JPH06121682A

JPH06121682A - 骨関連カルボキシペプチダーゼ様タンパク質およびその製造法

Info

Publication number: JPH06121682A
Application number: JP4324033A
Authority: JP
Inventors: Shinji Kawai; 伸治河合; Atsushi Takeshita; 淳竹下; Makoto Okazaki; 誠岡崎; Egon Aman; アマン・エゴン
Original assignee: Hoechst Japan Ltd
Current assignee: Sanofi Aventis KK
Priority date: 1992-08-28
Filing date: 1992-12-03
Publication date: 1994-05-06
Anticipated expiration: 2018-12-02
Also published as: PT588118E; US5460951A; DK0588118T3; JP3472587B2; AU663217B2; DE69328527D1; EP0588118B1; CA2104998A1; ATE192495T1; AU4492393A; EP0588118A3; DE69328527T2; EP0588118A2; ES2147556T3

Abstract

(57)【要約】【構成】マウス、ヒトを含む哺乳動物の骨組織から得
られるＯＳＦ−５と名付けられた骨関連カルボキシペプ
チダーゼ様タンパク質およびその製造法。本タンパク質
は新しい天然型哺乳類タンパク質であり、カルボキシペ
プチダーゼ分子のグループに属するタンパク質である。【効果】ＯＳＦ−５は、骨誘導部位における骨形成の
過程において関与する接着分子または成長因子として作
用する。ＯＳＦ−５は、骨代謝性疾患の治療剤といえ用
いることができ、また骨に対する臓器特異性が高いの
で、骨代謝性疾患の診断剤としても用いることができ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規な骨関連タンパク
質を提供する。本発明のタンパク質はＯＳＦ−５と名付
けられたものであり、カルボキシペプチダーゼ分子のグ
ループに属する新規なタンパク質である。また、このＯ
ＳＦ−５はマウスまたはヒトを含む哺乳動物の骨組織よ
り得ることができる。さらに本発明は、動物細胞などの
培養細胞を用いた組換え遺伝子技術によるＯＳＦ−５製
造方法を提供する。

【０００２】

【発明の背景】骨代謝性疾患と総称される疾患の中に
は、骨粗鬆症(Osteoporosis)、ページェット病(Paget's
disease)、骨軟化症、過骨形成症、大理石病等が含ま
れ、このうち、特に骨粗鬆症は発生頻度が閉経後の女性
及び老齢人口の約半分を越える程に高く、その診断と有
効な治療法が強く望まれている。

【０００３】骨代謝性疾患とは、何らかの骨組織におけ
る、細胞レベルでの、骨に特異的な代謝の変調を伴うも
のであり、骨の代謝に特異的に関与する因子の発見、分
離そして同定は、この代謝の異常を明らかにするのに非
常に有効である。本発明者等は、これらの骨の代謝に特
異的な因子の発見のために鋭意研究し、ついに、本発明
を完成させるに至ったものである。

【０００４】より詳しくは、本発明者等は、特に、骨形
成において主要な働きをする骨芽細胞の細胞株を用い、
この細胞株により特異的に生成されるタンパク性因子を
同定したものである。さらに、本発明は、こうした研究
によって得られた、従来知られている種々のカルボキシ
ペプチダーゼとアミノ酸配列上で強いホモロジーを有す
る実質的に骨特異的なＯＳＦ−５と名付けられた新規な
タンパク質を提供する。

【０００５】本発明のＯＳＦ−５は、本明細書に記載さ
れたＤＮＡ配列から当業者において公知の通常の遺伝子
工学的手法によっても生産でき、また本明細書に記載の
アミノ酸配列から、化学的なペプチド合成法により、Ｏ
ＳＦ−５又はその断片を生産することができる。さら
に、本発明に記載されたＯＳＦ−５のＤＮＡ配列の特に
他のカルボキシペプチダーゼに対し、ＯＳＦ−５の特異
性の高い部分配列を通常のオリゴヌクレオチド化学合成
法により、１５〜５０塩基長で合成し、骨由来細胞を識
別診断するＤＮＡプローブとして使用することができ
る。このような骨由来細胞の識別は、特に、転移再発性
癌の由来を識別するために有用であり、適切な再発性癌
の治療をもたらす。さらにＯＳＦ−５の部分ペプチドの
うち、抗体の認識しうるエピトープ(epitope)部分のペ
プチドは、ＯＳＦ−５に特異的なモノクローナル抗体を
作成するために使用できる。こうして得られたモノクロ
ーナル抗体は、免疫学的細胞組織染色法により骨由来細
胞の同定に有用である。

【０００６】

【従来の技術】本発明で提供されるＯＳＦ−５が属する
カルボキシペプチダーゼグループのタンパク質について
以下のことが知られている。

【０００７】生理活性ペプチドの研究のめざましい進展
により、カルボキシペプチダーゼの重要性が、より明確
になってきている。カルボキシペプチダーゼは、その活
性中心により、金属カルボキシペプチダーゼ（Ｅ．Ｃ．
３．４．１７）、セリンカルボキシペプチダーゼ（Ｅ．
Ｃ．３．４．１６）、システインカルボキシペプチダー
ゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．１８）に大別され、ペプチドやタ
ンパク質のカルボキシル末端からそれぞれ特異的なアミ
ノ酸を遊離する。この中で金属カルボキシペプチダーゼ
には、ペプチドホルモンと深い関わりを持つ塩基性カル
ボキシペプチダーゼが含まれている。その代表的なもの
に、カルボキシペプチダーゼＢ、Ｎ、Ｈ(Ｅ)、Ｍ等があ
る。カルボキシペプチダーゼＢは、プロタミンからアル
ギニンを遊離する酵素として発見され、広く哺乳類の膵
臓に前駆体として存在し、消化管においてトリプシンの
作用で活性化され、他の消化酵素と協調して消化の役割
を果たす。カルボキシペプチダーゼＮ（キニナーゼＩ）
は動物の血漿中に発見され、ブラジキニンやアナフィラ
トキシンを失活させる作用があるので、生体内でキニン
系の恒常性維持の役割を果たす。カルボキシペプチダー
ゼＨ（エンケファリンコンバーターゼ）はエンケファリ
ンの生合成を担うカルボキシペプチダーゼＢ様の酵素と
して同定され、ペプチドホルモン前駆体のプロセシング
に関与し、分泌顆粒に局在する。カルボキシペプチダー
ゼＭは、細胞表面のペプチドホルモンのレセプター特異
性を制御できる原形質膜に結合した酵素である。このよ
うにカルボキシペプチダーゼの機能は少なくとも三つに
分類され、即ち、(１)不活性ペプチド前駆体から活性な
ペプチドを生成する、(２)活性ペプチドを失活させる、
(３)ペプチドのレセプター特異性を変える、である(Ski
dgel, (1988), Trends Pharmacol. Sci. vol.9, p299〜
304)。

