NO320839B1

NO320839B1 - Isolert polypeptid, fremgangsmate for dets fremstilling, isolert nukleinsyremolekyl, isolert antistoff, antisensemolekyl, preparat, anvendelse av henholdsvis et polypeptid og et nukleinsyremolekyl, vertscelle samt vektor.

Info

Publication number: NO320839B1
Application number: NO19974035A
Authority: NO
Inventors: Nicholas Kim Hayward; Gunther Weber; Sean Grimmond; Magnus Nordenskjold; Catharina Larsson
Original assignee: Amrad Operations Pty Ltd
Priority date: 1995-03-02
Filing date: 1997-09-02
Publication date: 2006-01-30
Also published as: DE69630442D1; WO1996027007A1; FI120153B; BR9607628A; FI973571A; JPH11500139A; DE69630442T2; US20070135344A1; HUP9800377A3; ATE252600T1; KR100414615B1; NO974035D0; HUP9800377A1; EP0815221A4; EP0815221B1; ES2206558T3; CN1194090C; NO974035L; EP0815221A1; HK1002963A1

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører generelt et isolert molekyl med vaskulær endotel vekstfaktor-lignende egenskaper og en genetisk sekvens som koder for det samme. Molekylet vil være anvendbart i utviklingen av en rekke terapeutiske og diagnostiske midler som kan anvendes i behandling, profylakse og/eller diagnose av tilstander som krever økt eller redusert vaskulatur og/eller vaskulær permeabilitet. Molekylet i henhold til oppfinnelsen er også en anvendbar effektor av primære og sentrale neuroner og er i stand til å indusere astroglia proliferasjon.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører et isolert polypeptid samt en fremgangsmåte for dets fremstilling.

Oppfinnelsen vedrører også et isolert nukleinsyremolekyl, et isolert antistoff, et antisensemolekyl, et preparat, en vertcelle samt en vektor.

Endelig vedrører oppfinnelsen anvendelse av henholdsvis et polypeptid og et nukleinsyremolekyl.

Bibliografiske detaljer av publikasjonene som forfatteren viser til i denne søknad er samlet på slutten av beskrivelsen. Sekvensidentitetstall (SEQ ID NO'er) for nukleotid-

og aminosyresekvenser som er omtalt i beskrivelsen er definert etter bibliografien.

I forbindelse med denne beskrivelse, med mindre sammenhengen krever noe annet, vil ordet "omfatte", eller variasjoner som "omfatter" eller "omfattende", forstås til å innebære inn-lemmelsen av et angitt element eller enhet eller gruppe av elementer eller enheter men ikke utelukkelsen av et hvilket som helst annet element eller enhet eller gruppe av elementer eller enheter.

Vaskulær endotel vekstfaktor (heretter omtalt som VEGF) også kjent som vasoaktiv permeabilitetsfaktor, er et utskilt, kovalent bundet homodimert glykoprotein som spesifikt akti-verer endotelvev (Senger et al, 1993). En rekke funksjoner er blitt tillagt VEGF som dens involvering i normal angiogenese som inkluderer dannelsen av corpus iuteum (Yan et al, 1993) og placental utvikling (Sharkey et al, 1993), reguler-ing av vaskulær permeabilitet (Senger et al, 1993), inflamma-torisk angiogenese (Sunderkotter et al, 19 94) og autotrans-plantasjon (Dissen et al, 1994) og humane sykdommer som tumorfremmende angiogenese (Folkman & Shing, 1992), revmatoid artritt (Koch et al, 1994) og diabetesrelatert retinopati (Folkman & Shing, 1992).

EP 0471754 Bl vedrører en isolert nukleinsyresekvens som omfatter en sekvens som koder for en vaskulær endotelcelle-vekstfaktor.

EP 04844 01 Bl vedrører en isolert DNA sekvens som koder for bovin endotelcelle-vekstfaktor bVEGF120.

K. Weindel et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, vol. 183, no. 3 1992, pp 1167-1174 vedrører at AIDS-assosierte Kaposis sarkomaceller i kultur uttrykker vaskulær endotel-vekstfaktor.

E. Tischer et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, vol. 165, no. 3, 1989, pp 1198-1206 vedrører isolering av CDNA kloner som koder for bVEGF. D. J. Lyttle et al., Journal of Virology, vol. 68 no. 1, 1994, pp 84-92 vedrører funnet av et gen i et virus som koder for et polypeptid med homologi til pattedyr VEGF.

VEGF er derfor et viktig molekyl som gjør det til et potensielt verdifullt mål for forskning på terapeutiske, profylaktiske og diagnostiske midler basert på VEGF eller dens aktiviteter. Der er også et behov for å identifisere homologer eller ellers relaterte molekyler for anvendelse som et alternativ til VEGF eller sammen med VEGF.

I det arbeid som ledet til den foreliggende oppfinnelse søkte oppfinnerne multippel endokrin neoplasi type I suskeptibili-tetsgenet (MEN1). Oppfinnerne har overraskende funnet at en genetisk sekvens som var utelukket som en kandidat for MEN1 genet likevel var en hy vekstfaktor med noe likhet med VEGF. Videre er vekstfaktoren i henhold til oppfinnelsen et effek-tormolekyl for primære og sentrale neuroner.

I ett aspekt av den foreliggende oppfinnelse tilveiebringes følgelig et isolert polypeptid som utviser i det minste en av de etterfølgende egenskaper: (i) en evne til å indusere proliferasjon av vaskulære endotelceller; (ii) en evne til å interagere med flt- l/ f. lk- 1 familien av reseptorer; og/eller (iii) en evne til å indusere cellemigrering, celleoverlevelse og/eller en økning i intracellulære

nivåer av alkalisk fosfatase;

hvor nevnte polypeptid omfatter:

a. en aminosyresekvens som kodet for av nukleotidsekvensen som angitt i SEQ ID NO:3, eller en nukleotidsekvens som hybridiserer over den fulle lengde av SEQ ID NO:3 eller dens komplementære form under høystringensbetingelser av 0,1-1 x SSC/0,1% vekt/vekt SDS ved 60°C i 1-3 timer;

eller

b. en aminosyresekvens som angitt i SEQ ID NO:4 eller en trunkert form av nevnte polypeptid som utviser minst en av egenskapene (i)- (iii) .

Med uttrykket "biologisk isolert" menes at molekylet har gjen-nomgått minst ett rensetrinn fra en biologisk kilde. Molekylet er foretrukket også biologisk rent, noe som betyr at et preparat omfatter minst omtrent 2 0 %, mer foretrukket minst omtrent 40 %, ytterligere foretrukket minst omtrent 65 %, og enda mer foretrukket minst omtrent 80-90 % eller mer av molekylet som bestemt uttrykt i vekt, aktivitet eller på annen passende måte, i forhold til andre forbindelser i preparatet. Molekylet er mest foretrukket sekvensmessig rent.

I et annet foretrukket aspekt av den foreliggende oppfinnelse tilveiebringes molekylet i rekombinant form.

Den foreliggende oppfinnelse ser også på genomiske kloner eller partielle genomiske kloner som koder for et proteinøst molekyl ifølge oppfinnelsen.

Aminosyresekvensen som angitt i SEQ ID NO:2 svarer til human VEGF (omtalt heri som "VEGF165"). Følgelig er molekylet i henhold til oppfinnelsen VEGF-lignende eller er en homolog av VEGF men omfatter en aminosyresekvens som ligner men som ikke er identisk med aminosyresekvensen til VEGF. Skjønt den foreliggende oppfinnelse er eksemplifisert ved anvendelse av et humant VEGF-lignende molekyl, er dette gjennomført med den forståelse at den foreliggende oppfinnelse kontemplerer det homologe molekyl og kodesekvensen fra andre pattedyr slik som husdyr (f.eks. sau, svin, hester og kuer), selskapsdyr (f.eks. hunder og katter) og laboratorieforsøksdyr (f.eks. mus, rotter, kaniner og marsvin) så vel som ikke-pattedyr som fugler (f.eks. fjærkre), fisk og reptiler. I den mest fore-trukne utførelsesform er det VEGF-lignende molekyl av human opprinnelse og kodet for av et gen lokalisert i kromosom llql3. Den foreliggende oppfinnelse strekker seg derfor.til den genomiske sekvens eller del derav som koder for det til-siktede VEGF-lignende molekyl.

