FI120313B - TIE-2-ligandit, niiden valmistusmenetelmät ja käytöt - Google Patents

Description

5

Tie-2-ligandit, niiden valmistusmenetelmät ja käytöt - ΤΪΕ-2-ligander, metoder för framställning av dem och andvändning av dem Tämä kansainvälinen patenttihakemus pyytää etuoikeutta samaan aikaan jätetyistä yhdysvaltalaisista hakemuksista, sarjanro 418 595, jätetty 6.4.1995 ja US sarjanro 373 579, jätetty 17.1.1995 ja US sarjanro 353 503, jätetty 9.12.1994 ja US sar-10 janro 348 492, jätetty 2.12.1994 ja US sarjanro 330 261, jätetty 27.10.1994 ja US sarjanro 319 932, jätetty 7.10.1994, joista jokaisen sisältö on liitetty tähän viitteeksi. Läpi tämän hakemuksen on viitattu erilaisiin julkaisuihin. Näiden julkaisuiden esitykset on kokonaisuudessaan liitetty viitteek-15 si tähän hakemukseen.

Johdanto Tämä keksintö koskee yleisesti geenitekniikan aluetta ja aivan 20 erityisesti tyrosiinikinaasien reseptorin geenejä ja niiden samaa alkuperää olevia ligandeja, niiden insertiota rekombi-nantti DNA-vektoreihin ja koodattujen proteiinien tuottoa vastaanottavissa mikro-organismikannoissa ja vastaanottavissa eukaryoottisissa soluissa. Aivan erityisesti, tämä keksintö 25 koskee uusia ligandeja, jotka tunnetaan TIE-2-ligandeina, jotka sitovat TIE-2-reseptorin, samoin kuin menetelmiä valmistaa ja käyttää TIE-2-ligandeja. Keksintö koskee edelleen nukleii-nihapposekvenssejä, jotka koodaavat TIE-2-ligandeja, ja menetelmät luoda nukleiinihappoja, jotka koodaavat TIE-2-ligandeja 30 ja niiden geenituotteita. TIE-2-ligandit, samoin kuin niitä koodaavat nukleiinihapot voivat olla hyödyllisiä tiettyjen sairauksien, joihin liittyy endoteelisoluja ja niihin liittyneitä TIE-reseptoreita, diagnoosissa ja käsittelyssä, kuten kasvainsairaudet, joihin sisältyy kasvaimen verisuonten kehit-35 tyminen, haavan paranemimen, veritukkotulppaumasairaudet, ate-roskleroosi ja tulehdussairaudet. Yleisemmin, biologisesti aktiiviisia TIE-2-ligandeja voidaan käyttää edistämään TIE-2-reseptoria ekspressoivien solujen kasvua, selviämistä ja/tai 2 erilaistumista. Biologisesti aktiivista TIE-2-ligandia voidaan käyttää TIE-2-reseptoria ekspressoivien solujen in vitro ylläpitämiseen viljelmässä. Soluihin ja kudoksiin, jotka ekspres-soivat TIE-2-reseptoria, kuuluu esimerkiksi sydämen ja veri-5 suonen endoteelisoluja, linssin epiteeli ja sydänpussin sisä-lehti. Vaihtoehtoisesti sellaista ligandia voidaan käyttää ylläpitämään soluja, joita on manipuloitu ekspressoimaan TIE- 2-reseptoria. Lisäksi TIE-2-ligandit ja niiden kanssa samaa alkuperää olevaa reseptoria voidaan käyttää määrityssysteemei-10 sssä tunnistamaan TIE-2-reseptorin agonisteja tai antagonisteja.

Keksinnön taustaa 15 Solun käyttäytymistä, joka on vastuussa erilaistuneiden solujen ja kudosten kehittymisestä, ylläpidosta ja korjauksesta, säätelee suureksi osaksi solun sisäiset signaalit, joita kasvutekijät ja samanlaiset ligandit ja niiden reseptorit kuljettavat. Reseptorit sijaitsevat vastesolujen pinnalla ja ne si-. 20 tovat peptidejä tai polypeptidejä, jotka tunnetaan kasvuteki-jöinä, samoin kuin muut hormonin kaltaiset ligandit. Tämän vuorovaikutuksen tulokset ovat nopeita biokemiallisia muutoksia vastesoluissa, samoin kuin solun geeniekspression nopea ja pitkänajan uudelleen säätely. Useat reseptorit, jotka liitty-25 vät erilaisiin solupintoihin, voivat sitoa erityisiä kasvutekijöitä.

Tyrosiinien fosforylaatio proteiineihin tyrosiinikinaaseilla on eräs avaintapa, jolla signaalit transdusoidaan plasmamemb-30 raanin yli. Useat tällä hetkellä tunnetut proteiinin tyrosii-nikinaasin geenit koodaavat polypeptidikasvuteki jöiden ja hormonien, kuten epidermikasvutekijä (EGF), insuliini, insuliinin kaltainen kasvuteki jä-I (IGF-I), verihiutaleesta johdetut kasvutekijät (PDGF-A ja -B), ja fibroblastikasvutekijät (FGF), 35 transmembraanireseptoreja, (Heidin et ai., Cell Regulation, 1: 555-566 (1990); Ullrich, et ai.. Cell, 61; 243-54 (1990)).

Jokaisessa tapauksessa nämä kasvutekijät panevat liikkeelle toimintansa sitoutumalla niiden samaa alkuperää olevien resep- 3 torien solunulkoisiin osiin, mikä johtaa reseptorin sytoplas-misessa osassa olevan sisäisen tyrosiinikinaasin aktivaatioon. Endoteelisolujen kasvutekijäreseptorit ovat erittäin kiinnostavia johtuen kasvutekijöiden mahdollisesta sekaantumisesta 5 lukuisiin tärkeisiin fysiologisiin ja patologisiin prosesseihin, kuten suoniston muodostuminen, verisuonten kehittyminen, ateroskleroosi ja tulehdukselliset sairaudet. (Folkman, et ai., Science, 235: 442-447 (1987)). Useiden veren muodostumiseen liittyvien kasvutekijöiden reseptorit ovat myös tyrosii-10 nikinaaseja; näihin sisältyvät c-fms, joka on colony stimulating factor 1 (verisolujen kasutekijä) reseptori, Sherr, et ai., Cell, 41: 665-676 (1985) ja c-kit, primitiivinen veren muodostumiseen liittyvä kasvutekijän reseptori, josta Huang et ai., ovat raportoineet, Cell, 63: 225-33 (1990).

15

Reseptorityrosiinikinaasit on jaettu evolutiivisiin alaperhei-siin, jotka perustuvat niiden ektodomeenien tunnusomaiseen rakenteeseen. (Ullrich, et ai., Cell, 61: 243-54 (1990)). Sellaisiin alaperheisiin kuuluu EGF reseptorin kaltainen kinaasi 20 (alaluokka I) ja insuliinireseptorin kaltainen kinaasi (alaluokka II), joista jokaisessa on toistuvia homologisia kyste-iinirikkaita sekvenssejä niiden solunulkoisissa domeeneissa. Yksittäinen kysteiini-rikas alue on myös eph-kaltaisten ki-naasien solunulkoisissa domeeneissa. Hirai, et ai., Science, 25 238: 1717-1720 (1987),· Lindberg, et ai., Mol. Cell. Biol., 10: 6316-24 (1990); Lhotak, et ai., Mol. Cell. BIol. 11: 2496-2502 (1991). PDGF-reseptorit, samoin kuin c-fms- ja c-kit-resepto-rityrosiinikinaasit voidaan ryhmittää alaluokaksi III; kun taas FGF-reseptorit muodostavat alaluokan IV. Molempien näiden 30 alaluokkien jäsenille ovat tyypillisiä solunulkoiset laskos-yksiköt, joita stabiloi ketjujen väliset disulfidisidokset. Näitä niin kutsuttuja immunoglobuliinin (Ig) kaltaisia laskok-sia on immunoglobuliinin superperheen proteiineissa, joissa on runsaasti muita solupinnan reseptoreita, joissa on joko solu-35 sitoutuneita tai liukoisia ligandeja. Williams, et ai., Ann. Rev. Immunol., 6: 381-405 (988).

4

Reseptorityrosiinikinaasit eroavat niiden spesifisyydessä että affiniteetissä. Yleensä reseptorityrosiinikinaasit ovat glyko-proteiineja, jotka koostuvat (1) solunulkoisesta domeenista, joka kykenee sitomaan spesifisen (spesifisiä) kasvutekijän 5 (-tekijöitä); (2) transmembraanidomeenista, joka tavallisesti on proteiinin alfa-helikaalinen osa; (3) juxtamembraanido-meenista, missä reseptoria voidaan säädellä, esim. proteiini-fosforylaatiolla? (4) tyrosiinikinaasidomeenista, joka on ent-symaattinen reseptorikomponentti; ja (5) karboksiterminaali-10 sesta hännästä, joka monissa reseptoreissa liittyy tyrosiisii-nikinaasin substraattien tunnistamiseen ja sitomiseen.

Prosessien, kuten vaihtoehtoisen eksonin pilkkomisen ja gee-nipromoottorin tai polyadenylaatiokohtien vaihtoehtoisen va-15 linnan, on raportoitu kykenevän tuottamaan useita erillisiä polypeptidejä samasta geenistä. Nämä polypeptidit saattavat tai eivät ehkä sisällä erilaisia edellä luetteloituja domee-neja. Sen mukaisesti joitakin solunulkoisia domeeneja voidaan ekspressoida erillisinä, eritettyinä proteiineina ja joistakin 20 reseptorien muodoista saattaa puuttua tyrosiinikinaasidomeeni t ja sisältää vain solunulkoisen domeenin, joka on insertoitu plasmamembraaniin transmembraanidomeenin kautta, plus lyhyt karboksiterminaalinen häntä.

25 Partanen et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 87: 8913-8917 (1990), kuvasivat geenin, joka koodaa endoteelistä solun transmembraanityrosiinikinaasia, alunperin tunnistettu RT-PCR: llä tuntemattomaksi tyrosiinikinaasiksi, joka on homologinen ihmisen leukemiasolujen cDNA-fragmentin kanssa. Tätä geeniä ja 30 sen koodaamaa proteiinia kutsutaan "tie":ksi, mikä on lyhennys "tyrosiinikinaasi, jossa on Ig- ja EGF-homologiadoraeenit". Partanen et ai., Mol. Cell. Biol. 12: 1698-1707 (1992).

On raportoitu, että tie mRNA:ta on kaikissa ihmisen sikiön ja 35 hiiren alkion kudoksissa. Tutkimisen jälkeen tie-lähetti on paikallistettu sydämen ja verisuonen endoteelisoluihin. tie mRNA on paikallistettu verisuonten endoteeliin ja 9,5-18,5 d vanhojen hiiren alkioiden sydämen sisäkalvoon. Lisääntynyttä 5 tie-ekspressiota osoitettiin uudissuonittumisen aikana, mikä liittyi kehittyviin munasarjan rakkuloihin ja verisuonirikkaan kudoksen muodostuminen ihohaavojen pohjalle. Korhonen et ai., Blood 80s 2548-2555 (1992). Täten tiesllä on ehdotettu olevan 5 osuus verisuonten kehittymisessä, mikä on tärkeätä kehitettäessä hoitoja kiinteille kasvaimille ja useille muille verisuonten kehittymisestä riippuville sairauksille, kuten sokeritautiin liittyvä verkkokalvon sairaus, psoriaasi, ateroskle-roosi ja niveltulehdus.

10

Kahden rakenteellisesti samanlaisen rotan TIE-reseptoriprote-iinin on raportoitu olevan erillisten geenien, joilla on samankaltaiset ekspressioprofiilit, koodaamaa. Yksi geeni, jota nimitetään tie-1:ksi, on rotan homologi ihmisen tie:stä. Mails sonpierre, et ai., Oncogene 8: 1631-1637 (1993). Toinen geeni, tie-2, voi olla rotta-homologi hiiren tek-aeenistä. jonka, kuten tie:n, on raportoitu ekspressoituvan hiiressä ainoastaan endoteelisoluissa ja niiden oletettavissa kantaisissä. Dumont, et ai., Oncogene 8; 1293-1301 (1993).

20

Molempien geenien havaittiin ekspressoituvan laajasti alkion ja syntymän jälkeisten kudosten endoteelisoluissa. Merkittäviä tie-2-tason transkriptejä oli myös muissa alkiosolupopulaati-oissa, linssin epiteeli, sydämen sydänpussin sisälehti ja me-25 senkyymin alueet mukaanleuttuna. Maisonperre, et ai., Oncogene 8: 1631-1637 (1993).

TIE-reseptorin vallitseva ekspressio verisuonen endoteelissä antaa olettaa, että TIE:llä on osuus verisuonisysteemin kehit-30 tymisessä ja ylläpitämisessä. Tähän voisi kuulua osuudet endo-teelisolun määrittämisessä, lisääntymisessä, erilaistumisessa ja solun vaelluksessa ja mallin mukaan verisuonielementeiksi tekemisessä. On raportoitu, että sellaisten hiirialkioiden tutkimukset, joista puuttui TIE-2, osoittivat että se on tär-35 keä verisuonten kehittymisessä, erityisesti verisuoniverkoston muodostumiselle endoteelisoluissa. Sato, T.N., et ai., Nature 376: 70-74 (1994). Valmiissa verisuonisysteemissä TIE voisi 6 toimia endoteelisolun selviämisessä, ylläpidossa ja vasteessa patogeenisille vaikutuksille.

Keksinnön yhteenveto Tämä keksintö antaa koostumuksen, jossa on TIE-2-5 ligandi, jossa ei olennaisesti ole proteiineja. Keksintö antaa myös eristetyn nukleiinihappomolekyylin, joka koodaa TIE-2-ligandia. Eristetty nukleiinihappo voi olla DNA, cDNA tai RNA. Keksintö antaa myös vektorin, jossa on eristetty nukleiinihappomolekyyli, 10 joka koodaa TIE-2-ligandia. Keksintö antaa edelleen isäntävektorisysteemin tuottamaan polypeptidiä, jolla on TIE-2- ligandin biologinen aktiivisuus, sopivassa isäntäsolussa. Sopiva isäntäsolu voi olla bakteeri-, hiiva-, hyönteis- tai nisäkässolu. Keksintö antaa myös 15 menetelmän tuottaa polypeptidiä, jolla on TIE-2-ligandin biologinen aktiivisuus, mihin sisältyy isäntävektorisysteemin solujen kasvattaminen olosuhteissa, jotka sallivat polypeptidin tuoton ja siten tuotetun polypeptidin talteenoton.

20 Keksintö, joka on tässä kuvattu eristetyksi nukleiinihappomolekyyliksi, joka koodaa TIE-2-ligandia, antaa edelleen ligandin, fragmentin tai sen johdannaisen tai toisen molekyylin, joka on reseptoriagonisti tai antagonisti, kehittämisen 25 hoidoksi käsittelemään potilaita, joilla on häiriöitä soluissa, kudoksissa tai elimissä, jotka ekspressoivat TIE-reseptoria. Tämä keksintö antaa myös vasta-aineen, joka spesifisesti sitoo sellaisen hoitavan molekyylin. Vasta-aine voi olla monoklonaalinen tai 30 polyklonaalinen. Keksintö antaa myös menetelmän käyttää sellaista monoklonaalista tai polyklonaalista vasta-ainetta mittaamaan hoitavan molekyylin määrää näytteessä, joka on otettu potilaasta tarkoituksiin . ·. tarkkailla hoidon kulkua.

35 Tämä keksintö antaa myös vasta-aineen, joka spesifisesti sitoo TIE-2-ligandin. Vasta-aine voi olla monoklonaalinen tai polyklonaalinen. Täten keksintö antaa edelleen terapeuttisia koostumuksia, jotka käsittävät vasta-aineen, joka spesifisesti sitoo TIE-2-40 ligandia, farmaseuttisesti hyväksyttävässä kantajassa.

7

Keksintö antaa myös menetelmän blokata verisuonten kasvua nisäkkäässä antamalla tehokkaan määrän hoitavaa koostumusta, joka käsittää vasta-aineen, joka sitoo spesifisesti TIE- 2-ligandin, farmaseuttisesti 5 hyväksyttävässä kantajassa.

Keksintö antaa edelleen hoitavat koostumukset, joissa on TIE-2-ligandi farmaseuttisesti hyväksyttävässä kantajassa. Keksintö antaa myös menetelmän edistää uudissuonittumista potilaassa antamalla tehokkaan 10 määrän koostumusta, joka käsittää TIE-2-ligandin farmaseuttisesti hyväksyttävässä kantajassa. Eräässä suoritusmuodossa keksintöä voidaan käyttää edistämään haavan paranemista. Eräässä toisessa suoritusmuodossa menetelmää voidaan käyttää hoitamaan iskemiaa.

15 Vaihtoehtoisesti, keksinnön mukaan TIE-2-ligandi voidaan konjugoida sytotoksiseen aineeseen ja siitä valmistetaan hoitava koostumus. Keksintö antaa edelleen reseptoriaineen, joka spesifisesti sitoo TIE-2-ligandin. Keksintö antaa edelleen hoitavat 20 koostumukset, joissa on reseptoriaine joka spesifisesti sitoo TIE-2-ligandin farmaseuttisesti hyväksyttävään kantajaan. Keksintö antaa myös menetelmän blokata verisuonten kasvua nisäkkäässä antamalla tehokkaan määrän hoitavaa koostumusta, joka käsittää 25 reseptoriaineen, joka spesifisesti sitoo TIE-2-ligandin ; farmaseuttisesti hyväksyttävään kantajaan.

Keksintö antaa myös TIE-2-reseptoriantagonistin, samoin kuin menetelmän inhiboida TIE-2-ligandin biologista . aktiivisuutta nisäkkäässä, mihin sisältyy, että 30 annetaan nisäkkäälle tehokas määrä TIE-2-antagonistia.

Keksinnön mukaisesti antagonisti voi olla vasta-aine tai muu molekyyli, joka kykenee spesifisesti sitomaan joko TIE-2-ligandin tai TIE-2-reseptorin. Antagonisti ! : voi esimerkiksi olla TIE-2-reseptoriaine.

35 Piirrosten lyhyt kuvaus

Kuviot IA ja IB - TIE-2-reseptoriaine (TIE-2 RB) inhiboi verisuonten kehittymisen kanan alkion rakkokalvomembraanissa (CAM). Yksittäinen pala itseensä imevää gelatiinivaahtoa (Gel 8 foam), johon imeytettiin 6 μg RB:tä, insertoitiin välittömästi 1 d kanan alkioiden CAM:n alle. Kolmen päivän lisäinkubaation jälkeen 4 d vanhat alkiot ja ympäröivä CAM poistettiin ja tutkittiin. Kuvio IA: alkiot, jotka oli käsitelty EHK-1 RB:llä 5 (rEHK-l ecto / h IgGl Fc) olivat eläviä ja niillä oli normaalisti kehittyneet verisuonet niitä ympäröivässä CAM:ssa. Kuvio IB: kaikki alkiot, jotka oli käsitelty TIE-2 RB:llä (r TIE-2 ecto / h IgGl Fc) olivat kuolleet, pienentyneet kooltaan ja olivat melkein täydellisesti vailla ympäröiviä verisuonia.

10

Kuvio 2 - Vektori pJFE14.

Kuvio 3 - IgtlO:n restriktiokartta.

15 Kuvio 4 - Nukleiinihappo- ja johdetut aminohappo- (yhden kirjaimen koodi) sekvenssit ihmisen TIE-2-ligandista kloonista AgtlO, joka koodaa htie-2-ligandi i:tä.

Kuvio 5 - Nukleiinihappo- ja johdettu aminohappo- (yhden kir-, 20 jaimen koodi) sekvenssit ihmisen TlE-2-ligandista kloonista T98G.

Kuvio 6 - Nukleiinihappo- ja johdettu aminohappo- (yhden kirjaimen koodi) sekvenssit ihmisen TIE-2-ligandista kloonista 25 pBluescript KS, joka koodaa ihmisen TIE 2-ligandi 2:ta.

Kuvio 7 - Western blot, joka osoittaa TIE-2-reseptorin aktivaation TIE-2-ligandi l:llä (raita LI), mutta ei TIE-2-ligandi 2:11a (raita L2) tai kontrolli (vale).

30

Kuvio 8 - Western blot, joka osoittaa että ennen HAEC-solujen esikäsittely ylimäärällä TIE-2-ligandi 2:ta (raita 2) antago-nisoi laimean TIE-2-ligandi l:n myöhemmän kyvyn aktivoida TIE- 2-reseptori (TIE2-R) verrattuna HAEC-solujen esikäsittelyä 35 VALE-alustalla (raita 1).

Kuvio 9 - Histogrammiesitys TIE2-ligandin C2C12 ras, Rat2 ras, SHEP ja T98G sitoutumisesta rotan TIE2 IgG immobilisoituun 9 pintaan konsentroidussa (lOx) •’konditioidussa" (toisten solujen avulla rikastettu alusta) alustassa. Rat TIE2 (rTIE2) spesifinen sitoutuminen on osoitettu merkittävällä sitomisaktii-visuuden vähenemisellä 25 Mg/ml liukoisen rotta TIE2 RB:n läs-5 näollessa verrattuna vähäiseen vähennykseen liukoisen trkB RB:n läsnäollessa.

Kuvio 10 - Rekombinantti ihmisen TIE-2-ligandi l:n (hTLl) ja ihmisen TIE-2-ligandi 2;n (hTL2) sitoutuminen cos-solusuper-10 natanteissa ihmisen TIE-2 RB immobilisoituun pintaan. Ihmisen TIE-2 spesifinen sitoutuminen määritettiin inkuboimalla näytteitä 25 β9/ΤΛΐ kanssa, joko liukoista ihmisen TIE2 RB:tä tai trkB RB:tä; merkittävä väheneminen sitomisaktiivisuudessa havaittiin vain näytteille, joita inkuboitiin ihmisen TIE2 RB:n 15 kanssa.

Kuvio 11 - Western blot, joka osoittaa TIE-2-reseptoriaineen (merkitty TIE-2 RB tai kuten tässä, TIE2-Fc) blokkaavan TIE-2-reseptorien aktivaation TIE-2-ligandi l:llä (TI1) HUVEC-so-20 luissa, kun taas yhteenkuulumaton reseptoriaine (TRKB-Fc) ei blokkaa tätä aktivaatiota.

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus 25 Kuten alla kuvataan yksityiskohtaisemmin, ovat hakijat eristäneet ekspressiokloonauksella uuden ligandin, joka sitoo TIE- 2-reseptorin. Tämä keksintö koostuu TIE-2-ligandista, samoin kuin sen aminohapposekvenssistä ja myös toiminnallisesti ekvivalenteista molekyyleistä, joissa aminohappo jäännöksiä susbti-30 tuoidaan jäännöksiin sekvenssissä, mikä johtaa hiljaiseen muutokseen. Esimerkiksi yksi tai useampi aminohappojäännös sekvenssissä voidaan substituoida toisella (toisilla) aminohapolla (-hapoilla), joilla on sama polaarisuus, mikä toimii toiminnallisena ekvivalenttina johtaen hiljaiseen muutokseen. 35 Substituutiot aminohappoihin sekvenssissä voidaan valita sen luokan, mihin aminohappo kuuluu, jäsenistä. Esimerkiksi ei-poolisten aminohappojen (hydrofobinen) luokkaan kuuluvat ala-niini, leusiini, isoleusiini, väliini, proliini, fenyyliala- 10 niini, tryptofaani ja metioniini. Poolisiin neutraaleihin aminohappoihin kuuluvat glysiini, seriini, treoniini, kysteiini, tyrosiini, asparagiini ja glutamiini. Positiivisesti varautuneisiin (emäksisiin) aminohappoihin kuuluvat arginiini, lysii-5 ni ja histidiini. Negatiivisesti varautuneisiin (happamiini) aminohappoihin kuuluvat aspartiinihappo ja glutamiinihappo. Keksinnön piiriin kuuluvat myös proteiinit tai niiden fragmentit tai johdannaiset, joilla on sama tai samanlainen biologinen aktiivisuus, tai johdannaiset, jotka ovat tunnusmerkilli-10 sesti modifioitu translaation aikana tai sen jälkeen, esim. glykosylaatiolla, proteolyyttisellä pilkkomisella, sidoksella vasta-ainemolekyyliin tai muihin solun ligandeihin, jne.