【０００８】一方、骨組織のリモデリング過程には、副
甲状腺ホルモン、インターロイキン−１、カルシトニ
ン、Transforming growth factor-β(ＴＧＦ−β)、Bon
e morphogenetic protein(ＢＭＰ)、Insulin like grow
th factor(ＩＧＦ)、Fibroblast growth factor(ＦＧ
Ｆ)などのような成長因子、局所因子が関与する。これ
らの因子の生物活性が厳密に制御されることによって、
正常な骨リモデリングが維持される。この制御の機構に
ついての詳細には不明な点も多いが、その機構の一つと
して、局所的なタンパク質加水分解酵素による制御機構
が挙げられる。生体内には多くのタンパク質加水分解酵
素が存在するが、その候補としてカルボキシペプチター
ゼに着目する事ができる。即ち、骨組織に局在するカル
ボキシペプチダーゼが、骨代謝に関与するペプチド性因
子の生物活性をコントロールしている可能性である。最
近、タンパク質分解酵素の一種であるエンケファリナー
ゼ（中性金属エンドペプチダーゼ）がin vitroで骨吸収
を阻害している事が示され(Ibbotson.et.al. (1992),
J. Bone Miner. Res. vol.7, p273〜279)、タンパク質
分解酵素による骨代謝の制御機序が徐々に解明されてき
ている。

【０００９】更に、骨のリモデリングでは、まず主に骨
芽細胞で合成されると考えられているコラーゲナーゼや
その活性化酵素であるプラスミノーゲン活性化酵素によ
り未石灰化類骨層が消化され、その下層の石灰化基質が
露出し、そこに破骨細胞が誘導され骨基質の吸収を行う
と推定されている。この過程における骨芽細胞で合成さ
れているタンパク質加水分解酵素群にカルボキシペプチ
ターゼが含まれている可能性がある。つまり骨芽細胞の
コラーゲナーゼやプラスミノーゲン活性化酵素などによ
る分解物を更に分解する役割である。また、破骨細胞に
よる吸収後に、破骨細胞が分泌した酸やプロテアーゼに
よる消化断片をカルボキシペプチダーゼが更に分解し、
吸収が行われた石灰化基質部位で骨芽細胞が効率よく作
用するための微細環境を形成するスカベンジャーとして
の役割も推定される。更に、破骨細胞が石灰化基質を吸
収した時、ＴＧＦ−βなどの成長因子は通常、不活性型
として分泌されるが、カルボキシペプチダーゼがこれら
の成長因子を活性化している可能性も考えられる。カル
ボキシペプチダーゼはカルボキシル末端のアミノ酸残基
を遊離する事により骨芽細胞による骨形成（タンパク質
合成）に必要なアミノ酸などの材料を供給している事も
推察される。しかしながら、骨細胞に特異的なカルボキ
シペプチダーゼは、未だ知られていない。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、骨細胞、なかでも骨芽細胞に特異的に発現している
新しいタイプのカルボキシペプチダーゼを見いだすこと
である。こうした骨由来のカルボキシペプチダーゼは一
般的な用途としては、タンパク質のカルボキシル末端分
析に利用できるが、さらにその骨由来という特徴を生か
した骨組織に作用する諸々のペプチドホルモンの活性を
コントロールしたり、未石灰化類骨の消化やスカベンジ
ャー、アミノ酸供給を促進することで、諸々の骨代謝疾
患への治療効果が期待できる。

【００１１】

【課題を解決するための手段】マウスＯＳＦ−５のｃＤ
ＮＡは、マウス骨芽細胞様細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１由来
のｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ(Polymerase Chain
Reaction)法とサブトラクション(Subtraction)法を組み
合わせた方法によりｃＤＮＡライブラリーを作成し、デ
ィファレンシャルスクリーニング(Differential Screen
ing)法によりクローン化した。得られたクローンをＯＳ
Ｆ−５と名付け、その塩基配列を決定した。ＯＳＦ−５
のｃＤＮＡの塩基配列は現在利用できる種々のＤＮＡ及
びアミノ酸配列データベースによる検索で、新規である
ことが明らかにされた。

【００１２】ＯＳＦ−５は一般に分泌型蛋白で知られて
いる典型的なシグナルペプチド（２５アミノ酸残基）を
有しているが、典型的な細胞膜貫通領域は含んでいな
い。ＯＳＦ−５はＮ末端より１１６番目から１５９番目
にLys-Pro-Lys-Glu-Lys-Pro-Pro-Lys-Ala-Thr-Lysの１
１アミノ酸残基からなるリジンとプロリンに富んだ４回
繰り返し構造を持つ。この１１アミノ酸残基は、プロラ
クチンレセプター、繊維芽細胞成長因子レセプター、γ
−アミノ酪酸レセプター、セロトニンレセプター、ヒス
トンＨ１などと相同性を示す。４２３番目から５３１番
目に血液凝固因子ＶＩＩＩのリン脂質結合領域と相同性
を持つドメインがある。この血液凝固因子ＶＩＩＩのリ
ン脂質結合領域は、細胞膜表面のリン脂質に結合すると
考えられるドメインであり、ＯＳＦ−５が機能すべき特
定の細胞（骨芽細胞や軟骨細胞など）の細胞膜表面にＯ
ＳＦ−５自身を誘導する。即ち、ＯＳＦ−５の骨組織へ
のターゲッティング(drug delivery system)に利用され
得る。また、５４４番目から１０２７番目にはカルボキ
シペプチダーゼＨと相同性を示す領域があり、カルボキ
シペプチダーゼＨのほぼ全領域のドメインを含んでい
る。このカルボキシペプチダーゼ様のドメインは、骨代
謝過程におけるペプチド性のホルモンやサイトカインの
制御因子として作用する。

【００１３】ＯＳＦ−５の親水性(hydrophilic)領域に
由来する１１６番目から１２６番目(KPKEKPPKATK)の１
１アミノ酸残基、４８２から４９６番目(GYEEMTFYGNVDK
DT)、５５７から５７１番目(SYKDMRQLMKAVDEE)、７０１
から７１５番目(WAAEEKKWVPYRVPN)、８７２から８８６
番目(PHESELPREWENNKE)のそれぞれ１５アミノ酸残基に
相当するペプチドを合成し、卵白アルブミンと架橋し、
ウサギの免疫に使用した。得られた抗ＯＳＦ−５ペプチ
ド抗血清を新生児マウス全身切片中のＯＳＦ−５の免疫
組織化学的検出に用いた。ＯＳＦ−５は骨芽細胞、軟骨
細胞などに検出された。

【００１４】一般に、ＯＳＦ−５はヒト、ウシ、マウ
ス、または、その他の材料から、公知の生化学的技術に
より、直接、骨組織または軟骨組織から抽出する事がで
きる。

【００１５】また、本発明のマウスのＯＳＦ−５は、塩
基配列やアミノ酸配列において類似した他の哺乳類由来
のＯＳＦ−５タンパク質を分離同定するために使用でき
る。即ち、ＯＳＦ−５をコードするＤＮＡは、脊椎動物
の骨組織から抽出したｍＲＮＡから作成されたｃＤＮＡ
ライブラリーまたはゲノム遺伝子ライブラリーから、本
明細書中で開示されたマウスのｃＤＮＡ塩基配列の断片
を標識してプローブとして用い、得る事ができる。全長
ｃＤＮＡクローンは上記の及び他の標準的な分子生物学
的な技術を組み合わせて得る事ができる。

【００１６】本発明は更にＯＳＦ−５の類似体より成る
ポリペプチド、即ち、ミュータント、融合蛋白、及びＯ
ＳＦ−５の主要部分を含む断片を提供する。本発明はま
た組換え遺伝子技術によるＯＳＦ−５の製造方法を提供
する。