Den prosentvise likhet er foretrukket minst omtrent 3 0 %, mer foretrukket minst omtrent 40 %, ytterligere foretrukket minst omtrent 50 % og enda ytterligere foretrukket minst omtrent 60-70 %, likevel enda ytterligere foretrukket minst omtrent 80-95 % med hele eller en del av aminosyresekvensen angitt i

SEQ ID, NO : 2 .~

I ett aspekt omfatter det VEGF-lignende molekyl i henhold til oppfinnelsen en sekvens av aminosyrer som angitt i SEQ ID NO:4 eller er en del, et fragment, et derivat eller analog derav. Henvisning heri til derivater inkluderer også spleisevarianter. Følgelig strekker den foreliggende oppfinnelse seg også til spleisevarianter av SOM175. Eksempler på spleisevarianter' som omfattes av den foreliggende oppfinnelse inkluderer, men er ikke begrenset til, varianter med en aminosyresekvens som hovedsakelig angitt i minst én av SEQ ID NO:8 og/eller SEQ ID NO:10 eller mutanter eller derivater eller ytterligere spleisevarianter derav.

Således omfatter et ytterligere aspekt av den foreliggende oppfinnelse omfatter et peptidfragment som svarer til en del av aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO:4 eller en spleise-variant derav som angitt i SEQ ID NO:8 eller SEQ ID NO:10 eller en kjemisk ekvivalent derav. Det biologisk isolerte eller rekombinante molekyl i henhold til oppfinnelsen kan være naturlig glykosylert eller det kan omfatte et endret glykosyleringsspor avhengig av cellene hvorfra det er isolert eller syntetisert. Dersom det for eksempel er dannet ved rekombinante metoder i prokaryotiske organismer, vil molekylet være ikke-glykosylert. Molekylet kan ha en full-lengde, naturlig forekommende form eller det kan være i en trunkert eller på annen måte derivatisert form.

I et ytterligere aspekt vedrører den foreliggende oppfinnelse et isolert nukleinsyremolekyl som koder for det VEGF-lignende molekyl beskrevet heri. Mere spesielt tilveiebringer oppfinnelsen et nukleinsyremolekyl som omfatter nukleotidsekvensen som angitt i SEQ ID NO:3 eller en nukleotidsekvens som hybridiserer over den fulle lengde av nukleotidsekvensen angitt i SEQ ID NO:3 eller den komplementære form under svært stringente betingelser av 0,1 - 1 x SSC/0,1% vekt/vekt SDS ved 60°C i 1-3 timer.

For å definere graden av stringens kan man passende vise til Sambrook et al (1989) side 9.47-9.51 hvor vasketrinnene angitt deri er betraktet som høystringente. En lav stringens er heri definert til å være 4-6X SSC/0,1-0,5 % vekt/volum SDS ved 3 7-45°C i 2-3 timer. Avhengig av kilden og konsentra-sjonen av nukleinsyre involvert i hybridiseringen, kan alternative stringensbetingelser anvendes som betingelser med medium stringens som heri betraktes til å være 1-4X SSC/0,25-0,5 % vekt/volum SDS ved *45°C i 2-3 timer eller høystring-ensbetingelser som heri betraktes til å være 0,1-IX SSC/0,1 % vekt/volum SDS ved 60°C i 1-3 timer.

Oppfinnelsen er videre rettet mot den murine homolog av human VEGF (heretter omtalt som "mSOM175"). mSOM175 har omtrent 85 % identitet og 92 % bevaring av aminosyrerester over hele koderegionen sammenlignet med human VEGF. mSOM175 er kodet for av et nukleinsyremolekyl som omfatter en nukleotidsekvens som hovedsakelig angitt i fig. 9.

Det VEGF-lignende molekyl i henhold til oppfinnelsen vil være anvendbart i utviklingen av en rekke terapeutiske og/eller diagnostiske anvendelser alene eller i kombinasjon med andre molekyler som VEGF. Den foreliggende oppfinnelse strekker seg derfor til farmasøytiske preparater som omfatter det VEGF-lignende molekyl eller deler, fragmenter, derivater, homologer eller analoger derav sammen med en eller flere farmasøytisk tålbare bærere og/eller fortynningsmidler. I tillegg vedrører oppfinnelsen også ribozymer og antisense-molekyler basert på SEQ ID NO:3 så vel som isolerte nøytrali-serende antistoffer mot det VEGF-lignende molekyl. Slike molekyler kan være anvendbare til å forbedre effekten av, for eksempel, overekspresjon av VEGF-lignende gener som fører til angiogenese eller vaskularisering av tumorer.

Oppfinnelsen vedrører også en fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid ifølge oppfinnelsen som omfatter å uttrykke et nukleinsyremolekyl som koder for et polypeptid ifølge oppfinnelsen i en passende vert dyrket under betingelser som er effektive for syntese av nevnte polypeptid.

Oppfinnelsen vedrører også et preparat som omfatter et polypeptid ifølge oppfinnelsen og en eller flere farmasøytisk aksepterbare bærere og/eller fortynningsmidler.

Oppfinnelsen vedrører også en vektor som omfatter et nukleinsyremolekyl ifølge oppfinnelsen, samt en vertcelle som omfatter et nukleinsyremolekyl ifølge oppfinnelsen.

Oppfinnelsen vedrører også anvendelse av et polypeptid som utviser minst en av de etterfølgende egenskaper: (i) en evne til å indusere proliferasjon av vaskulære endotelceller (ii) en evne til å interagere med flt- l/ flk- 1 familien av reseptorer; og/eller (iii) en evne til å indusere cellemigrering, celleoverlevelse og/eller en økning i intracellulære nivåer av

alkalisk fosfatase;

hvor nevnte polypeptid omfatter:

a. en aminosyresekvens som kodet for av nukleotidsekvensen som angitt i SEQ ID N0:1, 3, 5, 7 eller 9 eller en nukleotidsekvens i stand til å hybridisere til SEQ ID N0:1, 3, 5, 7 eller 9 eller dens komplementære form under høystringensbetingelser av 0,1-1 x SSC/0,1%

vekt/vekt SDS ved 60°C i 1-3 timer; eller

b. en aminosyresekvens som angitt i SEQ ID NO:2, 4, 6, 8

eller 10 eller en aminosyresekvens med minst 70% likhet

dermed; eller en trunkert form av nevnte polypeptid, for fremstilling av et medikament for å indusere astroglia proliferasjon i et pattedyr.

Endelig vedrører oppfinnelsen anvendelse av et nukleinsyremolekyl som koder for et polypeptid som definert i ett eller flere av kravene 13 til 16 for fremstilling av et medikament for å indusere astroglia proliferasjon i et pattedyr.

Det rekombinante proteinøse molekyl omfatter foretrukket aminosyresekvensen som angitt i SEQ ID NO:4 eller SEQ ID NO: 6.

Den foreliggende oppfinnelse er videre beskrevet under henvisning til de etterfølgende figurer og/eller eksempler.

I figurene:

Fig. 1 Nukleotidsekvens [SEQ ID NO:l] og tilsvarende

aminosyresekvens [SEQ ID NO:2] av VEGF165.

Fig. 2 Nukleotidsekvens [SEQ ID NO:3] og tilsvarende aminosyresekvens [SEQ ID NO:4] av SOM175. Fig. 3 Resultater av BLAST søk med SOM175 proteinsekvens. Fig. 4 BESTFIT oppstilling av VEGF cDNA og SOM175 cDNA. Fig. 5 Multippel oppstilling av VEGF165 med SOM175 og dens

spleisevarianter på nukleotidnivå.

Fig. 6 Multippel oppstilling av VEGF165 med SOM175 og dens

spleisevarianter på aminosyrenivå.

Fig. 7 Skjematisk fremstilling av SOM175 og dens spleise varianter. Fig. 8(a) Skjematisk fremstilling av genomisk struktur av

human SOM175 som genomisk viser exon/intron kart.

Fig. 8(b) Skjematisk fremstilling av genomisk struktur av

human SOM175 som viser exon/intron grenser.