Tämä keksintö käsittää myös nukleotidisekvenssin, joka koodaa 15 proteiinia, joka on tässä kuvattu TIE-2-ligandi l:ksi, samoin kuin solut, joita on geneettisesti manipuloitu tuottamaan proteiinia, esim. transfektiolla, transduktiolla, infektiolla, elektroporaatiolla tai tässä kuvatun TIE-2-ligandi l:tä koo-daavan nukleiinihapon mikroinjektiolla sopivaan ekspressiovek-20 toriin.

Tämä keksintö käsittää edelleen nukleotidisekvenssin, joka koodaa proteiinia, joka on tässä kuvattu TIE-2-ligandi 2:ksi, samoin kuin solut, joita on geneettisesti manipuloitu tuotta-25 maan proteiinia, esim. transfektiolla, transduktiolla, infektiolla, elektroporaatiolla tai tässä kuvatun TIE-2-ligandi l:tä koodaavan nukleiinihapon mikroinjektiolla sopivaan eks-pressiovektoriin.

30 Ammattimies käsittää myös, että tämä keksintö sisältää DNA- ja RNA-sekvenssit, jotka hybridisoituvat johdettuun TlE-2-ligan-dia koodaavaan sekvenssiin kohtalaisesti tiukennetuissa olosuhteissa, kuten esimerkiksi Sambrook, et ai., ovat kuvanneet, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. toim. voi. 1, ss. 35 101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Täten keksinnön tarkastelemaan nukleiinihappomolekyyliin sisältyy sellainen nukleiinihappomolekyylii, jossa on sekvenssi, joka on johdettu TIE-2--ligandin aminohapposekvenssistä, joka on 11 valmistettu kuten tässä on kuvattu, samoin kuin molekyyli, jossa on nukleiinihappojen sekvenssi, joka hybridisoituu sellaiseen nukleiinihapposekvenssiin, ja myös nukleiinihapposek-venssi, joka on degeneroitunut edellä olevista sekvensseistä 5 geneettisen koodin seurauksena, mutta joka koodaa ligandia, joka sitoo TIE-2-reseptorin.

Mitä tahansa ammattimiehelle tunnettua menetelmää insertoida DNA-fragmentit vektoriin voidaan käyttää rakentamaan eks-10 pressiovektoreita, jotka koodaavat TIE-2-ligandia, käyttämällä sopivia transkriptionaalisia/translationaalisia kontrollisig-naaleja ja proteiinia koodaavia sekvenssejä. Näihin menetelmiin kuuluvat in vitro rekombinantti-DNA- ja synteettiset tekniikat ja in vivo rekombinaatiot (geneettinen rekombinaatio). 15 TIE-2-ligandia tai sen peptidifragmenttia koodaavan nukleii-nihapposekvenssin ekspressiota voidaan säädellä toisella nuk-leiinihapposekvenssillä siten, että proteiinia tai peptidiä ekspressoidaan isännässä, joka on transformoitu rekombinantti DNA-molekyylillä. Esimerkiksi tässä kuvatun TIE-2-ligandin 20 ekspressiota voidaan kontrolloida millä tahansa alalla tunnetulla promoottori/vahvistajaelementillä. Promoottoreihin, joita voidaan käyttää kontrolloimaan ligandin ekspressiota, kuuluu, mutta ei rajoitu, pitkä terminaalinen toistuma, kuten Squinto et ai., ovat kuvanneet (Cell 65: 1-20 (1991)); SV40 25 aikainen promoottorialue (Bernoist ja Chambon, Nature 290: 304-310), CMV-promoottori, M-MuLV 5' terminaalinen toistuma, promoottori joka on Rous sarcoma viruksen 3' pitkässä terminaalisessa toistumassa (Yamamoto, et ai., Cell 22: 787-797 (9180)), herpes tymidiinikinaasipromoottori (Wagner et ai., 30 Proc. Natl. Acad. Sei, USA 78: 144-1445 (1981)), adenovirus-promoottori, metallotioeenigeenin säätelysekvenssit (Brinster et ai., 296: 39-42 (1982)); prokaryoottiset ekspressiovekto-rit, kuten B-laktamaasipromoottori (Villa-Kamaroff, et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75: 3727-3731 (1978)), tac-promoot-35 tori (DeBoer, et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80: 21-25 (1983)), katso myös Scientific American, 242: 74-94 (1980), "Useful proteins from recombinant bacteria"; promoottoriele-mentit hiivasta tai muista sienistä, kuten Gal 4 promoottori, 12 ÄDH- (alkoholi- dehydrogenaasi) promoottori, PGK- (fosfogly-serolikinaasi) promoottori, alkaalinen fosfataasipromoottori ja seuraavat eläimen transkription kontrollialueet, joilla on kudosspesifisyyttä ja on käytetty transgeenisissä eläimissä: 5 elastaasi I geenin kontrollialue, joka on aktiivinen haiman asinaarisoluissa (Swift et ai., Cell 38: 639-646 (1984); or-nitz et ai., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399-409 (1986); MacDonald, Hepatology 7: 425-515 (1987); insuliinigee-nin kontrollialue, joka on aktiivinen haiman beta-soluissa 10 (Hanahan, Nature 315: 115-122 (1985)), immunoglobuliinigeenin kontrollialue, joka on aktiivinen lymfoidisoluissa (Grosschedl et ai., 1984, Cell 38: 647-658; Adames et ai., 1985, Nature 318: 533-538; Alexander et ai., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 1436-1444), hiiren rintatumoriviruksen kontrollialue, joka on 15 aktiivinen kiveksen, rinnan, imukudos- ja syöttösoluissa (Le-der et ai., 1986, Cell 45: 485-495), albumiinigeenin kontrollialue, joka on aktiivinen maksassa (Pinkert et ai., 1987, Genes and Devel. 1: 268-276), alfa-fetoproteiinigeenin kontrollialue, joka on aktiivinen maksassa (Krumlauf et ai., 1985, 20 Mol. Cell. Biol. 5: 1639-1648; Hammer et ai., 1987, Science 235: 53-58); alfa-l-antitrypsiinigeenin kontrollialue, joka on aktiivinen maksassa (Kelsey et ai., 1987, Genes and Devel. l: 161-171), beta-globiinigeenin kontrollialue, joka on aktiivinen myeloidisoluissa (Mogram et ai., 1985, Nature 315: 338-25 340; Kollias et ai., 1986, Cell 46: 89-94); myeliinin emäksi sen proteiinin geenikontrollialue, joka on aktiivinen oligo-dendrosyyttisoluissa aivoissa (Readhead et ai., 1987, Cell 48: 703-712); myosiini kevytketju-2 geenikontrollialue, joka on aktiivinen luustoon kiinnittyneessä lihaksessa (Shani, 1985, 30 Nature 314: 283-286) ja gonadotrooppinen vapauttava hormooni-geenin kontrollialue, joka on aktiivinen alanäkökukkulassaa (Mason et ai., 1986, Science 234: 1372-1378). Keksintö käsittää lisäksi antisense-yhdisteiden tuoton, jotka kykenevät spesifisesti hybridisoitumaan RNA-sekvenssin kanssa, joka koodaa 35 ΤΙΕ-2-ligandia moduloimaan sen ekspressiota (Ecker, US patentti nro 5 166 195, julkaistu 24.11.1992).

13 Täten keksinnön mukaisesti käytetään ekspressiovektoreita, jotka kykenevät replikoi tumaan bakteeri- tai eukaryootti-isän-nässä, joissa on TIE-2-ligandia koodaava nukleiinihappo, kuten tässä on kuvattu, transfektoimaan isäntää ja täten sellaisen 5 nukleiinihapon ekspressiota tuottamaan TIE-2-ligandi, joka voidaan sitten ottaa talteen biologisesti aktiivisessa muodossa. Kuten tässä on käytetty, biologisesti aktiiviseen muotoon kuuluu muoto, joka kykynee sitomaan TIE-2-reseptorin ja aiheuttamaan biologisen vasteen, kuten erilaistunut toiminta tai 10 reseptoria ekspressoivan solun fenotyyppiin vaikuttaminen. Sellaiset biologisesti aktiiviset muodot indusoisivat esimerkiksi TIE-2-reseptorin tyrosiinikinaasin fosforylaation.

Ekspressiovektorit, joissa on geeni-insertit, voidaan tunnis-15 taa neljällä yleisellä lähestymistavalla: (a) DNA-DNA-hybri-disaatiolla, (b) "markkeri"-geenitoimintojen läsnäololla tai puuttumisella, (c) insertoitujen sekvenssien ekspressiolla ja (d) PCR-havaitsemisella. Ensimmäisessä lähestymistavassa vieraan geenin läsnäolo ekspressiovektorissa voidaan havaita DNA-: 20 DNA-hybridisaatiolla käyttämällä koettimia, joissa on sekvens sejä, jotka ovat homologisia insertoidun TIE-2-ligandia koo-daavan geenin kanssa. Toisessa lähestymistavassa rekombinantti vektori/isäntäsysteemi voidaan tunnistaa ja valita perustuen tiettyjen s,markkeri"-geenitoimintojen läsnäoloon tai puuttumi-25 seen (esim. tymidiinikinaasiaktiivisuus, antibioottiresistenssi, transformaatiofenotyyppi, baculoviruksen okluusiokappa-leen muodostuminen, jne.), jonka vieraiden geenien insertio vektoriin on aiheuttanut. Esimerkiksi jos nukleiinihappoa koodaava TIE-2-ligandi insertoidaan vektorin markkerigeenisek-30 venssiin, rekombinantit joissa on insertti, voidaan tunnistaa markkeri-geenitoiminnan puuttumisesta. Kolmannessa lähestymistavassa rekombinantti ekspressiovektorit voidaan tunnistaa määrittämällä vieras geenituote, jota rekombinantti ekspres-soi. Sellaiset määritykset voivat perustua esimerkiksi TIE-2-35 ligandin geenituotteen fysikaalisiin tai toiminnallisiin ominaisuuksiin, esimerkiksi sitomalla ligandin TIE-2-reseptoriin tai sen osaan, joka voidaan merkitä esimerkiksi havaittavalla vasta-aineella tai sen osalla tai sitomalla vasta-aineisiin, 14 joita tuotetaan TIE-2-ligandiproteiinia tai sen osaa vastaan. Tämän keksinnön solut voivat ohimenevästi tai edullisemmin konstitutiivisesti tai pysyvästi ekspressoida TIE-2-ligandeja kuten tässä on kuvattu. Neljännessä lähestymistavassa DNA nuk-5 leotidialukkeet voidaan valmistaa vastaamaan tie-2 spesifistä DNA-sekvenssiä. Näitä alukkeita voitaisiin sitten käyttää tekemään PCR tie-2-aeenifraaamentille. (PCR-protokollia: A Guide To Methods and Applications, toimittanut Michael A. Innis et ai., Academic Press (1990)).

10

Rekombinanttiligandi voidaan puhdistaa millä tahansa tekniikalla, joka sallii myöhemmän stabiilin, biologisesti aktiivisen proteiinin muodostumisen. Esimerkiksi, eikä rajoituksen vuoksi, ligandi voidaan saada talteen soluista joko liukoisina 15 proteiineina tai inkluusiokappaleina, joista ne voidaan uuttaa kvantitatiivisesti 8 M guanidiniumhydrokloridilla ja dialysoi-da. Jotta ligandia puhdistetaan edelleen, voidaan käyttää tavanomaista ioninvaihtokromatograf iaa, hydrof obista vuorovaiku-tuskromatograf iaa, käänteisfaasikromatografiaa tai geelisuoda-20 tusta.

Keksinnön lisäsuoritusmuodoissa voidaan käyttää rekombinantti TIE-2-ligandia koodaavaa geeniä inaktivoimaan tai "estää" en-dogeenisen geenin toiminta homologisella rekombinaatiolla ja 25 täten luomaan TIE-2-ligandi viallinen solu, kudos tai eläin. Esimerkiksi, eikä rajoituksen vuoksi, rekombinantti TIE-2-li-gandia koodaavaa geeni voidaan manipuloida sisältämään inser-tiomutaation, esimerkiksi neo-geeni, joka inaktivoisi natiivin TIE-2-ligandia koodaavan geenin. Sellainen rakenne, sopivan 30 promoottorin kontrollin alaisena voidaan viedä soluun, kuten alkion kantasoluun, tekniikoilla kuten transfektio, transduk-tio tai injektio. Solut, joissa on rakenne, voidaan sitten valita G418-resistenssillä. Solut, joista puuttuu koskematonta TIE-2-ligandia koodaava geeni, voidaan sitten tunnistaa, esim. 35 Southern blottingilla, PCR-havaitsemisella, Nothern blottauk-sella tai ekspression määrityksellä. Solut, joista puuttuu koskematonta TIE-2-ligandia koodaava geeni, voidaan sitten fuusioida aikaisiin alkioso-luihin luomaan transgeenisiä eläi- 15 miä, joilta puuttuu sellainen ligandi. Sellaista eläintä voidaan käyttää kuvaamaan spesifisiä in vivo prosesseja, normaalisti ligandista riippuvaisia.

5 Tämä keksintö antaa myös vasta-aineet tässä kuvatuille TIE-2-ligandeille, jotka ovat hyödyllisiä havaitsemaan ligandeja esimerkiksi diagnostisissa sovellutuksissa. Monoklonaalisten vasta-aineiden, jotka on kohdistettu TIE-2-ligandia vastaan, valmistamiseksi voidaan käyttää mitä tahansa menetelmää, joka 10 antaa vasta-ainemolekyylien tuoton jatkuvilla soluiinjoilla viljelmässä. Esimerkiksi hybridomatekniikka, jonka alunperin kehitti Kohler ja Milstein (1975, Nature 256; 495-497), samoin kuin triomatekniikka, ihmisen B-soluhybridoraatekniikka (Kozbor et ai., 1983, Immunology Today 4; 72) ja EBV-hybridomatekniik-15 ka tuottamaan ihmisen monoklonaalisia vasta-aineita (Cole et ai., 1985, teoksessa "Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy", Alan R. Liss, Inc. ss. 77-96) ja sen kaltaiset kuuluvat tämän keksinnön piiriin.

20 Monoklonaaliset vasta-aineet voivat olla ihmisen monoklonaalisia vasta-aineita tai kimeerisiä ihminen-hiiri (tai muut lajit) monoklonaalisia vasta-aineita. Ihmisen monoklonaaliset vasta-aineet voidaan valmistaa millä tahansa alalla tunnetuista lukuisista tekniikoista (esim. Teng et ai., 1983, Proc. 25 Natl. Acad. Sei. USA 80; 7308-7312; Kozbor et ai., 1983, Immunology Today 4: 72-79; Olsson et ai., 1982, Meth. Enzymol. 92; 3-16). Kimeerisiä vasta-ainemolekyylejä, joissa on hiiren antigeeniä sitova domeeni ja ihmisen vakioalueet, voidaan valmistaa (Morrison et ai., 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81; 30 6851, Takeda et ai., 1985, Nature 314; 452).

Erilaisia alalla tunnettuja menetelmiä voidaan käyttää tuottamaan polyklonaalisia vasta-aineita tässä kuvattuja TIE-2-ligandien epitooppeja vastaan. Vasta-aineen tuottoa varten 35 voidaan erilaisia isäntäeläimiä immunisoida injektoimalla TIE- 2-ligandilla tai sen fragmentilla tai johdannaisella, kanit, hiiret ja rotat mukaanleuttuina, mutta ei niihin rajoittuen.

16

Erilaisia adjuvantteja voidaan käyttää nostamaan immunologista vastetta, riippuen isäntälajista, ja mukaanluettuna, mutta ei rajoittuen, Freundin (täydellinen tai epätäydellinen), mine-raaligeelit, kuten alumiinihydroksidi, pinta-aktiiviset ai-5 neet, kuten lysolesitiini, pluroniset polyolit, polyanionit, peptidit, öl jyemulsiot, avaimenreikä maljakotilon hemosyaanit, dinitrofenoli ja mahdollisesti hyödylliset ihmisen adjuvantit, kuten BCG (Bacille Calmette-Guerin) ja Corynebacterium parvum- 10 Valitulle TIE-2-ligandiepitoopille voidaan valmistaa tunnetuilla tekniikoilla vasta-aineen molekyyliklooni. Voidaan käyttää rekombinantti-DNA-metodologiaa (katso esim. Maniatis et ai., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) raken-15 tamaan nukleiinihapposekvenssejä, jotka koodaavat monoklonaa-lista vasta-ainemolekyyliä tai sen antigeeniä sitovaa aluetta.

Tämä keksintö antaa vasta-ainemolekyylit samoin kuin sellaisten vasta-ainemolekyylien fragmentit. Vasta-ainefragmentteja, 20 joissa on molekyylin perimä, voidaan luoda tunnetuin tekniikoin. Esimerkiksi sellaisiin fragmentteihin sisältyy, mutta ei rajoitu; F(ab' )2-fragmentti, joka voidaan tuottaa vasta-aine-molekyylin pepsiinipilkkomisella: Fab'-fragmentit voidaan luoda pelkistämällä F(ab' )2-fragmentin disulfidisillat ja Fab-25 fragmentit, joita voidaan luoda käsittelemällä vasta-ainemolekyyliä papaiinilä ja pelkistävällä aineella. Vasta-ainemolekyylit voidaan puhdistaa tunnetuin tekniikoin, esim. immunoab-sorptiolla tai immunoaffiniteettikromatogarialla, kromatogafi-silla menetelmillä, kuten HPLC (korkeapainenestekromatografia) 30 tai niiden yhdistelmällä.

Tämä keksintö käsittää lisäksi immunomäärityksen mittaamaan TIE-2-ligandin määrää biologisessa näytteessä a) saattamalla biologinen näyte kosketuksiin ainakin yhden 35 vasta-aineen kanssa, joka spesifisesti sitoo TIE-2-ligandin siten, että vasta-aine muodostaa kompleksin minkä tahansa näytteessä olevan TIE-2-ligandin kanssa? ja 17 b) mittaamalla kompleksin määrä ja täten mittaamalla biologisessa näytteessä olevan TIE-2-ligandin määrä.

Keksintö käsittää edelleen määrityksen mitata TIE-2-reseptorin 5 määrä biologisessa näytteessä a) saattamalla biologinen näyte kosketuksiin ainakin yhden keksinnön ligandin kanssa siten, että ligandi muodostaa kompleksin TIE-2-respetorin kanssa; ja b) mittaamalla kompleksin määrä ja täten mittaamalla biologi-10 sessa näytteessä olevan TIE-2-reseptorin määrä.

Tämän keksinnön mukaan voidaan myös hyödyntää TIE-2-ligandia tukemaan TIE-2-reseptoria ekspressoivien solujen selviämistä ja/tai kasvua ja/tai erilaistumista. Täten ligandia voidaan 15 käyttää täydennyksenä tukemaan, esimerkiksi endoteelisoluja viljelmässä. Lisäksi hakijoiden havainto TIE-2-reseptorin samaa alkuperää olevasta ligandista mahdollistaa määrityssystee-mien, jotka ovat hyödyllisiä TIE-2-reseptorin agonistin tai antagonistin tunnistamiseen, hyödyksi käytön. Sellaiset määri-20 tyssysteemit olisivat hyödyllisiä tunnistamaan molekyylejä, jotka kykenevät edistämään tai inhiboimaan verisuonten kehittymistä. Esimerkiksi eräässä suoritusmuodossa TIE-2-reseptorin antagonistit voidaan tunnistaa testimolekyyleiksi, jotka kykenevät sekaantumaan TIE-2-reseptorin vuorovaikutukseen biolo-25 gisesti aktiivisen TIE-2-ligandin kanssa. Sellaiset antagonistit tunnistetaan niiden kyvystä 1) blokata biologisesti aktiivisen TIE-2“ligandin sitoutuminen reseptoriin mitattuna, esimeriksi käyttämällä BIAcore biosensoritekniikka (BIAcore? Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ); tai 2) blokata biologi-30 sesti aktiivisen TIE-2-ligandin kyky aiheuttaa biologista vastetta. Sellaisiin biologisiin vasteisiin kuuluu, mutta ei rajoitu, TIE-2-reseptorin tai TIE-2-signaali transduktioreitin eteenpäin olevien komponenttien fosforylaatio tai TIE-2-resep-toria sisältävien solujen selviäminen, kasvu tai erilaistumi-35 nen.

Eräässä suoritusmuodossa solut, joita on manipuloitu eks-pressoimaan TIE-2-reseptoria, voivat olla riippuvaisia kasva 18 maan TIE-2-ligandilisäyksellä. Sellaiset solut tajoavat hyödylliset määrityssysteemit tunnistamaan TIE-2-reseptorin lisä-agonistit tai antagonistit, jotka kykenevät sekaantumaan TIE- 2-ligandin aktiivisuuteen sellaisissa soluissa, Vaihtoehtoi-5 sesti, autokriinisolut, jotka on manipuloitu kykenemään eks-pressoimaan samanaikaisesti sekä TIE-2-ligandia että -reseptoria, voivat antaa hyödylliset systeemit määrittämään mahdollisia agonisteja tai antagonisteja.

10 Siksi tämä keksintö antaa TIE-2-reseptorin viemisen soluihin, jotka eivät normaalisti ekspressoi tätä reseptoria, täten sallien näiden solujen osoittaa perusteellisia ja helposti erotettavissa olevia vasteita ligandille, joka sitoo tämän reseptorin. Esiin saadun vasteen tyyppi riippuu käytetyistä soluis-15 ta eikä spesifisestä reseptorista, joka on viety soluun. Sopivat solulinjat voidaan valita tuottamaan vasteen, jolla on suurin hyöty määritykseen, samoin kuin havaitsemaan molekyylejä, jotka voivat toimia tyrosiinikinaasireseptoreihin. Molekyylit voivat olla minkä tahansa tyyppisiä molekyylejä, sisäl-, 20 täen mutta ei rajoittuen peptidi- ja ei-peptidimolekyyleihin, jotka toimivat systeemeissä, joita kuvataan reseptorispesifi-sellä tavalla.

Erääseen hyödyllisemmistä systeemeistä, joita käytetään hyö-25 dyksi, sisältyy TIE-2-reseptorin vieminen fibroblastisolulin-jaan (esim. NIH3T3-solut) täten sellainen reseptori, joka ei normaalisti välitä lisääntyviä vasteita, voidaan fibroblastei-hin viemisen seurauksena kuitenkin määrittää lukuisilla hyvin vakiintuneilla menetelmillä määrittää f ibroblastikasvuteki jöi-30 den vaikutukset (esim. tymidiinin liittyminen tai muun tyyppiset lisääntymismääritykset; katso van Zoelen, 1990, "The Use of Biological Assays For Detection Of Polypeptide Growth Factors", teoksessa Progress Factor Research, vol. 2, ss. 131-152; Zhan ja M. Goldfarb, 1986, Mol. Cell. Biol., vol. 6, ss. 35 3541-3544). Näillä määrityksillä on lisäetuna, sekä mikä ta hansa valmiste voidaan määrittää sekä solulinjassa, jossa on viety reseptori, että emäsolulinjassa, josta reseptori puuttuu; vain spesifisiä vaikutuksia solulinjaan reseptorin kanssa 19 pidettäisiin viedyn reseptorin välittämänä. Sellaisia soluja voidaan manipuloida edelleen ekspressoimaan TIE-2-ligandia, täten luomaan autokriinisysteemin, joka on hyödyllinen määrittämään molekyylit, jotka toimivat antagonistina/agonistina 5 tässä vuorovaikutuksessa. Täten tämä keksintö antaa isän-täsolut, jotka koostuvat nukleiinihaposta, joka koodaa TIE-2-ligandia ja nukleiinihaposta, joka koodaa TIE-2-reseptoria.

TIE-2~reseptori/TIE-2-ligandi vuorovaikutus antaa myös hyödyl-10 lisen systeemin tunnistaa TIE-2-reseptorin pieniä molekyylia-gonisteja tai -antagonisteja. Esimerkiksi TIE-2-ligandin fragmenteista, mutanteista tai johdannaisista voidaan tunnistaa ne, jotka sitovat TIE-2-reseptorin mutta eivät indusoi biologista aktiivisuutta. Vaihtoehtoisesti TIE-2-ligandin karakte-15 risointi mahdollistaa molekyylin aktiivisten osien määrittämisen. Lisäksi ligandin tunnistaminen mahdollistaa reseptori/li-gandikompleksin röntgensädekiderakenteen määrittämisen, täten mahdollistaen reseptorin sitomiskohdan. Sitomiskohdan tietäminen antaa hyödyllisen näkemyksen uusien agonistien ja antago-20 nistien rationaalisesta suunnittelusta.