【００１７】本発明をより具体的に説明するため、以下
に実施例を示す。

【００１８】

【実施例】〔実施例１〕サブトラクション／ＰＣＲｃＤＮＡライ
ブラリーの作成この実施例では骨芽細胞様細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１に特
異的なｃＤＮＡライブラリーの構築について記述する。
このｃＤＮＡライブラリーはサブトラクション法とＰＣ
Ｒ法を組み合わせることにより、マウス肝組織で発現し
ている遺伝子を差し引いたＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ｃＤＮＡラ
イブラリーであり、各ｃＤＮＡクローンは平均約３００
塩基の遺伝子断片を有し、さらに、本来含有量の少ない
遺伝子をも増幅されるという特徴を有している。

【００１９】全ての一般的な組換えＤＮＡ技術に関する
手順(protocol)は、特に他に断らなければ、サムブルッ
ク(Sambrook)らによる「Molecular Cloning Manual」(1
989年、Cold Spring Harbor Laboratory社、米国、Cold
Spring Harbor)に準じて行った。総ＲＮＡは、グアニ
ジン法により、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞及びマウス肝組織
の、それぞれ、８×１０⁷個、約１ｇから抽出した。ポ
リＡ⁺ＲＮＡは総ＲＮＡから市販の「オリゴｄＴラテッ
クスｍＲＮＡ精製キット」（宝酒造(株)）により精製し
た。各１μｇポリＡ⁺ＲＮＡをテンプレートとし、ｃＤ
ＮＡ合成キット(Amersham社)を用いてｃＤＮＡを合成し
た。ただし、オリゴｄＴプライマーの代わりにランダム
プライマーを用い、その量は通常使用量の１.５倍使用
した。これにより、ｃＤＮＡ鎖伸長反応を平均約３００
塩基に制限した。上記のキットを用いて２本鎖平滑末端
にした後、下記の２種類の合成ＤＮＡリンカーをＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼ（宝酒造(株)）により、それぞれ、ＭＣ３
Ｔ３−Ｅ１ｃＤＮＡはＡＴＯＳ−１／２（配列表の配列
番号２及び３）を、肝臓ｃＤＮＡはＡＴＯＳ−４／５
（配列表の配列番号４及び５）を結合した。

【００２０】ATOS-1/2 ATOS-1 5′- CTCTTGCTTGAATTCGGACTA-3′ ATOS-2 3′-ACACGAGAACGAACTTAAGCCTGAT-5′ ATOS-4/5 ATOS-4 5′- CTCTTGCTTAAGCTTGGACTA-3′ ATOS-5 3′-ACACGAGAACGAATTCGAACCTGAT-5′

【００２１】次に、各反応産物をＰＣＲ(Polymerase Ch
ain Reaction)法により、プライマーとして、それぞ
れ、ＡＴＯＳ−１とＡＴＯＳ−４を用いてＤＮＡを増幅
した。増幅したＤＮＡ濃度は「ＤＮＡ濃度測定キット”
DNA Dipstick”」(Invitrogen社)を用いて行った。サブ
トラクション法はフォトビオチン(Photobiotin, Pirce
社)を用いて行った。ＰＣＲ法により増幅した２０μｇ
の肝臓ｃＤＮＡに２０ｎｇのフォトビオチンを加え、サ
ンランプを１０ｃｍ隔て１０分間照射することにより、
ＤＮＡをビオチンで標識した。この標識した肝臓ｃＤＮ
Ａ３.０μｇに、標識していないＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ｃＤ
ＮＡ０.３μｇを加え、ハイブリダイゼーションを行っ
た。次いで、これにストレプトアビジン(Streptavidi
n，宝酒造(株)）を反応し、フェノール抽出する事によ
り、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ｃＤＮＡから肝臓ｃＤＮＡと共通
のｃＤＮＡを除いた。サブトラクション法を再度繰り返
し行い、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ｃＤＮＡから肝臓ｃＤＮＡと
共通なものをできるだけ除いた。さらに、上記のＡＴＯ
Ｓ−１を用いてＰＣＲ法によりＤＮＡを増幅し、ＤＮＡ
濃度を測定した。このｃＤＮＡ１０ｎｇを制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩで消化した後、ＥｃｏＲＩで消化し末端を脱燐酸
化したファージベクターλｇｔ１０（λｇｔ１０／Ｅｃ
ｏＲＩクローニングキット、Stratagene社）１μｇとＴ
４リガーゼを用いて連結した。これを市販のインビトロ
パッケイジングキット(in vitro packaging kit)「ギガ
パックゴールド(Gigapack-gold)」(Stratagene社)によ
りλファージ粒子にパッケイジングした。この組換え体
ファージを、大腸菌Ｃ６００（日本予防衛生研究所、日
本癌研究資源バンクにＨＴ００３として保存されてい
る）に感染させ、軟寒天培地とともに寒天培地の上にま
きファージプラークを形成させ感染効率を測定したとこ
ろ、１μｇのｃＤＮＡあたり３×１０⁶のファージプラ
ークが得られた。

【００２２】さらに、このｃＤＮＡライブラリーをディ
ファレンシャルスクリーニング(differential screenin
g)法を用い、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１に特異性の高いクローン
を選択した。つまり、２.２５×１０⁴個のファージを計
１０枚のプレートにまき、それぞれ２枚（計２０枚）の
ナイロンメンブレンフィルターに移した。これらの一方
を放射能でラベルしたＭＣ３Ｔ３−Ｅ１のｃＤＮＡと、
また、他方を同様にラベルした肝臓のｃＤＮＡをプロー
ブとして、プラークハイブリダイゼーション法を行っ
た。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ｃＤＮＡプローブでシグナルが認
められ、しかも、肝臓のｃＤＮＡプローブでシグナルの
認められない２７３クローンをミニライブラリーとし、
以後の実験に用いた。

【００２３】〔実施例２〕マウスＯＳＦ−５クローン
の単離この実施例では、上記の実施例１で作成したミニライブ
ラリーから、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１に特異的なクローンとし
て、ＯＳＦ−５の部分的ｃＤＮＡ断片を同定し、さら
に、これを用いてＭＣ３Ｔ３−Ｅ１のｃＤＮＡライブラ
リーから完全長ｃＤＮＡをクローニングする方法につい
て記述している。

【００２４】実施例１で調製したＭＣ３Ｔ３−Ｅ１及び
肝臓の各総ＲＮＡを、それぞれ１μｇづつナイロンメン
ブレンフィルターにスポットし、このフィルターを２７
３個作成し、以下のハイブリダイゼーションに用いた。
一方、実施例１で作成した２７３個のファージクローン
の挿入部分のＤＮＡをＰＣＲ法を用いて増幅した。この
ＤＮＡをアガロースゲル電気泳動した後、主なバンドを
切り出し精製し、放射能ラベルしてプローブとして用い
た。オートラジオグラフィーの結果、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１
でシグナルが認められ、しかも肝臓でシグナルの認めら
れないクローンについてプラスミドベクターにリクロー
ニング(recloning)した。つまり、ＰＣＲ法により増幅
し精製した挿入部分のＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで消
化し、プラスミドベクターｐＵＣ１１８（宝酒造(株)）
のＥｃｏＲＩサイトにリクローニングした。これらのク
ローンについて市販の「ＤＮＡシーケンスキット」（宝
酒造(株)）を用いユニバーサルプライマーにて塩基配列
を決定した。得られた塩基配列をＤＮＡ及びタンパク質
データベースを検索したところ、既存のＤＮＡ及びタン
パク質と同一でない新規クローンが得られ、これをｐＭ
ＣＬＳ６８と命名し、これを用いて以後の完全長ｃＤＮ
Ａのクローニングを行った。