Fig. 9 Nukleotid- og forutsagte peptidsekvenser avledet fra mS0M175 cDNA kloner. Nummerering av nukleotider er gitt på venstre side, idet man starter fra A av initieringskodonet. Aminosyrer er nummerert på høyre side, idet man starter fra den første rest av det forutsagte modne protein etter at det putative signalpeptid har blitt fjernet. Den alternative spleisede region er dobbelt understreket og den oppnådde peptidsekvens fra hver mRNA er inkludert. Et potensielt polyadenyleringssignal er indikert i uthevet skrift. Start- og stopp-kodoner av mSOM175167 og mSOM175186 er understreket og en poly-morf AC repetisjon i 3' UTR er indikert ved en stiplet boks. Posisjonene av intron/exon grenser er indikert ved piler. Fig. 10 BESTFIT oppstillinger av human og murin SOM175

proteinisoformer. A: mSOM175167 og hSOM175167.

B: mSOM17<5>186 og hSOM175166 fra punktet hvor

, sekvensene divergerer fra de respektive 167 amino-syreisoformer. Aminosyreidentiteter er markert med vertikale streker og konserverte aminosyrer med koloner. En pil markerer det forutsagte signalpeptid-kuttesete av human og mus SOM175.

Fig. 11 - BESTFIT oppstilling av mSOM175167 og mVEGF188 (Breier et al, 1992) peptidsekvenser. En pil markerer signalpeptid-kuttesetet av mVEGF. Identiske aminosyrer er indikert ved vertikale streker og konver-verte substitusjoner ved koloner. Nummerering av aminosyrer er som beskrevet i forklaringen til fig. 9.

Fig. 12 Sammenligning av genstruktur mellom SOM175 (et generisk SOM175 gen er vist da intron/exon-organise-ringen av mus og humane homologer nesten er identiske) og andre medlemmer av den humane VEGF/PIGF/ PDGF genfamilien. Exoner er representert ved bokser. Proteinkoderegioner og utranslaterte regioner er vist ved henholdsvis fylte og åpne seksjoner.

Den skraverte region i SOM175 indikerer den ytterligere 3' UTR sekvens dannet ved vekslende spleising av SOM175186. isoformen. Potensielle vekslende spleiseprodukter av hvert gen er vist. Fig. 13 Autoradiogram av et Northern blot av total RNA fra forskjellige vev fra voksne mus (som indikert) hybridisert med et mSOM175 cDNA klon. Et stort transkript på 1,3 kb ble detektert i alle prøver. Fig. 14 Filmautoradiografer (A-C) og mørkefelt mikrografer (D-E) illustrerer ekpresjonsmønsteret til mSOM175 og mRNA i mus. I E14 museembryoet (A) fremvises positive signaler over det utviklende hjertet (Ha) og cerebral korteks (Cx). Et lavt bakgrunnssignal fremvises også over annet vev i snittet. I E17 embryoet (B).er hjertet (Ha) klart synlig på grunn av et sterkt hybridiseringssignal. Et like sterkt signal er tilstede over "brown" adipøst vev (Fa) i ryggen og rundt brysthulen. Et moderat hybridiseringssignal er tilstede over ryggmargen (SC) og tungen (T). Bakgrunnssignalet er redusert sammenlignet med E14 embryoet. I den unge utvokste mus (C-D) er positive signaler tilstede over hjertet (Ha) og adipøst vev (Fa) rundt brysthulen, mens for eksempel lungene (Lu) er umerket. Hybridiserings-signalet over hjertet er jevnt fordelt over hele den venstre ventrikkel, inkluderende papillarmuskler (D). I E17 hjertet hybridisert med et overskudd av kald probe, er ingen positive signaler tilstede (E).

Skalastreker = 0,5 mm (A), 1,2 mm (B), 1 mm (C), 0,3 , mm (D) , 0,1 mm (E) . Fig. 15 Mørkefelt (A og C) og lysfelt (B og D) mikrografer viser mSOM175 mRNA ekspresjon i adipøst vev (A-B) og ryggmargen (C-D) fra mus. Et sterkt hybridiseringssignal er tilstede over fett (A), som vist ved den sterke merking i Sudan-sortfargede snitt (B). Et svakt signal er også tilstede i skjelettmuskel (M i A-B). I den fullt utviklede ryggmarg (C) ga mSOM175 prober et neuronalt fargingsmønster over den grå substans. Toloudin motfarging viste at motoneuroner i det ventrale horn (D), interneuroner i den dype delen av det dorsale horn og rundt sentralkanalen (ikke vist) var svært positive for mSOM175 mRNA. Skalastreker = 0,1 mm (A), 0,1 mm (B), 0,25 mm (C), 0. 015 mm (D) . Fig. 16 Effekt av VEGF på embryoniske dag 8 (E8) sensoriske kyllingneuroner som bestemt i % overlevelse, % neuritt utvekst og gjennomsnittlig neuritt lengde (/zm) . Fig. 17 Effekter av VEGF og SOM175 på kylling-gliavev. Det ble testet CNS gliavev, perifert gliavev og CNS

oligodendrocytter.

Fig. 18 Effekt av forskjellige S0M175 proteiner på

astrogliaceller fra mus. ■ <3>H (cpm)

1. FGF-2 (10 ng/ml) positiv kontroll

2. SOMAX6<*> 1 ng/ml

3. SOMÅX6 10 ng/ml

4. S0MAX6 100 ng/ml

5. S0MAX6 1000 ng/ml

6. S0MAX6 1000 ng/ml, ingen heparin

7. S0MX6<**> 1 ng/ml

8. S0MX6 10 ng/ml

9. SOMX6 100 ng/ml

10. SOMX6 1000 ng/ml

11. SOMX6 1000 ng/ml, ingen heparin

<*> Denne refererer til SOM175 manglende exon 6

<**> Denne refererer til S0M175.

Fig. 19 Effekt av forskjellige SOM175 proteiner på

oligodenrogliaceller fra mus. ■ <3>H (cpm) 1. FGF-2 (10 ng/ml) positiv kontroll

2. SOMAX6<*> 1 ng/ml

3. SOMAX6 10 ng/ml

4. SOMAX6 100 ng/ml

5. SOMAX6 1000 ng/ml .

6.. SOMAX6 100 0 ng/ml, ingen heparin

7.. SOMX6<**> 1 ng/ml

8. S0MX6 10 ng/ml

9. S0MX6 100 ng/ml

10. S0MX6 1000 ng/ml 11. SOMX6 100 0 ng/ml, ingen heparin <*> Denne refererer til SOM175 manglende exon 6

<**> Denne refererer til SOM175.

Fig. 2 0 Effekt av forskjellige SOM175 proteiner på

forhjerneneuroner fra mus. ■ % overlevelse I. FGF-2 (10 ng/ml) positiv kontroll 2 . S0MÅX6<*> 1 ng/ml

3 . S0MAX6 10 ng/ml

4. S0MAX6 100 ng/ml

5. S0MAX6 1000 ng/ml

6. S0MAX6 1000 ng/ml, ingen heparin

7. S0MX6<**> 1 ng/ml

8. S0MX6 10 ng/ml

9. S0MX6 100 ng/ml

10. S0MX6 1000 ng/ml II. S0MX6 1000 ng/ml, ingen heparin <*> Denne refererer til SOM175 manglende exon 6 <**> Denne refererer til SOM175.

EKSEMPEL 1

Humane cDNA kloner

Det opprinnelige SOM175 cDNA ble isolert ved å screene et humant føtal-hjerne bibliotek (AzapII, Stratagene) med cosmidet D11S750 (Larsson et al, 1992). Plasmidet ble skilt ut "in vivo" og et enkelt 1,1 kb cDNA ble oppnådd. Tre uavhengige SOM175 cDNA kloner ble også isolert fra et humant føtal-milt bibliotek (Stratagene, Unizap) ved anvendelse av det ovennevnte SOM175 innskudd som en probe. Tre kloner ble oppnådd: SOM175-4A, -5A og-6A. SOM175-5A er et alternativt spleiset klon med exon 4 fraværende (S0M175-e4). Disse bibliotekscreeninger ble utført ved anvendelse av hybridiseringsbetingelser som er anbefalt av produsenten av biblio-teket (Stratagene) og random primet innskudd av SOM175.

To partielle humane SOM175 cDNA'er er også blitt isolert fra et AGTll human melanom cellelinje A2 058 bibliotek (Clontech).

