JP2001037493A

JP2001037493A - 新規成長因子およびそれをコードする遺伝子配列

Info

Publication number: JP2001037493A
Application number: JP2000178462A
Authority: JP
Inventors: Nicholas Kim Hayward; ニコラス・キム・ヘイワード; Gunther Weber; ギュンター・ヴェバー; Sean Grimmond; ショーン・グリモンド; Magnus Nordenskjold; マグナス・ノルデンスチョールド; Catharina Larsson; カタリナ・ラーソン
Original assignee: Amrad Operations Pty Ltd
Current assignee: CSL IP Investments Pty Ltd
Priority date: 1995-03-02
Filing date: 2000-06-14
Publication date: 2001-02-13
Anticipated expiration: 2016-02-22
Also published as: HUP9800377A3; KR19980702702A; WO1996027007A1; ATE252600T1; HK1002963A1; BR9607628A; HU223438B1; ES2206558T3; NO974035L; FI973571A0; EP0815221A1; EP0815221B1; HUP9800377A1; EP0815221A4; CA2214439A1; DE69630442T2; DE69630442D1; FI120153B; NZ337634A; NO320839B1

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】本発明は一般に血管内皮成長因子様特性を有
する単離分子およびそれをコードする遺伝子配列に関す
る。【解決手段】下記の特徴：(i)特定の配列に少なくと
も約１５％の類似性を有するが、少なくとも約５％の非
類似性を有し；(ii)少なくとも１つの血管内皮成長因子
(ＶＥＧＦ)と共通の性質を示すを有する生物学的に分離
されたタンパク質を提供する。この分子は脈管構造およ
び／または血管透過性の増大または低減を要する症状
の、ある領域の処置、予防および診断に有用である。本
発明の分子はまた主要かつ中枢ニューロンの有用なエフ
ェクターであり、大グリア細胞の増殖を誘導し得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は一般に血管内皮成長
因子様特性を有する単離分子およびそれをコードする遺
伝子配列に関する。この分子は脈管構造および／または
血管の透過性の増大または低減を要する症状の、ある領
域の処置、予防および診断に有用である。本発明の分子
はまた主要かつ中枢ニューロンの有用なエフェクターで
あり、大グリア細胞の増殖を誘導し得る。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】血管
内皮成長因子（vascular endothorial growth factor、
以下「ＶＥＧＦ」という）は、血管作動性透過因子とも
いうが、内皮組織を特異的に活性化するホモ２量体グリ
コプロテインと共有結合して分泌される（Sengerら、１
９９３年）。ある領域の機能はＶＥＧＦに起因するもの
であり、そのかかわりあいは黄体の形成(Yanら、１９９
３年)および胎盤発達(Sharkeyら、１９９４年)を含む正
常な脈管形成、血管透過性の制御(Sengerら、１９９３
年)、炎症性の脈管形成（Sunderkotterら、１９９４
年）および自家移植（Dissenら、１９９４年）、腫瘍助
長脈管形成（Folkman ＆ Shing、１９９２年）、リュー
マチ性関節炎(Kochら、１９９４年)および糖尿病性網膜
症（Folkman & Shing）などのヒトの疾患である。

【０００３】従って、ＶＥＧＦはＶＥＧＦまたはその作
用に基づく治療、予防および診断の研究の有力な価値あ
る標的となる重要な分子である。また、ＶＥＧＦの代わ
りとしてまたはＶＥＧＦと関連させて使用する同族体ま
たは他の関連分子を確認する必要性が存在する。

【０００４】この発明の糸口となる研究において、発明
者らは多数の内分泌新形成タイプＩ感受性遺伝子（mult
iple endocrine neoplasia type I：ＭＥＮ１）を追及
していた。驚くべきことに、発明者らはＭＥＮ１遺伝子
の候補としては除外していた遺伝子配列が、それにもか
かわらずＶＥＧＦとある類似性を有する新規な成長因子
であることを発見した。さらに、本発明の成長因子は主
要かつ中枢ニューロンのエフェクター分子である。

【０００５】

【課題を解決するための手段】すなわち、本発明の１つ
の態様は、アミノ酸配列：（i）ＳＥＱＩＤＮＯ:２に記載のアミノ酸配列に少な
くとも約１５％類似しており；（ii）ＳＥＱＩＤＮＯ:２に記載のアミノ酸配列に少
なくとも５％非類似であるを含む生物学的に分離されたタンパク様分子を含む。

【０００６】本発明の他の態様は、下記の特徴：（i）ＳＥＱＩＤＮＯ:２に記載のアミノ酸配列の全部
または部分に少なくとも約１５％類似しているが、少な
くとも５％非類似であり；（ii）少なくとも１つＶＥＧＦと共通の性質を示すを含む生物学的に分離されたタンパク様分子を提供す
る。

【０００７】本発明の関連した態様は、下記の特徴：（i）ＳＥＱＩＤＮＯ:２に記載のアミノ酸配列に少な
くとも約１５％の類似性を有するが、少なくとも５％の
非類似性を有し；（ii）下記の特性： (a)血管内皮細胞の増殖を誘導する能力 (b)受容体のflt-1／flk-1族と相互作用する能力 (c)細胞移動、細胞生存および／またはアルカリホスフ
ァターゼの細胞内濃度の増大を誘導する能力を示す；を含む生物学的に分離されたタンパク様分子を
含む。

【０００８】「生物学的に分離された」とは、分子が生
物学的資源から少なくとも１工程の精製が行われたこと
をいう。好ましくは、また、組成物中の他の化合物に対
して組成物が、重量で測定された分子の少なくとも約２
０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらに好ま
しくは約６５％、なお好ましくは少なくとも約８０−９
０％またはそれ以上の活性または他の有用な手段を含む
という生物学的に純粋な意味であることをいう。最も好
ましくは分子が配列的に純粋であることをいう。

【０００９】本明細書中で著者により引用された刊行物
の書誌学的詳細については明細書の末尾にすべて記載し
た。本明細書中のヌクレオチドおよびアミノ酸配列の配
列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）は書誌学的記載のつぎに定
義した。

【００１０】この明細書を通して、特に断らない限り、
「含む（comprise、comprisesまたはcomprising）」と
は当該要素もしくは整数、または要素もしくは整数の群
の包含をいい、他の要素もしくは整数、または要素もし
くは整数の群の排除をいうものではないと理解されるべ
きである。

【００１１】本発明の他の好ましい態様は組換え体の分
子を提供する。

【００１２】

【発明の実施の形態】本発明のこの態様によれば、アミ
ノ酸配列：（i）ＳＥＱＩＤＮＯ:２に記載のアミノ酸配列に少な
くとも約１５％類似しており；（ii）ＳＥＱＩＤＮＯ:２に記載のアミノ酸配列に少
なくとも５％非類似であるを含む組換え分子を提供する。

【００１３】本発明の関連する態様は、下記の特徴：（i）ＳＥＱＩＤＮＯ:２に記載のアミノ酸配列の全部
または部分に少なくとも約１５％の類似性を有するが、
少なくとも５％の非類似性を有し；（ii）少なくとも１つＶＥＧＦと共通の性質を示すを有する組換え分子である。

【００１４】本発明のさらに関連する態様は、下記の特
徴：（i）ＳＥＱＩＤＮＯ:２に記載のアミノ酸配列に少な
くとも約１５％の類似性を有するが、少なくとも約５％
の非類似性を有し；（ii）少なくとも１つの下記の特性： (a)血管内皮細胞の増殖を誘導する能力 (b)受容体のflt-1／flk-1族と相互作用する能力 (c)細胞移動、細胞生存および／またはアルカリホスフ
ァターゼの細胞内濃度の増大を誘導する能力を示す；を有する組換え分子を含む。

【００１５】本発明はまた、ＳＥＱＩＤＮＯ:１に少
なくとも約１５％のアミノ酸類似性を有するが、少なく
とも約５％非類似性であるタンパク質性分子をコードし
ているゲノムまたは部分的ゲノムクローンを含む。

【００１６】ＳＥＱＩＤＮＯ:２に記載のアミノ酸配
列はヒトＶＥＧＦに対応する(以下、「ＶＥＧＦ１６
５」という)。従って、本発明の分子はＶＥＧＦ様であ
るか、またはＶＥＧＦの同族体であるが、ＶＥＧＦのア
ミノ酸配列に類似しているが、同一ではないアミノ酸配
列を含む。本発明はヒトＶＥＧＦ様分子を用いて例示す
ることができるが、これは本発明が、同族体分子であ
り、家畜類（例えば、羊、豚、馬および牛）、愛玩動物
（例えば、犬および猫）および実験動物（例えば、マウ
ス、ラツト、家兎およびモルモット）などの哺乳動物な
らびに鳥類（例えば、家きん類）などの非哺乳動物、魚
および爬虫類などの非哺乳動物からのコード配列を含む
ものとして理解されねばならない。最も好ましい具体例
では、ＶＥＧＦ様分子は、ヒト由来のものであり、染色
体１１ｑ１３に位置する遺伝子によってコードされてい
る。本発明は従って、当該ＶＥＧＦ様分子をコードする
ゲノム配列またはその部分に及ぶ。

【００１７】好ましくは、類似性のパーセントが、ＳＥ
ＱＩＤＮＯ:２に記載のアミノ酸配列の全部または部
分の少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも約
４０％、さらに好ましくは少なくとも約５０％、よりさ
らに好ましくは少なくとも約６０−７０％、なおさらに
好ましくは少なくとも約８０−９５％である。

【００１８】特に好ましい具体例において、本発明のＶ
ＥＧＦ様分子はＳＥＱＩＤＮＯ:４に記載のアミノ酸
配列を含むか、またはそれらの部分、フラグメント、誘
導体または類似体である。特に好ましい類似性は約１９
−２０％および２９−３０％である。ここに引用された
誘導体もまたスプライス変異体を含む。従って、本発明
はＳＯＭ１７５のスプライス変異体に及ぶ。本発明に含
まれるスプライス変異体の例としてはＳＥＱＩＤＮ
Ｏ:６、ＳＥＱＩＤＮＯ:８および／またはＳＥＱＩ
ＤＮＯ:１０の少なくとも１つに実質的に記載されたア
ミノ酸配列を有する変異体、またはそれらの突然変異体
もしくは誘導体、またはそれらのさらなるスプライス変
異体を含むがこれに限られない。

【００１９】他の具体例は、下記の特徴：（i）ＳＥＱＩＤＮＯ:４に実質的に記載されたアミノ
酸配列または、その全部または部分に少なくとも約１５
％の類似性（ただし、上記アミノ酸配列はＳＥＱＩＤ
ＮＯ:２に記載のアミノ酸配列の全部または部分に少な
くとも約５％非類似である）を有し；（ii）少なくとも１つのＶＥＧＦと共通の生物学的性質
を示す；を有する組換分子を提供する。

【００２０】他の具体例は、下記の特徴：（i）ＳＥＱＩＤＮＯ:６に実質的に記載されたアミノ
酸配列または、その全部またはその部分に少なくとも約
１５％の類似性（ただし、上記アミノ酸配列はＳＥＱ
ＩＤＮＯ:２に記載のアミノ酸配列の全部または部分に
少なくとも約５％非類似である）を有し；（ii）少なくとも１つのＶＥＧＦと共通の生物学的性質
を示す；を有する組換分子を提供する。

【００２１】他の具体例は、下記の特徴：（i）ＳＥＱＩＤＮＯ:８に実質的に記載されたアミノ
酸配列または、その全部またはその部分に少なくとも約
１５％の類似性（ただし、上記アミノ酸配列はＳＥＱ
ＩＤＮＯ:２に記載のアミノ酸配列の全部または部分に
少なくとも約５％非類似である）を有し；（ii）少なくとも１つのＶＥＧＦと共通の生物学的性質
を示す；を有する組換分子を提供する。

【００２２】他の具体例は、下記の特徴：（i）ＳＥＱＩＤＮＯ:１０に実質的に記載されたアミ
ノ酸配列または、その全部またはその部分に少なくとも
約１５％の類似性（ただし、上記アミノ酸配列はＳＥＱ
ＩＤＮＯ:２に記載のアミノ酸配列の全部または部分
に少なくとも約５％非類似である）を有し；（ii）少なくとも１つのＶＥＧＦと共通の生物学的性質
を示す；を有する組換分子を提供する。