Testimolekyylin spesifinen sitoutuminen TIE-2-reseptoriin voidaan mitata lukuisilla tavoilla. Esimerkiksi testimolekyylin todellinen sitoutuminen soluihin, jotka ekspressoivat tie-25 2:ta, voidaan havaita tai mitata havaitsemalla tai mittaamalla (i) testimolekyyli, joka on sitoutunut koskemattomien solujen pintaan; (ii) testimolekyyli, joka on ristiinsitoutunut TIE-2-proteiiniin solulysaateissa; tai (iii) testimolekyyli, joka on sitoutunut TIE-2:een in vitro. Spesifinen vuorovaikutus testi-30 molekyylin ja TIE-2:n välillä voidaan arvioida käyttämällä reagensseja, jotka osoittavat tuon vuorovaikutuksen ainutlaatuiset ominaisuudet.

Spesifisenä, ei rajoittavana esimerkkinä voidaan keksinnön 35 menetelmiä käyttää seuraavasti. Tarkastellaan tapausta, jossa TIE-2-ligandi näytteessä on mitattava. Näytteen vaihtelevia laimennuksia (testimolekyyli), rinnakkain negatiivisen kontrollin kanssa (NC), jossa ei ole TIE™2-ligandin aktiivisuutta, 20 ja positiivinen kontrollin (PC), jossa on tunnettu määrä TIE- 2-ligandia, voidaan altistaa soluille, jotka ekspressoivat t-ie-2:ta havaittavasti leimatun TIE-2-ligandin läsnäollessa (tässä esimerkissä radiojodinoitu ligandi). TIE-2-ligandin 5 määrä testinäytteessä voidaan arvioida määrittämällä “^-leimatun TIE-2-ligandin määrä, joka sitoutuu kontrolleihin, ja jokaisessa laimennuksessa ja sitten vertaamalla näytearvoja standardikäyrään. Mitä enemmän TIE-2-ligandia näytteessä, sitä vähemmän l28I-ligandi sitoutuu TIE-2:een.

10

Sitoutuneen 12SI-ligandin määrä voidaan määrittää mittaamalla radioaktiivisuus solua kohti tai ristiinsitomalla TIE-2-ligan-di solun pinnan proteiineihin käyttämällä DSS:ää, kuten Meakin ja Shooter, 1991, Neuron 6: 153-163, ovat kuvanneet, ja mää-15 rittämällä leimatun proteiinin määrä solu-uutteissa käyttämällä esimerkiksi SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesia, joka voi paljastaa leimatun proteiinin, jonka koko vastaa TIE-2-ligandi/TIE-2-reseptoria. Spesifinentestimolekyyli/TIE-2-vuo-rovaikutus voidaan edelleen testata lisäämällä määrityksiin 20 erilaisia laimennuksia leimaamatonta kontrolliligandia, joka ei sido TIE-2-reseptoria eikä siksi pitäisi olennaisesti vaikuttaa kilpailuun leimatun TIE-2-molekyylin ja testimolekyylin välillä TIE-2-sitomisesta. Vaihtoehtoisesti molekyylin, jonka tiedetään kykenevän rikkomaan TIE-2-ligandi/TIE-2-sitomisen, 25 kuten, mutta ei rajoittuen anti-TIE-2-vasta-aine tai TIE-2-reseptoriaine, kuten tässä on kuvattu, voidaan odottaa sekaantuvan kilpailuun 125I-ligandin ja testimolekyylin välillä TIE- 2-reseptorin sitomisesta.

30 Havaittavasti leimattuun TIE-2-ligandiin kuuluu, mutta ei rajoitu, TIE-2-ligandi, joka on kovalenttisesti tai ei-kovalent-tisesti liittynyt radioaktiiviseen aineeseen, fluoresoivaan aineeseen, aineeseen, jolla on entsymaattista aktiviisuutta, aineeseen, joka voi toimia substraattina entsyymille (entsyy-35 mit ja substraatit, jotka ovat liittyneet kolorimetrisesti havaittavilla reaktioilla, ovat edullisia) tai aineeseen, joka voidaan tunnistaa vasta-ainemolekyylillä, joka edullisemmin on havaittavasti leimattu vasta-ainemolekyyli.

21

Vaihtoehtoisesti, testimolekyy1in spesifinen sitoutuminen TIE-2reen voidaan mitata arvioimalla TIE-2-ligandi/TIE-2-resepto-ri-sitomisen sekundääriset biologiset vaikutukset, mukaanluettuna, mutta ei rajoittuen, TIE-2:n solukasvu ja/tai erilaistu-5 minen tai välitön aikaisen geenin ekspression tai fosforylaa-tio. Esimerkiksi testimolekyy Iin kyky indusoida erilaistumista voidaan testata soluissa, joista puuttuu tie-2 f ja vertailu-soluissa, jotka ekspressoivat tie-2rta; erilaistuminen tie-2:ta ekspressoivissa soluissa, mutta ei vertailusoluissa, 10 joilta puuttuu tie-2. olisi osoitus spesifisestä testimolekyy-li/TIE-2-vuorovaikutuksesta. Samanlainen analyysi voitaisiin suorittaa havaitsemalla välitön aikaisen geenin (esim. fos ja iun) induktio tie-2-miinus- ja tie-2-plus-soluissa tai havaitsemalla TIE-2;n fosforylaatio käyttämällä alalla tunnettuja 15 standardifosforylaatiomäärityksiä. Sellainen analyysi saattaisi olla hyödyllinen tunnistettaessa agonisteja tai antagonisteja, jotka eivät sitoudu kilpailevasta TIE-2reen.

Samalla lailla tämä keksintö antaa menetelmän tunnistaa mole-20 kyylin, jolla on TIE-2-ligandin biologista aktiivisuutta, mihin sisältyy (i) altistetaan solu, joka ekspressoi tie-2;ta. testimolekyylille ja (ii) havaitaan testimolekyy Iin spesifinen sitoutuminen TIE-2-reseptoriin, missä spesifinen sitoutuminen TIE-2reen korreloi positiivisesti TIE-2m kaltaisen aktiivi-25 suuden kanssa. Spesifinen sitoutuminen voidaan havaita joko määrittämällä suora sitominen tai sitomisen sekundääriset biologiset vaikutukset, kuten on keskusteltu, supra. Sellainen menetelmä voi olla erityisen hyödyllinen tunnistettaessa TIE-ligandi-perheen uusia jäseniä tai farmaseuttisessa teollisuu-30 dessa seulottaessa suuresta peptidi- tai ei-peptidimolekyylien (esim. peptidien muotoa jäljittelevät) joukosta TIErhen liittyvää biologista aktiivisuutta. Edullisemmassa, spesifisessä, ei rajoittavassa keksinnön suoritusmuodossa voidaan valmistaa suuri viljelmäkuoppien ruudukko, jossa on vuorottelevissa ri-35 veissä, PC12- (tai fibroblasteja, katso, infra) soluja, jotka ovat joko tie-2-miinus tai manipuloitu olemaan tie-2-plus. Sitten voidaan lisätä lukuisia testimolekyylejä siten, että jokainen verkon sarake tai sen osa sisältää erilaisen testimo- 22 lekyylin. Jokaisesta kuopasta voitaisiin sitten pisteyttää kasvun ja/tai erilaistumisen läsnäolo tai puuttuminen. Tällä tavalla voitaisiin äärettömän suuresta määrästä testimolekyy-lejä seuloa sellaista aktiivisuutta.

5

Lisäksi tulevissa suoritusmuodoissa keksintö antaa menetelmät havaita tai mitata TIE-kaltaista aktiivisuutta tai tunnistaa molekyylin, jolla on sellaista aktiivisuutta, mihin sisältyy (i) altistetaan testimolekyyli TIE-2-reseptoriproteiinilie in 10 vitro olosuhteissa, jotka sallivat sitomisen tapahtua ja (ii) havaitaan testimolekyylin sitoutuminen TIE-2-proteiiniin, missä testimolekyy1in sitoutuminen TIE-2:een korreloi TIE:n kaltaisen aktiivisuuden kanssa. Sellaisten menetelmien mukaisesti TIE-2 voi olla tai ei ole olennaisesti puhdistettu, voidaan 15 kiinnittää kiinteään kantajaan (esim. af f initeettikolonni- tai ELISA-määritys) tai voidaan liittää keinotekoiseen membraa-niin. Testimolekyylin sitoutumista TIE-2:een voidaan arvioida millä tahansa alalla tunnetulla menetelmällä. Edullisissa suoritusmuodoissa testimolekyylin sitoutuminen voidaan havaita 20 tai mitata arvioimalla sen kyky kilpailla havaittavasti leimattujen, tunnettujen TIE-2-ligandien kanssa TIE-2-reseptorin sitomisesta.

Tämä keksintö antaa myös menetelmän havaita testimolekyylin 25 kyky toimia TIE:n kaltaisen aktiivisuuden antagonistina, mihin sisältyy havaita molekyylin kyky inhiboida TIE-ligandin vaikutusta sitoutua TIE-2:een solussa, joka ekspressoi tie-2:ta. Sellainen antagonisti voi tai ei voi sekaantua TIE-2-ligan-di/TIE-2-reseptori-sitomiseen. TIE-2-ligandin TIE-2-resepto-30 riin sitoutumisen vaikutukset ovat edullisemmin biologisia tai biokemiallisia vaikutuksia, mukaanluettuna, mutta ei rajoittuen, solun selviäminen tai lisääntyminen, solun transformaatio, välitön aikaisen geenin induktio tai TIE-2-fosforylaatio.

35 Keksintö antaa edelleen menetelmän tunnistaa sekä vasta-aineita että muita molekyylejä, jotka kykenevät neutraloimaan li-gandin tai blokkaamaan sitoutumisen reseptoriin, samoin kuin tällä menetelmällä tunnistetut molekyylit. Ei rajoittavan esi- 23 merkin vuoksi menetelmä voidaan suorittaa määrityksellä, joka on käsitteellisesti samanlainen kuin ELISA-määritys. Esimerkiksi TIE-reseptoriaine voidaan sitoa kiinteään kannattajaan, kuten muovinen monikuoppalevy. Kontrollina voidaan kuoppaan 5 sitten laittaa tunnettu määrä TIE-ligandia, joka on Myc-mer-kitty ja mikä tahansa merkitty TIE-ligandi, joka sitoo resep-toriaineen, voidaan sitten tunnistaa reportteri-vasta-aineen avulla, joka on kohdistettu Myc-merkkiä vastaan. Tätä määri-tyssysteemiä voidaan sitten käyttää seulomaan testinäytteistä 10 molekyylit, jotka kykenevät i) sitoutumaan merkittyyn ligan-diin tai ii) sitoutumaan reseptoriaineeseen ja täten blokkaa-maan sitoutumisen reseptoriaineeseen merkityllä ligandilla. Esimerkiksi testinäyte, jossa on oletettu kiinnostuksen kohteena oleva molekyyli yhdessä tunnetun määrän kanssa merkittyä 15 ligandia, voidaan viedä kuoppaan ja merkityn ligandin määrä, joka sitoutuu reseptoriaineeseen, voidaan mitata. Vertaamalla sidotun merkityn ligandin määrää testinäytteessä määrään kontrollissa, näytteet joissa on molekyylejä, jotka kykenevät blokkaamaan ligandin sitoutumisen reseptoriin, voidaan tunnis-20 taa. Täten tunnistetut kiinnostuksen kohteena olevat molekyylit voidaan eristää käyttämällä menetelmiä, jotka ovat ammattimiehelle tuttuja.

Kun ligandin sitomisen blokkaaja kerran on löydetty, niin am-25 mattimies suorittaisi sekundääriset määritykset määrittämään, onko blokkaaja reseptoriin sitoutumista vai ligandiin, samoin kuin määrittäisi, voiko blokkaajamolekyyli neutraloida ligandin biologista aktiivisuutta. Esimerkiksi käyttämällä sitomis-määritystä, missä käytetään BIAcore biosensoritekniikkaa (tai 30 vastaavaa), missä joko TIE-reseptoriaine tai TIE-ligandi on kovalenttisesti kiinnittynyt kiinteään kantajaan (esim. kar-boksimetyylidekstraani kultapinnalla), ammattimies pystyisi määrittämään, sitoutuuko blokkaajamolekyyli spesifisesti ligandiin vai reseptoriaineeseen. Jotta määritetään, voiko blok-35 kaajamolekyyli neutraloida ligandin biologista aktiivisuutta, voisi ammattimies suorittaa fosforylaatiomäärityksen (katso esimerkki 5) tai vaihtoehtoisesti toiminnallisen biomäärityk-sen, kuten selviämismääritys käyttämällä primäärisiä viljel- 24 miä, esimerkiksi endoteelisoluja. Vaihtoehtoisesti blokkaaja-molekyyli, joka sitoutuu reseptoriaineeseen, voisi olla ago-nisti, ja ammattimies tietäisi, kuinka määrittää tämä suorittamalla sopiva määritys tunnistamaan TIE-2-reseptorin lisä-5 agonistit.

Koska TIE-2-reseptori on tunnistettu endoteelisolujen yhteydessä, ja kuten tässä on osoitettu, ligandin blokkaus näyttää estävän verisuonitusta, ovat hakijat osoittaneet, että TIE-2-10 ligandi on hyödyllinen verisuonituksen induktioon sairauksissa tai häiriöissä, missä on osoitettu sellaista verisuonitusta. Sellaisiin sairauksiin tai häiriöihin kuuluisi haavan paraneminen, iskemia ja diabetes. Toisaalta TIE-2-reseptorin antagonistit, kuten reseptorlaineet, kuten tässä on kuvattu esi-15 merkeissä 2 ja 3 ja ΤϊΕ-2-ligandi 2, kuten on kuvattu esimerkissä 9, olisivat hyödyllisiä estämään tai vähentämään verisuonitusta, täten estäen tai vähentäen esimerkiksi tumorin kasvua.

20 Koska TIE-2-reseptoria sisältävät solut näyttävät olevan säädeltyjä verisuonittumisessa, TIE-2-ligandiaineita voidaan myös käyttää estämään tai vähentämään esimerkiksi tumorin kasvua. TIE-2-ligandiaineet voivat olla hyödyllisiä toksiinien jakamiseen reseptoria sisältävälle solulle. Vaihtoehtoisesti voidaan 25 jakaa muita molekyylejä, kuten kasvutekijöitä, sytokiineja tai ravinteita, TXE-2-reseptoria sisältävälle solulle TIE-2-ligan-diaineiden kautta. TIE-2-ligandiaineita voitaisiin myös käyttää diagnostisena reagenssina TIE-2-reseptorille havaitsemaan reseptori in yivo tai in vitro. Missä TIE-2-reseptori liittyy 30 sairaustilaan, TIE-2-ligandiaineet voivat olla hyödyllisiä diagnostisina reagensseina havaitsemaan sairaus esimerkiksi kudosvärjäyksellä tai koko kehon kuvantamisella.

Tämä keksintö antaa myös farmaseuttisia koostumuksia, joissa 35 on TIE-2-ligandit tai ligandiaineet, joita tässä on kuvattu, niiden peptidifragmentteja tai johdannaisia farmakologisesti hyväksyttävässä kantajassa. TIE-2-ligandiproteiineja, peptidi-fragmentteja tai johdannaisia voidaan antaa systeemisesti tai 25 paikallisesti. Mitä tahansa alalla käytettyä antamismallia voidaan käyttää, mukaan luettuna, mutta ei rajoittuen, laskimonsisäinen, peitinkalvon sisäisesti, valtimonsisäisesti, nenäontelon sisäisesti, 5 suun kautta, ihonalaisesti, vatsaontelon sisäisesti tai paikallisella injektiolla tai kirurgisella siirrännäisellä. Viivästyneen vapautumisen formulaatiot annetaan myös.

Tässä esitetään edelleen eristetty ja puhdistettu 10 nukleiinihappomolekyyli, jossa on nukleiinihapposekvenssi, joka koodaa ihmisen TIE-2-ligandia, missä nukleiinihapposekvenssi valitaan ryhmästä, joka koostuu: (a) nukleiinihapposekvenssistä, jossa on ihmisen TIE-2-15 ligandin koodausalue, kuten kuviossa 4, kuviossa 5 tai kuviossa 6 on esitetty; (b) nukleiinihapposekvenssistä, joka hybridisoituu kohtalaisesti tiukennetuissa olosuhteissa (a) :n nukeliinihapposekvenssiin, ja joka koodaa TIE-2- 20 ligandia, joka sitoo TIE-2-reseptoria; ja (c) nukleiinihapposekvenssistä, joka on degeneroitunut geneettisen koodin seurauksena (a) :n tai (b) :n nukleiinihapposekvenssiin, ja joka koodaa TIE-2- ligandia, joka sitoo TIE-2-reseptorin.

25 Esillä oleva keksintö antaa eristetyn nukleiinihappomolekyylin, joka koodaa TIE-2-ligandia, jossa nukleiinihapposekvenssi on: (a) nukleiinihapposekvenssi, jossa on ihmisen TIE-2-ligandin koodausalue, kuten kuviossa 4, kuviossa 5 tai 30 kuviossa 6 on esitetty; (b) nukleiinihapposekvenssistä, joka hybridisoituu kohtalaisesti tiukennetuissa olosuhteissa (a) :n nukleiinihapposekvenssiin, ja joka koodaa TIE-2-

Ligandia, joka sitoo TIE-2-reseptoria; tai 35 (c) nukleiinihapposekvenssi, joka jos geneettisen koodin degeneraatiota ei olisi, hybridisoitu.isi (a) :n tai (b):n nukle- 26 iinihapposekvenssiin, ja joka koodaa TIE-2-ligandia, joka sitoo TIE-2-reseptorin.

Tämä keksintö antaa edelleen eristetyn ja puhdistetun ihmisen 5 TIE-2-ligandin, jota keksinnön eristetty nukleiinihappomole- kyylin koodaa. Keksintö antaa myös vektorin, joka koostuu e-ristetystä nukleiinihappomolekyylistä, jossa on ihmisen TIE-2-ligandia koodaava nukleiinihapposekvenssi. Eräässä suoritusmuodossa vektori on suunniteltu pBluescript KS:ksi, joka koo-10 daa ihmisen TIE-2-ligandi 2:ta.

Keksintö antaa edelleen ekspressiovektorin, joka koostuu DNA-molekyylistä, joka koodaa ihmisen TIE-2-ligandia, missä DNA-molekyyli on operatiivisesti liittynyt ekspression kontrol-15 lisekvenssiin. Keksintö antaa myös isäntävektorisysteemin polypeptidin, jolla on ihmisen TIE-2-ligandin biologista aktiivisuutta, tuottamiseksi, mihin sisältyy keksinnön ekspressio-vektori sopivassa isäntäsolussa. Eräässä suoritusmuodossa sopiva isäntäsolu voi olla bakteerisolu, hiivasolu, hyönteissolu 20 tai nisäkässolu. Keksintö antaa edelleen menetelmän tuottaa polypeptidiä, jolla on biologisesti aktiivisen TIE-2-ligandin aktiivisuutta, mihin sisältyy kasvattaa keksinnön isäntävektorisysteemin soluja olosuhteissa, jotka sallivat polypeptidin tuoton ja siten tuotetun polypeptidin talteenoton.

25 Tässä kuvattu keksintö, joka on eristetty nukleiinihappomole-kyyli, joka koodaa TIE-2-ligandia, antaa edelleen ligandin, sen fragmentin tai johdannaisen kehittämiseen, tai toisen molekyylin, joka on reseptoriagonisti tai antagonisti, hoidoksi 30 potilaille, jotka kärsivät vioista, mukaanluettuna solut, kudokset tai elimet, jotka ekspressoivat TIE-reseptoria. Ei rajoittavan esimerkin vuoksi tämä keksintö antaa ligandiaineen, joka spesifisesti sitoo TIE-2-reseptoria tai TIE-2:ta. Vaihtoehtoisessa suoritusmuodossa tämä keksintö antaa ligandiai-35 neen, jossa on TIE-2-ligandi fuusioituneena immunoglobuliinin vakioalueeseen. Eräässä suoritusmuodossa ligandiaine koostuu TIE-2-ligandi l:stä tai TlE-2-ligandi 2ssta ja ihmisen IgGl:n

Fc-osasta. Ligandiainetta voidaan käyttää ihmisen tai eläimen kehon hoitomenetelmässä tai diagnoosimenetelmässä.

27 Tämä keksintö antaa myös vasta-aineen, joka sitoo spesifisesti 5 sellaista hoitavaa molekyyliä. Vasta-aine voi olla monoklonaa-linen tai polyklonaalinen. Keksintö antaa myös menetelmän käyttää sellaista monoklonaalista tai polyklonaalista vasta-ainetta mittaamaan hoitavan molekyylin määrä näytteessä, joka on otettu potilaasta tarkoituksena tarkkailla hoidon kulkua.

10

Keksintö antaa edelleen hoitavan koostumuksen, joka koostuu ihmisen TIE-2-ligandista tai ligandiaineesta, ja sytotoksisen aineen, joka on konjugoitu siihen. Eräässä suoritusmuodossa sytotoksinen aine voi olla radioisotooppi tai toksiini.

15

Keksintö antaa myös vasta-aineen, joka spesifisesti sitoo ihmisen TXE-2-ligandia. Vasta-aine voi olla monoklonaalinen tai polyklonaalinen.

20 Keksintö antaa edelleen menetelmän puhdistaa ihmisen TIE-2-ligandia, mihin sisältyy: a) kytketään ainakin yksi TIE-2:ta sitova substraatti kiinteään matriisiin; 25 b) inkuboidaan a):n substraattia solulysaatin kanssa siten, että substraatti muodostaa kompleksin minkä tahansa ihmisen TIE-2-ligandin kanssa solulysaatissa; c) pestään kiinteä matriisi; ja d) eluoidaan ihmisen TIE-2-ligandi kytketystä substraatista. 30

Substraatti voi olla mikä tahansa aine, joka spesifisesti sitoo ihmisen TIE-2-ligandia. Eräässä suoritusmuodossa substraatti valitaan ryhmästä, joka koostuu anti-TIE-2-ligandi vasta-aineesta, TlE-2-reseptorista ja TlE-2-reseptoriaineesta. 35 Keksintö antaa edelleen reseptoriaineen, joka spesifisesti sitoo ihmisen TIE-2-ligandia, samoin kuin hoitavan koostumuksen, mikä koostuu reseptoriaineesta farmaseuttisesti hyväksyttävässä kantajassa, ja menetelmän blokata verisuonen kasvua 28 ihmisessä, mihin sisältyy hoitavan koostumuksen tehokkaan määrän antaminen.

Keksintö antaa myös hoitavan koostumuksen, mikä koostuu ihmi-5 sen TIE-2-ligandista tai ligandiaineesta farmaseuttisesti hyväksyttävässä kantajassa, samoin kuin menetelmän edistää uu-dissuonittumista potilaassa, mihin sisältyy hoitokoostumuksen tehokkaan määrän antaminen potilaalle.

10 Lisäksi tämä keksintö antaa menetelmän tunnistaa solun, joka ekspressoi TIE-2-reseptoria, mihin sisältyy saattaa solu kosketuksiin havaittavasti leimatun TIE-2-ligandin tai ligandiai-neen kanssa olosuhteissa, jotka sallivat havaittavasti leimatun ligandin sitoutumisen TIE-2-reseptoriin ja määritetään, 15 onko havaittavasti leimattu ligandi sitoutunut TIE-2-resepto-riin, tällöin tunnistaen solu sellaiseksi, joka ekspressoi TIE-2-reseptoria. Tämä keksintö antaa myös hoitokoostumuksen, mikä koostuu ihmisen TIE-2-ligandista tai ligandiaineesta ja sytotoksisesta aineesta, joka on konjugoitunut siihen. Syto-20 toksinen aine voi olla radioisotooppi tai toksiini.

Keksintö antaa myös menetelmän havaita TIE-2-ligandin ekspres-sio solussa, mihin sisältyy että saadaan mRNA solusta, saatetaan siten saatu mRNA kosketuksiin leimatun nukleiinihappomo-25 lekyylin kanssa, joka koodaa TIE-2-ligandia, hybridisaatio-olosuhteissa, määritetään leimattuun molekyyliin hybridisoitu-neen mRNA:n läsnäolo ja siten havaitaan TIE-2-ligandin eks-pressio solussa.

30 Keksintö antaa edelleen menetelmän havaita TIE-2-ligandin eks-pressio kudosleikkeissä, mihin sisältyy että saatetaan kudos-leikkeet kosketuksiin leimatun nukleiinihappomolekyylin kanssa, joka koodaa TIE-2-ligandia, hybridisaatio-olosuhteissa, määrittää leimattuun molekyyliin hybridisoituneen mRNA:n läs-35 näolo ja siten havaitaan TIE-2-ligandin ekspressio kudosleikkeissä .

