JP4086315B2 - 調節遺伝子およびその使用 - Google Patents
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Description
本発明は、Fosによって調節される遺伝子のヌクレオチド配列、その配列によってコードされるタンパク質、その配列およびコードされたタンパク質の使用、ならびにその配列を１つ以上含むトランスジェニック動物に関する。本発明はまた、コードされたタンパク質に対して親和性を有する抗体分子およびその抗体分子の使用、ならびにアンチセンスヌクレオチド分子およびそのアンチセンスヌクレオチド分子の使用に関する。
転写因子AP-1は、細胞増殖、分化、および神経細胞機能を含む多くの細胞プロセスに関与する（AngelおよびKarin、1991を参照）。
AP-1は、遺伝子のプロモーターおよびエンハンサー領域に見い出された、AP-1エレメントとして知られるDNA認識配列に結合することによって、その効果を発揮すると考えられている。AP-1エレメントは、TGA G/C TCAのコンセンサス配列を有する。
調節領域中にAP-1エレメントを含む多くの遺伝子が見い出されており、c-Jun（Angelら、1988）、MCP-1（Rollinsら、1988）、ストロメライシン（Kerrら、1988）、Ｉ型コラゲナーゼ（Schonthalら、1988）、およびインターロイキンII（Farrarら、1989）が挙げられる。
AP-1は、Jun（c-Jun、Jun-BおよびJun D）タンパク質とFos（c-Fos、Fos B、Fra-1およびFra-2）タンパク質との間で形成された二量体複合体から構成される。AP-1のFos成分は、増殖周期中の細胞においてAP-1活性の制限成分であることが見い出されている（KovaryおよびBravo、1991を参照）。
c-Fosは、核内ガン原遺伝子であり、これは細胞増殖（Holtら、1986；Riabowolら、1988）、分化（Distelら、1987；Lordら、1993）、および腫瘍形成（Currenら、1983；Millerら、1984；Rutherら、1989）を含む多くの重要な細胞事象に関与している。
c-Fosは、c-Junとヘテロ二量体を形成する62kDaタンパク質をコードし、AP-1エレメントにおいてDNAと結合し、そして転写を刺激するAP-1転写因子を形成する。
Fos遺伝子産物はまた遺伝子発現を抑制し得る。Sassoneら（1988）は、c-Fosがそれ自身のプロモーターを阻害することを示し、そしてGiusら（1990）およびHayら（1989）は、c-Fosが初期応答遺伝子Egr-1およびc-mycを阻害することを示した。
AP-1因子はまた、MHCクラスＩ遺伝子およびPEPCK遺伝子の発現を阻害することが示されている（Gurneyら、1992およびHowcroftら、1993を参照）。
それゆえ、Fos調節遺伝子は、細胞表現型の変化を導く遺伝子の正確な発現に大変重要であると考えられ得る。Fos遺伝子の重要性は、c-Fos欠損マウスを作製することによってはっきりと示された（Huら、1994を参照）。c-Fos欠損マウスは生存可能であったが、大理石骨病、配偶子形成延滞、およびリンパ球減少（lymphophenia）および行動異常を含む幅広い組織特異的発育不全が現れた。
c-Fos欠損マウスは、線維芽細胞株を作製するために使用され、そして２つの遺伝子の発現が異常に低いことが見い出された。その２つの遺伝子は、ストロメライシンおよびＩ型コラゲナーゼであった。両遺伝子は、それらの調節配列中にAP-1部位を有するとして以前に同定された（Kerrら、1988およびSchonthalら、1988を参照）。
ストロメライシンおよびＩ型コラゲナーゼは、胚の組織発育（Brennerら、1989）、損傷組織の再構築（Hastyら、1990；WoessnerおよびGunja、1991）、ならびに腫瘍の進行および転移（LiottaおよびStetler、1990）に関連づけられている。
Superti-Furgaら（1991）は、c-Fos活性が、マウスc-Fosタンパク質とヒトエストロゲンレセプターのリガンド結合ドメインとが融合することによって、ホルモン性に制御され得ることを示した。この融合タンパク質は、厳格なホルモン依存性様式でAP-1依存性転写を刺激することが見い出された。この融合タンパク質を使用して、AP-1調節遺伝子であるFit-1が発見された。Fit-1は、スプライシングパターンに依存して、分泌タンパク質または膜結合タンパク質をコードすることが見い出された。
本発明は、２つの新規のFos調節遺伝子をコードするヌクレオチド配列に関する。
本発明は、Fos調節遺伝子によってコードされるタンパク質またはそのフラグメントをコードするヌクレオチド分子を提供する。ここで、前記タンパク質またはそのフラグメントは、図１または２に示されるヌクレオチド配列またはそれらのフラグメント（このヌクレオチド配列の対立遺伝子改変体および種改変株を含む）によってコードされる。
本明細書中で使用される用語「ヌクレオチド分子」とは、任意の長さのヌクレオチド、リボヌクレオチド、あるいはデオキシリボヌクレオチドのいずれもをいう。その用語は二本鎖および一本鎖分子の両方を含む。この用語はまた、公知のタイプの修飾、例えば当該分野で公知の標識、メチル化、「キャップ」、１つまたはそれ以上の天然に存在するヌクレオチドとアナログとの置換、ヌクレオチド間修飾（例えば、非荷電結合を有するもの（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメートなど）および荷電結合を有するもの（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど））、タンパク質（ヌクレアーゼ、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ-Ｌ-リジンなどを含む）のようなペンダント部分を含むもの、インターカレーター（例えば、アクリジン、プソラレンなど）を含むもの、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化性金属など）を含むもの、アルキル化剤を含むものおよび改変された結合を含むもの（例えば、αアノマー核酸など）を包含する。
本発明のヌクレオチド分子は、Fos調節遺伝子のタンパク質またはそのフラグメントをコードし得る。
タンパク質に関して使用される用語「フラグメント」とは、本発明のタンパク質に独特である十分な長さ（例えば、10、15、20または25の連続アミノ酸長）のフラグメントをいう。好ましくは、そのタンパク質フラグメントは、完全なタンパク質の活性の少なくとも一部を誘発し得る。特に好ましいフラグメントは、他の多くの遺伝子と相同であることが見い出されている、遺伝子の保存領域を含む。このような保存領域は特異的な機能を有すると考えられる。
ほとんどの天然に存在するヌクレオチド配列と同様に、図１および２に示されるヌクレオチド配列は、他の多くの形態（例えば、対立遺伝子改変体および種改変体）を有する。本発明のヌクレオチド配列のこのような改変体および他の任意の天然に存在する形態もまた、本発明の一部を形成すると考えられる。そのような改変体は、図１または図２に示される配列あるいはそのフラグメントと少なくとも60％、好ましくは80％、そして最も好ましくは90％の配列相同性を有するべきである。
本発明はまた、本発明のヌクレオチド分子であって、図１または２に示される配列またはそのフラグメントによってコードされるタンパク質またはそのフラグメントが変化している、ヌクレオチド分子に関する。
好ましい変化したタンパク質またはそのフラグメントは、依然としてその活性を保持し、そして図１または図２に示される配列あるいはそのフラグメントによってコードされるタンパク質またはそのフラグメントと、好ましくは少なくとも80％、より好ましくは90％、そして最も好ましくは95％の相同性を有する、タンパク質またはそのフラグメントである。好ましくは、そのような変化したタンパク質またはそのフラグメントは、１〜10アミノ酸だけ異なる。さらに好ましくは、アミノ酸交換は保存的である。
保存交換とは、あるアミノ酸と、それらの側鎖が関連するアミノ酸ファミリーからのアミノ酸とが置き換わることである。例えば、ロイシンとイソロイシンまたはバリンとの、アスパラギン酸とグルタミン酸との、スレオニンとセリンとの隔離された置換、または構造的に関連するアミノ酸間の同様な保存的置換が、タンパク質の生物学的活性に大きな影響を与えないことは容易に予期され得る。
しかしながら、タンパク質の生物学的活性を変化させるために、アミノ酸を変化させることが時には望まれる。例えば、タンパク質の１つまたはそれ以上の機能を破壊または増強した変異体は、特に有用であり得る。そのような変異体は、一般的にタンパク質の任意の保存配列を変化させることによって作製され得る。タンパク質中の他のアミノ酸とジスルフィド結合を形成し得るアミノ酸の数を増加させた変異体は、タンパク質の安定性を増加させるためには、特に好ましい。タンパク質中の他のアミノ酸とジスルフィド結合を形成し得るアミノ酸の数を減少させた変異体もまた、タンパク質の安定性を減少させることが所望であれば、作製され得る。このような変化したタンパク質またはそのフラグメントは、図１または図２に示される配列あるいはそのフラグメントによってコードされるタンパク質またはそのフラグメントと、好ましくは少なくとも80％、さらに好ましくは90％、そして最も好ましくは95％の相同性を有する。好ましくは、このような変化したタンパク質またはそのフラグメントは、１〜10アミノ酸だけ異なる。
本発明のヌクレオチド分子は、当該分野で周知の方法によって得られ得る。例えば、配列は、ゲノムクローニングあるいはcDNAクローニングによって、適切な細胞株あるいは生物（例えばマウス）の組織に直接由来するDNAまたはcDNAから得られ得る。適切な細胞株は、Huら（1994）に記載されている3T3細胞株のような任意の線維芽細胞株を包含する。ポジティブクローンは、望ましいヌクレオチド分子に適切なプローブを用いてスクリーニングされ得る。PCRクローニングもまた使用され得る。本発明のヌクレオチド分子によってコードされるタンパク質またはそのフラグメントをコードする配列が本明細書中で与えられれば、プローブおよびプライマーは容易に作製され得る。
分子生物学の分野で公知の多くの標準的な技術が、望ましいヌクレオチド分子、またはポジティブクローンを同定するためのプローブおよびプライマーを調製するために使用され得る。ヌクレオチド分子、プローブまたはプライマーは、ホスホルアミダイト法のような標準的なオリゴヌクレオチド合成法を使用して完全に合成され得る。
多くの技術が、合成またはクローニング手順によって得られるDNA配列を変化させるために使用され得、そしてそのような技術は当業者に周知である。例えば、部位特異的変異誘発、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発およびPCR技術が、DNA配列を変化させるために使用され得る。そのような技術は当業者に周知であり、そして当業者に公知の膨大な量の文献（例えば、Sambrookら（1989））に記載されている。
本発明はさらに、本発明のヌクレオチド分子によってコードされるタンパク質を提供する。
好ましくは、本発明のヌクレオチド分子によってコードされるタンパク質は、図１または図２に示されるアミノ酸配列あるいはそのフラグメントを有する。
本明細書中で使用される用語「タンパク質」とは、アミノ酸のポリマーをいい、特定の長さの生成物をいうのではない；したがって、ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質は、用語タンパク質に包含される。その用語はまた、タンパク質の発現後に修飾（例えば、グリコシル化、アセチル化、およびリン酸化）されたものをいうのではなく、これらを含まない。アミノ酸の１つまたはそれ以上のアナログ（例えば、非天然アミノ酸を含む）を含有するタンパク質、置換された結合を有するタンパク質、および当該分野で公知の他の修飾体（天然に生じる修飾体および合成された修飾体の両方）がその定義に含まれる。
本発明のタンパク質は、線維芽細胞のような天然にこのタンパク質を産生する細胞から、標準的な精製技術を用いて得られ得る。しかしながら、本発明のヌクレオチド分子の発現に適切な宿主細胞およびベクターシステムを、使用することが好ましい。本発明のヌクレオチド分子は、様々な異なる発現システム（例えば、哺乳動物細胞、バキュロウイルス、細菌および酵母のような真核微生物を用いたシステム）において発現され得る。
上記の発現システムはすべて当該分野で公知であり、そしてヌクレオチド配列を発現させることは、今では、当業者全てに公知の標準的な技術である。
好ましくは、真核生物（例えば哺乳動物）の宿主細胞発現システムが使用される。特に、適切な哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、HeLa細胞、ベビーハムスター腎（BKH）細胞、HepG2細胞のような肝臓起源の細胞、およびメラローマまたはハイブリドーマ細胞株を含む。
本発明はさらに、プロモーターおよび本発明のヌクレオチド分子を含む、本発明のヌクレオチド分子の発現のためのベクターを提供する。
哺乳動物プロモーターは、哺乳動物RNAポリメラーゼに結合してmRNAへのコード配列の転写を開始し得る任意のDNA配列であり得る。特に有用なプロモーターは、SV40初期プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーターおよび単純ヘルペスウイルスプロモーターのような哺乳動物ウイルス遺伝子由来のプロモーターである。それに加えて、マウスメタロチオネイン遺伝子由来のような非ウイルス遺伝子由来の配列もまた、プロモーターとして使用され得る。
本発明のヌクレオチド分子は、哺乳動物細胞において細胞内に発現し得る。プロモーター配列は、本発明のヌクレオチド分子と直接結合され得る。この場合、コードされるタンパク質のＮ末端の最初のアミノ酸は、開始ATGコドンによりコードされるメチオニンである。
あるいは、本発明のヌクレオチド分子によってコードされるタンパク質は、リーダー配列をコードするヌクレオチド配列を本発明のヌクレオチド分子と結合することによって、細胞から分泌され得る。コードされた融合タンパク質は、リーダー配列フラグメントおよび本発明のヌクレオチド分子にコードされるタンパク質を含む。リーダー配列は、融合タンパク質の細胞外への分泌を導く。好ましくは、リーダー配列と本発明のヌクレオチド分子にコードされるタンパク質との間にプロセシング部位が存在し、リーダー配列を酵素的あるいは化学的に切断することが可能である。そのようなリーダー配列の例は、アデノウイルス３分節リーダーである。
