JPH11500139A - 新規成長因子およびそれをコードする遺伝子配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は一般に血管内皮成長因子様特性を有する単離分子およびそれをコードする遺伝子配列に関する。この分子は脈管構造および／または血管透過性の増大または低減を要する症状の、ある領域の処置、予防および診断に有用である。本発明の分子はまた主要かつ中枢ニューロンの有用なエフェクターであり、大グリア細胞の増殖を誘導し得る。

Description

【発明の詳細な説明】 新規成長因子およびそれをコードする遺伝子配列 本発明は一般に血管内皮成長因子様特性を有する単離分子およびそれをコード する遺伝子配列に関する。この分子は脈管構造および／または血管の透過性の増 大または低減を要する症状の、ある領域の処置、予防および診断に有用である。 本発明の分子はまた主要かつ中枢ニューロンの有用なエフェクターであり、大グ リア細胞の増殖を誘導し得る。 本明細書中で著者により引用された刊行物の書誌学的詳細については明細書の 末尾にすべて記載した。本明細書中のヌクレオチドおよびアミノ酸配列の配列番 号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）は書誌学的記載のつぎに定義した。 この明細書を通して、特に断らない限り、「含む（comprise、comprisesまた はcomprising）」とは当該要素もしくは整数、または要素もしくは整数の群の包 含をいい、他の要素もしくは整数、または要素もしくは整数の群の排除をいうも のではないと理解されるべきである。 血管内皮成長因子（vascular endothorial growth factor、以下「ＶＥＧＦ」 という）は、血管作動性透過因子ともいうが、内皮組織を特異的に活性化するホ モ２量体グリコプロテインと共有結合して分泌される（Sengerら、１９９３年） 。ある領域の機能はＶＥＧＦに起因するものであり、そのかかわりあいは黄体の 形成(Yanら、１９９３年)および胎盤発達(Sharkeyら、１９９４年)を含む正常な 脈管形成、血管透過性の制御(Sengerら、１９９３年)、炎症性の脈管形成（Sund erkotterら、１９９４年）および自家移植（Dissenら、１９９４年）、腫瘍助長 脈管形成（Folkman ＆ Shing、１９９２年）、リューマチ性関節炎(Kochら、１ ９９４年)および糖尿病性網膜症（Folkman & Shing）などのヒトの疾患である。 従って、ＶＥＧＦはＶＥＧＦまたはその作用に基づく治療、予防および診断の 研究の有力な価値ある標的となる重要な分子である。また、ＶＥＧＦの代わりと してまたはＶＥＧＦと関連させて使用する同族体または他の関連分子を確認する 必要性が存在する。 この発明の糸口となる研究において、発明者らは多数の内分泌新形成タイプＩ 感受性遺伝子（multiple endocrine neoplasia typeＩ：ＭＥＮ１）を追及して いた。驚くべきことに、発明者らはＭＥＮ１遺伝子の候補としては除外していた 遺伝子配列が、それにもかかわらずＶＥＧＦとある類似性を有する新規な成長因 子であることを発見した。さらに、本発明の成長因子は主要かつ中枢ニューロン のエフェクター分子である。 すなわち、本発明の１つの態様は、アミノ酸配列： （ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２に記載のアミノ酸配列に少なくとも約１５％類似 しており； （ii）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２に記載のアミノ酸配列に少なくとも５％非類似で ある を含む生物学的に分離されたタンパク様分子を含む。 本発明の他の態様は、下記の特徴： （ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２に記載のアミノ酸配列の全部または部分に少なく とも約１５％類似しているが、少なくとも５％非類似であり； （ii）少なくとも１つＶＥＧＦと共通の性質を示す を含む生物学的に分離されたタンパク様分子を提供する。 本発明の関連した態様は、下記の特徴： （ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２に記載のアミノ酸配列に少なくとも約１５％の類 似性を有するが、少なくとも５％の非類似性を有し； （ii）下記の特性： (a)血管内皮細胞の増殖を誘導する能力 (b)受容体のflt-1／flk-1族と相互作用する能力 (c)細胞移動、細胞生存および／またはアルカリホスファターゼの細胞内濃度 の増大を誘導する能力 を示す；を含む生物学的に分離されたタンパク様分子を含む。 「生物学的に分離された」とは、分子が生物学的資源から少なくとも１工程の 精製が行われたことをいう。好ましくは、また、組成物中の他の化合物に対して 組成物が、重量で測定された分子の少なくとも約２０％、より好ましくは少なく とも約４０％、さらに好ましくは約６５％、なお好ましくは少なくとも約８０− ９０％またはそれ以上の活性または他の有用な手段を含むという生物学的に純粋 な意味であることをいう。最も好ましくは分子が配列的に純粋であることをいう 。 本発明の他の好ましい態様は組換え体の分子を提供する。 本発明のこの態様によれば、 アミノ酸配列： （ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２に記載のアミノ酸配列に少なくとも約１５％類似 しており； （ii）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２に記載のアミノ酸配列に少なくとも５％非類似で ある を含む組換え分子を提供する。 本発明の関連する態様は、下記の特徴： （ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２に記載のアミノ酸配列の全部または部分に少なく とも約１５％の類似性を有するが、少なくとも５％の非類似性を有し； （ii）少なくとも１つＶＥＧＦと共通の性質を示す を有する組換え分子である。 本発明のさらに関連する態様は、下記の特徴： （ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２に記載のアミノ酸配列に少なくとも約１５％の類 似性を有するが、少なくとも約５％の非類似性を有し； （ii）少なくとも１つの下記の特性： (a)血管内皮細胞の増殖を誘導する能力 (b)受容体のflt-1／flk-1族と相互作用する能力 (c)細胞移動、細胞生存および／またはアルカリホスファターゼの細胞内濃度 の増大を誘導する能力 を示す；を有する組換え分子を含む。 本発明はまた、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１に少なくとも約１５％のアミノ酸類似性 を有するが、少なくとも約５％非類似性であるタンパク質性分子をコードしてい るゲノムまたは部分的ゲノムクローンを含む。 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２に記載のアミノ酸配列はヒトＶＥＧＦに対応する(以下、 「ＶＥＧＦ₁₆₅」という)。従って、本発明の分子はＶＥＧＦ様であるか、または ＶＥＧＦの同族体であるが、ＶＥＧＦのアミノ酸配列に類似しているが、同一で はないアミノ酸配列を含む。本発明はヒトＶＥＧＦ様分子を用いて例示すること ができるが、これは本発明が、同族体分子であり、家畜類（例えば、羊、豚、馬 および牛）、愛玩動物（例えば、犬および猫）および実験動物（例えば、マウス 、ラット、家兎およびモルモット）などの哺乳動物ならびに鳥類（例えば、家き ん類）などの非哺乳動物、魚および爬虫類などの非哺乳動物からのコード配列を 含むものとして理解されねばならない。最も好ましい具体例では、ＶＥＧＦ様分 子は、ヒト由来のものであり、染色体１１ｑ１３に位置する遺伝子によってコー ドされている。本発明は従って、当該ＶＥＧＦ様分子をコードするゲノム配列ま たはその部分に及ぶ。 好ましくは、類似性のパーセントが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２に記載のアミノ酸 配列の全部または部分の少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも約４０ ％、さらに好ましくは少なくとも約５０％、よりさらに好ましくは少なくとも約 ６０−７０％、なおさらに好ましくは少なくとも約８０−９５％である。 特に好ましい具体例において、本発明のＶＥＧＦ様分子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: ４に記載のアミノ酸配列を含むか、またはそれらの部分、フラグメント、誘導体 または類似体である。