(cDNA bibliotek screeninger ble utført ved anvendelse av hybridiseringsbetingelser beskrevet av Church og Gilbert, 1984). I hvert tilfelle ble proben dannet ved random priming av et PCR produkt avledet fra SOM175 (18f-700r).

cDNA kloner fra mus

Human SOM175 ble også anvendt til å screene et neonatal helhjerne cDNA bibliotek fra mus (Unizap, Stratagene). Fire ikke-kimære kloner ble isolert: M175-A, B, C, D. Alle kloner var partielle cDNA1 er og M175-C inneholdt flere introner.

Tre av disse cDNA'er manglet exonet 6.

Et annet klon omtalt som Ml ble fullstendig sekvensert og ble funnet til å inneholde den fullstendige åpne leseramme pluss del av 5'utr og total 3'utr.

EKSEMPEL 2

DNA sekvensanalyser

Den totale sekvens av cDNA klonet (SOM175) ble kompilert og er vist i fig. 2 med dets tilsvarende aminosyresekvens. Denne sekvens ble screenet for åpne leserammer ved anvendelse av MAP programmet (GCG, University of Wisconsin). En enkel åpen leseramme av 672 bp ble observert (se fig. 2). Der fremgår å være lite 5' utranslaterte sekvenser (2 bp). Den 3<1> utranslaterte region synes å være komplett da den inkluderer et polyadenylensignal og poly-A hale.

Database-homologisøk ble utført ved anvendelse av BLAST-algoritmen (kjørt ved NCBI, USA). Denne analyse viste homologi med en rekke pattedyrformer av VEGF (se fig. 3). Graden av homologi mellom SOM175 og human VEGF165 ble bestemt ved anvendelse av BESTFIT programmet (GCG, University of Wisconsin, se fig. 4 og 5). Nukleotidhomologi ble estimert til 69,7 % og proteinhomologi ble estimert som minst 33,3 % identitet og 52,5 % konservering ved anvendelse av BESTFIT analyse. BLAST analyser på nukleotidsekvenser viste det nesten komplette motstykke til en human uttrykt sekvenstag EST06302 (Adams et al, 1993).

Disse data indikerer at SOM175 koder for en vekstfaktor som har strukturelle likheter med VEGF. Begge gener viser start-og stoppkodoner i lignende posisjoner og deler adskilte blok-ker av homologi. Alle 8 cysteiner så vel som en rekke andre VEGF rester antatt til å være involvert i dimerisering er konservert. Disse rester er Cystein-47, Prolin-70, Cystein-72, Valin-74, Arginin-77, Cystein-78, Glycin-80, Cystein-81, Cystein-82, Cystein-89, Prolin-91, Cystein-122 og Cystein-124 og er vist i fig. 6. Gitt den strukturelle konservering mellom VEGF og SOM175 genproduktet er det også mulig at de deler funksjonsmessige likheter. Det er foreslått at SOM175 koder for et VEGF-lignende molekyl som deler enkelte egenskaper med VEGF men som har egne unike egenskaper. Nukleotidsekvensen og den tilsvarende aminosyresekvens av VEGF165 er vist i fig. 1.

EKSEMPEL 3

Prosentandelen likhet og forskjell mellom VEGF165 familie og SOM175 familie (protein) ble analysert ved anvendelse av Clustal-metoden, MegAlign Software, DNASTAR, Wisconsin. Resultatene er vist i tabellene 2.1 og 2.2. De alternativt spleisede former av SOM175 er forkortet til SOM175-e6 hvor hele exon 6 er deletert, SOM175-e6 og 7 hvor hele exoner 6 og 7 er deletert, og SOM175-e4 hvor hele exon 4 er deletert.

Den spleisede form av SOM175 er vist i fig. 7. Genomiske kart av SOM175 som viser, intron/exon grenser er vist i fig. 8a og 8b.

EKSEMPEL 4

BIOASSAYS FOR Å BESTEMME FUNKSJONEN AV SOM175

Analyser gjennomføres for å evaluere om SOM175 har lignende aktiviteter som VEGF på endotelcellefunksjon, angiogenese og sårheling. Andre analyser gjennomføres basert på resultatene av reseptor-bindingsfordelingsstudier.

Analyser av endotelcellefunksjon

Endotelcelleproliferasjon. Endotelcellevekstanalyser som beskrevet i Ferrara & Henzel (1989) og i Gospodarowicz et al

(1989) .

Vaskulær permeabilitetsanalyse. Denne analyse, som anvender Miles-testen i marsvin, gjennomføres som beskrevet i Miles & Miles (1952).

Celleadhesjonsanalyse. Innvirkningen av SOM175 på adhesjon av polymorfer til endotelceller er analysert.

Kjemotaksis. Denne gjennomføres ved anvendelse av standard Boyden-kammer kjemotaksisanalyse.

Plasminogenaktivatoranalyse. Endotelceller testes for plasminogenaktivator og plasminogenaktivatorinhibitor-produksjon ved tilsetning av SOM175 (Pepper et al (1991)). Endotelcellemigreringsanalyse. Evnen til SOM175 til å stimulere endotelceller til å migrere og danne kanaler er bestemt som beskrevet i Montesano et al (1986).

Angiogeneseanalyse

SOM175 induksjon av en angiogen respons i kyl1ing-korio-allantoisk membran er evaluert som beskrevet i Leung et al

(1989) .

Mulige neurotrofiske virkninger'av SOM175 er bestemt ved anvendelse av følgende analyser:

Neuritt utvekstanalyse og geninduksjon (PC12 celler)

PC12 celler (en feokromocytomcellelinje) responderer på NGF og andre neurotrofiske faktorer ved å utvikle egenskapene av sympatiske neuroner, inkluderende induksjon av tidlige og sene gener og ekstensjonen av neuritter. Disse celler er eksponert for SOM175 og deres respons måles (Drinkwater et al

(1991) og Drinkwater et al (1993)).

Dyrkede neuroner fra det perifere nervesystem (PNS)

Primære kulturer av følgende PNS neuroner er eksponert for SOM175 og målt for en hvilken som helst respons: sensoriske neuroner fra nevral crest og dorsalrot ganglier sympatiske neuroner fra sympatisk-streng ganglier placode-avledede sensoriske neuroner fra nodoseganglier motoneuroner fra ryggmargen

Analysene er beskrevet i Suter et al (1992) og i Marinou et al (1992) .

Der det observeres in vitro respons, blir in vivo analyser for egenskaper som opptak og retrograd transport utført som beskrevet i Hendry et al (1992).

Nerveregenerering (PNS)

Der neurotrofiske effekter av SOM175 observeres, blir .dets mulige rolle i regeneringen av aksotomiserte sensoriske neuroner, sympatiske neuroner og motoneuroner' analysert ved hjelp av metodene etter Otto et al (1989), Yip et al (1984) og Hendry et al (1976).

Virkninger av SOM175 på CNS neuroner

Evnen til SOM175 til å fremme overlevelse av sentralnerve-systemneuroner er analysert som beskrevet i Hagg et al

(1992), Williams et al (1986), Hefti (1986) og Kromer (1987).

Sårheling

Evnen til SOM175 til å understøtte sårheling er testet i den mest klinisk relevante tilgjengelige modell som beskrevet i Schilling et al (1959) og benyttet av Hunt et al (1967).

Heznopoe s e sy s terne t

En rekke in vitro og in vivo analyser på spesifikke celle-populasjoner i hemopoesesystemet er tilgjengelige og er angitt i det etterfølgende:

Stamceller

Murin

En rekke nye in vitro murin-ståmcelleanalyser er blitt utviklet ved anvendelse av FACS-rensede celler:

(a) Repopulasjons-stamceller

Disse celler er i stand til repopulasjon av benmargen i letalt bestrålt mus, og har Lin", Rh<hi>, Ly-6A/E<+>, c-kit<+ >fenotypen. Testsubstansen er testet på disse celler enten alene eller ved ko-inkubasjon med multiple faktorer, etterfulgt av måling av cellulær proliferasjon ved <3>H tymi-dininnlemmelse.