本発明のベクターは、好ましくは、DNAを含む核酸ベクターである。そのベクターは、当業者に公知の広範囲の文献に発表されているように、直線状または環状の形状であり得、宿主細胞におけるエピソームとしての存在あるいは組み込まれた存在に適合され得る。ベクターは、ウイルス性または非ウイルス性送達システムを用いて細胞へ送達され得る。送達システムの選択は、DNA分子が細胞ゲノム中に取り込まれるかまたはエピソームのままであるかを決定する。
本発明のベクターは、ポリアデニル化シグナル、転写終結シグナル、エンハンサー、遺伝子座制御領域（LCR）などのようなさらなる制御エレメントを含み得る。
本発明はさらに、本発明のベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
形質転換とは、外因性ポリヌクレオチドを宿主細胞中へ挿入することをいい、挿入に使用する方法（例えば、直接取り込み、形質導入、ｆ接合またはエレクトロポレーション）を問わない。外因性ポリヌクレオチドは、非組み込みベクター（エピソーム）として維持され得るか、あるいは宿主ゲノム中へ組み込まれ得る。
好ましくは、宿主細胞は真核細胞であり、さらに好ましくは、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、HeLa細胞、ベビーハムスター腎（BKH）細胞、HepG2細胞のような肝臓起源の細胞、およびメラローマまたはハイブリドーマ細胞株のような哺乳動物細胞である。
さらに本発明は、本発明のヌクレオチド分子によってコードされるタンパク質を産生するための方法を提供する。この方法は、本発明のベクターで宿主細胞をトランスフェクトする工程、そのトランスフェクトした宿主細胞を、DNA分子の発現および所望のタンパク質の産生を導くために適切な条件下で培養する工程を包含する。次いで、タンパク質は、そのタンパク質が分泌されるかどうかに応じて、標準的な技術を用いて、トランスフェクトした細胞または細胞増殖培地から収集され得る。
さらに本発明は、治療に使用するために本発明のヌクレオチド分子を提供する。
さらに本発明は、発育障害の処置のための組成物の製造における、本発明のヌクレオチド分子の使用を提供する。
さらに本発明は、発育障害の処置における、本発明のヌクレオチド分子の使用を提供する。
Fos調節遺伝子は、発生および細胞分化に関与することが知られている。従って、Fosにより調節される遺伝子の発見は、発生および細胞分化の制御において意味を持つ。
図１および図２に示されるヌクレオチド配列は、血小板増殖因子（PDGF）ファミリー固有の特徴によって特徴づけられる増殖因子ファミリーの遺伝子に類似する配列を有することが見い出された。最も明らかに関連する配列は、血管内皮増殖因子（VEGF）の配列である。VEGFは、血管形成および内皮細胞増殖において活性な増殖因子であるホモ二量体を形成する（Keckら、1989、およびLeungら、1989を参照）。VEGFはまた、血管形成を刺激し、それにより治療効果を生じさせるために使用されてきた（Takeshitaら、1994を参照）。
図１の配列によってコードされるタンパク質は、マウスのタンパク質であり、そして図２の配列によってコードされるタンパク質は、図１に与えられた配列によってコードされるマウスタンパク質のヒトホモログである。本明細書中で両タンパク質は、c-Fos誘導増殖因子（FIGF）と呼ばれている。
それゆえ、治療における本発明のヌクレオチド分子の使用は、本発明のFos調節遺伝子配列の重要な適用であると考えられ得る。
図１および図２に示されるヌクレオチド配列は、このヌクレオチド配列が主に肺で発現されることが見い出されているので、肺疾患に特に重要である。図１または図２に示される配列によってコードされるタンパク質またはそのフラグメントをコードするヌクレオチド分子を使用して処置され得る特定の肺疾患は、肺炎および塵肺症を含む。ヌクレオチド分子はまた、肺の再生を助けるために肺摘除術後に使用され得る。
図２のヌクレオチド配列は、病変である脊椎骨端形成異常（SEDL）に関する遺伝子座の近くの、ヒト染色体Xp22にマッピングされた。この領域の遺伝子地図は、Ferreroら（1995）によって記載され、そしてSEDL疾患のマッピングは、Heuertzら（1993）によって記載されている。従って、SEDLは、図１または図２に与えられた配列によってコードされるタンパク質をコードするヌクレオチド分子、またはそのフラグメントを使用して処置され得る。
以前に考察されたように、Fos調節遺伝子は、腫瘍進行および転移に関与することが、見出されている。Fos調節遺伝子を阻害することによって、腫瘍増殖を阻害または抑制することが可能である。
以前に、Kimら（1983）は、VEGFに特異的なモノクローナル抗体を注入することによって、腫瘍増殖を抑制した。以前に記載されたように、VEGFは、図１および図２に示されるヌクレオチド配列と同様なヌクレオチド配列を有する。従って、本発明のネイティブなヌクレオチド分子のインビボ発現、翻訳などのいずれかを阻害することによって、腫瘍増殖が阻害または抑制され得る。
本発明のヌクレオチド分子に対応するFos調節遺伝子の作用は、多数の技術によって阻害され得る。好ましい技術は、アンチセンスに基づく技術、リボザイムに基づく技術、および抗体に基づく技術を包含する。
本発明のヌクレオチド分子によりコードされるタンパク質に特異性を有する抗体分子は、タンパク質の機能をブロックし、それにより腫瘍増殖を阻害または抑制するために、使用され得る。
さらに、本発明は、本発明のタンパク質に対して特異性を有する抗体分子を提供する。抗体分子は、完全なポリクローナルまたはモノクローナル抗体、またはFv、Fab、F（ab'）2フラグメント、およびそれらの一本鎖Fvフラグメントのような、抗原結合フラグメントであり得る。抗体分子は、好ましくは、ヒト定常領域およびマウス可変領域を有するキメラ抗体分子、ヒト化CDRグラフト抗体分子、またはそのフラグメントのような、組換え抗体分子であり得る。このような抗体を作製するための方法は、当業者に周知であり、そしてEP-A-0120694およびEP-A-0125023に記載されている。
本発明はさらに、治療に使用するための本発明の抗体分子を提供する。
本発明はまた、ガンのような増殖性疾患を処置するための組成物の製造における、本発明の抗体分子の使用を提供する。
本発明はさらに、ガンのような増殖性疾患を処置するための本発明の抗体分子の使用を提供する。
本発明はさらに、本発明のヌクレオチド分子またはそのフラグメントに相補的な配列を有する、アンチセンスヌクレオチド分子またはそのフラグメントを提供する。
本発明のアンチセンスヌクレオチド分子は、本発明のヌクレオチド分子について用いる方法と同じ標準的な方法を用いて生成され得る。
本発明はさらに、プロモーターおよびアンチセンスヌクレオチド分子を含有する、本発明のアンチセンスヌクレオチド分子を発現させるための、アンチセンスベクターを提供する。
アンチセンスベクターは、ベクターが本発明のアンチセンスヌクレオチド分子を含有すること以外は、本発明の核酸ベクターと同じである。
本発明はさらに、治療における使用のための、本発明のアンチセンスベクターを提供する。
本発明はさらに、ガンのような細胞増殖性疾患を処置するための組成物の製造における、本発明のアンチセンスベクターの使用を提供する。
本発明はさらに、ガンのような細胞増殖性疾患の処置における、本発明のアンチセンスベクターの使用を提供する。
本発明はさらに、プロモーターおよび本発明のヌクレオチド分子のRNA転写産物を切断し得るリボザイムをコードするヌクレオチド配列を含有する、リボザイムを発現するためのベクターを提供する。
リボザイムをコードするベクターは、このベクターがリボザイムをコードする以外は、以前に記載したベクターと同じである。リボザイムは、本発明のヌクレオチド分子のRNA転写産物を切断し得る。このようなリボザイムを産生する技術は、当業者に公知であり、Cantorら（1993）に記載されている。
本発明はさらに、治療における使用のための、本発明のリボザイムコードベクターを提供する。
本発明はさらに、ガンのような細胞増殖性疾患を処置するための組成物の製造における、本発明のリボザイムコードベクターの使用を提供する。
本発明はさらに、ガンのような細胞増殖性疾患の処置における、本発明のリボザイムコードベクターの使用を提供する。
本発明のさらなる目的は、本発明のタンパク質のレセプターまたは本発明のタンパク質を含有するタンパク質複合体のレセプターを同定することにおける、本発明のタンパク質の使用である。
レセプターを同定する方法は当業者に周知であり、そして広く文献に記載されている。しかし、基本的に、レセプターを同定する３つの主な方法がある：
i．類似の分子に結合する全ての既知のレセプターをテストする。これは、VEGFが類似の配列を有することが見出されているので、図１および図２に示されるDNA配列によってコードされるタンパク質について、特に有用である。
ii．結合精製工程を行う。例えば、本発明のタンパク質または本発明のタンパク質を含有するタンパク質複合体を、固体支持体上に固定し得、次いで、多くの可能性のあるレセプター分子（特に、膜タンパク質）をその固体支持体上を通過させる。結合精製手順は、Schustedら（1995）に記載されている。
iii．レセプターを欠損する細胞を見出すために発現ライブラリーをスクリーニングし、次いでSeedおよびAruffo（1987）によって記載されたレセプタークローニング法を利用することによる。
他の方法もまた、当業者に公知であり、レセプターを見出すために使用され得る。
レセプターの同定により、レセプターの活性をブロックまたは増強する薬剤を設計すること、およびレセプターをブロックする抗体分子を作製することが可能である。一旦、レセプターのDNA配列が公知になると、レセプターにおける誤りを修正するか、またはレセプターの発現をブロックするための多数の遺伝子治療が、設計され得る。
本発明はさらに、ガンおよび発育障害のそれぞれを処置することにおける薬物として使用され得る、本発明のタンパク質のアンタゴニストまたはアゴニストを同定するためのアッセイにおける、本発明のタンパク質の使用を提供する。このような潜在的な薬物の同定するためのアッセイは頻繁に使用され、当業者に周知である。このようなアッセイの例は、Tsunodaら（1994）に明確に記載されている。
本発明はさらに、本発明のヌクレオチド分子、アンチセンスヌクレオチド分子、タンパク質もしくは抗体分子、またはそれらの任意の組合せの、病理学的状態または疾患に対する疾病素質を診断するにおける使用を提供する。
本発明のヌクレオチド分子またはアンチセンスヌクレオチド分子は、このヌクレオチド分子に対応する遺伝子の存在を決定することに、またはその遺伝子から転写されたRNAの量を測定することに、使用され得る。
本発明のタンパク質は、本発明のヌクレオチド分子に対応する遺伝子によりコードされるタンパク質の量を測定するためのアッセイにおいて使用され得る。
本発明の抗体分子は、本発明のヌクレオチド分子に対応する遺伝子によりコードされるタンパク質の量を測定するためのアッセイにおいて使用され得る。本発明の抗体分子を使用する、タンパク質の量を測定するためのアッセイの例は、競合結合アッセイである。
本発明のヌクレオチド分子に対応する遺伝子、または転写RNAまたは遺伝子にコードされるタンパク質の存在を決定することによって、その遺伝子の存在またはこの遺伝子の過剰発現によって引き起こされる病理学的状態または疾患に対する疾病素質を診断することが可能である。
本発明はさらに、トランスジェニック動物の作製における、本発明のヌクレオチド分子の使用を提供する。特に、本発明は、非ヒトトランスジェニック動物、特にトランスジェニックマウスを作製するための、このようなヌクレオチド分子の使用を提供する。
研究のためのモデルとして適切であるトランスジェニック動物が作製され得る。例えば、本発明のヌクレオチド分子を過剰発現するトランスジェニック動物は、過剰発現がどのような影響を有するかを決定するために使用され得る。あるいは、本発明のネイティブなヌクレオチド分子が「ノックアウト」されたトランスジェニック動物が作製され得る。次いで、本発明のヌクレオチド分子を「ノックアウト」する効果が研究され得る。
このようなトランスジェニック動物を作製するための方法は、当業者に周知であり、過剰発現または「ノックアウト」されるべきヌクレオチド分子が、本明細書に開示されているので、容易に実施され得る。
本発明のトランスジェニック動物はまた、続いて、改変したFos制御の効果を測定するために、Fos過剰発現マウスまたはFos「ノックアウト」マウスのいずれかと交配し得る。
本発明はまた、図１または図２のいずれかに示される配列の全てまたは一部を含有するヌクレオチド分子を提供する。
図１または図２のいずれかに示される配列の全てまたは一部を含有するヌクレオチド分子は、タンパク質をコードしてもよいし、またはコードしなくてもよい。好ましくは、ヌクレオチド分子は、図１または図２のいずれかに示されるヌクレオチド配列に対応するFos遺伝子の制御配列をさらにコードする。さらに好ましくは、ヌクレオチド分子は、遺伝子にFos調節を付与する配列をコードする。特に好ましくは、ヌクレオチド分子は配列TGACTCAを含有する。
本発明は、以下の図面を参照して、添付の実施例において例示される。
図１
Fos調節遺伝子F0401のDNA配列。コードされるタンパク質配列およびVEGFに相同な領域（下線）も示す。
図２
Fos調節遺伝子HF175のDNA配列（F0401のヒトホモログ）。コードされるタンパク質も示す。
図３
増殖因子のPDGF/VEGFファミリーの保存ドメインと、FIGFによってコードされるタンパク質とのアラインメント。点は、これらの増殖因子の特徴であるシステイン残基を示す。
図４
