas, mikä tarkoittaa, että koostumus sisältää vähintään noin 20 %, mieluummin vähintään noin 40 %, vielä mieluummin vähintään noin 65 %, 35 vieläkin mieluummin vähintään noin 80 - 90 % tai enemmän molekyyliä painon tai 3 aktiivisuuden perusteella tai muulla sopivalla tavalla laskettuna verrattuna muihin koostumuksen komponentteihin. Edullisimmin molekyyli on sekvenssiltään puhdas.

Esillä olevan keksinnön toinen edullinen aspekti koskee rekombinanttimuodossa olevaa molekyyliä.

5 Esillä olevan keksinnön tämän aspektin mukaan kysymyksessä on rekombinanttimo-lekyyli, joka käsittää aminohapposekvenssin, joka: (i) on vähintään noin 15-prosenttisesti samankaltainen kuin SEQ ID NO:2:ssa esitetty aminohapposekvenssi; ja (ii) on vähintään 5-prosenttisesti erilainen kuin SEQ ID NO:2:ssa esitetty amino- 10 happosekvenssi.

Toinen esillä olevaan keksintöön liittyvä aspekti on rekombinanttimolekyyli, jolla on seuraavat ominaisuudet: (i) se käsittää aminohapposekvenssin, joka on vähintään noin 15-prosenttisesti samankaltainen, mutta vähintään noin 5-prosenttisesti erilainen kuin koko 15 SEQ ID NO:2:ssa esitetty aminohapposekvenssi tai osa siitä; (ii) sillä on ainakin yksi VEGF.n kanssa yhteinen ominaisuus.

Eräs esillä olevan keksinnön toinen aspekti koskee rekombinanttimolekyyliä, jolla on seuraavat ominaisuudet: ·:··· (i) se käsittää aminohapposekvenssin, joka on vähintään noin 15-prosenttisesti sa- :\<t 20 mankaltainen, mutta vähintään noin 5-prosenttisesti erilainen kuin SEQ ID NO:2:ssa : esitetty aminohapposekvenssi; ••V (ii) sillä on vähintään yksi seuraavista ominaisuuksista: • · I. * (a) kyky indusoida verisuonten endoteelisolujen proliferaatiota; :* (b) kyky olla vuorovaikutuksessa flt-1 Iflk-1 reseptoriperheen kanssa; • · · '·' 25 (c) kyky indusoida solujen migratoitumista, solujen eloonjäämistä ja/tai alkalisen fosfataasin solunsisäisen tason nousua.

• · • · • · ·

Esillä oleva keksintö koskee myös genomisia tai osittain genomisia klooneja, jotka '· koodaavat proteiinimolekyyliä, joka on vähintään noin 15-prosenttisesti samankal- täinen, mutta vähintään noin 5-prosenttisesti erilainen kuin SEQ ID NO: 1.

• · 30 Aminohapposekvenssi SEQIDNO:2 vastaa ihmisen VEGF:ä (nimitetään tässä • · ·...· "VEGF165":ksi). Esillä olevan keksinnön mukainen molekyyli on siis VEGF:n kai- • · · : .* täinen eli se on VEGF:n homologi, mutta käsittää aminohapposekvenssin, joka on samankaltainen, mutta ei identtinen VEGF.n aminosekvenssin kanssa. Vaikka esillä olevassa keksinnössä esimerkkinä esitetään ihmisen VEGF:n kaltainen molekyyli, 4 näin tehdään pitäen selvänä, että tämä keksintö koskee yhtä hyvin homologista molekyyliä ja sitä koodaavaa sekvenssiä, joka on peräisin muista nisäkkäistä, kuten kotieläimistä (esimerkiksi lampaista, sioista, hevosista ja lehmistä), lemmikkieläimistä (esimerkiksi hiiristä, rotista, kaniineista ja marsuista) sekä ei-nisäkkäistä, kuten lin-5 nuista (esimerkiksi kanalinnuista), kaloista ja matelijoista. Edullisimmassa toteutus-muodossa VEGF:n kaltainen molekyyli on peräisin ihmisestä ja sitä koodaa geeni, joka sijaitsee kromosomissa 1 lql3. Esillä oleva keksintö koskee siis myös genomi-seen sekvenssiin, joka koodaa kohteena olevaa VEGF:n kaltaista molekyyliä, tai osaan siitä.

10 Samankaltaisuusprosentti on edullisesti vähintään noin 30 %, mieluummin vähintään noin 40 %, vielä edullisemmin vähintään noin 50 %, vieläkin edullisemmin vähintään noin 60 - 70 %, ja edelleen edullisemmin vähintään noin 80 -95 % verrattuna koko aminohapposekvenssiin SEQ ID NO:2 tai osaan siitä.

Eräässä erityisen edullisessa toteutusmuodossa esillä olevan keksinnön mukainen 15 VEGF:n kaltainen molekyyli käsittää aminohapposekvenssin SEQIDNO:4 tai on sen osa, fragmentti, johdos tai analogi. Erityisen edullisesti samankaltaisuuksia on noin 19-20 %, ja 29 - 30 %. Tässä tehdyt viittaukset johdoksiin sisältävät myös silmukoidut variantit. Niinpä esillä oleva keksintö koskee SOM175:n silmukoituja variantteja. Esimerkkejä esillä olevan keksinnön kohteena olevista silmukoiduista . 20 varianteista ovat, rajoittumatta kuitenkaan niihin, variantit, jotka käsittävät aminohapposekvenssin, joka olennaisesti samankaltainen kuin vähintään yksi sekvensseis-' ** tä SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8 ja/tai SEQ ID NO: 10 tai jokin niiden mutanteista tai i johdoksista tai edelleen silmukoiduista varianteista.

• · · • · · • · :·, Eräs toinen toteutusmuoto koskee rekombinanttimolekyyliä, jolla on seuraavat omi- • · · 25 naisuudet: • · · « « · * (i) aminohapposekvenssi, joka on olennaisesti kuten SEQ ID NO:4 tai se on vähintään noin 15-prosenttisesti samankaltainen kuin koko mainittu aminohapposekvenssi • · • ** tai osa siitä, edellyttäen, että mainittu aminohapposekvenssi on vähintään noin 5- • · · : prosenttisesti erilainen kuin koko aminohapposekvenssi SEQ ID NO:2 tai osa siitä; .··*. 30 (ii) sillä on vähintään yksi VEGF:n kanssa yhteinen biologinen ominaisuus.

• · ·

Eräs toinen toteutusmuoto koskee rekombinanttimolekyyliä, jolla on seuraavat tun-nusmerkit: • · · ·*·': (i) aminohapposekvenssi, joka on olennaisesti kuten SEQ ID NO:6 tai se on vähin- • · tään noin 15-prosenttisesti samankaltainen kuin koko mainittu aminohapposekvenssi 35 tai osa siitä, edellyttäen, että mainittu aminohapposekvenssi on vähintään noin 5- 5 prosenttisesti erilainen kuin koko aminohapposekvenssi SEQ ID NO:2 tai osa siitä; (ii) sillä on vähintään yksi VEGF:n kanssa yhteinen biologinen ominaisuus.

Eräs toinen toteutusmuoto koskee rekombinanttimolekyyliä, jolla on seuraavat ominaisuudet: 5 (i) aminohapposekvenssi, joka on olennaisesti kuten SEQ ID NO:8 tai se on vähin tään noin 15-prosenttisesti samankaltainen kuin koko mainittu aminohapposekvenssi tai osa siitä, edellyttäen, että mainittu aminohapposekvenssi on vähintään noin 5-prosenttisesti erilainen kuin koko aminohapposekvenssi SEQ ID NO:2 tai osa siitä; (ii) sillä on vähintään yksi VEGF:n kanssa yhteinen biologinen ominaisuus.

10 Eräs toinen toteutusmuoto koskee rekombinanttimolekyyliä, jolla on seuraavat ominaisuudet: (i) aminohapposekvenssi, joka on olennaisesti kuten SEQ ID NO: 10 tai se on vähintään noin 15-prosenttisesti samankaltainen kuin koko mainittu aminohapposekvenssi tai osa siitä, edellyttäen, että mainittu aminohapposekvenssi on vähintään 15 noin 5-prosenttisesti erilainen kuin koko aminohapposekvenssi SEQ ID NO:2 tai osa siitä; (ii) sillä on vähintään yksi VEGF:n kanssa yhteinen biologinen ominaisuus.

Sellaisia VEGF:n ominaisuuksia ovat vähintään yksi seuraavista: (a) kyky indusoida verisuonten endoteelisolujen proliferaatiota; ....: 20 (b) kyky olla vuorovaikutuksessa fit-1 Iflk-1 reseptoriperheen kanssa; « · .. (c) kyky indusoida solujen migratoitumista, solujen eloonjäämistä ja/tai alkalisen l [' fosfataasin solunsisäisen tason nousua.

• · · • · · • · · · :*·*: Esillä olevan keksinnön mukaan edullinen samankaltaisuus on vähintään noin 40 %, edullisemmin vähintään noin 50 % ja vielä edullisemmin vähintään noin 65 %.

··· « · « *·* ’ 25 Esillä olevan keksinnön vielä eräs aspekti koskee peptidifragmenttia, joka vastaa osaa aminohapposekvenssistä SEQ ID NO:4 tai jotakin sen silmukointivarianttia, : ’·· kuten SEQ ID NO:6:ta, SEQIDNO:8:aa tai SEQ ID NO:10:tä tai jotakin sen ke- Σ.ϊ : miallista ekvivalenttia. Esillä olevan keksinnön mukainen biologisesti eristetty tai ,···. rekombinanttimolekyyli voi olla luonnollisesti glykosyloitunut tai se voi käsittää • · 30 muuttuneen glykosylointimallin riippuen soluista, joista se on eristetty tai syntetisoi- . ’ tu. Esimerkiksi jos molekyyli on tuotettu rekombinaatiotekniikalla prokaryoottisissa • · · organismeissa, se olisi ei-glykosyloitunut. Molekyyli voi olla täyspitkä luonnossa :*·*: esiintyvä muoto tai se voi olla typistetty tai muuten siitä johdettu muoto.

6

Esillä olevan keksinnön vielä eräs aspekti koskee nukleiinihappomolekyyliä, joka koodaa tässä kuvattua VEGF:n kaltaista molekyyliä. Tarkemmin sanoen esillä oleva keksintö koskee nukleiinihappomolekyyliä, joka käsittää nukleotidisekvenssin, joka on olennaisesti kuten SEQ ID NO:3 tai se on vähintään 15-prosenttisesti samankal-5 täinen kuin se kokonaisuudessaan tai osa siitä tai se kykenee hybridisoitumaan ei-vaativissa olosuhteissa nukleotidisekvenssin SEQ ID N0.3 käänteiskomplementtiin edellyttäen, että nukleotidisekvenssi on vähintään 15-prosenttisesti samankaltainen, mutta vähintään 30-prosenttisesti erilainen kuin SEQ ID NO:3:ssa esitetty nukleotidisekvenssi. SEQ IDNO:3:ssa esitettyä nukleotidisekvenssiä nimitetään tässä myös 10 "SOM175:ksi". Edullisesti erilaisuusprosentti on noin 35%, edullisemmin noin 39 % ja vieläkin edullisemmin noin 40 - 50 % tai suurempi.

Vaativuustason määrittelemiseksi voidaan viitata teokseen Sambrook et ai. (1989) sivuille 9.47-9.51, joka sisällytetään tähän viitejulkaisuna ja jossa esitetyt pesuvai-heet katsotaan erittäin vaativiksi. Ei-vaativuuden määritellään tässä tarkoittavan 4 -15 6X SSC/0,1 - 0,5 % w/v SDS 37 - 45°C:ssa 2-3 tuntia. Hybridisaatiossa mukana olevan nukleiinihapon lähteestä ja konsentraatiosta riippuen voidaan käyttää vaihtoehtoisia vaativuusolosuhteita, kuten kohtuullisen vaativia olosuhteita, joiden katsotaan tässä tarkoittavan 1 - 4 X SSC/0,25 - 0,5 % w/v SDS > 45°C:ssa 2-3 tuntia, tai erittäin vaativissa olosuhteita, minkä katsotaan tässä tarkoittavan 0,1 - IX SSC/0,1 . 20 % w/v SDS 60°C:ssa 1 - 3 tuntia.

• ·

Esillä oleva keksintö koskee vielä nukleiinihappomolekyyliä, joka koodaa edellä • kuvattua VEGF:n kaltaista molekyyliä, jonka nukleotidisekvenssin homologia on • · ♦ » vähintään 15 % SEQ ID NO:3:een nähden. Edullisia homologiatasoja ovat vähin- ··.* tään noin 40 %, edullisemmin noin 60 - 70 %.

• · · ··· : 25 Esillä oleva keksintö koskee myös ihmisen VEGF:n hiiri-VEGF-homologin (nimitetään tässä "mVRF:ksi"). mVRF on noin 85-prosenttisesti identtinen ja 92 % sen aminohappotähteistä on säilynyt koko koodaavalla alueella ihmisen VEGF:ään verrattuna. mVRF:ä koodaa nukleiinihappomolekyyli, joka käsittää nukleotidisek-venssin, joka on olennaisesti kuten kuviossa 9 esitetty.

• · ♦ · »«« *:**: 30 Esillä olevan keksinnön mukaista VEGF:n kaltaista molekyyliä voidaan käyttää kehitettäessä erilaisia terapeuttisia ja/tai diagnostisia sovelluksia yksinään tai kom- • · .Γ* binaatiossa muiden molekyylien, kuten VEGF.n kanssa. Esillä oleva keksintö kattaa • · · • ** sen vuoksi farmaseuttiset koostumukset, jotka käsittävät VEGF:n kaltaisen mole kyylin tai sen osia, fragmentteja, johdoksia, homologeja tai analogeja yhdessä yhden 35 tai useamman farmaseuttisesti hyväksyttävän kantajan ja/tai laimenteen kanssa. Li- 7 saksi esillä oleva keksintö koskee vektoreita, jotka käsittävät nukleiinihapposek-venssin, joka on esitetty SEQ ID NO:3:ssa tai joka on vähintään noin 15-prosentti-sesti, edullisemmin noin 40-prosenttisesti ja vielä edullisemmin noin 60 - 70-pro-senttisesti samankaltainen kuin se, mutta vähintään 30-prosenttisesti ja edullisem-5 min noin 39-prosenttisesti erilainen kuin se, sekä niitä sisältäviä isäntäsoluja. Lisäksi tämä keksintö koskee ribotsyymejä ja antisense-molekyylejä, jotka perustuvat SEQ ID NO:3:een, sekä neutraloivia vasta-aineita VEGF:n kaltaiselle molekyylille. Sellaisia molekyylejä voidaan käyttää esimerkiksi VEGF:n kaltaisten geenien yli-ilmentymisen, joka johtaa angiogeneesiin eli kasvainten verisuonittumiseen, vaiku-10 tusten parantamiseen.