【００２５】完全長ｃＤＮＡクローニングのために、実
施例１で精製したＭＣ３Ｔ３−Ｅ１のポリＡ⁺ＲＮＡ５
μｇから「ｃＤＮＡ合成キット」(cDNA systhsis syste
m plus, Amersham社)を用いて平滑末端２本鎖ｃＤＮＡ
を合成した。これにＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩアダプター
（宝酒造(株)）をＴ４リガーゼを用いて連結した後、ア
ガロースゲル電気泳動し、約７００塩基対以上のフラク
ションを精製した。この断片をλｇｔ１０ファージベク
ター(Stratagene社)のＥｃｏＲＩサイトに連結し、実施
例１と同様にファージ粒子にパッケイジングした後、大
腸菌に感染させ感染効率を測定したところ、１μｇのベ
クターＤＮＡあたり、１.５×１０⁷であった。前述のｐ
ＭＣＬＳ６８を放射能ラベルしてプローブとして用い、
このｃＤＮＡライブラリー１.０×１０⁶個のファージク
ローンをプラークハイブリダイゼーション法によりスク
リーニングした。その結果、５個のポジティブシグナル
が得られ、その内、最も挿入断片の長いファージクロー
ンのＥｃｏＲＩ断片をプラスミドベクターｐＵＣ１１８
（宝酒造(株)）のＥｃｏＲＩサイトにリクローニング
し、これをｐＫＯＴ２０と命名した。

【００２６】〔実施例３〕マウスＯＳＦ−５のＤＮＡ
配列ｐＫＯＴ２０、及びこのｃＤＮＡ断片を有するサブクロ
ーン(subclone)から「キロシークエンス用デレーション
キット」（宝酒造(株)）を用いて、それぞれ約３００塩
基対おきに両方向からのデレーションミュータントを作
成した。それぞれのデレーションミュータントの塩基配
列の決定は、米国Applied Biosystems社製の自動ＤＮＡ
シークエンサー・モデル３７３Ａ(automatic DNA seque
ncer)を用いて行った。この完全長ｃＤＮＡの塩基配列
と、塩基配列より翻訳したアミノ酸配列を配列表の配列
番号１に示した。アミノ酸残基の番号１は予想されるＯ
ＳＦ−５前駆体タンパク質のＮ末端に相当する。このｃ
ＤＮＡにコードされるタンパク質をＯＳＦ−５と名付け
た。得られたマウスＯＳＦ−５のタンパク質の構造の模
式図を図１に、またマウスＯＳＦ−５をコードするｃＤ
ＮＡの制限酵素地図を図２に示した。得られた塩基配列
を再度ＤＮＡ及びタンパク質データベースで検索したと
ころ、血液凝固因子VIIIのリン脂質結合領域、及びほぼ
全領域のカルボキシペプチダーゼＨと相同性を持つ領域
を含んでいる事が判明した。マウスＯＳＦ−５と他のカ
ルボキシペプチダーゼ分子のアミノ酸比較表(alignmen
t)を図３〜５に、また、マウスＯＳＦ−５と他血液凝固
因子のリン脂質結合領域とのアミノ酸比較表を図６に示
した。

【００２７】〔実施例４〕マウスＯＳＦ−５の組織特
異的発現マウスＯＳＦ−５の組織特異的発現をみるためにＲＮＡ
ドットブロッティング(RNA dot blotting)を行った。マ
ウス（日本クレアから購入）の胸腺、脾臓、脳、腎臓、
肝臓、肺、睾丸、及び、心臓の総ＲＮＡをグアニジン法
で調製した。頭蓋冠由来の骨芽細胞を多く含む細胞は、
新生児マウスの頭蓋冠より調製し、これを培養して得ら
れた。さらに、この細胞から総ＲＮＡを前述と同様な方
法で抽出した。上記の組織、頭蓋冠培養細胞、ＭＣ３Ｔ
３−Ｅ１及びマウス線維芽細胞株ＮＩＨ３Ｔ３(ATCC CR
L 1658)の各総ＲＮＡ１μｇをナイロンメンブレンフィ
ルター(Biodyne, PALL社)にドットし、加熱固定した後
に、ハイブリダイゼーションに用いた。一方、ｐＫＯＴ
２０をＳｐｈＩで消化し、アガロースゲル電気泳動によ
る分離精製を行った後、放射能でラベルしプローブとし
て用いた。オートラジオグラフィーの結果、頭蓋冠培養
細胞とＭＣ３Ｔ３−Ｅ１に強いシグナルが見られた（図
７）。

【００２８】〔実施例５〕抗ＯＳＦ−５抗血清の調製マウスＯＳＦ−５の抗ペプチド抗体を作成するにあた
り、繰り返し領域のＮ末端より１１６から１２６番目の
１１アミノ酸残基、血液凝固因子VIII様領域の４８２か
ら４９６番目の１５アミノ酸残基、及びカルボキシペプ
チダーゼ様領域の５５７から５７１番目、７０１から７
１５番目、８７２から８８６番目の１５アミノ酸残基、
合計５ペプチドをペプチド合成機(Applied Biosystems
社、モデル４３０Ａ）により、固相合成法で合成した。
合成したペプチドは各々、ＯＳＦ−５.１(KPKEKPPKAT
K：配列番号６)、ＯＳＦ−５.２(GYEEMTFYGNVDKDT：配
列番号７)、ＯＳＦ−５.３(SYKDMRQLMKAVDEE：配列番号
８)、ＯＳＦ−５.４(WAAEEKKWVPYRVPN：配列番号９)、
ＯＳＦ−５.５(PHESELPREWENNKE：配列番号１０)であ
る。合成ペプチドはグルタルアルデヒドをカップリング
剤として卵白アルブミン担体と結合し、ウサギの免疫に
使用した。得られた抗血清は、新生児マウス全身切片中
で、組織免疫化学的に、ＯＳＦ−５の存在を検索した
り、大腸菌、酵母及び動物細胞でのＯＳＦ−５の発現を
検出するのに使用できた。

【００２９】〔実施例６〕動物細胞でのＯＳＦ−５の
発現マウスＯＳＦ−５のｃＤＮＡ領域を含むＮｏｔＩ断片を
動物細胞発現用ベクターｐＲｃ／ＣＭＶにクローニング
し、このプラスミドＤＮＡを用いてチャイニーズハムス
ター卵巣細胞（ＣＨＯ）にカルシウム・リン酸共沈法に
より導入した。得られたＧ４１８耐性のコロニーを分離
増殖し、それぞれのクローンについてＯＳＦ−５の発現
をノーザンブロット法(Northern blotting analysis)に
より解析した。これらの中でＯＳＦ−５の発現が最も高
かったクローン化細胞について、ウエスタンブロット法
(Western blot analysis)により解析したところ、約８
０キロダルトンのバンドが検出された。