（Ａ）FIGFタンパク質の免疫沈降アッセイ。ベクターのみでトランスフェクトしたCOS-7細胞（−）、または、CMVプロモーターの制御下にFIGFコード配列を含有するベクターでトランスフェクトしたCOS-7細胞（＋）を、それぞれ、100μCi/mlの濃度の［35S］メチオニンおよび［35S］システインで、１時間、代謝的に標識した。１時間または22時間のチェイス後、馴化培地および細胞溶解物を、抗FIGFポリクローナル抗体で、別々に免疫沈降させた。（FIGFタンパク質は、T5プロモーターの制御下で、E. coliにおいて発現させた。FIGFのコード領域から、cDNAフラグメントを、+40位のメチオニン残基からのPCRによって作製し、pQE-31ベクター（Qiagen）中にクローニングしてＮ末端ヒスチジンタグとの融合タンパク質を得た。このタンパク質を２mMイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドの存在下で、37℃にて４時間、誘導することによって、TG1細菌（pREP+）において発現させた。組換えタンパク質は、専ら封入体中に局在し、そして製造者のプロトコル（Qiagen）に従って、変性条件下、Ni−NTA−樹脂カラムで精製した。完全フロイントアジュバント中の変性タンパク質の形態で200μgの組換えFIGFをウサギに注射して、抗体を惹起させた。不完全フロイントアジュバントでの３週間間隔で４回の注射後、血清を調製した。免疫複合体を、プロテイン−Ａセファロースビーズ（Pharmacia）によって回収し、そして3％ β−メルカプトエタノールの存在下での12％ SDS-PAGEで分離した。矢印は、FIGFトランスフェクト細胞にのみ存在する特異的なバンドを示す。
（Ｂ）［3H］-チミジン取り込みとして測定された、c-fos（-/-）線維芽細胞中の細胞分裂促進活性。細胞を、FIGF発現ベクターまたはベクター単独でトランスフェクトしたCOS-7細胞の馴化培地とともに、インキュベートした。トランスフェクションの１日後に、それらの細胞を分割して、２％血清中に維持した。120時間後、馴化培地を回収した。
（Ｃ）［3H］-チミジン取り込みとして測定された、c-fos（-/-）線維芽細胞中の細胞分裂促進活性。CMVプロモーターの制御下で構成的に外因性FIGFを発現する、c-fos（-/-）安定クローン（FH-10.2、FH-10.5、FH-9.3、FH-9.6、FH-10.9と命名）およびc-fos（-/-）細胞（模擬）から得た馴化培地とともに、細胞をインキュベートした。馴化培地を、0.5％血清中で48時間培養された細胞から回収した。
（Ｄ）［3H］-チミジン取り込みとして測定された、c-fos（-/-）線維芽細胞中の細胞分裂促進活性。細胞を、部分再生された組換えFIGFとともにインキュベートした。同一条件下で、PDGF-BB（Sigma）とのインキュベーション（ポジティブコントロールとして使用）は、約30％高いチミジン取り込みを誘導するが、一方、VEGF（Sigma）は、バックグラウンドを超える取り込みを誘導しない。示されるデータは、２つの異なるFIGF調製物で実施された６回の実験の平均である。
（Ｅ）［3H］-チミジン取り込みとして測定された、マウス胚線維芽細胞における細胞分裂促進活性。細胞を、部分再生された組換えFIGFとインキュベートした。MEF細胞を、B6D2F1マウスの13〜15日齢の胚から得た。胚を屠殺して、リンスし、そして37℃で30分間トリプシン処理した。MEF細胞を、増殖因子を添加する前に、0.5％血清を含有する培地中で24時間増殖させた。同一条件下で、PDGF-BB（Sigma）とのインキュベーション（ポジティブコントロールとして使用）は、約30％高いチミジン取り込みを誘導するが、一方、VEGF（Sigma）は、バックグラウンドを超える取り込みを誘導しない。示したデータは、２つの異なるFIGF調製物で実施された６回の実験の平均である。バックグラウンド値を、各実験において差し引いた。
図５
（Ａ）培養細胞におけるFIGF発現。以下の細胞から得たトータルRNAのノーザンブロット解析：c-fos（-/-）線維芽細胞（レーン１〜３）；外因性c-fosを発現する、c-fos（-/-）細胞から得た安定細胞株（レーン４〜６）、c-fos（+/+）線維芽細胞（レーン７〜９）。0.5％血清中で48時間、細胞のインキュベーションした後、グアニジンチオシアネート法によって、細胞性RNAを抽出した（時間０）。血清濃度を10％まで増加させ、そして示すように、２時間または４時間でトータルRNAを回収した。レーン10および11は、ベクター単独（模擬）、または、FBJ-LTR構成プロモーター下にc-fosを含有するベクター（c-fos）で、一過性にトランスフェクトしたc-fos（-/-）線維芽細胞におけるFIGF発現を示す。一過性にトランスフェクトした細胞のRNAを、0.5％血清を含有する培地中でこの細胞を培養して30時間後に、回収した。各レーンに、10μgのトータル細胞性RNAをロードした。
（Ｂ）PDGFまたはVEGFの発現。c-fos（-/-）細胞由来のトータル細胞性RNA（レーン１〜３）、または外因性c-fosを発現する、c-fos（-/-）細胞から得た安定細胞株由来のトータル細胞性RNA（レーン４〜６）を、パネルＡに示すように抽出した。グリセルアルデヒド−ホスフェート−デヒドロゲナーセ（GAPDH）を、RNAのロードについてのコントロールとして使用した。
図６
異なるマウス組織から抽出したRNAポリＡ＋のノーザンブロット解析。
図７
（Ａ）c-fos欠損細胞の形態。細胞を、ベクター単独で安定にトランスフェクトした。
（Ｂ）CMVプロモーターの制御下にFIGFを含有する発現ベクターで安定にトランスフェクトした、c-fos欠損細胞由来の細胞クローンの形態。
（Ｃ）CMVプロモーターの制御下にアンチセンス方向でFIGF cDNAを含有する発現ベクターで安定にトランスフェクトした細胞の形態。
（Ｄ）FBJ-LTRプロモーターの制御下にc-fosを含有する発現ベクターで安定にトランスフェクトした細胞の形態。
（Ｅ）CMVプロモーターの制御下にFIGFを含有する発現ベクターでトランスフェクトした、Ｄにおける細胞（構成的にc-fosを発現する）と同じ細胞に由来する細胞クローン。
（Ｆ）CMVプロモーターの制御下にアンチセンス方向でFIGF cDNAを含有する発現ベクターでトランスフェクトした、Ｄにおける細胞（構成的にc-foscを発現する）と同じ細胞に由来する細胞クローン。
（Ｇ）0.5％血清を含有する培地中で120時間培養された、c-fos（-/-）線維芽細胞。
（Ｈ）部分再生された組換えFIGFで120時間処理した以外は、Ｇと同じ細胞。3つの独立したトランスフェクションから得た、10の独立したクローンを分析した。全て、図において観察される変化と同じ形態学的変化を示した。
実施例
細胞培養およびクローン単離
c-Fos発現（+/+）に関するマウス野生型線維芽細胞、およびc-Fos欠損（-/-）3T3細胞株、ならびに外因性c-Fosを構成的に発現する安定にトランスフェクトした細胞株を、記載（Huら、1994）のように作製した。全ての細胞株を、10％胎児ウシ血清（FCS）、グルタミン、およびペニシリン−ストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）において、５％ CO2で、37℃にて増殖させた。細胞を、約70％集密に達するまで培養し、0.5％ FCS含有DMEM中で48時間血清欠乏させ、そしてRNA単離前の０、２、および４時間、10％ FCS含有DMEMで刺激した。トータルRNAを、グアニジン−イソチオシアネート法を用いて単離した。mRNAディッファレンシアルディスプレイを、Laingらにより記述され、そしてBauerらにより改変された（Bauerら、1993）ように実施した。要するに、抽出したRNAから、染色体DNA夾雑物を、DNaseI処理により単離した50μgのトータルRNAから除去した。血清誘導２時間後または４時間後に抽出した0.2μgのRNAを、dT12mNプライマーおよび300U MMLV逆転写酵素（Promega Corp., Madison, WI）を使用する、40μlの反応容量で、37℃にて60分間のインキュベーション時間での逆転写のために使用した。cDNA増幅用のPCR混合物は、dT12mNプライマー、任意配列を有する、20の10merデオキシオリゴヌクレオチドプライマーのうち１つ（Kit A - Operon Biotechnology Inc., Alameda, CA）、33P-dATP（Amersham International plc,Buckinghamshire, England）、および１U Taqポリメラーゼ（Promega Corp.）を含有した。試料を、PTC-100サーモサイクラー（MJ Research Inc., Watertown, MA）を使用して、40サイクルの増幅に供した。サイクルパラメーターは以下のとおりであった：94℃で30秒間、42℃で90秒間、72℃で30秒間、そして72℃で10分間のさらなる伸長時間。2μlのPCR混合物を、グリセロールで５％に調整し、尿素を含まない６％ポリアクリルアミドゲルに負荷した（Bauerら、1993）。別々に発現したcDNAのバンドを、ゲルから回収し、再度増幅した。再増幅cDNAプローブを、1.5％アガロースゲル上で泳動し、精製し、そしてTAクローニングシステム（Promega Corp.）を使用して、pGEM-Tベクター中へクローニングした。ポジティブクローンを、ブルー−ホワイト表現型を使用して選択した。
新規クローンの特徴づけおよび配列分析
典型的には、１つのバンドから１〜３の異なるクローンを得、それらを引き続いて、ノーザンブロット分析による特徴づけに利用した。cDNAフラグメントを、ランダムプライマー標識キット（Amersham International plc）を使用して、32P-dCTPで標識した。ハイブリダイゼーションシグナルをスクリーニングし、Image Quantソフトウエアーを用いるPhosphorImager（Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA）によって定量した。T7またはSP6プライマーのいずれかでのクローニングされたcDNAプローブのプラスミドDNA配列分析を、Sequenase V 2.0キット（US Biochemical Inc., Cleveland, Ohio）を使用して、手動で実施した。要するに、細胞から抽出したRNAを、ランダムプライマーを利用する増幅に供し、そして細胞タイプのバンドを比較により同定して、単離した。得られたフラグメントを、その細胞株由来のRNAを用いるノーザンブロットにおいてテストして、対応するmRNAが、Fos発現細胞でアップレギュレートされることを確認した。次に、マウス線維芽細胞株から、λZAPベクター中に独自のcDNAライブラリーを作製し、cDNA合成およびクローニングキット（Stratagene）を利用して、完全長クローンを得た。スクリーニングは、製造業者の指示に従って実施した。ポジティブクローンを、まず制限地図によって分析し、最も長いものをDNA配列分析に供した。
クローン分析
F0401配列を図１に示し、HF175配列を図２に示す：NIHおよびEMBLデータバンクに対する簡単な検索分析により、F0401およびヒトホモログFIGFが新規遺伝子であり、それらの配列は、血小板増殖因子（PDGF）ファミリー固有の特徴により特徴づけられる、増殖因子ファミリーの遺伝子と同様であることが明かとなった。このファミリーの共通パターンは、C-V-x（3）-R-C-x-G-C-C-Nである。このファミリーのメンバーは、ジスルフィド連結による二量体を形成し、そして強力なマイトジェンである。F0401およびHF175に最も類似する配列は、ホモ二量体を形成し、血管形成および内皮細胞増殖において活性な増殖因子である（Keckら、1989；Leungら、1989）血管内皮増殖因子（VEGF）である。VEGFは増殖因子であるので、その過剰発現は、腫瘍血管形成を生じ得る（Plateら、1993）。最近の報文には、腫瘍におけるVEGF阻害（Kimら、1993）、および血管形成を刺激するためのVEGF処置（Takeshitaら、1994）に基づく、可能な治療的使用が示されている。
以下の実験は、F0401を使用して実施された。
FIGF推定タンパク質配列は、シグナルペプチドをコードし得る、Ｎ末端に疎水性配列を有する。この長いＮ末端領域は、既知タンパク質に対して有意な相同性を示さない。しかし、この領域には、細胞膜または細胞外マトリックスへのタンパク質の結合を可能にし得る、正に荷電したドメインが存在する。
FIGFが分泌タンパク質であるどうかを証明するために、COS-7細胞を、サイトメガロウイルス（CMV）即時型遺伝子プロモーターの制御下に、FIGF cDANを有する発現ベクターでトランスフェクトした。組換えFIGFに対して惹起させた（以前に記載されたように）ポリクローナル抗体は、FIGFトランスフェクトCOS-7細胞の細胞溶解物および馴化培地の両方において観察される特異バンドを免疫沈降させた（図4A）。１時間の標識に続いて１時間のチェイス後、特異バンドは、主に細胞溶解物に存在したが、４時間より長いチェイス後には、タンパク質は細胞上清に蓄積した。非変性条件下では、FIGFは多量体形態に凝集した。β-メルカプトエタノールの添加は、66kDaバンドとして主に移動したタンパク質の部分変性を生じ、タンパク質のわずかな画分のみが、推定分子量33kDaの単量体として見出され得る（図4A）。これらの結果は、FIGFが分泌タンパク質であり、二量体を形成し得ることを示す。FIGFの中心ドメインが高度に保存され、PDGFおよびVEGFの両方の二量体化に関与するシステイン残基を含有するので、FIGFの二量体化は予測され得る。FIGF産生細胞の馴化培地が、インビトロで細胞増殖を促進し得るかどうかをさらに研究し、［3H］-チミジン取り込み（Vaziriら、（1995））としてアッセイした。馴化培地を、一過性トランスフェクトCOS-7細胞、またはCMVプロモーターの制御下でFIGFを発現する、c-fos（-/-）線維芽細胞由来の安定なクローンのいずれかから得た。FIGFを含有する培地の細胞分裂促進活性を、c-fos（-/-）線維芽細胞についてテストした。トランスフェクトCOS-7細胞（図4B）またはFIGFを過剰発現する安定な線維芽細胞クローン（図4C）の両方からの馴化培地は、c-fos（-/-）線維芽細胞でのDNA合成を誘導する。哺乳動物細胞において、FIGF発現が、他の増殖因子の活性化を誘導し得、これが、次に、測定した［3H］-チミジン取り込みを担うので、E. coliにおいて発現された組換えFIGFタンパク質の細胞分裂促進活性をテストした（以前に記載されたように）。生物学的に活性な組換えタンパク質を得るために、E. coli由来の精製FIGFタンパク質を、還元グルタチオンおよび酸化グルタチオン混合物の存在下で、部分的に再生した。精製組換えタンパク質を0.4mg/mlに調整し、８M尿素、２％β-メルカプトエタノールの存在下に、370℃で１時間、完全に還元した。還元タンパク質を、Hoppeら、Biochemistry, 28, pp 2956-2960（1989）；Hoppeら、Eur. J. Biochem., 187, pp 207-214（1990）に記載されているように、50mM Tris-Cl（pH8.0）、１M尿素、５mM還元グルタチオン、および0.5mM酸化グルタチオンを含有する溶液に対して２日間透析し、そして20mM Tris-Cl（pH7.5）、0.7M NaClを含有する溶液に対して１日透析した。