特に好ましい類似性は約１９−２０％および２９−３０％ である。ここに引用された誘導体もまたスプライス変異体を含む。従って、本発 明はＳＯＭ１７５のスプライス変異体に及ぶ。本発明に含まれるスプライス変異 体の例としてはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:８および／またはＳＥ Ｑ ＩＤ ＮＯ:１０の少なくとも１つに実質的に記載されたアミノ酸配列を有す る変異体、またはそれらの突然変異体もしくは誘導体、またはそれらのさらなる スプライス変異体を含むがこれに限られない。 他の具体例は、下記の特徴： （ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:４に実質的に記載されたアミノ酸配列または、その 全部または部分に少なくとも約１５％の類似性（ただし、上記アミノ酸配列はＳ ＥＱ ＩＤ ＮＯ:２に記載のアミノ酸配列の全部または部分に少なくとも約５％ 非類似である）を有し； （ii）少なくとも１つのＶＥＧＦと共通の生物学的性質を示す； を有する組換分子を提供する。 他の具体例は、下記の特徴： （ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:６に実質的に記載されたアミノ酸配列または、その 全部またはその部分に少なくとも約１５％の類似性（ただし、上記アミノ酸配列 はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２に記載のアミノ酸配列の全部または部分に少なくとも約 ５％非類似である）を有し； （ii）少なくとも１つのＶＥＧＦと共通の生物学的性質を示す； を有する組換分子を提供する。 他の具体例は、下記の特徴： （ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:８に実質的に記載されたアミノ酸配列または、その 全部またはその部分に少なくとも約１５％の類似性（ただし、上記アミノ酸配列 はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２に記載のアミノ酸配列の全部または部分に少なくとも約 ５％非類似である）を有し； （ii）少なくとも１つのＶＥＧＦと共通の生物学的性質を示す； を有する組換分子を提供する。 他の具体例は、下記の特徴： （ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１０に実質的に記載されたアミノ酸配列または、そ の全部またはその部分に少なくとも約１５％の類似性（ただし、上記アミノ酸配 列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２に記載のアミノ酸配列の全部または部分に少なくとも 約５％非類似である）を有し； （ii）少なくとも１つのＶＥＧＦと共通の生物学的性質を示す； を有する組換分子を提供する。 上記のＶＥＧＦの性質は、 (a)血管内皮細胞の増殖を誘導する能力； (b)受容体のflt-1／flk-1族と相互作用する能力； (c)細胞移動、細胞生存および／またはアルカリホスファターゼの細胞内濃度 の増大を誘導する能力； の少なくとも１つを含む。 本発明によれば、類似性は好ましくは少なくとも約４０％、より好ましくは少 なくとも約５０％およびさらに好ましくは少なくとも約６５％の類似性である。 本発明のさらなる態様は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:４に記載のアミノ酸配列の一部 または、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:８またはＳＥＱ Ｉ Ｄ ＮＯ:１０に記載のアミノ酸配列などのそのスプライス変異体またはそれらの 化学的均等物を含む。本発明の生物学的に分離されたまたは組換分子は天然にグ リコシル化されたものであってもよく、またはそれが分離されまたは合成された 細胞により変化する変異グリコシル化形態を含んでいてもよい。例えば、もし、 原核細胞中に組換手段によって産生されたならば、分子は非グリコシル化のもの である。分子は全長であってもよく、または一部を切り取ったかまたは誘導され た形態であってもよい。 さらに本発明の他の態様はここに記載のＶＥＧＦ様分子をコードする核酸分子 を含む。さらに具体的には、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３に実質的に記載さ れたヌクレオチドの配列、またはその全部または分子に少なくとも１５％の類似 性を有するヌクレオチド配列、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３に記載の逆相補性の ヌクレオチド配列に低いストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るヌク レオチド配列（ただし、核酸はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載のヌクレオチド配列 に少なくとも約１５％の類似性を有するが、３０％の非類似性を有する）を提供 する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３に記載のヌクレオチドはまた「ＳＯＭ１７５」とも いう。好ましくは、非類似の％は約３５％、より好ましくは約３９％およびさら に好ましくは約４０−５０％である。 ストリンジェントの程度を定義する目的で、簡略化のために、Sambrook et al (1989)の９.４７−９.５１頁を引用することができ、ここに引用して明細書の記 載とし、そこに記載の洗浄工程を高いストリンジェントな条件とみなす。低いス トリンジェントな条件とは、この明細書では、４−６Ｘ ＳＳＣ／０.１−０.５ ％ w/v ＳＤＳ、３７−４５℃にて２−３時間と定義される。ハイブリダイズに おける核酸の資源および濃度により異なるが、≧４５℃にて１−４Ｘ ＳＳＣ／ ０.２５−０.５％ w/v ＳＤＳ、２−３時間のこの明細書でみなされる中程度の ストリンジェントな条件、または６０℃にて０.１−１Ｘ ＳＳＣ／０.１％ w/v ＳＤＳ、１−３時間のこの明細書でみなされる高いストリンジェントな条件など の別のストリンジェントな条件を採用することもできる。 さらに、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３に少なくとも１５％のヌクレオチド 配列の相同性を有する、上記ＶＥＧＦ様分子をコードする核酸分子を含む。好ま しい相同性の程度は少なくとも約４０％、より好ましくは約６０−７０％である 。 本発明はさらに、ヒトＶＥＧＦのマウス相同体（ここでは「ｍＶＲＦ」という ）を含む。ヒトＶＥＧＦと比較してｍＶＲＦは約８５％の同一性を有し、ヒトＶ ＥＧＦと比較して全コード領域にわたって９２％のアミノ酸残基の保存率を有す る。ｍＶＲＦは、実質的に図９に記載のヌクレオチド配列を含む核酸分子によっ てコードされている。 本発明のＶＥＧＦ様分子は、単独またはＶＥＧＦなどの他の分子と組み合わせ てある領域の治療および／または診断への適用に有用である。本発明は従って、 ＶＥＧＦ様分子、その部分、フラグメント、誘導体、相同体または類似体ととも に１つまたはそれ以上の医薬的に許容され得る担体または希釈剤を含む医薬組成 物に及ぶ。さらに、本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３に記載の核酸配列またはそれ に少なくとも約１５％、より好ましくは約４０％、さらに好ましくは少なくとも 約６０−７０％の類似性を有するが、それに少なくとも約３０％、より好ましく は少なくとも３０％、さらに好ましくは約３９％の非類似性を有するベクター、 およびこれを含む宿主に及ぶ。さらに、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３に基づ くリボザイムおよびアンチセンス分子ならびにＶＥＧＦ様分子の中和抗体に及ぶ 。このような分子は、例えば、腫瘍の脈管形成または血管新生に至るＶＥＧＦ様 遺伝子の過剰発現の効果を改善するのに有効である。 本発明の他の態様は哺乳動物における大グリア細胞増殖を誘導する方法であっ て、上記方法が、下記の特徴： （ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２に記載の配列に少なくとも約１５％の類似性を有 するが、少なくとも５％の非類似性を有するアミノ酸配列を含み； （ii）少なくとも１つ血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）と共通の性質を示す を有する組換タンパク質性分子の有効量を上記哺乳動物に投与し、上記投与が大 グリア細胞の増殖を誘導するのに十分な期間および条件であることを特徴とする 方法である。 