Esimerkki 1 29 ABAE-solulinjan tunnistaminen reportterisoluiksi TIE-2-resep-torille

Aikuisen BAE-solut on reksiteröity European Cell Culture Re-5 positorytssa ECACC#92010601:nä (Katso PNAS 75:2621 (1978)). Northern-analyysit (RNA) paljastivat kohtalaiset tasot tie-2-transkriptejä ABAE- (Adult Bovine Arterial Endothelial, aikuinen naudan valtimon endoteelinen) solulinjassa, mikä on yhdenmukaista in situ hybridisaatiotulosten kanssa, jotka osoitti-10 vat melkein ainutlaatuisen tie-2 RNA:n sijainnin verisuonen endoteelisoluissa. Tutkimme siksi ABAE-solulysaateista TIE-2-proteiinin läsnäolon, samoin kuin missä määrin tämä TIE-2-pro-teiini tyrosiinifosforyloidaan normaaleissa versus seerumi-vajavaiset kasvuolosuhteet. ABAE-solulysaatit kerättiin ja 15 altistettiin immunopresipitaatiolle, jonka jälkeen immunop-resipitoitujen proteiinien Western blot TIE-2 spesifisillä ja fosfotyrosiini-spesifisillä antiseerumeilla. TIE-2-peptidien poisjättäminen tai mukaaniiittäminen spesifisinä blokkausmole-kyyleinä TIE-2 immunopresipitaation aikana salli yksiselittei-20 sen TIE-2-tunnistamisen noin 150 kD kohtalaisti havaittavana proteiinina, jonka steady-state fosfotyrosiinitasot vähenevät lähelle havaitsemattomia tasoja ennen solujen seeruminäänty-mistä.

25 ABAE-solujen viljely ja solulysaattien talteenotto tehtiin seuraavasti. ABAE-solut, joilla oli alhainen pasaasiluku, mal-jattiin yksinkertaisena kerroksena, tiheydellä 2 x 106 solua/ 150 mm muovinen petrimalja (Falcon) ja viljeltiin Dulbecco's mukaellulla Eagles alustalla (DMEM), jossa oli 10 % naudan 30 vasikan seerumia (10 % BCS), 2 mM L-glutamiinia (Q) ja 1 % kumpaakin, penisilliiniä ja streptomysiiniä (P-S) 5 % «^-ilmakehässä. Ennen solulysaattien keräämistä soluja seeruminään-nytettiin 24 h DMEM/Q/P-S:llä, jonka jälkeen alusta imettiin pois ja maljat huuhdeltiin jääkylmällä puskuroidulla suolali-35 uoksella (PBS), johon oli lisätty natrium-orto-vanadaattia, natriumfluoridia ja natriumbentsamidiinia. Solut lyysattiin pienessä tilavuudessa tätä huuhtelupuskuria, johon oli lisätty 30 1 % NP40 detergenttiä ja proteaasi-inhibiittoreita, PMSFrää ja aprotiinia. Liukenematon jäte poistettiin solulysaateista sentrifugoimalla 14 000 x G 10 min, 4°C ja supernatantit altistettiin immunopresipitaatiolle TIE-2-reseptorin spesifisten 5 antiseerumien kanssa, blokkauspeptidien, joita oli lisätty noin 20 /zg/ml lysaattiin, kanssa tai ilman. Immunopresipitoi-dut proteiinit liuotettiin uudestaan PAGE:11a (7,5 % Laemmli-geeli) ja sitten elektrosiirrettiin PVDF-membraanille ja inku-boitiin joko erilaisten TIE-2- tai fosfotyrosiini-spesifisten 10 antiseerumien kanssa. TIE-2-proteiini tehtiin näkyväksi inku-boimalla membraania HRP:hen liittyneiden sekundääristen anti-seerumien kanssa, jonka jälkeen käsiteltiin ECL-reagenssilla (Amersham).

15 Esimerkki 2 TIE-2-reseptoriaineen kloonaus ja ekspressio TIE-2-ligandin vuorovaikutusten affiniteetti-pohjaista tutkimusta varten

Luotiin ekspressiorakenne, joka tuottaisi eritetyn proteiinin, 20 joka koostuu rotan TIE-2-reseptorin koko solunulkoisesta osasta fuusioituneena ihraisen immunoglobuliinin gamma-1 vakioalu-eeseen (IgGl Fc). Tätä fuusioproteiinia kutsutaan TIE-2 "re-septoriaineeksi" (RB) ja odotettaisiin normaalisti olevan di-meerinä liuoksessa, joka perustuu disulfidisidosten muodostu-25 miseen yksittäisten IgGl Fc-häntien välille. TIE-2 RB:n Fc-annos valmistettiin seuraavasti. DNA-fragmentti, joka koodaa ihmisen IgGl:n Fc-annosta, joka ulottuu proteiinin karboksi-terminuksen sarana-alueen yli, amplifioitiin ihmisen istukan cDNA:sta PCR:llä oligonukleotidien knassa, jotka vastaavat 30 ihmisen IgGl:n julkaistua sekvenssiä; tuloksena oleva DNA-fragmentti kloonattiin plasmidivektoriin. Sopivat DNA-restrik-tiofragmentit plasmidista, joka koodaa täysipitkää TIE-2-re-septoria ja ihmisen IgGl Fc-plasmidista ligoitiin lyhyen PCR-johdetun fragmentin molemmille puolille, mikä oli siten suun-35 niteltu, että fuusioidaan oikeaan lukuraamiin TIE-2- ja ihmisen IgGl Fc-proteiinia koodaavat sekevnssit. Täten tuloksena oleva TIE-2 ektodomeeni-Fc-fuusioproteiini substituoi tarkalleen IgGl Fc:n alueen paikalle, joka ulottui TIE-2-transmem- 31 braani- ja sytoplasmisten domeenien yli. Goodwin, et al., Cell 73: 447-456 (1993) ovat kuvanneet vaihtoehtoisen menetelmän valmistaa RBitä.

5 Saatiin TIE-2 RB:tä mg-määrät kloonaamalla TIE-2 RB DNA-fragmentti pVL1393 baculovirusvektoriin ja sen jälkeen infek-toiin Spodontera fruaiperda SF-21AE hyönteissolulinja. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää solulinjaa SF-9 (ATCC tallennus-numero CRL-1711) tai solulinjaa BTI-TN-5bl-4. DNA, joka koodaa 10 TIE-2 RB:tä, kloonattiin Eco RI-Notl-fragmenttina baculoviruk- sen siirtoplasmidiin pVL1393. Plasmidi DNA, joka puhdistettiin keesiumkloriditiheysgradienttisentrifuugauksella, rekombinoi-tiin virus DNA:han sekoittamalla 3 pg plamsidi DNA:ta 0,5 μg;n kanssa Baculo-Gold DNA:ta (Pharminigen), jonka jälkeen vietiin 15 liposomeihin käyttämällä 30 μg Lipofectiniä (GIBCO-BRL). Lisättiin DNA-liposomiseokset SF-21AE-soluihin (2 x 106 solua/60 mm astia) TMN-FH-alustassa (Modified Grace's Insect Cell Medium (GIBCO-BRL) 5 h 27°C:ssa, jonka jälkeen inkuboitiin 5 d TMN-FH-alustassa, johon oli lisätty 5 % vasikan sikiön seeru-20 mia. Kudosvil jelmäalusta kerättiin rekombinanttivirusten plak-kipuhdistusta varten, mikä suoritettiin käyttämällä aikaisemmin kuvattuja menetelmiä (O'Reilly, D.R., L.K. Miller ja V.A. Luckow, Baculovirus Expression Vectors - A Laboratory Manual, 1992, New York: W.H. Freeman), paitsi että agaroosipäällyste 25 sisälsi 125 pg/ml X-gal:a (5-bromi-4-kloori-3-indolyyli-B-D-galaktopyranosidi? GIBCO-BRL). 5 d inkubaation, 27°C:ssa, jälkeen ei-rekombinanttiplakit arvioitiin positiivisestä kromo-geenisestä reaktiosta X-gal-substraattiin ja niiden asemat merkittiin. Rekombinanttiplakit tehtiin sitten näkyviksi li-30 säämällä toinen päällyste, jossa oli 100 Mg/ml MTTitä (3-[4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli]2,5,difenyylitetrasoliumbromidi; Sigma) . Oletetut rekombinantti virusplakit kerättiin korkin kautta imemällä ja puhdistettiin lukuisilla plakkieristyksen kierroksella homogeenisyyden varmistamiseksi. Luotiin viruskannat 35 plakki-puhdistetun viruksen sarjassa tapahtuvalla alhaisella pasaasimäärällä. Tuotettiin yhden viruskloonin (vTIE-2-resep-toriaine) alhaisen pasaasin varastot.

32 SF-2lAE-soluja viljeltiin alustassa, jossa ei ollut seerumia (SF—900 II, Gibco BRL), jossa oli 1 x antibiootti/antimy-koottinen liuos (Gibco BRL) ja 25 mg/1 gentamysiiniä (Gibco BRL). Lisättiin PlUronic F-68:aa surfaktantiksi lopulliseen 1 5 g/1 konsentraatioon. Viljelmiä (4 1) kasvatettiin bioreakto- rissa (Artisan Cell Station System) ainakin 3 d ennen infektiota. Soluja kasvatettiin 27°C:ssa kaasuttamalla 50 prosenttiin liuennutta happea, 80 ml/min kaasun virtausnopeudella (ilmastus kaasunpirskotusrenaalla). Ravistelu tehtiin meri-10 tyyppisellä sekoittajallalla 100 rpm nopeudella. Solut kerättiin logaritmisen kasvufaasin keskivälillä (noin 2 x 106 solua/ml) , konsentroitiin sentrifugoimlla ja infektoitiin 5 plakkia muodostavalla yksiköllä vTIE-2 reseptoriainetta solua kohti. Solut ja ymppi saatettiin 400 mlsksi tuoreella alustal-15 la ja virusta adsorboitiin 2 h 27°Csssa sekoituspullossa. Viljelmä suspendoitiin sitten uudestaan lopulliseen 8 1 tilavuuteen alustaan, jossa ei ollut seerumia ja soluja inkuboi-tiin bioreaktorissa käyttämällä aikaisemmin kuvattuja olosuhteita.

20

Viljelalusta vTIE2-reseptoriaineella infektoiduista SF21AE-soluista kerättiin sentrifugaatiolla (500 x g, 10 min) 72 h infektion jälkeen. Solusuprenatantit saatettiin pH Siksi NaOH: 11a. Lisättiin EDTAita lopulliseen 10 mM konsentraatioon ja 25 supernatantin pH säädettiin uudestaan 8:ksi. Supernatantit suodatettiin (0,45 μιη, Millipore) ja laitettiin proteiini A-kolonniin (proteiini A sepharose 4, nopea virtaus tai HiTrap-proteiini A, molemmat Pharmacia). Kolonni pestiin PBStllä, jossa oli 0,5 M NaCl:ää, kunnes absorbanssi 280 nm:ssä väheni 30 peruslinjalle. Kolonni pestiin PBS:ssä ja eluoitiin 0,5 M e-tikkahapolla. Kolonnifraktiot neutraloitiin välittömästi elu-oimalla putkiin, joissa oli 1 M Tris pH 9. Piikkifraktiot, joissa oli TIE-2 RB, kerättiin ja dialysoitiin PBSrää vastaan.

35

Esimerkki 3

Osoitus että TIE-2:11a on kriittinen osuus verisuonten kehit tymisessä 33 5 Kun tunnetun TIE-2-reseptorin ligandin puuttuminen osoitettiin , pääteltiin että saattaisi olla mahdollista saada selvä käsitys TIE-2:n toiminnasta viemällä "ylimäärin" liukoista TIE-2-reseptoriainetta (TIE-2 RB) kehittyvään systeemiin. TIE-2 RB:n mahdollinen kyky sitoa ja täten neutraloida saatavilla 10 olevaa TIE-2-ligandia voisi johtaa normaalin verisuonen kehittymisen huomattavaan hajoamiseen ja ligandin karakterisointi -seen. Jotta tutkitaan, voitaisiinko TIE-2 RB:tä käyttää hajottamaan verisuonen kehittyminen aikaisissa kanan alkioissa, pieniä palasia biologisesti itseensä imevään vaahtoon imeytet-15 tiin TIE-2 RB:tä ja insertoitiin välittömästi rakkokalvomem-braanin alapuolelle asemiin, jotka olivat juuri primitiivisen alkion ulkopuolella.

Aikaiset kanan alkiot kehittyvät munankeltuaisen päällä pie-20 nestä solujen levystä, jota peittää sikiön rakkokalvomembraani (CAM). Endoteelisolut, jotka reunustavat verisuonistoa alkiossa, syntyvät sekä alkion ulkoisista että sisäisistä soluläh-teistä. Alkion ulkoisesti johdetut endoteelisolut, jotka tarjoavat pääasiallisen lähteen endoteelisoluille alkiossa, ovat 25 peräisin mesenkyymin yhteenkasvuista, jotka sijaitsevat lateraalisesti varsinaisen alkion ympärillä, aivan CAM:n alapuolella. Kun nämä mesenkyymisolut valmistuvat, ne synnyttävät yleisen kantaisän sekä endoteeli- että hematopoettisille so-lusukuperille, joita nimitetään hematoblasteiksi. Puolestaan 30 hemangioblastitt synnyttävät angioblastien (endoteelisolujen kantaisä) sekapopulaation ja verisolujen kantasolut (moneen suuntaan kehittymään pystyvä hematopoeettinen prekursori). Verenkiertojärjestelmän jäänteiden muodostuminen alkaa kun endoteelisolun jälkeläiset jakaantuvat muodostamaan yhden so-35 lun paksuisen rakkulan, joka ympäröi primitiivisiä verisoluja. Näiden solukomponenttien lisääntyminen ja vaellus todennäköisesti tuottaa hyvin suuren veerellä täytettyjen mikrosuonten verkoston CAM:n alapuolelle, joka lopuksi tunkeutuu alkioon liittymään rajoitettuihin, alkion sisäisestä johdettuihin ve- risuonielementteihin.

34

Juuri hedelmöitettyjä kananmunia, joita saatiin Spafas:lta, 5 Inc. (Boston, MA), inkuboitiin 37,5°c:ssa, 55 % RH. Noin 24 kehittymisessä munankuori pyyhittiin 70 prosenttisella etanolilla ja käytettiin hammaslääkärin poraa tekemään 1,5 cm reikä jokaisen munan tylppään kärkeen. Kuorikalvo poistettiin ilmatilan paljastamiseksi suoraan alkion yläpuolella. Leikattiin 10 pieniä suorakulmaisia paloja steriilistä Gelfoam:sta (Upjohn) leikkausveitsellä ja upotettiin yhtä suuriin konsentraatiohin joko TIE-2- tai EHK-l-reseptoriainetta. EHK-l-reseptoriaine tehtiin, kuten on esitetty esimerkissä 2 käyttämällä EHK-1 solun ulkoista domeenia TIE-2:n solun ulkoisen domeenin sijas-15 ta (Maisonpierre et ai., oncogene 8: 3277-3288 (1993)). Jokainen Gelfoam-pala absorboi noin 6 Mg proteiinia 30 Ml:ssa. Käytettiin steriilejä kellosepän pihtejä tekemään pieni reikä CAM:iin asemaan, joka oli useita mm lateraalisesti primitiiviseen alkioon. Suurin osa RB-upotetusta Gelfoam-palasta inser-20 toitiin CAM:n alapuolelle ja munankuori suljettiin teippipa-lalla. Muita samalla lailla käsiteltyjä munia käsiteltiin rinnakkain erilaisen, neuronaalisesti ekspressoidun reseptori -tyrosiinikinaasi, EHK-1 RB:n kanssa (Maisonpierre et ai., Oncogene 8: 3277-3288 (1993)). Kehittymisen annettiin edetä 4 d 25 ja sitten alkiot tutkittiin tarkastelemalla visuaalisesti. Alkiot poistettiin rikkomalla varovasti kuoret astioissa, joissa oli lämmitettyä PBS:ää ja varovasti leikkaamalla alkio pois ympäröivän CAM:n kanssa. Kahdestatoista munasta, joista jokainen oli käsitelty RB:llä, oli kehittynyt 6 TIE-2 RB- ja 30 5 EHK-1 RB- käsiteltyä alkiota yli vaiheen, joka havaittiin kokeen alussa. Näiden kehittyneiden alkioiden välillä nähtiin dramaattinen ero, kuten kuvioissa IA ja IB on esitetty. Ne, joita oli käsitelty EHK-1 RB:llä, näyttivät kehittyvän suhteellisen normaalisti. Neljä viidestä EHK-l-alkiosta oli elä-35 viä arvioituna lyövän sydämen läsnäolosta. Lisäksi alkion ulkopuolinen verisuonisto, joka on visuaalisesti ilmeinen johtuen punaisista verisoluista, oli runsas ja ulottui useita senttimetrejä lateraalisesti CAM:n alle. Päinvastoin, ne joita 35 oli käsitelty TIE-2 RB:llä, olivat äärimmäisen kitukasvuisia, ollen 2-5 mm halkaisijaltaan, verrattuna EHK-1 RB-alkioihin, jotka olivat yli 10 mm halkaisijaltaan. Kaikki TIE-2 RB-käsi-tellyt alkiot olivat kuolleita ja niiden CAM:sta puuttui ve-5 risuonet. TIE-2 RB:n kyky blokata verisuoniston kehittyminen kanassa osoittaa, että TIE-2-ligandi on tarpeellinen verisuoniston kehittymiselle.

Esimerkki 4 10 TIE-2-spesifisen sitomisaktiivisuuden tunnistaminen "konditi- oidussa" alustassa ras-onkogeenillä transformoidusta C2C12 hiiren myoblasti-solulinjasta

Kun seulottiin 10-kertaisesti konsentroiduista solu-Mkonditi-15 oiduista" alustoista (10 x CCM) eri solulinjoista liukoisen, TIE-2-spesifisen sitomisaktiivisuuden läsnäoloa (BIAcore; Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ), paljastui sitomisaktiivi-suus seerumittomasta alustasta onkogeenisellä ras:11a transformoiduista C2C12-soluista (C2C12-ras), RAT 2-ras- (mikä on 20 ras-transformoitu fibroblastisolulinja) , ihmisen glioblastoma T98G- ja ihmisen neuroblastoma soluiinjasta, joka tunnetaan SHEP-1:nä.

C2C12-ras 10 x CCM oli peräisin stabiilisti transfektoidusta 25 C2C12-myoblastilinjasta, joka oli onkogeenisesti transformoitu transfektoimalla H-ras T-24-mutantilla standardeilla kalsium-fosfaattipohjäisillä menetelmillä. SV40-pohjainen neosmysiini-resistenssi ekspressioplasmidi kytkettiin fysikaalisesti ras ekspressioplasmidiin transfektoitujen kloonien valinnan salli-30 miseksi. Tuloksena olevat G418-resistenssit ras-C2C12-solut ylläpidettiin rutiininomaisesti yksikerroksisena kerroksena muoviastioissaDMEM/glutamiini/penisilliini-streptomysiinissä, johon oli lisätty 10 % vasikan sikiön seerumia (FCS). Seerumi-ton C2C12-ras 10 X CCM tehtiin maljaamalla solut siten, että 35 se oli 60 % täyteen kasvanut, määritetyille alustoille 12 tunniksi. (Zhan ja Goldfarb, Mol. Cell. Biol. 6: 3541-3544 (1986-)); Zhan, et ai., Oncogene 1: 369-373 (1987)). Alusta heitettiin pois ja korvattiin tuoreella DMEM/Q/P-S:llä 24 tunniksi.

36 Tämä alusta kerättiin ja soluja pidettiin tuoreina DMEM/Q/P-S:nä, mikä kerättiin myös 24 lisätunnin kuluttua. Näihin CCM:-iin lisättiin proteaasi-inhibiittoreita PMSF:ää (1 mM) ja ap-rotiniinia (10 μg/ml) ja 10-kertaisesti konsentroitua sterii-5 leiliä kokoeksluusiomembraaneilla (Amicon). TIE-2-sitomiska-tiivisuus voitaisiin neutraloida inkuboimalla alustaa ylimäärän kanssa TIE-2 RB:tä, mutta ei inkuboimlla EHK-1 RB:n kanssa ennen BIAcore-analyysi ä.

10 10 X CCM:n sitomisaktivisuus mitattiin käyttämällä biosenso- ritekniikkaa (BIAcore; Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ), mikä tarkkailee biomolekyylisiä vuorovaikutuksia reaaliajassa pintaplasmoniresonanssilla. Puhdistettu TIE-2 RB kytkettiin kovalenttisesti primäärisien amiinien kautta CM5 tutkimuslaa-15 tua olevan sensorisirun (Pharmacia Biosensor; Piscataway, NJ) karboksimetyylidekstraanikerrokseen. Sensorisirun pinta aktivoitiin käyttämällä N-hydroksisukkinimidin (NHS) ja N-etyyli-Nr — (3-dimetyyliaminopropyyli)—karbodi—imidin (EDC) seosta, jonka jälkeen TIE-2 RB (25 pg/ml, pH 4,5) immobilisoitiin ja 20 ei-reagoimattomat kohdat deaktivoitiin 1,0 Milla etanoliamii-nilla (pH 8,5). Valmistettiin samalla lailla negatiivinen ! kontrollipinta EHK-l-reseptorikappaleesta.

Systeemissä käytetty ajopuskuri oli HBS (10 mM Hepes, 3,4 mM 25 EDTA, 150 mM NaCl, 0,005 % P20 surfaktantti, pH 7,4). 10 X CCM näytteet sentrifugoitiin 15 min 4°C:ssa ja kirkastettiin edelleen käyttämällä steriiliä, vähän proteiinia sitovaa 0,45 μη suodatinta (Millipore; Bedford, MA). Dekstraani (2 mg/ml) ja P20 surfaktanttia (0,005 %) lisättiin jokaiseen CCM-näyttee-30 seen. 40 μΐ erät injektoitiin yli immobilisoidun pinnan (joko TIE-2 tai EHK-1) 5 μΐ/min virtausnopeudella ja reseptorin sitomista tarkkailtiin 8 min. Sitomisaktiivisuus (resonanssiyk-siköt, RU) mitattiin eroksi peruslinja-arvon, joka oli määritetty 30 s ennen näyteinjektiota, ja mittauksen välillä, joka 35 oli otettu 30 s injektion jälkeen. Pinnan regeneraatio suoritettiin yhdellä 12 μ1:η pulssilla 3 Mistä MgCl2;a.

37

Kojeen melutaso on 20 RU; siksi mikä tahansa sitomisaktiivi-suus, jonka signaali on yli 20 RU, voidaan tulkita todelliseksi vuorovaikutukseksi reseptorin kanssa. C2C12-ras "konditoi-duille" alustoille sitomisaktiivisuudet olivat alueella 60-90 5 RU:ta TIE-2 RB immobilisoidulle pinnalle. Samoille näytteille, jotka määritettiin EHK-1 RB immobilisoidulla pinnalla, mitatut aktiivisuudet olivat alle 35 RU. Spesifinen sitominen TIE-2 reseptoriaineeseen arvioitiin inkuboimalla näytteitä ylimäärän kanssa, joko liukoista TIE-2:ta tai EHK-1 RB:tä, ennen sito-10 misaktiivisuuden määrittämistä. Liukoisen EHK-1 RB:n lisäämisellä ei ollut vaikutusta minkään näytteen TIE-2 sitomisaktii-visuuteen, kun taas liukoisen TIE-2:n läsnäollessa sitoutuminen pintaan on kaksikolmannesta vähemmän kuin mitattuna TIE-2:n puuttuessa. Toistettu määritys, jossa käytetään > 50X kon-15 sentroitua C2C12-ras CCM:ää, johti nelinkertaiseen lisääntymiseen verrattuna TIE-2-spesifisen sitomissignaalin taustaan.