部分的に再度折り畳まれた組換えFIGFは、用量依存的な様式で、c-fos（-/-）線維芽細胞にDNA合成を誘導した（図4D）。予測されるように、c-fos（-/-）細胞はまた、PDGF-BBに対して応答性であり、一方、VEGFによる処理は、これらの細胞において［3H］-チミジン取り込みを誘導しなかった。DNA合成の最高活性は2μgの精製FIGFで得られた。観察された組換えFIGFの外見上低い比活性は、おそらく、FIGFの正確な再折り畳みの効率が低いことに起因するであろう。なぜなら、FIGFは、358アミノ酸中の29システイン残基を有するからである。さらに、マウス胚線維芽細胞（MEF）に対する組換えFIGFの細胞分裂促進活性もまたテストした。FIGFは、マウス胚線維芽細胞に、用量依存的な様式で、DNA合成を誘導した（図4E）。FIGF cDNAを、c-fos発現についてのみ異なる細胞由来のRNAの鑑別スクリーニングにより単離した。ノーザンブロットによるFIGF遺伝子発現の分析により、FIGFメッセンジャーは、c-fos（-/-）線維芽細胞ではほとんど検出され得ないが、その発現は野生型c-fos（+/+）線維芽細胞において高いことが示された（図5A、レーン１〜３とレーン７〜９を比較のこと）。FIGF発現は、FBJ-LTR構成プロモーター（Huら、（1994））の制御下で外因性c-fosを発現する、c-fos（-/-）細胞由来の安定クローンにおいて、完全に元に戻った（図5A、レーン１〜３とレーン４〜６を比較のこと）。外因性c-fosの一過性トランスフェクションは、c-fos（-/-）細胞においてFIGF誘導を生じるが、トランスフェクション細胞の数がより少ないため、観察される誘導は顕著ではない（図5A、レーン10および11）。従って、FIGF発現はc-fosに依存する。さらに、FIGFは、構成的AP-1酵母ホモログGCN4によって誘導されない。哺乳動物細胞において、GCN4は、ほとんどのAP-1標的遺伝子を活性化し得るが、それは非ガン原性である。野生型線維芽細胞において、c-Fosは、血清誘導後最初の１時間以内に、c-JunまたはJun Bと会合する、主要Fosタンパク質である。その後、c-Fosは、もはや検出され得ず、それは、AP-1複合体中でFraJ1およびFraJ2により置換される。c-fos発現細胞では、FIGFは、細胞が低血清条件に維持される場合、高度に発現され、血清誘導後６時間以内に、検出不可能なレベルに減少する（図5A）。このパターンのFIGF発現は、野生型細胞およびc-fosを構成的に発現する細胞の両方において観察された（図5A）。従って、c-fos発現の推定ピークとFIGFの出現（FIGFのメッセンジャーは静止期に蓄積する）と間の不一致が観察される。調節のFIGFパターンは、c-fos発現に加えて、その活性化のためのさらなる調節制御が必要であることを示唆する。FIGFは、PDGF/VEGFファミリーの増殖因子に属するが、その発現は、増殖停止特異（gas）遺伝子の発現とほぼ同様である。興味深いことに、それらの１つであるgas6は、増殖因子として作用する。PDGFおよびVEGFの両増殖因子は腫瘍形成に関与する（Kimら、（1993））。さらに、PDGFは、c-fosの転写活性化を誘導する主要な血清マイトジェンである。FIGFに関して、これらの増殖因子の発現パターンを比較するために、c-fos発現について異なる線維芽細胞中の、PDGFおよびVEGFのメッセンジャーレベルを測定した。図5Bに認められ得るように、PDGFおよびVEGFの両メッセンジャーの調節は、FIGFのメッセンジャー調節とは異なる。これらの増殖因子は、血清誘導後に迅速に誘導され、そしてそれらの発現はc-fos非依存的である。腫瘍の進行は、変異細胞を、元の隣接細胞への付着力を失わせ、元の組織から逃れるように導く、腫瘍の形態学的変化によって特徴づけられる。c-fosは腫瘍進行に関連づけられており、その過剰発現が、線維芽細胞および上皮細胞において形質転換細胞の形態を誘導する。FIGFはc-fos依存性増殖因子であるので、その過剰発現が、線維芽細胞の形態学的形質転換を誘導し得るかどうかを分析した。図７に認められ得るように、線維芽細胞でのFIGFの構成的発現は、形質転換表現型を誘導する。FIGFを構成的に発現するc-fos（-/-）細胞由来の安定クローンは、紡錘型の形態を獲得し、より屈折的になり、プレートから脱離する（図７、ＢとＡとを比較）。対照的に、FIGFアンチセンスメッセンジャーを発現する安定クローンは、平坦で、より屈折性でない表現型を獲得し（図7C）、これは、低血清条件で維持されたc-fos（-/-）細胞の表現型（図7G）とほとんど同様である。c-fosの過剰発現は、c-fos（-/-）細胞の形態を、FIGFの過剰発現によって観察される形態と同様に変化させるが、表現型はさほど顕著ではない（図7D）。c-fosおよびFIGFの両方の過剰発現は、線維芽細胞において極端な表現型を導く：細胞はより長くなり、組織が崩壊し、連絡を失う（図7E）。c-fosを構成的に発現する細胞におけるFIGFアンチセンスメッセンジャーの発現は、形質転換表現型の復帰を誘導する（図7F）。従って、c-fosを発現するがFIGFを枯渇させた細胞は、ほとんどの形質転換表現型を失い、このことは、c-fosを構成的に発現する細胞において観察される形態が、FIGFに起因することを示唆する。同様の形態学的変化はまた、精製組換えFIGFでの細胞の処理によって得られる。0.5％血清を含有する培地中で120時間、増殖を停止され続けたc-fos（-/-）線維芽細胞は、平坦で大きくなり、そしてより屈折性でなくなる（図7G）。組換えFIGFでの細胞処理は、屈折性で、長く伸びた、非付着性表現型を誘導する（図7H）。
c-fos欠損細胞から得た腫瘍は、それが活性化v-H-Rasを有している場合でさえも、悪性進行を経験し得ない。従って、c-fos発現は、悪性表現型を担う標的遺伝子の活性化に必須である。FIGFは、線維芽細胞において、細胞分裂エントリーを導き、そして過剰発現される場合には形質転換表現型を導き得る、c-fos依存性オートクリン増殖因子である。これらのデータは、悪性表現型の活性化におけるc-fosの役割が、FIGFの活性化に起因することを示唆する。
マウス組織由来のRNAのノーザンブロット分析における、FIGFに対して特異的なプローブを使用する、FIGFについてのさらなる実験は、FIGF遺伝子が、Fosを発現する細胞でのみ発現し、Fosガン遺伝子を欠く細胞では貧弱な発現することを示す（図５）。ノーザンアッセイで使用されるRNAブロットをClontecから得た。マウス組織におけるその発現の分析は、FIGFが、主に肺で発現され（図６）、マウス胚胎期７日目にすでに存在することを示す（図示せず）。
従って、FIGFは、ガン遺伝子Fosによってポジティブに調節される、増殖因子VEGFに関連する分子である。これは腫瘍および発生に関与し得る。
配列表
（1）一般的情報：
（i）出願人：
（A）名称：ユニベルシタ デグリ スチュディ ディ シエナ
（B）番地：ビア バンキ ディ ソットー エンネ５５
（C）市：シエナ
（E）国：イタリア共和国
（F）郵便番号：53100
（A）氏名：オリビエロ サルバトーレ
（B）番地：ビア デル ギグリオ２０
（C）市：シエナ
（E）国：イタリア共和国
（F）郵便番号：53100
（ii）発明の名称：調節遺伝子およびその使用
（iii）配列数：２０
（iv）コンピューター読み出し形態：
（A）媒体型：フロッピーディスク
（B）コンピューター：IBM PC互換用
（C）OS：PC-DOS/MS-DOS
（D）ソフトウェア：パテントイン リリース #1.0, バージョン #1.30（EPO）
（v）現在の出願データ：
（A）出願番号：WO PCT/IB96/01113
（2）配列番号１の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：1890塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（ix）配列の特徴
（A）特徴を表す記号：CDS
（B）存在位置：283..1356
（xi）配列：配列番号１：
（2）配列番号２の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：358アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号２：
（2）配列番号３の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：1864塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（ix）配列の特徴
（A）特徴を表す記号：CDS
（B）存在位置：1..1860
（xi）配列：配列番号３：
（2）配列番号４の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：620アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号４：
（2）配列番号５の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：1864塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（ix）配列の特徴
（A）特徴を表す記号：CDS
（B）存在位置：2..1861
（xi）配列：配列番号５：
（2）配列番号６の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：620アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号６：
（2）配列番号７の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：1864塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（ix）配列の特徴
（A）特徴を表す記号：CDS
（B）存在位置：3..1862
（xi）配列：配列番号７：
（2）配列番号８の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：620アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号８：
（2）配列番号９の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：48アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号９：
（2）配列番号１０の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：48アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号１０：
（2）配列番号１１の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：48アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号１１：
（2）配列番号１２の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：48アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号１２：
（2）配列番号１３の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：50アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号１３：
（2）配列番号１４の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：50アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号１４：
（2）配列番号１５の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：49アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号１５：
（2）配列番号１６の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：49アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号１６：
（2）配列番号１７の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：47アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号１７：
（2）配列番号１８の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：47アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号１８：
（2）配列番号１９の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：50アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号１９：
（2）配列番号２０の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：50アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号２０：
転写因子AP-1は、細胞増殖、分化、および神経細胞機能を含む多くの細胞プロセスに関与する（AngelおよびKarin、1991を参照）。
AP-1は、遺伝子のプロモーターおよびエンハンサー領域に見い出された、AP-1エレメントとして知られるDNA認識配列に結合することによって、その効果を発揮すると考えられている。AP-1エレメントは、TGA G/C TCAのコンセンサス配列を有する。
調節領域中にAP-1エレメントを含む多くの遺伝子が見い出されており、c-Jun（Angelら、1988）、MCP-1（Rollinsら、1988）、ストロメライシン（Kerrら、1988）、Ｉ型コラゲナーゼ（Schonthalら、1988）、およびインターロイキンII（Farrarら、1989）が挙げられる。