Esillä olevan keksinnön eräs toinen aspekti koskee menetelmää astrogliasolujen proliferaation indusoimiseksi nisäkkäässä ja tässä menetelmässä mainitulle nisäkkäälle annetaan tehokas määrä jotakin rekombinanttiproteiinimolekyyliä, jolla on seuraavat ominaisuudet: 15 (i) se käsittää aminohapposekvenssin, joka on vähintään noin 15-prosenttisesti sa mankaltainen, mutta vähintään noin 5-prosenttisesti erilainen kuin sekvenssi SEQ ID NO:2; (ii) sillä on ainakin yksi verisuonten endoteelin kasvutekijän (VEGF) kanssa yhteinen ominaisuus, 20 mainitun annon ollessa kestoltaan ja olosuhteiltaan riittävä indusoimaan astroglia- * * solujen proliferaatiota.

• · • · · : Edullisesti rekombinanttiproteiinimolekyyli käsittää aminohapposekvenssin, joka on esitetty SEQ ID NO:3:ssa tai SEQ ID NO:6:ssa.

• · • · ♦ · : *·· Esillä olevan keksinnön eräs toinen aspekti koskee menetelmää neuronien eloon- • · · v : 25 jäämisen ja/tai proliferaation edistämiseksi nisäkkäässä, ja tässä menetelmässä mainitulle nisäkkäälle annetaan tehokas määrä rekombinanttiproteiinimolekyyliä, jolla on seuraavat ominaisuudet: (i) se käsittää aminohapposekvenssin, joka on vähintään noin 15-prosenttisesti sa-mankaltainen, mutta vähintään noin 5-prosenttisesti erilainen kuin sekvenssi 30 SEQ ID NO:2; • (ii) sillä on ainakin yksi verisuonten endoteelin kasvutekijän (VEGF) kanssa yhtei- ; * * *; nen ominaisuus, ··· : ·. ·. mainitun annon ollessa kestoltaan ja olosuhteiltaan riittävä indusoimaan astroglia solujen proliferaatiota.

8

Edullisesti rekombinanttiproteiinimolekyyli käsittää aminohapposekvenssin, joka on esitetty SEQ ID NO:3:ssa tai SEQ ID NO:6.

Esillä oleva keksintö koskee myös vasta-aineita VEGF:n kaltaiselle molekyylille tai nukleiinihappokoettimia geenille, joka koodaa VEGF:n kaltaista molekyyliä, joita 5 vasta-aineita ja koettimia voidaan käyttää diagnostisina aineina.

Esillä olevaa keksintöä kuvataan vielä viitaten seuraaviin keksintöä rajoittamattomiin kuvioihin ja/tai esimerkkeihin.

Kuvioissa:

Kuvio 1 VEGF165:n nukleotidisekvenssi (SEQ ID NO: 1) ja vastaava aminohappo-10 sekvenssi (SEQ ID NO:2).

Kuvio 2 SOM175:n nukleotidisekvenssi (SEQ ID NO:3) ja vastaava aminohappo-sekvenssi (SEQ ID NO:4).

Kuvio 3 SOM175-proteiinisekvenssillä suoritetun BLAST-etsinnän tulokset. Kuvio 4 VEGF cDNA:n ja SOM175 cDNA:n BESTFIT-vertailu.

15 Kuvio 5 VEGFi65:n monivertailu SOM175:n ja sen silmukointivarianttien kanssa nukleotiditasolla.

Kuvio 6 VEGF165:n monivertailu SOM175:n ja sen silmukointivarianttien kanssa aminohappotasolla.

Kuvio 7 Kaavamainen esitys SOM175:stäja sen silmukointivarianteista.

• · • *·· 20 Kuvio 8(a) Kaavamainen esitys, jossa näkyy eksoni/intronikartta, ihmisen : SOM175:ngenomirakenteesta.

·*·’: Kuvio 8(b) Kaavamainen esitys, jossa näkyy eksoni/intronirajat, ihmisen • · SOM175:n genomirakenteesta.

Kuvio 9 mVRF cDNA-klooneista johdettu nukleotidisekvenssi ja ennakoitu pep- • · · 25 tidisekvenssi. Nukleotidien numerot ovat vasemmalla lähtien aloituskodonin A.sta.

.. Aminohappojen numerointi on oikealla, lähtien ennakoidun kypsän proteiinin en- • · simmäisestä tähteestä sen jälkeen, kun putatiivinen signaalipeptidi on poistettu.

* * * *| * Toisin silmukoitunut alue on kaksoisalleviivattu ja muodostunut peptidisekvenssi kustakin mRNA:sta on mukana. Mahdollinen polyadenylaatiosignaali on osoitettu • · · 30 lihavoinnilla. mVRF167:n ja mVRF186:n aloitus- ja lopetuskodonit on alleviivattu ja polymorfmen AC-toisto 3' UTR:ssä on osoitettu piste viivoitetulla laatikolla. Intro- t · ];··* ni/eksonirajojen positiot on osoitettu nuolenpäillä.

i V Kuvio 10 Ihmisen ja hiiren VRF-proteiinien isoformien BESTFIT-vertailut. A: mVRFi67 ja hVRFi67. B: mVRF186 ja hVRF186 kohdasta, jossa sekvenssit eroavat 35 vastaavista 167-aminohappoisoformeista. Aminohappoidenttisyydet on merkitty 9 pystysuorilla viivoilla ja säilyneet aminohapot kaksoispisteillä. Nuoli on merkkinä ihmisen ja hiiren VRF:n ennakoidusta signaalipeptidin katkaisukohdasta.

Kuvio 11 mVRF167:n ja mVEGF188:n (Breier et ai, 1992) peptidisekvenssien BESTFIT-vertailu. Nuoli on merkkinä mVEGF:n signaalipeptidin katkaisukohdasta. 5 Identtiset aminohapot on merkitty pystysuorilla viivoilla ja konservatiiviset substituutiot kaksoispisteillä. Aminohappojen numerointi on kuvion 9 kuvatekstissä esitetyn kaltainen.

Kuvio 12 VRF.n (geneerinen VRF-geeni esitetään siksi, että hiiren ja ihmisen homologien introni/eksonijärjestys on lähes identtinen) ja muiden ihmisen 10 VEGF/PIGF/PDGF-geeniperheen geenirakenteen vertailu. Eksonit on esitetty laatikoin. Proteiinia koodaavat alueet ja translatoitumattomat alueet on esitetty täytetyin ja avoimin sektioin, vastaavassa järjestyksessä. Viivoitettu alue VRF.ssä osoittaa lisä-3' UTR-sekvenssin, joka on muodostunut, kun VRFi86-isoformi on silmukoitu-nut eri tavalla. Kuviossa on esitetty kunkin geenin potentiaaliset toisin silmukoitu-15 neet tuotteet.

Kuvio 13 Täysikasvuisen hiiren eri kudoksista (kuten ilmoitettu) peräisin olevan kokonais-RNA:n, joka on hybridisoitu VRF cDNA -klooniin, Northern blotin radio-autogrammi. Merkittävä 1,3 kiloemäksen transskripti osoitettiin kaikissa näytteissä. Kuvio 14 Filmradioautokuva (A-C) ja pimeäkenttämikroskooppikuva (D-E), jotka 20 esittävät mVRF:n ja mRNA:n ilmentymismallia hiiressä. Hiiren E14-alkiossa (A) positiivisia signaaleja on havaittavissa kehittymässä olevan sydämen (Ha) ja etuai- * *: vokuoren (Cx) kohdalla. Vähäinen taustasignaali on myös todettavissa muiden ku- • · : ’·· dosten kohdalla leikkeessä. E17-alkiossa (B) sydän (Ha) on selvästi näkyvissä voi-• · ·.· { makkaan hybridisaatiosignaalin ansiosta. Yhtä voimakas signaali todetaan ruskean : *]: 25 rasvakudoksen (Fa) kohdalla selässä ja rintakehän paikkeilla. Keskinkertainen hy- ·*·.. bridisaatiosignaali on havaittavissa selkäytimen (SC) ja kielen (T) kohdalla. Tausta-♦ signaali on heikompi E14-alkioon verrattuna. Nuoressa täysikasvuisessa hiiressä (C- D) positiivisia signaaleja on läsnä sydämen (Ha) ja rasvakudoksen (Fa) kohdalla .. rintakehän ympärillä, kun sen sijaan esimerkiksi keuhkoissa (Lu) ei näy merkkiä.

*..!* 30 Sydämen kohdalla esiintyvä hybridisaatiosignaali on tasaisesti jakautuneena koko • · · *♦) vasemman kammion alueelle, nystylihakset (D) mukaanluettuina. E17-sydämessä, :]**: joka on hybridisoitu kylmän koettimen ylimäärään, ei positiivisia signaaleja ole läsnä ·:··· (E). Mittakaavajanat = 0,5 mm (A), 1,2 mm (B), 1 mm (C), 0,3 mm (D), 0,1 mm .·=·. <E> [;*;* 35 Kuvio 15 Pimeä- (A ja C) ja kirkaskenttä- (B ja D) mikrokuvia, jotka esittävät • · · : ·* m VRF mRNA:n ilmentymistä hiiren rasvakudoksessa (A-B) ja selkäytimessä (C-D).

Voimakas hybridisaatiosignaali on läsnä rasvan (A) kohdalla, kuten osoittaa voimakas merkkiytyminen sudaninmustalla värjätyissä sektioissa (B). Heikko signaali on 10 läsnä myös luustolihaksessa (M A-B:ssä). Täysikasvuisen selkäytimessä (C) mVRF:koettimet tuottivat neuronien värjäytymiskuvion harmaan aineen kohdalla. Toluidiinilla vastavärjääminen osoitti, että motoneuronit etusarvessa (D), intemeu-ronit takasarven syvässä osassa ja keskikanavan (ei esitetty) ympärillä olivat erittäin 5 positiivisia mVRF mRNA:n suhteen. Mittakaavajanat = 0,1 mm (A), 0,1 mm (B), 0. 25.mm (C), 0,015 mm (D).

Kuvio 16 VEGF:n vaikutus kanan alkion 8 päivän ikäisiin (E8) sensorisiin hermo-soluihin määritettynä eloonjäämisprosentilla, neuriittien kasvuprosentilla ja neuriit-tien keskimääräisellä pituudella (pm).

10 Kuvio 17 VEGF:n ja SOM175:n vaikutukset kanan gliasoluihin. Kokeessa testattiin CNS-gliasoluja, perifeerisiä gliasoluja ja CNS-oligodendrosyyttejä.

Kuvio 18 Eri SOM175-proteiinien vaikutus hiiren astrogliasoluihin. 3H (cpm).

1. FGF-2 (10 ng/ml) positiivinen verrokki 2. SOMaX6* 1 ng/ml 15 3. SOMaX6 10 ng/ml 4. SOMaX6 100 ng/ml 5. SOMaX6 1000 ng/ml 6. SOMaX6 1000 ng/ml, ei hepariinia 7. SOMX6** 1 ng/ml 20 8. SOMX610 ng/ml ..... 9. SOMX6 100 ng/ml ’ 10. SOMX6 1000 ng/ml j 11. SOMX6 1000 ng/ml, ei hepariinia ;·· : * Tarkoittaa SOM175:tä ilman eksonia 6; • · · : ·.: 25 ** Tarkoittaa SOM175:tä.

: ’·· Kuvio 19 Eri SOM175-proteiinien vaikutus hiiren oligodendrogliasoluihin. H

:T: (cpm).

1. FGF-2 (10 ng/ml) positiivinen verrokki 2. SOMaX6* 1 ng/ml !·:♦. 30 3. SOMaX6 10 ng/ml 4. SOMaX6 100 ng/ml 5. SOMaX6 1000 ng/ml 6. SOMaX6 1000 ng/ml, ei hepariinia 7. SOMX6* 1 ng/ml :·!·.* 35 8. SOMX610 ng/ml : ** 9. SOMX6100 ng/ml 10. SOMX6 1000 ng/ml 11 11. S0MX6 1000 ng/ml, ei hepariinia * Tarkoittaa SOM175:tä ilman eksonia 6; ** T arkoittaa SOM 175 :tä.

Kuvio 20 Eri SOM175-proteiinien vaikutus hiiren aivojen etulohkon hermosolui-5 hin. Eloonjäämis-%.

1. FGF-2 (10 ng/ml) positiivinen verrokki 2. SOMaX6* 1 ng/ml 3. SOMaX6 10 ng/ml 4. SOMaX6 100 ng/ml 10 5. SOMaX6 1000 ng/ml 6. SOMaX6 1000 ng/ml, ei hepariinia 7. SOMX6* 1 ng/ml 8. SOMX6 10 ng/ml 9. SOMX6 100 ng/ml 15 10. SOMX6 1000 ng/ml 11. SOMX6 1000 ng/ml, ei hepariinia * Tarkoittaa SOM 175 :tä ilman eksonia 6; ** Tarkoittaa SOM175 :tä.

20

Taulukko 1 * ; Yhteenveto sekvenssien tunnistusnumeroista :’·· SEQIDNOT VEGF165:n nukleotidisekvenssi ·.: : SEQIDNO:2 VEGFi65:n aminohapposekvenssi SEQ ID NO:3 SOM175:n (VEGF:n kaltaisten molekyylien) nukleotidisekvenssi SEQIDNO:4 SOM175:n aminohapposekvenssi • SEQ ID NO:5 SOM175:n ilman eksonia 6 nukleotidisekvenssi SEQ ID NO:6 SOM175:n ilman eksonia 6 aminohapposekvenssi .. SEQ ID NO:7 SOM175:n ilman eksonia 6 ja eksonia 7 nukleotidisekvenssi ·... SEQ ID NO:8 SOM175:n ilman eksonia 6 ja eksonia 7 aminohapposekvenssi ' SEQ ID NO:9 SOM175:n ilman eksonia 4 nukleotidisekvenssi SEQ ID NO: 10 SOM175:n ilman eksonia 4 aminohapposekvenssi ♦:··· SEQ ID NO: 11 Oligonukleotidi SEQ ID NO: 12 Oligonukleotidi SEQ ID NO: 13 Oligonukleotidi : ·* SEQ ID NO: 14 Oligonukleotidi 12

Esimerkki 1 Ihmisen cDNA -kloonit

Alkuperäinen SOM175 cDNA eristettiin seulomalla ihmisen sikiön aivokirjastoa (λζ3ρΙΙ, Stratagene) kosmidilla DIIS750 (Larsson et ai., 1992). Plasmidi leikattiin 5 "in vivo" ja saatiin yksi 1,1 kiloemäksen cDNA. Myös kolme toisistaan riippumatonta SOM175 cDNA:ta eristettiin ihmisen sikiön pemakirjastosta (Stratagene, Unizap) käyttäen edellä mainittua SOM175-inserttiä koettimena. Saatiin kolme kloonia: SOM175-4A, -5A ja -6A. SOM175-5A on eri tavalla silmukoitunut klooni, josta puuttuu eksoni 4 (SOM175-e4). Nämä kirjastoseulonnat suoritettiin käyttäen kirjas-10 ton valmistajan (Stratagene) suosittelemia hybridisaatio-olosuhteita ja SOM175:n satunnaisalukkeella saatua inserttiä.