Esimerkki 5 C2Cl2-ras CCM sisältää aktiivisuutta, joka indusoi TIE-2-re-20 septorin tyrosiinifosforylaation C2C12-£aa 10 x CCM:stä tutkittiin sen kyky indusoida TIE-2 tyrosiinifosforylaatiota ABAE-soluissa. Seerumi-näännytettyjä ABAE-soluja inkuboitiin lyhyesti C2C12-ras CCM:n kanssa, lyy-25 sattiin ja altistettiin immunopresipitaatiolle ja Western analyysille, kuten edellä on kuvattu. Seerumi-näännytettyjen ABAE-solujen stimulaatio seerumittomalla C2C12-ras 10 x CCM: llä tehtiin seuraavasti. ABAE-solujen, joita oli näännytetty kuten edellä on kuvattu, alusta poistettiin ja korvattiin joko 30 määritetyllä alustalla tai 10 x CCM:llä, joka oli esilämmitet-ty 37°C:een. 10 min kuluttua alustat poistettiin ja solut huuhdeltiin kahdesti jään päällä ylimäärän kanssa PBS:ää, johon oli lisätty ortovanadaatti/NaF/bentsamidiinia. Solulyysaus ja TIE-2-spesifinen immunopresipitaatio tehtiin kuten edellä 35 on kuvattu.

38 kanssa, eivät osoittaneet TIE-2 tyrosiinifosforylaation induktiota, kun taas inkubointi C2C12-ras CCM:n kanssa stimuloi ainakin 100 x lisääntymisen TIE-2 fosforylaatiossa. Tämä aktiivisuus oli melkein kokonaan kulutettu loppuun esi-inkuboi-5 maila C2C12-ras 10 x CCM:ää 90 min huoneenlämmössä 13 μg:n kanssa TIE-2 RB:tä, joka oli kytketty proteiini G-Sepharose-helmiin. Alustasta, jota inkuboitiin yksin proteiini G-Sepha-rosen kanssa, ei tätä fosforyloivaa aktiivisuutta oltu kulutettu loppuun.

10

Esimerkki 6 TIE-2-ligandin ekspressiokloonaus COS-7-soluja viljetiin Dulbeccon muokatulla Eagle's alustalla 15 (DMEM), jossa oli 10 % naudan sikiön seerumia (FBS), 1 % kumpaakin penisilliiniä ja streptomysiiniä (P/S) ja 2 mM gluta-miinia 5 % C02-ilmakehässä. Hiiren myoblasti C2C12 ras solu-linjaa viljeltiin Eagle's minimal essential alustalla (EMEM), jossa oli 10 % FBS:ää, (P/S) ja 2 mM glutamiinia. Täysipitkät 20 hiiren TIE-2-ligandin cDNA-kloonit saatiin seulomalla C2C12 ras cDNA-kirjastoa pJFE14-vektorissa, jota ekspressoidaan COS-soluissa. Tämä vektori, kuten kuviossa 2 on esitetty, on vektorin pSRa modifioitu versio (Takebe, et ai., 1988, Mol. Cell. Biol. 8: 466-472). Kirjasto luotiin käyttämällä kahta BSTX1 25 restriktiokohtaa pJFE14-vektorissa.

COS-7-solut transfektoitiin lyhytaikaisesti joko pJFE14-kir-jastolla tai kontrollivektorilla DEAE-dekstraani transfektiop-rotokollalla. Lyhyesti, COS-7-solut maljattiin tiheydellä 1,0 30 x 106 solua/100 mm malja 24 h ennen transfektiota. Transfek-tiota varten soluja kasvatettiin seerumittomassa DMEM:ssä, jossa oli 400 μg/ml DEAE-dekstraania, 1 μΜ klorokiinia ja 2 mM glutamiinia ja 1 μg sopivaa DNA:ta, 3-4 h 37°C:ssa 5 % C02-il-makehässä. Transfektioalustat imettiin ja korvattiin fosfaat-35 tipuskuroidulla suolaliuoksella, jossa oli 10 % DMSO, 2-3 min. Tämän DMSO "shokin" jälkeen COS-7-solut laitettiin DMEM:ään, jossa oli 10 % FBS, 1 % kumpaakin penisilliiniä ja streptomysiiniä ja 2 mM glutamiinia, 48 h.

39

Koska TIE-2-ligandi eritetään, on tarpeellista läpäistä solut, jotta havaitaan reseptoriaineen koettimen sitoutuminen ligan-diin. Kaksi d transfektion jälkeen solut huuhdottiin PBStllä ja sitten inkuboitiin PBS:llä, jossa oli 1,8 % formaldehydiä, 5 15-30 min huoneenlämmössä. Sitten solut pestiin PBS:llä ja inkuboitiin 15 min PBSsn kanssa, jossa oli 0,1 % Triton X-100 ja 10 % naudan vasikan seerumia, solujen läpäisemiseksi ja ei-spesifisten sitomiskohtien blokkaamiseksi. Seulontaa jatkettiin suoralla värjäyksen paikantamisella käyttämällä TIE-2-10 reseptoriainetta, joka koostui TIE-2:n solunulkoisesta do-meenista, joka on fuusioitunut IgGl vakioalueeseen. Tämä re-septoriaine valmistettiin kuten esimerkissä 2 on esitetty. 100 mm astia transfektoitiin, kiinnitettiin ja läpäiseväksi tehdyt COS-solut koetettiin inkuboimalla niitä 30 min TIE-2-RB:n 15 kanssa. Sitten solut pestiin kahdesti PBS:llä ja inkuboitiin vielä 30 min PBS/10 % naudan vasikan seerumi/anti-ihmisen IgG-alkaalisen fosfataasikonjugaatin kanssa. Kolmen PBS-pesun jälkeen soluja inkuboitiin alkaalisessa fosfataasisubstraatissa 30-60 min. Astiasta tarkasteltiin sitten mikroskooppisesti 20 värjättyjen solujen läsnäolo. Jokaista värjättyä solua varten raaputettiin pieni alue soluista, mukaanluettuna värjätty solu, astiasta käyttämällä muovipipetin kärkeä ja plasmidi-DNA vapautettiin ja käytettiin bakteerisolujen elektoporaatioon. Yksittäisiä bakteeripesäkkeitä, joita seurasi elektroporaa-25 tiosta, kerättiin ja plasmidi-DNA, joka valmistettiin näistä pesäkkeistä, käytettiin transfektoimaan C0S-7-soluja, jotka koetettiin TIE-2-ligandin ekspressiolle, mikä varmistettiin sitoutumalla TIE-2-reseptoriaineisiin. Tämä salli yksittäisten kloonien, jotka koodaavat TIE-2-ligandia, tunnistamisen. TIE-30 2-ligandin ekspression vahvistaminen saatiin TIE-2-reseptorin fosforylaatiolla käyttämällä esimerkissä 5 esitettyä menetelmää. Plasmidiklooni, joka koodaa TIE-2-ligandia, tallennettiin ATCCihen 7.10.1994 ja merkittiin "pJFE14, joka koodaa TIE-2-ligandia", ATCC tallennusnumerolla 75910.

35 40

Esimerkki 7

Ihmisen TIE-2-ligandia koodaavan täysipitkän cDNA-kloonin eritys ja sekvensointi 5

Ihmisen sikiön keuhkon cDNA-kirjasto lambda gt-10:ssä (katso kuvio 3) saatiin Clontech Laboratories:sta, Inc. (Palo Aito, CA). Plakit mal jättiin tiheydellä 1,25 x 106/20 x 20 cm maljalle ja otettiin repiikasuodattimet standardimemenetelmien 10 mukaisesti (Sambrook, et ai., Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2. toim., sivu 8.46, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York).

Ihmisen tie-2-1igandiklonien eristäminen suoritettiin seuraa-15 vasti. 2,2 kb Xhol-fragmentti tallennetusta tie-2-ligandikloo-nista (ATCC nro 75910 - katso esimerkki 6 edellä) leimattiin satunnaisilla alukkeilla spesifiseen noin 5 x 10® cpm/ng aktiivisuuteen. Hybridisaatio suoritettiin 65°C;ssa hybridisaa-tioliuoksessa, jossa oli 0,5 mg/ml lohen sperman DNA:ta. Suo-20 dattimet pestiin 65°C:ssa 2 x SSC;ssä, 0,1 % SDS:ssä ja altistettiin Kodak XAR-5-f ilmi Ile yön yli -70°C:ssa. Positiivinen faagi plakkipuhdistettiin. Puhtaan faagin korkean tiitterin faagilysaatteja käytettiin eristämään DNA Qiagen-kolonnin a-vulla käyttämällä standarditekniikoita (Qiagen, Inc., Chats-25 worth, CA, 1995 luettelo, sivu 36). Faagi-DNA pilkottiin Eco-RI:llä kloonatun cDNA-fragmentin vapauttamiseksi seuraavaa jatkokloonaamista varten. Lambda-faagivektori, jossa on ihmisen tie-2-ligandin DNA;ta, tallennettiin ATCC:hen 26.10.1994, merkittynä AgtlO, joka koodaa htie-2-ligandi i:tä (ATCC tal-30 lennusnro 75928). Faagi-DNA voidaan altistaa suoraan DNA-sek-venssianalyysiin dideoksi ket juterminaatiomenetelmällä (Sanger et ai., 1977, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74: 5463-5467).

Ihmisen TIE-2-ligandin jatkokloonaaminen nisäkkään ekspres-3 5 siovektori in

Klooni AgtlO, joka koodaa htie-2-ligandi l:tä, sisältää EcoRI kohdan, joka sijaitsee 490 emäsparia alaspäin ihmisen tie-2- 41 ligandin koodaussekvenssin aloituksesta. Koodausalue voidaan leikata käyttämällä ainutlaatuisia restriktiokohtia aloitus-ja lopetuskodoneista ylöspäin ja alaspäin, vastaavasti. Esimerkiksi Spel-kohtaa, joka sijaitsee 70 bp 5' aloituskodoniin, 5 ja Bpuil02iitä (tunnetaan myös Blpl:nä), joka sijaitsee 265 bp 3' lopetuskodoniin, voidaan käyttää leikkaamaan täydellinen koodausalue. Tämä voidaan sitten jatkokloonata pJFE14 kloo-nausvektoriin käyttämällä Xbal- (yhteensopiva Spel yli jäävän kanssa) ja Pstl-kohtia (Pstl- ja Bpu ll02i-kohdat on molemmat 10 tehty tasapäisiksi).

Ihmisen TIE-2-ligandin sekvensointi

Koodausalue kloonista XgtlO, joka koodaa htie-2-ligandi l:tä, 15 sekvensoitiin käyttämälllä ABI 373A DNA-sekvenssoria ja Taq Dyedeoxy Terminator Cycle Sequencing Kittiä (Applied Biosys-tems, Inc., Foster City, CA). Kuviossa 4 on esitetty kloonin IgtlO ihmisen TIE-2-ligandin, joka koodaa htie-2-ligandi l:tä, nukleotidi- ja johdettu aminohapposekvenssi.

20

Lisäksi täysipitkän ihmisen TIE-2-ligandin cDNA-kloonit saatiin seulomalla ihmisen glioblastoma T98G cDNA-kirjastoa pJFE-14-vektorissa. Kloonit, jotka koodaavat ihmisen TIE-2-ligan-dia, tunnistettiin DNA-hybridisaatiolla käyttämällä 2,2 kb 25 Xhol-fragraenttia tallennetusta tie-2-ligandikloonista (ATCC nro 75910) koettimena (katso esimerkki 6 edellä). Koodausalue sekvenssoitiin käyttämällä ABI 373A DNA-sekvenssoria ja Taq Dyedeoxy Terminator Cycle Sequencing Kittiä (Applied Biosys-tems, Inc., Foster City, CA). Tämä sekvenssi oli melkein sa-30 manlainen kuin kloonin IgtlO, joka koodaa htie-2-ligandi l:tä. Kuten kuviossa 4 on esitetty, klooni AgtlO, joka koodaa htie- 2-ligandi l:tä, sisältää lisäksi tulevan glysiinijäännöksen, jota nukleotidit 1114-1116 koodaavat, T98G-kloonin koodausse-kvenssi ei sisällä glysiini jäännöstä, mutta on muuten identti-35 nen kloonin Agtio koodaussekvenssin kanssa, joka koodaa htie- 2-ligandi 1:tä. Kuvio 5 esittää ihmisen TIE-2-ligandin nukleotidi- ja johdetun aminohapposekvenssin T98G-kloonista.

42

Esimerkki 8

Ihmisen TIE-2-ligandia koodaavan toisen täysipitkän cDNA-kloo-nin eristys ja sekvensointi 5 Ihmisen sikiön keuhkon cDNA-kirjasto lambda gt-10:ssä (katso kuvio 3) saatiin Clontech Laboratories:sta, Inc. (Palo Aito, CA). Plakit maljättiin tiheydellä 1,25 x 106/20 x 20 cm maljalle ja otettiin repiikasuodattimet standardimemenetelmien mukaisesti (Sambrook, et ai., Molecular Cloning: A Laboratory 10 Manual, 2. toim., sivu 8.46, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). Kaksoissuodattimista seulottiin vähän tiukennetuissa olosuhteissa (2 x SSC, 55°C) koettimilla, jotka oli tehty ihmisen tie 2 L-l-sekvenssille. Yksi kaksoissuodattimista koetettiin 5' koettimen kanssa, joka koodaa ih-15 misen tie 2 L-l aminohappoja 25-265, kuten on esitetty kuviossa 4. Toinen kaksoisuodatin koetettiin 3' koettimen kanssa, joka koodaa ihmisen tie 2 L-l-sekvenssin aminohappoja 282-498 (katso kuvio 4). Molemmat koettimet hybridisoitiin 55°C:ssa hybridisaatioliuoksessa, jossa oli 0,5 mg/ml lohen sperman 20 DNA:ta. Suodattimet pestiin 2 x SSC:ssä 55°C:ssa ja altistettiin yön yli röntgenfilmille. Lisäksi kaksoissuodattimet hybridisoitiin myös normaalin tiukennetuissa olosuhteisssa (2 x SSC, 65°C:ssa) hiiren tie2L täysipitkään koodauskoettimeen (F3-15, Xhol-insertti). Kolme positiivista kloonia, jotka 25 täyttivät seuraavan kriteerin, kerättiin: i. hybridisaatiota ei nähty täysipitkään (hiiren) koettimeen normaalin tiukennetuissa olosuhteissa ja ii. hybridisaatio nähtiin vähän tiukennetuissa olosuhteissa sekä 5'- että 3'-koettimiin. Faagi DNA:n EcoRI-pilkkominen, joka saatiin näistä klooneista, osoitti 30 kahta itsenäistä kloonia, joiden inserttikoot olivat noin 2,2 kb ja noin 1,8 kb. 2,2 kb EcoRI-insertti jatkokloonattiin sekä pBluescript KS (Stratagene) että nisäkkään ekspressiovektorin, joka on sopiva käytettäväksi COS-soluissa, EcoRI-kohtiin. Nisäkkään ekspressiovektorilie tunnistettiin kaksi suuntausta. 35 2,2 kb insertti pBluescript KS:ään tallennettiin ATCC:hen 9.

12.1994 ja merkittiin pBluescript KS, joka koodaa ihmisen TIE

2-ligandi 2:ta. TIE 2-ligandi 2:n koodaussekvenssin aloitus- kohta on noin 355 emäsparia alaspäin pBluescript EcoRi-kohdas ta.

43 C0S-7-solut transfektoitiin lyhytaikaisesti joko ekspres-5 siovektorilla tai kontroi1ivektori1la DEAE-dekstraani trans-fektioprotokollalla. Lyhyesti, COS-7-solut maljättiin tiheydellä 1,0 x 106 solua/100 mm malja 24 h ennen transfek-tiota. Transfektiota varten soluja kasvatettiin seerumittomas-sa DMEM:ssä, jossa oli 400 μq/ml DEAE-dekstraania, 1 μΜ kloro-10 kiinia ja 2 mM glutamiinia ja 1 μ9 sopivaa DNA:ta, 3-4 h 37°C: ssa 5 % C02-ilmakehässä. Transfektioalustat imettiin ja korvattiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella, jossa oli 10 % DMSO, 2-3 min. Tämän DMSO "shokin" jälkeen COS-7-solut laitettiin DMEM:ään, jossa oli 10 % FBS, 1 % kumpaakin penisil-15 liiniä ja streptomysiiniä ja 2 mM glutamiinia, 48 h.

Koska TIE-2-ligandi eritetään, on tarpeellista läpäistä solut, jotta havaitaan reseptoriaineen koettimen sitoutuminen ligan-diin. Transfektoidut C0S-7-solut maljättiin tiheydellä 1,0 x 20 106 solua/100 mm malja. Solut huuhdottiin PBS:llä ja sitten inkuboitiin PBS:llä, jossa oli 1,8 % formaldehydiä, 15-30 min huoneenlämmössä. Sitten solut pestiin PBSillä ja inkuboitiin 15 min PBS:n kanssa, jossa oli 0,1 % Triton X-100:aa ja 10 % naudan vasikan seerumia, solujen läpäisemiseksi ja ei-spesi-25 fisten sitomiskohtien blokkaamiseksi. Seulontaa jatkettiin suoralla värjäyksen paikantamisella käyttämällä TIE-2-resepto-riainetta, joka koostui TIE-2:n solunulkoisesta domeenista, joka on fuusioitunut IgGl vakioalueeseen. Tämä reseptoriaine valmistettiin kuten esimerkissä 2 on esitetty. Transfektoidut 30 COS-solut koetettiin inkuboimalla niitä 30 min TIE-2-RB:n kanssa. Sitten solut pestiin kahdesti PBSrllä, kiinnitettiin me-tanolilla ja inkuboitiin vielä 30 min PBS/10 % naudan vasikan seerumi/anti-ihmisen IgG-alkaalisen fosfataasikonjugaatin kanssa. Kolmen PBS-pesun jälkeen soluja inkuboitiin alkaalisessa 35 fosfataasisubstraatissa 30-60 min. Astiasta tarkasteltiin sitten mikroskooppisesti värjättyjen solujen läsnäoloa. Solujen, jotka ekspressoivat yhtä kloonin suuntaa, mutta eivät toista suuntaa, nähtiin sitoutuvan TIE-2 reseptorlaineeseen.

44

Ammattimies näkee helposti, että kuvattuja menetelmiä voidaan käyttää tunnistamaan lisää muita TIE-ligandiperheen läheisiä jäseniä.

5 Toisen ihmisen TIE-2-ligandin sekvenssointi

Koodausalue kloonista pBluescript KS, joka koodaa ihmisen TIE- 2-ligandi 2:ta, sekvensoitiin käyttämälllä ABI 373A DNA-sek-venssoria ja Taq Dyedeoxy Terminator Cycle Sequencing Kittiä 10 (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) . Kuviossa 6 on esitetty kloonista pBluescript KS, joka koodaa ihmisen TIE-2-ligandi 2:ta, ihmisen TIE-2-ligandin nukleotidi- ja johdettu aminohapposekvenssi.

15 Esimerkki 9 TIE-2-ligandi on reseptoriantagonisti "Konditioiduista" alustoista, COS-soluista, jotka ekspressoi-vat joko TIE-2-ligandi 2:ta (TL2) tai TIE-2-ligandi l:tä (TL-20 1), verrattiin niiden kykyä aktivoida TIE-2-reseptorit, joita on luonnollisesti ihmisen endoteelisolulinjassa.

Käytettiin Lipofectamine-reagenssia (GIBCO-BRL, Inc.) ja suositeltuja protokolleja transfektoimaan COS-7-solut, joko pJF-25 E14 ekspressiovektorilla yksin, pJFE14-vektorilla, jossa oli ihmisen TIE-2-ligandi 1 cDNA tai pMT21 ekspressiovektorilla (Kaufman, R.J., 1985, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82: 689-693), jossa oli ihmisen TIE-2-ligandi 2 cDNA. COS-alustat, joissa oli eritettyjä ligandeja, kerättiin 3 d jälkeen ja konsentroi-30 tiin 20-kertaisesti diasuodatuksella (DIAFLO ultrasuodatusmem-braanit, Amicon, Inc.). Näissä alustoissa läsnäolevan aktiivisen TIE-2-ligandi l:n ja TIE-2-ligandi 2:n määrä määritettiin ja ekspressoitiin TIE-2-reseptori-spesifisenä sitomisaktiivi-suuden määränä (resonanssiyksikköinä, R.U.), joka mitattiin 35 BIAcore sitomismäärityksellä.

Northern (RNA) analyysit paljastivat merkittävät tasot TIE-2-transkriptejä HAEC (Human Aortic Endothelial Cell) ihmisen 45 primäärisissä endoteelisoluissa (Clonetics, Inc.)· Siksi näitä soluja käytettiin tutkimaan, onko TIE-2-reseptori tyrosiini-fosforyloitu, kun altistetaan COS-alustoille, joissa on TIE-2-ligandeja. HAEC-soluja ylläpidettiin täydellisessä endoteeli-5 solun kasvualustassa (Clonetics, Inc.), jossa oli 5 % naudan sikiön seerumia, liukoista naudan aivouutetta, 10 ng/ml ihmisen EGF:ää, 1 mg/ml hydrokortisonia, 50 mg/ml gentamisiinia ja 50 ng/ml amfoterisiini-B:tä. Arviointi, voisivatko TL1 ja TL2 aktivoida TIE-2-reseptoria HAEC-soluissa, tehtiin seuraavasti. 10 Puoleksi täyteen kasvaneita HAEC-soluja näännytettiin seerumilla 2 h korkea-glukoosisessa Dulbecco's MEM:llä, johon oli lisätty L-glutamiinia ja penisilliini-streptomysiiniä 37°C: ssa, jonka jälkeen näännytysalusta korvataan ligandia sisältävillä "konditioiduilla" COS-alustoilla 7 minuutiksi 37°C:ssa 5 15 prosenttisessa C02-inkubaattorissa. Solut lyysattiin sen jälkeen ja TIE-2-reseptoriproteiinia saatiin talteen lysaattien immunopresipitaatiolla TI E- 2 -pept idiant iseerumin kanssa, jonka jälkeen Western blotting antifosfotyrosiini-antiseerumin kanssa, juuri kuten esimerkissä 1 on kuvattu. Tulokset esitetään 20 kuviossa 7. Fosfotyrosiinitasot TIE-2-reseptorissa (TIE2-R) indusoitiin käsittelemällä HEAC-soluja TIE-2-1igandi l:llä (raita LI), mutta ei TIE-2-ligandi 2:11a (raita L2) "konditi-oiduilla" COS-alustoilla. VALE on "konditioidut" alustat COS; sta, jotka oli transfektoitu tyhjällä JFE14 vektorilla.

25

Todiste, että sekä TL1 että TL2 sitoutuvat TIE-2-reseptoriin, osoitettiin käyttämällä BIAcorea määrittämään TI E-2-reseptorin spesifiset sitornisaktiivisuudet transfektoiduissa COS-alus-toissa ja immunovärjäämällä TL1- ja TL2-ekspressoivat COS-so-30 lut TIE-2 reseptoriaineilla.

Koska TL2 ei aktivoinut TIE-2-reseptoria, hakijat ryhtyivät määrittämään, olisiko TL2 kykenevä toimimaan Tl 1-aktiivisuuden antagonistina. HAEC-fosforylaatiomääritykset suoritettiin, 35 missä soluja inkuboitiin ensin "ylimäärän" kanssa TL2:ta, jonka jälkeen lisättiin laimeata TLl:tä. Pääteltiin että TIE-2:n aikaisempi reseptoriin sijoittuminen, johtuen korkeista TL2-tasoista, saattaisi estää reseptorin myöhemmän stimuloinnin, joka seuraa altistamista TLl:lle, jota on läsnä rajoittava konsentraatio.

46

Puoleksi täyteen kasvaneita HAEC-soluja seerumi-näännytettiin, 5 kuten edellä on kuvattu ja sitten inkuboitiin 3 min. 37°C:ssa 1-2 ml:n kanssa 20 X COS/JFE14-TL2 "konditioidun" alustan kanssa. Kontrollimaljoja käsiteltiin 20 X C0S/JFE14 - vain alusta (VALE). Maljat poistettiin inkubaattorista ja sitten lisättiin erilaisia laimennuksia C0S/JFE14-TLl-alustaa, jonka jäl-10 keen maljoja inkuboitiin edelleen 5-7 min 37°C:ssa. Solut huuhdeltiin sen jälkeen, lyysattiin ja TIE-2-spesifistä tyros iinifosfory laat iota lysaateissa tutkittiin reseptori-im-munopresipitaatiolla ja Western blottauksella, kuten edellä on kuvattu. Tehtiin TLl-laimennukset käyttämällä 20 X COS/JFE14-15 TLl-alustaa, joka oli laimennettu 2x, 0,5x, 0,lx tai 0,02x lisäämällä 20 X COS/JFE14 - vain alustaa. Ensimmäisten 20 x TL1 ja 20x TL2 COS-alustojen määrittäminen käyttämällä BIAcore biosensoritekniikkaa, osoitti että niissä oli samanlaiset määrät TIE-2-spesifisiä sitomisaktiivisuuksia, so. 445 R.U. ja 20 511 R.U. TLl:lle ja TL2:lle, vastaavasti. Antifosfotyrosiinin

Western biotin tulokset, esitetty kuviossa 8, osoittavat että kun verrattiin HAEC-solujen aikaisempaan käsittelyyn VALE-a-lustalla (raita 1), HAEC-solujen aikaisempi käsittely ylimäärällä TIE-2-ligandi 2:ta (raita 2) antagonisoi laimean TIE-2-25 ligandi l:n myöhemmän kyvyn aktivoida TIE-2-reseptoria (TIE2-R).