AP-1は、Jun（c-Jun、Jun-BおよびJun D）タンパク質とFos（c-Fos、Fos B、Fra-1およびFra-2）タンパク質との間で形成された二量体複合体から構成される。AP-1のFos成分は、増殖周期中の細胞においてAP-1活性の制限成分であることが見い出されている（KovaryおよびBravo、1991を参照）。
c-Fosは、核内ガン原遺伝子であり、これは細胞増殖（Holtら、1986；Riabowolら、1988）、分化（Distelら、1987；Lordら、1993）、および腫瘍形成（Currenら、1983；Millerら、1984；Rutherら、1989）を含む多くの重要な細胞事象に関与している。
c-Fosは、c-Junとヘテロ二量体を形成する62kDaタンパク質をコードし、AP-1エレメントにおいてDNAと結合し、そして転写を刺激するAP-1転写因子を形成する。
Fos遺伝子産物はまた遺伝子発現を抑制し得る。Sassoneら（1988）は、c-Fosがそれ自身のプロモーターを阻害することを示し、そしてGiusら（1990）およびHayら（1989）は、c-Fosが初期応答遺伝子Egr-1およびc-mycを阻害することを示した。
AP-1因子はまた、MHCクラスＩ遺伝子およびPEPCK遺伝子の発現を阻害することが示されている（Gurneyら、1992およびHowcroftら、1993を参照）。
それゆえ、Fos調節遺伝子は、細胞表現型の変化を導く遺伝子の正確な発現に大変重要であると考えられ得る。Fos遺伝子の重要性は、c-Fos欠損マウスを作製することによってはっきりと示された（Huら、1994を参照）。c-Fos欠損マウスは生存可能であったが、大理石骨病、配偶子形成延滞、およびリンパ球減少（lymphophenia）および行動異常を含む幅広い組織特異的発育不全が現れた。
c-Fos欠損マウスは、線維芽細胞株を作製するために使用され、そして２つの遺伝子の発現が異常に低いことが見い出された。その２つの遺伝子は、ストロメライシンおよびＩ型コラゲナーゼであった。両遺伝子は、それらの調節配列中にAP-1部位を有するとして以前に同定された（Kerrら、1988およびSchonthalら、1988を参照）。
ストロメライシンおよびＩ型コラゲナーゼは、胚の組織発育（Brennerら、1989）、損傷組織の再構築（Hastyら、1990；WoessnerおよびGunja、1991）、ならびに腫瘍の進行および転移（LiottaおよびStetler、1990）に関連づけられている。
Superti-Furgaら（1991）は、c-Fos活性が、マウスc-Fosタンパク質とヒトエストロゲンレセプターのリガンド結合ドメインとが融合することによって、ホルモン性に制御され得ることを示した。この融合タンパク質は、厳格なホルモン依存性様式でAP-1依存性転写を刺激することが見い出された。この融合タンパク質を使用して、AP-1調節遺伝子であるFit-1が発見された。Fit-1は、スプライシングパターンに依存して、分泌タンパク質または膜結合タンパク質をコードすることが見い出された。
本発明は、２つの新規のFos調節遺伝子をコードするヌクレオチド配列に関する。
本発明は、Fos調節遺伝子によってコードされるタンパク質またはそのフラグメントをコードするヌクレオチド分子を提供する。ここで、前記タンパク質またはそのフラグメントは、図１または２に示されるヌクレオチド配列またはそれらのフラグメント（このヌクレオチド配列の対立遺伝子改変体および種改変株を含む）によってコードされる。
本明細書中で使用される用語「ヌクレオチド分子」とは、任意の長さのヌクレオチド、リボヌクレオチド、あるいはデオキシリボヌクレオチドのいずれもをいう。その用語は二本鎖および一本鎖分子の両方を含む。この用語はまた、公知のタイプの修飾、例えば当該分野で公知の標識、メチル化、「キャップ」、１つまたはそれ以上の天然に存在するヌクレオチドとアナログとの置換、ヌクレオチド間修飾（例えば、非荷電結合を有するもの（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメートなど）および荷電結合を有するもの（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど））、タンパク質（ヌクレアーゼ、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ-Ｌ-リジンなどを含む）のようなペンダント部分を含むもの、インターカレーター（例えば、アクリジン、プソラレンなど）を含むもの、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化性金属など）を含むもの、アルキル化剤を含むものおよび改変された結合を含むもの（例えば、αアノマー核酸など）を包含する。
本発明のヌクレオチド分子は、Fos調節遺伝子のタンパク質またはそのフラグメントをコードし得る。
タンパク質に関して使用される用語「フラグメント」とは、本発明のタンパク質に独特である十分な長さ（例えば、10、15、20または25の連続アミノ酸長）のフラグメントをいう。好ましくは、そのタンパク質フラグメントは、完全なタンパク質の活性の少なくとも一部を誘発し得る。特に好ましいフラグメントは、他の多くの遺伝子と相同であることが見い出されている、遺伝子の保存領域を含む。このような保存領域は特異的な機能を有すると考えられる。
ほとんどの天然に存在するヌクレオチド配列と同様に、図１および２に示されるヌクレオチド配列は、他の多くの形態（例えば、対立遺伝子改変体および種改変体）を有する。本発明のヌクレオチド配列のこのような改変体および他の任意の天然に存在する形態もまた、本発明の一部を形成すると考えられる。そのような改変体は、図１または図２に示される配列あるいはそのフラグメントと少なくとも60％、好ましくは80％、そして最も好ましくは90％の配列相同性を有するべきである。
本発明はまた、本発明のヌクレオチド分子であって、図１または２に示される配列またはそのフラグメントによってコードされるタンパク質またはそのフラグメントが変化している、ヌクレオチド分子に関する。
好ましい変化したタンパク質またはそのフラグメントは、依然としてその活性を保持し、そして図１または図２に示される配列あるいはそのフラグメントによってコードされるタンパク質またはそのフラグメントと、好ましくは少なくとも80％、より好ましくは90％、そして最も好ましくは95％の相同性を有する、タンパク質またはそのフラグメントである。好ましくは、そのような変化したタンパク質またはそのフラグメントは、１〜10アミノ酸だけ異なる。さらに好ましくは、アミノ酸交換は保存的である。
保存交換とは、あるアミノ酸と、それらの側鎖が関連するアミノ酸ファミリーからのアミノ酸とが置き換わることである。例えば、ロイシンとイソロイシンまたはバリンとの、アスパラギン酸とグルタミン酸との、スレオニンとセリンとの隔離された置換、または構造的に関連するアミノ酸間の同様な保存的置換が、タンパク質の生物学的活性に大きな影響を与えないことは容易に予期され得る。
しかしながら、タンパク質の生物学的活性を変化させるために、アミノ酸を変化させることが時には望まれる。例えば、タンパク質の１つまたはそれ以上の機能を破壊または増強した変異体は、特に有用であり得る。そのような変異体は、一般的にタンパク質の任意の保存配列を変化させることによって作製され得る。タンパク質中の他のアミノ酸とジスルフィド結合を形成し得るアミノ酸の数を増加させた変異体は、タンパク質の安定性を増加させるためには、特に好ましい。タンパク質中の他のアミノ酸とジスルフィド結合を形成し得るアミノ酸の数を減少させた変異体もまた、タンパク質の安定性を減少させることが所望であれば、作製され得る。このような変化したタンパク質またはそのフラグメントは、図１または図２に示される配列あるいはそのフラグメントによってコードされるタンパク質またはそのフラグメントと、好ましくは少なくとも80％、さらに好ましくは90％、そして最も好ましくは95％の相同性を有する。好ましくは、このような変化したタンパク質またはそのフラグメントは、１〜10アミノ酸だけ異なる。
本発明のヌクレオチド分子は、当該分野で周知の方法によって得られ得る。例えば、配列は、ゲノムクローニングあるいはcDNAクローニングによって、適切な細胞株あるいは生物（例えばマウス）の組織に直接由来するDNAまたはcDNAから得られ得る。適切な細胞株は、Huら（1994）に記載されている3T3細胞株のような任意の線維芽細胞株を包含する。ポジティブクローンは、望ましいヌクレオチド分子に適切なプローブを用いてスクリーニングされ得る。PCRクローニングもまた使用され得る。本発明のヌクレオチド分子によってコードされるタンパク質またはそのフラグメントをコードする配列が本明細書中で与えられれば、プローブおよびプライマーは容易に作製され得る。
分子生物学の分野で公知の多くの標準的な技術が、望ましいヌクレオチド分子、またはポジティブクローンを同定するためのプローブおよびプライマーを調製するために使用され得る。ヌクレオチド分子、プローブまたはプライマーは、ホスホルアミダイト法のような標準的なオリゴヌクレオチド合成法を使用して完全に合成され得る。
多くの技術が、合成またはクローニング手順によって得られるDNA配列を変化させるために使用され得、そしてそのような技術は当業者に周知である。例えば、部位特異的変異誘発、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発およびPCR技術が、DNA配列を変化させるために使用され得る。そのような技術は当業者に周知であり、そして当業者に公知の膨大な量の文献（例えば、Sambrookら（1989））に記載されている。
本発明はさらに、本発明のヌクレオチド分子によってコードされるタンパク質を提供する。
好ましくは、本発明のヌクレオチド分子によってコードされるタンパク質は、図１または図２に示されるアミノ酸配列あるいはそのフラグメントを有する。
本明細書中で使用される用語「タンパク質」とは、アミノ酸のポリマーをいい、特定の長さの生成物をいうのではない；したがって、ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質は、用語タンパク質に包含される。その用語はまた、タンパク質の発現後に修飾（例えば、グリコシル化、アセチル化、およびリン酸化）されたものをいうのではなく、これらを含まない。アミノ酸の１つまたはそれ以上のアナログ（例えば、非天然アミノ酸を含む）を含有するタンパク質、置換された結合を有するタンパク質、および当該分野で公知の他の修飾体（天然に生じる修飾体および合成された修飾体の両方）がその定義に含まれる。
本発明のタンパク質は、線維芽細胞のような天然にこのタンパク質を産生する細胞から、標準的な精製技術を用いて得られ得る。しかしながら、本発明のヌクレオチド分子の発現に適切な宿主細胞およびベクターシステムを、使用することが好ましい。本発明のヌクレオチド分子は、様々な異なる発現システム（例えば、哺乳動物細胞、バキュロウイルス、細菌および酵母のような真核微生物を用いたシステム）において発現され得る。
上記の発現システムはすべて当該分野で公知であり、そしてヌクレオチド配列を発現させることは、今では、当業者全てに公知の標準的な技術である。
好ましくは、真核生物（例えば哺乳動物）の宿主細胞発現システムが使用される。特に、適切な哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、HeLa細胞、ベビーハムスター腎（BKH）細胞、HepG2細胞のような肝臓起源の細胞、およびメラローマまたはハイブリドーマ細胞株を含む。
本発明はさらに、プロモーターおよび本発明のヌクレオチド分子を含む、本発明のヌクレオチド分子の発現のためのベクターを提供する。
哺乳動物プロモーターは、哺乳動物RNAポリメラーゼに結合してmRNAへのコード配列の転写を開始し得る任意のDNA配列であり得る。特に有用なプロモーターは、SV40初期プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーターおよび単純ヘルペスウイルスプロモーターのような哺乳動物ウイルス遺伝子由来のプロモーターである。それに加えて、マウスメタロチオネイン遺伝子由来のような非ウイルス遺伝子由来の配列もまた、プロモーターとして使用され得る。
本発明のヌクレオチド分子は、哺乳動物細胞において細胞内に発現し得る。プロモーター配列は、本発明のヌクレオチド分子と直接結合され得る。この場合、コードされるタンパク質のＮ末端の最初のアミノ酸は、開始ATGコドンによりコードされるメチオニンである。
あるいは、本発明のヌクレオチド分子によってコードされるタンパク質は、リーダー配列をコードするヌクレオチド配列を本発明のヌクレオチド分子と結合することによって、細胞から分泌され得る。コードされた融合タンパク質は、リーダー配列フラグメントおよび本発明のヌクレオチド分子にコードされるタンパク質を含む。リーダー配列は、融合タンパク質の細胞外への分泌を導く。好ましくは、リーダー配列と本発明のヌクレオチド分子にコードされるタンパク質との間にプロセシング部位が存在し、リーダー配列を酵素的あるいは化学的に切断することが可能である。そのようなリーダー配列の例は、アデノウイルス３分節リーダーである。
本発明のベクターは、好ましくは、DNAを含む核酸ベクターである。そのベクターは、当業者に公知の広範囲の文献に発表されているように、直線状または環状の形状であり得、宿主細胞におけるエピソームとしての存在あるいは組み込まれた存在に適合され得る。ベクターは、ウイルス性または非ウイルス性送達システムを用いて細胞へ送達され得る。送達システムの選択は、DNA分子が細胞ゲノム中に取り込まれるかまたはエピソームのままであるかを決定する。
本発明のベクターは、ポリアデニル化シグナル、転写終結シグナル、エンハンサー、遺伝子座制御領域（LCR）などのようなさらなる制御エレメントを含み得る。
本発明はさらに、本発明のベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
形質転換とは、外因性ポリヌクレオチドを宿主細胞中へ挿入することをいい、挿入に使用する方法（例えば、直接取り込み、形質導入、ｆ接合またはエレクトロポレーション）を問わない。外因性ポリヌクレオチドは、非組み込みベクター（エピソーム）として維持され得るか、あるいは宿主ゲノム中へ組み込まれ得る。
