JP4657757B2 - 肺高血圧症発症関連遺伝子を用いた肺高血圧症の診断および治療 - Google Patents
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Description
[実施の形態1]
(PH関連遺伝子)
本発明にかかるPH関連遺伝子は、配列番号1に示されるアミノ酸配列からなり、その配列中第269番目のアミノ酸としてグリシン挿入変異を持ったタンパク質をコードする遺伝子である。本発明にかかるPH関連遺伝子としては、具体的には、配列番号2に示される塩基配列を有し、その配列中第805〜807番目の塩基として「GGT」の3塩基挿入変異を持ったアンジオポエチン1遺伝子を例に挙げることができる。上記第805〜807番目の塩基は、アンジオポエチン1遺伝子のcDNAとしてGenBankに登録されている塩基配列(アクセッション番号:U83508)の第1114〜1116番目の塩基に相当する。
[実施の形態2]
(PHの発症またはその発症の可能性の判定方法)
本発明にかかるPHの発症またはその発症可能性の判定方法(換言すれば、PHの診断方法)において、具体的に、(1)ゲノムDNAを用いる場合、(2)mRNA(cDNA)を用いる場合、(3)本発明にかかるタンパク質を用いる場合を挙げることができる。以下、これら3種の方法について説明する。
(1)ゲノムDNAを用いる場合
ゲノムDNAを用いる本判定方法は、例えば次のようにして実施できる。
(2)mRNA(cDNA)を用いる場合
mRNAを利用する場合、例えば、被験者の細胞より抽出したmRNAから逆転写反応によってcDNAを作製し、上記変異位置を含む領域を増幅後、上記と同様、増幅断片の塩基配列を直接シークエンスすることにより、またはDNAチップを用いることにより、あるいはRFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)法を用いることにより、上記変異の有無を検出できる。
センスプライマー:5’-CCACCAACAACAGTGTCCTT-3’(配列番号3)
センスプライマー:5’-CAACCTTGTCAATCTTTGC-3’(配列番号4)
アンチセンスプライマー:5’-CAGCTTGATATACATCTGCACAG-3’(配列番号5)
このように、mRNA(cDNA)上の変異を検出することにより、上記と同様、被験者のPHの診断(発症またはその発症可能性の判定)を簡便に行うことができる。
(3)タンパク質を用いる場合
被験者の細胞より調製したタンパク質を利用する場合、配列番号1のアミノ酸配列において上記変異位置におけるグリシン挿入の有無を検出する方法が挙げられる。このグリシン挿入の有無の検出は、通常のタンパク質のシークエンス方法に準ずればよいが、例えば、グリシン挿入型タンパク質のみを認識する抗体を作製し、ELISA法で検出する方法、タンパク質を単離し、直接または必要に応じ、酵素等で切断し、プロテインシークエンサーを利用して変異を検出する方法、アミノ酸の等電点の変異を検出する方法および質量分析により質量の差を検出する方法が挙げられ、好ましくは、グリシン挿入型タンパク質のみを認識する抗体を作製し、ELISA法で検出する方法が挙げられる。
[実施の形態3]
(PHの発症またはその発症可能性の判定キット)
本発明にかかるPHの発症またはその発症可能性の判定キット(換言すれば、PHの診断キット)は、上記の変異を検出できる試薬、例えば、プライマー、プローブ、抗体などを含むものであれば特に限定されず、さらにその他の試薬を組み合わせることにより得ることができる。
また、本発明にかかるPHの発症またはその発症可能性の判定キットが適用される被験者は特に限定されるものではないが、MCTDを発症している者が好ましく、MCTDおよびSScを併発している者がより好ましい。
[実施の形態4]
(正常型PH発症関連タンパク質などのPHの治療方法および治療薬剤への利用)
このように、PH関連遺伝子上の3塩基挿入変異をもち、これに対応するアミノ酸配列上のグリシン挿入変異をもつPHの患者に正常型タンパク質(即ち、グリシン欠落型タンパク質)を補完することは、PHの治療法として有効であると考えられる。そこで、本発明は、(1)PHの治療方法、および(2)PHの治療薬剤に用いてもよい。
(1)PHの治療方法
上記グリシン挿入変異を持ったタンパク質を有するPH患者に、その変異を持たない正常型タンパク質または当該正常型タンパク質をコードするDNA、あるいは、当該正常型タンパク質がリガンドとなるレセプタータンパク質のアゴニストとしての低分子化合物を補完するPHの治療方法であることが好ましい。
(2)PHの治療薬剤
上記グリシン挿入変異を持ったタンパク質を有するPH患者の治療に用いられる治療薬剤であって、その変異を持たない正常型タンパク質または当該正常型タンパク質をコードするDNA、あるいは、当該正常型タンパク質がリガンドとなるレセプタータンパク質のアゴニストとしての低分子化合物を主成分とするPHの治療薬剤であることが好ましい。
[アンジオポエチン1遺伝子における変異の有無の評価方法]
(1)配列分析