(b) Stamceller fra sent utviklingstrinn

Disse er celler med forholdsmessig liten benmargs-repopulasjonsevne men kan danne D13 CFU-S. Disse celler har Lin", Rh<hl>, Ly-6A/E<+>, c-kit<+> fenotypen. Testsubstansen er inkubert med disse celler i en viss tid, injisert inn i letalt bestrålte mottakere og antallet D13 miltkolonier telles.

(c) Progenitor-anrikede celler

Disse er celler som responderer in vitro på enkelt-vekst-faktorer, og har Lin", Rhhi, Ly-6A/E<+>, c-kit<+> fenotypen. Denne analyse vil vise om SOM175 kan virke direkte på hemopoese-progenitorceller. Testsubstansen inkuberes med disse celler i agarkulturer, og antallet kolonier telles etter 7-14 døgn.

Aterosklerose

Glatte muskelceller spiller en avgjørende rolle i utviklingen eller initieringen av aterosklerose, som krever en forandring i deres fenotype fra en kontraktil til en syntetisk tilstand. Makrofager, endotelceller. T-lymfocytter og plater spiller en rolle i utviklingen av. aterosklerotisk plakk ved å innvirke på vekst og fenotypiske modulasjoner av glatte muskelceller. En in vitro analyse som måler den proliferative rate og fenotypiske modulasjoner av glatte muskelceller i et multicellu-lært miljø anvendes til å fastslå effekten av S0M175 på glatte muskelceller. Systemet anvender et modifisert Rosékammer hvori forskjellige celletyper er utsådd på motsatte dekk-glass.

Effekter av SOM175 på ben

Evnen til SOM175 til å regulere proliferasjon av osteoblaster bestemmes som beskrevet i Lowe et al (1991),. Enhver effekt på benresorpsjon bestemmes som beskrevet i Lowe et al (1991). Effekter på osteoblastmigrering og forandringer i intracellulære molekyler (f.eks. cAMP akkumulering, nivåer av alkalisk fosfatase) analyseres som beskrevet i Midy et al

(1994).

Effekter på skjelettmuskelceller

Effekter av SOM175 på proliferasjon av myoblaster og utvikling av muskelfibre kan bestemmes som beskrevet av Ewton et. al (1980) og av Gospodarowicz et al (1976) .

EKSEMPEL 5

KLONING AV MURIN SOM175 DNA

Isolering av cDNA'er

Murin SOM175 (mSOM175) kloner ble selektert fra et lambda Zap nyfødt helhjerne cDNA bibliotek (Stratagene). Primær fag fra høydensitetsfiltere (5 x IO<4> pfu/plate) ble identifisert ved hybridisering med en 682bp <32>P-merket probe dannet ved PCR fra en hVRF cDNA (pSOM175) som beskrevet over. Hybridisering og stringente vaskinger av nylonmembraner (Hybond-N) ble gjen-nomført ved 65°C under betingelser beskrevet av Church og Gilbert (1984). Positive plakk ble plukket, renset og skåret ut in vivo til å gi bakteriekolonier som inneholder cDNA kloner i pBluescript SK-.

Isolering av genomiske kloner

Genomiske kloner ble isolert fra et musestamme SV/129 bibliotek klonet i lambda Fix II vektoren (Stratagene). Høydensitetsfiltere (5 x IO<4> pfu/filter) ble screenet med en 563 bp <32>P-merket probe dannet ved PCR amplifikasjon av nukleotid 233-798 regionen av mSOM175 cDNA (se fig. 9). Positive kloner ble fjernet og re-screenet med filtere inneholdende 400-8 00 pfu. Stor-skala fagpreparater ble fremstilt ved anvendelse av QIAGEN lambda kit eller ved ZnCl2 rensing (Santos, 1991).

Nukleotidsekvensering og analyse

cDNA'er ble sekvensert på begge tråder ved anvendelse av en rekke vektor-baserte og interne primere med Applied Bio-systems Incorporated (ABI) fargeterminator-sekvenseringskit i henhold til produsentens spesifikasjoner. Sekvenser ble analysert på en ABI modell 373A automatisert DNA sekvensator. Peptidhomologioppstillinger ble utført ved anvendelse av programmet BESTFIT (GCG, Wisconsin).

Identifikasjon av intron/exon grenser

Identifikasjon av exongrenser og flankeregioner ble gjennom-ført ved anvendelse av PCR med mus genomisk DNA eller mSOM175 genomisk lambda kloner som templater. Primerne anvendt i PCR til å identifisere introner ble avledet fra hS0M175 sekvensen og for å ta hensyn til potensielle human-mus. sekvens - mismatcher ble annealingtempératurer 5-10°C under den esti-merte Tm anvendt. Alle PCR-produkter ble størrelsesbestemt ved agarosegelelektroforese og gelrenset ved anvendelse av "QIAquick" spinnkolonner (Qiagen) og intron/exon grenser ble sekvensert direkte fra disse produkter. I tillegg bie enkelte spleiseforbindelser sekvensert fra subklonede genomiske fragmenter av mSOM175. Intron/exon grenser ble. identifisert ved å sammenligne cDNA og genomiske DNA sekvenser.

Northern analyse

Total cellulær RNA ble fremstilt fra et panel av friskt vev fra normal voksen mus (hjerne, nyre, lever, muskel) ved anvendelse av metoden etter Chomczynski og Sacchi (1987).

2 0 [ ig av total RNA ble underkastet elektroforese, overført

til en nylonmembran (Hybond N, Amersham) og hybridisert under standardbetingelser (Church & Gilbert, 1984). Filtere ble vasket ved 65°C i 0,1 x SSC (20 x SSC er 3M NaCl/0,3M trinatriumcitrat), 0,1 % SDS og eksponert for røntgenfilm med forsterkningsskjermer ved -70°C i 1-3 døgn.

Karakterisering av mSOMl75 cDNA'er

Murine SOM175 homologer ble isolert ved å screene et murint cDNA bibliotek med et hSOM175 cDNA klon. Fem kloner med størrelse som varierer fra 0,8-1,5 kb ble oppnådd og sekvensert. cDNA-sekvensene ble kompilert til å gi en full-lengde 1041 bp cDNA sekvens som dekker hele den åpne leseramme (621 bp eller 564 bp avhengig av spleiseformen, se det etterfølgende) og 3' UTR (379 bp), så vel som 163 bp av 5' UTR (fig. 9).

Det forutsagte initieringskodon matchet posisjonen til start-kodonet i hSOM175. Et annet ute av ramme ATG ble lokalisert i posisjon -47 og to termineringskodoner ble observert opp-strøms (henholdsvis posisjoner -9 og -33) og i-rammen med det putative initieringskodon.

Det forutsagte N-terminale signalpeptid av hSOM175 viser seg å være tilstede i mSOM175 med 81 % identitet (17/21 aminosyrer) . Peptidspalting innen mSOM175 forventes til å skje etter rest 21 (fig. 10). Disse data foreslår at moden mSOM175 utskilles og vil derfor om mulig kunne virke som en vekstfaktor.

Som med hSOM175 ble to åpne leserammer (ORF'er) detektert i cDNA'er isolert ved bibliotekscreening. Fire av fem kloner ble funnet til alternativt å være spleiset og manglet et 101 bp fragment homologt til exon 6 av hSOM175. De forutsagte peptidsekvenser av de to isoformer av mSOM175 ble bestemt og oppstilt med de tilsvarende humane isoformer (fig. 10) .

Budbringeren som koder for mSOM175186 inneholder et 621 bp ORF med kodesekvenser som terminerer i posisjon +622, mot enden av exon 7 (fig. 9). Den mindre budbringer som koder for mSOM175167 terminerer i realiteten nedstrøms av +622 TAG setet på grunn av et rammeskift resulterende fra utspleising av 101 bp exon 6 og introduksjon av et stoppkodon (TGA) i posisjon +666, nær begynnelsen av exon 8 (fig. 9).

mSOM175186 proteinet har en sterk homologi med aminodelene" og de sentrale deler av VEGF mens karboksylenden er fullstendig divergent og er alaninrik. mSOM175167 har disse likheter og opprettholder også homologi med mVEGF helt til C-terminålen (fig. 11) . Den totale homologi for mSOM17<5>167 til hSOM175167 var henholdsvis 85 % identitet og 92 % likhet (fig. 10). Likeledes var homologien mellom mSOM175167 og mVEGF (Breier et al, 1992) henholdsvis 49 % identitet og 71 % konservativ aminosyresubstitusjon (fig. 11).