【００２３】上記のＶＥＧＦの性質は、 (a)血管内皮細胞の増殖を誘導する能力； (b)受容体のflt-1／flk-1族と相互作用する能力； (c)細胞移動、細胞生存および／またはアルカリホスフ
ァターゼの細胞内濃度の増大を誘導する能力；の少なくとも１つを含む。

【００２４】本発明によれば、類似性は好ましくは少な
くとも約４０％、より好ましくは少なくとも約５０％お
よびさらに好ましくは少なくとも約６５％の類似性であ
る。

【００２５】本発明のさらなる態様は、ＳＥＱＩＤＮ
Ｏ:４に記載のアミノ酸配列の一部または、例えば、Ｓ
ＥＱＩＤＮＯ:６、ＳＥＱＩＤＮＯ:８またはＳＥＱ
ＩＤＮＯ:１０に記載のアミノ酸配列などのそのスプ
ライス変異体またはそれらの化学的均等物を含む。本発
明の生物学的に分離されたまたは組換分子は天然にグリ
コシル化されたものであってもよく、またはそれが分離
されまたは合成された細胞により変化する変異グリコシ
ル化形態を含んでいてもよい。例えば、もし、原核細胞
中に組換手段によつて産生されたならば、分子は非グリ
コシル化のものである。分子は全長であってもよく、ま
たは一部を切り取ったかまたは誘導された形態であって
もよい。

【００２６】さらに本発明の他の態様はここに記載のＶ
ＥＧＦ様分子をコードする核酸分子を含む。さらに具体
的には、本発明は、ＳＥＱＩＤＮＯ:３に実質的に記
載されたヌクレオチドの配列、またはその全部または分
子に少なくとも１５％の類似性を有するヌクレオチド配
列、またはＳＥＱＩＤＮＯ:３に記載の逆相補性のヌ
クレオチド配列に低いストリンジェントな条件下でハイ
ブリダイズし得るヌクレオチド配列（ただし、核酸はＳ
ＥＱＩＤＮＯ:３に記載のヌクレオチド配列に少なく
とも約１５％の類似性を有するが、３０％の非類似性を
有する）を提供する。ＳＥＱＩＤＮＯ:３に記載のヌ
クレオチドはまた「ＳＯＭ１７５」ともいう。好ましく
は、非類似の％は約３５％、より好ましくは約３９％お
よびさらに好ましくは約４０−５０％である。

【００２７】ストリンジェントの程度を定義する目的
で、簡略化のために、Sambrook et al(1989)の９.４７
−９.５１頁を引用することができ、ここに引用して明
細書の記載とし、そこに記載の洗浄工程を高いストリン
ジェントな条件とみなす。低いストリンジェントな条件
とは、この明細書では、４−６ＸＳＳＣ／０.１−０.
５％ w/v ＳＤＳ、３７−４５℃にて２−３時間と定義
される。ハイブリダイズにおける核酸の資源および濃度
により異なるが、≧４５℃にて１−４ＸＳＳＣ／０.２
５−０.５％ w/v ＳＤＳ、２−３時間のこの明細書でみ
なされる中程度のストリンジェントな条件、または６０
℃にて０.１−１ＸＳＳＣ／０.１％ w/v ＳＤＳ、１−
３時間のこの明細書でみなされる高いストリンジェント
な条件などの別のストリンジェントな条件を採用するこ
ともできる。

【００２８】さらに、本発明は、ＳＥＱＩＤＮＯ:３
に少なくとも１５％のヌクレオチド配列の相同性を有す
る、上記ＶＥＧＦ様分子をコードする核酸分子を含む。
好ましい相同性の程度は少なくとも約４０％、より好ま
しくは約６０−７０％である。

【００２９】本発明はさらに、ヒトＶＥＧＦのマウス相
同体（ここでは「ｍＶＲＦ」という）を含む。ヒトＶＥ
ＧＦと比較してｍＶＲＦは約８５％の同一性を有し、ヒ
トＶＥＧＦと比較して全コード領域にわたって９２％の
アミノ酸残基の保存率を有する。ｍＶＲＦは、実質的に
図９に記載のヌクレオチド配列を含む核酸分子によって
コードされている。

【００３０】本発明のＶＥＧＦ様分子は、単独またはＶ
ＥＧＦなどの他の分子と組み合わせてある領域の治療お
よび／または診断への適用に有用である。本発明は従っ
て、ＶＥＧＦ様分子、その部分、フラグメント、誘導
体、相同体または類似体とともに１つまたはそれ以上の
医薬的に許容され得る担体または希釈剤を含む医薬組成
物に及ぶ。さらに、本発明はＳＥＱＩＤＮＯ:３に記
載の核酸配列またはそれに少なくとも約１５％、より好
ましくは約４０％、さらに好ましくは少なくとも約６０
−７０％の類似性を有するが、それに少なくとも約３０
％、より好ましくは少なくとも３０％、さらに好ましく
は約３９％の非類似性を有するベクター、およびこれを
含む宿主に及ぶ。さらに、本発明は、ＳＥＱＩＤＮ
Ｏ:３に基づくリボザイムおよびアンチセンス分子なら
びにＶＥＧＦ様分子の中和抗体に及ぶ。このような分子
は、例えば、腫瘍の脈管形成または血管新生に至るＶＥ
ＧＦ様遺伝子の過剰発現の効果を改善するのに有効であ
る。

【００３１】本発明の他の態様は哺乳動物における大グ
リア細胞増殖を誘導する方法であって、上記方法が、下
記の特徴： (i)ＳＥＱＩＤＮＯ:２に記載の配列に少なくとも約１
５％の類似性を有するが、少なくとも５％の非類似性を
有するアミノ酸配列を含み; （ii）少なくとも１つ血管内皮成長因子(ＶＥＧＦ)と共
通の性質を示すを有する組換タンパク質性分子の有効量を上記哺乳動物
に投与し、上記投与が大グリア細胞の増殖を誘導するの
に十分な期間および条件であることを特徴とする方法で
ある。

【００３２】好ましくは、組換タンパク質性分子はＳＥ
ＱＩＤＮＯ:３またはＳＥＱＩＤＮＯ:６に記載のア
ミノ酸配列を含む。

【００３３】本発明のさらなる態様は、哺乳動物におけ
る神経の生存および／または増殖を促進する方法であっ
て、上記方法が下記の特徴： (i)ＳＥＱＩＤＮＯ:２に記載の配列に少なくとも約１
５％の類似性を有するが、少なくとも約５％の非類似性
を有するアミノ酸配列を含み; (ii)少なくとも１つ血管内皮成長因子(ＶＥＧＦ)と共通
の性質を示すを有する組換タンパク質性分子の有効量を上記哺乳動物
に投与し、上記投与が大グリア細胞の増殖を誘導するの
に十分な期間および条件であることを特徴とする方法を
提供する。

【００３４】好ましくは、組換タンパク質性分子はＳＥ
ＱＩＤＮＯ:３またはＳＥＱＩＤＮＯ:６に記載のア
ミノ酸配列を含む。

【００３５】本発明はまた、診断剤として有用なＶＥＧ
Ｆ様分子に対す抗体またはＶＥＧＦ様分子をコードする
遺伝子に対する核酸プローブを含む。

【００３６】本発明はさらに下記の図面および／または
実施例によって説明されるが、これに限定されるもので
はない。

【表１】表１配列番号の要約ＳＥＱＩＤＮＯ：１ＶＥＧＦ１６５のヌクレオチド配列ＳＥＱＩＤＮＯ：２ＶＥＧＦ１６５アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ：３ＳＯＭ１７５(ＶＥＧＦ様分子)のヌクレオチド配列ＳＥＱＩＤＮＯ：４ＳＯＭ１７５のアミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ：５エクソン６を欠くＳＯＭ１７５のヌクレオチド配列ＳＥＱＩＤＮＯ：６エクソン６を欠くＳＯＭ１７５のアミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ：７エクソン６およびエクソン７を欠くＳＯＭ１７５のヌクレオチド配列ＳＥＱＩＤＮＯ：８エクソン６およびエクソン７を欠くＳＯＭ１７５のアミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ：９エクソン４を欠くＳＯＭ１７５のヌクレオチド配列ＳＥＱＩＤＮＯ：１０エクソン４を欠くＳＯＭ１７５のアミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ：１１オリゴヌクレオチド配列ＳＥＱＩＤＮＯ：１２オリゴヌクレオチド配列ＳＥＱＩＤＮＯ：１３オリゴヌクレオチド配列ＳＥＱＩＤＮＯ：１４オリゴヌクレオチド配列

【００３７】

【実施例】実施例１ヒトcＤＮＡクローンヒト胎児脳ライブラリー(λzapII、Ｓtratagene)をコス
ミドＤ１１Ｓ７５０(Ｌarssonら、１９９２)でスクリー
ニングすることにより、最初のＳＯＭ１７５cＤＮＡを
単離した。プラスミドを「インビボ」において切断し
て、一本鎖の１.１kbのcＤＮＡを得た。上述のＳＯＭ１
７５挿入断片をプローブとして使用して、３つの独立し
たＳＯＭ１７５ cＤＮＡクローンもまた、ヒト胎児脾臓
ライブラリー(Ｓtratagene、Ｕnizap)から分離した。３
つのクローンを得た：ＳＯＭ１７５−４Ａ、−５Ａ、お
よび−６Ａ。ＳＯＭ１７５−５Ａは、エクソン４が欠け
ている、選択的スプライシングされたクローン(ＳＯＭ
１７５−e４)である。ライブラリーの製造業者(Ｓtrata
gene)により推奨されるハイブリダイゼーション条件と
ランダム感作ＳＯＭ１７５の挿入断片とを使用して、こ
れらのライブラリーのスクリーニングを行った。２つの
部分的なヒトＳＯＭ１７５ cＤＮＡもまた、λＧＴ１１
ヒト黒色腫セルラインＡ２０５８ライブラリー(Ｃlont
ech)から分離した。ＣhurchおよびＧilbert、１９８４
に記載のハイブリダイゼーション条件を使用して、cＤ
ＮＡライブラリーのスクリーニングを行った。各々の場
合において、ＳＯＭ１７５から誘導されたＰＣＲ産物
(１８ｆ−７００ｒ)のランダム感作により、プローブを
発生させた。

【００３８】マウスcＤＮＡクローン再びヒトＳＯＭ１７５を使用して、マウス新生児全脳c
ＤＮＡライブラリー(Ｕnizap、Ｓtratagene)をスクリー
ニングした。４つの非キメラクローンを分離した：Ｍ１
７５−Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ。クローンは全て部分的なcＤＮ
Ａであって、Ｍ１７５−Ｃは幾つかのイントロンを含ん
でいた。これらのcＤＮＡのうち３つは、エクソン６が
欠けていた。Ｍ１と呼ばれる別のクローンは完全に配列
決定されており、完全なオープンリーディングフレーム
＋５'utrの一部と３'utr全体を含むことが分かった。

【００３９】実施例２ＤＮＡ配列分析 cＤＮＡクローン(ＳＯＭ１７５)の全体配列をまとめ
て、その対応するアミノ酸配列と共に図２に示す。ＭＡ
Ｐプログラム(ＧＣＧ、ウィスコンシン大学)を使用し
て、この配列をオープンリーディングフレームに関して
スクリーニングした。６７２bpの一本鎖のオープンリー
ディングフレームが観察された(図２を参照)。５'非翻
訳化配列は殆ど無いようである(２bp)。３'非翻訳化領
域は、ポリアデニル化シグナルおよびポリＡ尾部が含ま
れることから完全であるらしい。ＢＬＡＳＴアルゴリズ
ムを使用して、データーベース相同性調査を行った(Ｎ
ＣＢＩで操作する、米国)。この分析は、幾つかの哺乳
動物型のＶＥＧＦに対する相同性を明らかにした(図３
を参照)。ＢＥＳＴＦＩＴプログラム(ＧＣＧ、ウィスコ
ンシン大学；図４および５を参照)を使用して、ＳＯＭ
１７５とヒトＶＥＧＦ１６５との間の相同性の程度を測
定した。ＢＥＳＴＦＩＴ分析を使用して、ヌクレオチド
の相同性は６９.７％であると推定され、またタンパク
質の相同性は少なくとも３３.３％の同一性と５２.５％
の保存性と推定された。ヌクレオチド配列に関するＢＬ
ＡＳＴ分析では、ヒト発現配列タグＥＳＴ０６３０２
(Ａdamsら、１９９３)にほぼ完全に対応することが明ら
かになった。