【００３０】

【発明の効果】本発明により提供されるＯＳＦ−５は、
骨代謝性疾患の治療剤として用いることができ、また、
骨に対する臓器特異性が高いので骨代謝性疾患の診断剤
として用いることもできる。

【００３１】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：3728 配列の型：核酸鎖の数：二重鎖トポロジー：直線状配列の種類：cDNA to mRNA 起源：生物名：マウス（Mus musculus）株名：骨芽細胞株 MC3T3E1 配列の特徴：配列 GAATTCGCGG CCGCCTGCCA CCCAAGTCCC TGCTCAAGCC CGCCCGGCTC CCGCGCGTGC 60 CCAGAGCC ATG GCT CCA GTG CGC ACC GCA TCC CTG CTC TGC GGC CTC CTG 110 Met Ala Pro Val Arg Thr Ala Ser Leu Leu Cys Gly Leu Leu 1 5 10 GCA CTG CTG ACG CTG TGC CCT GAG GGG AAC CCA CAG ACG GTG CTG ACG 158 Ala Leu Leu Thr Leu Cys Pro Glu Gly Asn Pro Gln Thr Val Leu Thr 15 20 25 30 GAC GAC GAG ATC GAG GAG TTC CTC GAA GGC TTC CTT TCG GAG TTG GAG 206 Asp Asp Glu Ile Glu Glu Phe Leu Glu Gly Phe Leu Ser Glu Leu Glu 35 40 45 ACC CAG TCC CCG CCC CGG GAA GAC GAC GTG GAA GTC CAG CCG CTT CCC 254 Thr Gln Ser Pro Pro Arg Glu Asp Asp Val Glu Val Gln Pro Leu Pro 50 55 60 GAA CCC ACC CAG CGT CCC CGC AAA TCC AAG GCA GGG GGC AAG CAG CGG 302 Glu Pro Thr Gln Arg Pro Arg Lys Ser Lys Ala Gly Gly Lys Gln Arg 65 70 75 GCA GAT GTA GAA GTC CCT CCA GAA AAA AAC AAA GAC AAA GAG AAG AAA 350 Ala Asp Val Glu Val Pro Pro Glu Lys Asn Lys Asp Lys Glu Lys Lys 80 85 90 GGA AAG AAG GAC AAA GGC CCC AAA GCC ACA AAA CCC CTG GAG GGC TCT 398 Gly Lys Lys Asp Lys Gly Pro Lys Ala Thr Lys Pro Leu Glu Gly Ser 95 100 105 110 ACC AGG CCC ACC AAG AAA CCA AAG GAG AAG CCA CCC AAG GCC ACC AAG 446 Thr Arg Pro Thr Lys Lys Pro Lys Glu Lys Pro Pro Lys Ala Thr Lys 115 120 125 AAG CCC AAG GAG AAA CCA CCC AAG GCC ACC AAG AAG CCC AAG GAG AAG 494 Lys Pro Lys Glu Lys Pro Pro Lys Ala Thr Lys Lys Pro Lys Glu Lys 130 135 140 CCA CCC AAG GCC ACC AAG AAG CCT AAG GAG AAG CCA CCC AAG GCC ACT 542 Pro Pro Lys Ala Thr Lys Lys Pro Lys Glu Lys Pro Pro Lys Ala Thr 145 150 155 AAG AGG CCC TCG GCA GGA AAG AAG TTC TCA ACT GTG GCC CCC TTG GAA 590 Lys Arg Pro Ser Ala Gly Lys Lys Phe Ser Thr Val Ala Pro Leu Glu 160 165 170 ACG CTG GAT CGG TTA CTC CCC TCA CCC TCC AAC CCC AGC GCC CAG GAG 638 Thr Leu Asp Arg Leu Leu Pro Ser Pro Ser Asn Pro Ser Ala Gln Glu 175 180 185 190 CTA CCG CAG AAG AGA GAC ACA CCC TTC CCA AAT GCC TGG CAA GGT CAA 686 Leu Pro Gln Lys Arg Asp Thr Pro Phe Pro Asn Ala Trp Gln Gly Gln 195 200 205 GGA GAA GAG ACC CAG GTG GAG GCC AAG CAG CCC CGG CCA GAG CCA GAG 734 Gly Glu Glu Thr Gln Val Glu Ala Lys Gln Pro Arg Pro Glu Pro Glu 210 215 220 GAG GAG ACT GAG ATG CCC ACA CTG GAC TAC AAT GAC CAG ATA GAG AAG 782 Glu Glu Thr Glu Met Pro Thr Leu Asp Tyr Asn Asp Gln Ile Glu Lys 225 230 235 GAG GAT TAC GAG GAT TTT AAG TAC ATC CTT TGC CAG AAG CAG CCC AGG 830 Glu Asp Tyr Glu Asp Phe Lys Tyr Ile Leu Cys Gln Lys Gln Pro Arg 240 245 250 CCA ACA CCC AGC AGG AGG AGG CTC TGG CCA GAG CGC CCT GAG GAG AAG 878 Pro Thr Pro Ser Arg Arg Arg Leu Trp Pro Glu Arg Pro Glu Glu Lys 255 260 265 270 ACT GAA GAG CCA GAG GAA AGG AAG GAA GTC GAG CCA CCT CTG AAG CCC 926 Thr Glu Glu Pro Glu Glu Arg Lys Glu Val Glu Pro Pro Leu Lys Pro 275 280 285 CTG CTG CCT CCG GAC TAT GGG GAT AGC TAC GTG ATC CCC AAC TAT GAT 974 Leu Leu Pro Pro Asp Tyr Gly Asp Ser Tyr Val Ile Pro Asn Tyr Asp 290 295 300 GAC TTG GAC TAT TAT TTC CCC CAC CCT CCA CCG CAG AAG CCT GAT GTT 1022 Asp Leu Asp Tyr Tyr Phe Pro His Pro Pro Pro Gln Lys Pro Asp Val 305 310 315 GGA CAA GAG GTG GAT GAG GAA AAG GAA GAG ATG AAG AAG CCC AAA AAG 1070 Gly Gln Glu Val Asp Glu Glu Lys Glu Glu Met Lys Lys Pro Lys Lys 320 325 330 GAG GGT AGT AGC CCC AAG GAG GAC ACA GAG GAC AAG TGG ACC GTG GAG 1118 Glu Gly Ser Ser Pro Lys Glu Asp Thr Glu Asp Lys Trp Thr Val Glu 335 340 345 350 AAA AAC AAG GAC CAC AAA GGG CCC CGG AAG GGT GAG GAG CTG GAG GAG 1166 Lys Asn Lys Asp His Lys Gly Pro Arg Lys Gly Glu Glu Leu Glu Glu 355 360 365 GAG TGG GCG CCA GTG GAG AAA ATC AAG TGC CCA CCT ATT GGG ATG GAG 1214 Glu Trp Ala Pro Val Glu Lys Ile Lys Cys Pro Pro Ile Gly Met Glu 370 375 380 TCA CAC CGC ATT GAG GAC AAC CAG ATC CGT GCC TCC TCC ATG CTG CGC 1262 Ser His Arg Ile Glu Asp Asn Gln Ile Arg Ala Ser Ser Met Leu Arg 385 390 395 CAC GGC CTC GGA GCC CAG CGG GGC CGG CTC AAC ATG CAG GCT GGT GCC 1310 His Gly Leu Gly Ala Gln Arg Gly Arg Leu Asn Met Gln Ala Gly Ala 400 405 410 AAT GAA GAT GAC TAC TAT GAC GGG GCA TGG TGT GCT GAG GAC GAG TCG 1358 Asn Glu Asp Asp Tyr Tyr Asp Gly Ala Trp Cys Ala Glu Asp Glu Ser 415 420 425 430 CAG ACC CAG TGG ATC GAG GTG GAC ACC CGA AGG ACA ACT CGG TTC ACG 1406 Gln Thr Gln Trp Ile Glu Val Asp Thr Arg Arg Thr Thr Arg Phe Thr 435 440 445 GGC GTC ATC ACT CAG GGC CGT GAC TCC AGC ATC CAT GAC GAC TTC GTG 1454 Gly Val Ile Thr Gln Gly Arg Asp Ser Ser Ile His Asp Asp Phe Val 450 455 460 ACT ACC TTC TTT GTG GGC TTC AGC AAT GAC AGC CAG ACC TGG GTG ATG 1502 Thr Thr Phe Phe Val Gly Phe Ser Asn Asp Ser Gln Thr Trp Val Met 465 470 475 TAC ACC AAT GGC TAC GAG GAA ATG ACC TTC TAT GGA AAT GTG GAC AAG 1550 Tyr Thr Asn Gly Tyr Glu Glu Met Thr Phe Tyr Gly Asn Val Asp Lys 480 485 490 GAC ACA CCT GTG CTG AGC GAG CTC CCT GAG CCA GTT GTG GCC CGT TTC 1598 Asp Thr Pro Val Leu Ser Glu Leu Pro Glu Pro Val Val Ala Arg Phe 495 500 505 510 ATC CGC ATC TAT CCA CTC ACC TGG AAC GGT AGC CTG TGC ATG CGC CTG 1646 Ile Arg Ile Tyr Pro Leu Thr Trp Asn Gly Ser Leu Cys Met Arg Leu 515 520 525 GAG GTG CTA GGC TGC CCC GTG ACC CCT GTC TAC AGC TAC TAC GCA CAG 1694 Glu Val Leu Gly Cys Pro Val Thr Pro Val Tyr Ser Tyr Tyr Ala Gln 530 535 540 AAT GAG GTG GTA ACT ACT GAC AGC CTG GAC TTC CGG CAC CAC AGC TAC 1742 Asn Glu Val Val Thr Thr Asp Ser Leu Asp Phe Arg His His Ser Tyr 545 550 555 AAG GAC ATG CGC CAG CTG ATG AAG GCT GTC AAT GAG GAG TGC CCC ACA 1790 Lys Asp Met Arg Gln