Nämä tiedot osoittavat, että TL2 päinvastoin kuin TL1, ei kyennyt stimuloimaan TIE-2-reseptorikinaasiaktiivisuutta HAEC-30 soluissa. Lisäksi endoteelisolujen esi-inkubaatio korkeiden TL2-konsentraatioiden kanssa, jonka jälkeen TLl:n lisäys blok-kasi TL1:n kyvyn stimuloida TIE-2-reseptoria, osoittaen että TL2 on TIE-2-reseptoriantagonisti.

47

Esimerkki 10 TIE-2-spesifisen sitoraisaktiivisuuden tunnistaminen "konditi-oidussa" alustassa ja COS-solusupernatanteissa 5

Mitattiin 10 x CCM sitornisaktiivisuus solulinjoista C2C12 ras, Rat2 ras, SHEP ja T98G tai cos-solusupernatanteissa sen jälkeen, kun oli transfektoitu joko ihmisen ΤϊΕ-2-ligandi l:llä (hTLl) tai ihmisen TlE-2-ligandi 2:11a (hTL2) käyttämällä bio-10 sensoritekniikkaa (BIAcore; Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ), joka tarkkailee biomolekyylisiä vuorovaikutuksia reaaliajassa pintaplasmoniresonanssin kautta (SPR). Rotan tai ihmisen puhdistettu TIE-2-RB kytkettiin kovalenttisesti primäärisien amiinien kautta CM5 tutkimuslaatua olevan sensorihiuk-15 kasen (Pharmacia Biosensor? Piscataway, NJ) karboksimetyyli-dekstraanikerrokseen. Sensorihiukkasen pinta aktivoitiin käyttämällä N-hydroksisukkinimidin (NHS) ja N-etyyli-n'-(3-dime-tyyliaminopropyyli)-karbodi-imidin (EDC) seosta, jonka jälkeen TIE-2 RB immobilisoitiin (25 μ/ml, pH 4,5) ja reagoimattomat 20 kohdat deaktivoitiin 1,0 M etanoliamiinilla (pH 8,5). Yleensä kutakin reseptoriainetta kytkettiin 9000-10 000 RU:ta sensori-hiukkaseen.

Systeemissä käytetty ajopuskuri oli HBS (10 mM Hepes, 150 mM 25 NaCl, 0,005 % P20 surfaktantti, pH 7,4). Näytteitä sentrifu-goitiin 15 min 4°C:ssa ja kirkastettiin edelleen käyttämällä steriiliä, vähän proteiinia sitovaa 0,45 μν& suodatinta (Mil-lipore? Bedford, MA). Dekstraani (2 mg/ml) ja P20 surfaktantti (0,005 %) lisättiin jokaiseen näytteeseen. 40 μ1:η erät injek-30 toitiin immobilisoidun pinnan toiselle puolelle (joko rotan tai ihmisen TIE2) 5 μΐ/min virtausnopeudella ja reseptorin sitoutumista tarkkailtiin 8 min. Sitomisaktiivisuus (resonans-siyksiköt, RU) mitattiin erona peruslinja-arvon, joka oli määritetty 30 s ennen näytteen injektiota, ja mittaamisen, joka 35 oli otettu 30 s injektion jälkeen, välillä. Pinnan regeneraa-tio saatiin aikaan yhdellä 15 μΐ pulssilla 3 M:sta MgCl2:ta.

48 CCM-näytteet (C2C12 ras, Rat2 ras, SHEP, T98G) testattiin rotan TIE2 RB immobilisoituun pintaan, kun taas rekombinantti hTLl ja hTL2 testattiin ihmisen TIE2 RB immobilisoituun pintaan. Jokaisessa tapauksessa spesifinen sitoutuminen TIE-2-5 reseptorlaineeseen arvioitiin inkuboimlla näytteitä 25 μg/ml kanssa joko TIE-2- (rotta tai ihminen) tai trk RB-liuoksen kanssa, ennen kuin määritettiin sitomisaktiivisuus. Kuten kuvioissa 9 ja 10 on esitetty, liukoisen trkB RB:n lisäys aiheuttaa vähäisen laskun TIE-2 sitomisaktiivisuudessa, kun taas 10 liukoisen TIE-2 RB:n lisäys merkitsevästi vähentää sitomisak-tiivisuutta verrattuna siihen, mikä mitattiin TIE-2 RB:n puuttuessa .

Esimerkki 11 15 TIE-2 RB blokkaa spesifisesti TIE-2 reseptorin aktiivisuuden TIE-2 ligandi l:llä

Hakijat yrittivät määrittää, voiko liukoinen TIE-2 RB toimia kilpailevana inhibiittorina blokkaamaan TIE-2-reseptorin akti-20 vaation TIE2 ligandi l:llä (TL1). Tämän tekemiseksi TL-l:tä sisältäviä COS-alustoja esi-inkuboitiin joko TIE2- tai TrkB-RB:n kanssa ja sitten verrattiin niiden kykyä aktivoida TIE-2-reseptoreja, joita on luonnostaan ihmisen endoteelisessä solu-linjassa.

25

Luotiin "konditioidut" COS-alustat COS-7-soluista, jotka oli transfektoitu joko pJFE14 ekspressiovektorilla yksin (VALE) tai pJFEl4-vektorilla, jossa oli ihmisen TIE-2-ligandi 1 cDNA: ta (TL1) ja kerättiin, kuten esimerkissä 9 tässä edellä on 30 kuvattu, poikkeuksena että alustat steriilisuodatettiin, mutta ei konsentroitu. TL1:n määrä määritettiin ja ilmaistiin TIE-2-reseptori-spesifisen sitomisaktiivisuuden määränä (resonans-siyksikköinä, R.U.), joka mitattiin BIAcore sitomismäärityk-sellä.

Northern (RNA) analyysit paljastivat merkittävät tasot TIE-2-transkriptejä HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cell, ihmisen napalaskimon endoteelisolu) ihmisen primäärisissä en- 35 49 doteelisoluissa (Clonetics, Inc.)· Siksi näitä soluja käytettiin tutkimaan, voiko TIE-2-reseptori olla tyrosiinifosfory-loitu, kun altistetaan TIE-2- tai TrkB-RB:n läsnäollessa COS-alustoille, joissa on TL1. HUVEC-soluja ylläpidettiin 37°C: 5 ssa, 5 % C02:ssa täydellisessä endoteelisolun kasvualustassa (Clonetics, Inc.), jossa oli 5 % naudan sikiön seerumia, liukoista naudan aivouutetta, jossa oli 10 Mg/ml hepariinia, 10 ng/ml ihmisen EGF:ää, 1 μg/ml hydrokortisonia, 50 μg/ml genta-misiinia ja 50 ng/ml arafoterisiini-B:tä. Arvioinnit, voisiko 10 TLl aktivoida TIE-2-reseptoria HUVEC-soluissa, tehtiin seuraavasti. Täyteen kasvaneet astiat HUVEC-soluja seeruminäännytet-tiin 2-4 h alhaisen glukoosin Dulbecco's MEM:ssä 37°C:ssa, 5 % C02:ssa, jonka jälkeen inkuboitiin 10 min näännytysalustassa, jossa oli 0,1 mM natrium-orto-vanadaattia, mahdollinen fosfo-15 tyrosiinifosfataasien inhibiittori. Sillä välin "konditioitu-jaH COS-alustoja esi-inkuboitiin 30 min huoneenlämmössä, joko TIE-2- tai TrkB-RB:n kanssa, jota oli lisätty 50 μg/ml:aan. Sitten näännytysalusta poistettiin HUVEC-astioista ja inkuboitiin RB:tä sisältävien COS-alustojen kanssa 7 min 37°C:ssa. 20 HUVEC-solut lyysattiin seuraavaksi ja TIE-2-reseptoriproteiini otettiin talteen immunopresipitaatiolla TIE-2-peptidiantisee-rumin kanssa, jonka jälkeen Western blottaus anti-fosfotyro-siini-vasta-aineen kanssa, kuten esimerkissä 1 on kuvattu.

Tulokset on esitettu kuviossa 11. Fosfotyrosiinitasot TIE-2-25 reseptorissa indusoitiin käsittelemällä HUVEC-soluja TIE-2-ligandi l:llä (TLl), joka on vastaava kuin mitä nähtiin kontrollialustan (VALE) kanssa ja tämä induktio blokataan spesifisesti ennen inkubointia TIE2-RB:n (TIE2-Fc) kanssa, mutta ei inkuboitaessa TrkB-RBsn (TrkB-Fc) kanssa. Nämä tiedot o-30 soittavat, että liukoinen TIE-2 RB voi toimia selektiivisenä inhibiittorina blokkaamaan TIE-2-reseptorin aktivaation TIE-2-ligandi l:llä.

Esimerkki 12 35 ΤΙΕ-2-ligandiaineiden rakentaminen

Luotiin ekspressiorakenne, joka voisi tuottaa eritettyä proteiinia, jossa on ihmisen TIE-2-ligandi l:n (TLl) tai TIE-2- 50 ligandi 2:n (TL2) koko koodaussekvenssi fuusioituneena ihmisen immunoglobuliini gamma-1 vakioalueeseen (IgGl Fc). Näitä fuu-sioproteiineja kutsutaan TIE-2 "ligandiaineiksi” (TLl-Fc tai TL2-Fc). TLl-Fc:n ja TL2-Fc:n Fc-osa valmistettiin seuraavas-5 ti. DNA-fragmentti, joka koodaa ihmisen IgGlsn Fc-osaa, joka ulottuu proteiinin sarana-alueelta karboksiterminukseen, amp-lifioitiin ihmisen istukan cDNArsta PCRsllä oligonukleotidien kanssa, jotka vastaavat ihmisen IgGl:n julkaistua sekvenssiä; tuloksena oleva DNA-fragmentti kloonattiin plasmidivektoriin. 10 Sopivat DNA-restriktiofragmentit plasmidista, joka koodaa täy-sipitkää TLl:tä tai TL2;ta, ja ihmisen IgGl Fc-plasmidista ligoitiin lyhyen PCR-johdetun fragmentin molemmille puolille, mikä oli siten suunniteltu, että se fuusioi oikeaan lukuraamiin TL1 :n tai TL2 ;n ihmisen IgGl Fc proteiinia koodaavien 15 sekvenssien kanssa.

Saatiin mg-määriä TL2-Fc;tä kloonaamalla TL2-FC DNA-f ragmentti pVL1393 baculovirus-vektoriin ja myöhemmin infektoimalla Spo-doptera fruaioerda SF-21AE hyönteissolulin ja. Vaihtoehtoisesti 20 voidaan käyttää solulinjaa SF-9 (ATCC tallennusnro CRL-1711) tai solulinjaa BTI-TN-5bl-4. DNA, joka koodaa TL2-Fc:tä, kloonattiin Eco RI-Notl-fragmenttina baculoviruksen siirtoplasmi-diin pVL1393. Plasmidi DNA rekombinoitiin virus-DNA:han sekoittamalla 3 mg plasmidi-DNA:ta 0,5 mg:n kanssa Baculo-Gold 25 DNA;ta (Pharminigen), jonka jälkeen vietiin liposomeihin käyttämällä 30 mg Lipofectiniä (Gibco-BRL). DNA-liposomiseokset lisättiin SF-21AE-soluihin (2x 106 solua/60 mm astia) TMN-FH-alustassa (Modified Grace's Insect Cell Medium (GIBCO-BRL)) 5 h 27°C:ssa, jonka jälkeen inkuboitiin 27°C;ssa 5 d TMN-FH-alus-30 tässä, johon oli lisätty 5 % vasikan sikiön seerumia. Kudos-viljelmäalusta kerättiin rekombinanttivirusten plakkipuhdis-tusta varten, mikä suoritettiin käyttämällä aikaisemmin kuvattuja menetelmiä (O'Reilly, D.R., L.K. Miller, ja V.A. Luckow, Baculovirus Expression Vectors - A Laboratory Manual, 1992, 35 New York; W.H. Freeman), paitsi että agaroosipäällysteessä oli 125 mg/ml X-gal;a (5-bromi-4-kloori-3-indolyyli-b-D-galaktopy-ranosidi? GIBCO-BRL). 5 d inkubaation jälkeen 27°C:ssa ei-re-kombinanttiplakit arvoitiin positiivisesta kromogeenisestä 51 reaktiosta X-gal-substraattiin ja niiden asemat merkittiin. Rekombinanttiplakit tehtiin sitten näkyviksi lisäämällä toinen päällyste, jossa oli 100 mg/ml MTT:tä (3-[4,5-dimetyylitiat-sol-2-yyli]2,5,difenyylitetrasoliumbromidia; Sigma). Oletetut 5 rekombinantti-virusplakit kerättiin korkin kautta imemimällä ja puhdistettiin usealla plakkieristyksen kierroksella homogeenisyyden varmistamiseksi. Luotiin virusvarastot plakki-puhdistetun viruksen sarjassa tapahtuvalla alhaisella määrällä pasaaseja. Tuotettiin yhden viruskloonin (vTL2-klooni #7) ai-10 haisen pasaasin varastot.

SF-21AE--soluja viljeltiin alustassa, jossa ei ollut seerumia (SF-900 II, Gibco BRL), jossa oli 1 x antibiootti/antimy-koottinen liuos (Gibco BRL) ja 25 mg/1 gentamysiiniä (Gibco 15 BRL). Lisättiin Pluronic F-68:aa surfaktantiksi lopulliseen 1 g/1 konsentraatioon. Viljelmiä (4 1) kasvatettiin bioreakto-rissa (Artisan Cell Station System) ainakin 3 d ennen infektiota. Soluja kasvatettiin 27°C:ssa kaasuttamalla 50 prosenttiin liuennutta happea, 80 ral/min kaasun virtausnopeudella 20 (ilmastus kaasunpirkostusrenkaalla). Ravistelu tehtiin meri-tyyppisellä sekoittajalla 100 rpm nopeudella. Solut kerättiin logaritmisen kasvufaasin keskivälillä (noin 2 x 106 solua/ml), konsentroitiin sentrifugoimlla ja infektoitiin 5 plakkia muodostavalla yksiköllä vTL2-Fc:tä solua kohti. Solut ja ymppi 25 saatettiin 400 ml:ksi tuoretta alustaa ja virusta adsorboitiin 2 h 27°C:ssa sekoituspullossa. Viljelmä suspendoitiin sitten uudestaan lopulliseen 8 1 tilavuuteen alustaan, jossa ei ollut seerumia ja soluja inkuboitiin bioreaktorissa käyttämällä aikaisemmin kuvattuja olosuhteita.

30

Viljelalusta vTL2-Fc-infektoiduista SF21AE-soluista kerättiin sentrifugaatiolla (500 x g, 10 min) 72 h infektion jälkeen. Solusupernatantit saatettiin ph 8:ksi NaOH:lla. Lisättiin ED-TAita lopulliseen 10 mM konsentraatioon ja supernatantin pH 35 säädettiin uudestaan 8:ksi. Supernatantit suodatettiin (0,45 μη, Millipore) ja laitettiin proteiini A-kolonniin (proteiini A sepharose 4, nopea virtaus tai HiTrap-proteiini A, molemmat Pharmacia). Kolonni pestiin PBS:llä, jossa oli 0,5 M NaCltää, 52 kunnes absorbanssi 280 nm:ssä väheni peruslinjalle. Kolonni pestiin PBS:ssä ja eluoitiin 0,5 M etikkahapolla. Kolonnifrak-tiot neutraloitiin välittömästi eluoimalla putkiin, joissa oli 1 M Tris pH 9. Piikkifraktiot, joissa oli TL2-Fc, kerättiin ja 5 dialysoitiin PBS:ää vastaan.

Tallennukset

Seuraavat on tallennettu American Type Culture Collection:iin, 10 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, Budapestin sopimuksen mukaisesti. Plasmidiklooni, joka koodaa TIE-2-li-gandia, tallennettiin ATCC:hen 7.10.1994 ja merkittiin "pJFE-14, joka koodaa TIE-2-ligandia", ATCC tallennusnumerolla 759- 10. Rekombinantti Autographa California baculovirus, joka koo-15 daa TIE-2 reseptoriainetta, tallennettiin ATCC:hen 7.10.1994 ja merkittiin "vTIE-2-reseptoriaine" ATCC tallennusnroslla VR2484. Lambda-faagivektori, jossa on ihmisen tie-2-ligandi DNA, tallennettiin ATCCihen 26.10.1994 ja merkittiin AgtlO, ja joka koodaa htie-2-ligandi l:tä ATCC tallennusnro:lla 75928. 20 Plasmidiklooni, joka koodaa toista TIE-2-ligandia, tallennettiin ATCCihen 9.12.1994 ja merkittiin "pBluescript KS, joka koodaa ihmisen TIE 2 ligandi 2:ta" ATCC tallennsunro:11a 75-963.

25 Tätä keksintöä ei ole tarkoitus rajoittaa suoja-alueelta tässä kuvatuilla spesifisillä suoritusmuodoilla. Todellakin, keksinnön erilaiset modifikaatiot tässä kuvattujen lisäksi tulevat ammattimiehille ilmeisiksi edellä olleesta kuvauksesta ja mukana olevista kuvioista. Sellaisten modifikaatioiden on tar-30 koitus kuulua liitteenä olevien patenttivaatimusten piiriin.

5 53

SEKVENSSILISTAUS

(1) YLEISET TIEDOT: (i) HAKIJA: (A) NIMI: REGENERON PHARMACEUTICALS, INC.

(B) KATU: 777 OLD SAW MILL RIVER ROAD

(C) KAUPUNKI: TARRYTOWN

10 (D) OSAVALTIO: NEW YORK

(E) MAA: AMERIKAN YHDYSVALLAT

(F) POSTIKOODI: 10591

(A) NIMI: DAVIS, SAMUEL

15 (B) KATU: 332 WEST 88TH STREET, Apt. B 2

(C) KAUPUNKI: NEW YORK

(D) OSAVALTIO: NEW YORK

(E) MAA: AMERIKAN YHDYSVALLAT

(F) POSTIKOODI: 10024 20

(A) NIMI: BRUNO, JOANNNE

(B) KATU: 135 RAFKIND ROAD

(C) KAUPUNKI: BLOOMINGDALE

(D) OSAVALTIO: NEW JERSEY

25 (E) MAA: AMERIKAN YHDYSVALLAT

(F) POSTIKOODI: 07403

(A) NIMI: GOLDFARB, MITCHELL

(B) KATU: 327 TAFT ROAD

30 (C) KAUPUNKI: RIVER EDGE

(D) OSAVALTIO: NEW JERSEY

(E) MAA: AMERIKAN YHDYSVALLAT

(F) POSTIKOODI: 07661 35 (A) NIMI: ALDRICH, THOMAS H.

(B) KATU: 2-3 BROOK CLUB DRIVE

(C) KAUPUNKI: OSSINING

(D) OSAVALTIO: NEW YORK

(E) MAA: AMERIKAN YHDYSVALLAT

40 (F) POSTIKOODI: 10562 (A) NIMI: MAISONPIERRE, PETER C.

(B) KATU: 15 ELMORE AVENUE

(C) KAUPUNKI: CROTON

45 (D) OSAVALTIO: NEW YORK

(E) MAA: AMERIKAN YHDYSVALLAT

54 (F) POSTIKOODI: 10520

(A) NIMI: RADZIJEWEWSKI, CZESLAW

(B) KATU: 48 WASHINGTON AVENUE

5 (C) KAUPUNKI: NORTH WHITE PLAINS

(D) OSAVALTIO: NEW YORK

(E) MAA: AMERIKAN YHDYSVALLAT

(F) POSTIKOODI: 10603 10 (A) NIMI: JONES, PAMELA F.

(B) KATU: 85 KAREN STREET

(C) KAUPUNKI: FAIRFIELD

(D) OSAVALTIO: CONNECTICUT

(E) MAA: AMERIKAN YHDYSVALLAT

15 (F) POSTIKOODI: 06430 (A) NIMI: YANCOPOULOS, GEORGE D.

(B) KATU: 1519 BAPTIST CHURCH ROAD

(C) KAUPUNKI: YORKTOWN HEIGHTS

20 (D) OSAVALTIO: NEW YORK

(E) MAA: AMERIKAN YHDYSVALLAT

(F) POSTIKOODI: 10598 (ii) KEKSINNÖN NIMITYS: TIE-2-ligandit, niiden valmistusmenetelmät 25 ja käytöt (iii) SEKVENSSIEN LUKUMÄÄRÄ: 6 (iv) KONEKOODIMUOTO: 30 (A) VÄLINETYYPPI: levyke (B) TIETOKONE: IBM PC yhteensopiva

(C) KÄYTTÖJÄRJESTELMÄ: PC-DOS/MS-DOS

(D) OHJELMISTO: Patentin Release #1.0, Versio #1.30 (EPO) 35 (2) SEKVENSSIN ID NO:l TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 2149 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo 40 (C) JUOSTEISUUS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: tuntematon (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) 45 (ix) PIIRRE:

(A) NIMI/AVAIN: CDS

55 (B) SIJAINTI: 310..1806 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID ΝΟ:1: 5 CAGCTGACTC AGGCAGGCTC CATGCTGAAC GGTCACACAG AGAGGAAACA ATAAATCTCA 60 GCTACTATGC AATAAATATC TCAAGTTTTA ACGAAGAAAA ACATCATTGC AGTGAAATAA 120 10 AAAATTTTAA AATTTTAGAA CAAAGCTAAC AAATGGCTAG TTTTCTATGA TTCTTCTTCA 180 AACGCTTTCT TTGAGGGGGA AAGAGTCAAA CAAACAAGCA GTTTTACCTG AAATAAAGAA 240 CTAGTTTTAG AGGTCAGAAG AAAGGAGCAA GTTTTGCGAG AGGCACGGAA GGAGTGTGCT 300 15 GGCAGTACA ATG ACA GTT TTC CTT TCC TTT GCT TTC CTC GCT GCC ATT 348

Met Thr Val Phe Leu Ser Phe Ala Phe Leu Ala Ala lie 15 10 2 0 CTG ACT CAC AT A GGG TGC AGC AAT CAG CGC CGA AGT CCA GAA AAC AGT 396

Leu Thr His lie Gly Cys Ser Asn Gin Arg Arg Ser Pro Glu Asn Ser 15 20 25 GGG AGA AGA TAT AAC CGG ATT CAA CAT GGG CAA TGT GCC TAC ACT TTC 444 25 Gly Arg Arg Tyr Asn Arg lie Gin His Gly Gin Cys Ala Tyr Thr Phe 30 35 40 45 ATT CTT CCA GAA CAC GAT GGC AAC TGT CGT GAG AGT ACG ACA GAC CAG 492 lie Leu Pro Glu His Asp Gly Asn Cys Arg Glu Ser Thr Thr Asp Gin 30 50 55 60 TAC AAC ACA AAC GCT CTG CAG AGA GAT GCT CCA CAC GTG GAA CCG GAT 540

Tyr Asn Thr Asn Ala Leu Gin Arg Asp Ala Pro His Val Glu Pro Asp 65 70 75 35 TTC TCT TCC CAG AAA CTT CAA CAT CTG GAA CAT GTG ATG GAA AAT TAT 588

Phe Ser Ser Gin Lys Leu Gin His Leu Glu His Val Met Glu Asn Tyr 80 85 90 40 ACT CAG TGG CTG CAA AAA CTT GAG AAT TAC ATT GTG GAA AAC ATG AAG 636

Thr Gin Trp Leu Gin Lys Leu Glu Asn Tyr lie Val Glu Asn Met Lys 95 100 105 TCG GAG ATG GCC CAG ATA CAG CAG AAT GCA GTT CAG AAC CAC ACG GCT 684 45 Ser Glu Met Ala Gin He Gin Gin Asn Ala Val Gin Asn His Thr Ala 110 115 120 125 56 ACC ATG CTG GAG ATA GGA ACC AGC CTC CTC TCT CÄG ACT GCA GAG CAG 732