好ましくは、組換タンパク質性分子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:６に記載のアミノ酸配列を含む。 本発明のさらなる態様は、哺乳動物における神経の生存および／または増殖を 促進する方法であって、上記方法が下記の特徴： （ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２に記載の配列に少なくとも約１５％の類似性を有 するが、少なくとも約５％の非類似性を有するアミノ酸配列を含み； （ii）少なくとも１つ血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）と共通の性質を示す を有する組換タンパク質性分子の有効量を上記哺乳動物に投与し、上記投与が大 グリア細胞の増殖を誘導するのに十分な期間および条件であることを特徴とする 方法を提供する。 好ましくは、組換タンパク質性分子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:６に記載のアミノ酸配列を含む。 本発明はまた、診断剤として有用なＶＥＧＦ様分子に対す抗体またはＶＥＧＦ 様分子をコードする遺伝子に対する核酸プローブを含む。 本発明はさらに下記の図面および／または実施例によって説明されるが、これ に限定されるものではない。 図面において： 図１ ＶＥＧＦ₁₆₅のヌクレオチド配列［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１］および対応す るアミノ酸配列［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２］ 図２ ＳＯＭ１７５のヌクレオチド配列［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３］および対応 するアミノ酸配列［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:４］ 図３ ＳＯＭ１７５タンパク質配列によるＢＬＡＳＴ検索の結果 図４ ＶＥＧＦ cＤＮＡおよびＳＯＭ１７５ cＤＮＡのＢＥＳＴＦＩＴ配列 図５ ＳＯＭ１７５およびヌクレオチドレベルのスプライス変異体とＶＥＧＦ₁₆₅ の複数の配列 図６ ＳＯＭ１７５およびアミノ酸レベルのスプライス変異体とＶＥＧＦ₁₆₅ の複数の配列 図７ ＳＯＭ１７５およびそのスブライス変異体の図式表現 図８(a) エクソン／イントロン地図を示すヒトＳＯＭ１７５ゲノム構造の図 式表現 図８ エクソン／イントロン境界を示すヒトＳＯＭ１７５ゲノム構造の図式表 現 図９ ｍＶＲＦ cＤＮＡクローンから誘導されたヌクレオチドおよび推定ペプ チド配列。ヌクレオチドの番号は左側に記載され、開始コドンのＡから始まる。 アミノ酸の番号は右側に記載され、推定シグナルペプチドが除去された後、予測 成熟タンパク質の最初の残基から始まる。別にスプライスされた領域は２重下線 で示し、各ｍＲＮＡから得られたペプチド配列が含まれている。主要なポリアデ ニル化の標識は太字で示されている。ｍＶＲＦ₁₆₇およびｍＶＲＦ₁₈₆の開始およ び終止コドンは下線で示され、３’ＵＴＲ中の多形のＡＣの反復は破線で囲って 示した。イントロン／エクソンの境界の位置は矢印で示した。 図１０ ヒトおよびマウスＶＲＦタンパク質異性体のＢＥＳＴＦＩＴ配列 Ａ ：ｍＶＲＦ₁₆₇およびｈＶＲＦ₁₆₇； Ｂ：配列が各１６７アミノ酸異性体と異な る点からのｍＶＲＦ₁₈₆およびｈＶＲＦ₁₈₆； アミノ酸の同一性は縦棒で示し、 保存アミノ酸は黒点で示した。矢印はヒトおよびマウスＶＲＦの予測シグナルペ プチド開裂部位を示す。 図１１ ｍＶＲＦ₁₆₇およびｍＶＲＦ₁₈₈（Breier ら、１９９２年）ペプチド 配列のＢＥＳＴＦＩＴ配列。矢印はｍＶＥＧＦのシグナルペプチド開裂部位を示 す。同一のアミノ酸は縦棒で示し、保存的置換は黒点で示した。アミノ酸の番号 は図９の方法で記載した。 図１２ ＶＲＦ（マウスとヒトの相同体のイントロン／エクソン構造はほぼ同 一であるから、一般的なＶＲＦ遺伝子を示した）とヒトＶＥＧＦ／ＰＩＧＦ／Ｐ ＤＧＦ遺伝子族の他の構成員との遺伝子構造の比較。エクソンは四角で示した。 タンパク質コード領域および非翻訳領域は内部を埋めた四角または白ぬきの四角 で示した。ＶＲＦの斜線領域はＶＲＦ₁₈₆異性体の別のスプライシングによって 形成された追加的３’ＵＴＲ配列を示す。各遺伝子の別の主要なスプライス生成 物を示した。 図１３ ｍＶＲＦ cＤＮＡクローンとハイブリダイズした種々の成熟マウス組 織(表示した)からの全ＲＮＡのノーザンブロットのオートラジオグラム。主要な １.３ｋｂの転写はすべての試料から検出された。 図１４ マウスにおけるｍＶＲＦおよびｍＲＮＡの発現パターンを示すフィル ムオートラジオグラフ(Ａ−Ｃ)および暗視野照明顕微鏡写真(Ｄ−Ｅ)。Ｅ１４マ ウス胎芽（Ａ）において、陽性のシグナルが現れている心臓(Ｈａ)および大脳皮 質(Ｃｘ)に見られる。バックグランドの低いシグナルが他の組織の断面に存在す る。Ｅ１７胎芽(Ｂ)において、心臓(Ｈａ)は強いハイブリダイズのシグナルのた めにはっきりと見える。同じ位の強さのシグナルが背中および胸郭付近の茶色の 脂肪組織(Ｆａ)に存在する。中程度のハイブリダイゼーションのシグナルが脊髄 (ＳＣ)および舌(Ｔ)に存在する。バックグラウンドシグナルはＥ１４胎芽と比較 して調整した。若年マウス(Ｃ-Ｄ)では、陽性のシグナルは心臓(Ｈａ)および胸 郭付近の脂肪組織(Ｆａ)に見られ、一方、例えば、肺(Ｌｕ)はラベルされていな い。心臓のハイブリダイゼーションシグナルは乳頭筋肉を含む左心室全体に平等 に分布している(Ｄ)。過剰の冷プローブとハイブリダイズさせたＥ１７心臓には 、陽性のシグナルは存在しなかった(Ｅ)。尺度＝０.５ｍｍ(Ａ)、１.２ｍｍ(Ｂ) 、１ｍｍ(Ｃ)、０.３ｍｍ（Ｄ）、０．１ｍｍ(Ｅ) 図１５ マウス脂肪組織(Ａ−Ｂ)および脊髄(ＣおよびＤ)におけるｍＶＲＦｍ ＲＮＡ発現を示す暗−(ＡおよびＣ)および明−(ＢおよびＤ)視野顕微鏡写真。ズ タンブラック染色部分の強い標識によって示されているように（Ｂ）、強いハイ ブリダイズシグナルが脂肪に存在する（Ａ）。弱いシグナルがまた骨格筋(Ａ− Ｂ中Ｍ)に存在する。成熟脊髄(Ｃ)には、ｍＶＲＦプローブは灰白質にニューロ ンの発色パターンを示す。ｍＶＲＦｍＲＮＡに対して強い陽性を示す腹側灰白柱 (Ｄ)中の運動ニューロン、背側灰白柱の深部および中央管付近の介在ニューロン を示すトルイジン対比染色。尺度＝０.１ｍｍ(Ａ)、０.１ｍｍ(Ｂ)、０.２５ｍ ｍ(Ｃ)、０.０１５ｍｍ(Ｄ)。 図１６ 生存％、神経成長％および平均神経の長さ（μｍ）で測定された、胎 芽８日令ヒナ感覚神経に対するＶＥＧＦの作用。 図１７ ニワトリのヒナのグリアに対するＶＥＧＦおよびＳＯＭ１７５の作用 。ＣＮＳグリア、末梢グリアおよびＣＮＳ乏突起膠細胞が試験された。 図１８ マウス大グリア細胞に対する種々のＳＯＭ１７５タンパク質の作用 図１９ マウス乏突起神経膠細胞に対する種々のＳＯＭ１７５タンパク質の作 用 図２０ マウス前脳ニューロンに対する種々のＳＯＭ１７５タンパク質の作用 実施例 １ ヒトｃＤＮＡクローン ヒト胎児脳ライブラリー(λzapII、Ｓtratagene)をコスミドＤ１１Ｓ７５０( Ｌarssonら、１９９２)でスクリーニングすることにより、最初のＳＯＭ１７５ cＤＮＡを単離した。プラスミドを「インビボ」において切断して、一本鎖の１. １kbのcＤＮＡを得た。上述のＳＯＭ１７５挿入断片をプローブとして使用して 、３つの独立したＳＯＭ１７５ cＤＮＡクローンもまた、ヒト胎児脾臓ライブラ リー(Ｓtratagene、Ｕnizap)から分離した。３つのクローンを得た：ＳＯＭ１７ ５ −４Ａ、−５Ａ、および−６Ａ。ＳＯＭ１７５−５Ａは、エクソン４が欠けてい る、選択的スプライシングされたクローン(ＳＯＭ１７５−e４)である。ライブ ラリーの製造業者(Ｓtratagene)により推奨されるハイブリダイゼーション条件 とランダム感作ＳＯＭ１７５の挿入断片とを使用して、これらのライブラリーの スクリーニングを行った。２つの部分的なヒトＳＯＭ１７５ cＤＮＡもまた、λ ＧＴ１１ヒト黒色腫セルライン Ａ２０５８ライブラリー(Ｃlontech)から分離し た。ＣhurchおよびＧilbert、１９８４に記載のハイブリダイゼーション条件を 使用して、cＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行った。各々の場合におい て、ＳＯＭ１７５から誘導されたＰＣＲ産物(１８ｆ−７００ｒ)のランダム感作 により、プローブを発生させた。