Kaksi osittaista ihmisen SOM175 cDNAita eristettiin myös λΘΤΙΙ ihmisen mela-noomasolulinja A2058 -kirjastosta (Clontech). cDNA-kirjastojen seulonnat suoritettiin käyttäen Churchin ja Gilbertin, 1984, kuvaamia hybridisaatio-olosuhteita. 15 Kussakin tapauksessa koetin kehitettiin käyttämällä satunnaisaluketta PCR-tuotteeseen, joka oli johdettu SOM175:stä (181700r).

Hiiren cDNA-kloonit

Ihmisen SOM175:tä käytettiin myös hiiren neonataalisen kokoaivo-cDNA-kirjaston . (Unizap, Stratagene) seulomiseen. Eristettiin neljä ei-kimeeristä kloonia: M175-A, ’ 20 B, C, D. Kaikki kloonit olivat osittaisia cDNA: itä ja M175-C sisälsi useita introneja.

: ** Kolmesta näistä cDNA:sta puuttui eksoni 6.

• · • · · • · · • · · ·

Eräs toinen klooni, jota nimitettiin Ml :ksi, sekvensoitiin täydellisesti ja sen todettiin ··.* sisältävän täyden avoimen lukukehyksen plus osan 5'utr:stä ja koko 3'utr.n • · · • · · ·.· · Esimerkki 2 :·. 25 DNA-sekvenssianalyysi • · · • · · ·.· · cDNA-kloonin (SOM175) koko sekvenssi rakennettiin ja se on esitetty kuviossa 2 .*··. vastaavine aminohapposekvensseineen. Tämä sekvenssi seulottiin avoimien lukuke- • · · hysten suhteen käyttäen MAP-ohjelmaa (GCG, Wisconsinin yliopisto). Todettiin yksi 672 emäsparin avoin lukukehys (katso kuvio 2). Siinä osoittautuu olevan vähän 30 5'-pään translatoitumattomia sekvenssejä (2 emäsparia). 3'-pään translatoitumaton • · ·

• alue näyttää olevan täydellinen, koska se sisältää polyadenylaatiosignaalin ja poly-A

-hännän.

13

Tietokantahomologiatutkimukset suoritettiin käyttäen BLAST-algoritmia (ajettiin NCBFllä, USA). Tämä tutkimus paljasti samankaltaisuuden useiden VEGF:n nisä-käsmuotojen kanssa (katso kuvio 3). SOM175:n ja ihmisen VEGF165:n välisen ho-mologian määrä määritettiin käyttämällä BESTFIT-ohjelmaa (GCG, Wisconsinin 5 yliopisto; katso kuviot 4 ja 5). Nukleotidihomologia määritettiin 69,7-prosenttiseksi ja proteiinihomologia määritettiin vähintään 33,3-prosenttiseksi ja konservaatio 52,5-prosenttiseksi BESTFIT-analyysiä käyttäen. Nukleotidisekvenssien BLAST-analyysi osoitti lähes täydellisen samankaltaisuuden ihmisen ilmentyneen sekvenssi-leiman EST06302:n kanssa (Adams et ah, 1993).

10 Nämä tulokset osoittavat, että SOM175 koodaa kasvutekijää, jolla on rakenteellista samankaltaisuutta VEGF:n kanssa. Molemmissa geeneissä on aloitus- ja lopetusko-donit samanlaisissa positioissa ja niillä on jaksottaisia homologiajaksoja. Kaikki 8 kysteiiniä sekä joukko muita VEGF-tähteitä, joiden uskotaan olevan mukana dimeri-saatiossa, ovat säilyneet. Nämä tähteet ovat kysteiini-47, proliini-70, kysteiini-72, 15 valiini-74, arginiini-77, kysteiini-78, glysiini-80, kysteiini-81, kysteiini-82, kysteiini-89, proliini-91, kysteiini-122 ja kysteiini-124 ja ne on esitetty kuviossa 6. Koska VEGF:llä ja SOM175-geenituotteella on rakenteellista yhtäläisyyttä, on myös mahdollista, että niiden toiminnassa on samankaltaisuutta. SOM175:n ehdotetaan koo-daavan VEGF:n kaltaista molekyyliä, jolla on joitakin samanlaisia ominaisuuksia 20 VEGF:n kanssa, mutta jolla on myös omia ainutlaatuisia ominaisuuksia. VEGF^n ....: nukleotidisekvenssi ja vastaava aminohapposekvenssi on esitetty kuviossa 1.

• · i **· Esimerkki 3 • · • · · • · · • · · · :·. ·. VEGF165-perheen ja SOM 175-perheen (proteiini) samankaltaisuus ja erilaisuus pro- sentteinä tutkittiin käyttämällä Clustal-menetelmää, MegAlign Software, DNA- • · · 25 STAR, Wisconsin. Tulokset esitetään taulukoissa 2.1 ia 2.2. SOM175:n eri tavalla • · · ** *·1 1 silmukoituneet muodot on lyhennetty SOM175-e6:ksi, kun koko eksoni 6 puuttuu; SOM175-e6:ksi ja 7:ksi, kun kaikki eksonit 6 ja 7 puuttuvatta SOM175-e4:ksi, kun : 1·· koko eksoni 4 puuttuu. SOM175:n silmukoitunut muoto on esitetty kuviossa 7. • · · ; SOM175:n genomikartat, joissa näkyvät introni/eksonirajat, on esitetty kuvioissa 8a .···. 30 ja 8b.

• · · • · • · · • · • · • · · · · • · · • · • · 14

Taulukko 2.1 A SOM175:n ja ihmisen VEGF^in silmukointivarianttien nukleotidien samankaltaisuus prosentteina VEGF165 SOM175 SOM175-e6 SOM175-e6&7 SOM175-e4 VEGF165 *** 34,9 39,7 41,4 37,0 SOM175 *** 98,9 95,1 99,2 SOM175-e6 *** 98,8 84,0 SOM175-e6&7 *** 80,3 SOM175-e4 *** 5 B SOM175:n ja ihmisen VEGF165:n silmukointivarianttien nukleotidien samankaltaisuus prosentteina VEGF165 SOM175 SOM175-e6 SOM175-e6&7 SOM175-e4 VEGF165 *** 41,7 41,6 41,7 41,8 SOM175 *** 0,2 0,2 0,0 SOM175-e6 *** 0,0 0,2 SOM175-e6&7 *** 0,3 SOM175-e4 *** • · • · • · • · · • · • · · • · · • · · · • · · • · · • · • · • · • · • · · • · · • · · • · · • · • · • · · • · · • · · • · · • · · • · • · • · · • · • · · • · • · • · · 1 · · • · · • · • · 15

Taulukko 2.2 A SOM175:n ja ihmisen VEGFi^n silmukointivarianttien aminohappojen samankaltaisuus prosentteina VEGF,65 SOM175 SOM175-e6 SOM175-e6&7 SOM175-e4 VEGF165 *** 31,4 42,3 33,5 40,6 SOM175 *** 74,7 73,7 99,1 SOM175-e6 *** 76,8 99,1 SOM175-e6&7 SOM175-e4 5 B SOM175:n ja ihmisen VEGF165:n silmukointivarianttien aminohappojen samankaltaisuus prosentteina VEGF165 SOM175 SOM175-e6 SOM175-e6&7 SOM175-e4 VEGF165 *** 65,7 55,4 54,6 57,4 SOM175 *** 19,9 4,2 0,0 SOM175-e6 *** 0,0 0,0 SOM175-e6&7 *** 0 0 SOM175-e4 *** • · • · • · • · · • · • · · • · · • · · · • · · • · · • · • · • · • · • ··

• M

• · · • · · ·· • · • ·· ·»· • · · • * ♦ ♦ ··· • · • ♦ ··· • · ··· • · • · ··♦ ·· ♦ • · · • · • · 16

Esimerkki 4

Biologisia analyysejä SOM175:n funktion määrittämiseksi

Analyysejä suoritettiin sen määrittämiseksi, onko SOM175:llä samankaltaisia vaikutuksia kuin VEGF:llä endoteelisolujen toimintaan, angiogeneesiin ja haavojen para-5 nemiseen. Tutkimuksissa, jotka koskivat reseptoriin sitoutumisen jakautumista, saatujen tulosten perusteella suoritettiin sitten muita kokeita.

Endoteelisolujen toiminnan tutkiminen

Endoteelisolujen proliferaatio. Endoteelisolujen kasvukokeet suoritetaan Ferraran & Henzelin (1989) ja Gospodarowiczin et ai. (1989) kuvaamalla tavalla.

10 Verisuonien permeabiliteettikoe. Tämä koe, jossa käytetään Milesin testiä marsuissa, suoritetaan Milesin & Milesin (1952) kuvaamalla tavalla.

Solun adheesiokoe. Tutkitaan SOM175:n vaikutus polymorfien adheesioon endo-teelisoluihin.

Kemiallinen vetovoima. Tämä suoritetaan käyttämällä standardin mukaista kemialli-15 sen vetovoiman Boyden-kammiokoetta.

Plasminogeeniaktivaattorikoe. Tutkitaan, syntyykö SOM175:tä lisättäessä plasmi-nogeeniaktivaattoria ja plasminogeeniaktivaattorin estäjää (Pepper et ai., 1991).

• ·

Endoteelisolujen migraatiokoe. SOM175:n kyky stimuloida endoteelisoluja migra- • .·. toitumaan ja muodostamaan putkia tutkitaan Montesanon et ai. (1986) kuvaamalla "V 20 tavalla.

• · · • · • · • · • *·· Angiogeneesikoe • · · • · · • · · SOM175:n kyky aikaansaada angiogeeninen vaste kanan korioallantoiskalvossa .. määritetään Leungin et ai. (1989) kuvaamalla tavalla.

• · • · · • :T: SOM175:n mahdolliset neurotrofiset vaikutukset määritetään käyttämällä seuraavia 25 kokeita: • · • · • · ·

Hermoston viejähaarakkeiden kasvukoe ja geeni-induktio (PC12-solut) • · ♦ • · ’·♦·’ PC12-solut (feokromosytoomasolulinja) reagoivat NGF:ään ja muihin neurotrofisiin : V tekijöihin kehittämällä sympaattisten neuroneiden tunnusmerkkejä, varhaisten ja myöhäisten geenien induktio ja hermoston viejähaarakkeiden pidentyminen mu- 17 kaanluettuna. Nämä solut altistetaan SOM175:lle ja niiden vastetta tarkkaillaan (Drinkwater et ai., 1991) ja (Drinkwater et ai., 1993).

Viljellyt ääreishermoston (PNS) neuronit

Alla mainittujen PNS-neuronien primaariviljelmiä altistettiin SOM175:lle ja tark-5 kaihiin mahdollisen vasteen toteamiseksi: - sensoriset neuronit hermostopienasta ja takajuuren gangliasta - sympatikusneuronit sympatikusketjun hermosolmusta - alkion ulkolehden paksunnoksesta johdetut neuronit kyhmyisestä gangliasta - liikeneuronit selkäytimestä.

10 Kokeita kuvataan julkaisuissa Suter et ai. (1992) ja Marinou et ai. (1992).

Kun todetaan in vitro -vaste, suoritetaan in vivo -kokeita sellaisten ominaisuuksien kuten impulssien vastaanoton ja poispäinkuljetuksen tutkimiseksi julkaisussa Hendry et ai. (1992) kuvatulla tavalla.

Hermojen regeneraatio (PNS) 15 Kun SOM175:llä todetaan neurotrofisia vaikutuksia, tutkitaan sen mahdollinen rooli aksotomisoituneiden sensoristen neuronien, sympatikusneuronien ja motoneuronien regeneraatiossa menetelmillä, joita kuvataan viitejulkaisuissa Otto et ai. (1989), Yip et ai. (1984) ja Hendry et ai. (1976).

• · : “ SOM175:n vaikutukset CNS-neuroneihin • ♦ • · · • · · 20 SOM175:n kyky edistää keskushermoston neuronien eloonjäämistä tutkitaan mene-:·.* telmillä, joita kuvataan julkaisuissa Hagg et ai. (1992), Williams et ai. (1986), Hefti (1986) ja Kramer (1987).

• ♦ ·

Haavojen paraneminen • · • · • ♦ # SOM175.n kykyä edistää haavojen paranemista tutkitaan käytettävissä olevassa • · · *. 25 kliinisesti relevanteimmassa mallissa, kuten kuvataan julkaisussa Schilling et ai.

«·» (1959) ja jota käytetään viitejulkaisussa Hunt et ai. (1967).

• · • Hematopoieettinen systeemi • ♦ • · ·«· Käytettävissä on erilaisia in vitro ja in vivo -kokeita, joita suoritetaan hematopoieet- tisen systeemin spesifisillä solupopulaatioilla ja niitä hahmotellaan alla.

• · 18

Kantasolut Hiiren solut

On kehitetty erilaisia uusia in vitro hiiren kantasolukokeita, joissa käytetään FACS-puhdistettuja soluja: 5 (a) Repopuloituvat kantasolut

Ne ovat soluja, jotka pystyvät muodostamaan uusia populaatioita kuolettavasti sätei-lytettyjen hiirien luuytimessä ja niiden fenotyyppi on Lin', Rh1", Ly-6A/E+, c-kit+. Tutkittava aine testataan näillä soluilla joko yksinään tai inkuboimalla yhdessä monien tekijöiden kanssa ja mittaamalla sen jälkeen proliferaatio lisäämällä 3H tymi-10 diiniä.