Leu Met Lys Ala Val Asn Glu Glu Cys Pro Thr 560 565 570 ATC ACT CGC ACA TAC AGC CTG GGC AAG AGT TCA CGA GGG CTC AAG ATC 1838 Ile Thr Arg Thr Tyr Ser Leu Gly Lys Ser Ser Arg Gly Leu Lys Ile 575 580 585 590 TAC GCA ATG GAA ATC TCA GAC AAC CCT GGG GAT CAT GAA CTG GGG GAG 1886 Tyr Ala Met Glu Ile Ser Asp Asn Pro Gly Asp His Glu Leu Gly Glu 595 600 605 CCC GAG TTC CGC TAC ACA GCC GGG ATC CAC GGC AAT GAG GTG CTA GGC 1934 Pro Glu Phe Arg Tyr Thr Ala Gly Ile His Gly Asn Glu Val Leu Gly 610 615 620 CGA GAG CTC CTG CTC CTG CTC ATG CAA TAC CTA TGC CAG GAG TAC CGC 1982 Arg Glu Leu Leu Leu Leu Leu Met Gln Tyr Leu Cys Gln Glu Tyr Arg 625 630 635 GAT GGG AAC CCG AGA GTG CGC AAC CTG GTG CAG GAC ACA CGC ATC CAC 2030 Asp Gly Asn Pro Arg Val Arg Asn Leu Val Gln Asp Thr Arg Ile His 640 645 650 CTG GTG CCC TCG CTG AAC CCT GAT GGC TAT GAG GTG GCA GCG CAG ATG 2078 Leu Val Pro Ser Leu Asn Pro Asp Gly Tyr Glu Val Ala Ala Gln Met 655 660 665 670 GGC TCA GAG TTT GGG AAC TGG GCA CTG GGG CTG TGG ACT GAG GAG GGC 2126 Gly Ser Glu Phe Gly Asn Trp Ala Leu Gly Leu Trp Thr Glu Glu Gly 675 680 685 TTT GAC ATC TTC GAG GAC TTC CCA GAT CTC AAC TCT GTG CTC TGG GCA 2174 Phe Asp Ile Phe Glu Asp Phe Pro Asp Leu Asn Ser Val Leu Trp Ala 690 695 700 GCT GAG GAG AAG AAA TGG GTC CCC TAC AGG GTC CCA AAC AAT AAC TTG 2222 Ala Glu Glu Lys Lys Trp Val Pro Tyr Arg Val Pro Asn Asn Asn Leu 705 710 715 CCA ATC CCT GAA CGT TAC CTG TCC CCA GAT GCC ACG GTC TCC ACA GAA 2270 Pro Ile Pro Glu Arg Tyr Leu Ser Pro Asp Ala Thr Val Ser Thr Glu 720 725 730 GTC CGG GCC ATT ATT TCC TGG ATG GAG AAG AAC CCC TTT GTG CTG GGT 2318 Val Arg Ala Ile Ile Ser Trp Met Glu Lys Asn Pro Phe Val Leu Gly 735 740 745 750 GCA AAT CTG AAC GGT GGT GAG CGG CTT GTG TCT TAT CCC TAT GAC ATG 2366 Ala Asn Leu Asn Gly Gly Glu Arg Leu Val Ser Tyr Pro Tyr Asp Met 755 760 765 GCC CGG ACA CCT AGC CAG GAG CAG CTG TTG GCC GAG GCA CTG GCA GCT 2414 Ala Arg Thr Pro Ser Gln Glu Gln Leu Leu Ala Glu Ala Leu Ala Ala 770 775 780 GCC CGC GGA GAA GAT GAT GAC GGG GTG TCT GAG GCC CAG GAG ACT CCA 2462 Ala Arg Gly Glu Asp Asp Asp Gly Val Ser Glu Ala Gln Glu Thr Pro 785 790 795 GAT CAC GCT ATT TTC CGC TGG CTG GCC ATC TCA TTT GCC TCC GCC CAT 2510 Asp His Ala Ile Phe Arg Trp Leu Ala Ile Ser Phe Ala Ser Ala His 800 805 810 CTC ACC ATG ACG GAG CCC TAC CGG GGA GGG TGC CAG GCC CAG GAC TAC 2558 Leu Thr Met Thr Glu Pro Tyr Arg Gly Gly Cys Gln Ala Gln Asp Tyr 815 820 825 830 ACC AGC GGC ATG GGC ATT GTC AAC GGG GCC AAG TGG AAT CCT CGC TCT 2606 Thr Ser Gly Met Gly Ile Val Asn Gly Ala Lys Trp Asn Pro Arg Ser 835 840 845 GGG ACT TTC AAT GAC TTT AGC TAC CTG CAC ACA AAC TGT CTG GAG CTC 2654 Gly Thr Phe Asn Asp Phe Ser Tyr Leu His Thr Asn Cys Leu Glu Leu 850 855 860 TCC GTA TAC CTG GGC TGT GAC AAG TTC CCC CAC GAG AGT GAG CTA CCC 2702 Ser Val Tyr Leu Gly Cys Asp Lys Phe Pro His Glu Ser Glu Leu Pro 865 870 875 CGA GAA TGG GAG AAC AAC AAA GAA GCG CTG CTC ACC TTC ATG GAG CAG 2750 Arg Glu Trp Glu Asn Asn Lys Glu Ala Leu Leu Thr Phe Met Glu Gln 880 885 890 GTG CAC CGT GGC ATT AAG GGT GTG GTG ACA GAT GAG CAA GGC ATC CCC 2798 Val His Arg Gly Ile Lys Gly Val Val Thr Asp Glu Gln Gly Ile Pro 895 900 905 910 ATT GCC AAT GCC ACC ATC TCT GTG AGT GGC ATC AAC CAT GGT GTG AAG 2846 Ile Ala Asn Ala Thr Ile Ser Val Ser Gly Ile Asn His Gly Val Lys 915 920 925 ACA GCA AGT GGA GGT GAC TAC TGG CGC ATT CTG AAC CCG GGT GAG TAC 2894 Thr Ala Ser Gly Gly Asp Tyr Trp Arg Ile Leu Asn Pro Gly Glu Tyr 930 935 940 CGT GTG ACA GCT CAC GCA GAG GGC TAC ACC TCA AGT GCC AAG ATC TGC 2942 Arg Val Thr Ala His Ala Glu Gly Tyr Thr Ser Ser Ala Lys Ile Cys 945 950 955 AAT GTG GAC TAC GAT ATT GGG GCC ACT CAG TGC AAC TTC ATC CTG GCT 2990 Asn Val Asp Tyr Asp Ile Gly Ala Thr Gln Cys Asn Phe Ile Leu Ala 960 965 970 CGA TCC AAC TGG AAG CGC ATT CGG GAG ATC TTG GCT ATG AAC GGG AAC 3038 Arg Ser Asn Trp Lys Arg Ile Arg Glu Ile Leu Ala Met Asn Gly Asn 975 980 985 990 CGT CCC ATT CTC GGA GTT GAC CCC TCA CGA CCC ATG ACC CCC CAG CAG 3086 Arg Pro Ile Leu Gly Val Asp Pro Ser Arg Pro Met Thr Pro Gln Gln 995 1000 1005 CGG CGC ATG CAG CAG CGC CGT CTA CAG TAC CGG CTC CGC ATG AGG GAA 3134 Arg Arg Met Gln Gln Arg Arg Leu Gln Tyr Arg Leu Arg Met Arg Glu 1010 1015 1020 CAG ATG CAA CTG CGT CGC CTC AAT TCT ACC GCA GGC CCT GCC ACA AGC 3182 Gln Met Gln Leu Arg Arg Leu Asn Ser Thr Ala Gly Pro Ala Thr Ser 1025 1030 1035 CCC ACT CCT GCC CTT ATG CCT CCC CCT TCC CCT ACA CCA GCC ATT ACC 3230 Pro Thr Pro Ala Leu Met Pro Pro Pro Ser Pro Thr Pro Ala Ile Thr 1040 1045 1050 TTG AGG CCC TGG GAA GTT CTA CCC ACT ACC ACT GCA GGC TGG GAG GAG 3278 Leu Arg Pro Trp Glu Val Leu Pro Thr Thr Thr Ala Gly Trp Glu Glu 1055 1060 1065 1070 TCA GAG ACT GAG ACC TAT ACA GAA GTA GTG ACA GAG TTT GAG ACA GAG 3326 Ser Glu Thr Glu Thr Tyr Thr Glu Val Val Thr Glu Phe Glu Thr Glu 1075 1080 1085 TAT GGG ACT GAC CTA GAG GTG GAA GAG ATA GAG GAG GAG GAG GAG GAG 3374 Tyr Gly Thr Asp Leu Glu Val Glu Glu Ile Glu Glu Glu Glu Glu Glu 1090 1095 1100 GAG GAG GAA GAG ATG GAC ACA GGC CTT ACA TTT CCA CTC ACA ACA GTG 3422 Glu Glu Glu Glu Met Asp Thr Gly Leu Thr Phe Pro Leu Thr Thr Val 1105 1110 1115 GAG ACC TAC ACA GTG AAC TTT GGG GAC TTC TGA GACTGGGATC TCAAAGCCCT 3475 Glu Thr Tyr Thr Val Asn Phe Gly Asp Phe *** 1120 1125 GCCCAATTCA AACTAAGGCA GCACCTCCCA AGCCTGTGCC AGCAGACACA TAGCCATCAG 3535 ATGTCCCTGG GGTGGACCCC ACTCCCCCAG TGTGGGACAT CAAAGCTACC GGGACTCTGC 3595 ATAGACTCTG GTCTACCCGC CCCAGCTCTT ACCTGCCAGC CTTTGGGGGA GGGGCAGGCA 3655 AAGGAAGCCA ACGTTCAACA TCAATAAAAC CAAGCTCATG ACACCAAAAA AAAAAAAAAG 3715 CGGCCGCGAA TTC 3728