マウスcＤＮＡクローン 再びヒトＳＯＭ１７５を使用して、マウス新生児全脳cＤＮＡライブラリー(Ｕ nizap、Ｓtratagene)をスクリーニングした。４つの非キメラクローンを分離し た：Ｍ１７５−Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ。クローンは全て部分的なcＤＮＡであって、Ｍ １７５−Ｃは幾つかのイントロンを含んでいた。これらのcＤＮＡのうち３つは 、エクソン６が欠けていた。 Ｍ１と呼ばれる別のクローンは完全に配列決定されており、完全なオープンリ ーディングフレーム＋５'utrの一部と３'utr全体を含むことが分かった。 実施例 ２ ＤＮＡ配列分析 cＤＮＡクローン(ＳＯＭ１７５)の全体配列をまとめて、その対応するアミノ 酸配列と共に図２に示す。ＭＡＰプログラム(ＧＣＧ、ウィスコンシン大学)を使 用して、この配列をオープンリーディングフレームに関してスクリーニングした 。６７２bpの一本鎖のオープンリーディングフレームが観察された(図２を参照) 。５'非翻訳化配列は殆ど無いようである(２bp)。３'非翻訳化領域は、ポリアデ ニル化シグナルおよびポリＡ尾部が含まれることから完全であるらしい。 ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して、データーベース相同性調査を行った(Ｎ ＣＢＩで操作する、米国)。この分析は、幾つかの哺乳動物型のＶＥＧＦに対す る相同性を明らかにした(図３を参照)。ＢＥＳＴＦＩＴプログラム(ＧＣＧ、ウ ィスコンシン大学；図４および５を参照)を使用して、ＳＯＭ１７５とヒトＶＥ ＧＦ₁₆₅との間の相同性の程度を測定した。ＢＥＳＴＦＩＴ分析を使用して、ヌ クレオチドの相同性は６９.７％であると推定され、またタンパク質の相同性は 少なくとも３３.３％の同一性と５２.５％の保存性と推定された。ヌクレオチド 配列に関するＢＬＡＳＴ分析では、ヒト発現配列タグＥＳＴ０６３０２(Ａdams ら、１９９３)にほぼ完全に対応することが明らかになった。 これらのデータは、ＳＯＭ１７５がＶＥＧＦに対して構造上の類似性を有する 成長因子をコードすることを示す。両方の遺伝子が同じような位置に開始および 停止コドンを示し、また不連続の相同性の固まりをもっている。二量化に関与す ると考えられている８つのシステイン全て、さらにはまた多数の他のＶＥＧＦ残 基は保存されている。これらの残基は、システイン−４７、プロリン−７０、シ ステイン−７２、バリン−７４、アルギニン−７７、システイン−７８、グリシ ン−８０、システイン−８１、システイン−８２、システイン−８９、プロリン −９１、システイン−１２２、およびシステイン−１２４であって、図６に示す 。ＶＥＧＦとＳＯＭ１７５遺伝子産物との間の構造上の保存があれば、それらが 両方とも機能上の類似性を有することもまた可能となる。ＳＯＭ１７５は、ＶＥ ＧＦと幾つかの性質を共有するが、それ自身の独自の性質を有するＶＥＧＦ様分 子をコードすることが提唱される。ＶＥＧＦ₁₆₅のヌクレオチド配列および対応 するアミノ酸配列を図１に示す。 実施例 ３ Ｃlustal法、ＭegＡlignソフトウェア、ＤＮＡＳＴＡＲ、ウィスコンシンを使 用して、ＶＥＧＦ₁₆₅ファミリーとＳＯＭ１７５ファミリー(タンパク質)との間 の類似性および相違性のパーセントを分析した。結果を表２.１および２.２に示 す。選択的にスプライシングされた型のＳＯＭ１７５を、ＳＯＭ１７５−e６(エ クソン６が全て欠失している)；ＳＯＭ１７５−e６並びに７(エクソン６と７が 全て欠失している)；およびＳＯＭ１７５−e４(エクソン４が全て欠失している) と略す。スプライシングされた型のＳＯＭ１７５を図７に示す。イントロン／エ クソンの境界を示すＳＯＭ１７５のゲノムマップを図８ａおよび図８ｂに示す。 実施例 ４ ＳＯＭ１７５の機能を測定するためのバイオアッセイ ＳＯＭ１７５が内皮細胞機能、脈管形成、および創傷治癒に対してＶＥＧＦと 同様の活性を有するかどうかを評価するためにアッセイを行う。受容体結合分布 試験の結果に基づいて他のアッセイを行う。内皮細胞機能のアッセイ 内皮細胞増殖。ＦerraraおよびＨenzel（１９８９）およびＧospodarowiczら （１９８９）に記載の内皮細胞成長アッセイ。 脈管透過性アッセイ。モルモットでのマイルス(Ｍiles)試験を利用するこのア ッセイは、ＭilesおよびＭiles（１９５２）に記載と同様に行う。 細胞接着アッセイ。ポリモルフの内皮細胞への接着に対するＳＯＭ１７５の影 響を分析する。 走化性。これは、標準的なボイデン(Ｂoyden)チャンバー走化性アッセイを使 用して行う。 プラスミノーゲンアクチベータアッセイ。ＳＯＭ１７５の添加によるプラスミ ノーゲンアクチベータおよびプラスミノーゲンアクチベータ阻害物質産生に関し て、内皮細胞を試験する(Ｐepperら（１９９１）)。 内皮細胞移動アッセイ。内皮細胞を刺激して、移動させ管を形成させるＳＯＭ １７５の能力を、Ｍontesanoら（１９８６）に記載と同様にしてアッセイする。脈管形成アッセイ 雛の漿尿膜での脈管形成応答のＳＯＭ１７５誘導を、Ｌeungら（１９８９）に 記載と同様にして評価する。 次のアッセイを使用して、ＳＯＭ１７５の潜在的神経栄養作用を評価する。軸索外殖アッセイおよび遺伝子誘導（ＰＣ１２細胞） ＰＣ１２細胞(クロム親和性細胞腫セルライン)は、ＮＧＦおよび他の神経栄養 因子に応答し、初期並びに後期遺伝子の誘導、および神経の伸長を含む交感神経 ニューロンの特性を発達させる。これらの細胞をＳＯＭ１７５に暴露して、それ らの応答をモニターする(Ｄrinkwaterら（１９９１）；およびＤrinkwaterら（ １９９３））。末梢神経系(ＰＮＳ)由来の培養されたニューロン 次のＰＮＳニューロンの初代培養物をＳＯＭ１７５に暴露して、幾つかの応答 に関してモニターする： −神経冠および背根神経節由来の感覚ニューロン、 −交感神経系神経節由来の交感神経ニューロン、 −節状神経節由来のプラコード(placode)誘導感覚ニューロン、 −脊髄由来の運動ニューロン。 そのアッセイは、Ｓuterら（１９９２）およびＭarinouら（１９９２）に記載 されている。 インビトロにおける応答が観察された場合には、取込みおよび逆行性輸送など の性質に関するインビボにおけるアッセイを、Ｈendryら（１９９２）に記載と 同様にして行う。神経再生(ＰＮＳ) ＳＯＭ１７５の神経栄養効果が観察された場合には、軸索を切断した感覚ニュ ーロン、交感神経ニューロン、および運動ニューロンの再生におけるその可能な 役割を、Ｏttoら（１９８９）；Ｙipら（１９８.４）；およびＨendryら（１９ ７６）の方法により分析する。ＣＮＳニューロンに対するＳＯＭ１７５の作用 中枢神経系ニューロンの生存を増進するＳＯＭ１７５の能力を、Ｈaggら（１ ９９２）;Ｗilliamsら（１９８６）；Ｈefti（１９８６）；およびＫromer（１ ９８７）に記載と同様にして分析する。創傷治癒 創傷治癒を支えるＳＯＭ１７５の能力を、Ｓchillingら（１９５９）に記載さ れ、Ｈuntら（１９６７）により利用いるのと同様にして、利用できる最も臨床 的に適切なモデルで試験する。造血系 造血系の特異的な細胞集団に対して、様々なインビトロおよびインビボ・アッ セイが可能であり、また以下に概略を述べる。 幹細胞 マウス ＦＡＣＳ−精製細胞を使用して、様々な新規のインビトロ・マウス幹細胞アッセ イが開発されている。（ａ）再増殖する幹細胞 致死量を照射したマウスの骨髄を再増殖することができる細胞があって、Ｌin^- 、Ｒh^hi、Ｌy−６Ａ／Ｅ⁺、ｃ−kit⁺表現型を有する。試験物質を、これらの細 胞に対して単独で、または複数の因子との同時インキュベーションにより試験し た後、³Ｈチミジンの取込みにより、細胞増殖を測定する。（ｂ）後期幹細胞 比較的僅かな骨髄再増殖能しか有していないが、Ｄ１３ ＣＦＵ−Ｓを発生さ せることができる細胞がある。これらの細胞は、Ｌin^-、Ｒh^hi、Ｌy−６Ａ／Ｅ⁺ 、ｃ−kit⁺表現型を有する。試験物質をこれらの細胞と共に一定時間インキュベ ートし、致死量を照射したレシピエントに注射して、Ｄ１３脾臓コロニーの数を 数える。（ｃ）前駆体に富む細胞 インビトロにおいて単一の成長因子に応答する細胞があって、Ｌin^-、Ｒh^hi、 Ｌy−６Ａ／Ｅ⁺、ｃ−kit^-表現型を有する。このアッセイは、ＳＯＭ１７５が造 血前駆体細胞に直接作用することができるかどうかを示すで。試験物質をこれら の細胞と共に寒天培養でインキュベートして、７−１４日後にコロニーの数を数 える。アテローム性動脈硬化症 平滑筋細胞は、収縮状態から合成状態へのそれらの表現型の変えながら、アテ ローム性動脈硬化症の発生または開始において重要な役割を果す。マクロファー ジ、内皮細胞、Ｔリンパ球、および血小板は全て、平滑筋細胞の成長および表現 型修飾に影響を及ぼすことにより、アテローム性動脈硬化症プラークの発生にお いて重要な役割を果す。