(b) Myöhäisvaiheen kantasolut

Ne ovat soluja, joilla on suhteellisen vähäinen kyky muodostaa uusia populaatioita luuytimessä, mutta ne pystyvät kehittämään Dl3 CFU-S:ä. Näillä soluilla on Lin', Rhhl, Ly-6A/E+, c-kit+ fenotyyppi. Tutkittavaa ainetta inkuboidaan näiden solujen 15 kanssa jonkin aikaa, ruiskutetaan kuolettavasti säteilytettyihin vastaanottajiin ja Dl 3 pemakolonioiden lukumäärä lasketaan.

(c) Progenitorilla rikastetut solut

Ne ovat soluja, jotka reagoivat in vitro yksittäisiin kasvutekijöihin ja niillä on Lin', : ** Rhhl, Ly-6A/E+, c-kit+ fenotyyppi. Tämä koe osoittaa, pystyykö SOM175 vaikutta-• · : 20 maan suoraan hematopoieettisiin progenitor-soluihin. Tutkittavaa ainetta inkuboi- • · m • V daan näiden solujen kanssa agarviljelmissä ja kolonioiden lukumäärä lasketaan 7 - : * ·.. 14 vuorokauden kuluttua.

• · · • · · • · · * Ateroskleroosi

Sileiden lihasten soluilla on ratkaiseva merkitys ateroskleroosin kehittymisessä tai 25 puhkeamisessa ja siihen vaaditaan niiden fenotyypin muuttuminen kontraktiilisesta synteettiseen tilaan. Makrofageilla, endoteelisoluilla, T-lymfosyyteillä ja verihiuta- ’···[ leiliä on kaikilla oma roolinsa ateroskleroottisten plakkien kehittymisessä niiden vaikuttaessa sileiden lihasten solujen kasvuun ja fenotyypin muutoksiin. Vaikutus- ten, joita SOM175:llä on sileän lihaksiston soluihin, tutkimiseen käytetään in vitro :*·*· 30 -koetta, jossa mitataan sileän lihaksiston solujen proliferaation nopeutta ja fenotyy-• · pin muutoksia monisoluympäristössä. Systeemissä käytetään muunnettua Rosen astiaa, jossa eri solutyyppejä ympätään vastakkaisille kansiliuskoille.

19 SOM175:n vaikutukset luuhun SOM175:n kykyä säädellä osteoblastien proliferaatiota tutkitaan menetelmällä, jota kuvataan viitejulkaisussa Lowe et ai. (1991). Mahdollisia vaikutuksia luun resorptioon tutkitaan julkaisussa Lowe et ai. (1991) kuvatulla tavalla. Vaikutuksia os-5 teoblastien migratoitumiseen ja muutoksiin solunsisäisissä molekyyleissä (esimerkiksi cAMP:n kasaantumista, alkalisen fosfataasin tasoja) tutkitaan viitejulkaisussa Midy et ai. (1994) kuvatulla tavalla.

Vaikutukset luustolihassoluihin SOM175:n vaikutuksia varhaislihassolujen proliferaatioon ja lihasputkien kehitty-10 miseen voidaan määrittää viitejulkaisuissa Ewton et ai. (1980) ja Gospodarowicz et ai. (1976) kuvatulla tavalla.

Esimerkki 5

Hiiren VEGF DNA:n kloonaaminen cDNA:iden eristäminen 15 Hiiren VRF (mVRF) -klooneja seulottiin lambda Zap vastasyntyneen kokoaivo cDNA -kirjastosta (Stratagene). Primaarinen faagi suurtiheyssuodattimista (5 x 104 pfu/levy) identifioitiin hybridisoimalla 682 emäsparin 32P-leimattuun koettimeen, J°ka oli kehitetty PCR:llä hVRF cDNA:sta (pSOMl 75), kuten edellä kuvattiin. Hyb- • · .. ridisaatio ja nylonkalvojen (Hybond-N) tarkat pesut suoritettiin 65°C:ssa olosuhteis- j ** 20 sa, joita kuvataan viitejulkaisussa Church ja Gilbert (1984). Positiiviset plakit poi-• · · ί*: : niittiin, puhdistettiin ja leikattiin in vivo sellaisten bakteerikolonioiden tuottamiseksi, : *.* jotka sisältävät cDNA-klooneja pBluescript SK-:ssa.

• « • · • · · .*:·. Genomikloonien eristäminen • · ·

Genomiklooneja eristettiin hiirikanta SV/129 -kirjastosta, joka oli kloonattu lambda • · .

: *·· 25 Fix 11 vektorissa (Stratagene). Erittäin tiheitä suodattimia (5 x 10 pfii/suodatin) L* ‘ seulottiin 563 emäsparin P-leimatulla koettimella, joka oli kehitetty PCR-monis- .···. tuksella mVRF cDNA.n nukleotidialueesta 233-798 (katso kuvio 9). Positiiviset • · kloonit poimittiin ja seulottiin uudelleen suodattimilla, jotka sisälsivät 400 - 800 pfu. . * Suuren mittakaavan faagivalmisteita valmistettiin käyttämällä QIAGEN-lambda- :; 30 kittiä tai ZnCl2-puhdistusta (Santos, 1991).

·· · • · · • · • · 20

Nukleotidisekvensointi ja analyysi cDNA.t sekvensoitiin molemmista säikeistä käyttäen erilaisia vektoriperustaisia ja sisäisiä alukkeita sekä Applied Biosystems Incorporatedin (ABI) väriterminaattori-sekvensointikittejä valmistajan ohjeiden mukaisesti. Sekvenssit analysoitiin auto-5 maattisella ABI Model 373A -DNA-sekvensointilaitteella. Peptidien homologiaver-tailut suoritettiin käyttämällä BESTFIT-ohjelmaa (GCG, Wisconsin).

Introni/eksonirajojen identifiointi

Eksonirajojen ja niiden viereisten alueiden identifiointi suoritettiin käyttämällä PCR:ä ja hiiren genomi-DNA- tai mVRF genomi-lambdaklooneja templaatteina. 10 Intronien tunnistamiseen PCR:ssä käytetyt alukkeet johdettiin hVRF-sekvenssistä ja mahdollisten ihminen/hiirisekvenssien erilaisuuksien sallimiseksi käytettiin lämpö-käsittelylämpötiloja, jotka olivat 5 - 10°C arvioitua Tm:ä alhaisempia. Kaikki PCR-tuotteet käsiteltiin agaroosigeelielektroforeesilla ja geelipuhdistettiin käyttämällä QIAquick spinkolonneja (Qiagen) ja introni/eksonirajat sekvensoitiin suoraan näistä 15 tuotteista. Lisäksi joitakin silmukointikohtia sekvensoitiin mVRF:n alakloonatuista genomiffagmenteista. Introni/eksonirajat identifioitiin vertaamalla cDNA- ja geno-mi-DNA-sekvenssejä.

Northern-analyysi ....: Solun kokonais-RNA valmistettiin joukosta tuoreita normaalin täysikasvuisen hiiren • · 20 kudoksia (aivot, munuainen, maksa, lihas) käyttäen Chomczynskin ja Sacchin • · · I . (1987) menetelmää. 20 pg kokonais-RNA:ta elektroforesoitiin, siirrettiin nylonkal- • # · j1:#: voile (Hybond N, Amersham) ja hybridisoitiin standardiolosuhteissa (Church & Gil-

·' bert, 1984). Suodattimia pestiin 65°C:ssa 0,lxSSC:ssä (20xSSC on 3M NaCl/0,3M

• · : '·· trinatriumsitraattia), 0,1 % SDS:ssä ja valotettiin röntgenfilmille vahvistusvarjosti-v · 25 mia käyttäen -70°C:ssa 1 - 3 vuorokautta.

.. mVRF cDNA: iden karakterisointi • · • · · • · ·

v‘ · Hiiren VRF-homologeja eristettiin seulomalla hiiren cDNA-kirjastoa hVRF cDNA

.···. -kloonilla. Viisi kloonia, joiden koko vaihteli 0,8 kiloemäksestä 1,5 kiloemäkseen, • · otettiin talteen ja sekvensoitiin. cDNA-sekvenssit mukautettiin niin, että saatiin • · . 30 täyspitkä 1041 emäsparin cDNA-sekvenssi, joka kattoi koko avoimen lukukehyksen • · · (621 emäsparia tai 564 emäsparia riippuen silmukointimuodosta, katso alla) ja ’ 3' UTR (379 emäsparia) sekä 5' UTR:n 163 emäsparia (kuvio 9).

21

Ennakoitu aloituskodoni vastasi aloituskodonin positiota hVRF.ssä. Toinen kehyksen ulkopuolinen ATG paikallistettiin positiossa -47 ja kaksi lopetuskodonia todettiin ylävirran puolella (positiot -9 ja -33, vastaavassa järjestyksessä) ja kehyksessä (in-frame) putatiivisen aloituskodonin kanssa.

5 hVRF:n ennakoitu N-terminaalinen signaalipeptidi osoittautuu olevan läsnä mVRF.ssä 81-prosenttisella identtisyydellä (17/21 aminohaposta). Peptidipilkkou-tumista mVRF:ssä odotetaan esiintyvän position 21 jälkeen (kuvio 10). Nämä tulokset johtavat ajattelemaan, että kypsä mVRF erittyy ja sen voisi siksi ajatella toimivan kasvutekijänä.

10 Samoin kuin hVRF:ssä, kaksi avointa lukukehystä (ORF; open reading frame) todettiin cDNA:issa, jotka oli eristetty kirjastoseulonnalla. Neljän viidestä kloonista todettiin olevan vaihtoehtoisesti silmukoituneita ja niistä puuttui hVRF.n eksonin 6 kanssa homologinen 101 emäsparin fragmentti. mVRF:n kahden isoformin ennakoidut peptidisekvenssit määritettiin ja niitä verrattiin vastaavien ihmisen isoformi-15 en kanssa (kuvio 10).

mVRFi86:ta koodaava viesti sisältää 621 emäsparin avoimen lukukehyksen koodaa-vine sekvensseineen, jotka päättyvät positioon +622, eksonin 7 loppua kohden (kuvio 9). Pienempi mVRFi67:ä koodaava viesti päättyy itse asiassa +622 TAG-kohdan jälkeen kehyksen siirtymän vuoksi, joka johtuu 101 emäsparin eksonin 6 . 20 ulossilmukoitumisesta ja lopetuskodonin (TGA) insertoitumisesta positioon +666, lähelle eksonin 8 alkua (kuvio 9).

• · • · · j mVRFi86-proteiini on vahvasti homologinen VEGF.n amino- ja sentraalisten osien • ·· · kanssa, kun sen sijaan karbonyylipää on täysin erilainen ja se sisältää runsaasti ala- .··.* niiniä. mVRF167:llä on nämä samankaltaisuudet ja se pysyy myös homologisena • · · 25 VEGF.n kanssa koko matkan C-terminukseen asti (kuvio 11). mVRFi67:n koko- * naishomologia hVRFi67:n kanssa sisälsi 85-prosenttisen identtisyyden ja 92-prosenttisen samankaltaisuuden, vastaavassa järjestyksessä (kuvio 10). Samaten : *· mVRFi67:n ja m VEGF.n homologia (Breier et ai., 1992) käsitti 49-prosenttisen • · · v : identtisyyden ja 71-prosenttisen konservatiivisen aminohapposubstituution, vastaa- .···. 30 vassa järjestyksessä (kuvio 11).

\ ’ mVRF cDNA:ssa ei ollut kanonista selkärankaisten polyadenylaatiosignaalia (AATAAA) (Bimstiel et ai, 1986), mutta lähelle osuva sekvenssi GATAAA on läs- • · · nä samoissa positioissa sekä hiiren että ihmisen VFR cDNA:issa (kuvio 9). Päinvas- toin kuin hVRF.n, mVRF:n todettiin sisältävän AC dinukleotiditoiston 3' UTR:n • · 22 äärimmäisessä 3’-päässä (nukleotidipositiot 998 - 1011, kuvio 9). Tämän toistoalueen polymorfismi havaittiin joidenkin mVRF cDNA:iden välillä, nukleotidien lukumäärän vaihdellessa 7-11.

mVRF:n genomin karakterisointi 5 Introni/eksonirajat (taulukko 3) kartoitettiin käyttäen alukkeita, joiden vieressä oli sekvenssejä, jotka olivat homologisia vastaavien hVRF-rajojen kanssa. VRF:n intronit I, III, IV ja VI (taulukko 3, kuvio 12) olivat pienempiä kuin hVRF-välisekvenssit. Täydellinen genominen sekvenssi koostui mVRF:n 5' UTR:stä introniin IV, joka oli suurin välialue (2,2 kiloemästä), sekvensoitaessa mVRF:n 10 monistettuja introneita ja kloonattuja genomin osia. mVRF:n ja hVRF.n genomises-sa rakenteessa oli ainoastaan yksi suurehko eroavuus ja se oli se, että mVRF:n ek-soni 7/introni IV-raja sijaitsi 10 emäsparia alempana cDNA-sekvenssiin nähden, joten eksoni 7 on mVRF.ssä 10 emäsparia pitempi kuin vastaava eksoni hVRF:ssä.

Eksonit 6 ja 7 ovat vierekkäin mVRF:ssä, kuten todettiin olevan ihmisen homologis-15 sakin. Voimakas sekvenssihomologia mVRF.n ja hVRF.n eksonin 6 välillä (kuvio 10) johtaa ajattelemaan, että tämä sekvenssi ei ole säilynyt intronijakso, vaan että se pikemminkin koodaa jotakin VRF^-isoformin funktionaalista osaa.

Yleinen introni/eksonirakenne on säilynyt VEGF-geeniperheen (VEGF, PIGF, hVRF) eri osien välillä ja sen vuoksi ei olekaan yllättävää, että mVRF-geenin koko *:··: 20 genomin organisaatio on kovin samankaltainen kuin näiden geenien (kuvio 12).

• · • · • · · .* . Aikaisemmat vertailevat kartoitustutkimukset ovat osoittaneet, että alue, joka ympä- • · · röi ihmisen multippeliendokriimneoplasia tyypin 1 taudin lokusta kromosomissa : 1 lql3 on synteeninen hiiren kromosomin 19 Proksimaalisen segmentin kanssa : *·· (Rochelle et ai., 1992). Koska keksinnön tekijät ovat kartoittaneet hVRF-geenin • · · :.·* · 25 ihmisen MENI -lokuksen 1 kiloemäksen sisään (katso edellä), on mitä todennäköisintä, että hiiren VRF-geeni sijoittuu kromosomin 19 sentromeerin lähelle.