【００４０】これらのデータは、ＳＯＭ１７５がＶＥＧ
Ｆに対して構造上の類似性を有する成長因子をコードす
ることを示す。両方の遺伝子が同じような位置に開始お
よび停止コドンを示し、また不連続の相同性の固まりを
もっている。二量化に関与すると考えられている８つの
システイン全て、さらにはまた多数の他のＶＥＧＦ残基
は保存されている。これらの残基は、システイン−４
７、プロリン−７０、システイン−７２、バリン−７
４、アルギニン−７７、システイン−７８、グリシン−
８０、システイン−８１、システイン−８２、システイ
ン−８９、プロリン−９１、システイン−１２２、およ
びシステイン−１２４であって、図６に示す。ＶＥＧＦ
とＳＯＭ１７５遺伝子産物との間の構造上の保存があれ
ば、それらが両方とも機能上の類似性を有することもま
た可能となる。ＳＯＭ１７５は、ＶＥＧＦと幾つかの性
質を共有するが、それ自身の独自の性質を有するＶＥＧ
Ｆ様分子をコードすることが提唱される。ＶＥＧＦ１６
５のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列を図
１に示す。

【００４１】実施例３Ｃlustal法、ＭegＡlignソフトウェア、ＤＮＡＳＴＡ
Ｒ、ウィスコンシンを使用して、ＶＥＧＦ１６５ファミ
リーとＳＯＭ１７５ファミリー(タンパク質)との間の類
似性および相違性のパーセントを分析した。結果を表
２.１および２.２に示す。選択的にスプライシングされ
た型のＳＯＭ１７５を、ＳＯＭ１７５−e６(エクソン６
が全て欠失している)；ＳＯＭ１７５−e６並びに７(エ
クソン６と７が全て欠失している)；およびＳＯＭ１７
５−e４(エクソン４が全て欠失している)と略す。スプ
ライシングされた型のＳＯＭ１７５を図７に示す。イン
トロン／エクソンの境界を示すＳＯＭ１７５のゲノムマ
ップを図８ａおよび図８ｂに示す。

【００４２】

【表２】表２.１ＡＳＯＭ１７５のスプライシング変異体とヒトＶＥＧＦ１６５との間のヌクレオチド類似性パーセント VEGF₁₆₅ SOM175 SOM175-e6 SOM175-e6および 7 SOM175-e4 VEGF１６５ *** 34.9 39.7 41.4 37.0 SOM175 *** 98.9 95.1 99.2 SOM175-e6 *** 98.8 84.0 SOM175-e6および7 *** 80.3 SOM175-e4 ***

【００４３】

【表３】ＢＳＯＭ１７５のスプライシング変異体とヒトＶＥＧＦ１６５との間のヌクレオチド相違性パーセント VEGF₁₆₅ SOM175 SOM175-e6 SOM175-e6および 7 SOM175-e4 VEGF１６５ *** 41.7 41.6 41.7 41.8 SOM175 *** 0.2 0.2 0.0 SOM175-e6 *** 0.0 0.2 SOM175-e6および7 *** 0.3 SOM175-e4 ***

【００４４】

【表４】表２.２ＡＳＯＭ１７５のスプライシング変異体とヒトＶＥＧＦ１６５との間のアミノ酸同一性パーセント VEGF₁₆₅ SOM175 SOM175-e6 SOM175-e6および 7 SOM175-e4 VEGF１６５ *** 31.4 42.3 33.5 40.6 SOM175 *** 74.7 73.7 99.1 SOM175-e6 *** 76.8 99.1 SOM175-e6および7 *** 99.1 SOM175-e4 ***

【００４５】

【表５】ＢＳＯＭ１７５のスプライシング変異体とヒトＶＥＧＦ１６５との間のアミノ酸相違性パーセント VEGF₁₆₅ SOM175 SOM175-e6 SOM175-e6および 7 SOM175-e4 VEGF１６５ *** 65.7 55.4 54.6 57.4 SOM175 *** 19.9 4.2 0.0 SOM175-e6 *** 0.0 0.0 SOM175-e6および7 *** 0.0 SOM175-e4 ***

【００４６】実施例４ＳＯＭ１７５の機能を測定するためのバイオアッセイＳＯＭ１７５が内皮細胞機能、脈管形成、および創傷治
癒に対してＶＥＧＦと同様の活性を有するかどうかを評
価するためにアッセイを行う。受容体結合分布試験の結
果に基づいて他のアッセイを行う。

【００４７】内皮細胞機能のアッセイ内皮細胞増殖。ＦerraraおよびＨenzel（１９８９）お
よびＧospodarowiczら（１９８９）に記載の内皮細胞成
長アッセイ。

【００４８】脈管透過性アッセイ。モルモットでのマイ
ルス(Ｍiles)試験を利用するこのアッセイは、Ｍilesお
よびＭiles（１９５２）に記載と同様に行う。

【００４９】細胞接着アッセイ。ポリモルフの内皮細胞
への接着に対するＳＯＭ１７５の影響を分析する。

【００５０】走化性。これは、標準的なボイデン(Ｂoyd
en)チャンバー走化性アッセイを使用して行う。

【００５１】プラスミノーゲンアクチベータアッセイ。
ＳＯＭ１７５の添加によるプラスミノーゲンアクチベー
タおよびプラスミノーゲンアクチベータ阻害物質産生に
関して、内皮細胞を試験する(Ｐepperら（１９９
１）)。

【００５２】内皮細胞移動アッセイ。内皮細胞を刺激し
て、移動させ管を形成させるＳＯＭ１７５の能力を、Ｍ
ontesanoら（１９８６）に記載と同様にしてアッセイす
る。

【００５３】脈管形成アッセイ雛の漿尿膜での脈管形成応答のＳＯＭ１７５誘導を、Ｌ
eungら（１９８９）に記載と同様にして評価する。

【００５４】次のアッセイを使用して、ＳＯＭ１７５の
潜在的神経栄養作用を評価する。

【００５５】軸索外殖アッセイおよび遺伝子誘導(ＰＣ
１２細胞) ＰＣ１２細胞(クロム親和性細胞腫セルライン)は、ＮＧ
Ｆおよび他の神経栄養因子に応答し、初期並びに後期遺
伝子の誘導、および神経の伸長を含む交感神経ニューロ
ンの特性を発達させる。これらの細胞をＳＯＭ１７５に
暴露して、それらの応答をモニターする(Ｄrinkwaterら
（１９９１）；およびＤrinkwaterら（１９９３）)。

【００５６】末梢神経系(ＰＮＳ)由来の培養されたニュ
ーロン次のＰＮＳニューロンの初代培養物をＳＯＭ１７５に暴
露して、幾つかの応答に関してモニターする： −神経冠および背根神経節由来の感覚ニューロン、 −交感神経系神経節由来の交感神経ニューロン、 −節状神経節由来のプラコード(placode)誘導感覚ニュ
ーロン、 −脊髄由来の運動ニューロン。そのアッセイは、Ｓuterら（１９９２）およびＭarinou
ら（１９９２）に記載されている。

【００５７】インビトロにおける応答が観察された場合
には、取込みおよび逆行性輸送などの性質に関するイン
ビボにおけるアッセイを、Ｈendryら（１９９２）に記
載と同様にして行う。

【００５８】神経再生(ＰＮＳ) ＳＯＭ１７５の神経栄養効果が観察された場合には、軸
索を切断した感覚ニューロン、交感神経ニューロン、お
よび運動ニューロンの再生におけるその可能な役割を、
Ｏttoら（１９８９）；Ｙipら（１９８４）；およびＨe
ndryら（１９７６）の方法により分析する。

【００５９】ＣＮＳニューロンに対するＳＯＭ１７５の
作用中枢神経系ニューロンの生存を増進するＳＯＭ１７５の
能力を、Ｈaggら（１９９２）；Ｗilliamsら（１９８
６）；Ｈefti（１９８６）；およびＫromer（１９８
７）に記載と同様にして分析する。

【００６０】創傷治癒創傷治癒を支えるＳＯＭ１７５の能力を、Ｓchillingら
（１９５９）に記載され、Ｈuntら（１９６７）により
利用いるのと同様にして、利用できる最も臨床的に適切
なモデルで試験する。

【００６１】造血系造血系の特異的な細胞集団に対して、様々なインビトロ
およびインビボ・アッセイが可能であり、また以下に概
略を述べる。

【００６２】幹細胞マウスＦＡＣＳ−精製細胞を使用して、様々な新規のインビト
ロ・マウス幹細胞アッセイが開発されている。

【００６３】（ａ）再増殖する幹細胞致死量を照射したマウスの骨髄を再増殖することができ
る細胞があって、Ｌin−、Ｒhｈｉ、Ｌy−６Ａ／Ｅ＋、
ｃ−kit＋表現型を有する。試験物質を、これらの細胞
に対して単独で、または複数の因子との同時インキュベ
ーションにより試験した後、３Ｈチミジンの取込みに
より、細胞増殖を測定する。

【００６４】（ｂ）後期幹細胞比較的僅かな骨髄再増殖能しか有していないが、Ｄ１３
ＣＦＵ−Ｓを発生させることができる細胞がある。こ
れらの細胞は、Ｌin−、Ｒhｈｉ、Ｌy−６Ａ／Ｅ＋、ｃ
−kit＋表現型を有する。試験物質をこれらの細胞と共
に一定時間インキュベートし、致死量を照射したレシピ
エントに注射して、Ｄ１３脾臓コロニーの数を数える。

【００６５】（ｃ）前駆体に富む細胞インビトロにおいて単一の成長因子に応答する細胞があ
って、Ｌin−、Ｒhｈｉ、Ｌy−６Ａ／Ｅ＋、ｃ−kit−
表現型を有する。このアッセイは、ＳＯＭ１７５が造血
前駆体細胞に直接作用することができるかどうかを示す
で。試験物質をこれらの細胞と共に寒天培養でインキュ
ベートして、７−１４日後にコロニーの数を数える。

【００６６】アテローム性動脈硬化症平滑筋細胞は、収縮状態から合成状態へのそれらの表現
型の変えながら、アテローム性動脈硬化症の発生または
開始において重要な役割を果す。マクロファージ、内皮
細胞、Ｔリンパ球、および血小板は全て、平滑筋細胞の
成長および表現型修飾に影響を及ぼすことにより、アテ
ローム性動脈硬化症プラークの発生において重要な役割
を果す。多細胞環境での平滑筋細胞の増殖率および表現
型修飾を測定するインビトロにおけるアッセイを使用し
て、平滑筋細胞に対するＳＯＭ１７５の効果を評価す
る。そのシステムは、様々な細胞の種類をカバーガラス
の両側に播種する、変型ローズ(Ｒose)チャンバーを使
用する。

【００６７】骨に対するＳＯＭ１７５の効果骨芽細胞の増殖を調節するＳＯＭ１７５の能力を、Ｌow
eら（１９９１）に記載と同様にしてアッセイする。骨
吸収に対する幾つかの効果を、Ｌoweら（１９９１）に
記載と同様にしてアッセイする。細胞内分子における骨
芽細胞移動および変化に対する効果(例えば、cＡＭＰの
蓄積、アルカリ性ホスファターゼ濃度)を、Ｍidyら（１
９９４）に記載と同様にして分析する。

【００６８】骨格筋細胞に対する効果筋原細胞の増殖および筋管の発達に対するＳＯＭ１７５
の効果は、Ｅwtonら（１９８０）により、またＧospoda
rowiczら（１９７６）に記載と同様にして測定すること
ができる。