多細胞環境での平滑筋細胞の増殖率および表現型修飾を 測定するインビトロにおけるアッセイを使用して、平滑筋細胞に対するＳＯＭ１ ７５の効果を評価する。そのシステムは、様々な細胞の種類をカバーガラスの両 側に播種する、変型ローズ(Ｒose)チャンバーを使用する。骨に対するＳＯＭ１７５の効果 骨芽細胞の増殖を調節するＳＯＭ１７５の能力を、Ｌoweら（１９９１）に記 載と同様にしてアッセイする。骨吸収に対する幾つかの効果を、Ｌoweら（１９ ９１）に記載と同様にしてアッセイする。細胞内分子における骨芽細胞移動およ び変化に対する効果(例えば、cＡＭＰの蓄積、アルカリ性ホスファターゼ濃度) を、Ｍidyら（１９９４）に記載と同様にして分析する。骨格筋細胞に対する効果 筋原細胞の増殖および筋管の発達に対するＳＯＭ１７５の効果は、Ｅwtonら（ １９８０）により、またＧospodarowiczら（１９７６）に記載と同様にして測定 することができる。 実施例 ５ マウスＶＥＧＦ ＤＮＡのクローニング c ＤＮＡの単離 マウスＶＲＦ(mＶＲＦ)クローンを、λ Ｚap新生全脳cＤＮＡライブラリー(Ｓ tratagene)から選択した。上記のhＶＲＦ cＤＮＡ(pＳＯＭ１７５)からＰＣＲに より発生した、６８２bpの³²Ｐ−標識化プローブとのハイブリダイゼーションに より、高密度フィルター(５×１０⁴pfu／プレート)から得られた一次ファージを 同定した。ＣhurchおよびＧilbert（１９８４）に記載と同様の条件下、ハイブ リダイゼーションおよびナイロン膜(Ｈybond−Ｎ)のストリンジェント洗浄を６ ５℃で行った。陽性のプラークを採取し、精製し、インビボにおいて切断して、 pＢluescript ＳＫ−中にcＤＮＡクローンを含む細菌コロニーを産生させた。ゲノムクローンの単離 ゲノムクローンを、λ ＦixIIベクター(Ｓtratagene)にクローン化したマウ ス菌株ＳＶ／１２９ライブラリーから単離した。高密度フィルター(５×１０⁴pf u／フィルター)を、mＶＲＦ cＤＮＡのヌクレオチド２３３−７９８領域のＰＣ Ｒ増幅により創生させた、５６３bpの³²Ｐ−標識化プローブでスクリーニングし た(図９を参照)。陽性のクローンをプラグして(plugged)、４００−８００pfuを 含むフィルターで再びスクリーニングした。ＱＩＡＧＥＮ λキットを使用して 、またはＺnＣl₂精製(Ｓantos、１９９１)により、大量のファージ調製物を製造 した。ヌクレオチド配列決定および分析 様々なベクターに基づいたプライマーおよび内部プライマーを、製造業者の使 用説明書に従って、Ａpplied Ｂiosystems Ｉncorporated(ＡＢＩ)の色素ターミ ネーター配列決定キットと共に使用して、cＤＮＡを両方の鎖に関して配列決定 した。配列をＡＢＩの３７３Ａ型自動化ＤＮＡシークエンサーで分析した。ＢＥ ＳＴＦＩＴプログラム(ＧＣＧ、ウィスコンシン)を使用して、ペプチドの相同性 アラインメントを行った。イントロン／エクソンの境界の同定 ゲノムＤＮＡまたはmＶＲＦ ゲノムλクローンをテンプレートとして用いるＰ ＣＲを使用して、エクソンの境界およびフランキング領域の同定を行った。イン トロンを同定するためにＰＣＲで使用するプライマーは、hＶＲＦ配列から誘導 し、また可能性のあるヒト−マウス配列のミスマッチを考慮して、推定されるＴ mより低い５−１０℃のアニーリング温度を使用した。ＰＣＲ産物を全て、アガ ロースゲル電気泳動によりサイズ分けして、ＱＩＡ急速スピンカラム(Ｑiagen) を使用して精製したゲルとイントロン／エクソンの境界とを、これらの産物から 直接配列決定した。加えて、幾つかのスプライス部位を、サブクローン化したＭ ＶＲＦのゲノムフラグメントから配列決定した。cＤＮＡとゲノムＤＮＡの配列 を比較することにより、イントロン／エクソンの境界を同定した。ノーザン分析 ＣhomczynskiおよびＳacchi（１９８７）の方法を使用して、全ての細胞ＲＮ Ａを新鮮な正常成熟マウス組織(脳、腎臓、肝臓、筋肉)のパネルから調製した。 合計２０μgのＲＮＡを電気泳動し、ナイロン膜(Ｈybond−Ｎ、Ａmersham)に移 して、標準的な条件下(ＣhurchおよびＧilbert、１９８４)にハイブリダイズさ せた。フィルターを６５℃の０.１×ＳＳＣ(２０×ＳＳＣは、３Ｍ ＮaＣl／０. ３Ｍ クエン酸三ナトリウム)、０.１％ ＳＤＳ中で洗浄して、増感紙を用いるＸ 線フィルムに−７０℃で１−３日間暴露した。m ＶＲＦ cＤＮＡの特性決定 マウスcＤＮＡライブラリーをhＶＲＦ cＤＮＡクローンでスクリーニングする ことにより、マウスＶＲＦ相同体を分離した。０.８−１.５kbと様々なサイズの ５つのクローンを回収して、配列決定した。cＤＮＡ配列決定によれば、オープ ンリーディングフレーム全体(スプライス型によって、６２１bpまたは５６４bp 、下記参照)を含む全長１０４１bpのcＤＮＡ配列、および３'ＵＴＲ(３７９bp) 、さらにはまた１６３bpの５'ＵＴＲである(図９)。 予想される開始コドンは、hＶＲＦにおける開始コドンの位置に一致した。フ レームＡＴＧ以外の他のコドンは−４７の位置にあって、２つの終止コドンは推 定上の開始コドンと共に上流(各々、−９並びに−３３の位置)およびフレーム内 で観察された。 予想されるhＶＲＦのＮ末端シグナルペプチドは、８１％の同一性(１７／２１ アミノ酸)でmＶＲＦに存在すると思われる。mＶＲＦ内でのペプチド切断は、残 基２１の後で起こるものと思われる(図１０)。これらのデータは、成熟mＶＲＦ が分泌され、また従って、恐らく成長因子として機能し得ることを示す。 hＶＲＦに関しては、２つのオープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)が、ライ ブラリースクリーニングにより分離されたcＤＮＡにおいて検出された。５つの クローンのうち４つは、選択的にスプライシングされて、hＶＲＦのエクソン６ に相同である１０１bpのフラグメントに欠けることが判明した。mＶＲＦの２つ の異性体(isoform)の予想されるペプチド配列を決定して、対応するヒト異性体 と整列化した(図１０)。 メッセージをコードするmＶＲＦ₁₈₆は、エクソン７の末端に向かって、＋６２ ２の位置で終わるコード配列を有する６２１bpのＯＲＦを含む。より小さなメッ セージをコードするmＶＲＦ₁₆₇は、実際には、１０１bpのエクソン６からのスプ ライシングに起因するフレームシフトと、エクソン８の始まりに近い、＋６６６ の位置での終止コドン(ＴＧＡ)の導入により、＋６２２のＴＡＧ部位の下流で終 止する(図９)。 mＶＲＦ₁₈₆タンパク質は、ＶＥＧＦのアミノ部分および中心部分に対して強い 相同性を有するが、カルボキシル末端は全く違って、アラニンに富む。mＶＲＦ_{1 67} は、これらの類似性を有しており、mＶＥＧＦの右からＣ末端までの相同性も 維持している(図１１)。hＶＲＦ₁₆₇に対するmＶＲＦ₁₆₇の全体にわたる相同性は 各々、８５％の同一性と９２％の類似性であった(図１０)。同様に、mＶＲＦ₁₆₇ とmＶＥＧＦとの間の相同性(Ｂreierら、１９９２)は各々、４９％の同一性と７ １％の保存的アミノ酸置換であった(図１１)。 模範的な脊椎動物のポリアデニル化シグナル(ＡＡＴＡＡＡ)(Ｂirnstielら、 １９８６)は、mＶＲＦ cＤＮＡには存在していなかったが、しかし、ぴったりと 一致する配列ＧＡＴＡＡＡが、マウスとヒトの両方のＶＲＦ cＤＮＡにおいて同 じような位置に存在する。hＶＲＦとは対照的に、mＶＲＦは、ＡＣジヌクレオチ ドの反復を３'ＵＴＲのいちばん端の３'末端(ヌクレオチドの９９８〜１０１１ の位置、図９)に含むことが判明した。この反復領域の多様性は、７〜１１にわ たるジヌクレオチド数の、幾つかのmＶＲＦ cＤＮＡの間で観察された。m ＶＲＦのゲノム特性決定 対応するhＶＲＦの境界に相同な配列に隣接するプライマーを使用して、イン トロン／エクソンの境界（表３）をマップした。mＶＲＦのイントロンＩ、III、 IV、およびVI(表３、図１２)は、hＶＲＦの介在配列より小さかった。完全なゲ ノム配列は、mＶＲＦの増幅したイントロンとクローン化したゲノム部分を配列 決定することにより、mＶＲＦの５'ＵＴＲから最も大きな介在領域(２.２kb)で あるイントロンVIまでにまとめられていた。mＶＲＦとhＶＲＦとの間にはゲノム 構造において１つだけ大きな相違があって、それは、mＶＲＦのエクソン７／イ ントロンVIの境界が、cＤＮＡ配列との関係でさらに１０bp下流にあることであ り、従って、mＶＲＦにおけるエクソン７は、hＶＲＦにおいて対応するエクソン より１０bp長い。 エクソン６および７は、ヒト相同体で見受けられることが分かっているように 、mVＲＦで隣接している。mＶＲＦとhＶＲＦのエクソン６の間の強い配列相同性 (図１０)は、この配列が保持されたイントロン配列ではないが、どちらかといえ ばＶＲＦ₁₈₆異性体(isoform)の機能部分をコードすることを示す。 