Et anerkjent vertebrat-polyadenyleringssignal (AATAAA)(Birnstiel et al, 1986) var ikke tilstede i mSOM175 cDNA, men den nær matchende sekvens GATAAA er imidlertid tilstede i lignende posisjoner i både mus og humane SOM175 cDNA'er (fig.

9). I motsetning til hSOM175 ble mSOM175 funnet til å inneholde en AC dinukleotidrepetisjon i den ekstreme 3' enden av 3' UTR (nukleotidposisjoner 998 til 1011, fig. 9). Polymor-fisme av denne repetisjonsregion ble observert.mellom noen av mSOM175 cDNA'ene, med antallet dinukleotider varierende fra 7 til 11.

Genomisk karakterisering av mSOMl75

Intron/exon grenser (tabell 3) ble kartlagt ved anvendelse av primere som flankerte sekvenser homologe med de tilsvarende hSOM175 grenser. Introner I, III, IV og VI av mSOM175 (tabell 3, fig. 12) var mindre enn de hSOM175 intervenerende sekvenser. Den komplette genomiske sekvens ble kompilert fra 5' UTR av mSOM175 gjennom til intron VI, den største inter-veneringsregion (2,2 kb), ved sekvensering av amplifiserte introner og klonede genomiske deler av mSOM175. Der var kun en stor forskjell i genomisk struktur mellom mSOM175 og hSOM175 og det var at exon 7/intron VI grensen av mSOM175 var lokalisert 10 bp videre nedstrøms i forhold til cDNA-sekvensen, følgelig er exon 7 i mS0M175 10 bp lengre enn det tilsvarende exon i hSOM175.

Exoner 6 og 7 er nærliggende i mSOM175, som funnet til å forekomme i den humane homolog. Den sterke sekvenshomologi mellom exon 6 av mSOM175 og hSOM175 (fig. 10) foreslår at denne sekvens ikke er en bibeholdt intronisk sekvens men heller koder for en funksjonell del av SOM175186 isoformen.

Generell intron/exon struktur er beholdt mellom de forskjellige medlemmer av VEGF-genfamilien (VEGF, PIGF, hSOM175) og det er derfor ikke overraskende at den totale genomiske organisering av mSOMl75-genet er svært lik disse gener (fig. 12) .

Tidligere sammenlignende kartleggingsstudier har vist at regionen som omgir det humane multippel endokrin neoplasi type 1 sykdomslocus på kromosom llql3 er synten med det proksimale segment av musekromosom 19 (Rochelle et al, 1992). Siden oppfinnerne har kartlagt hSOM175-genet til innenfor 1 kb av det humane MEN1 locus (se over) er det mest sannsynlig at det murine SOM175 gen "maps" nær centrdmeren av kromosomet 1.9 •

Ekspresjonsstudier av mSOM175

Northern analyse av RNA fra vev fra voksne mus (muskel, hjerte, lunge og lever) viste at ekspresjon synes å være ubikvitær og forekommer primært som et hovedbånd med størrel-se omtrent 1,3 kb (fig. 14). Dette er noe forskjellig fra det mønster som observeres for hSOM175 hvori to hovedbånd på 2,0 og 5,5 kb er blitt identifisert i alle de undersøkte vev. Den 1,3 kb murine budbringer svarer antagelig til de kortere av de humane transkripter og størrelsesvariasjonen derav skyldes mest sannsynlig en forskjell i lengden av de respektive 5' UTR'er.

EKSEMPEL 6

EKSPRESJON AV MURIN S0M175 I PRE- 06 POSTNATAL MUS

Dyr

Tidsbestemte gravide (n=4) og unge fullt utviklede (n=2) mus (C57 innavlet stamme, ALAB, Sverige) ble avlivet med karbon-dioksyd, og de relevante vev ble tatt ut og frosset på en chuck. Vev ble holdt ved -70°C inntil videre bruk. To svangerskapsmessige aldre ble anvendt i dette forsøk, embryonisk dag 8 (E8), 14 og E17.

In situ hybridiseringshistokjemi

In situ hybridisering ble utført som beskrevet tidligere (Dagerlind et al, 1992). Kort fortalt ble tverrgående snitt (14 /im) kuttet i en kryostat (Microm, Tyskland) , tint på Probe-On preparatglass (Fisher Scientific, USA) og lagret i sorte forseglede bokser ved -70°C inntil anvendelse. Sekvensen til de syntetiske 42-mer oligonukleotider komplementære til mRNA som koder for mS0M175 var

ACCACCACCCTCCCTGGGCTGGCATGTGGCACGTGCATAAACG [SEQ ID NO:11]

(komplementær til nt 120-161) og

AGTTGTTTGACCACATTGCCCATGAGTTCCATGCTCAGAGGC [SEQ ID NO:12]

(komplementær til nt 162-2 03). For å detektere de to alternative spleisef ormer ble o.ligonukleotid

GATCCTGGGGCTGGAGTGGGATGGATGATGTCAGCTGG [SEQ ID NO:13]

(komplementær til nt xxx-xxx) og

GCGGGCAGAGGATCCTGGGGCTGTCTGGCCTCACAGCACT [SEQ ID NO:14]

anvendt. Probene ble merket i 3'-enden med deoksyadenosin-alfa[tio]trifosfat [<35>S] (NEN, USA) ved anvendelse av terminal deoksynukleotidyltransferase (IBI, USA) til en spesifikk aktivitet av 7-10 x IO<8> cpm//xg og hybridisert til snittene uten forbehandling i 16-18 timer ved 42°C. Hybridiserings- ■ blandingen inneholdt: 50 % volum/volum formamid, 4 x SSC

(1 x SSC = 0,15 M NaCl og 0,015 M natriumcitrat), 1 x Denhardts oppløsning (0,02 % av hver av polyvinyl-pyrrolidon, BSA og Ficoll), 1 % volum/volum sarkosyl (N-lauroylsarkosin, Sigma), 0,02 M fosfatbuffer (pH 7,0), 10 % vekt/volum dekstransulfat (Pharmacia, Sverige) , 250 /Ag/ml gjær tRNA (Sigma) , 50 0 pig/ml skjærbehandlet og varmedenaturert lakse-spermie DNA (Sigma) og 200 mM ditiotreitol (DDT, LKB, Sverige). I kontrollsnitt ble spesifisiteten av begge prober undersøkt ved å tilsette et 2 0-ganger overskudd av umerket probe til hybridiseringsblandingen. I tillegg ble nærliggende snitt hybridisert med en probe som ikke er relatert til dette studium som ga et annet ekspresjonsmønster. Etter hybridisering ble snittene vasket flere ganger i 1 x SSC ved 55°C, dehydratisert i etanol og dyppet i NTB2 nukleær-opp-sporingsemulsjon (Kodak, USA). Etter 3-5 uker ble snittene utviklet i D-19 utvikler (Kodak, USA) og dekket med dekk-glass. I enkelte tilfeller ble snittene utsatt for en autoradiografifilm (Beta-max autoradiografifilm Amersham Ltd., UK) før emulsjonsdypping.

De fire forskjellige prober ga identiske hybridiserings-mønstre i alle de undersøkte vev. Mus SOM175 ekspresjon ble detektert allerede i E8-embryoet, hvori positivt signal ble målt over strukturer som mest sannsynlig svarer til nevro-nalkanalen. I sagittalsnittene av E14 museembryo var det sterkeste hybridiseringssignal tilstede over hjertet og i nervesystemet, særlig cerebral cortex (fig. 14A) . Et lavere ekspresjonsnivå var tilstede i alle andre vev. På en senere gestasjonsalder, E17, ble et høyt mSOM175 mRNA signal begrenset til hjertet og brunt fettvev i ryggen og rundt halsen (fig. 14B). Klart positive hybridiseringssignaler var tilstede i den grå substans av ryggmargen og i tungen (fig. 14B). • Ekspresjon i den cerebrale cortex var klart redusert sammenlignet med dag 14. Den svake bakgrunnsekspresjon som man ser i E14 embryoet i for eksempel muskel, hadde avtatt ved denne gestasjonsalder. Et sterkt mSOM175 mRNA hybridiseringssignal var kun tilstede over hjertet og i det brune fett i de unge fullt utviklede mus (fig. 14C). Signalet over hjertet var jevnt fordelt over hele ventrikkelveggen, inkluderende de papillære muskler (fig. 14D). I snitt av hjerte-vev hybridisert med et overskudd av kald probe, ble ingen spesifikk merking utover bakgrunnssignal målt (fig. 14E).