【００６９】実施例５マウスＶＥＧＦＤＮＡのクローニング cＤＮＡの単離マウスＶＲＦ(mＶＲＦ)クローンを、λ Ｚap新生全脳c
ＤＮＡライブラリー(Ｓtratagene)から選択した。上記
のhＶＲＦ cＤＮＡ(pＳＯＭ１７５)からＰＣＲにより発
生した、６８２bpの３２Ｐ−標識化プローブとのハイブ
リダイゼーションにより、高密度フィルター(５×１０
４pfu／プレート)から得られた一次ファージを同定し
た。ＣhurchおよびＧilbert（１９８４）に記載と同様
の条件下、ハイブリダイゼーションおよびナイロン膜
(Ｈybond−Ｎ)のストリンジェント洗浄を６５℃で行っ
た。陽性のプラークを採取し、精製し、インビボにおい
て切断して、pＢluescript ＳＫ−中にcＤＮＡクローン
を含む細菌コロニーを産生させた。

【００７０】ゲノムクローンの単離ゲノムクローンを、λ Ｆix IIベクター(Ｓtratagene)
にクローン化したマウス菌株ＳＶ／１２９ライブラリー
から単離した。高密度フィルター(５×１０４pfu／フィ
ルター)を、mＶＲＦ cＤＮＡのヌクレオチド２３３−７
９８領域のＰＣＲ増幅により創生させた、５６３bpの３
２Ｐ−標識化プローブでスクリーニングした(図９を参
照)。陽性のクローンをプラグして(plugged)、４００−
８００pfuを含むフィルターで再びスクリーニングし
た。ＱＩＡＧＥＮ λキットを使用して、またはＺnＣl
２精製(Ｓantos、１９９１)により、大量のファージ調
製物を製造した。

【００７１】ヌクレオチド配列決定および分析様々なベクターに基づいたプライマーおよび内部プライ
マーを、製造業者の使用説明書に従って、Ａpplied Ｂi
osystems Ｉncorporated(ＡＢＩ)の色素ターミネーター
配列決定キットと共に使用して、cＤＮＡを両方の鎖に
関して配列決定した。配列をＡＢＩの３７３Ａ型自動
化ＤＮＡシークエンサーで分析した。ＢＥＳＴＦＩＴプ
ログラム(ＧＣＧ、ウィスコンシン)を使用して、ペプチ
ドの相同性アラインメントを行った。

【００７２】イントロン／エクソンの境界の同定ゲノムＤＮＡまたはmＶＲＦゲノムλクローンをテンプ
レートとして用いるＰＣＲを使用して、エクソンの境界
およびフランキング領域の同定を行った。イントロンを
同定するためにＰＣＲで使用するプライマーは、hＶＲ
Ｆ配列から誘導し、また可能性のあるヒト−マウス配列
のミスマッチを考慮して、推定されるＴmより低い５−
１０℃のアニーリング温度を使用した。ＰＣＲ産物を全
て、アガロースゲル電気泳動によりサイズ分けして、Ｑ
ＩＡ急速スピンカラム(Ｑiagen)を使用して精製したゲ
ルとイントロン／エクソンの境界とを、これらの産物か
ら直接配列決定した。加えて、幾つかのスプライス部位
を、サブクローン化したＭＶＲＦのゲノムフラグメント
から配列決定した。cＤＮＡとゲノムＤＮＡの配列を比
較することにより、イントロン／エクソンの境界を同定
した。

【００７３】ノーザン分析ＣhomczynskiおよびＳacchi（１９８７）の方法を使用
して、全ての細胞ＲＮＡを新鮮な正常成熟マウス組織
(脳、腎臓、肝臓、筋肉)のパネルから調製した。合計２
０μgのＲＮＡを電気泳動し、ナイロン膜(Ｈybond−
Ｎ、Ａmersham)に移して、標準的な条件下(Ｃhurchおよ
びＧilbert、１９８４)にハイブリダイズさせた。フィ
ルターを６５℃の０.１×ＳＳＣ(２０×ＳＳＣは、３Ｍ
ＮaＣl／０.３Ｍクエン酸三ナトリウム)、０.１％Ｓ
ＤＳ中で洗浄して、増感紙を用いるＸ線フィルムに−７
０℃で１−３日間暴露した。

【００７４】mＶＲＦ cＤＮＡの特性決定マウスcＤＮＡライブラリーをhＶＲＦ cＤＮＡクローン
でスクリーニングすることにより、マウスＶＲＦ相同体
を分離した。０.８−１.５kbと様々なサイズの５つのク
ローンを回収して、配列決定した。cＤＮＡ配列決定に
よれば、オープンリーディングフレーム全体(スプライ
ス型によって、６２１bpまたは５６４bp、下記参照)を
含む全長１０４１bpのcＤＮＡ配列、および３'ＵＴＲ
(３７９bp)、さらにはまた１６３bpの５'ＵＴＲである
(図９)。

【００７５】予想される開始コドンは、hＶＲＦにおけ
る開始コドンの位置に一致した。フレームＡＴＧ以外の
他のコドンは−４７の位置にあって、２つの終止コドン
は推定上の開始コドンと共に上流(各々、−９並びに−
３３の位置)およびフレーム内で観察された。

【００７６】予想されるhＶＲＦのＮ末端シグナルペプ
チドは、８１％の同一性(１７／２１アミノ酸)でmＶＲ
Ｆに存在すると思われる。mＶＲＦ内でのペプチド切断
は、残基２１の後で起こるものと思われる(図１０)。こ
れらのデータは、成熟mＶＲＦが分泌され、また従っ
て、恐らく成長因子として機能し得ることを示す。

【００７７】hＶＲＦに関しては、２つのオープンリー
ディングフレーム(ＯＲＦ)が、ライブラリースクリーニ
ングにより分離されたcＤＮＡにおいて検出された。５
つのクローンのうち４つは、選択的にスプライシングさ
れて、hＶＲＦのエクソン６に相同である１０１bpのフ
ラグメントに欠けることが判明した。mＶＲＦの２つの
異性体(isoform)の予想されるペプチド配列を決定し
て、対応するヒト異性体と整列化した(図１０)。

【００７８】メッセージをコードするmＶＲＦ１８６
は、エクソン７の末端に向かって、＋６２２の位置で終
わるコード配列を有する６２１bpのＯＲＦを含む。より
小さなメッセージをコードするmＶＲＦ１６７は、実際
には、１０１bpのエクソン６からのスプライシングに起
因するフレームシフトと、エクソン８の始まりに近い、
＋６６６の位置での終止コドン(ＴＧＡ)の導入により、
＋６２２のＴＡＧ部位の下流で終止する(図９)。

【００７９】mＶＲＦ１８６タンパク質は、ＶＥＧＦの
アミノ部分および中心部分に対して強い相同性を有する
が、カルボキシル末端は全く違って、アラニンに富む。
mＶＲＦ１６７は、これらの類似性を有しており、mＶＥ
ＧＦの右からＣ末端までの相同性も維持している(図１
１)。hＶＲＦ１６７に対するmＶＲＦ１６７の全体にわ
たる相同性は各々、８５％の同一性と９２％の類似性で
あった(図１０)。同様に、mＶＲＦ１６７とmＶＥＧＦと
の間の相同性(Ｂreierら、１９９２)は各々、４９％の
同一性と７１％の保存的アミノ酸置換であった(図１
１)。

【００８０】模範的な脊椎動物のポリアデニル化シグナ
ル(ＡＡＴＡＡＡ)(Ｂirnstielら、１９８６)は、mＶＲ
Ｆ cＤＮＡには存在していなかったが、しかし、ぴった
りと一致する配列ＧＡＴＡＡＡが、マウスとヒトの両
方のＶＲＦ cＤＮＡにおいて同じような位置に存在す
る。hＶＲＦとは対照的に、mＶＲＦは、ＡＣジヌクレオ
チドの反復を３'ＵＴＲのいちばん端の３'末端(ヌクレ
オチドの９９８〜１０１１の位置、図９)に含むことが
判明した。この反復領域の多様性は、７〜１１にわたる
ジヌクレオチド数の、幾つかのmＶＲＦ cＤＮＡの間で
観察された。

【００８１】mＶＲＦのゲノム特性決定対応するhＶＲＦの境界に相同な配列に隣接するプライ
マーを使用して、イントロン／エクソンの境界（表３）
をマップした。mＶＲＦのイントロンＩ、III、IV、およ
びVI(表３、図１２)は、hＶＲＦの介在配列より小さか
った。完全なゲノム配列は、mＶＲＦの増幅したイント
ロンとクローン化したゲノム部分を配列決定することに
より、mＶＲＦの５'ＵＴＲから最も大きな介在領域(２.
２kb)であるイントロンVIまでにまとめられていた。mＶ
ＲＦとhＶＲＦとの間にはゲノム構造において１つだけ
大きな相違があって、それは、mＶＲＦのエクソン７／
イントロンVIの境界が、cＤＮＡ配列との関係でさらに
１０bp下流にあることであり、従って、mＶＲＦにおけ
るエクソン７は、hＶＲＦにおいて対応するエクソンよ
り１０bp長い。

【００８２】エクソン６および７は、ヒト相同体で見受
けられることが分かっているように、mＶＲＦで隣接し
ている。mＶＲＦとhＶＲＦのエクソン６の間の強い配列
相同性(図１０)は、この配列が保持されたイントロン配
列ではないが、どちらかといえばＶＲＦ１８６異性体(i
soform)の機能部分をコードすることを示す。

【００８３】一般的なイントロン／エクソンの構造は、
ＶＥＧＦ遺伝子ファミリーの様々なメンバー(ＶＥＧ
Ｆ、ＰＩＧＦ、hＶＲＦ)の間で保存され、また従って、
mＶＲＦ遺伝子のゲノム組織全体がこれらの遺伝子に大
変似ていることは驚くべきことではない(図１２)。

【００８４】先の比較マッピング試験は、染色体１１q
１３遺伝子座上のヒト複合内分泌腺新生物タイプ１疾患
部を取り囲む領域が、マウス染色体１９の近位セグメン
トとシンテニック(syntenic)であることを示している
(Ｒochelleら、１９９２)。発明者らは、hＶＲＦ遺伝子
を１kbのヒトＭＥＮｌ遺伝子座内にマップしていること
から(上記参照)、多分、マウスＶＲＦ遺伝子は、染色体
１９のセントロメア付近にマップされるであろう。

【００８５】mＶＲＦの発現試験成人マウス組織(筋肉、心臓、肺、および肝臓)由来のＲ
ＮＡのノーザン分析は、発現が偏在するらしく、約１.
３kbの大きさの主要なバンドとして存在することを示し
た(図１４)。これは、２.０および５.５kbの２つの主要
なバンドが試験した全ての組織で同定されているとい
う、hＶＲＦの場合に観察されるパターンとは幾分異な
っている。１.３kbのマウスメッセージは、恐らく、よ
り短いヒト転写物に対応するであろうし、またその大き
さの変化は、多分、各々の５'ＵＴＲの長さにおける相
違によるものであろう。

【００８６】実施例６分娩前および分娩後のマウスにおけるマウスＶＥＧＦの
発現動物妊娠期の同じマウス(ｎ＝４)および若年の成熟マウス
(ｎ＝２)(Ｃ５７近交系、ＡＬＡＢ、スウェーデン)を二
酸化炭素で屠殺し、関連のある組織を採取して、チャッ
ク(chuck)上で凍結した。さらに使用するまで、組織を
−７０℃で保存した。２つの妊娠年齢をこの試験に使用
した；胚日数８(Ｅ８)、１４、およびＥ１７。