被験者の末梢血を、公知の方法によりEDTA採血した。採血した上記末梢血からRNA isolation kit (GENTRA SYSTEMS, MN)を用いて、トータルRNAを単離した。単離した上記トータルRNAから公知の方法により、Oligo dTプライマーによる逆転写反応を行い、cDNAを合成した。そして、アンジオポエチン1遺伝子のエクソン4から5にかけて設定したプライマーを用いて、RT−PCR法により増幅断片を得た。なお、上記の反応に使用したプライマーは、以下に示すとおりである。
センスプライマーF2−2:5’-CCACCAACAACAGTGTCCTT-3’(配列番号3)
センスプライマーF2−4:5’-CAACCTTGTCAATCTTTGC-3’(配列番号4)
アンチセンスプライマーR1186:5’-CAGCTTGATATACATCTGCACAG-3’(配列番号5)
また、上記センスプライマーF2−2およびF2−4、ならびに上記アンチセンスプライマーR1186の設定位置については、図1に示すとおりである。
(2)鎖長分析
上記の配列分析の場合と同様の方法で増幅断片を得た。ただし、鎖長分析では、上記センスプライマーF2−4はTET蛍光標識したものを用いた。最終PCR反応産物を10倍に希釈した上記増幅断片を含む溶液を用いて、鎖長分析を行った。鎖長分析は上記の希釈された増幅断片を含む溶液を1μl、5mg/ml Blue Dextran、2.5mM EDTA、分子量マーカーGS500 TAMRA(Applied Biosystems)0.3μlを含むホルムアミド液3μlを試料とし、蛍光DNAシークエンサーを用いて行った。
[実施例1]
MCTD患者から上記の方法で採血した末梢血を用いて、上記の配列解析および鎖長解析を行った。図3は、変異位置を含む領域のシークエンス解析結果を示している。図3に示すように、アンジオポエチン1遺伝子においては、3塩基挿入型および3塩基欠失型の2種類が存在することが見出された。なお、同図(左)が3塩基挿入型の解析結果であり、同図(右)が3塩基欠失型の解析結果である。つまり、3塩基挿入型では、「GGT」の3塩基挿入が生じていることが確認でき(図3(左)を参照)、3塩基欠失型では、この3塩基が欠落していることが確認できた(図3(右)を参照)。
[実施例2]
RA患者、MCTD患者、MCTDおよびSScを併発している患者、ならびに健常者から採血した末梢血を用いて、上記方法により、アンジオポエチン1遺伝子における上記3塩基挿入変異の有無を検出した結果を図4に示す。
[実施例3]
図4中のMCTDおよびSScを併発している患者について、PH、レイノー現象および関節炎の発症頻度を調べた。その結果を図5に示す。
Claims (4)
- 生体から分離された試料において、配列番号1に示されるアミノ酸配列からなり、その配列中第269番目のアミノ酸としてグリシン挿入変異をもつタンパク質をコードする肺高血圧症発症関連遺伝子を、ヘテロまたはホモで有するか否かを検出することを特徴とする混合型結合組織病および強皮症を併発している患者における肺高血圧症の発症またはその発症の可能性の判定のためのデータ取得方法。
- 生体から分離された試料において、配列番号2に示される塩基配列を有し、その配列中第805〜807番目の塩基として「GGT」(G、Tはそれぞれグアニン、チミンを表す)の3塩基挿入変異をもつ肺高血圧症関連遺伝子を、ヘテロまたはホモで有するか否かを検出することを特徴とする混合型結合組織病および強皮症を併発している患者における肺高血圧症の発症またはその発症の可能性の判定のためのデータ取得方法。
- 生体から分離された試料において、配列番号1に示されるアミノ酸配列からなり、その配列中第269番目のアミノ酸としてグリシン挿入変異をもつタンパク質の有無を検出することを特徴とする混合型結合組織病および強皮症を併発している患者における肺高血圧症の発症またはその発症の可能性の判定のためのデータ取得方法。
- 請求項1ないし3のいずれか1項に記載の混合型結合組織病および強皮症を併発している患者における肺高血圧症の発症またはその発症の可能性の判定方法に利用するためのキットであり、以下の(a)〜(c)に示すプライマー、プローブおよび抗体の中から少なくとも1つを含むことを特徴とするキット。
(a)(i)配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子において、その配列中第269番目のグリシン挿入変異をコードする領域を増幅するためのプライマー、または(ii)配列番号2に示される塩基配列からなる遺伝子において、その配列中第805〜807番目の塩基として「GGT」(G、Tはそれぞれグアニン、チミンを表す)の3塩基挿入変異を含む領域を増幅するためのプライマー。
(b)(i)配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子において、その配列中第269番目のグリシン挿入変異をコードする領域に結合するプローブ、または(ii)配列番号2に示される塩基配列からなる遺伝子において、その配列中第805〜807番目の塩基として「GGT」(G、Tはそれぞれグアニン、チミンを表す)の3塩基挿入変異を含む領域に結合するプローブ。
(c)上記抗体として、配列番号1に示されるアミノ酸配列からなり、その配列中第269番目のアミノ酸としてグリシン挿入変異をもつタンパク質のグリシン挿入部位を認識する抗体。
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