Bortsett fra hjertet, var mSOM175 mRNA signal tilstede over bestemte vev på utsiden av brysthulen som morfologisk lignet brunt fett. Dette ble verifisert med Sudan-sort motfarging, som viste en sterk farging i de samme områder (fig. 15A og 15B). I tverrsnitt fra ryggmargen fra fullt utviklet mus ga mSOM175-probene et nevronalt fargingsmønster over den grå substans (fig. 15C). Motfarging med toluidin (fig. 15D) viste at motoneuroner i ventralhornet (fig. 15C og 15D), interneuroner (fig. 15C) i den dypere del av dorsalhornet og rundt sentralkanalen var i stor grad positive for mSOM175 mRNA.

EKSEMPEL 7

EFFEKTER AV VEGF OG SOM175 PROTEINER PÅ SENSORISKE NEURONER FRA KYLLING

Effektene av VEGF og SOM175 proteiner på .embryoniske dag 8 sensoriske neuroner fra kylling ble bestemt ved anvendelse av metoden etter Nurcombe et al (1992). Den nevronale analyse ble avlest etter 48 timer ved anvendelse av 2 000 celler pr. analysebrønn. Resultatene ble oppnådd ved anvendelse av <3>H-tymidintellinger. Prosentandel overlevelse av neuroner, neuritt-utvekst og gjennomsnittlig neurittlengde i /xm ble bestemt ved anvendelse av NGF som positiv kontroll og forskjellige konsentrasjoner av VEGF, VEGF i nærvær av heparin og VEGF i nærvær av heparin og 5 /xm 51 -flurouracil (5FU). 5FU dreper gliaceller.

Resultatene er vist i fig. 16. Resultatene viser at VEGF er effektiv i å fremme nevronal overlevelse men at dette krever tilstedeværelse av gliaceller. Fig. 17 viser resultatene av effekten av VEGF og S0M175 på tre typer kyllingglia. Glia som ble testet var CNS glia,. perifer glia og CNS oligodendrocytter. Heparin ble anvendt som 10 iig/ml i alle kulturer og analysen ble avlest etter 24 timer. Resultatene ble målt i <3>H-tymidintellinger ved anvendelse av 2 0 00 celler pr. brønn.

Resultatene viser at for sentrale og perifere neuroner fra kylling, var astroglia markert stimulert til proliferasjon ved SOM175 i nærvær av heparin men at kylling-oligodendrocytter viste neglisjerbar økning i delingshyppighet.

EKSEMPEL 8

EFFEKTER AV SOM175 PROTEINER PÅ PRIMERE OG SENTRALE NEURONER AV MOS

Resultatene i eksempel 7 viser at VEGF isoform hadde en effekt på primære og sentrale neuroner fra kylling gjennom astrogliacellene. Lignende forsøk ble gjentatt i museceller.

Dyrkingsbetingelser

Nerveceller og gliaceller for alle in vitro forsøk ble preparert og dyrket i henhold til teknikkene beskrevet i "Methods in Neurosciences (vol. 2): Cell Culture" Ed. P.M. Conn, Academic Press, San Diego, 1990, s. 33-46 for astrogliaceller, s. 56-74 for oligodendrogliaceller, og s. 87-102 for sentralneuroner.

Celler ble utplatet på 24-brønns dyrkingsclustere (Nunc) belagt med poly-L-ornitin (0,1 mg/ml, lt) i en densitet på 2000 celler/brønn. Etter 48 timers dyrking ble neuroner talt i brønnene under lys. med invertert fase ved anvendelse av vel etablerte teknikker (Maruta et al, 1993) og gliaceller ble bestemt med [<3>H]tymidinopptak til monitorcelledelingsrater som under. Heparin (10 ixg/ml, lavmolekylvektfraksjon, Sigma Chemical Corp.) var tilstede hele tiden i dyrkingsmediet unn-tatt hvor angitt. De nevronale kulturene ble supplert med 5 mM 5-fluor-2-deoksyuridin (Sigma) for å undertrykke bak-grunns -gl iavekst .

<3>H-tymidininnlemmelsesanalyse for gliacelleproliferasjon Cellene ble pulset i 14 timer med <3>H-tymidin (spesifikk aktivitet 103 /iCi//ig) fra en stamkonsentrasjon på 0,1 mCi/ml 1 standard medium, noe som gir et endelig inkubasjonsvolum av 2 0 fil/brønn. Innholdene i brønnene ble høstet og absorbert på nitrocellulosepapir (Titertek, Flow). Gjenværende adhe-rente celler ble fjernet ved inkubasjon med trypsin/versen (CSL Limited, Victoria, Australia) i 5 min. Denne prosedyre ble gjennomført to ganger. Nitrocelluloseplatene ble vasket i en standard Titertek høsteanordning (Flow) ved anvendelse av først destillert vann og deretter metanol. Nitrocelluloseplatene ble tørket, seintillasjonsfluid (inneholdende 5 % volum/volum Triton-X) ble tilsatt og platene ble telt på en scintillasjonsteller.

Størst aktivitet ble sett med preparater av SOM175 manglende exon 6 (SOMAX6) på astrogliacellekulturer fra mus, hvor der var en signifikant stimulans til deres proliferasjon når gitt sammen med heparin (fig. 16). Liten stimulans ble gitt til proliferasjonen av oligodendrogliaceller (fig. 17), og svært liten merkbar potensiering av overlevelsesrespons hos isolerte forhjerneneuroner (fig. 18). Standard avvik for alle tre kurver i hvert punkt var mindre enn 8 %.

Levedyktigheten til neuroner kan opprettholdes ved å fremme gliacelleproliferasjon. Videre er SOMAX6 en god fremmer av astrogliaproliferasjon og kan uttrykkes sammen med dannelsen av astroglia-"endfeet" på sentralnervesystem-endotelceller.

LITTERATURFORTEGNELSE

Adams MD, Soares MB. Kerlavage AR, Fields C, Venter JC, (1993) Nature Genet.

4, 373-380.

Birnstiel ML, Busslinger M and Strub K (1985) Cell 41, 349-359.

Breier G, Albrecht U, Stener S and Risau W (1992) Development 114, 521-532.

Chomczynski P and Sacchi N (1987) Analyt. Biochem. 162, 156-159.

Church G and Gilbert W (1984) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 18, 1991-1995.

Dagerlind A, Friberg K, Bean AJ and Hokfelt T (1992) Histochemistry 98, 39-49.

Dissen GA, Låra HE, Fabrenbach WH, Costa ME, Ojeda SR, (1994) Endocrinology-134, 1146-1154.

Drinkwater CC, Barker PA, Suter U and Shooter EM (1993) J. Biol. Chem.- 268, 23202-23207.

Drinkwater CC, Suter U, Angst C and Shooter EM (1991) Proe. Roy. Soc. Lond.

( Series B), 246, 307-313.

Ewton DZ & Florini JR (1980) Endocrinology, 106: 577-583.

Ferrara N & Hcnzel WJ (1989) Biochem. Biophys. Res. Commun. 161, 851-858.

Folkman J & Shing Y (1992) J. Biol. Chem. 267, 10931-10934.

Gospodarowicz D, Abraham JA & Schilling J (1989) Proe. Nati Acad Sei USA 86,

7311-7315.

Gospodarowicz D, Weseman J, Morgan JS & Lindstrom J (1976) J. Cell Biol., 70: 395-405.

Hagg t, Quon D, Higaki J & Varon S (1992) Neuron, 8, 145-158.

Hefti S (1986) J. Neurosci, 6, 2155-2162.

Hendry IA & Campbell J (1976) J. NeurocytoL, 5, 351-360.

Hendry IA, Murphy M, Hilton DJ, Nicola NA & Bartlett PF (1992) J. Neurosci. 12, 3427-3434.

Hunt et al., (1967) Am. 1 Surgery, 114: 302-307.

Koch AE, Harlow LA, Haines GK, Amento EP, Unemoti EN, Wong WL, Pope RM, Ferrara N, (1994) J. Immunol. 152, 4149-4156.