• · • · • · · _ *... mVRF:n iimentymistutkimukset • * · • · · • .···. Täysikasvuisen hiiren kudoksista (lihas, sydän, keuhko ja maksa) peräisin olevan l”. RNA:n Northem-analyysi osoitti, että ilmentyminen tapahtuu kaikkialla ja esiintyy • · . 30 ensisijaisesti kooltaan suunnilleen 1,3 kiloemäksen juovana (kuvio 14). Tämä eroaa • · · jonkin verran mallista, joka todettiin hVRF:ssä, jossa identifioitiin kaksi suurehkoa | 2,0 ja 5,5 kiloemäksen juovaa kaikissa tutkituissa kudoksissa. Hiiren 1,3 kiloemäk- 23 sen viesti luultavasti vastaa ihmisen lyhyempää transskriptiä ja sen koon vaihtelu johtuu sangen todennäköisesti eroavuudesta vastaavien 5' UTR:ien pituudessa.

Esimerkki 6

Hiiren VEGF:n ilmentyminen pre-ja postnataalisessa hiiressä 5 Eläimet

Ajoitetusti raskaana olevia (n=4) ja nuoria täysikasvuisia (n=2) hiiriä (sisäsiittoinen C57-kanta, ALAB, Ruotsi) lopetettiin hiilidioksidilla ja asianomaiset kudokset irrotettiin ja pakastettiin kiinnityslaitteen päällä. Kudoksia pidettiin -70°C:ssa myöhempään käyttöön asti. Tässä tutkimuksessa käytettiin kahta sikiöikää: alkiovuorokausi 8 10 (E8), 14 ja E17.

In situ hybridisaatiohistokemia

In situ hybridisaatio suoritettiin aikaisemmin kuvatulla tavalla (Dagerlind et ai, 1992). Lyhyesti, poikittaisleikkeitä (14 pm) leikattiin kryostaatissa (Microm, Saksa), sulatettiin Probe-On -levyillä (Fisher Scientific, USA) ja säilytettiin mustissa sulje-15 tuissa rasioissa -70°:ssa käyttöön asti. mVRF.ä koodaavalle mRNA.lle komplementaaristen synteettisten 42-meerioligonukleotidien sekvenssit olivat ACCACCACCTCCCTGGGCTGGCATGTGGCACGTGCATAAACG [SEQ ID NO:l 1] (komplementaarinen nukleotideille 120-161) ja AGTTGTTTGACCACATTGCCCATGAGTTCCATGCTCAGAGGC 20 [SEQ ID NO: 12] (komplementaarinen nukleotideille 162-203). Molempien vaihto-| ’’ ehtoisten silmukointimuotojen osoittamiseksi käytettiin oligonukleotidiä \} : GATCCTGGGGCTGGAGTGGGATGGATGATGTCAGCTGG [SEQ ID NO: 13] : V (komplementaarinen nukleotideille xxx-xxx) ja

! * * · · GCGGGC AGAGGATCCTGGGGCTGTCTGGCCTC AC AGC ACT

25 [SEQ ID NO: 14], Koettimet leimattiin 3'-päästä deoksiadenosiini-alfa[tio]trifosfaa-tilla [35S] (NEN, USA) käyttämällä terminaalista deoksinukleotidyylitransferaasia (IBI, USA) spesifiseen aktiviteettiin 7 -10 x 108cpm/pg ja hybridisoitiin leikkeisiin ilman esikäsittelyä 16-18 tuntia 42°C:ssa. Hybridisaatioseos sisälsi: 50 % v/v for-mamidia, 4 x SSC (1 x SSC = 0,15M NaCl ja 0,015M natriumsitraattia), 1 x Den-*·..* 30 hardtin liuosta (polyvinyylipyrrolidonia, BSA:ta ja Ficollia 0,02 % kutakin), 1 % v/v *·*’· sarkosyyliä (N-lauryylisarkosiini; Sigma), 0,02M fosfaattipuskuria (pH 7,0), 10 %

.*·*. w/v dekstraanisulfaattia (Pharmacia, Ruotsi), 250 pg/l hiiva-tRNA:ta (Sigma), 500 pg/ml leikattua ja kuumadenaturoitua lohen mäti-DNA:ta (Sigma) ja 200 mM

ditiotreitolia (DTT; LKB, Ruotsi). Vertailuleikkeissä molempien koettimien spesifi- • · 24 syys tarkistettiin lisäämällä hybridisaatioseokseen 20-kertainen ylimäärä leimaama-tonta koetinta. Lisäksi vierekkäisiä leikkeitä hybridisoitiin koettimellä, joka ei liittynyt tähän tutkimukseen ja joka tuotti erilaisen ilmentymismallin. Hybridisaation jälkeen leikkeet pestiin useaan kertaan 1 x SSC:ssä 55°C:ssa, tehtiin vedettömäksi eta-5 nolissa ja kastettiin NTB2 radioaktiiviseen merkkiemulsioon (Kodak, USA). Kolmen - viiden viikon kuluttua leikkeet kehitettiin D-19 -kehitteessä (Kodak, USA) ja päällystettiin. Joissakin tapauksissa leikkeet pantiin radioautografiafilmiä vasten (Beta-max radioautografiafilmi; Amersham Ltd., UK) ennen emulsioon kastamista.

Neljä eri koetinta tuottivat identtiset hybridisaatiomallit kaikissa tutkituissa kudok-10 sissa. Hiiren VRF:n ilmentyminen osoitettiin jo E8-alkiossa, jossa positiivinen signaali rekisteröitiin rakenteista, jotka mitä todennäköisimmin vastasivat neuroniput-kea. E14-hiirenalkion sagittaalileikkeissä voimakkain hybridisaatiosignaali esiintyi sydämen ja hermoston kohdalla, erityisesti etuaivokuoressa (kuvio 14A). Kaikissa muissa kudoksissa esiintyi alhaisemman tason ilmentymistä. Myöhemmässä sikiöi-15 ässä, E17, voimakas mVRF mRNA -signaali saatiin sydämestä ja ruskearasvakudok-sesta selässä ja kaulan ympärillä (kuvio 14B). Selvästi positiivisia hybridisaatiosig-naaleja todettiin selkäytimen harmaassa aineessa ja kielessä (kuvio 14B). Ilmentyminen etuaivokuoressa oli selvästi heikentynyt päivään 14 verrattuna. Heikko taus-taekspressio, joka todettiin E14-alkiossa esimerkiksi lihaksessa, oli alentunut tässä 20 sikiöiässä. Nuoressa täysikasvuisessa hiiressä voimakas mVRF mRNA -signaali oli todettavissa ainoastaan sydämestä ja ruskeasta rasvasta (kuvio 14C). Sydämen koh-dalta saatu signaali oli jakautunut tasaisesti koko kammionseinämän alueelle, nysty- r. lihakset mukaanluettuina (kuvio 14D). Sydänkudosleikkeissä, jotka oli hybridisoitu : .·. ylimäärällä kylmää koetinta, ei rekisteröity mitään taustasignaalista erottuvaa erityis- «V 25 leimaa (kuvio 14E).

• « • « ·· • *·· Sydämen lisäksi mVRF mRNA -signaali saatiin eräistä rintakehän ulkopuolisista :T: kudoksista, jotka morfologisesti muistuttivat ruskeaa rasvaa. Tämä tarkistettiin vas- tavärjäämällä sudaninmustalla, jolloin todettiin voimakasta värjäytymistä samoilla # alueilla (kuvio 15A ja 15B). Täysikasvuisen hiiren selkäytimen poikittaisleikkauk- 30 sissa mVRF-koettimet tuottivat neuronaalisen värjäytymiskuvion harmaan aineen • kohdalla (kuvio 15C). Vastavärjäys toluidiinilla (kuvio 15D) osoitti, että motoneu- ronit etusarvessa (kuvio 15C ja 15D), intemeuronit (kuvio 15C) takasarven syvässä osassa ja keskikanavan ympärillä olivat suuressa määrin positiivisia mVRF mRNA:n .*··. suhteen.

• · ··♦ ♦ · · • ♦ ♦ • ♦ • · 25

Esimerkki 7 VEGF- ja SOM175-proteiinien vaikutukset kanan sensorisiin neuroneihin VEGF- ja SOM175-proteiinien vaikutukset kanan 8 päivän alkion sensorisiin neuroneihin määritettiin käyttämällä Nurcomben et ai. (1992) menetelmää. Neuroniko-5 keen tulokset luettiin 48 tunnin kuluttua käyttäen 2000 solua per koekuoppa. Tulok-set saatiin käyttämällä H-tymidiinilukemia. Eloonjääneiden neuronien lukumäärä prosentteina, neuriittien kasvu ja neuriittien keskimääräinen pituus pm:inä määritettiin käyttäen NGF:ä positiivisena verrokkina ja erilaisia VEGF-konsentraatioita, VEGF:ä hepariinin läsnäollessa ja VEGF:ä hepariinin ja 5 μΜ:η kanssa 5-fluoro-10 urasiilia (5FU). 5FU tappaa gliasoluja.

Tulokset on esitetty kuviossa 16. Tulokset osoittavat, että VEGF edistää neuronien eloonjäämistä, mutta että tämä edellyttää gliasolujen läsnäoloa. Kuvio 17 esittää tuloksia kokeesta, joka koski VEGF:n ja SOM175:n vaikutusta kolmentyyppisiin kanan gliasoluihin. Testatut gliasolut olivat CNS-gliasoluja, periferaalisia gliasoluja ja 15 CNS-oligodendrosyyttejä. Hepariinia käytettiin 10 pg/ml kaikissa viljelmissä ja ko-keen tulokset luettiin 24 tunnin kuluttua. Tulokset mitattiin H-tymidiinilukemina käyttäen 2000 solua per kuoppa.

Tulokset osoittavat, että kanan sentraalisten ja perifeeristen neuronien osalta ast-rogliasolut stimuloituivat silminnähtävästi proliferoitumaan SOM175:n vaikutukses-20 ta hepariinin läsnäollessa, mutta että kanan oligodendrosyyttien jakautumisnopeus ei lisääntynyt merkittävästi.

• · • · • · · ! . Esimerkki 8 • · · • · · *!*.* SOM175-proteiinien vaikutukset hiiren primaarisiin ja sentraalisiin neuro- • · · j, ·’ neihin • · • · · 25 Esimerkissä 7 saadut tulokset osoittavat, että VEGF-isoformi vaikutti kanan pri- maarisiin ja sentraalisiin neuroneihin astrogliasolujen kautta. Samanlaisia kokeita :·. toistettiin hiiren soluilla.

• · · • · · ν' : Viljelyolosuhteet ··♦ • · *··♦* Neuronaalisia ja gliasoluja kaikkia in vitro -kokeita varten valmistettiin ja viljeltiin * 30 menetelmillä, joita on kuvattu julkaisussa "Methods in Neurosciences (Vol.2): Cell Culture", P M. Conn, toim., Academic Press, San Diego, 1990, s s. 33-46, kysymyk- • · · sen ollessa astrosoluista, ss. 56-74 kysymyksen ollessa oligodendrogliasoluista ja ss.

87-102 kysymyksen ollessa sentraalisista neuroneista.

• · 26

Solut siirrostettiin 24-kuoppaisille viljelyklustereille (Nunc), jotka oli päällystetty poly-L-omitiinilla (0,1 mg/ml, 1 h) tiheydellä 2 000 solua/kuoppa. Neljänkymme-nenkahdeksan tunnin viljelyn jälkeen neuronit laskettiin kuopissa käänteisfaasivalon alla käyttäen vakiintuneita menetelmiä (Maruta et ai., 1993) ja gliasolut määritettiin 5 [ Hjtymidiimotolla solujen jakautumisnopeuden tarkkailemiseksi alla kuvatulla ta valla. Hepariinia (10 pg/ml, pienimolekyylipainoinen fraktio, Sigma Chemical Corp.) oli läsnä kaikkina hetkinä viljelynesteessä paitsi jos muuta mainitaan. Neu-roniviljelmiin lisättiin 5 mM 5-fluoro-2-deoksiuridiinia (Sigma) taustagliasolukas-vun estämiseksi.

10 Gliasolujen proliferaatiota koskeva H-tymidiinin lisäämiskoe o

Soluja pulsoitiin sykäyksittäin 14 tuntia H-tymidiinillä (spesifinen aktiivisuus 103 pCi/ug) lähtien 0,1 mC/ml varastokonsentraatiosta standardielatusaineessa, jolloin lopulliseksi inkubointitilavuudeksi tuli 20 μΐ/kuoppa. Kuoppien sisällöt otettiin talteen ja absorboitiin nitroselluloosapaperille (Titertek, Flow). Jäljelle jääneet 15 tarttuvat solut poistettiin inkuboimalla trypsiini/verseenin kanssa (CSL Limited, Victoria, Australia) 5 minuuttia. Tämä menettely suoritettiin kaksi kertaa. Nitrosellu-loosakiekot pestiin standardin mukaisella Titertek-harvesterilla (Flow) käyttäen ensin tislattua vettä ja sitten metanolia. Nitroselluloosakiekot kuivattiin, tuikeliuos (sisälsi 5 % v/v Triton-X:ä) lisättiin ja kiekot laskettiin tuikelaskimessa.

20 SOM175 ilman eksonia 6 (SOMaX6) -valmisteilla todettiin voimakkain vaikutus ·:··: hiiren astrogliasoluviljelmiin, joissa havaittiin proliferaation huomattava stimuloi- tuminen, kun valmistetta käytettiin yhdessä hepariinin kanssa (kuvio 16). Oligo- : .·. dendrogliasolujen proliferoituminen stimuloitui vähän (kuvio 17) ja eristetyissä ··’·] etuaivokuoren neuroneissa eloonjäämisvaste oli juuri ja juuri havaittavissa (kuvio • · !.t‘ 25 18). Keskihajonta kaikissa kolmessa kaaviossa oli jokaisessa pisteessä alle 8 %.

• · ·

IM

v : Neuronien elinkykyisyyttä voidaan ylläpitää edistämällä gliasolujen proliferaatiota.

Lisäksi SOMaX6 on hyvä astrogliasolujen proliferaation indusoija ja se kykenee ·*·.. ilmentymään astroglian hermosäikeiden päätehaarakkeiden muodostuessa keskus-hermoston endoteelisoluihin.

• · · • :’ j 30 Alaan perehtyneet ymmärtävät, että tässä kuvattuun keksintöön voidaan tehdä mui-·:··· takin variaatioita ja muutoksia kuin tässä nimenomaisesti kuvattuja. On selvää, että keksintö kattaa kaikki sellaiset variaatiot ja muunnokset. Keksintö kattaa myös ];·;* kaikki vaiheet, tunnusmerkit, koostumukset ja yhdisteet, joihin tässä selityksessä • · · • · • · 27 viitataan tai jotka siinä mainitaan, erikseen tai yhdessä, ja kaikki kahden tai useamman mainitun vaiheen tai tunnusmerkin yhdistelmät.