好ましくは、宿主細胞は真核細胞であり、さらに好ましくは、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、HeLa細胞、ベビーハムスター腎（BKH）細胞、HepG2細胞のような肝臓起源の細胞、およびメラローマまたはハイブリドーマ細胞株のような哺乳動物細胞である。
さらに本発明は、本発明のヌクレオチド分子によってコードされるタンパク質を産生するための方法を提供する。この方法は、本発明のベクターで宿主細胞をトランスフェクトする工程、そのトランスフェクトした宿主細胞を、DNA分子の発現および所望のタンパク質の産生を導くために適切な条件下で培養する工程を包含する。次いで、タンパク質は、そのタンパク質が分泌されるかどうかに応じて、標準的な技術を用いて、トランスフェクトした細胞または細胞増殖培地から収集され得る。
さらに本発明は、治療に使用するために本発明のヌクレオチド分子を提供する。
さらに本発明は、発育障害の処置のための組成物の製造における、本発明のヌクレオチド分子の使用を提供する。
さらに本発明は、発育障害の処置における、本発明のヌクレオチド分子の使用を提供する。
Fos調節遺伝子は、発生および細胞分化に関与することが知られている。従って、Fosにより調節される遺伝子の発見は、発生および細胞分化の制御において意味を持つ。
図１および図２に示されるヌクレオチド配列は、血小板増殖因子（PDGF）ファミリー固有の特徴によって特徴づけられる増殖因子ファミリーの遺伝子に類似する配列を有することが見い出された。最も明らかに関連する配列は、血管内皮増殖因子（VEGF）の配列である。VEGFは、血管形成および内皮細胞増殖において活性な増殖因子であるホモ二量体を形成する（Keckら、1989、およびLeungら、1989を参照）。VEGFはまた、血管形成を刺激し、それにより治療効果を生じさせるために使用されてきた（Takeshitaら、1994を参照）。
図１の配列によってコードされるタンパク質は、マウスのタンパク質であり、そして図２の配列によってコードされるタンパク質は、図１に与えられた配列によってコードされるマウスタンパク質のヒトホモログである。本明細書中で両タンパク質は、c-Fos誘導増殖因子（FIGF）と呼ばれている。
それゆえ、治療における本発明のヌクレオチド分子の使用は、本発明のFos調節遺伝子配列の重要な適用であると考えられ得る。
図１および図２に示されるヌクレオチド配列は、このヌクレオチド配列が主に肺で発現されることが見い出されているので、肺疾患に特に重要である。図１または図２に示される配列によってコードされるタンパク質またはそのフラグメントをコードするヌクレオチド分子を使用して処置され得る特定の肺疾患は、肺炎および塵肺症を含む。ヌクレオチド分子はまた、肺の再生を助けるために肺摘除術後に使用され得る。
図２のヌクレオチド配列は、病変である脊椎骨端形成異常（SEDL）に関する遺伝子座の近くの、ヒト染色体Xp22にマッピングされた。この領域の遺伝子地図は、Ferreroら（1995）によって記載され、そしてSEDL疾患のマッピングは、Heuertzら（1993）によって記載されている。従って、SEDLは、図１または図２に与えられた配列によってコードされるタンパク質をコードするヌクレオチド分子、またはそのフラグメントを使用して処置され得る。
以前に考察されたように、Fos調節遺伝子は、腫瘍進行および転移に関与することが、見出されている。Fos調節遺伝子を阻害することによって、腫瘍増殖を阻害または抑制することが可能である。
以前に、Kimら（1983）は、VEGFに特異的なモノクローナル抗体を注入することによって、腫瘍増殖を抑制した。以前に記載されたように、VEGFは、図１および図２に示されるヌクレオチド配列と同様なヌクレオチド配列を有する。従って、本発明のネイティブなヌクレオチド分子のインビボ発現、翻訳などのいずれかを阻害することによって、腫瘍増殖が阻害または抑制され得る。
本発明のヌクレオチド分子に対応するFos調節遺伝子の作用は、多数の技術によって阻害され得る。好ましい技術は、アンチセンスに基づく技術、リボザイムに基づく技術、および抗体に基づく技術を包含する。
本発明のヌクレオチド分子によりコードされるタンパク質に特異性を有する抗体分子は、タンパク質の機能をブロックし、それにより腫瘍増殖を阻害または抑制するために、使用され得る。
さらに、本発明は、本発明のタンパク質に対して特異性を有する抗体分子を提供する。抗体分子は、完全なポリクローナルまたはモノクローナル抗体、またはFv、Fab、F（ab'）2フラグメント、およびそれらの一本鎖Fvフラグメントのような、抗原結合フラグメントであり得る。抗体分子は、好ましくは、ヒト定常領域およびマウス可変領域を有するキメラ抗体分子、ヒト化CDRグラフト抗体分子、またはそのフラグメントのような、組換え抗体分子であり得る。このような抗体を作製するための方法は、当業者に周知であり、そしてEP-A-0120694およびEP-A-0125023に記載されている。
本発明はさらに、治療に使用するための本発明の抗体分子を提供する。
本発明はまた、ガンのような増殖性疾患を処置するための組成物の製造における、本発明の抗体分子の使用を提供する。
本発明はさらに、ガンのような増殖性疾患を処置するための本発明の抗体分子の使用を提供する。
本発明はさらに、本発明のヌクレオチド分子またはそのフラグメントに相補的な配列を有する、アンチセンスヌクレオチド分子またはそのフラグメントを提供する。
本発明のアンチセンスヌクレオチド分子は、本発明のヌクレオチド分子について用いる方法と同じ標準的な方法を用いて生成され得る。
本発明はさらに、プロモーターおよびアンチセンスヌクレオチド分子を含有する、本発明のアンチセンスヌクレオチド分子を発現させるための、アンチセンスベクターを提供する。
アンチセンスベクターは、ベクターが本発明のアンチセンスヌクレオチド分子を含有すること以外は、本発明の核酸ベクターと同じである。
本発明はさらに、治療における使用のための、本発明のアンチセンスベクターを提供する。
本発明はさらに、ガンのような細胞増殖性疾患を処置するための組成物の製造における、本発明のアンチセンスベクターの使用を提供する。
本発明はさらに、ガンのような細胞増殖性疾患の処置における、本発明のアンチセンスベクターの使用を提供する。
本発明はさらに、プロモーターおよび本発明のヌクレオチド分子のRNA転写産物を切断し得るリボザイムをコードするヌクレオチド配列を含有する、リボザイムを発現するためのベクターを提供する。
リボザイムをコードするベクターは、このベクターがリボザイムをコードする以外は、以前に記載したベクターと同じである。リボザイムは、本発明のヌクレオチド分子のRNA転写産物を切断し得る。このようなリボザイムを産生する技術は、当業者に公知であり、Cantorら（1993）に記載されている。
本発明はさらに、治療における使用のための、本発明のリボザイムコードベクターを提供する。
本発明はさらに、ガンのような細胞増殖性疾患を処置するための組成物の製造における、本発明のリボザイムコードベクターの使用を提供する。
本発明はさらに、ガンのような細胞増殖性疾患の処置における、本発明のリボザイムコードベクターの使用を提供する。
本発明のさらなる目的は、本発明のタンパク質のレセプターまたは本発明のタンパク質を含有するタンパク質複合体のレセプターを同定することにおける、本発明のタンパク質の使用である。
レセプターを同定する方法は当業者に周知であり、そして広く文献に記載されている。しかし、基本的に、レセプターを同定する３つの主な方法がある：
i．類似の分子に結合する全ての既知のレセプターをテストする。これは、VEGFが類似の配列を有することが見出されているので、図１および図２に示されるDNA配列によってコードされるタンパク質について、特に有用である。
ii．結合精製工程を行う。例えば、本発明のタンパク質または本発明のタンパク質を含有するタンパク質複合体を、固体支持体上に固定し得、次いで、多くの可能性のあるレセプター分子（特に、膜タンパク質）をその固体支持体上を通過させる。結合精製手順は、Schustedら（1995）に記載されている。
iii．レセプターを欠損する細胞を見出すために発現ライブラリーをスクリーニングし、次いでSeedおよびAruffo（1987）によって記載されたレセプタークローニング法を利用することによる。
他の方法もまた、当業者に公知であり、レセプターを見出すために使用され得る。
レセプターの同定により、レセプターの活性をブロックまたは増強する薬剤を設計すること、およびレセプターをブロックする抗体分子を作製することが可能である。一旦、レセプターのDNA配列が公知になると、レセプターにおける誤りを修正するか、またはレセプターの発現をブロックするための多数の遺伝子治療が、設計され得る。
本発明はさらに、ガンおよび発育障害のそれぞれを処置することにおける薬物として使用され得る、本発明のタンパク質のアンタゴニストまたはアゴニストを同定するためのアッセイにおける、本発明のタンパク質の使用を提供する。このような潜在的な薬物の同定するためのアッセイは頻繁に使用され、当業者に周知である。このようなアッセイの例は、Tsunodaら（1994）に明確に記載されている。
本発明はさらに、本発明のヌクレオチド分子、アンチセンスヌクレオチド分子、タンパク質もしくは抗体分子、またはそれらの任意の組合せの、病理学的状態または疾患に対する疾病素質を診断するにおける使用を提供する。
本発明のヌクレオチド分子またはアンチセンスヌクレオチド分子は、このヌクレオチド分子に対応する遺伝子の存在を決定することに、またはその遺伝子から転写されたRNAの量を測定することに、使用され得る。
本発明のタンパク質は、本発明のヌクレオチド分子に対応する遺伝子によりコードされるタンパク質の量を測定するためのアッセイにおいて使用され得る。
本発明の抗体分子は、本発明のヌクレオチド分子に対応する遺伝子によりコードされるタンパク質の量を測定するためのアッセイにおいて使用され得る。本発明の抗体分子を使用する、タンパク質の量を測定するためのアッセイの例は、競合結合アッセイである。
本発明のヌクレオチド分子に対応する遺伝子、または転写RNAまたは遺伝子にコードされるタンパク質の存在を決定することによって、その遺伝子の存在またはこの遺伝子の過剰発現によって引き起こされる病理学的状態または疾患に対する疾病素質を診断することが可能である。
本発明はさらに、トランスジェニック動物の作製における、本発明のヌクレオチド分子の使用を提供する。特に、本発明は、非ヒトトランスジェニック動物、特にトランスジェニックマウスを作製するための、このようなヌクレオチド分子の使用を提供する。
研究のためのモデルとして適切であるトランスジェニック動物が作製され得る。例えば、本発明のヌクレオチド分子を過剰発現するトランスジェニック動物は、過剰発現がどのような影響を有するかを決定するために使用され得る。あるいは、本発明のネイティブなヌクレオチド分子が「ノックアウト」されたトランスジェニック動物が作製され得る。次いで、本発明のヌクレオチド分子を「ノックアウト」する効果が研究され得る。
このようなトランスジェニック動物を作製するための方法は、当業者に周知であり、過剰発現または「ノックアウト」されるべきヌクレオチド分子が、本明細書に開示されているので、容易に実施され得る。
本発明のトランスジェニック動物はまた、続いて、改変したFos制御の効果を測定するために、Fos過剰発現マウスまたはFos「ノックアウト」マウスのいずれかと交配し得る。
本発明はまた、図１または図２のいずれかに示される配列の全てまたは一部を含有するヌクレオチド分子を提供する。
図１または図２のいずれかに示される配列の全てまたは一部を含有するヌクレオチド分子は、タンパク質をコードしてもよいし、またはコードしなくてもよい。好ましくは、ヌクレオチド分子は、図１または図２のいずれかに示されるヌクレオチド配列に対応するFos遺伝子の制御配列をさらにコードする。さらに好ましくは、ヌクレオチド分子は、遺伝子にFos調節を付与する配列をコードする。特に好ましくは、ヌクレオチド分子は配列TGACTCAを含有する。
本発明は、以下の図面を参照して、添付の実施例において例示される。
図１
Fos調節遺伝子F0401のDNA配列。コードされるタンパク質配列およびVEGFに相同な領域（下線）も示す。
図２
Fos調節遺伝子HF175のDNA配列（F0401のヒトホモログ）。コードされるタンパク質も示す。
図３
増殖因子のPDGF/VEGFファミリーの保存ドメインと、FIGFによってコードされるタンパク質とのアラインメント。点は、これらの増殖因子の特徴であるシステイン残基を示す。
図４
（Ａ）FIGFタンパク質の免疫沈降アッセイ。ベクターのみでトランスフェクトしたCOS-7細胞（−）、または、CMVプロモーターの制御下にFIGFコード配列を含有するベクターでトランスフェクトしたCOS-7細胞（＋）を、それぞれ、100μCi/mlの濃度の［35S］メチオニンおよび［35S］システインで、１時間、代謝的に標識した。１時間または22時間のチェイス後、馴化培地および細胞溶解物を、抗FIGFポリクローナル抗体で、別々に免疫沈降させた。（FIGFタンパク質は、T5プロモーターの制御下で、E. coliにおいて発現させた。FIGFのコード領域から、cDNAフラグメントを、+40位のメチオニン残基からのPCRによって作製し、pQE-31ベクター（Qiagen）中にクローニングしてＮ末端ヒスチジンタグとの融合タンパク質を得た。このタンパク質を２mMイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドの存在下で、37℃にて４時間、誘導することによって、TG1細菌（pREP+）において発現させた。組換えタンパク質は、専ら封入体中に局在し、そして製造者のプロトコル（Qiagen）に従って、変性条件下、Ni−NTA−樹脂カラムで精製した。完全フロイントアジュバント中の変性タンパク質の形態で200μgの組換えFIGFをウサギに注射して、抗体を惹起させた。不完全フロイントアジュバントでの３週間間隔で４回の注射後、血清を調製した。免疫複合体を、プロテイン−Ａセファロースビーズ（Pharmacia）によって回収し、そして3％ β−メルカプトエタノールの存在下での12％ SDS-PAGEで分離した。矢印は、FIGFトランスフェクト細胞にのみ存在する特異的なバンドを示す。
（Ｂ）［3H］-チミジン取り込みとして測定された、c-fos（-/-）線維芽細胞中の細胞分裂促進活性。細胞を、FIGF発現ベクターまたはベクター単独でトランスフェクトしたCOS-7細胞の馴化培地とともに、インキュベートした。トランスフェクションの１日後に、それらの細胞を分割して、２％血清中に維持した。120時間後、馴化培地を回収した。