【００８７】in situハイブリダイゼーション組織化学前記(Ｄagerlindら、１９９２)と同様にして、in situ
ハイブリダイゼーションを行った。簡単に言えば、横切
片(１４μm)を低温槽(Ｍicrom、独国)中で切断し、プロ
ーブ−オン(Ｐrobe−Ｏn)スライド(Ｆisher Ｓcientifi
c、米国)上で解凍して、使用するまで、光を遮断しシー
ルされた箱の中に−７０℃で保存した。mＶＲＦをコー
ドするmＲＮＡに相補的な合成の４２−merのオリゴヌク
レオチドの配列は、ＡＣＣＡＣＣＡＣＣＴＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＧＣＡＴＧ
ＴＧＧＣＡＣＧＴＧＣＡＴＡＡＡＣＧ［配列番号１１］(nt １２０−１６
１に相補的である)およびＡＧＴＴＧＴＴＴＧＡＣＣＡＣＡＴＴＧＣＣＣＡＴＧＡ
ＧＴＴＣＣＡＴＧＣＴＣＡＧＡＧＧＣ［配列番号１２］(nt １６２−２０
３に相補的である)であった。２つの選択的なスプライ
ス型を検出するために、オリゴヌクレオチドＧＡＴＣＣＴＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＴＧＧＡ
ＴＧＡＴＧＴＣＡＧＣＴＧＧ［配列番号１３］(nt ｘｘｘ−ｘｘｘに相補
的である)およびＧＣＧＧＧＣＡＧＡＧＧＡＴＣＣＴＧＧＧＧＣＴＧＴＣ
ＴＧＧＣＣＴＣＡＣＡＧＣＡＣＴ［配列番号１４］を使用した。プローブ
は、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラ
ーゼ(ＩＢＩ、米国)を使用して、デオキシアデノシン−
α[チオ]トリホスフェート[３５Ｓ](ＮＥＮ、米国)で７
−１０×１０８cpm／μgの比放射能まで３'末端を標識
して、前処理することなく、切片に４２℃で１６−１８
時間ハイブリダイズさせた。そのハイブリダイゼーショ
ン混合物は、以下のものを含んでいた：５０％ｖ／ｖ
ホルムアミド、４×ＳＳＣ(１×ＳＳＣ＝０.１５ＭＮa
Ｃlおよび０.０１５Ｍクエン酸ナトリウム)、１×Ｄen
hardt溶液(各々、０.０２％ポリビニルピロリドン、Ｂ
ＳＡ、およびフィコール)、１％ｖ／ｖサルコシル(Ｎ
−ラウロイルサルコシン；Ｓigma)、０.０２Ｍリン酸
緩衝液(pＨ７.０)、１０％ｗ／ｖ硫酸デキストラン
(Ｐharmacia、スウェーデン)、２５０μg／ml 酵母tＲ
ＮＡ(Ｓigma)、５００μg／ml 切断して熱変性させたサ
ケ精子ＤＮＡ(Ｓigma)、および２００mＭジチオトレイ
トール(ＤＴＴ；ＬＫＢ、スウェーデン)。対照切片で
は、そのハイブリダイゼーション混合物に２０倍過剰の
非標識化プローブを添加することにより、両方のプロー
ブの特異性を調べた。加えて、隣接した切片を、異なっ
た発現パターンを与える、この試験には関係のないプロ
ーブとハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション
に続いて、その切片を５５℃の１×ＳＳＣ中で数回洗浄
し、エタノール中で脱水して、ＮＴＢ２核トラックエマ
ルション(Ｋodak、米国)に浸漬した。３−５週間後、そ
の切片をＤ−１９展開剤(Ｋodak、米国)中で展開して、
カバーグラスをかけた。いくつかの場合には、エマルシ
ョンに浸漬する前に、切片をオートラジオグラフフィル
ム(β−マックスオートラジオグラフフィルム、Ａmersh
am Ｌtd、英国)と対置させた。

【００８８】４つの異なったプローブは、試験した全て
の組織において同一のハイブリダイゼーションパターン
を与えた。マウスＶＲＦ発現は、Ｅ８胚において既に検
出されており、ニューロン管にもっともよく対応するで
あろう構造に対して、陽性のシグナルが記録された。Ｅ
１４マウス胚の縦切片では、最も強いハイブリダイゼー
ションシグナルが心臓に、および神経系、特に大脳皮質
において存在していた(図１４Ａ)。低レベルの発現は、
全ての他の組織において存在していた。妊娠後期Ｅ１７
では、高いmＶＲＦ mＲＮＡシグナルは、心臓および首
の後ろ並びに周りにある褐色脂肪組織に限られていた
(図１４Ｂ)。明らかに陽性のハイブリダイゼーションシ
グナルが脊髄の灰白質において、および舌において存在
していた(図１４Ｂ)。大脳皮質での発現は、１４日目に
比べて明らかに減少した。例えば、筋肉におけるＥ１４
胚で見られる弱いバックグラウンド発現は、この妊娠年
齢で減少した。強いmＶＲＦ mＲＮＡハイブリダイゼー
ションシグナルは、若年の成熟マウスにおける心臓に対
して、および褐色脂肪においてのみ存在していた(図１
４Ｃ)。心臓上のシグナルは、乳頭筋を含め、心室壁全
体にわたって均一に分布していた(図１４Ｄ)。過剰の冷
プローブとハイブリダイズした心臓組織の切片では、バ
ックグラウンドシグナルの特異的な標識化は全く記録さ
れなかった(図１４Ｅ)。

【００８９】心臓とは別に、mＶＲＦ mＲＮＡシグナル
は、形態学的には、褐色脂肪に似ている胸郭の外側にあ
る、ある組織全体に存在していた。これは、同じ領域で
強い染色を示す、ズダン黒対比染色で確認された(図１
５Ａおよび１５Ｂ)。成熟マウス脊髄の横切片では、mＶ
ＲＦプローブは、灰白質に対してニューロン染色パター
ンを与えた(図１５Ｃ)。トルイジンでの対比染色(図１
５Ｄ)は、前角における運動ニューロン(図１５Ｃおよび
１５Ｄ)、後角の深部における、および中心管の周りの
介在ニューロン(図１５Ｃ)の大部分が、mＶＲＦ mＲＮ
Ａに陽性であることを示した。

【００９０】実施例７ヒナの感覚ニューロンに対するＶＥＧＦおよびＳＯＭ１
７５タンパク質の効果Ｎurcombeら（１９９２）の方法を使用して、胚８日目
のニワトリのヒナの感覚ニューロンに対するＶＥＧＦお
よびＳＯＭ１７５タンパク質の効果を測定した。試験ウ
ェル当たり２０００細胞を使用して、ニューロンの試験
を４８時間目に計数した。３Ｈ−チミジン計数を使用し
て結果を得た。ＮＧＦを陽性の対照として、また様々な
濃度のＶＥＧＦ、ヘパリンの存在下におけるＶＥＧＦ、
およびヘパリンと５μＭ５'−フルオロウラシル(５Ｆ
Ｕ)の存在下におけるＶＥＧＦを使用して、ニューロン
の生存のパーセント、神経外殖、および平均の神経の長
さ(μm)を測定した。５ＦＵは神経膠細胞を殺す。

【００９１】結果を図１６に示す。その結果は、ＶＥＧ
Ｆがニューロンの生存を増進するのに有効であるが、こ
れには、神経膠細胞の存在が必要であることを示す。図
１７は、３種類の雛の神経膠に対するＶＥＧＦおよびＳ
ＯＭ１７５の効果の結果を示す。試験した神経膠は、Ｃ
ＮＳ神経膠、末梢神経膠、およびＣＮＳ希突起神経膠細
胞であった。全ての培養において、ヘパリンを１０μg
／mlとして使用して、試験を２４時間目に計数した。ウ
ェル毎に２０００細胞を使用して、結果を３Ｈ−チミジ
ン計数で測定した。その結果は、ヒナの中枢および末梢
ニューロンの場合には、大神経膠細胞が著しく刺激され
て、ヘパリンの存在下においてＳＯＭ１７５により増殖
したが、ヒナの希突起神経膠細胞は分裂速度は無視でき
るほどの増加であったことを示す。

【００９２】実施例８マウス一次および中枢ニューロンに対するＳＯＭ１７５
タンパク質の効果実施例７での結果は、ＶＥＧＦ異性体が、大神経膠細胞
の作用によって、ヒナの一次および中枢ニューロンに対
する効果を有していたことを示す。同様の実験をマウス
細胞で繰返した。

【００９３】培養条件「Ｍethods in Ｎeurosciences（第２巻）：Ｃell Ｃul
ture」Ｐ.Ｍ.Ｃonn編、Ａcademic Ｐress、サンディエ
ゴ、１９９０、大神経膠細胞に関しては３３−４６頁、
希突起神経膠細胞に関しては５６−７４頁、および中枢
ニューロンに関しては８７−１０２頁に記載されている
方法に従って、全てのインビトロにおける実験のために
ニューロンおよび神経膠細胞を調製して、培養した。ポ
リ−Ｌ−オルニチン(０.１mg／ml、１時間)で被覆した
２４ウェルの培養クラスター(Ｎunc)に、細胞を２,００
０細胞／ウェルの密度で塗布した。培養してから４８時
間後、十分確立された方法(Ｍarutaら、１９９３)を使
用して、ニューロンを逆相光(inverted phase light)の
下にウェル中で計数し、以下のようにして、神経膠細胞
を[３Ｈ]チミジンの取込みで評価して、細胞分裂速度を
モニターした。ことわらなければ、ヘパリン(１０μg／
ml、低分子量画分、Ｓigma Ｃhemical Ｃorp.)は常時、
培地中に存在していた。ニューロン培養物に５mＭ５−
フルオロ−２−デオキシウリジン(Ｓigma)を補って、バ
ックグラウンドの神経膠細胞増殖を抑制した。

【００９４】神経膠細胞増殖に関する３Ｈ−チミジン取
込みアッセイ細胞を、標準的な培地中、０.１mＣi／mlの保存濃度か
ら３Ｈ−チミジン(比放射能１０３μＣi／ug)で１４時
間パルスして、最終的に２０μl／ウェルのインキュー
ベート容量になった。ウェルの内容物を収集して、ニト
ロセルロース紙(Ｔitertek、Ｆlow)に吸収させた。トリ
プシン／ベルセン(versene)(ＣＳＬＬimited、ビクト
リア、オーストラリア)と共に５分間インキュベーショ
ンすることにより、残りの付着細胞を取り除いた。この
手順を２回行った。最初に蒸留水を、次いでメタノール
を使用して、ニトロセルロースディスクを標準的なＴit
ertek 収集装置(Ｆlow)で洗浄した。そのニトロセルロ
ースディスクを乾燥させ、シンチレーション液(５％ｖ
／ｖＴriton−Ｘを含む)を添加して、そのディスクを
シンチレーションカウンターで計数した。

【００９５】最大活性は、マウス大神経膠細胞培養物で
のエクソン６が欠けているＳＯＭ１７５(ＳＯＭΔＸ６)
の製剤で見られ、ヘパリンと共に投与した場合には、そ
れらの増殖に対して重要な刺激があった(図１６)。わず
かな刺激が希突起神経膠細胞の増殖に与えられ(図１
７)、また単離された前脳ニューロンの生存応答の極僅
かに認められる増強作用が与えられた(図１８)。各々の
点に対する３つのグラフ全てに関する標準偏差は８％未
満であった。

【００９６】神経膠細胞の増殖を増進することにより、
ニューロンの生存率を維持することができる。さらにま
た、ＳＯＭΔＸ６は、大神経膠細胞の良好な誘導物質で
あって、中枢神経系の内皮細胞での大神経膠細胞の終末
球の形成と共に発現され得る。

【００９７】当業者は、ここに記載する本発明が、具体
的に記載したもの以外にも変化および変更が可能である
ことが分かるであろう。本発明には、そのような変化お
よび変更が全て含まれることが理解されるべきである。
本発明にはまた、本明細書中に言及した、または示した
工程、特徴、組成物、および化合物も全て個々に、また
は総合的に含まれ、および該工程または特徴のいずれか
２つまたはそれ以上の、幾つか、および全ての組み合わ
せもまた含まれる。

【００９８】

【表６】表３マウスＶＲＦ遺伝子のスプライス部位 5'UTR* ...... エクソン1 >223bp CCCAGgtacgtgcgt イントロンI 495bp ttccccacagGCCCC エクソン2 43bp GAAAGgtaataatag イントロンII 288bp ctgcccacagTGGTG エクソン3 197bp TGCAGgtaccagggc イントロンIII 196bp ctgagcacagATCCT エクソン4 74bp TGCAGgtgccagccc イントロンIV 182bp ctcttttcagACCTA エクソン5 36bp GACAGattcttggtg イントロンV 191bp ctcctcctagGGTTG エクソン6 101bp (イントロンなし) CCCACTCCAGCCCCA エクソン7 135bp TGTAGgtaaggagtc イントロンVI 〜2200bp cactccccagGTGCC エクソン8 394bp AGAGATGGAGACACT 大文字および小文字は各々、エクソン配列およびイントロン配列を示す。 *は、エクソン１の５'末端がまだ決定されていないことを示す。