Thr Met Leu Glu lie Gly Thr Ser Leu Leu Ser Gin Thr Ala Glu Gin 130 135 140 5 ACC AGA AAG CTG ÄCA GAT GTT GAG ACC CAG GTA CTA AAT CAA ACT TCT 780

Thr Arg Lys Leu Thr Asp Vai Glu Thr Gin Val Leu Asn Gin Thr Ser 145 150 155 CGA CTT GAG ATA CAG CTG CTG GAG AAT TCA TTA TCC ACC TAC AAG CTA 828 10 Arg Leu Glu lie Gin Leu Leu Glu Asn Ser Leu Ser Thr Tyr Lys Leu 160 165 170 GAG AAG CAA CTT CTT CAA CAG ACA AAT GAA ATC TTG AAG ATC CAT GAA 876

Glu Lys Gin Leu Leu Gin Gin Thr Asn Glu lie Leu Lys He His Glu 15 175 180 185 AAA AAC AGT TTA TTA GAA CAT AAA ATC TTA GAA ATG GAA GGA AAA CAC 924

Lys Asn Ser Leu Leu Glu His Lys lie Leu Glu Met Glu Gly Lys His 190 195 200 205 20 AAG GAA GAG TTG GAC ACC TTA AAG GAA GAG AAA GAG AAC CTT CAA GGC 972

Lys Glu Glu Leu Asp Thr Leu Lys Glu Glu Lys Glu Asn Leu Gin Gly 210 215 220 25 TTG GTT ACT CGT CAA ACA TAT ATA ATC CAG GAG CTG GAA AAG CAA TTA 1020

Leu Val Thr Arg Gin Thr Tyr lie lie Gin Glu Leu Glu Lys Gin Leu 225 230 235 AAC AGA GCT ACC ACC AAC AAC AGT GTC CTT CAG AAG CAG CAA CTG GAG 1068 30 Asn Arg Ala Thr Thr Asn Asn Ser Val Leu Gin Lys Gin Gin Leu Glu 240 245 250 CTG ATG GAC ACA GTC CAC AAC CTT GTC AAT CTT TGC ACT AAA GAA GGT 1116

Leu Met Asp Thr Val His Asn Leu Val Asn Leu Cys Thr Lys Glu Gly 35 255 260 265 GTT TTA CTA AAG GGA GGA AAA AGA GAG GAA GAG AAA CCA TTT AGA GAC 1164

Val Leu Leu Lys Gly Gly Lys Arg Glu Glu Glu Lys Pro Phe Arg Asp 270 275 280 285 40 TGT GCA GAT GTA TAT CAA GCT GGT TTT AAT AAA AGT GGA ATC TAC ACT 1212

Cys Ala Asp Val Tyr Gin Ala Gly Phe Asn Lys Ser Gly lie Tyr Thr 290 295 300 45 ATT TAT ATT AAT AAT ATG CCA GAA CCC AAA AAG GTG TTT TGC AAT ATG 1260 lie Tyr lie Asn Asn Met Pro Glu Pro Lys Lys Val Phe Cys Asn Met 57 305 310 315 GAT GTC AAT GGG GGA GGT TGG ACT GTA ATA CAA CAT CGT GAA GAT GCA 1308

Asp Vai Asn Gly Gly Gly Trp Thr Val lie Gin His Arg Glu Asp Ala 320 325 330 5 AGT CTA GAT TTC CAA AGA GGC TGG AAG GAA TAT AAA ATG GGT TTT GGA 1356

Ser Leu Asp Phe Gin Arg Gly Trp Lys Glu Tyr Lys Met Gly Phe Gly 335 340 345 10 AAT CCC TCC GGT GAA TAT TGG CTG GGG AAT GAG TTT ATT TTT GCC ATT 1404

Asn Pro Ser Gly Glu Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe lie Phe Ala lie 350 355 360 365 ACC AGT CAG AGG CAG TAC ATG CTA AGA ATT GAG TTA ATG GAC TGG GAA 1452 15 Thr Ser Gin Arg Gin Tyr Met Leu Arg lie Glu Leu Met Asp Trp Glu 370 375 380 GGG AAC CGA GCC TAT TCA CAG TAT GAC AGA TTC CAC ATA GGA AAT GAA 1500

Gly Asn Arg Ala Tyr Ser Gin Tyr Asp Arg Phe His lie Gly Asn Glu 20 385 390 395 AAG CAA AAC TAT AGG TTG TAT TTA AAA GGT CAC ACT GGG ACA GCA GGA 1548

Lys Gin Asn Tyr Arg Leu Tyr Leu Lys Gly His Thr Gly Thr Ala Gly 400 405 410 25 AAA CAG AGC AGC CTG ATC TTA CAC GGT GCT GAT TTC AGC ACT AAA GAT 1596

Lys Gin Ser Ser Leu lie Leu His Gly Ala Asp Phe Ser Thr Lys Asp 415 420 425 30 GCT GAT AAT GAC AAC TGT ATG TGC AAA TGT GCC CTC ATG TTA ACA GGA 1644

Ala Asp Asn Asp Asn Cys Met Cys Lys Cys Ala Leu Met Leu Thr Gly 430 435 440 445 GGA TGG TGG TTT GAT GCT TGT GGC CCC TCC AAT CTA AAT GGA ATG TTC 1692 35 Gly Trp Trp Phe Asp Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Phe 450 455 460 TAT ACT GCG GGA CAA AAC CAT GGA AAA CTG AAT GGG ATA AAG TGG CAC 1740

Tyr Thr Ala Gly Gin Asn His Gly Lys Leu Asn Gly lie Lys Trp His 40 465 470 475 TAC TTC AAA GGG CCC AGT TAC TCC TTA CGT TCC ACA ACT ATG ATG ATT 1788

Tyr Phe Lys Gly Pro Ser Tyr Ser Leu Arg Ser Thr Thr Met Met lie 480 485 490 45 CGA CCT TTA GAT TTT TGA AAGCGCAATG TCAGAAGCGÄ TTATGAAAGC 1836

Arg Pro Leu Asp Phe 495 58 AACAAAGAAA TCCGGAGÄAG CTGCCAGGTG AGAAACTGTT TGAAÄACTTC AGAAGCAAAC 1896 5 AATATTGTCT CCCTTCCAGC AATAAGTGGT AGTTATGTGA AGTCACCAAG GTTCTTGACC 1956 GTGAATCTGG AGCCGTTTGA GTTCACAAGA GTCTCTACTT GGGGTGACAG TGCTCACGTG 2016 GCTCGACTAT AGAAAACTCC ACTGACTGTC GGGCTTTAAA AAGGGAAGAA ACTGCTGAGC 2076 10 TTGCTGTGCT TCAAACTACT ÄCTGGACCTT ATTTTGGAAC TATGGTAGCC AGATGATAAA 2136 TATGGTTAAT TTC 2149 15 (2) SEKVENSSIN ID NO:2 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 498 aminohappoa 20 (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini 25 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:2:

Met Thr Vai Phe Leu Ser Phe Ala Phe Leu Ala Ala Ile Leu Thr His 15 10 15 30 Ile Gly Cys Ser Asn Gin Arg Arg Ser Pro Glu Asn Ser Gly Arg Arg 20 25 30

Tyr Asn Arg Ile Gin His Gly Gin Cys Ala Tyr Thr Phe Ile Leu Pro 35 40 45 35

Glu His Asp Gly Asn Cys Arg Glu Ser Thr Thr Asp Gin Tyr Asn Thr 50 55 60

Asn Ala Leu Gin Arg Asp Ala Pro His Vai Glu Pro Asp Phe Ser Ser 40 65 70 75 80

Gin Lys Leu Gin His Leu Glu His Vai Met Glu Asn Tyr Thr Gin Trp 85 90 95 45 Leu Gin Lys Leu Glu Asn Tyr Ile Vai Glu Asn Met Lys Ser Glu Met 100 105 110 59

Ala Gin Ile Gin Gin Asn Ala Vai Gin Asn His Thr Ala Thr Met Leu 115 120 125

Glu Ile Gly Thr Ser Leu Leu Ser Gin Thr Ala Glu Gin Thr Arg Lys 5 130 135 140

Leu Thr Asp Vai Glu Thr Gin Vai Leu Asn Gin Thr Ser Arg Leu Glu 145 150 155 160 10 Ile Gin Leu Leu Glu Asn Ser Leu Ser Thr Tyr Lys Leu Glu Lys Gin 165 170 175

Leu Leu Gin Gin Thr Asn Glu Ile Leu Lys Ile His Glu Lys Asn Ser 180 185 190 15

Leu Leu Glu His Lys Ile Leu Glu Met Glu Gly Lys His Lys Glu Glu 195 200 205

Leu Asp Thr Leu Lys Glu Glu Lys Glu Asn Leu Gin Gly Leu Vai Thr 20 210 215 220

Arg Gin Thr Tyr Ile Ile Gin Glu Leu Glu Lys Gin Leu Asn Arg Ala 225 230 235 240 25 Thr Thr Asn Asn Ser Vai Leu Gin Lys Gin Gin Leu Glu Leu Met Asp 245 250 255

Thr Vai His Asn Leu Vai Asn Leu Cys Thr Lys Glu Gly Vai Leu Leu 260 265 270 30

Lys Gly Gly Lys Arg Glu Glu Glu Lys Pro Phe Arg Asp Cys Ala Asp 275 280 285

Vai Tyr Gin Ala Gly Phe Asn Lys Ser Gly Ile Tyr Thr Ile Tyr Ile 35 290 295 300

Asn Asn Met Pro Glu Pro Lys Lys Vai Phe Cys Asn Met Asp Vai Asn 305 310 315 320 40 Gly Gly Gly Trp Thr Vai Ile Gin His Arg Glu Asp Ala Ser Leu Asp 325 330 335

Phe Gin Arg Gly Trp Lys Glu Tyr Lys Met Gly Phe Gly Asn Pro Ser 340 345 350

Gly Glu Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Ile Phe Ala Ile Thr Ser Gin 45 60 355 360 365

Arg Gin Tyr Met Leu Arg lie Glu Leu Met Asp Trp Glu Gly Asn Arg 370 375 380 5

Ala Tyr Ser Gin Tyr Asp Arg Phe His lie Gly Asn Glu Lys Gin Asn 385 390 395 400

Tyr Arg Leu Tyr Leu Lys Gly His Thr Gly Thr Ala Gly Lys Gin Ser 10 405 410 415

Ser Leu lie Leu His Gly Ala Asp Phe Ser Thr Lys Asp Ala Asp Asn 420 425 430 15 Asp Asn Cys Met Cys Lys Cys Ala Leu Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp 435 440 445

Phe Asp Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Phe Tyr Thr Ala 450 455 460 20

Gly Gin Asn His Gly Lys Leu Asn Gly lie Lys Trp His Tyr Phe Lys 465 470 475 480

Gly Pro Ser Tyr Ser Leu Arg Ser Thr Thr Met Met lie Arg Pro Leu 25 485 490 495

Asp Phe (2) SEKVENSSIN ID NO:3 TIEDOT: 30 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 2146 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: kaksisäikeinen 35 (D) TOPOLOGIA: tuntematon (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (ix) PIIRRE:

40 (A) NIMI/AVAIN: CDS

(B) SIJAINTI: 310..1803 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:3: 45 CAGCTGACTC AGGCAGGCTC CATGCTGAAC GGTCACACAG AGAGGAAACA ATAAATCTCA 60 61 GCTACTATGC AATAAATATC TCÄAGTTTTA ACGAAGAAAA ACATCATTGC AGTGAAATAA 120 AAAATTTTAA AATTTTAGAA CAAAGCTAAC AAATGGCTAG TTTTCTATGA TTCTTCTTCA 180 5 AACGCTTTCT TTGAGGGGGA AAGAGTCAAA CAAACAAGCA GTTTTACCTG AAATAAAGAA 240 CTAGTTTTAG AGGTCAGAAG AAAGGAGCAA GTTTTGCGAG AGGCACGGAA GGAGTGTGCT 300 GGCAGTACA ATG ACA GTT TTC CTT TCC TTT GCT TTC CTC GCT GCC ATT 348 10 Met Thr Vai Phe Leu Ser Phe Ala Phe Leu Ala Ala Ile 15 10 CTG ACT CAC ATA GGG TGC AGC AAT CAG CGC CGA ÄGT CCA GAA AAC AGT 396

Leu Thr His Ile Gly Cys Ser Asn Gin Arg Arg Ser Pro Glu Asn Ser 15 20 25 15 GGG AGA AGA TAT AAC CGG ATT CAA CAT GGG CAA TGT GCC TAC ACT TTC 444

Gly Arg Arg Tyr Asn Arg Ile Gin His Gly Gin Cys Ala Tyr Thr Phe 30 35 40 45 20 ATT CTT CCA GAA CAC GAT GGC AAC TGT CGT GAG AGT ACG ACA GAC CAG 492

Ile Leu Pro Glu His Asp Gly Asn Cys Arg Glu Ser Thr Thr Asp Gin 50 55 60 TAC AAC ACA AAC GCT CTG CAG AGA GAT GCT CCA CAC GTG GAA CCG GAT 540 25 Tyr Asn Thr Asn Ala Leu Gin Arg Asp Ala Pro His Vai Glu Pro Asp 65 70 75 TTC TCT TCC CAG AAA CTT CAA CAT CTG GAA CAT GTG ATG GAA AAT TAT 588

Phe Ser Ser Gin Lys Leu Gin His Leu Glu His Vai Met Glu Asn Tyr 30 80 85 90 ACT CAG TGG CTG CAA AAA CTT GAG AAT TAC ATT GTG GAA AAC ATG AAG 636

Thr Gin Trp Leu Gin Lys Leu Glu Asn Tyr Ile Vai Glu Asn Met Lys 95 100 105 35 TCG GAG ATG GCC CAG ATA CAG CAG AAT GCA GTT CAG AAC CAC ACG GCT 684

Ser Glu Met Ala Gin Ile Gin Gin Asn Ala Vai Gin Asn His Thr Ala 110 115 120 125 40 ACC ATG CTG GAG ATA GGA ACC AGC CTC CTC TCT CAG ACT GCA GAG CAG 732

Thr Met Leu Glu Ile Gly Thr Ser Leu Leu Ser Gin Thr Ala Glu Gin 130 135 140 ACC AGA AAG CTG ACA GAT GTT GAG ACC CAG GTA CTA AAT CAA ACT TCT 780

Thr Arg Lys Leu Thr Asp Vai Glu Thr Gin Vai Leu Asn Gin Thr Ser 45 145 150 155 62 CGA CTT GAG ATA CAG CTG CTG GAG AAT TCA TTA TCC ACC TAC AAG CTA 828

Arg Leu Glu lie Gin Leu Leu Glu Asn Ser Leu Ser Thr Tyr Lys Leu 160 165 170 5 GAG AAG CAA CTT CTT CAA CAG ACA AAT GAA ATC TTG AAG ATC CAT GAA 876

Glu Lys Gin Leu Leu Gin Gin Thr Asn Glu lie Leu Lys lie His Glu 175 180 185 AAA AAC AGT TTA TTA GAA CAT AAA ATC TTA GAA ATG GAA GGA AAA CAC 924 10 Lys Asn Ser Leu Leu Glu His Lys lie Leu Glu Met Glu Gly Lys His 190 195 200 205 AAG GAA GAG TTG GAC ACC TTA AAG GAA GAG AAA GAG AAC CTT CAA GGC 972

Lys Glu Glu Leu Asp Thr Leu Lys Glu Glu Lys Glu Asn Leu Gin Gly 15 210 215 220 TTG GTT ACT CGT CAA ACA TAT ATA ATC CAG GAG CTG GAA AAG CAA TTA 1020

Leu Val Thr Arg Gin Thr Tyr lie lie Gin Glu Leu Glu Lys Gin Leu 225 230 235 20 AAC AGA GCT ACC ACC AAC AAC AGT GTC CTT CAG AAG CAG CAA CTG GAG 1068

Asn Arg Ala Thr Thr Asn Asn Ser Val Leu Gin Lys Gin Gin Leu Glu 240 245 250 25 CTG ATG GAC ACA GTC CAC AAC CTT GTC AAT CTT TGC ACT AAA GAA GTT 1116

Leu Met Asp Thr Val His Asn Leu Val Asn Leu Cys Thr Lys Glu Val 255 260 265 TTA CTA AAG GGA GGA AAA AGA GAG GAA GAC AAA CCA TTT AGA GAC TGT 1164 30 Leu Leu Lys Gly Gly Lys Arg Glu Glu Asp Lys Pro Phe Arg Asp Cys 270 275 280 285 GCA GAT GTA TAT CAA GCT GGT TTT AAT AAA AGT GGA ATC TAC ACT ATT 1212

Ala Asp Val Tyr Gin Ala Gly Phe Asn Lys Ser Gly lie Tyr Thr lie 35 290 295 300 TAT ATT AAT AAT ATG CCA GAA CCC AAA AAG GTG TTT TGC AAT ATG GAT 1260

Tyr He Asn Asn Met Pro Glu Pro Lys Lys Val Phe Cys Asn Met Asp 305 310 315 40 GTC AAT GGG GGA GGT TGG ACT GTA ATA CAA CAT CGT GAA GAT GGA AGT 1308

Vai Asn Gly Gly Gly Trp Thr Val He Gin His Arg Glu Asp Gly Ser 320 325 330 CTA GAT TTC CAA AGA GGC TGG AAG GAA TAT AAA ATG GGT TTT GGA AAT 1356 45 Leu Asp Phe Gin Arg Gly Trp Lys Glu Tyr Lys Met Gly Phe Gly Asn 335 340 345 63 CCC TCC GGT GAA TAT TGG CTG GGG AAT GAG TTT ATT TTT GCC ATT ACC 1404

Pro Ser Gly Glu Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Ile Phe Ala Ile Thr 350 355 360 365 5 AGT CAG AGG CAG TAC ATG CTA AGA ATT GAG TTA ATG GAC TGG GAA GGG 1452

Ser Gin Arg Gin Tyr Met Leu Arg Ile Glu Leu Met Asp Trp Glu Gly 370 375 380 AAC CGA GCC TAT TCA CAG TAT GAC AGA TTC CAC ATA GGA AAT GAA AAG 1500 10 Asn Arg Ala Tyr Ser Gin Tyr Asp Arg Phe His Ile Gly Asn Glu Lys 385 390 395 CAA AAC TAT AGG TTG TAT TTA AAA GGT CAC ACT GGG ACA GCA GGA AAA 1548

Gin Asn Tyr Arg Leu Tyr Leu Lys Gly His Thr Gly Thr Ala Gly Lys 15 400 405 410 CAG AGC AGC CTG ATC TTA CAC GGT GCT G AT TTC AGC ACT AAA GAT GCT 1596

Gin Ser Ser Leu Ile Leu His Gly Ala Asp Phe Ser Thr Lys Asp Ala 415 420 425 20 GAT AAT GAC AAC TGT ATG TGC AAA TGT GCC CTC ATG TTA ACA GGA GGA 1644

Asp Asn Asp Asn Cys Met Cys Lys Cys Ala Leu Met Leu Thr Gly Gly 430 435 440 445 25 TGG TGG TTT GAT GCT TGT GGC CCC TCC AAT CTA AAT GGA ATG TTC TAT 1692

Trp Trp Phe Asp Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Phe Tyr 450 455 460 ACT GCG GGA CAA AAC CAT GGA AAA CTG AAT GGG ATA AAG TGG CAC TAC 1740 30 Thr Ala Gly Gin Asn His Gly Lys Leu Asn Gly Ile Lys Trp His Tyr 465 470 475 TTC AAA GGG CCC AGT TAC TCC TTA CGT TCC ACA ACT ATG ATG ATT CGA 1788

Phe Lys Gly Pro Ser Tyr Ser Leu Arg Ser Thr Thr Met Met Ile Arg 480 485 490 35 CCT TTA GAT TTT TGA AAGCGCAATG TCAGAAGCGA TTÄTGAAAGC AACAAAGAAA 1843 Pro Leu Asp Phe 495 40 TCCGGAGAAG CTGCCAGGTG AGAAACTGTT TGAAAACTTC AGAAGCAAAC AATATTGTCT 1903 CCCTTCCAGC AATAAGTGGT AGTTATGTGA AGTCACCAAG GTTCTTGACC GTGAATCTGG 1963 AGCCGTTTGA GTTCACAAGA GTCTCTACTT GGGGTGACAG TGCTCACGTG GCTCGACTAT 2023 45 AGAAAACTCC ACTGACTGTC GGGCTTTAAA AAGGGAAGAA ACTGCTGAGC TTGCTGTGCT 2083 5 64 TCAAACTACT ACTGGACCTT ATTTTGGAAC TATGGTAGCC AGATGATAAA TATGGTTAAT 2143 TTC 2146 (2) SEKVENSSIN ID NO:4 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 497 aminohappoa 10 (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini 15 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:4:

Met Thr Vai Phe Leu Ser Phe Ala Phe Leu Ala Ala Ile Leu Thr His 15 10 15 20 Ile Gly Cys Ser Asn Gin Arg Arg Ser Pro Glu Asn Ser Gly Arg Arg 20 25 30

Tyr Asn Arg Ile Gin His Gly Gin Cys Ala Tyr Thr Phe Ile Leu Pro 35 40 45 25

Glu His Asp Gly Asn Cys Arg Glu Ser Thr Thr Asp Gin Tyr Asn Thr 50 55 60

Asn Ala Leu Gin Arg Asp Ala Pro His Vai Glu Pro Asp Phe Ser Ser 30 65 70 75 80

Gin Lys Leu Gin His Leu Glu His Vai Met Glu Asn Tyr Thr Gin Trp 85 90 95 35 Leu Gin Lys Leu Glu Asn Tyr Ile Vai Glu Asn Met Lys Ser Glu Met 100 105 110

Ala Gin Ile Gin Gin Asn Ala Vai Gin Asn His Thr Ala Thr Met Leu 115 120 125 40

Glu Ile Gly Thr Ser Leu Leu Ser Gin Thr Ala Glu Gin Thr Arg Lys 130 135 140

Leu Thr Asp Vai Glu Thr Gin Vai Leu Asn Gin Thr Ser Arg Leu Glu 45 145 150 155 160 65

Ile Gin Leu Leu Glu Asn Ser Leu Ser Thr Tyr Lys Leu Glu Lys Gin 165 170 175

Leu Leu Gin Gin Thr Asn Glu Ile Leu Lys Ile His Glu Lys Asn Ser 5 180 185 190

Leu Leu Glu His Lys Ile Leu Glu Met Glu Gly Lys His Lys Glu Glu 195 200 205 10 Leu Asp Thr Leu Lys Glu Glu Lys Glu Asn Leu Gin Gly Leu Vai Thr 210 215 220

Arg Gin Thr Tyr Ile Ile Gin Glu Leu Glu Lys Gin Leu Asn Arg Ala 225 230 235 240 15

Thr Thr Asn Asn Ser Vai Leu Gin Lys Gin Gin Leu Glu Leu Met Asp 245 250 255

Thr Vai His Asn Leu Vai Asn Leu Cys Thr Lys Glu Vai Leu Leu Lys 20 260 265 270

Gly Gly Lys Arg Glu Glu Asp Lys Pro Phe Arg Asp Cys Ala Asp Vai 275 280 285 25 Tyr Gin Ala Gly Phe Asn Lys Ser Gly Ile Tyr Thr Ile Tyr Ile Asn 290 295 300

Asn Met Pro Glu Pro Lys Lys Vai Phe Cys Asn Met Asp Vai Asn Gly 305 310 315 320 30

Gly Gly Trp Thr Vai Ile Gin His Arg Glu Asp Gly Ser Leu Asp Phe 325 330 335

Gin Arg Gly Trp Lys Glu Tyr Lys Met Gly Phe Gly Asn Pro Ser Gly 35 340 345 350

Glu Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Ile Phe Ala Ile Thr Ser Gin Arg 355 360 365 40 Gin Tyr Met Leu Arg Ile Glu Leu Met Asp Trp Glu Gly Asn Arg Ala 370 375 380

Tyr Ser Gin Tyr Asp Arg Phe His Ile Gly Asn Glu Lys Gin Asn Tyr 385 390 395 400

Arg Leu Tyr Leu Lys Gly His Thr Gly Thr Ala Gly Lys Gin Ser Ser 45 66 405 410 415

Leu Ile Leu His Gly Ala Asp Phe Ser Thr Lys Asp Ala Asp Asn Asp 420 425 430 5

Asn Cys Met Cys Lys Cys Ala Leu Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe 435 440 445