【００３２】配列番号：２配列の長さ：21 配列の型：核酸鎖の数：一重鎖トポロジー：直線状配列の種類：他の核酸起源：なし生物名：なし株名：なし配列の特徴：リンカーDNA。配列番号3と相補的配列。
名称「ATOS-1」配列 CTCTTGCTTG AATTCGGACT A 21

【００３３】配列番号：３配列の長さ：25 配列の型：核酸鎖の数：一重鎖トポロジー：直線状配列の種類：他の核酸起源：なし生物名：なし株名：なし配列の特徴：リンカーDNA。配列番号2と相補的配列。名
称「ATOS-2」配列 TAGTCCGAAT TCAAGCAAGA GCACA 25

【００３４】配列番号：４配列の長さ：21 配列の型：核酸鎖の数：一重鎖トポロジー：直線状配列の種類：他の核酸起源：なし生物名：なし株名：なし配列の特徴：リンカーDNA。配列番号5と相補的配列。
名称「ATOS-4」配列 CTCTTGCTTA AGCTTGGACT A 21

【００３５】配列番号：５配列の長さ：25 配列の型：核酸鎖の数：一重鎖トポロジー：直線状配列の種類：他の核酸起源：なし生物名：なし株名：なし配列の特徴：リンカーDNA。配列番号4と相補的配列。名
称「ATOS-5」配列 TAGTCCAAGC TTAAGCAAGA GCACA 25

【００３６】配列番号：６配列の長さ：11 配列の型：アミノ酸トポロジー：直線状配列の種類：ペプチド起源：生物名：マウス配列の特徴：OSF-5-1 （抗原ペプチド）存在位置：マウスOSF-5の断片で116番目から126番目ま
で。