Taulukko 3

Hiiren VGF-geenin silmukointikohdat 5' UTR1 2 3...... Eksoni 1 >223 bp CCCAGgtacgtgcgt Introni I 495 bp ttccccacagGCCCC Eksoni 2 43 bp GAAAGgtaataatag Introni II 288 bp ctgcccacagTGGTG Eksoni 3 197 bp TGCAGgtaccagggc Introni III 196 bp ctgagcacagATCCT Eksoni 4 74 bp TGCAGgtgccagccc Introni IV 182 bp ctcttttcagACCTA Eksoni 5 36 bp GACAGattcttggtg Introni V 191 bp ctcctcctagGGTTG Eksoni 6 101 bp (ei intronia) CCCACTCCAGCCCCA Eksoni 7 135 bp TGTAGgtaaggagtc Introni VI ~2200bp cactccccagGTGCC Eksoni 8 394 bp AGAGATGGAGACACT 5 Isot kiijaimet ja pienet kiijaimet tarkoittavat eksoni- ja intronijaksoja, vastaavassa järjestyksessä.

* tarkoittaa, että eksonin 1 5-päätä ei ole vielä määritetty.

• · • · • · · • · • 1 · • · · • · · · • · · • · · • · • · • · · ··· • · · • · · • · • · • · · • · · • · · • · · · · • · • · 2 • · · • · • · · • · • · 3 • · · • « · • · • · 28

Kirjallisuusluettelo

Adams MD, Soares MB, Kerlavage AR, Fields C, Venter JC, (1993) Nature Genet, 4,373-380.

Bimstiel ML, Busslinger M ja Strub K (1985) Cell 41, 349-359.

5 Breier G, Albrecht U, Sterrer S ja Risau W (1992) Development 114, 521 -532.

Chomczynski P ja Sacchi N (1987) Analyt Biochem. 162,156-159.

Church G ja Gilbert W (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 18,1991-1995.

Dagerlind A, Friberg K, Beab AJ ja Hokfelt T (1992) Histochemistry 98, 39-49. Dissen GA, Lara HE, Fabrenbach WH, Costa ME, Ojeda SR (1994) Endocrinology 10 134,1146-1154.

Drinkwater CC, Barker PA, Suter U ja Shooter EM (1993) J. Biol. Chem., 268, 23202-23207.

Drinkwater CC, Suter U, Angst C ja Shooter EM (1991) Proc. Roy. Soc. Lond. (Series B), 246, 307-313.

15 Ewton DZ & Florini JR (1980) Endocrinology, 106: 577-583.

Ferrara N & Henzel WJ (1989) Biochem. Biophys. Res. Commun. 161, 851-858.

Folkman J & Shing Y (1992) J. Biol. Chem. 267, 10931-10934

Gospodarowicz D, Abraham JA & Schilling J (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86, 7311-7315.

20 Gospodarowicz D, Weseman J, Morgan JS & Lindström J (1976) J. Cell Biol, 70: *·*':· 395-405.

• *·· Hagg T, Quon D, Higaki J & Varon S (1992) Neuron, 8, 145-158.

j#| · Hefti S (1986) J. Neurosci, 6,2155-2162.

:*·]: Hendry IA & Campbell J (1976) J. Neurocytol, 5, 351-360.

·’·.. 25 Hendry IA, Murphy M, Hilton DJ, Nicola ΝΑ & Bartlett PF (1992) J. Neurosci. 12, !·:·. 3427-3434.

• · ·

Hunt et ai, (1967)Am. J. Surgery, 114: 302-307.

.. Koch AE, Harlow LA, Haines GK, Amento EP, Unemoti EN, Wong WL, Pope RM, ’... Ferrara N, (1994)7. Immunol. 152,4149-4156.

:·; : 30 Kromer AF (1987) Science, 235, 214-216.

Larsson C, Weber G, Kvanta E, Lewis C, Janson M, Jones C, Glaser T, Evans G, ·:··· Nordenskjold M, (1992) Hum. Genet. 89, 187-193.

.:. Ozus Leung DW, Cachianes G, Kuang W-J, Goeddel DV & Ferrara N (1989) ’··* Science 246: 1306-1309.

φ · · ♦ ·* 35 Lowe C, Cornish J, Callon K, Martin TJ & Reid IR (1991) J. Bone Mineral Res., 6, 1277-1283.

Lowe C, Cornish J, Martin TJ & Reid IR (1991) Calcif. Tissue Int., 49, 394-397.

29

Martinou JC, Martinou I & Kato AC (1992) Nueorn, 8, 737-744.

Maruta etal., (1993) Growth Factors 8: 119-134.

Midy V & Plouet J (1994) Biochem. Biophys. Res. Commun., 199: 380-386.

Miles AA & Miles EM (1952) J. Physiol. (Lond) 118: 228-257.

5 Montesano R, Vassalli JD, Baird A, Guillemin R & Orci L (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83,7297-7301.

Nurcombe et al., (1992) Development 116: 1175-1183.

Otto D, Frotscher M & Unsicker K (1989) J. Neurosci. Res., 22, 83-91.

Pepper MS, Ferrara N, Orci L, Montesano R (1991) Biochem. Biophys. Res. Com-10 mun. 181, 902-906.

Rochell JM, Watson ML, Oakey RJ ja Seidin MF (1992) Genomics 14,26-31.

Roth S & Weston J (1967) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 58: 974-980.

Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual - 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.

15 Santos MA (1991) Nucleic Acids Res. 19, 5442.

Schilling et al., (1959) Surgery, 46: 702-710.

Senger DR, Van De Water L, Brown LF, Nagy JA, Yeo KT, Yeo TK, Berse B, Jackman RW, Dvorak AM, Dvorak HF (1993) Cancer Metastasis Rev. 12, 303-324. Sharkey AM, Chamock-Jones DS, Boocock CA, Brown KD, Smith SK, (1993) J. 20 Reprod. Fertill. 99, 609-615.

. Sunderkotter C, Steinbrink K, Goebeler M, Bhardway R, Sorg E, (1993) J. Leu- kocyt. Biol. 55,410-422.

: 1’ Suter U, Angst C, Tien C-L, Drinkwater CC, Lindsay RM ja Shooter EM (1992) J.

:.: : Neurosci., 12, 306-318.

• 25 Tischer E, Mitchell R, Hartman T, Silva M, Gospodarowicz D, Fiddes JC & Abra- ham J (1991) J. Biol. Chem. 266, 11947-11954.

Williams LR, Varon S, Peterson GM, Wictorin K, Fischer W, Björklund A & Gage FH (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 9231 -9235.

:·. Yan Z, Weich HA, Bemart W, Breckwoldt M, Neulen J, (1993) J. Clin. Endocrinol.

:..i’ 30 Metab. 11,1723-1725.

*. Yip NK, Rich KM, Lampe PA & Johnson EM Jr (1984) J. Neurosci. 4,2986-2992.

• · · • · * · • · · • · • · · • · • · • · · · · • » · • · # · 30

Sekvenssiluettelo (1) YLEISINFORMAATIO: (i) HAKIJA: (muut maat kuin USA) AMRAD OPERATIONS PTY. LTD.

(vain meillä) Hayward, N ja Weber, G

(ii) KEKSINNÖN NIMITYS: Uusi kasvutekijä ja sitä koodaava geenisekvenssi (iii) SEKVENSSIEN LUKUMÄÄRÄ: 14 (iv) POSTIOSOITE: (A) VASTAANOTTAJA: Davies Collison Cave (B) KATUOSOITE: 1 Little Collins Street (C) KAUPUNKI: Melbourne (D) OSAVALTIO: Victoria (E) MAA: Australia (F) ZIP: 3000 (v) TIETOKONEKIELINEN MUOTO: (A) VÄLINETYYPPI; levyke (B) TIETOKONE: IBM PC yhteensopiva

(C) KÄYTTÖJÄRJESTELMÄ: PC-DOS/MS-DOS

: ’·* (D) OHJELMISTO: Patentin Release # 1.0, Version # 1.25 • · • · · • · · !”·! (vi) TÄMÄNHETKISET HAKEMUSTIEDOT:

!./ (A) HAKEMUSNUMERO: PCT INTERNATIONAL

·..!* (B) HAKEMUSPÄIVÄ: 22. helmikuuta 1996 • · · • · · • (vn) TIEDOT PRIORITEETTIHAKEMUKSISTA: (A) HAKEMUSNUMERO. AU PN 1457 (B) HAKEMUSPÄIVÄ: 2. maaliskuuta 1995 I:. (A) HAKEMUSNUMERO. AU PN6647 :···; (B) HAKEMUSPÄIVÄ: 20. marraskuuta 1995 (A) HAKEMUSNUMERO. AU PN7274 ·/··: (B) HAKEMUSPÄIVÄ: 22. joulukuuta 1995 • · · • · · • (viii) ASIAMIESTIEDOT:

(A) NIMI: Hughes DR, E John L

(C) VIITE/ASIANUMERO: EJH/EK

31 (ix) TELEK0MMUN1KAATI0T1ED0T: (A) PUHELIN: +61 3 9254 2777 (B) TELEFAX: +61 3 9254 2770 (2) SEQ ID NO: 1 :TÄ KOSKEVAT TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 646 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(ix) TUNNUSMERKIT:

(A) NIMI/AVAIN: CDS

(B) SUAINTI: 17.589 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 1: TCGGGCCTCC GAAACC ATG AAC TTT CTG CTG TCT TGG GTG CAT TGG AGC 49

Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Vai His Trp Ser 1 5 10 : ·. CTT GCC TTG CTG CTC TAC CTC CAC CAT GCC AAG TGG TCC CAG GCT GCA 97 • · · * . Leu Ala Leu Leu Leu Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gin Ala Ala : 15 20 25 • · · • · · • « I. / CCC ATG GC A GAA GG A GGA GGG CAG AAT CAT CAC GAA GTG GTG AAG TTC 145 • Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gin Asn His His Glu Vai Vai Lys Phe 30 35 40 .. ATG GAT GTC T AT CAG CGC AGC TAC TGC CAT CC A ATC GAG ACC CTG GTG 193 • *·· Met Asp Vai Tyr Gin Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Vai 45 50 55 • GAC ATC TTC CAG G AG TAC CCT GAT GAG ATC GAG TAC ATC TTC AAG CC A 241 ·;··· Asp Ile Phe Gin Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro . 60 65 70 75 ··· • · ♦ · TCC TGT GTG CCC CTG ATG CGA TGC GGG GGC TGC TGC AAT GAC GAG GGC 289 * * Ser Cys Vai Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly 80 85 90 32 CTG GAG TGT GTG CCC ACT GAG GAG TCC AAC ATC ACC ATG CAG ATT ATG 337

Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn lie Thr Met Gin lie Met 95 100 105 CGG ATC AAA CCT CAC CAA GGC CAG CAC ATA GGA GAG ATG AGC TTC CTA 385

Arg He Lys Pro His Gin Gly Gin His He Gly Glu Met Ser Phe Leu 110 115 120 CAG CAC AAC AAA TGT GAA TGC AGA CCA AAG AAA GAT AGA GCA AGA CAA 433

Gin His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gin 125 130 135 GAA AAT CCC TGT GGG CCT TGC TCA GAG CGG AGA AAG CAT TTG TTT GTA 481

Glu Asn Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe Val 140 145 150 155 CAA GAT CCG CAG ACG TGT AAA TGT TCC TGC AAA AAC ACA GAC TCG CGT 529

Gin Asp Pro Gin Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg 160 165 170 TGC AAG GCG AGG CAG CTT GAG TTA AAC GAA CGT ACT TGC AGA TGT GAC 577

Cys Lys Ala Arg Gin Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp 175 180 185 AAG CCG AGG CGG TGAGCCGGGC AGGAGGAAGG AGCCTCCCTC AGCGTTTCGG 629 . Lys Pro Arg Arg 190 • · • · • · * i .·. GAACCAGATC TCTCACCAGG 649 • · « ··· · • · · • · · : ·' (2) SEQ ID NO:2:TA KOSKEVAT TIEDOT: • · • · • ·· (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 191 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo • · · (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • ♦ · « ♦ · ♦ .···. (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini • # ··· (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:2: • · · • · * · · · * Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Vai His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu :***: 1 5 10 15 • ·

Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gin Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly 20 25 30 33

Gly Gly Gin Asn His His Glu Vai Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gin 35 40 45

Arg Ser Tyr Cys His Pro He Glu Thr Leu Val Asp He Phe Gin Glu 50 55 60

Tyr Pro Asp Glu lie Glu Tyr lie Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu 65 70 75 80

Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro 85 90 95

Thr Glu Glu Ser Asn lie Thr Met Gin He Met Arg lie Lys Pro His 100 105 110

Gin Gly Gin His He Gly Glu Met Ser Phe Leu Gin His Asn Lys Cys 115 120 125

Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gin Glu Asn Pro Cys Gly 130 135 140

Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe Val Gin Asp Pro Gin Thr 145 150 155 160

Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gin 165 170 175 • · • · • · · I . Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg '··· ’ 180 185 190 • · · • · · « · • · (2) SEQ ID NO:3:A KOSKEVAT TIEDOT: • · · • · · ’** * (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 1094 emäsparia • · : (B) TYYPPI: nukleiinihappo • · · : (C) SÄIKEISYYS: yksisäikeinen .*·. (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • · • · ·

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

• · » • · I":’ (ix) TUNNUSMERKIT: • · ·

: ·’ (A) NIMI/AVAIN: CDS

(B) SIJAINTI: 3...624 34 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS SEQ ID N0:3: CC ATG AGC CCT CTG CTC CGC CGC CTG CTG CTC GCC GCA CTC CTG CAG 47

Met Ser Pro Leu Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ala Ala Leu Leu Gin 15 10 15 CTG GCC CCC GCC CAG GCC CCT GTC TCC CAG CCT GAT GCC CCT GGC CAC 95

Leu Ala Pro Ala Gin Ala Pro Val Ser Gin Pro Asp Ala Pro Gly His 20 25 30 CAG AGG AAA GTG GTG TCA TGG ATA GAT GTG TAT ACT CGC GCT ACC TGC 143

Gin Arg Lys Val Val Ser Trp lie Asp Val Tyr Thr Arg Ala Thr Cys 35 40 45 CAG CCC CGG GAG GTG GTG GTG CCC TTG ACT GTG GAG CTC ATG GGC ACC 191