一般的なイントロン／エクソンの構造は、ＶＥＧＦ遺伝子ファミリーの様々な メンバー(ＶＥＧＦ、ＰＩＧＦ、hＶＲＦ)の間で保存され、また従って、mＶＲＦ 遺伝子のゲノム組織全体がこれらの遺伝子に大変似ていることは驚くべきことで はない(図１２)。 先の比較マッピング試験は、染色体１１q１３遺伝子座上のヒト複合内分泌腺 新生物タイプ１疾患部を取り囲む領域が、マウス染色体１９の近位セグメントと シンテニック(syntenic)であることを示している(Ｒochelleら、１９９２)。発 明者らは、hＶＲＦ遺伝子を１kbのヒトＭＥＮ１遺伝子座内にマップしているこ とから(上記参照)、多分、マウスＶＲＦ遺伝子は、染色体１９のセントロメア付 近にマップされるであろう。m ＶＲＦの発現試験 成人マウス組織(筋肉、心臓、肺、および肝臓)由来のＲＮＡのノーザン分析は 、発現が偏在するらしく、約１.３kbの大きさの主要なバンドとして存在するこ とを示した(図１４)。これは、２.０および５.５kbの２つの主要なバンドが試験 した全ての組織で同定されているという、hＶＲＦの場合に観察されるパターン とは幾分異なっている。１.３kbのマウスメッセージは、恐らく、より短いヒト 転写物に対応するであろうし、またその大きさの変化は、多分、各々の５'ＵＴ Ｒの長さにおける相違によるものであろう。 実施例 ６ 分娩前および分娩後のマウスにおけるマウスＶＥＧＦの発現 動物 妊娠期の同じマウス(ｎ＝４)および若年の成熟マウス(ｎ＝２)(Ｃ５７近交系 、ＡＬＡＢ、スウェーデン)を二酸化炭素で屠殺し、関連のある組織を採取して 、チャック(chuck)上で凍結した。さらに使用するまで、組織を−７０℃で保存 した。２つの妊娠年齢をこの試験に使用した；胚日数８(Ｅ８)、１４、およびＥ １７。in situ ハイブリダイゼーション組織化学 前記(Ｄagerlindら、１９９２)と同様にして、in situハイブリダイゼーショ ンを行った。簡単に言えば、横切片(１４μm)を低温槽(Ｍicrom、独国)中で切断 し、プローブ−オン(Ｐrobe-Ｏn)スライド(Ｆisher Ｓcientific、米国)上で解 凍して、使用するまで、光を遮断しシールされた箱の中に−７０℃で保存した。 mＶＲＦをコードするmＲＮＡに相補的な合成の４２−merのオリゴヌクレオチド の配列は、 ＡＣＣＡＣＣＡＣＣＴＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＧＣＡＴＧＴＧＧＣＡＣＧＴ ＧＣＡＴＡＡＡＣＧ［配列番号１１］(nt １２０−１６１に相補的である)およ び ＡＧＴＴＧＴＴＴＧＡＣＣＡＣＡＴＴＧＣＣＣＡＴＧＡＧＴＴＣＣＡＴＧ ＣＴＣＡＧＡＧＧＣ［配列番号１２］(nt １６２−２０３に相補的である)であ った。２つの選択的なスプライス型を検出するために、オリゴヌクレオチド ＧＡＴＣＣＴＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＴＧＧＡＴＧＡＴＧＴＣＡ ＧＣＴＧＧ［配列番号１３］(nt ｘｘｘ−ｘｘｘに相補的である)および ＧＣＧＧＧＣＡＧＡＧＧＡＴＣＣＴＧＧＧＧＣＴＧＴＣＴＧＧＣＣＴＣＡ ＣＡＧＣＡＣＴ［配列番号１４］を使用した。プローブは、ターミナルデオキシ ヌクレオチジルトランスフェラーゼ(ＩＢＩ、米国)を使用して、デオキシアデノ シン−α[チオ]トリホスフェート[³⁵Ｓ](ＮＥＮ、米国)で７−１０×１０⁸cpm／ μgの比放射能まで３'末端を標識して、前処理することなく、切片に４２℃で１ ６−１８時間ハイブリダイズさせた。そのハイブリダイゼーション混合物は、以 下のものを含んでいた：５０％ ｖ／ｖ ホルムアミド、４×ＳＳＣ(１×ＳＳＣ ＝０.１５Ｍ ＮaＣlおよび０.０１５Ｍ クエン酸ナトリウム)、１×Ｄenhardt溶 液(各々、０.０２％ ポリビニルピロリドン、ＢＳＡ、およびフィコール)、１％ ｖ／ｖ サルコシル(Ｎ−ラウロイルサルコシン；Ｓigma)、０.０２Ｍ リン酸緩 衝液(pＨ７.０)、１０％ ｗ／ｖ 硫酸デキストラン(Ｐharmacia、スウェーデン) 、２５０μg／ml 酵母tＲＮＡ(Ｓigma)、５００μg／ml 切断して熱変性させた サケ精子ＤＮＡ(Ｓigma)、および２００mＭ ジチオトレイトール(ＤＴＴ；ＬＫ Ｂ、スウェーデン)。対照切片では、そのハイブリダイゼーション混合物に２０ 倍過剰の非標識化プローブを添加することにより、両方のプローブの特異性を調 べた。加えて、隣接した切片を、異なった発現パターンを与える、この試験には 関係のないプローブとハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションに続いて 、その切片を５５℃の１×ＳＳＣ中で数回洗浄し、エタノール中で脱水して、Ｎ ＴＢ２核トラックエマルション(Ｋodak、米国)に浸漬した。３−５週間後、その 切片をＤ−１９展開剤(Ｋodak、米国)中で展開して、カバーグラスをかけた。い くつかの場合には、エマルションに浸漬する前に、切片をオートラジオグラフフ ィルム(β−マックスオートラジオグラフフィルム、Ａmersham Ｌtd、英国)と対 置させた。 ４つの異なったプローブは、試験した全ての組織において同一のハイブリダイ ゼーションパターンを与えた。マウスＶＲＦ発現は、Ｅ８胚において既に検出さ れており、ニューロン管にもっともよく対応するであろう構造に対して、陽性の シグナルが記録された。Ｅ１４マウス胚の縦切片では、最も強いハイブリダイゼ ーションシグナルが心臓に、および神経系、特に大脳皮質において存在していた (図１４Ａ)。低レベルの発現は、全ての他の組織において存在していた。妊娠後 期Ｅ１７では、高いmＶＲＦ mＲＮＡシグナルは、心臓および首の後ろ並びに周 りにある褐色脂肪組織に限られていた(図１４Ｂ)。明らかに陽性のハイブリダイ ゼーションシグナルが脊髄の灰白質において、および舌において存在していた( 図１４Ｂ)。大脳皮質での発現は、１４日目に比べて明らかに減少した。例えば 、筋肉におけるＥ１４胚で見られる弱いバックグラウンド発現は、この妊娠年齢 で減少した。強いmＶＲＦ mＲＮＡハイブリダイゼーションシグナルは、若年の 成熟マウスにおける心臓に対して、および褐色脂肪においてのみ存在していた( 図１４Ｃ)。心臓上のシグナルは、乳頭筋を含め、心室壁全体にわたって均一に 分布していた(図１４Ｄ)。過剰の冷プローブとハイブリダイズした心臓組織の切 片では、バックグラウンドシグナルの特異的な標識化は全く記録されなかった( 図１４Ｅ)。 心臓とは別に、mＶＲＦ mＲＮＡシグナルは、形態学的には、褐色脂肪に似て いる胸郭の外側にある、ある組織全体に存在していた。これは、同じ領域で強い 染色を示す、ズダン黒対比染色で確認された(図１５Ａおよび１５Ｂ)。成熟マウ ス脊髄の横切片では、mＶＲＦプローブは、灰白質に対してニューロン染色パタ ーンを与えた(図１５Ｃ)。トルイジンでの対比染色(図１５Ｄ)は、前角における 運動ニューロン(図１５Ｃおよび１５Ｄ)、後角の深部における、および中心管の 周りの介在ニューロン(図１５Ｃ)の大部分が、mＶＲＦ mＲＮＡに陽性であるこ とを示した。 実施例 ７ ヒナの感覚ニューロンに対するＶＥＧＦおよびＳＯＭ１７５タンパク質の効果 Ｎurcombeら（１９９２）の方法を使用して、胚８日目のニワトリのヒナの感 覚ニューロンに対するＶＥＧＦおよびＳＯＭ１７５タンパク質の効果を測定した 。試験ウェル当たり２０００細胞を使用して、ニューロンの試験を４８時間目に 計数した。³Ｈ−チミジン計数を使用して結果を得た。ＮＧＦを陽性の対照とし て、 また様々な濃度のＶＥＧＦ、ヘパリンの存在下におけるＶＥＧＦ、およびヘパリ ンと５μＭ ５'−フルオロウラシル(５ＦＵ)の存在下におけるＶＥＧＦを使用し て、ニューロンの生存のパーセント、神経外殖、および平均の神経の長さ(μm) を測定した。５ＦＵは神経膠細胞を殺す。 結果を図１６に示す。その結果は、ＶＥＧＦがニューロンの生存を増進するの に有効であるが、これには、神経膠細胞の存在が必要であることを示す。図１７ は、３種類の雛の神経膠に対するＶＥＧＦおよびＳＯＭ１７５の効果の結果を示 す。試験した神経膠は、ＣＮＳ神経膠、末梢神経膠、およびＣＮＳ希突起神経膠 細胞であった。全ての培養において、ヘパリンを１０μg／mlとして使用して、 試験を２４時間目に計数した。ウェル毎に２０００細胞を使用して、結果を³Ｈ −チミジン計数で測定した。その結果は、ヒナの中枢および末梢ニューロンの場 合には、大神経膠細胞が著しく刺激されて、ヘパリンの存在下においてＳＯＭ１ ７５により増殖したが、ヒナの希突起神経膠細胞は分裂速度は無視できるほどの 増加であったことを示す。 実施例 ８ マウス一次および中枢ニューロンに対するＳＯＭ１７５タンパク質の効果 実施例７での結果は、ＶＥＧＦ異性体が、大神経膠細胞の作用によって、ヒナ の一次および中枢ニューロンに対する効果を有していたことを示す。