（Ｃ）［3H］-チミジン取り込みとして測定された、c-fos（-/-）線維芽細胞中の細胞分裂促進活性。CMVプロモーターの制御下で構成的に外因性FIGFを発現する、c-fos（-/-）安定クローン（FH-10.2、FH-10.5、FH-9.3、FH-9.6、FH-10.9と命名）およびc-fos（-/-）細胞（模擬）から得た馴化培地とともに、細胞をインキュベートした。馴化培地を、0.5％血清中で48時間培養された細胞から回収した。
（Ｄ）［3H］-チミジン取り込みとして測定された、c-fos（-/-）線維芽細胞中の細胞分裂促進活性。細胞を、部分再生された組換えFIGFとともにインキュベートした。同一条件下で、PDGF-BB（Sigma）とのインキュベーション（ポジティブコントロールとして使用）は、約30％高いチミジン取り込みを誘導するが、一方、VEGF（Sigma）は、バックグラウンドを超える取り込みを誘導しない。示されるデータは、２つの異なるFIGF調製物で実施された６回の実験の平均である。
（Ｅ）［3H］-チミジン取り込みとして測定された、マウス胚線維芽細胞における細胞分裂促進活性。細胞を、部分再生された組換えFIGFとインキュベートした。MEF細胞を、B6D2F1マウスの13〜15日齢の胚から得た。胚を屠殺して、リンスし、そして37℃で30分間トリプシン処理した。MEF細胞を、増殖因子を添加する前に、0.5％血清を含有する培地中で24時間増殖させた。同一条件下で、PDGF-BB（Sigma）とのインキュベーション（ポジティブコントロールとして使用）は、約30％高いチミジン取り込みを誘導するが、一方、VEGF（Sigma）は、バックグラウンドを超える取り込みを誘導しない。示したデータは、２つの異なるFIGF調製物で実施された６回の実験の平均である。バックグラウンド値を、各実験において差し引いた。
図５
（Ａ）培養細胞におけるFIGF発現。以下の細胞から得たトータルRNAのノーザンブロット解析：c-fos（-/-）線維芽細胞（レーン１〜３）；外因性c-fosを発現する、c-fos（-/-）細胞から得た安定細胞株（レーン４〜６）、c-fos（+/+）線維芽細胞（レーン７〜９）。0.5％血清中で48時間、細胞のインキュベーションした後、グアニジンチオシアネート法によって、細胞性RNAを抽出した（時間０）。血清濃度を10％まで増加させ、そして示すように、２時間または４時間でトータルRNAを回収した。レーン10および11は、ベクター単独（模擬）、または、FBJ-LTR構成プロモーター下にc-fosを含有するベクター（c-fos）で、一過性にトランスフェクトしたc-fos（-/-）線維芽細胞におけるFIGF発現を示す。一過性にトランスフェクトした細胞のRNAを、0.5％血清を含有する培地中でこの細胞を培養して30時間後に、回収した。各レーンに、10μgのトータル細胞性RNAをロードした。
（Ｂ）PDGFまたはVEGFの発現。c-fos（-/-）細胞由来のトータル細胞性RNA（レーン１〜３）、または外因性c-fosを発現する、c-fos（-/-）細胞から得た安定細胞株由来のトータル細胞性RNA（レーン４〜６）を、パネルＡに示すように抽出した。グリセルアルデヒド−ホスフェート−デヒドロゲナーセ（GAPDH）を、RNAのロードについてのコントロールとして使用した。
図６
異なるマウス組織から抽出したRNAポリＡ＋のノーザンブロット解析。
図７
（Ａ）c-fos欠損細胞の形態。細胞を、ベクター単独で安定にトランスフェクトした。
（Ｂ）CMVプロモーターの制御下にFIGFを含有する発現ベクターで安定にトランスフェクトした、c-fos欠損細胞由来の細胞クローンの形態。
（Ｃ）CMVプロモーターの制御下にアンチセンス方向でFIGF cDNAを含有する発現ベクターで安定にトランスフェクトした細胞の形態。
（Ｄ）FBJ-LTRプロモーターの制御下にc-fosを含有する発現ベクターで安定にトランスフェクトした細胞の形態。
（Ｅ）CMVプロモーターの制御下にFIGFを含有する発現ベクターでトランスフェクトした、Ｄにおける細胞（構成的にc-fosを発現する）と同じ細胞に由来する細胞クローン。
（Ｆ）CMVプロモーターの制御下にアンチセンス方向でFIGF cDNAを含有する発現ベクターでトランスフェクトした、Ｄにおける細胞（構成的にc-foscを発現する）と同じ細胞に由来する細胞クローン。
（Ｇ）0.5％血清を含有する培地中で120時間培養された、c-fos（-/-）線維芽細胞。
（Ｈ）部分再生された組換えFIGFで120時間処理した以外は、Ｇと同じ細胞。3つの独立したトランスフェクションから得た、10の独立したクローンを分析した。全て、図において観察される変化と同じ形態学的変化を示した。
実施例
細胞培養およびクローン単離
c-Fos発現（+/+）に関するマウス野生型線維芽細胞、およびc-Fos欠損（-/-）3T3細胞株、ならびに外因性c-Fosを構成的に発現する安定にトランスフェクトした細胞株を、記載（Huら、1994）のように作製した。全ての細胞株を、10％胎児ウシ血清（FCS）、グルタミン、およびペニシリン−ストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）において、５％ CO2で、37℃にて増殖させた。細胞を、約70％集密に達するまで培養し、0.5％ FCS含有DMEM中で48時間血清欠乏させ、そしてRNA単離前の０、２、および４時間、10％ FCS含有DMEMで刺激した。トータルRNAを、グアニジン−イソチオシアネート法を用いて単離した。mRNAディッファレンシアルディスプレイを、Laingらにより記述され、そしてBauerらにより改変された（Bauerら、1993）ように実施した。要するに、抽出したRNAから、染色体DNA夾雑物を、DNaseI処理により単離した50μgのトータルRNAから除去した。血清誘導２時間後または４時間後に抽出した0.2μgのRNAを、dT12mNプライマーおよび300U MMLV逆転写酵素（Promega Corp., Madison, WI）を使用する、40μlの反応容量で、37℃にて60分間のインキュベーション時間での逆転写のために使用した。cDNA増幅用のPCR混合物は、dT12mNプライマー、任意配列を有する、20の10merデオキシオリゴヌクレオチドプライマーのうち１つ（Kit A - Operon Biotechnology Inc., Alameda, CA）、33P-dATP（Amersham International plc,Buckinghamshire, England）、および１U Taqポリメラーゼ（Promega Corp.）を含有した。試料を、PTC-100サーモサイクラー（MJ Research Inc., Watertown, MA）を使用して、40サイクルの増幅に供した。サイクルパラメーターは以下のとおりであった：94℃で30秒間、42℃で90秒間、72℃で30秒間、そして72℃で10分間のさらなる伸長時間。2μlのPCR混合物を、グリセロールで５％に調整し、尿素を含まない６％ポリアクリルアミドゲルに負荷した（Bauerら、1993）。別々に発現したcDNAのバンドを、ゲルから回収し、再度増幅した。再増幅cDNAプローブを、1.5％アガロースゲル上で泳動し、精製し、そしてTAクローニングシステム（Promega Corp.）を使用して、pGEM-Tベクター中へクローニングした。ポジティブクローンを、ブルー−ホワイト表現型を使用して選択した。
新規クローンの特徴づけおよび配列分析
典型的には、１つのバンドから１〜３の異なるクローンを得、それらを引き続いて、ノーザンブロット分析による特徴づけに利用した。cDNAフラグメントを、ランダムプライマー標識キット（Amersham International plc）を使用して、32P-dCTPで標識した。ハイブリダイゼーションシグナルをスクリーニングし、Image Quantソフトウエアーを用いるPhosphorImager（Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA）によって定量した。T7またはSP6プライマーのいずれかでのクローニングされたcDNAプローブのプラスミドDNA配列分析を、Sequenase V 2.0キット（US Biochemical Inc., Cleveland, Ohio）を使用して、手動で実施した。要するに、細胞から抽出したRNAを、ランダムプライマーを利用する増幅に供し、そして細胞タイプのバンドを比較により同定して、単離した。得られたフラグメントを、その細胞株由来のRNAを用いるノーザンブロットにおいてテストして、対応するmRNAが、Fos発現細胞でアップレギュレートされることを確認した。次に、マウス線維芽細胞株から、λZAPベクター中に独自のcDNAライブラリーを作製し、cDNA合成およびクローニングキット（Stratagene）を利用して、完全長クローンを得た。スクリーニングは、製造業者の指示に従って実施した。ポジティブクローンを、まず制限地図によって分析し、最も長いものをDNA配列分析に供した。
クローン分析
F0401配列を図１に示し、HF175配列を図２に示す：NIHおよびEMBLデータバンクに対する簡単な検索分析により、F0401およびヒトホモログFIGFが新規遺伝子であり、それらの配列は、血小板増殖因子（PDGF）ファミリー固有の特徴により特徴づけられる、増殖因子ファミリーの遺伝子と同様であることが明かとなった。このファミリーの共通パターンは、C-V-x（3）-R-C-x-G-C-C-Nである。このファミリーのメンバーは、ジスルフィド連結による二量体を形成し、そして強力なマイトジェンである。F0401およびHF175に最も類似する配列は、ホモ二量体を形成し、血管形成および内皮細胞増殖において活性な増殖因子である（Keckら、1989；Leungら、1989）血管内皮増殖因子（VEGF）である。VEGFは増殖因子であるので、その過剰発現は、腫瘍血管形成を生じ得る（Plateら、1993）。最近の報文には、腫瘍におけるVEGF阻害（Kimら、1993）、および血管形成を刺激するためのVEGF処置（Takeshitaら、1994）に基づく、可能な治療的使用が示されている。
以下の実験は、F0401を使用して実施された。
FIGF推定タンパク質配列は、シグナルペプチドをコードし得る、Ｎ末端に疎水性配列を有する。この長いＮ末端領域は、既知タンパク質に対して有意な相同性を示さない。しかし、この領域には、細胞膜または細胞外マトリックスへのタンパク質の結合を可能にし得る、正に荷電したドメインが存在する。
FIGFが分泌タンパク質であるどうかを証明するために、COS-7細胞を、サイトメガロウイルス（CMV）即時型遺伝子プロモーターの制御下に、FIGF cDANを有する発現ベクターでトランスフェクトした。組換えFIGFに対して惹起させた（以前に記載されたように）ポリクローナル抗体は、FIGFトランスフェクトCOS-7細胞の細胞溶解物および馴化培地の両方において観察される特異バンドを免疫沈降させた（図4A）。１時間の標識に続いて１時間のチェイス後、特異バンドは、主に細胞溶解物に存在したが、４時間より長いチェイス後には、タンパク質は細胞上清に蓄積した。非変性条件下では、FIGFは多量体形態に凝集した。β-メルカプトエタノールの添加は、66kDaバンドとして主に移動したタンパク質の部分変性を生じ、タンパク質のわずかな画分のみが、推定分子量33kDaの単量体として見出され得る（図4A）。これらの結果は、FIGFが分泌タンパク質であり、二量体を形成し得ることを示す。FIGFの中心ドメインが高度に保存され、PDGFおよびVEGFの両方の二量体化に関与するシステイン残基を含有するので、FIGFの二量体化は予測され得る。FIGF産生細胞の馴化培地が、インビトロで細胞増殖を促進し得るかどうかをさらに研究し、［3H］-チミジン取り込み（Vaziriら、（1995））としてアッセイした。馴化培地を、一過性トランスフェクトCOS-7細胞、またはCMVプロモーターの制御下でFIGFを発現する、c-fos（-/-）線維芽細胞由来の安定なクローンのいずれかから得た。FIGFを含有する培地の細胞分裂促進活性を、c-fos（-/-）線維芽細胞についてテストした。トランスフェクトCOS-7細胞（図4B）またはFIGFを過剰発現する安定な線維芽細胞クローン（図4C）の両方からの馴化培地は、c-fos（-/-）線維芽細胞でのDNA合成を誘導する。哺乳動物細胞において、FIGF発現が、他の増殖因子の活性化を誘導し得、これが、次に、測定した［3H］-チミジン取り込みを担うので、E. coliにおいて発現された組換えFIGFタンパク質の細胞分裂促進活性をテストした（以前に記載されたように）。生物学的に活性な組換えタンパク質を得るために、E. coli由来の精製FIGFタンパク質を、還元グルタチオンおよび酸化グルタチオン混合物の存在下で、部分的に再生した。精製組換えタンパク質を0.4mg/mlに調整し、８M尿素、２％β-メルカプトエタノールの存在下に、370℃で１時間、完全に還元した。還元タンパク質を、Hoppeら、Biochemistry, 28, pp 2956-2960（1989）；Hoppeら、Eur. J. Biochem., 187, pp 207-214（1990）に記載されているように、50mM Tris-Cl（pH8.0）、１M尿素、５mM還元グルタチオン、および0.5mM酸化グルタチオンを含有する溶液に対して２日間透析し、そして20mM Tris-Cl（pH7.5）、0.7M NaClを含有する溶液に対して１日透析した。部分的に再度折り畳まれた組換えFIGFは、用量依存的な様式で、c-fos（-/-）線維芽細胞にDNA合成を誘導した（図4D）。予測されるように、c-fos（-/-）細胞はまた、PDGF-BBに対して応答性であり、一方、VEGFによる処理は、これらの細胞において［3H］-チミジン取り込みを誘導しなかった。DNA合成の最高活性は2μgの精製FIGFで得られた。観察された組換えFIGFの外見上低い比活性は、おそらく、FIGFの正確な再折り畳みの効率が低いことに起因するであろう。なぜなら、FIGFは、358アミノ酸中の29システイン残基を有するからである。さらに、マウス胚線維芽細胞（MEF）に対する組換えFIGFの細胞分裂促進活性もまたテストした。FIGFは、マウス胚線維芽細胞に、用量依存的な様式で、DNA合成を誘導した（図4E）。FIGF cDNAを、c-fos発現についてのみ異なる細胞由来のRNAの鑑別スクリーニングにより単離した。ノーザンブロットによるFIGF遺伝子発現の分析により、FIGFメッセンジャーは、c-fos（-/-）線維芽細胞ではほとんど検出され得ないが、その発現は野生型c-fos（+/+）線維芽細胞において高いことが示された（図5A、レーン１〜３とレーン７〜９を比較のこと）。