Gin Pro Arg Glu Val Val Val Pro Leu Thr Val Glu Leu Met Gly Thr 50 55 60 GTG GCC AAA CAG CTG GTG CCC AGC TGC GTG ACT GTG CAG CGC TGT GGT 239

Val Ala Lys Gin Leu Val Pro Ser Cys Val Thr Val Gin Arg Cys Gly 65 70 75 GGC TGC TGC CCT GAC GAT GGC CTG GAG TGT GTG CCC ACT GGG CAG CAC 287

Gly Cys Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gin His 80 85 90 95 . CAA GTC CGG ATG CAG ATC CTC ATG ATC CGG TAC CCG AGC AGT CAG CTG 335

Gin Val Arg Met Gin He Leu Met lie Arg Tyr Pro Ser Ser Gin Leu i*·.. 100 105 110 • · • · · : GGG GAG ATG TCC CTG GAA GAA CAC AGC CAG TGT GAA TGC AGA CCT AAA 383 • · · • *.· Gly Glu Met Ser Leu Glu Glu His Ser Gin Cys Glu Cys Arg Pro Lys :·· 115 120 125 • · · • · · : : AAA AAG GAC AGT GCT GTG AAG CCA GAC AGG GCT GCC ACT CCC CAC CAC 431

Lys Lys Asp Ser Ala Val Lys Pro Asp Arg Ala Ala Thr Pro His His 130 135 140 • · · • · · : CGT CCC CAG CCC CGT TCT GTT CCG GGC TGG GAC TCT GCC CCC GGA GCA 479 #···# Arg Pro Gin Pro Arg Ser Val Pro Gly Trp Asp Ser Ala Pro Gly Ala *···* 145 150 155 • · .:. CCC TCC CCA GCT GAC ATC ACC CAT CCC ACT CCA GCC CCA GGC CCC TCT 527

Pro Ser Pro Ala Asp He Thr His Pro Thr Pro Ala Pro Gly Pro Ser 160 165 170 175 • · 35 GCC CAC GCT GCA CCC AGC ACC ACC AGC GCC CTG ACC CCC GGA CCT GCC 575

Ala His Ala Ala Pro Ser Thr Thr Ser Ala Leu Thr Pro Gly Pro Ala 180 185 190 GCT GCC GCT GCC GAC GCC GCA GCT TCC TCC GTT GCC AAG GGC GGG GCT T 624

Ala Ala Ala Ala Asp Ala Ala Ala Ser Ser Val Ala Lys Gly Gly Ala 195 200 205 AGAGCTCAAC CCAGACACCT GCAGGTGCCG GAAGCTGCGA AGGTGACACA TGGCTTTTCA 684 GACTCAGCAG GGTGACTTGC CTCAGAGGCT ATATCCCAGT GGGGGAACAA AGGGGAGCCT 744 GGTAAAAAAC AGCCAAGCCC CCAAGACCTC AGCCCAGGCA GAAGCTGCTC TAGGACCTGG 804 GCCTCTCAGA GGGCTCTTCT GCCATCCCTT GTCTCCCTGA GGCCATCATC AAACAGGACA 864 GAGTTGGAAG AGGAGACTGG GAGGCAGCAA GAGGGGTCAC ATACCAGCTC AGGGGAGAAT 924 GGAGTACTGT CTCAGTTTCT AACCACTCTG TGCAAGTAAG CATCTTACAA CTGGCTCTTC 984 CTCCCCTCAC TAAGAAGACC CAAACCTCTG CATAATGGGA TTTGGGCTTT GGTACAAGAA 1044 CTGTGACCCC CAACCCTGAT AAAAGAGATG GAAGGAAAAA AAAAAAAAAA 1094

·:**: (2) SEQ ID N0 4 ÄÄ KOSKEVAT TIEDOT

• ♦ • ♦ ♦ ·· I . (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: • · · I;1/ (A) PITUUS: 207 aminohappoa • · · · (B) TYYPPI: aminohappo • *’ (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • · · • · · • · · (ii) MOLEKYYLIT YYPPI: proteiini • · : (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:4: • · · • · · • · · • Met Ser Pro Leu Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ala Ala Leu Leu Gin Leu 15 io is ··· . Ala Pro Ala Gin Ala Pro Vai Ser Gin Pro Asp Ala Pro Gly His Gin 20 25 30 ··· • · · • * · • * Arg Lys Vai Vai Ser Trp Ile Asp Vai Tyr Thr Arg Ala Thr Cys Gin 35 40 45 36

Pro Arg Glu Vai Vai Val Pro Leu Thr Val Glu Leu Met Gly Thr Val 50 55 60

Ala Lys Gin Leu Val Pro Ser Cys Val Thr Val Gin Arg Cys Gly Gly 65 70 75 80

Cys Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gin His Gin 85 90 95

Val Arg Met Gin lie Leu Met lie Arg Tyr Pro Ser Ser Gin Leu Gly 100 105 110

Glu Met Ser Leu Glu Glu His Ser Gin Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys 115 120 125

Lys Asp Ser Ala Val Lys Pro Asp Arg Ala Ala Thr Pro His His Arg 130 135 140

Pro Gin Pro Arg Ser Val Pro Gly Trp Asp Ser Ala Pro Gly Ala Pro 145 150 155 160

Ser Pro Ala Asp He Thr His Pro Thr Pro Ala Pro Gly Pro Ser Ala 165 170 175

His Ala Ala Pro Ser Thr Thr Ser Ala Leu Thr Pro Gly Pro Ala Ala 180 185 190 • · ; ·. Ala Ala Ala Asp Ala Ala Ala Ser Ser Val Ala Lys Gly Gly Ala \ 195 200 205 • · · • · · • · · · • · · • · · • · • · ·*·.. (2) SEQ ID NO 5:TÄ KOSKEVAT TIEDOT: ··» • · · *·* * (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 993 emäsparia • · : ·* (B) TYYPPI: nukleiinihappo ·.· · (C) SÄIKEISYYS yksisäikeinen .···. (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • · • · ·

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

• · · • · li*!" (ix) TUNNUSMERKIT: • · ·

: ·' (A) NIMI/AVAIN. CDS

(B) SIJAINTI: 3. .566 37 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID N0:5: CC ATG AGC CCT CTG CTC CGC CGC CTG CTG CTC GCC GCA CTC CTG CAG 47

Met Ser Pro Leu Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ala Ala Leu Leu Gin 15 10 15 CTG GCC CCC GCC CAG GCC CCT GTC TCC CAG CCT GAT GCC CCT GGC CAC 95

Leu Ala Pro Ala Gin Ala Pro Val Ser Gin Pro Asp Ala Pro Gly His 20 25 30 CAG AGG AAA GTG GTG TCA TGG ATA GAT GTG TAT ACT CGC GCT ACC TGC 143

Gin Arg Lys Val Val Ser Trp lie Asp Val Tyr Thr Arg Ala Thr Cys 35 40 45 CAG CCC CGG GAG GTG GTG GTG CCC TTG ACT GTG GAG CTC ATG GGC ACC 191

Gin Pro Arg Glu Val Val Val Pro Leu Thr Val Glu Leu Met Gly Thr 50 55 60 GTG GCC AAA CAG CTG GTG CCC AGC TGC GTG ACT GTG CAG CGC TGT GGT 239

Val Ala Lys Gin Leu Val Pro Ser Cys Val Thr Val Gin Arg Cys Gly 65 70 75 GGC TGC TGC CCT GAC GAT GGC CTG GAG TGT GTG CCC ACT GGG CAG CAC 287

Gly Cys Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gin His 80 85 90 95 ' ·’ * · CAA GTC CGG ATG CAG ATC CTC ATG ATC CGG TAC CCG AGC AGT CAG CTG 335

Gin Val Arg Met Gin He Leu Met He Arg Tyr Pro Ser Ser Gin Leu ! . 100 105 110 • · · • · · • ·· · ·***: GGG GAG ATG TCC CTG GAA GAA CAC AGC CAG TGT GAA TGC AGA CCT AAA 383 • · ;·. Gly Glu Met Ser Leu Glu Glu His Ser Gin Cys Glu Cys Arg Pro Lys 115 120 125 • · · • · · • AAA AAG GAC AGT GCT GTG AAG CCA GAT AGC CCC AGG CCC CTC TGC CCA 431 .·_ Lys Lys Asp Ser Ala Val Lys Pro Asp Ser Pro Arg Pro Leu Cys Pro Ϊ *’ 130 135 140 • · · • « · * · · • .:. CGC TGC ACC CAG CAC CAC CAG CGC CCT GAC CCC CGG ACC TGC CGC TGC 479

Arg Cys Thr Gin His His Gin Arg Pro Asp Pro Arg Thr Cys Arg Cys ·:··· 145 150 155 • C.: CGC TGC CGA CGC CGC AGC TTC CTC CGT TGC CAA GGG CGG GGC TTA GAG 527

Arg Cys Arg Arg Arg Ser Phe Leu Arg Cys Gin Gly Arg Gly Leu Glu * ' 160 165 170 175 38 CTC AAC CCA GAC ACC TGC AGG TGC CGG AAG CTG CGA AGG TGACACATGG 576

Leu Asn Pro Asp Thr Cys Arg Cys Arg Lys Leu Arg Arg 180 185 CTTTTCAGAC TCAGCAGGGT GACTTGCCTC AGAGGCTATA TCCCAGTGGG GGAACAAAGG 636 GGAGCCTGGT AAAAAACAGC CAAGCCCCCA AGACCTCAGC CCAGGCAGAA GCTGCTCTAG 696 GACCTGGGCC TCTCAGAGGG CTCTTCTGCC ATCCCTTGTC TCCCTGAGGC CATCATCAAA 756 CAGGACAGAG TTGGAAGAGG AGACTGGGAG GCAGCAAGAG GGGTCACATA CCAGCTCAGG 816 GGAGAATGGA GTACTGTCTC AGTTTCTAAC CACTCTGTGC AAGTAAGCAT CTTACAACTG 876 GCTCTTCCTC CCCTCACTAA GAAGACCCAA ACCTCTGCAT AATGGGATTT GGGCTTTGGT 936 ACAAGAACTG TGACCCCCAA CCCTGATAAA AGAGATGGAA GGAAAAAAAA AAAAAAA 993 (2) SEQ ID NO:6:TA KOSKEVAT TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 188 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • · • · • ·· : (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini • ·· · • · · i V (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:6: • · • · • ··

Met Ser Pro Leu Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ala Ala Leu Leu Gin Leu *·* * 1 5 10 15 ", Ala Pro Ala Gin Ala Pro Vai Ser Gin Pro Asp Ala Pro Gly His Gin 20 25 30 • « f • ♦ ♦ • .···, Arg Lys Vai Vai Ser Trp Ile Asp Vai Tyr Thr Arg Ala Thr Cys Gin '··♦* 35 40 45 • ·

Pro Arg Glu Vai Vai Vai Pro Leu Thr Vai Glu Leu Met Gly Thr Vai :...* 50 55 60 • · · • · · • · • ·

Ala Lys Gin Leu Vai Pro Ser Cys Vai Thr Vai Gin Arg Cys Gly Gly 65 70 75 80 39

Cys Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gin His Gin 85 90 95

Val Arg Met Gin lie Leu Met He Arg Tyr Pro Ser Ser Gin Leu Gly 100 105 110

Glu Met Ser Leu Glu Glu His Ser Gin Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys 115 120 125

Lys Asp Ser Ala Val Lys Pro Asp Ser Pro Arg Pro Leu Cys Pro Arg 130 135 140

Cys Thr Gin His His Gin Arg Pro Asp Pro Arg Thr Cys Arg Cys Arg 145 150 155 160

Cys Arg Arg Arg Ser Phe Leu Arg Cys Gin Gly Arg Gly Leu Glu Leu 165 170 175

Asn Pro Asp Thr Cys Arg Cys Arg Lys Leu Arg Arg 180 185 (2) SEQ ID NO:7:ÄÄ KOSKEVAT TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: * (A) PITUUS. 858 emäsparia • · : ** (B) TYYPPI: nukleiinihappo ·.· ; (C) SÄIKEISYYS: yksisäikeinen i * ϊ (D) TOPOLOGIA, lineaarinen • · • · • · ^

*... (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

• · · • · · (ix) TUNNUSMERKIT:

·*·.. (A) NIMI/AVAIN: CDS

(B) SIJAINTI. 3...431 :***: (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ED NO:7: CC ATG AGC CCT CTG CTC CGC CGC CTG CTG CTC GCC GCA CTC CTG CAG 47 .***· Met Ser Pro Leu Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ala Ala Leu Leu Gin .Π 15 10 15 • · · • · • · 40 CTG GCC CCC GCC CAG GCC CCT GTC TCC CAG CCT GAT GCC CCT GGC CAC 95

Leu Ala Pro Ala Gin Ala Pro Val Ser Gin Pro Asp Ala Pro Gly His 20 25 30 CAG AGG AAA GTG GTG TCA TGG ATA GAT GTG TAT ACT CGC GCT ACC TGC 143

Gin Arg Lys Val Val Ser Trp lie Asp Val Tyr Thr Arg Ala Thr Cys 35 40 45 CAG CCC CGG GAG GTG GTG GTG CCC TTG ACT GTG GAG CTC ATG GGC ACC 191

Gin Pro Arg Glu Val Val Val Pro Leu Thr Val Glu Leu Met Gly Thr 50 55 60 GTG GCC AAA CAG CTG GTG CCC AGC TGC GTG ACT GTG CAG CGC TGT GGT 239

Val Ala Lys Gin Leu Val Pro Ser Cys Val Thr Val Gin Arg Cys Gly 65 70 75 GGC TGC TGC CCT GAC GAT GGC CTG GAG TGT GTG CCC ACT GGG CAG CAC 287

Gly Cys Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gin His 80 85 90 95 CAA GTC CGG ATG CAG ATC CTC ATG ATC CGG TAC CCG AGC AGT CAG CTG 335

Gin Val Arg Met Gin He Leu Met lie Arg Tyr Pro Ser Ser Gin Leu 100 105 110 GGG GAG ATG TCC CTG GAA GAA CAC AGC CAG TGT GAA TGC AGA CCT AAA 383

Gly Glu Met Ser Leu Glu Glu His Ser Gin Cys Glu Cys Arg Pro Lys 115 120 125 • *: ‘: AAA AAG GAC AGT GCT GTG AAG CCA GAT AGG TGC CGG AAG CTG CGA AGG 431 ·*·.. Lys Lys Asp Ser Ala Val Lys Pro Asp Arg Cys Arg Lys Leu Arg Arg * · 130 135 140 • · · • · · ··· · • · « • TGACACATGG CTTTTCAGAC TCAGCAGGGT GACTTGCCTC AGAGGCTATA TCCCAGTGGG 491 • * • · • · · GGAACAAAGGGGAGCCTGGTAAAAAACAGC CAAGCCCCCA AGACCTCAGCCCAGGCAGAA 551 • · · • · · GCTGCTCTAG GACCTGGGCC TCTCAGAGGG CTCTTCTGCC ATCCCTTGTC TCCCTGAGGC 611 • · • · : ** CATCATCAAA CAGGACAGAG TTGGAAGAGG AGACTGGGAG GCAGCAAGAG GGGTCACATA 671 • · · • · · • mm .I. CCAGCTCAGG GGAGAATGGA GTACTGTCTC AGTTTCTAAC CACTCTGTGC AAGTAAGCAT 731 * · • · • · · CTTACAACTG GCTCTTCCTC CCCTCACTAA GAAGACCCAA ACCTCTGCAT AATGGGATTT 791 *·· GGGCTTTGGT ACAAGAACTG TGACCCCCAA CCCTGATAAA AGAGATGGAA GGAAAAAAAA 851 ·· · ♦ · · ♦ · AAAAAAA 858 41 (2) SEQ ID N0:8:AA KOSKEVAT TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISUUDET.