同様の実験 をマウス細胞で繰返した。培養条件 「Ｍethods in Ｎeurosciences（第２巻）：Ｃell Ｃulture」Ｐ.Ｍ.Ｃonn編 、Ａcademic Ｐress、サンディエゴ、１９９０、大神経膠細胞に関しては３３− ４６頁、希突起神経膠細胞に関しては５６−７４頁、および中枢ニューロンに関 しては８７−１０２頁に記載されている方法に従って、全てのインビトロにおけ る実験のためにニューロンおよび神経膠細胞を調製して、培養した。 ポリ−Ｌ−オルニチン(０.１mg／ml、１時間)で被覆した２４ウェルの培養ク ラスター(Ｎunc)に、細胞を２,０００細胞／ウェルの密度で塗布した。培養して から４８時間後、十分確立された方法(Ｍarutaら、１９９３)を使用して、ニュ ーロンを逆相光(inverted phase light)の下にウェル中で計数し、以下のように して、神経膠細胞を[³Ｈ]チミジンの取込みで評価して、細胞分裂速度をモニタ ーした。ことわらなければ、ヘパリン(１０μg／ml、低分子量画分、Ｓigma Ｃh emical Ｃorp.)は常時、培地中に存在していた。ニューロン培養物に５mＭ ５− フルオロ−２−デオキシウリジン(Ｓigma)を補って、バックグラウンドの神経膠 細胞増殖を抑制した。神経膠細胞増殖に関する³Ｈ−チミジン取込みアッセイ 細胞を、標準的な培地中、０.１mＣi／mlの保存濃度から³Ｈ−チミジン(比放 射能 １０３μＣi／ug)で１４時間パルスして、最終的に２０μl／ウェルのイン キューベート容量になった。ウェルの内容物を収集して、ニトロセルロース紙( Ｔitertek、Ｆlow)に吸収させた。トリプシン／ベルセン(versene)(ＣＳＬ Ｌim ited、ビクトリア、オーストラリア)と共に５分間インキュベーションすること により、残りの付着細胞を取り除いた。この手順を２回行った。最初に蒸留水を 、次いでメタノールを使用して、ニトロセルロースディスクを標準的なＴiterte k 収集装置(Ｆlow)で洗浄した。そのニトロセルロースディスクを乾燥させ、シ ンチレーション液(５％ ｖ／ｖ Ｔriton−Ｘを含む)を添加して、そのディスク をシンチレーションカウンターで計数した。 最大活性は、マウス大神経膠細胞培養物でのエクソン６が欠けているＳＯＭ１ ７５(ＳＯＭΔＸ６)の製剤で見られ、ヘパリンと共に投与した場合には、それら の増殖に対して重要な刺激があった(図１６)。わずかな刺激が希突起神経膠細胞 の増殖に与えられ(図１７)、また単離された前脳ニューロンの生存応答の極僅か に認められる増強作用が与えられた(図１８)。各々の点に対する３つのグラフ全 てに関する標準偏差は８％未満であった。 神経膠細胞の増殖を増進することにより、ニューロンの生存率を維持すること ができる。さらにまた、ＳＯＭΔＸ６は、大神経膠細胞の良好な誘導物質であっ て、中枢神経系の内皮細胞での大神経膠細胞の終末球の形成と共に発現され得る 。 当業者は、ここに記載する本発明が、具体的に記載したもの以外にも変化およ び変更が可能であることが分かるであろう。本発明には、そのような変化および 変更が全て含まれることが理解されるべきである。本発明にはまた、本明細書中 に言及した、または示した工程、特徴、組成物、および化合物も全て個々に、ま たは総合的に含まれ、および該工程または特徴のいずれか２つまたはそれ以上の 、幾つか、および全ての組み合わせもまた含まれる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＷ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (31)優先権主張番号 ＰＮ７２７４ (32)優先日 1995年12月22日 (33)優先権主張国 オーストラリア（ＡＵ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＵＡ(ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ， ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 グリモンド，ショーン イギリス、オーエックス11・055、チルト ン、マナー・クロース２番 (72)発明者 ノルデンスチョールド，マグナス スウェーデン、エス−161 37ストックホ ルム、コルトラストヴェーゲン19番 (72)発明者 ラーソン，カタリナ スウェーデン、エス−113 44ストックホ ルム、ダンネモラガータン10エム３テーア ル番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．下記の特徴： （ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２に記載の配列に少なくとも約１５％の類似性を有 するが、少なくとも約５％の非類似性を有し； （ii）少なくとも１つの血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）と共通の性質を示すを 有する生物学的に分離されたタンパク質様分子。 ２．上記分子が、下記の特性： (a)血管内皮細胞の増殖を誘導する能力； (b)受容体のflt-1／flk-1族と相互作用する能力；および／または (c)細胞移動、細胞生存および／またはアルカリホスファターゼの細胞内濃度 の増大を誘導する能力； の少なくとも１つを示す、請求項１記載のタンパク質様分子。 ３．上記分子が大グリア細胞増殖を誘導する能力を有する、請求項１または２ 記載のタンパク質様分子。 ４．上記分子がヒト由来のものである、請求項１記載のタンパク質様分子。 ５．上記分子がヒト由来のものでない、請求項１記載のタンパク質様分子。 ６．上記分子が家畜類、愛玩動物、実験動物、鳥類、魚または爬虫類由来のも のである、請求項５記載のタンパク質様分子。 ７．上記分子が染色体１１ｑ１３に位置する遺伝子によってコードされている 、請求項５記載のタンパク質様分子。 ８．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２に対する類似性のパーセントが少なくとも約３０％ である、請求項１記載のタンパク質様分子。 ９．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２に対する類似性のパーセントが少なくとも約４０％ である、請求項１記載のタンパク質様分子。 １０．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２に対する類似性のパーセントが少なくとも約６０ −７０％である、請求項１記載のタンパク質様分子。 １１．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:４に記載のアミノ酸配列、またはそれらの部分、フ ラグメント、誘導体または類似体を含む、請求項１記載のタンパク質様分子。 １２．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:６に実質的に記載されたアミノ酸配列、またはそれ らの部分、フラグメント、誘導体または類似体を含む、請求項１記載のタンパク 質様分子。 １３．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:８に実質的に記載されたアミノ酸配列、またはそれ らの部分、フラグメント、誘導体または類似体を含む、請求項１記載のタンパク 質様分子。 １４．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１０に実質的に記載されたアミノ酸配列、またはそ れらの部分、フラグメント、誘導体または類似体を含む、請求項１記載のタンパ ク質様分子。 １５．下記の特徴： （ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:４に実質的に記載されたアミノ酸配列または、ＳＥ Ｑ ＩＤ ＮＯ:２に記載のアミ酸配列に少なくとも約１５％の類似性を有するが 、少なくとも約５％の非類似性を有し； （ii）少なくとも１つのＶＥＧＦと共通の生物学的性質を示す； を有する組換分子。 １６．下記の特徴： （ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:６に実質的に記載されたアミノ酸配列または、ＳＥ Ｑ ＩＤ ＮＯ:２に記載のアミ酸配列に少なくとも約１５％の類似性を有するが 、少なくとも約５％の非類似性を有し； （ii）少なくとも1つのＶＥＧＦと共通の生物学的性質を示す； を有する組換分子。 １７．