FIGF発現は、FBJ-LTR構成プロモーター（Huら、（1994））の制御下で外因性c-fosを発現する、c-fos（-/-）細胞由来の安定クローンにおいて、完全に元に戻った（図5A、レーン１〜３とレーン４〜６を比較のこと）。外因性c-fosの一過性トランスフェクションは、c-fos（-/-）細胞においてFIGF誘導を生じるが、トランスフェクション細胞の数がより少ないため、観察される誘導は顕著ではない（図5A、レーン10および11）。従って、FIGF発現はc-fosに依存する。さらに、FIGFは、構成的AP-1酵母ホモログGCN4によって誘導されない。哺乳動物細胞において、GCN4は、ほとんどのAP-1標的遺伝子を活性化し得るが、それは非ガン原性である。野生型線維芽細胞において、c-Fosは、血清誘導後最初の１時間以内に、c-JunまたはJun Bと会合する、主要Fosタンパク質である。その後、c-Fosは、もはや検出され得ず、それは、AP-1複合体中でFraJ1およびFraJ2により置換される。c-fos発現細胞では、FIGFは、細胞が低血清条件に維持される場合、高度に発現され、血清誘導後６時間以内に、検出不可能なレベルに減少する（図5A）。このパターンのFIGF発現は、野生型細胞およびc-fosを構成的に発現する細胞の両方において観察された（図5A）。従って、c-fos発現の推定ピークとFIGFの出現（FIGFのメッセンジャーは静止期に蓄積する）と間の不一致が観察される。調節のFIGFパターンは、c-fos発現に加えて、その活性化のためのさらなる調節制御が必要であることを示唆する。FIGFは、PDGF/VEGFファミリーの増殖因子に属するが、その発現は、増殖停止特異（gas）遺伝子の発現とほぼ同様である。興味深いことに、それらの１つであるgas6は、増殖因子として作用する。PDGFおよびVEGFの両増殖因子は腫瘍形成に関与する（Kimら、（1993））。さらに、PDGFは、c-fosの転写活性化を誘導する主要な血清マイトジェンである。FIGFに関して、これらの増殖因子の発現パターンを比較するために、c-fos発現について異なる線維芽細胞中の、PDGFおよびVEGFのメッセンジャーレベルを測定した。図5Bに認められ得るように、PDGFおよびVEGFの両メッセンジャーの調節は、FIGFのメッセンジャー調節とは異なる。これらの増殖因子は、血清誘導後に迅速に誘導され、そしてそれらの発現はc-fos非依存的である。腫瘍の進行は、変異細胞を、元の隣接細胞への付着力を失わせ、元の組織から逃れるように導く、腫瘍の形態学的変化によって特徴づけられる。c-fosは腫瘍進行に関連づけられており、その過剰発現が、線維芽細胞および上皮細胞において形質転換細胞の形態を誘導する。FIGFはc-fos依存性増殖因子であるので、その過剰発現が、線維芽細胞の形態学的形質転換を誘導し得るかどうかを分析した。図７に認められ得るように、線維芽細胞でのFIGFの構成的発現は、形質転換表現型を誘導する。FIGFを構成的に発現するc-fos（-/-）細胞由来の安定クローンは、紡錘型の形態を獲得し、より屈折的になり、プレートから脱離する（図７、ＢとＡとを比較）。対照的に、FIGFアンチセンスメッセンジャーを発現する安定クローンは、平坦で、より屈折性でない表現型を獲得し（図7C）、これは、低血清条件で維持されたc-fos（-/-）細胞の表現型（図7G）とほとんど同様である。c-fosの過剰発現は、c-fos（-/-）細胞の形態を、FIGFの過剰発現によって観察される形態と同様に変化させるが、表現型はさほど顕著ではない（図7D）。c-fosおよびFIGFの両方の過剰発現は、線維芽細胞において極端な表現型を導く：細胞はより長くなり、組織が崩壊し、連絡を失う（図7E）。c-fosを構成的に発現する細胞におけるFIGFアンチセンスメッセンジャーの発現は、形質転換表現型の復帰を誘導する（図7F）。従って、c-fosを発現するがFIGFを枯渇させた細胞は、ほとんどの形質転換表現型を失い、このことは、c-fosを構成的に発現する細胞において観察される形態が、FIGFに起因することを示唆する。同様の形態学的変化はまた、精製組換えFIGFでの細胞の処理によって得られる。0.5％血清を含有する培地中で120時間、増殖を停止され続けたc-fos（-/-）線維芽細胞は、平坦で大きくなり、そしてより屈折性でなくなる（図7G）。組換えFIGFでの細胞処理は、屈折性で、長く伸びた、非付着性表現型を誘導する（図7H）。
c-fos欠損細胞から得た腫瘍は、それが活性化v-H-Rasを有している場合でさえも、悪性進行を経験し得ない。従って、c-fos発現は、悪性表現型を担う標的遺伝子の活性化に必須である。FIGFは、線維芽細胞において、細胞分裂エントリーを導き、そして過剰発現される場合には形質転換表現型を導き得る、c-fos依存性オートクリン増殖因子である。これらのデータは、悪性表現型の活性化におけるc-fosの役割が、FIGFの活性化に起因することを示唆する。
マウス組織由来のRNAのノーザンブロット分析における、FIGFに対して特異的なプローブを使用する、FIGFについてのさらなる実験は、FIGF遺伝子が、Fosを発現する細胞でのみ発現し、Fosガン遺伝子を欠く細胞では貧弱な発現することを示す（図５）。ノーザンアッセイで使用されるRNAブロットをClontecから得た。マウス組織におけるその発現の分析は、FIGFが、主に肺で発現され（図６）、マウス胚胎期７日目にすでに存在することを示す（図示せず）。
従って、FIGFは、ガン遺伝子Fosによってポジティブに調節される、増殖因子VEGFに関連する分子である。これは腫瘍および発生に関与し得る。
（1）一般的情報：
（i）出願人：
（A）名称：ユニベルシタ デグリ スチュディ ディ シエナ
（B）番地：ビア バンキ ディ ソットー エンネ５５
（C）市：シエナ
（E）国：イタリア共和国
（F）郵便番号：53100
（A）氏名：オリビエロ サルバトーレ
（B）番地：ビア デル ギグリオ２０
（C）市：シエナ
（E）国：イタリア共和国
（F）郵便番号：53100
（ii）発明の名称：調節遺伝子およびその使用
（iii）配列数：２０
（iv）コンピューター読み出し形態：
（A）媒体型：フロッピーディスク
（B）コンピューター：IBM PC互換用
（C）OS：PC-DOS/MS-DOS
（D）ソフトウェア：パテントイン リリース #1.0, バージョン #1.30（EPO）
（v）現在の出願データ：
（A）出願番号：WO PCT/IB96/01113
（2）配列番号１の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：1890塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（ix）配列の特徴
（A）特徴を表す記号：CDS
（B）存在位置：283..1356
（xi）配列：配列番号１：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：358アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号２：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：1864塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（ix）配列の特徴
（A）特徴を表す記号：CDS
（B）存在位置：1..1860
（xi）配列：配列番号３：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：620アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号４：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：1864塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（ix）配列の特徴
（A）特徴を表す記号：CDS
（B）存在位置：2..1861
（xi）配列：配列番号５：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：620アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号６：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：1864塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（ix）配列の特徴
（A）特徴を表す記号：CDS
（B）存在位置：3..1862
（xi）配列：配列番号７：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：620アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号８：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：48アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号９：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：48アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号１０：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：48アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号１１：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：48アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号１２：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：50アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号１３：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：50アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号１４：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：49アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号１５：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：49アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号１６：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：47アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号１７：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：47アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号１８：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：50アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号１９：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：50アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号２０：
Claims (13)
- 下記の配列１（配列番号１）の読み枠によってコードされるタンパク質または配列２（配列番号５）の読み枠のヌクレオチド218位〜1302位によってコードされるタンパク質、または１つまたは数個のアミノ酸置換、付加、および／もしくは欠失によってそれらのタンパク質から誘導されるタンパク質をコードする、Fos調節ヌクレオチド分子であって、該タンパク質は、Fosによってポジティブに調節される、線維芽細胞における細胞分裂促進活性を示す、Fos調節ヌクレオチド分子：
（配列１）
（配列２）
- 請求項１に記載のヌクレオチド分子によってコードされるタンパク質。
- 請求項１に記載のヌクレオチド分子の発現のためのベクターであって、プロモーターおよび該ヌクレオチド分子を含む、ベクター。
- 請求項３に記載のベクターを用いて形質転換された宿主細胞。
- チャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項４に記載の宿主細胞。
- 請求項２に記載のタンパク質を産生するための方法であって、該タンパク質の産生を導く条件下で、請求項４または請求項５に記載の宿主細胞を培養する工程、および該タンパク質を収集する工程を包含する、方法。
- 請求項２に記載のタンパク質に対して特異性を有する抗体分子。
- 請求項１に記載のヌクレオチド分子と相補的な配列を有するアンチセンスヌクレオチド分子。
- 請求項８に記載のアンチセンスヌクレオチド分子の発現のためのアンチセンスベクターであって、プロモーターおよび該アンチセンス分子を含む、ベクター。
- 前記タンパク質のレセプターを同定することにおける、請求項２に記載のタンパク質の使用。
- 前記タンパク質のアンタゴニストの同定のためのアッセイにおける、請求項２に記載のタンパク質の使用。
- 非ヒトトランスジェニック動物の作製における、請求項１に記載のヌクレオチド配列の使用。
- 前記タンパク質のアゴニストの同定のためのアッセイにおける、請求項２に記載のタンパク質の使用。
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| WO2005011722A2 (en) * | 2003-06-12 | 2005-02-10 | Ludwig Institute For Cancer Research | Use of vegf-c or vegf-d in reconstructive surgery |
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