(A) PITUUS: 143 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO 8

Met Ser Pro Leu Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ala Ala Leu Leu Gin Leu 1 5 10 15

Ala Pro Ala Gin Ala Pro Vai Ser Gin Pro Asp Ala Pro Gly His Gin 20 25 30

Arg Lys Vai Vai Ser Trp Ile Asp Vai Tyr Thr Arg Ala Thr Cys Gin 35 40 45

Pro Arg Glu Vai Vai Vai Pro Leu Thr Vai Glu Leu Met Gly Thr Vai 50 55 60

Ala Lys Gin Leu Vai Pro Ser Cys Vai Thr Vai Gin Arg Cys Gly Gly 65 70 75 80 • · .. Cys Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Vai Pro Thr Gly Gin His Gin 85 90 95 • · • · · • · · • ·· · l 1. 1. Vai Arg Met Gin Ile Leu Met Ile Arg Tyr Pro Ser Ser Gin Leu Gly I. 2 3 100 105 110 • · • ·· :1·1; Glu Met Ser Leu Glu Glu His Ser Gin Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys 115 120 125 • · • 1 · · Lys Asp Ser Ala Vai Lys Pro Asp Arg Cys Arg Lys Leu Arg Arg 130 135 140 • · · · · • · 2 • · 3 • · (2) SEQ ID NO:9:ÄÄ KOSKEVAT TIEDOT.

• · • · • · · (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 910 emäsparia (B) TYYPPI, nukleiinihappo 42 (C) SÄIKEISYYS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI DNA

(ix) TUNNUSMERKIT:

(A) NIMI/AVAIN: CDS

(B) SIJAINTI: 3...305 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS SEQ ID NO:9 CC ATG AGC CCT CTG CTC CGC CGC CTG CTG CTC GCC GCA CTC CTG CAG 47

Met Ser Pro Leu Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ala Ala Leu Leu Gin 15 10 15 CTG GCC CCC GCC CAG GCC CCT GTC TCC CAG CCT GAT GCC CCT GGC CAC 95

Leu Ala Pro Ala Gin Ala Pro Vai Ser Gin Pro Asp Ala Pro Gly His 20 25 30 CAG AGG AAA GTG GTG TCA TGG ATA GAT GTG TAT ACT CGC GCT ACC TGC 143

Gin Arg Lys Vai Vai Ser Trp Ile Asp Vai Tyr Thr Arg Ala Thr Cys 35 40 45 CAG CCC CGG GAG GTG GTG GTG CCC TTG ACT GTG GAG CTC ATG GGC ACC 191

Gin Pro Arg Glu Vai Vai Vai Pro Leu Thr Vai Glu Leu Met Gly Thr 50 55 60 • · • · : *·* GTG GCC AAA CAG CTG GTG CCC AGC TGC GTG ACT GTG CAG CGC TGT GGT 239 j .' : Vai Ala Lys Gin Leu Vai Pro Ser Cys Vai Thr Vai Gin Arg Cys Gly 65 70 75 • · • · « · : *·* GGC TGC TGC CCT GAC GAT GGC CTG GAG TGT GTG CCC ACT GGG CAG CAC 287

Gly Cys Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Vai Pro Thr Gly Gin His 80 85 90 95 j * *. · CAA GTC CGG ATG CAG ACC TAAAAAAAAG GACAGTGCTG TGAAGCCAGA 335

Gin Vai Arg Met Gin Thr • · · \ 100 »•t • * • « ....: CAGGGCTGCC ACTCCCCACC ACCGTCCCCA GCCCCGTTCT GTTCCGGGCT GGGACTCTGC 395 • · • * · *. CCCCGGAGCA CCCTCCCCAG CTGACATCAC CCATCCCACT CCAGCCCCAG GCCCCTCTGC 455 • · ♦ ·· ·· · ♦ · · : ♦* CCACGCTGCA CCCAGCACCA CCAGCGCCCT GACCCCCGGA CCTGCCGCTG CCGCTGCCGA 515 CGCCGCAGCT TCCTCCGTTG CCAAGGGCGG GGCTTAGAGC TCAACCCAGA CACCTGCAGG 575 43 TGCCGGAAGC TGCGAAGGTG ACACATGGCT TTTCAGACTC AGCAGGGTGA CTTGCCTCAG 635 AGGCTATATC CCAGTGGGGA ACAAAGAGGA GCCTGGTAAA AAACAGCCAA GCCCCCAAGA 695 CCTCAGCCCA GGCAGAAGCT GCTCTAGGAC CTGGGCCTCT CAGAGGGCTC TTCTGCCATC 755 CCTTGTCTCC CTGAGGCCAT CATCAAACAG GACAGAGTTG GAAGAGGAGA CTGGGAGGCA 815 GCAAGAGGGG TCACATACCA GCTCAGGGGA GAATGGAGTA CTGTCTCAGT TTCTAACCAC 875 TCTGTGCAAG TAAGC ATCTT AC AACTGGCT CTTCC 910 (2) SEQ ID NO.IOTA KOSKEVAT TIEDOT.

(i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET.

(A) PITUUS: 101 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini . (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 10: • · ί *. Met Ser Pro Leu Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ala Ala Leu Leu Gin Leu i ; 1 5 10 15 • · · • · · • · · · : * * *: Ala Pro Ala Gin Ala Pro Vai Ser Gin Pro Asp Ala Pro Gly His Gin ··.* 20 25 30 • ·· • · · •. * · Arg Lys Vai Vai Ser Trp Ile Asp Vai Tyr Thr Arg Ala Thr Cys Gin 35 40 45 ·· • '* Pro Arg Glu Vai Vai Vai Pro Leu Thr Vai Glu Leu Met Gly Thr Vai 50 55 60 • · · *... * Ala Lys Gin Leu Vai Pro Ser Cys Vai Thr Vai Gin Arg Cys Gly Gly ·;··· 65 70 75 80 • ! _ Cys Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Vai Pro Thr Gly Gin His Gin :·.·. 85 90 95 ·’ ** Vai Arg Met Gin Thr 100 44 (2) SEQ ID NO. 11 :TÄ KOSKEVAT TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 42 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA, lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: oligonukleotidi (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 11: ACCACCACCT CCCTGGGCTG GCATGTGGCA CGTGCATAAA CG 42

(2) SEQ ID NO. 12 TA KOSKEVAT TIEDOT

(1) SEKVENSSIN OMINAISUUDET

(A) PITUUS: 42 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLIT YYPPI: oligonukleotidi * · • · ί ’'· · (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 12: • · • · · I!*/ AGTTGTTTGA CC AC ATTGCC CATGAGTTCC ATGCTCAGAG GC 42 • · · • · • · • · • · • · · (2) seq id no i3:AKOSKEVAT TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: • · v y • · • ** (A) PITUUS: 38 emäsparia • · · V : (B) TYYPPI: nukleiinihappo ;’**· (C) SÄIKEISYYS: yksisäikeinen • · · (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • · I : (ii) MOLEKYYLIT YYPPI: oligonukleotidi • · · •« · • · · : *’ (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 13: GATCCTGGGG CTGGAGTGGG ATGGATGATG TCAGCTGG 38 i 45

(2) SEQ ID NO:14:ÄÄ KOSKEVAT TIEDOT

(i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 40 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI. oligonukleotidi (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 14: GCGGGCAGAG GATCCTGGGG CTGTCTGGCC TCACAGCACT 40 • · • · • · • · · • · • · · • · · • · · · • · · • f · • · • 1 • · • ·

• M

• · 9 • · · « · · • · • · • · · • · · • » « • · · · · • · • · • · · • · • · · • · • « • · · • · · • · · • · • ·

Claims (19)

1. Eristetty polypeptidi, jolla on ainakin yksi seuraavista ominaisuuksista: (i) kyky indusoida verisuonten endoteelisoluja; (ii) kyky olla vuorovaikutuksessaflt-\/flk-\ -reseptoriperheen kanssa; ja/tai 5 (iii) kyky indusoida solujen migraatiota, solujen eloonjäämistä ja/tai alkalisen fosfataasin solunsisäisen tason nousua, tunnettu siitä, että polypeptidi käsittää (a) aminohapposekvenssin, jota koodaa SEQ ID NO: 3:ssa esitetty nukleotidisekvenssi tai nukleotidisekvenssi, joka hybridisoituu täyspitkän SEQ ID

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen eristetty polypeptidi, tunnettu siitä, että se käsittää aminohapposekvenssin, jota koodaa SEQ ID NO:3:ssa, SEQ ID NO:7:ssä tai SEQ ID NO: 9:ssä esitetty nukleotidisekvenssi.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen eristetty polypeptidi, tunnettu siitä, että se 20 käsittää SEQ ID NO:4:ssä, SEQ ID NO:8:ssa tai SEQ ID NO:10:ssä esitetyn aminohapposekvenssin

4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen polypeptidi, tunnettu siitä, että mainittu polypeptidi on ihmisestä peräisin.

5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen polypeptidi, tunnettu siitä, että mainitulla polypeptidillä on kyky indusoida astrogliasolujen proliferaatiota.

6. Eristetty nukleiinihappomolekyyli, tunnettu siitä, että se koodaa jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukaista polypeptidiä.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen eristetty nukleiinihappomolekyyli, tunnettu siitä, että se käsittää SEQ ID NO:3:ssa, SEQ ID NO: 7:ssä tai SEQ ID NO: 9:ssä esitetyn nukleotidisekvenssin.

8. Eristetty neutraloiva vasta-aine patenttivaatimuksen 6 tai 7 mukaisen 35 nukleiinihapon koodaamalle polypeptidille.

9. Eristetty neutraloiva vasta-aine jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukaiselle polypeptidille.

10. Menetelmä jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukaisen polypeptidin 5 valmistamiseksi, tunnettu siitä, että menetelmässä ilmennetään nukleiinihappomolekyyliä, joka koodaa jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukaista polypeptidiä, jonkin sopivan isännän avulla, jota kasvatetaan olosuhteissa, jotka tehokkaasti syntetisoivat mainittua polypeptidiä.

10 NO: 3:n tai sen komplementin kanssa erittäin vaativissa olosuhteissa 0,1 - IX SSC/0,1 % w/v SDS 60°C:ssa 1 - 3 tuntia; tai (b) SEQ ID NO:4:ssä esitetyn aminohapposekvenssin tai mainitun polypeptidin typistetyn muodon, jolla on ainakin yksi kohtien (i)—(iii) ominaisuuksista.

11. Antisense-molekyyli, tunnettu siitä, että se hybridisoituu patenttivaatimuksen 6 tai 7 mukaisen täyspitkän nukleiinihappomolekyylin tai sen komplementin kanssa.

12. Koostumus, joka käsittää jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukaista polypeptidiä ja yhtä tai useampaa farmaseuttisesti hyväksyttävää kantajaa ja/tai 15 laimenninta.

13. Polypeptidin, jolla on ainakin yksi seuraavista ominaisuuksista: (i) kyky indusoida verisuonten endoteelisoluja; (ii) kyky olla vuorovaikutuksessaflt-llflk-\ -reseptoriperheen kanssa; ja/tai 20 (iii) kyky indusoida solujen migraatiota, solujen eloonjäämistä ja/tai alkalisen fosfataasin solunsisäisen tason nousua, jolloin polypeptidi käsittää (a) aminohapposekvenssin, jota koodaa SEQ ID NO: l:ssä, 3:ssa, 5:ssä, 7:ssä tai 9:ssä esitetty nukleotidisekvenssi tai nukleotidisekvenssi, joka hybridisoituu 25 täyspitkän SEQ ID NO: l:n, 3:n, 5:n, 7:n tai 9:n tai sen komplementin kanssa erittäin vaativissa olosuhteissa 0,1 - IX SSC/0,1 % w/v SDS 60°C:ssa 1 - 3 tuntia; tai (b) SEQ ID NO: 2:ssa, 4:ssä, 6:ssa, 8:ssa tai 10:ssä esitetyn aminohapposekvenssin tai aminohapposekvenssin, jolla on ainakin 70 % samankaltaisuus, tai mainitun 30 polypeptidin typistetyn muodon, käyttö lääkkeen valmistamiseksi astrogliasolujen proliferaation indusoimiseksi nisäkkäässä.

14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että polypeptidi 35 käsittää aminohapposekvenssin, jota koodaa SEQ ID NO: 3:ssa, SEQ ID NO: 7:ssä tai SEQ ID NO: 9:ssä esitetty nukleotidisekvenssi.

15. Patenttivaatimuksen 13 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että polypeptidi käsittää SEQ ID NO: 4:ssä, SEQ ID NO: 8:ssa tai SEQ ID NO: 10:ssä esitetyn aminohapposekvenssin.

16. Jonkin patenttivaatimuksen 13-15 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että mainittu polypeptidi tai nukleotidisekvenssi on peräisin ihmisestä.

17. Nukleiinihappomolekyylin, joka koodaa jonkin patenttivaatimuksen 13-16 mutkaista polypeptidiä, käyttö lääkkeen valmistamiseksi astrogliasolujen 10 proliferaation indusoimiseksi nisäkkäässä.

18. Isäntäsolu, joka käsittää patenttivaatimuksen 6 tai 7 mukaisen nukleiinihappomolekyylin.

19. Vektori, joka käsittää patenttivaatimuksen 6 tai 7 mukaisen nukleiinihappomolekyylin.