下記の特徴： （ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:８に実質的に記載されたアミノ酸配列または、ＳＥ Ｑ ＩＤ ＮＯ:２に記載のアミ酸配列に少なくとも約１５％の類似性を有するが 、少なくとも約５％の非類似性を有し； （ii）少なくとも１つのＶＥＧＦと共通の生物学的性質を示す； を有する組換分子。 １８．下記の特徴： （ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１０に実質的に記載されたアミノ酸配列または、Ｓ ＥＱ ＩＤ ＮＯ:２に記載のアミ酸配列に少なくとも約１５％の類似性を有し、 かつ少なくとも約５％の非類似性を有し； （ii）少なくとも１つのＶＥＧＦと共通の生物学的性質を示す； を有する組換分子。 １９．下記の特性： (a)血管内皮細胞の増殖を誘導する能力； (b)受容体のflt-1／flk-1族と相互作用する能力； (c)細胞移動、細胞生存および／またはアルカリホスファターゼの細胞内濃度 の増大を誘導する能力； の少なくとも１つを有する、請求項１５〜１８のいずれか１項記載の組換分子。 ２０．大グリア細胞増殖を誘導する能力を有する、請求項１５〜１８のいずれ か１項記載の組換分子。 ２１．上記分子がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に実質的に記載されたアミノ酸配列を 含む請求項２０記載の組換分子。 ２２．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載のアミノ酸配列の一部に対応するペプチド フラグメント、または誘導体またはそれらの化学的均等物。 ２３．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に記載の配列を有する、請求項２２記載のペプチ ドフラグメント、またはそれらの化学的均等物。 ２４．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に記載の配列を有する、請求項２２記載のペプチ ドフラグメント、またはそれらの化学的均等物。 ２５．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に記載の配列を有する、請求項２２記載のペプ チドフラグメント、またはそれらの化学的均等物。 ２６．下記の特徴： （ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２に記載の配列に少なくとも約１５％の類似性を有 するが、少なくとも約５％の非類似性を有し； （ii）少なくとも１つの血管内皮成長因子(ＶＥＧＦ)と共通の性質を示す； を有するタンパク質様分子をコードするヌクレオチド配列または相補的な配列を 含む核酸分子。 ２７．上記タンパク様分子が、下記の特性： (i)血管内皮細胞の増殖を誘導する能力； (ii)受容体のflt-1／flk-1族と相互作用する能力； (iii)細胞移動、細胞生存および／またはアルカリホスファターゼの細胞内濃 度の増大を誘導する能力； の少なくとも１つを示す、請求項２６記載のタンパク質様分子。 ２８．上記タンパク様分子が大グリア細胞増殖を誘導する能力を有する、請求 項２７記載の核酸様分子。 ２９．上記分子がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に実質的に記載されたアミノ酸配列を コードする、請求項２８記載の核酸分子。 ３０．上記分子がヒト由来のものである、請求項２６記載の核酸分子。 ３１．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に対する類似性の％が少なくとも約３０％である 、請求項２６記載の核酸分子。 ３２．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３に実質的に記載されたヌクレオチド配列、または それに少なくとも１５％の類似性を有するヌクレオチド配列、またはＳＥＱ Ｉ Ｄ ＮＯ:３に定義された逆相補性のヌクレオチド配列に低いストリンジェントな 条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチド配列（ただし、ヌクレオチド配列は ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３に記載のヌクレオチド配列に少なくとも１５％の類似性を 有するが、３０％の非類似性を有する）を含む、請求項２６記載の核酸分子。 ３３．ヒトＶＥＧＦのマウス相同体をコードし、実質的に図９に示されたヌク レオチド配列を含む、請求項２６記載の核酸分子。 ３４．請求項１〜３および１１のいずれか１項記載のタンパク様分子、および １またはそれ以上の医薬的に許容され得る担体および／または希釈剤を含む、医 薬組成物。 ３５．下記の特徴： （ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２に記載の配列に少なくとも約１５％の類似性を有 するが、少なくとも約５％の非類似性を有するアミノ酸配列を含み； （ii）少なくとも１つの血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）と共通の生物学的性質 を示す； を有する組換分子の製造方法であって、上記方法が、上記組換分子を合成するの に効果的な条件下で適当な宿主細胞によって、上記組換分子をコードする核酸分 子を発現させ、ついで上記分子を分離することを含むことを特徴とする方法。 ３６．上記核酸分子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３に実質的に記載されたヌクレオ チド配列、またはそれに少なくとも１５％の類似性を有するヌクレオチド配列、 またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３に逆相補性のヌクレオチド配列に低いストリンジェ ントな条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチド配列（ただし、上記ヌクレオ チド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３に記載のヌクレオチド配列に少なくとも１５％ の類似性を有するが、３０％の非類似性を有する）を含むものである、請求項３ ５記載の方法。 ３７．哺乳動物における大グリア細胞の増殖方法であって、上記方法が、上記 哺乳動物に、下記の特徴： （ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２に記載の配列に少なくとも約１５％の類似性を有 するが、少なくとも約５％の非類似性を有するアミノ酸配列を含み； （ii）少なくとも１つの血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）と共通の性質を示す； を有する組換タンパク質様分子の有効量を投与し、上記投与が大グリア細胞の増 殖を誘導するのに適切な期間および条件下で行われることを特徴とする方法。 ３８．上記組換タンパク質様分子がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に実質的に記載され たアミノ酸配列を含むか、またはその誘導体である、請求項３７記載の方法。 ３９．上記組換タンパク質様分子がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に実質的に記載され たアミノ酸配列を含むか、またはその誘導体である、請求項３７記載の方法。 ４０．哺乳動物におけるニューロンの生存および／または増殖を促進する方法 であって、上記方法が、上記哺乳動物に、下記の特徴： （ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２に記載の配列に少なくとも約１５％の類似性を有 するが、少なくとも約５％の非類似性を有するアミノ酸配列を含み； （ii）少なくとも１つの血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）と共通の性質を示す； を有する組換タンパク質様分子の有効量を投与し、上記投与が大グリア細胞の増 殖を誘導するのに適切な期間および条件下で行われることを特徴とする方法。 ４１．上記組換タンパク質様分子がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に実質的に記載され たアミノ酸配列を含むか、またはその誘導体である、請求項４０記載の方法。 ４２．上記組換タンパク質様分子がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に実質的に記載され たアミノ酸配列を含むか、またはその誘導体である、請求項４０記載の方法。