【００９９】参考文献

【表７】

【０１００】

【表８】

【０１０１】

【表９】

【０１０２】

【配列表】

【０１０３】配列番号１の情報： (i) 配列の特徴： (A) 長さ：６４９塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：１本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：ＤＮＡ (ix) 配列の特徴： (A) 特徴を表す記号：ＣＤＳ (B) 存在位置：17...589 (xi) 配列：SEQ ID NO.1：

【化１】

【０１０４】配列番号２の情報： (i) 配列の特徴： (A) 長さ：１９１アミノ酸 (B) 型：アミノ酸 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：タンパク質 (xi) 配列：SEQ ID NO.2：

【化２】

【０１０５】配列番号３の情報： (i) 配列の特徴： (A) 長さ：１０９４塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：１本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：ＤＮＡ (ix) 配列の特徴： (A) 特徴を表す記号：ＣＤＳ (B) 存在位置：3..624 (xi) 配列：SEQ ID NO.3：

【化３】

【化４】

【０１０６】配列番号４の情報： (i) 配列の特徴： (A) 長さ：２０７アミノ酸 (B) 型：アミノ酸 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：タンパク質 (xi) 配列：SEQ ID NO.4：

【化５】

【０１０７】配列番号５の情報： (i) 配列の特徴： (A) 長さ：９９３塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：１本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：ＤＮＡ (ix) 配列の特徴： (A) 特徴を表す記号：ＣＤＳ (B) 存在位置：3..566 (xi) 配列：SEQ ID NO.5：

【化６】

【化７】

【０１０８】配列番号６の情報： (i) 配列の特徴： (A) 長さ：１８８アミノ酸 (B) 型：アミノ酸 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：タンパク質 (xi) 配列：SEQ ID NO.6：

【化８】

【０１０９】配列番号７の情報： (i) 配列の特徴： (A) 長さ：８５８塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：１本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：ＤＮＡ (ix) 配列の特徴： (A) 特徴を表す記号：ＣＤＳ (B) 存在位置：3..431 (xi) 配列：SEQ ID NO.7：

【化９】

【０１１０】配列番号８の情報： (i) 配列の特徴： (A) 長さ：１４３アミノ酸 (B) 型：アミノ酸 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：タンパク質 (xi) 配列：SEQ ID NO.8：

【化１０】

【０１１１】配列番号９の情報： (i) 配列の特徴： (A) 長さ：９１０塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：１本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：ＤＮＡ (ix) 配列の特徴： (A) 特徴を表す記号：ＣＤＳ (B) 存在位置：3..305 (xi) 配列：SEQ ID NO.9：

【化１１】

【０１１２】配列番号１０の情報： (i) 配列の特徴： (A) 長さ：１０１アミノ酸 (B) 型：アミノ酸 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：タンパク質 (xi) 配列：SEQ ID NO.10：

【化１２】

【０１１３】配列番号１１の情報： (i) 配列の特徴： (A) 長さ：４２塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：１本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：オリゴヌクレオチド (xi) 配列：SEQ ID NO.11：

【化１３】

【０１１４】配列番号１２の情報： (i) 配列の特徴： (A) 長さ：４２塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：１本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：オリゴヌクレオチド (xi) 配列：SEQ ID NO.12：

【化１４】

【０１１５】配列番号１３の情報： (i) 配列の特徴： (A) 長さ：３８塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：１本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：オリゴヌクレオチド (xi) 配列：SEQ ID NO.13：

【化１５】

【０１１６】配列番号１４の情報： (i) 配列の特徴： (A) 長さ：４０塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：１本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：オリゴヌクレオチド (xi) 配列：SEQ ID NO.14：

【化１６】

【図面の簡単な説明】

【図１】ＶＥＧＦ１６５のヌクレオチド配列［ＳＥＱ
ＩＤＮＯ:１］および対応するアミノ酸配列［ＳＥＱ
ＩＤＮＯ:２］

【図１i】ＶＥＧＦ１６５のヌクレオチド配列［ＳＥ
ＱＩＤＮＯ:１］および対応するアミノ酸配列［ＳＥ
ＱＩＤＮＯ:２］

【図１ii】ＶＥＧＦ１６５のヌクレオチド配列［ＳＥ
ＱＩＤＮＯ:１］および対応するアミノ酸配列［ＳＥ
ＱＩＤＮＯ:２］

【図１iii】ＶＥＧＦ１６５のヌクレオチド配列［Ｓ
ＥＱＩＤＮＯ:１］および対応するアミノ酸配列［Ｓ
ＥＱＩＤＮＯ:２］

【図１iv】ＶＥＧＦ１６５のヌクレオチド配列［ＳＥ
ＱＩＤＮＯ:１］および対応するアミノ酸配列［ＳＥ
ＱＩＤＮＯ:２］

【図２】ＳＯＭ１７５のヌクレオチド配列［ＳＥＱ
ＩＤＮＯ:３］および対応するアミノ酸配列［ＳＥＱ
ＩＤＮＯ:４］

【図２i】ＳＯＭ１７５のヌクレオチド配列［ＳＥＱ
ＩＤＮＯ:３］および対応するアミノ酸配列［ＳＥＱ
ＩＤＮＯ:４］

【図２ii】ＳＯＭ１７５のヌクレオチド配列［ＳＥＱ
ＩＤＮＯ:３］および対応するアミノ酸配列［ＳＥＱ
ＩＤＮＯ:４］

【図２iii】ＳＯＭ１７５のヌクレオチド配列［ＳＥ
ＱＩＤＮＯ:３］および対応するアミノ酸配列［ＳＥ
ＱＩＤＮＯ:４］

【図２iv】ＳＯＭ１７５のヌクレオチド配列［ＳＥＱ
ＩＤＮＯ:３］および対応するアミノ酸配列［ＳＥＱ
ＩＤＮＯ:４］

【図２v】ＳＯＭ１７５のヌクレオチド配列［ＳＥＱ
ＩＤＮＯ:３］および対応するアミノ酸配列［ＳＥＱ
ＩＤＮＯ:４］

【図２vi】ＳＯＭ１７５のヌクレオチド配列［ＳＥＱ
ＩＤＮＯ:３］および対応するアミノ酸配列［ＳＥＱ
ＩＤＮＯ:４］

【図３】ＳＯＭ１７５タンパク質配列によるＢＬＡＳ
Ｔ検索の結果

【図３i】ＳＯＭ１７５タンパク質配列によるＢＬＡ
ＳＴ検索の結果

【図３ii】ＳＯＭ１７５タンパク質配列によるＢＬＡ
ＳＴ検索の結果

【図４】ＶＥＧＦ cＤＮＡおよびＳＯＭ１７５ cＤＮ
ＡのＢＥＳＴＦＩＴ配列

【図４i】ＶＥＧＦ cＤＮＡおよびＳＯＭ１７５ cＤ
ＮＡのＢＥＳＴＦＩＴ配列

【図４ii】ＶＥＧＦ cＤＮＡおよびＳＯＭ１７５ cＤ
ＮＡのＢＥＳＴＦＩＴ配列

【図４iii】ＶＥＧＦ cＤＮＡおよびＳＯＭ１７５ c
ＤＮＡのＢＥＳＴＦＩＴ配列

【図４iv】ＶＥＧＦ cＤＮＡおよびＳＯＭ１７５ cＤ
ＮＡのＢＥＳＴＦＩＴ配列

【図５】ＳＯＭ１７５およびヌクレオチドレベルの
スプライス変異体とＶＥＧＦ１６５の複数の配列

【図５i】ＳＯＭ１７５およびヌクレオチドレベル
のスプライス変異体とＶＥＧＦ１６５の複数の配列

【図５ii】ＳＯＭ１７５およびヌクレオチドレベル
のスプライス変異体とＶＥＧＦ１６５の複数の配列

【図５iii】ＳＯＭ１７５およびヌクレオチドレベ
ルのスプライス変異体とＶＥＧＦ１６５の複数の配列

【図５iv】ＳＯＭ１７５およびヌクレオチドレベル
のスプライス変異体とＶＥＧＦ１６５の複数の配列

【図５v】ＳＯＭ１７５およびヌクレオチドレベル
のスプライス変異体とＶＥＧＦ１６５の複数の配列

【図５vi】ＳＯＭ１７５およびヌクレオチドレベル
のスプライス変異体とＶＥＧＦ１６５の複数の配列

【図６】ＳＯＭ１７５およびアミノ酸レベルのスプ
ライス変異体とＶＥＧＦ１６５の複数の配列

【図６i】ＳＯＭ１７５およびアミノ酸レベルのス
プライス変異体とＶＥＧＦ１６５の複数の配列

【図６ii】ＳＯＭ１７５およびアミノ酸レベルのス
プライス変異体とＶＥＧＦ１６５の複数の配列

【図６iii】ＳＯＭ１７５およびアミノ酸レベルの
スプライス変異体とＶＥＧＦ１６５の複数の配列

【図７】ＳＯＭ１７５およびそのスブライス変異体
の図式表現

【図８a】エクソン／イントロン地図を示すヒトＳＯ
Ｍ１７５ゲノム構造の図式表現

【図８b】エクソン／イントロン境界を示すヒトＳＯ
Ｍ１７５ゲノム構造の図式表現

【図９】ｍＶＲＦ cＤＮＡクローンから誘導されたヌ
クレオチドおよび推定ペプチド配列。ヌクレオチドの番
号は左側に記載され、開始コドンのＡから始まる。アミ
ノ酸の番号は右側に記載され、推定シグナルペプチドが
除去された後、予測成熟タンパク質の最初の残基から始
まる。別にスプライスされた領域は２重下線で示し、各
ｍＲＮＡから得られたペプチド配列が含まれている。主
要なポリアデニル化の標識は太字で示されている。ｍＶ
ＲＦ１６７およびｍＶＲＦ１８６の開始および終止コド
ンは下線で示され、３' ＵＴＲ中の多形のＡＣの反復は
破線で囲って示した。イントロン／エクソンの境界の位
置は矢印で示した。

【図９i】ｍＶＲＦ cＤＮＡクローンから誘導された
ヌクレオチドおよび推定ペプチド配列。ヌクレオチドの
番号は左側に記載され、開始コドンのＡから始まる。ア
ミノ酸の番号は右側に記載され、推定シグナルペプチド
が除去された後、予測成熟タンパク質の最初の残基から
始まる。別にスプライスされた領域は２重下線で示し、
各ｍＲＮＡから得られたペプチド配列が含まれている。
主要なポリアデニル化の標識は太字で示されている。ｍ
ＶＲＦ１６７およびｍＶＲＦ１８６の開始および終止コ
ドンは下線で示され、３' ＵＴＲ中の多形のＡＣの反復
は破線で囲って示した。イントロン／エクソンの境界の
位置は矢印で示した。

【図９ii】ｍＶＲＦ cＤＮＡクローンから誘導された
ヌクレオチドおよび推定ペプチド配列。ヌクレオチドの
番号は左側に記載され、開始コドンのＡから始まる。ア
ミノ酸の番号は右側に記載され、推定シグナルペプチド
が除去された後、予測成熟タンパク質の最初の残基から
始まる。別にスプライスされた領域は２重下線で示し、
各ｍＲＮＡから得られたペプチド配列が含まれている。
主要なポリアデニル化の標識は太字で示されている。ｍ
ＶＲＦ１６７およびｍＶＲＦ１８６の開始および終止コ
ドンは下線で示され、３' ＵＴＲ中の多形のＡＣの反復
は破線で囲って示した。イントロン／エクソンの境界の
位置は矢印で示した。

【図９iii】ｍＶＲＦ cＤＮＡクローンから誘導され
たヌクレオチドおよび推定ペプチド配列。ヌクレオチド
の番号は左側に記載され、開始コドンのＡから始まる。
アミノ酸の番号は右側に記載され、推定シグナルペプチ
ドが除去された後、予測成熟タンパク質の最初の残基か
ら始まる。別にスプライスされた領域は２重下線で示
し、各ｍＲＮＡから得られたペプチド配列が含まれてい
る。主要なポリアデニル化の標識は太字で示されてい
る。ｍＶＲＦ１６７およびｍＶＲＦ１８６の開始および
終止コドンは下線で示され、３' ＵＴＲ中の多形のＡＣ
の反復は破線で囲って示した。イントロン／エクソンの
境界の位置は矢印で示した。