Kromer AF (1987) Science, 235, 214-216.

Larsson C, Weber G, Kvanta E, Lewis C, Janson M, Jones C, Glaser T, Evans G,

Nordenskjold M, (1992) Hum. Genet. 89, 187-193.

02US Leung DW. Cachianes G, Kuang W-J, Goeddel DV & Ferrara. N (1989) Science 246:1306-1309.

Lowe C, Comish J, Callon K, Martin TJ & Reid IR (1991) J. Bone Mineral Res., 6,

1277-1283.

Lowe C, Cornish J, Martin TJ & Reid IR (1991) Calcif. Tissue Int., 49, 394-397.

Martinou JC, Martinou I & Kato AC (1992) Neuron, 8, 737-744.

Marma et al (1993) Growth Factors 8: 119-134.'

Midy V & Plouet J (1994) Biochem. Biophys. Res. Commun.. 199: 380-386.

Miles AA & Miles EM .(1952) J. Physiol. ( Lond) 118:228-257.

Montesano R, Vassalli JD, Baird A, Guillemin R & Orci, L (1986) Proe. Nati. Acad.

Sei USA, 83, 7297-7301.

Nurcombe et al (1992) Development 116: 1 175-1 183.

Otto D., Frotscher M & Unsicker K (1989) J. Neurosci. Res., 22, 83-91.

Pepper MS, Ferrara N, Orci L, Montesano R. (1991) Biochem. Biophys. Res. Commun.

181, 902-906).

Rochell JM, Watson ML, Oakey RJ and Seldin MF (1992) Genomics 14, 26-31.

Roth S & Weston J (1967) Proe. Nati. Acad. Sei USA, 58: 974-980.

Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual -

2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.

Santos MA (1991) Nucleic Acids Res. 19, 5442.

Schilling et al., (1959) Surgery, 46: 702-710.

Senger DR, Van De Water L, Brown LF, Nagy JA, Yeo KT, Yeo TK, Berse B,

Jackman RW, Dvorak AM, Dvorak HF (1993) Cancer Netastasis Rev. 12, 303-324.

Sharkey AM, Chamock-Jones DS, Boocock CA, Brown KD, Smith SK, (1993) J.

Reprod. Fertil. 99. 609-615.

Sunderkotter C, Steinbrink K, Goebeler M, Bhardway R, Sorg E, (1993) J. Leukocyt,

Biol. 55, 410-422.

Suter U, Angst C, Tien C-L, Drinkwater CC, Lindsay RM and Shooter EM (1992) J. Neurosci., 12, 306-318.

Tischer E, Mitchell R, Hartman T, Silva M, Gospodarowicz D, Fiddes JC, Abraham J (1991) y. Biol. Chem. 266, 11947-11954.

Williams LR, Varon S, Peterson GM, Wictorin K, Fischer W, Bjorklund A & Gage FH

(1986) Proe. Nati. Acad Sei. USA 83, '9231-9235..

Yan Z, Weich HA, Bernart W, Breckwoldt M, Neulen J, (1993) J. Clin. Endocrinol.

Metab. 77, 1723-1725.

Yip NK, Rich KM, Lampe PA & Johnson EM Jr (1984) J. Neurosci.. 4, 2986-2992.

Claims

1. Isolert polypeptid, karakterisert ved at det utviser i det minste en av de etterfølgende egenskaper: (i) en evne til å indusere proliferasjon av vaskulære endotelceller; (ii) en evne til å interagere med flt- l/ flk- 1 familien av reseptorer; og/eller (iii) en evne til å indusere cellemigrering, celleoverlevelse og/eller en økning i intracellulære nivåer av alkalisk fosfatase; hvor nevnte polypeptid omfatter: a. en aminosyresekvens som kodet for av nukleotidsekvensen som angitt i SEQ ID NO:3, eller en nukleotidsekvens som hybridiserer over den fulle lengde av SEQ ID NO:3 eller dens komplementære form under høystringensbetingelser av 0,1-1 x SSC/0,1% vekt/vekt SDS ved 60°C i 1-3 timer; eller b. en aminosyresekvens som angitt i SEQ ID NO:4 eller en trunkert form av nevnte polypeptid som utviser minst en av egenskapene (i)-(iii).

2. Isolert polypeptid ifølge krav 1, som omfatter en aminosyresekvens som kodet for av nukleotidsekvensen som angitt i SEQ ID N0:3, SEQ ID NO:7 eller SEQ ID NO:9.

3. Isolert polypeptid ifølge krav 1, som omfatter en aminosyresekvens som angitt i SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:8 eller SEQ ID NO:10.

4. Isolert polypeptid som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 3 hvor nevnte polypeptid er av human opprinnelse.

5. Isolert polypeptid som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 4 hvor nevnte polypeptid har kapasitet til å indusere astroglia proliferasjon.

6. Isolert nukleinsyremolekyl, karakterisert ved at det koder for poly-peptider som angitt i ett eller flere av de foregående krav.

7. Isolert nukleinsyremolekyl ifølge krav 6 som omfatter nukleotidsekvensen som angitt i SEQ ID NO: 3', SEQ ID NO: 7 eller SEQ ID NO:9.

8. Isolert antistoff, karakterisert ved at det er et antistoff mot polypeptidet som kodet for av nukleinsyremolekylet ifølge krav 6 eller 7.

9. Isolert antistoff, karakterisert ved at det er et antistoff mot polypeptidet ifølge ett eller flere av kravene 1 til 5.

10. Fremgangsmåte for å fremstille et polypeptid ifølge ett eller flere av kravene 1 til 5, karakterisert ved at den omfatter å uttrykke et nukleinsyremolekyl som koder for et polypeptid ifølge ett eller flere av kravene 1 til 5 i en passende vert dyrket under betingelser som er effektive for syntese av nevnte polypeptid.

11. Antisensemolekyl, karakterisert ved at det hybridiserer over den fulle lengde av et nukleinsyremolekyl ifølge krav 6 eller 7 eller dets komplement.

12. Preparat, karakterisert ved at det omfatter et polypeptid ifølge ett eller flere av kravene 1 til 5 og en eller flere farmasøytisk aksepterbare bærere og/eller fortynningsmidler.

13. Anvendelse av et polypeptid som utviser minst en av de etterfølgende egenskaper: (i) en evne til å indusere proliferasjon av vaskulære endotelceller; (ii) en evne til å interagere med flt- l/ flk- 1 familien av reseptorer; og/eller (iii) en evne til å indusere cellemigrering, celleoverlevelse og/eller en økning i intracellulære nivåer av alkalisk fosfatase; hvor nevnte polypeptid omfatter: a. en aminosyresekvens som kodet for av nukleotidsekvensen som angitt i SEQ ID N0:1, 3, 5, 7 eller 9 eller en nukleotidsekvens i stand til å hybridisere til SEQ ID N0:1, 3, 5, 7 eller 9 eller dens komplementære form under høystringensbetingelser av 0,1-1 x SSC/0,1% vekt/vekt SDS ved 60°C i 1-3 timer; eller b. en aminosyresekvens som angitt i SEQ ID NO:2, 4, 6, 8 eller 10 eller en aminosyresekvens med minst 70% likhet dermed; eller en trunkert form av nevnte polypeptid, for fremstilling av et medikament for å indusere astroglia proliferasjon i et pattedyr.

14. Anvendelse ifølge krav 13 hvor polypeptidet omfatter en aminosyresekvens som kodet for av nukleotidsekvensen som angitt i SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:7 eller SEQ ID NO:9.

15. Anvendelse ifølge krav 13 hvor polypeptidet omfatter en aminosyresekvens som angitt i SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:8 eller SEQ ID NO:10.

16. Anvendelse ifølge ett eller flere av kravene 13 til 15 hvor nevnte polypeptid eller nukleotidsekvensen som koder for det er av human opprinnelse.

17. Anvendelse av et nukleinsyremolekyl som koder for et polypeptid som definert i ett eller flere av kravene 13 til 16 for fremstilling av et medikament for å indusere astroglia proliferasjon i et pattedyr.

18. Vertcelle, karakterisert ved at den omfatter et nukleinsyremolekyl ifølge krav 6 eller 7. T Q 36 19 • Vektor, <3>S