【００３７】配列番号：７配列の長さ：15 配列の型：アミノ酸トポロジー：直線状配列の種類：ペプチド起源：生物名：マウス配列の特徴：OSF-5-2 （抗原ペプチド）存在位置：マウスOSF-5の断片で482番目から496番目ま
で。配列 Gly Tyr Gln Gln Met Thr Phe Tyr Gly Asn Val Asp Lys Asp Thr 5 10 15

【００３８】配列番号：８配列の長さ：15 配列の型：アミノ酸トポロジー：直線状配列の種類：ペプチド起源：生物名：マウス配列の特徴：OSF-5-3 （抗原ペプチド）存在位置：マウスOSF-5の断片で557番目から571番目ま
で。配列 Ser Tyr Lys Asp Met Arg Gln Leu Met Lys Ala Val Asp Glu Glu 5 10 15

【００３９】配列番号：９配列の長さ：15 配列の型：アミノ酸トポロジー：直線状配列の種類：ペプチド起源：生物名：マウス配列の特徴：OSF-5-4 （抗原ペプチド）存在位置：マウスOSF-5の断片で701番目から715番目ま
で。配列 Trp Ala Ala Glu Glu Lys Lys Trp Val Pro Tyr Arg Val Pro Asn 5 10 15

【００４０】配列番号：10 配列の長さ：15 配列の型：アミノ酸トポロジー：直線状配列の種類：ペプチド起源：生物名：マウス配列の特徴：OSF-5-5 （抗原ペプチド）存在位置：マウスOSF-5の断片で872番目から886番目ま
で。配列 Pro His Glu Ser Glu Leu Pro Arg Glu Trp Glu Asn Asn Lys Glu 5 10 15

【図面の簡単な説明】

【図１】マウスＯＳＦ−５前駆体タンパク質の構造の模
式図である。ＯＳＦ−５は４つの領域に分けることがで
き、シグナル配列、１１アミノ酸残基からなる４回の繰
り返し配列、細胞膜表面のリン脂質に結合すると考えら
れる血液凝固第ＶＩＩＩ因子様領域、及びカルボキシペ
プチダーゼ様領域である。

【図２】マウスＯＳＦ−５をコードするｃＤＮＡの制限
酵素地図である。太字はＯＳＦ−５のアミノ酸をコード
する領域を示す。但し、ＫｐｎＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｓ
ａｌＩとＸｂａＩサイトは存在しない。

【図３】マウスＯＳＦ−５と他のカルボキシペプチダー
ゼ分子とのアミノ酸比較表である。マウスＯＳＦ−５と
他のカルボキシペプチダーゼ分子に共通なアミノ酸残基
をコンサンサスとして示す。

【図４】図３のマウスＯＳＦ−５と他のカルボキシペプ
チダーゼ分子とのアミノ酸比較表の続きを示す。マウス
ＯＳＦ−５と他のカルボキシペプチダーゼ分子に共通な
アミノ酸残基をコンサンサスとして示す。

【図５】図４のマウスＯＳＦ−５と他のカルボキシペプ
チダーゼ分子とのアミノ酸比較表の続きを示す。マウス
ＯＳＦ−５と他のカルボキシペプチダーゼ分子に共通な
アミノ酸残基をコンサンサスとして示す。

【図６】マウスＯＳＦ−５と他の血液凝固因子のリン脂
質結合領域とのアミノ酸比較表である。マウスＯＳＦ−
５と他の血液凝固因子のリン脂質結合領域に共通なアミ
ノ酸残基をコンサンサスとして示す。

【図７】マウスＯＳＦ−５の組織特異的発現を示す。Ｒ
ＮＡを種々の組織や細胞株から精製し、ＲＮＡドットブ
ロット法により解析したものであり、オートラジオグラ
フィーの結果を示す。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成５年６月４日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図面の簡単な説明

【補正方法】変更

【補正内容】

【図面の簡単な説明】

【図３】マウスＯＳＦ−５と他のカルボキシペプチダー
ゼ分子とのアミノ酸比較図表である。マウスＯＳＦ−５
と他のカルボキシペプチダーゼ分子に共通なアミノ酸残
基をコンサンサスとして示す。

【図４】図３のマウスＯＳＦ−５と他のカルボキシペプ
チダーゼ分子とのアミノ酸比較図表の続きを示す。マウ
スＯＳＦ−５と他のカルボキシペプチダーゼ分子に共通
なアミノ酸残基をコンサンサスとして示す。

【図５】図４のマウスＯＳＦ−５と他のカルボキシペプ
チダーゼ分子とのアミノ酸比較図表の続きを示す。マウ
スＯＳＦ−５と他のカルボキシペプチダーゼ分子に共通
なアミノ酸残基をコンサンサスとして示す。

【図６】マウスＯＳＦ−５と他の血液凝固因子のリン脂
質結合領域とのアミノ酸比較図表である。マウスＯＳＦ
−５と他の血液凝固因子のリン脂質結合領域に共通なア
ミノ酸残基をコンサンサスとして示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ａ６１Ｋ 39/395 Ｎ 9284−4ＣＣ０７Ｋ 13/00 8517−4Ｈ 15/04 8517−4Ｈ 15/06 8517−4ＨＣ１２Ｎ 15/57 ＺＮＡＣ１２Ｐ 21/08 8214−4ＢＧ０１Ｎ 33/53 Ｂ 8310−2Ｊ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列表の配列番号１において、２６番か
ら１１２８番目までのアミノ酸配列を有するＯＳＦ−
５、またはこれのアナログ、またはこれの断片よりなる
タンパク質。
【請求項２】配列表の配列番号１において、１番から
２５番目までのシグナルペプチドを含む、１番から１１
２８番目までのアミノ酸配列を有するＯＳＦ−５前駆体
タンパク質、またはこれのアナログ、またはこれの断片
よりなるタンパク質。
【請求項３】請求項１または２のタンパク質をコード
するＤＮＡまたはＲＮＡ。
【請求項４】哺乳動物のＯＳＦ−５、またはそのアナ
ログ、または断片である組換えタンパク質を産生させる
方法であって、以下の手順を含む方法： (a) 以下のＤＮＡ配列より構成される異種のＤＮＡを
含む細胞集団を得ること。 (ｉ) 当該細胞で機能しうる転写と翻訳をコントロール
する配列。 (ii) 上記のコントロール配列の下に結合した当該組換
えタンパク質をコードするＤＮＡ配列。 (b) 当該細胞集団を当該組換えタンパク質が産生され
る条件下で培養すること。
【請求項５】請求項４のコントロール配列がさらに、
当該組換えタンパク質を細胞外に分泌させるためのシグ
ナルペプチドをコードするＤＮＡを、当該組換えタンパ
ク質をコードするＤＮＡ配列のすぐ上流に位置するよう
に、含むことを特徴とする産生方法。
【請求項６】細胞集団が大腸菌または酵母または哺乳
動物細胞である請求項４または５の産生方法。
【請求項７】請求項３のＤＮＡまたはＲＮＡの全体ま
たはその断片を含む骨代謝性疾患の診断剤。
【請求項８】請求項１のタンパク質を含む骨代謝性疾
患の診断剤。
【請求項９】請求項１のタンパク質に対するポリクロ
ーナル抗体及びモノクローナル抗体。
【請求項１０】請求項９の抗体を含む骨代謝性疾患の
診断剤。
【請求項１１】請求項１のタンパク質を含む骨代謝性
疾患の治療剤。