【図９iv】ｍＶＲＦ cＤＮＡクローンから誘導された
ヌクレオチドおよび推定ペプチド配列。ヌクレオチドの
番号は左側に記載され、開始コドンのＡから始まる。ア
ミノ酸の番号は右側に記載され、推定シグナルペプチド
が除去された後、予測成熟タンパク質の最初の残基から
始まる。別にスプライスされた領域は２重下線で示し、
各ｍＲＮＡから得られたペプチド配列が含まれている。
主要なポリアデニル化の標識は太字で示されている。ｍ
ＶＲＦ１６７およびｍＶＲＦ１８６の開始および終止コ
ドンは下線で示され、３' ＵＴＲ中の多形のＡＣの反復
は破線で囲って示した。イントロン／エクソンの境界の
位置は矢印で示した。

【図１０】ヒトおよびマウスＶＲＦタンパク質異性体
のＢＥＳＴＦＩＴ配列Ａ：ｍＶＲＦ１６７およびｈＶ
ＲＦ１６７；Ｂ：配列が各１６７アミノ酸異性体と異
なる点からのｍＶＲＦ１８６およびｈＶＲＦ１８６；
アミノ酸の同一性は縦棒で示し、保存アミノ酸は黒点で
示した。矢印はヒトおよびマウスＶＲＦの予測シグナル
ペプチド開裂部位を示す。

【図１０i】ヒトおよびマウスＶＲＦタンパク質異性
体のＢＥＳＴＦＩＴ配列Ａ：ｍＶＲＦ１６７およびｈ
ＶＲＦ１６７；Ｂ：配列が各１６７アミノ酸異性体と
異なる点からのｍＶＲＦ１８６およびｈＶＲＦ１８６；
アミノ酸の同一性は縦棒で示し、保存アミノ酸は黒点
で示した。矢印はヒトおよびマウスＶＲＦの予測シグナ
ルペプチド開裂部位を示す。

【図１０ii】ヒトおよびマウスＶＲＦタンパク質異性
体のＢＥＳＴＦＩＴ配列Ａ：ｍＶＲＦ１６７およびｈ
ＶＲＦ１６７；Ｂ：配列が各１６７アミノ酸異性体と
異なる点からのｍＶＲＦ１８６およびｈＶＲＦ１８６；
アミノ酸の同一性は縦棒で示し、保存アミノ酸は黒点
で示した。矢印はヒトおよびマウスＶＲＦの予測シグナ
ルペプチド開裂部位を示す。

【図１１】ｍＶＲＦ１６７およびｍＶＲＦ１８８（Br
eier ら、１９９２年）ペプチド配列のＢＥＳＴＦＩＴ
配列。矢印はｍＶＥＧＦのシグナルペプチド開裂部位を
示す。同一のアミノ酸は縦棒で示し、保存的置換は黒点
で示した。アミノ酸の番号は図９の方法で記載した。

【図１１i】ｍＶＲＦ１６７およびｍＶＲＦ１８８（B
reier ら、１９９２年）ペプチド配列のＢＥＳＴＦＩＴ
配列。矢印はｍＶＥＧＦのシグナルペプチド開裂部位を
示す。同一のアミノ酸は縦棒で示し、保存的置換は黒点
で示した。アミノ酸の番号は図９の方法で記載した。

【図１１ii】ｍＶＲＦ１６７およびｍＶＲＦ１８８
（Breier ら、１９９２年）ペプチド配列のＢＥＳＴＦ
ＩＴ配列。矢印はｍＶＥＧＦのシグナルペプチド開裂部
位を示す。同一のアミノ酸は縦棒で示し、保存的置換は
黒点で示した。アミノ酸の番号は図９の方法で記載し
た。

【図１２】ＶＲＦ（マウスとヒトの相同体のイントロ
ン／エクソン構造はほぼ同一であるから、一般的なＶＲ
Ｆ遺伝子を示した）とヒトＶＥＧＦ／ＰＩＧＦ／ＰＤＧ
Ｆ遺伝子族の他の構成員との遺伝子構造の比較。エクソ
ンは四角で示した。タンパク質コード領域および非翻訳
領域は内部を埋めた四角または白ぬきの四角で示した。
ＶＲＦの斜線領域はＶＲＦ１８６異性体の別のスプライ
シングによって形成された追加的３' ＵＴＲ配列を示
す。各遺伝子の別の主要なスプライス生成物を示した。

【図１３】ｍＶＲＦ cＤＮＡクローンとハイブリダイ
ズした種々の成熟マウス組織(表示した)からの全ＲＮＡ
のノーザンブロットのオートラジオグラム。主要な１.
３ｋｂの転写はすべての試料から検出された。

【図１４】マウスにおけるｍＶＲＦおよびｍＲＮＡの
発現パターンを示すフィルムオートラジオグラフ(Ａ−
Ｃ)および暗視野照明顕微鏡写真(Ｄ−Ｅ)。Ｅ１４マウ
ス胎芽（Ａ）において、陽性のシグナルが現れている心
臓(Ｈａ)および大脳皮質(Ｃｘ)に見られる。バックグラ
ンドの低いシグナルが他の組織の断面に存在する。Ｅ１
７胎芽(Ｂ)において、心臓(Ｈａ)は強いハイブリダイズ
のシグナルのためにはっきりと見える。同じ位の強さの
シグナルが背中および胸郭付近の茶色の脂肪組織(Ｆa)
に存在する。中程度のハイブリダイゼーションのシグナ
ルが脊髄(ＳＣ)および舌(Ｔ)に存在する。バックグラウ
ンドシグナルはＥ１４胎芽と比較して調整した。若年マ
ウス(Ｃ-Ｄ)では、陽性のシグナルは心臓(Ｈａ)および
胸郭付近の脂肪組織(Ｆａ)に見られ、一方、例えば、肺
(Ｌｕ)はラベルされていない。心臓のハイブリダイゼー
ションシグナルは乳頭筋肉を含む左心室全体に平等に分
布している(Ｄ)。過剰の冷プローブとハイブリダイズさ
せたＥ１７心臓には、陽性のシグナルは存在しなかった
(Ｅ)。尺度＝０.５ｍｍ(Ａ)、１.２ｍｍ(Ｂ)、１ｍｍ
(Ｃ)、０.３ｍｍ（Ｄ）、０.１ｍｍ(Ｅ)

【図１５】マウス脂肪組織(Ａ−Ｂ)および脊髄(Ｃお
よびＤ)におけるｍＶＲＦｍＲＮＡ発現を示す暗−(Ａお
よびＣ)および明−(ＢおよびＤ)視野顕微鏡写真。ズタ
ンブラック染色部分の強い標識によって示されているよ
うに（Ｂ）、強いハイブリダイズシグナルが脂肪に存在
する（Ａ）。弱いシグナルがまた骨格筋(Ａ−Ｂ中Ｍ)に
存在する。成熟脊髄(Ｃ)には、ｍＶＲＦプローブは灰白
質にニューロンの発色パターンを示す。ｍＶＲＦｍＲＮ
Ａに対して強い陽性を示す腹側灰白柱(Ｄ)中の運動ニュ
ーロン、背側灰白柱の深部および中央管付近の介在ニュ
ーロンを示すトルイジン対比染色。尺度＝０.１ｍｍ
(Ａ)、０.１ｍｍ(Ｂ)、０.２５ｍｍ(Ｃ)、０.０１５ｍ
ｍ(Ｄ)。

【図１６】生存％、神経成長％および平均神経の長さ
（μｍ）で測定された、胎芽８日令ヒナ感覚神経に対す
るＶＥＧＦの作用。

【図１７】ニワトリのヒナのグリアに対するＶＥＧＦ
およびＳＯＭ１７５の作用。ＣＮＳグリア、末梢グリア
およびＣＮＳ乏突起膠細胞が試験された。

【図１８】マウス大グリア細胞に対する種々のＳＯＭ
１７５タンパク質の作用 ■３Ｈ（cpm）１．ＦＧＦ−２（１０ng／ml）陽性コントロール２．ＳＯＭ△Ｘ６＊１ng／ml ３．ＳＯＭ△Ｘ６１０ng／ml ４．ＳＯＭ△Ｘ６１００ng／ml ５．ＳＯＭ△Ｘ６１０００ng／ml ６．ＳＯＭ△Ｘ６１０００ng／ml ヘパリンなし７．ＳＯＭＸ６＊＊１ng／ml ８．ＳＯＭＸ６１０ng／ml ９．ＳＯＭＸ６１００ng／ml 10．ＳＯＭＸ６１００ng／ml 11．ＳＯＭＸ６１０００ng／ml ヘパリンなし＊：エクソン６を欠くＳＯＭ１７５を意味する。＊＊：ＳＯＭ１７５を意味する。

【図１９】マウス乏突起神経膠細胞に対する種々のＳ
ＯＭ１７５タンパク質の作用 ■３Ｈ（cpm）１．ＦＧＦ−２（１０ng／ml）陽性コントロール２．ＳＯＭ△Ｘ６＊１ng／ml ３．ＳＯＭ△Ｘ６１０ng／ml ４．ＳＯＭ△Ｘ６１００ng／ml ５．ＳＯＭ△Ｘ６１０００ng／ml ６．ＳＯＭ△Ｘ６１０００ng／ml ヘパリンなし７．ＳＯＭＸ６＊＊１ng／ml ８．ＳＯＭＸ６１０ng／ml ９．ＳＯＭＸ６１００ng／ml 10．ＳＯＭＸ６１０００ng／ml 11．ＳＯＭＸ６１０００ng／ml ヘパリンなし＊：エクソン６を欠くＳＯＭ１７５を意味する。＊＊：ＳＯＭ１７５を意味する。

【図２０】マウス前脳ニューロンに対する種々のＳＯ
Ｍ１７５タンパク質の作用 ■生存率％１．ＦＧＦ−２（１０ng／ml）陽性コントロール２．ＳＯＭ△Ｘ６＊１ng／ml ３．ＳＯＭ△Ｘ６１０ng／ml ４．ＳＯＭ△Ｘ６１００ng／ml ５．ＳＯＭ△Ｘ６１００ng／ml ６．ＳＯＭ△Ｘ６１０００ng／ml ヘパリンなし７．ＳＯＭＸ６＊＊１ng／ml ８．ＳＯＭＸ６１０ng／ml ９．ＳＯＭＸ６１００ng／ml 10．ＳＯＭＸ６１０００ng／ml 11．ＳＯＭＸ６１０００ng／ml ヘパリンなし＊：エクソン６を欠くＳＯＭ１７５を意味する。＊＊：ＳＯＭ１７５を意味する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 14/52 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｎ 5/06 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＣ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/24 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ (72)発明者ギュンター・ヴェバースウェーデン112 43ストックホルム、グウィレンボリースガータン９エンベー番 (72)発明者ショーン・グリモンドイギリス、オーエックス11・055、チルトン、マナー・クロース２番 (72)発明者マグナス・ノルデンスチョールドスウェーデン、エス−161 37ストックホルム、コルトラストヴェーゲン19番 (72)発明者カタリナ・ラーソンスウェーデン、エス−113 44ストックホルム、ダンネモラガータン10エム３テーアル番