Asp Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Phe Tyr Thr Ala Gly 10 450 455 460

Gin Asn His Gly Lys Leu Asn Gly lie Lys Trp His Tyr Phe Lys Gly 465 470 475 480 15 Pro Ser Tyr Ser Leu Arg Ser Thr Thr Met Met lie Arg Pro Leu Asp 485 490 495

Phe 20 (2) SEKVENSSIN ID NO;5 TIEDOT; (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET; (A) PITUUS; 2282 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo 25 (C) JUOSTEISUUS; kaksisäikeinen (D) T0P0L0GIA; tuntematon (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) 30 (ix) PIIRRE;

(A) NIMI/AVAIN; CDS

(B) SIJAINTI: 357..1847 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:5: 35 GAATTCCTGG GTTGGTGTTT ATCTCCTCCC AGCCTTGAGG GAGGGAACAA CACTGTAGGA 60 TCTGGGGAGA GAGGAACAAA GGACCGTGAA AGCTGCTCTG TAAAAGCTGA CACAGCCCTC 120 40 CCAAGTGAGC AGGACTGTTC TTCCCACTGC AATCTGACAG TTTACTGCAT GCCTGGAGAG 180 AACACAGCAG TAAAAACCAG GTTTGCTACT GGAAAAAGAG GAAAGAGAAG ACTTTCATTG 240 ACGGACCCAG CCATGGCAGC GTAGCAGCCC TGCGTTTCAG ACGGCAGCAG CTCGGGACTC 300 TGGACGTGTG TTTGCCCTCA AGTTTGCTAA GCTGCTGGTT TATTACTGAA GAAAGA 356 45 67 ATG TGG CAG ATT GTT TTC TTT ACT CTG AGC TGT GAT CTT GTC TTG GCC 404

Met Trp Gin Ile Val Phe Phe Thr Leu Ser Cys Asp Leu Val Leu Ala 15 10 15 5 GCA GCC TAT AAC AAC TTT CGG AAG AGC ATG GAC AGC ATA GGA AAG AAG 452

Ala Ala Tyr Asn Asn Phe Arg Lys Ser Met Asp Ser He Gly Lys Lys 20 25 30 CAA TAT CAG GTC CAG CAT GGG TCC TGC AGC TAC ACT TTC CTC CTG CCA 500 10 Gin Tyr Gin Val Gin His Gly Ser Cys Ser Tyr Thr Phe Leu Leu Pro 35 40 45 GAG ATG GAC AAC TGC CGC TCT TCC TCC AGC CCC TAC GTG TCC AAT GCT 548

Glu Met Asp Asn Cys Arg Ser Ser Ser Ser Pro Tyr Val Ser Asn Ala 15 50 55 60 GTG CAG AGG GAC GCG CCG CTC GAA TAC GAT GAC TCG GTG CAG AGG CTG 596

Val Gin Arg Asp Ala Pro Leu Glu Tyr Asp Asp Ser Val Gin Arg Leu 65 70 75 80 20 CAA GTG CTG GAG AAC ATC ATG GAA AAC AAC ACT CAG TGG CTA ATG AAG 644

Gin Val Leu Glu Asn He Met Glu Asn Asn Thr Gin Trp Leu Met Lys 85 90 95 25 CTT GAG AAT TAT ATC CAG GAC AAC ATG AAG AAA GAA ATG GTA GAG ATA 692

Leu Glu Asn Tyr He Gin Asp Asn Met Lys Lys Glu Met Val Glu He 100 105 110 CAG CAG AAT GCA GTA CAG AAC CAG ACG GCT GTG ATG ATA GAA ATA GGG 740 30 Gin Gin Asn Ala Val Gin Asn Gin Thr Ala Val Met He Glu He Gly 115 120 125 ACA AAC CTG TTG AAC CAA ACA GCT GAG CAA ACG CGG AAG TTA ACT GAT 788

Thr Asn Leu Leu Asn Gin Thr Ala Glu Gin Thr Arg Lys Leu Thr Asp 35 130 135 140 GTG GAA GCC CAA GTA TTA AAT CAG ACC ACG AGA CTT GAA CTT CAG CTC 836

Val Glu Ala Gin Val Leu Asn Gin Thr Thr Arg Leu Glu Leu Gin Leu 145 150 155 160 40 TTG GAA CAC TCC CTC TCG ACA AAC AAA TTG GAA AAA CAG ATT TTG GAC 884

Leu Glu His Ser Leu Ser Thr Asn Lys Leu Glu Lys Gin He Leu Asp 165 170 175 45 CAG ACC AGT GAA ATA AAC AAA TTG CAA GAT AAG AAC AGT TTC CTA GAA 932

Gin Thr Ser Glu He Asn Lys Leu Gin Asp Lys Asn Ser Phe Leu Glu 68 180 185 190 AAG AAG GTG CTA GCT ATG GAA GAC AAG CAC ATC ATC CAA CTA CAG TCA 980

Lys Lys Val Leu Ala Met Glu Asp Lys His lie lie Gin Leu Gin Ser 5 195 200 205 ATA AAA GAA GAG AAA GAT CAG CTA CAG GTG TTA GTÄ TCC AAG CAA AAT 1028 lie Lys Glu Glu Lys Asp Gin Leu Gin Val Leu Val Ser Lys Gin Asn 210 215 220 10 TCC ATC ATT GAA GAA CTA GAA AAA AAA ATA GTG ACT GCC ACG GTG AAT 1076

Ser lie lie Glu Glu Leu Glu Lys Lys lie Val Thr Ala Thr Val Asn 225 230 235 240 15 AAT TCA GTT CTT CAA AAG CAG CAA CAT GAT CTC ATG GAG ACA GTT AAT 1124

Asn Ser Val Leu Gin Lys Gin Gin His Asp Leu Met Glu Thr Val Asn 245 250 255 AAC TTA CTG ACT ATG ATG TCC ACA TCA ÄAC TCA GCT AAG GAC CCC ACT 1172 20 Asn Leu Leu Thr Met Met Ser Thr Ser Asn Ser Ala Lys Asp Pro Thr 260 265 270 GTT GCT AAA GAA GAA CAA ATC AGC TTC AGA GAC TGT GCT GAA GTA TTC 1220

Val Ala Lys Glu Glu Gin lie Ser Phe Arg Asp Cys Ala Glu Val Phe 25 275 280 285 AAA TCA GGA CAC ACC ACA AAT GGC ATC TAC ACG TTA ACA TTC CCT AAT 1268

Lys Ser Gly His Thr Thr Asn Gly lie Tyr Thr Leu Thr Phe Pro Asn 290 295 300 30 TCT ACA GAA GAG ATC AAG GCC TAC TGT GAC ATG GAA GCT GGA GGA GGC 1316

Ser Thr Glu Glu lie Lys Ala Tyr Cys Asp Met Glu Ala Gly Gly Gly 305 310 315 320 35 GGG TGG ACA ATT ATT CAG CGA CGT GAG GAT GGC AGC GTT GAT TTT CAG 1364

Gly Trp Thr lie lie Gin Arg Arg Glu Asp Gly Ser Val Asp Phe Gin 325 330 335 AGG ACT TGG AAA GAA TAT AAA GTG GGA TTT GGT AAC CCT TCA GGA GAA 1412 40 Arg Thr Trp Lys Glu Tyr Lys Val Gly Phe Gly Asn Pro Ser Gly Glu 340 345 350 TAT TGG CTG GGA AAT GAG TTT GTT TCG CAA CTG ACT AAT CAG CAA CGC 1460

Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Val Ser Gin Leu Thr Asn Gin Gin Arg 45 355 360 365 69 TAT GTG CTT AAA ATA CAC CTT AAA GAC TGG GAA GGG AAT GAG GCT TAC 1508

Tyr Val Leu Lys lie His Leu Lys Asp Trp Glu Gly Asn Glu Ala Tyr 370 375 380 5 TCA TTG TAT GAA CAT TTC TAT CTC TCA AGT GAA GAA CTC AAT TAT AGG 1556

Ser Leu Tyr Glu His Phe Tyr Leu Ser Ser Glu Glu Leu Asn Tyr Arg 385 390 395 400 ATT CAC CTT AAA GGA CTT ACA GGG ACA GCC GGC AAA ATA AGC AGC ATC 1604 10 lie His Leu Lys Gly Leu Thr Gly Thr Ala Gly Lys lie Ser Ser lie 405 410 415 AGC CAA CCA GGA AAT GAT TTT AGC ACA AAG GAT GGA GAC AAC GAC AAA 1652

Ser Gin Pro Gly Asn Asp Phe Ser Thr Lys Asp Gly Asp Asn Asp Lys 15 420 425 430 TGT ATT TGC AAA TGT TCA CAA ATG CTA ACA GGA GGC TGG TGG TTT GAT 1700

Cys lie Cys Lys Cys Ser Gin Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe Asp 435 440 445 20 GCA TGT GGT CCT TCC AAC TTG AAC GGA ATG TAC TAT CCA CAG AGG CAG 1748

Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Tyr Tyr Pro Gin Arg Gin 450 455 460 AAC ACA AAT AAG TTC AAC GGC ATT AAA TGG TAC TAC TGG AAA GGC TCA 1796 25 Asn Thr Asn Lys Phe Asn Gly lie Lys Trp Tyr Tyr Trp Lys Gly Ser 465 470 475 480 GGC TAT TCG CTC AAG GCC ACA ACC ATG ATG ATC CGA CCA GCA GAT TTC 1844

Gly Tyr Ser Leu Lys Ala Thr Thr Met Met lie Arg Pro Ala Asp Phe 30 485 490 495 TAA ACATCCCAGT CCACCTGAGG AACTGTCTCG AACTATTTTC AAAGACTTAA 1897 35 GCCCAGTGCA CTGAAAGTCA CGGCTGCGCA CTGTGTCCTC TTCCACCACA GAGGGCGTGT 1957 GCTCGGTGCT GACGGGACCC ACATGCTCCA GATTAGAGCC TGTAAACTTT ATCACTTAAA 2017 CTTGCATCAC TTAACGGACC AAAGCAAGAC CCTAAACATC CATAATTGTG ATTAGACAGA 2077 40 ACACCTATGC AAAGATGAAC CCGAGGCTGA GAATCAGACT GACAGTTTAC AGACGCTGCT 2137 GTCACAACCA AGAATGTTAT GTGCAAGTTT ATCAGTAAAT AACTGGAAAA CAGAACACTT 2197 45 ATGTTATACA ATACAGATCA TCTTGGAACT GCATTCTTCT GAGCACTGTT TATACACTGT 2257 70 GTAAATACCC ATATGTCCTG AATTC 2282 (2) SEKVENSSIN ID NO:6 TIEDOT: 5 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 497 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 10 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:6: 15 Met Trp Gin Ile Vai Phe Phe Thr Leu Ser Cys Asp Leu Vai Leu Ala 15 10 15

Ala Ala Tyr Asn Asn Phe Arg Lys Ser Met Asp Ser Ile Gly Lys Lys 20 25 30 20

Gin Tyr Gin Vai Gin His Gly Ser Cys Ser Tyr Thr Phe Leu Leu Pro 35 40 45

Glu Met Asp Asn Cys Arg Ser Ser Ser Ser Pro Tyr Vai Ser Asn Ala 25 50 55 60

Vai Gin Arg Asp Ala Pro Leu Glu Tyr Asp Asp Ser Vai Gin Arg Leu 65 70 75 80 30 Gin Vai Leu Glu Asn Ile Met Glu Asn Asn Thr Gin Trp Leu Met Lys 85 90 95

Leu Glu Asn Tyr Ile Gin Asp Asn Met Lys Lys Glu Met Vai Glu Ile 100 105 110 35

Gin Gin Asn Ala Vai Gin Asn Gin Thr Ala Vai Met Ile Glu Ile Gly 115 120 125

Thr Asn Leu Leu Asn Gin Thr Ala Glu Gin Thr Arg Lys Leu Thr Asp 40 130 135 140

Vai Glu Ala Gin Vai Leu Asn Gin Thr Thr Arg Leu Glu Leu Gin Leu 145 150 155 160 45 Leu Glu His Ser Leu Ser Thr Asn Lys Leu Glu Lys Gin Ile Leu Asp 165 170 175 71

Gin Thr Ser Glu Ile Asn Lys Leu Gin Asp Lys Asn Ser Phe Leu Glu 180 185 190

Lys Lys Vai Leu Ala Met Glu Asp Lys His Ile Ile Gin Leu Gin Ser 5 195 200 205

Ile Lys Glu Glu Lys Asp Gin Leu Gin Vai Leu Vai Ser Lys Gin Asn 210 215 220 10 Ser Ile Ile Glu Glu Leu Glu Lys Lys Ile Vai Thr Ala Thr Vai Asn 225 230 235 240

Asn Ser Vai Leu Gin Lys Gin Gin His Asp Leu Met Glu Thr Vai Asn 245 250 255 15

Asn Leu Leu Thr Met Met Ser Thr Ser Asn Ser Ala Lys Asp Pro Thr 260 265 270

Vai Ala Lys Glu Glu Gin Ile Ser Phe Arg Asp Cys Ala Glu Vai Phe 20 275 280 285

Lys Ser Gly His Thr Thr Asn Gly Ile Tyr Thr Leu Thr Phe Pro Asn 290 295 300 25 Ser Thr Glu Glu Ile Lys Ala Tyr Cys Asp Met Glu Ala Gly Gly Gly 305 310 315 320

Gly Trp Thr Ile Ile Gin Arg Arg Glu Asp Gly Ser Vai Asp Phe Gin 325 330 335 30

Arg Thr Trp Lys Glu Tyr Lys Vai Gly Phe Gly Asn Pro Ser Gly Glu 340 345 350

Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Vai Ser Gin Leu Thr Asn Gin Gin Arg 35 355 360 365

Tyr Vai Leu Lys Ile His Leu Lys Asp Trp Glu Gly Asn Glu Ala Tyr 370 375 380 40 Ser Leu Tyr Glu His Phe Tyr Leu Ser Ser Glu Glu Leu Asn Tyr Arg 385 390 395 400

Ile His Leu Lys Gly Leu Thr Gly Thr Ala Gly Lys Ile Ser Ser Ile 405 410 415

Ser Gin Pro Gly Asn Asp Phe Ser Thr Lys Asp Gly Asp Asn Asp Lys 45 72 420 425 430

Cys Ile Cys Lys Cys Ser Gin Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe Asp 435 440 445 5

Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Tyr Tyr Pro Gin Arg Gin 450 455 460

Asn Thr Asn Lys Phe Asn Gly Ile Lys Trp Tyr Tyr Trp Lys Gly Ser 10 465 470 475 480

Gly Tyr Ser Leu Lys Ala Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Ala Asp Phe 485 490 495 • · · • · · • · · • · · • · • ' · • · · • · · • · · · • · • 1 • · • · · • · · • · · • · · • · · • · ·

• I I

• · · • · • · • · · • · • · • · · • · · • · • · ·«· • · • · · • · · • · · · • · • · • · ·

Claims (43)

73

1. Eristetty nukleiinihappomolekyyli, joka koodaa TIE-5 2-ligandia, tunnettu siitä, että nukleiinihapposekvenssi on (a) nukleiinihapposekvenssi, jossa on ihmisen TIE-2-ligandin koodausalue, kuten kuviossa 4 tai kuviossa 5 on esitetty; (b) nukleiinihapposekvenssi, joka hybridisoituu kohtalaisesti tiukennetuissa olosuhteissa (a) :n nukleiinihapposekvenssiin, 10 ja joka koodaa TIE-2-ligandia, joka sitoo TIE-2-reseptoria; tai (c) nukleiinihapposekvenssi, joka hybridisoituisi, jos geneettinen koodi ei olisi degeneroitunut, (a):n tai (b):n nukleiinihapposekvenssiin, ja joka koodaa TIE-2-ligandia, joka 15 sitoo TIE-2-reseptorin.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen eristetty nukleiinihappomolekyyli, tunnettu siitä, että koodattu TIE-2-ligandi on TIE-2-agonisti. 20

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen eristetty nukleiinihappomolekyyli, tunnettu siitä, että nukleiinihapposekvenssi on (a) nukleiinihapposekvenssi, jossa on ihmisen TIE-2-ligandin 25 koodausalue, kuten kuviossa 6 on esitetty; (b) nukleiinihapposekvenssi, joka hybridisoituu kohtalaisesti tiukennetuissa olosuhteissa (a):n nukleiinihapposekvenssiin, ja joka koodaa TIE-2-ligandia, joka sitoo TIE-2-reseptoria; tai 30 (c) nukleiinihapposekvenssi joka hybridisoituisi, jos geneet tinen koodi ei olisi degeneroitunut, (a) :n tai (b) :n nukleiinihapposekvenssiin, ja joka koodaa TIE-2-ligandia, joka sitoo TIE-2-reseptorin.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen eristetty nukleiini happomolekyyli, tunnettu siitä, että koodattu TIE-2-ligandi on TIE-2-antagonisti. 74

5. Vektori, jossa on minkä tahansa edellä olevan pa tenttivaatimuksen mukainen nukleiinihappomolekyyli.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen vektori, tunnettu siitä, että nukleiinihappo on operatiivisesti liittynyt ekspression kontrollisekvenssiin, joka kykenee ohjaamaan sen ekspressiota isäntäsolussa. 10

7. Patenttivaatimuksen 5 tai 6 mukainen vektori, joka on plasmidi.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen plasmidi, jota mer-15 kitään pJFE14, joka koodaa TIE-2 -ligandia (ATCC tallennusnro 75910).

9. Patenttivaatimuksen 7 mukainen plasmidi, jota merkitään pBluescript KS, joka koodaa ihmisen TIE-2-ligandi 2:ta 20 (ATCC tallennusnro 75963).

10. Patenttivaatimuksen 5 tai 6 mukainen vektori, jota merkitään AgtlO, ja joka koodaa hTIE-2-ligandi 1: tä (ATCC tallennusnro 75928). 25

11. Eristetty TIE-2-ligandi, jossa ei olennaisesti ole muita proteiineja, jota koodaa patenttivaatimuksen 1 mukainen nukleiinihappomolekyyli.

12. Eristetty TIE-2-ligandi, jossa ei olennaisesti ole muita proteiineja, jota koodaa patenttivaatimuksen 2 mukainen nukleiinihappo.

13. Eristetty TIE-2-ligandi, jossa ei olennaisesti ole 35 muita proteiineja, jota koodaa patenttivaatimuksen 3 tai 4 mukainen nukleiinihappo. 75

14. Isäntä-vektorisysteemi tuottamaan minkä tahansa patenttivaatimuksen 11-13 mukaista ligandia, mihin sisältyy minkä tahansa edellä olleen patenttivaatimuksen 6-10 mukainen vektori isäntäsolussa. 5

15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen isäntä- vektorisysteemi , tunnettu siitä, että isäntäsolu on bakteeri-, hiiva-, hyönteis- tai nisäkässolu.

16. Isäntä-vektorisysteemi, jossa on patenttivaatimuk sen 14 tai 15 mukainen isäntä-vektorisysteemi ja nukleiinihappo, joka koodaa TIE-2-reseptoria.

17. Menetelmä tuottaa ligandia, kuten patenttivaatimuk sessa 11-13 on kuvattu, johon sisältyy kasvattaa minkä tahansa patenttivaatimuksen 14-16 mukaisen isäntä-vektorisysteemin soluja olosuhteissa, jotka sallivat ligandin tuoton, ja siten 20 tuotetun ligandin talteenotto.

18. Vasta-aine, joka spesifisesti sitoo minkä tahansa patenttivaatimuksen 11-13 mukaisen ligandin.

19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen vasta-aine, joka on monoklonaalinen vasta-aine.

20. Konjugaatti, joka käsittää minkä tahansa patentti-30 vaatimuksen 11-13 mukaisen ligandin, ja siihen konjugoituneen sytotoksisen aineen.

21. Patenttivaatimuksen 20 mukainen konjugaatti, tunnettu siitä, että sytotoksinen aine on radioisotooppi tai 35 toksiini. 76

22. Farmaseuttinen koostumus, joka käsittää minkä ta hansa patenttivaatimuksen 11-13 mukaisen TIE-2-ligandin, ja farmaseuttisesti hyväksyttävän kantajan.

23. Farmaseuttinen koostumus, joka käsittää patentti vaatimuksen 18 tai 19 mukaisen vasta-aineen, ja farmaseuttisesti hyväksyttävän kantajan.

24. Farmaseuttinen koostumus, joka käsittää patentti vaatimuksen 20 tai 21 mukaisen konjugaatin, ja farmaseuttisesti hyväksyttävän kantajan.

25. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 11-13 mukainen 15 ligandi, patenttivaatimuksen 18 tai 19 mukainen vasta-aine, patenttivaatimuksen 20 tai 21 mukainen konjugaatti tai minkä tahansa patenttivaatimuksen 22 tai 23 mukainen koostumus käytettäväksi ihmis- tai eläinkehon hoitomenetelmässä tai diagnoosimenetelmässä . 20

26. Patenttivaatimuksen 12 mukainen ligandi käytettäväksi ihmis- tai eläinkehon hoitomenetelmässä.

27. Patenttivaatimuksen 13 mukainen ligandi käytettä-25 väksi ihmis- tai eläinkehon hoitomenetelmässä.

28. Patenttivaatimuksen 25 mukainen vasta-aine, joka vasta-aine sitoo spesifisesti patenttivaatimuksen 12 mukaisen ligandin, käytettäväksi menetelmässä blokata verisuonen kas- 30 vua nisäkkäässä.

29. Patenttivaatimuksen 28 mukainen vasta-aine käytettäväksi menetelmässä, jossa nisäkäs on ihminen.

30. Patenttivaatimuksen 25 mukainen ligandi käytettä väksi menetelmässä edistämään uudissuonnittumista nisäkkäässä , 77

31. Patenttivaatimuksen 30 mukainen ligandi käytettä väksi edistämään haavan paranemista.

32. Patenttivaatimuksen 31 mukainen ligandi käytettä- 5 väksi hoitamaan iskemiaa.

33. Vasta-aine, joka kykenee spesifisesti sitomaan TIE- 2-reseptoria, käytettäväksi menetelmässä inhiboimaan TIE-2-ligandin aktiivisuutta nisäkkäässä. 10

34. Patenttivaatimuksen 33 mukainen vasta-aine, joka on patenttivaatimuksen 18 tai 19 mukainen vasta-aine.

35. Patenttivaatimuksen 13 mukainen ligandi käytettä- 15 väksi menetelmässä inhiboimaan TIE-2 -ligandin aktiivisuutta nisäkkäässä.

36. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 33 tai 34 mukai nen vasta-aine tai patenttivaatimuksen 35 mukainen ligandi 20 käytettäväksi menetelmässä, jossa nisäkäs on ihminen.

37. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 33, 34 tai 36 mukainen vasta-aine tai patenttivaatimuksen 35 tai 36 mukainen ligandi käytettäväksi menetelmässä heikentämään tai estämään 25 tuumorin kasvua ihmisessä.

38. Menetelmä ylläpitää TIE-2-reseptoria ekspressoivaa solua viljelmässä, johon menetelmään sisältyy antaa TIE-2-reseptoria ekspressoivalle solulle tehokas määrä patenttivaa- 30 timuksen 12 mukaista ligandia.

39. Patenttivaatimuksen 38 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että TIE-2-reseptoria ekspressoiva solu on endotee-lisolu. 35

40. Menetelmä tunnistaa TIE-2-reseptoriantagonisti, mihin sisältyy että saatetaan TIE-2-reseptoria ekspressoivat solut kosketuksiin: 78 a) testiyhdisteen kanssa; ja b) patenttivaatimuksen 12 tai 13 mukaisen ligandin kanssa; olosuhteissa, jotka sallivat ligandin sitomisen reseptoriin, ja määritetään onko testiyhdiste kykenevä sekaantumaan ligan- 5 din reseptoriin sitoutumiseen.

41. Ligandiaine, johon sisältyy minkä tahansa patenttivaatimuksen 11-13 mukainen TIE-2-ligandi fuusioituneena immu-noglobuliinin vakioalueeseen. 10

42. Patenttivaatimuksen 41 mukainen ligandiaine, tunnettu siitä, että immunoglobuliinin vakioalue on ihmisen IGG1:n Fc-osa.

43. Patenttivaatimuksen 41 tai 42 mukainen ligandiaine käytettäväksi menetelmässä hoitaa ihmis- tai eläinkehoa, tai diagnoosimenetelmässä. 79