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記の特徴： (i)ＳＥＱＩＤＮＯ:２に記載の配列に少なくとも約１
５％の類似性を有するが、少なくとも約５％の非類似性
を有し； (ii)少なくとも１つの血管内皮成長因子(ＶＥＧＦ)と共
通の性質を示すを有する生物学的に分離されたタンパク
質。
【請求項２】上記分子が、下記の特性： (a)血管内皮細胞を誘導する能力； (b)受容体のflt-1／flk-1族と相互作用する能力；およ
び／または (c)細胞移動、細胞生存および／またはアルカリホスフ
ァターゼの細胞内濃度の増大を誘導する能力；の少なくとも１つを示す、請求項１記載のタンパク質。
【請求項３】上記分子が大グリア細胞増殖を誘導する
能力を有する、請求項１または２記載のタンパク質様分
子。
【請求項４】上記分子がヒト由来のものである、請求
項１記載のタンパク質。
【請求項５】上記分子がヒト由来のものでない、請求
項１記載のタンパク質。
【請求項６】上記分子が家畜類、愛玩動物、実験動
物、鳥類、魚または爬虫類由来のものである、請求項５
記載のタンパク質。
【請求項７】上記分子が染色体１１ｑ１３に位置する
遺伝子によってコードされている、請求項５記載のタン
パク質。
【請求項８】ＳＥＱＩＤＮＯ:２に対する類似性の
パーセントが少なくとも約３０％である、請求項１記載
のタンパク質。
【請求項９】ＳＥＱＩＤＮＯ:２に対する類似性
のパーセントが少なくとも約４０％である、請求項１記
載のタンパク質。
【請求項１０】ＳＥＱＩＤＮＯ:２に対する類似性
のパーセントが少なくとも約６０−７０％である、請求
項１記載のタンパク質。
【請求項１１】ＳＥＱＩＤＮＯ:４に記載のアミノ
酸配列、またはそれらの部分、フラグメント、または上
記配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換、
付加された配列を含む、請求項１記載のタンパク質。
【請求項１２】ＳＥＱＩＤＮＯ:６に記載されたア
ミノ酸配列、またはそれらの部分、フラグメント、また
は上記配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置
換、付加された配列を含む、請求項１記載のタンパク
質。
【請求項１３】ＳＥＱＩＤＮＯ:８に記載されたア
ミノ酸配列、またはそれらの部分、フラグメント、また
は上記配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置
換、付加された配列を含む、請求項１記載のタンパク
質。
【請求項１４】ＳＥＱＩＤＮＯ:１０に記載された
アミノ酸配列、またはそれらの部分、フラグメント、ま
たは上記配列において１または数個のアミノ酸が欠失、
置換、付加された配列を含む、請求項１記載のタンパク
質。
【請求項１５】下記の特徴： (i)ＳＥＱＩＤＮＯ:４に記載されたアミノ酸配列また
は、ＳＥＱＩＤＮＯ:２に記載のアミ酸配列に少なく
とも約１５％の類似性を有するが、少なくとも約５％の
非類似性を有し； (ii)少なくとも１つのＶＥＧＦと共通の生物学的性質を
示す；を有する組換体。
【請求項１６】下記の特徴： (i)ＳＥＱＩＤＮＯ:６に記載されたアミノ酸配列また
は、ＳＥＱＩＤＮＯ:２に記載のアミ酸配列に少なく
とも約１５％の類似性を有するが、少なくとも約５％の
非類似性を有し； (ii)少なくとも１つのＶＥＧＦと共通の生物学的性質を
示す；を有する組換体。
【請求項１７】下記の特徴： (i)ＳＥＱＩＤＮＯ:８に記載されたアミノ酸配列また
は、ＳＥＱＩＤＮＯ:２に記載のアミ酸配列に少なく
とも約１５％の類似性を有するが、少なくとも約５％の
非類似性を有し； (ii)少なくとも１つのＶＥＧＦと共通の生物学的性質を
示す；を有する組換体。
【請求項１８】下記の特徴： (i)ＳＥＱＩＤＮＯ:１０に記載されたアミノ酸配列ま
たは、ＳＥＱＩＤＮＯ:２に記載のアミ酸配列に少な
くとも約１５％の類似性を有し、かつ少なくとも約５％
の非類似性を有し； (ii)少なくとも１つのＶＥＧＦと共通の生物学的性質を
示す；を有する組換体。
【請求項１９】下記の特性： (a)血管内皮細胞を誘導する能力； (b)受容体のflt-1／flk-1族と相互作用する能力； (c)細胞移動、細胞生存および／またはアルカリホスフ
ァターゼの細胞内濃度の増大を誘導する能力；の少なくとも１つを有する、請求項１５〜１８のいずれ
か１項記載の組換分子。
【請求項２０】大グリア細胞増殖を誘導する能力を有
する、請求項１５〜１８のいずれか１項記載の組換体。
【請求項２１】上記分子がＳＥＱＩＤＮＯ：６に記
載されたアミノ酸配列を含む請求項２０記載の組換
体。
【請求項２２】ＳＥＱＩＤＮＯ：４に記載のアミノ
酸配列の一部に対応するペプチドフラグメント、または
誘導体またはそれらの化学的均等物。
【請求項２３】ＳＥＱＩＤＮＯ：６に記載の配列を
有する、請求項２２記載のペプチドフラグメント。
【請求項２４】ＳＥＱＩＤＮＯ：８に記載の配列を
有する、請求項２２記載のペプチドフラグメント。
【請求項２５】ＳＥＱＩＤＮＯ：１０に記載の配列
を有する、請求項２２記載のペプチドフラグメント。
【請求項２６】下記の特徴： (i)ＳＥＱＩＤＮＯ:２に記載の配列に少なくとも約１
５％の類似性を有するが、少なくとも約５％の非類似性
を有し； (ii)少なくとも１つの血管内皮成長因子(ＶＥＧＦ)と共
通の性質を示す；を有するタンパク質様分子をコードするヌクレオチド配
列または相補的な配列を含む核酸分子。
【請求項２７】上記タンパク様分子が、下記の特性： (i)血管内皮細胞の増殖を誘導する能力； (ii)受容体のflt-1／flk-1族と相互作用する能力； (iii)細胞移動、細胞生存および／またはアルカリホス
ファターゼの細胞内濃度の増大を誘導する能力；の少なくとも１つを示す、請求項２６記載の核酸分子。
【請求項２８】上記タンパク様分子が大グリア細胞増
殖を誘導する能力を有する、請求項２７記載の核酸分
子。
【請求項２９】上記分子がＳＥＱＩＤＮＯ：６に記
載されたアミノ酸配列をコードする、請求項２８記載の
核酸分子。
【請求項３０】上記分子がヒト由来のものである、請
求項２６記載の核酸分子。
【請求項３１】ＳＥＱＩＤＮＯ：２に対する類似性
の％が少なくとも約３０％である、請求項２６記載の核
酸分子。
【請求項３２】ＳＥＱＩＤＮＯ:３に記載されたヌ
クレオチド配列、またはそれに少なくとも１５％の類似
性を有するヌクレオチド配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ:
３に定義された逆相補性のヌクレオチド配列に低いスト
リンジェントな条件下でハイブリダイズし得るヌクレオ
チド配列(ただし、ヌクレオチド配列はＳＥＱＩＤＮ
Ｏ:３に記載のヌクレオチド配列に少なくとも１５％の
類似性を有するが、３０％の非類似性を有する)を含
む、請求項２６記載の核酸分子。
【請求項３３】ヒトＶＥＧＦのマウス相同体をコード
し、図９に示されたヌクレオチド配列を含む、請求項２
６記載の核酸分子。
【請求項３４】請求項１〜３および１１のいずれか１
項記載のタンパク様分子、および１またはそれ以上の医
薬的に許容され得る担体および／または希釈剤を含む、
医薬組成物。
【請求項３５】下記の特徴： (i)ＳＥＱＩＤＮＯ:２に記載の配列に少なくとも約１
５％の類似性を有するが、少なくとも約５％の非類似性
を有するアミノ酸配列を含み； (ii)少なくとも１つの血管内皮成長因子(ＶＥＧＦ)と共
通の生物学的性質を示す；を有する組換分子の製造方法であって、上記方法が、上
記組換分子を合成するのに効果的な条件下で適当な宿主
細胞によって、上記組換分子をコードする核酸分子を発
現させ、ついで上記分子を分離することを含むことを特
徴とする方法。
【請求項３６】上記核酸分子が、ＳＥＱＩＤＮＯ:
３に実質的に記載されたヌクレオチド配列、またはそれ
に少なくとも１５％の類似性を有するヌクレオチド配
列、またはＳＥＱＩＤＮＯ:３に逆相補性のヌクレオ
チド配列に低いストリンジェントな条件下でハイブリダ
イズし得るヌクレオチド配列(ただし、上記ヌクレオチ
ド配列はＳＥＱＩＤＮＯ:３に記載のヌクレオチド配
列に少なくとも１５％の類似性を有するが、３０％の非
類似性を有する)を含むものである、請求項３５記載の
方法。
【請求項３７】哺乳動物(人を除く)における大グリア
細胞の増殖方法であって、上記方法が、上記哺乳動物
に、下記の特徴： (i)ＳＥＱＩＤＮＯ:２に記載の配列に少なくとも約１
５％の類似性を有するが、少なくとも約５％の非類似性
を有するアミノ酸配列を含み； (ii)少なくとも１つの血管内皮成長因子(ＶＥＧＦ)と共
通の性質を示す; を有する組換タンパク質の有効量を投与し、上記投与が
大グリア細胞の増殖を誘導するのに適切な期間および条
件下で行われることを特徴とする方法。
【請求項３８】上記組換タンパク質がＳＥＱＩＤＮ
Ｏ：３に記載されたアミノ酸配列、または上記配列にお
いて１または数個のアミノ酸が欠失、置換、付加された
配列を含む、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】上記組換タンパク質がＳＥＱＩＤＮ
Ｏ：６に記載されたアミノ酸配列、または上記配列にお
いて１または数個のアミノ酸が欠失、置換、付加された
配列含む、請求項３７記載の方法。
【請求項４０】哺乳動物(人を除く)におけるニューロ
ンの生存および／または増殖を促進する方法であって、
上記方法が、上記哺乳動物に、下記の特徴： (i)ＳＥＱＩＤＮＯ:２に記載の配列に少なくとも約１
５％の類似性を有するが、少なくとも約５％の非類似性
を有するアミノ酸配列を含み； (ii)少なくとも１つの血管内皮成長因子(ＶＥＧＦ)と共
通の性質を示す; を有する組換タンパク質の有効量を投与し、上記投与が
大グリア細胞の増殖を誘導するのに適切な期間および条
件下で行われることを特徴とする方法。
【請求項４１】上記組換タンパク質がＳＥＱＩＤＮ
Ｏ：３に記載されたアミノ酸配列、または上記配列にお
いて１または数個のアミノ酸が欠失、置換、付加された
配列を含む、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】上記組換タンパク質がＳＥＱＩＤＮ
Ｏ：６に記載されたアミノ酸配列、または上記配列にお
いて１または数個のアミノ酸が欠失、置換、付加された
配列を含む、請求項４０記載の方法。
【請求項４３】有効成分として、下記の特徴： (i)ＳＥＱＩＤＮＯ:２に記載の配列に少なくとも約１
５％の類似性を有するが、少なくとも約５％の非類似性
を有するアミノ酸配列を含み； (ii)少なくとも１つの血管内皮成長因子(ＶＥＧＦ)と共
通の性質を示す; を有する組換タンパク質の有効量を含む、哺乳動物にお
ける大グリア細胞の増殖するための医薬組成物。
【請求項４４】上記組換タンパク質がＳＥＱＩＤＮ
Ｏ：３に記載されたアミノ酸配列、または上記配列にお
いて１または数個のアミノ酸が欠失、置換、付加された
配列を含む、請求項４３記載の医薬組成物。
【請求項４５】上記組換タンパク質がＳＥＱＩＤＮ
Ｏ：６に記載されたアミノ酸配列、または上記配列にお
いて１または数個のアミノ酸が欠失、置換、付加された
配列を含む、請求項４３記載の医薬組成物。
【請求項４６】有効成分として、下記の特徴： (i)ＳＥＱＩＤＮＯ:２に記載の配列に少なくとも約１
５％の類似性を有するが、少なくとも約５％の非類似性
を有するアミノ酸配列を含み； (ii)少なくとも１つの血管内皮成長因子(ＶＥＧＦ)と共
通の性質を示す; を有する組換タンパク質の有効量を含む、哺乳動物にお
けるニューロンの生存および／または増殖を促進するた
めの医薬組成物。
【請求項４７】上記組換タンパク質がＳＥＱＩＤＮ
Ｏ：３に記載されたアミノ酸配列、または上記配列にお
いて１または数個のアミノ酸が欠失、置換、付加された
配列を含む、請求項４６記載の医薬組成物。
【請求項４８】上記組換タンパク質がＳＥＱＩＤＮ
Ｏ：６に記載されたアミノ酸配列、または上記配列にお
いて１または数個のアミノ酸が欠失、置換、付加された
配列を含む、請求項４６記載の医薬組成物。