JPH05506659A - エピテリン類：新規なシステインに富む成長変調タンパク - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

エビテリン類゛新現なシスティンに富む成長変調タンパク■、緒言 本発明は、本出願人が“エビテリン類（Ｅρ１ｔｈｅｌｉｎｓ）”と名付けた新 規な一群の成長調節タンパク類、エビテリン類の調製法、およびその診断並びに 治療における使用に関する。本出願人は天然の細胞源から該エビテリン群の２種 、エビテリンｌおよびエピテリン２を精製し、また数種の異なるエビテリン類を コードするｃＤＮＡを単離した。エビテリン１およびエビテリン２は実質的な構 造上の類似性をもつにもかかわらず、機能的には別々のタンパクである。エビテ リン１は二官能性の成長調節因子であって、幾つかの型の細胞の成長を促進し得 るが、その他の細胞の成育を阻害する。エビテリン２は成長阻害生活性に関して はエビテリン１と機能的に類似している。しかし、逆にエピテリン２は明白にエ ビテリン１の成長促進活性特性を発揮し得す、かつ実際にはこのエビテリン活性 と拮抗する。 ２、　発明の背景 細胞の成長および分化は、促進、阻害および相乗的な因子並び（、こホルモンの 多様性により開始され、促進され、維持されかつ調節されているものと考えられ る。 細胞のホメオスターシスメカニズムの変更および／または破壊が、腫瘍形成を含 む成長−関連疾患の基本的な原因であると思われる。成長調節因子はシグナルの 変換、細胞の連絡、成長並びに発生、胚形成、免疫応答、造血、細胞の生存並び に分化、炎症、組織の治癒並びに改造作用、動脈硬化症および癌を包含する種々 様々な病理学的および生理学的諸過程に関与している。 上皮成長因子（ＥＧＰ）　、）ランスフォーミング成長因子−α（ＴＧＦα）、 血小板由来の成長因子（ＰＤＧＦ＞、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）　、神経成 長因子（ＮＧＦ）　、ｌ−ランスフォーミング成長因子−β（ＴＦＧβ）、イン シュリン成長因子りおよびＩＩ（ＩＧＦＩ。 ＩＧＦ　ＩＩ）　、造血成長因子、例えばエリスロボエチン、コロニー刺激因子 （（：ＳＦ　１ｓよび２）、インターロイキン類（ＩＣ−１〜８）、インターフ ェロン類（ＩＦＮα、β、Ｔ）、腫瘍壊死因子αおよびβ（ＴＮＦ　αおよびβ ）、ロイコレグリン（Ｉｅｕｋｏｒｅｇｕｌｉｎ）、オンコスタチン（ｏｎｃｏ ｓｔａｔｉｎ）　Ｍ、アンフイレグリン（ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ：　ＡＲ） 、および他の充分に定義されていない諸因子などが、正常な生理学的条件下で、 あるいは外因性の刺激に応答して種々の型の細胞により生産される成長並びに分 化変調タンパクである。これら因子の殆どは自己分泌的におよびパラ分泌的様式 で機能すると思われる（例えば、ゴースチン（Ｇｏｕｓｔｉｎ）等のＣａｎｃｅ ｒ　Ｒｅｓ、、　１９８６．４６．　Ｐｌｌ。 １０１５−１０２９；　Ｄ−ゼングールト（Ｒｏｚｅｎｇｕｒｔ）、　５ｃｉｅ ｎｃｅ、　１９８６．２３４．１）Ｉｌｌ、　１６１−１６６：パルディー（Ｐ ａｒｄｅｅ）、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、＋９８７．４７．　ＰＰ、１４８ｇ −１４９１：ザックス９８ｇ−１００２；バギオリニ（Ｂａｇｇ　ｉｏ　Ｉ　ｉ 　ｎ　ｉ）等、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、、　１９８９．８４．　ｐ ＰB １０４５−１０４９；クレメンズ＆マクナーラン（（ｊｅｍｅｎｓ　ａｎｄ　Ｍ ｃＮｕｒｌａｎ）、　ＢｉｏｃｈｅｆｆＩ、　Ｊ、。 Ｌ９８５．２２６．　ｐｐ、　３４５−３６０；ナーザン（Ｎａｔｂａｎ）、　 Ｊ、　１ＴＩｉｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、、　１９８７．７９．@ｐＰ。 ３１９−３２６；　スポーン＆ロパーツ（Ｓｐｏｒｎ　ａｎｄ　Ｒｏｂｅｒｔｓ ＞、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、、　１９８６゜７８、　ｐｐ、　３２ ９−３３２；オールド（Ｏｌｄ＞、　Ｎａｔｕｒｅ、　１９ｇ７．３２６．　Ｐ Ｐ、　３３０−３３１；ブートラ−＆セラミ（Ｂｅｕｔｌｅｒ　ａｎｄ　（：ｅ ｒａｍｉ）、　Ｎｅｗ　ＥｎｇＩ、　ＪｌＭｅｄ、、１９Ｂ７．３１６．　ｐＰ 、　３７９−３８５：ワインシュタイン（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ）、　Ｊ、　Ｃｅ １ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１９８７．３３．　ｐｐ、　２１３−２２４；ツア ーリング（７，ａｒｌｉｎｇ）等、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ ｃｉ、　ＵＳＡ、　１９８７．８３．　ｐｐ。 ９７３９−９７４４　；ショヤブ（Ｓｈｏｙａｂ）等、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ 、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｌｌ５Ａ、　１９８８．８５．P１ｆ＋。 ６５２８−６５３２：ショヤブ等、　５ｃｉｅｎｃｅ、　１９ｇ９．２４３．１ １１１．１０７４−１０７６；スポーン＆トダロ（Ｓｐｏｒｎ　ａｎｄ　Ｔｏｄ ａｒｏ）、　Ｎ−Ｅｎｇｌ−Ｊ、　Ｍｅｄ、、　１９８５．３０３．　ｐｐ、　 ８７８−８８０；スポーン＆ロパーツ（Ｓｐｏｒｎ　ａｎｄ　Ｒｏｂｅｒｔｓ） 、　Ｎａｔｕｒｅ、　１９８５．３１３．　Ｐｌｌ、　７４５−７４７を参照の こと）。 成長変調因子が癌の診断、予後および治療にふける潜在的な用途を有することか ら、該因子の単離、その特徴付は岐びにその機能的メカニズムの明確化には非常 な興味がある。更に、これら因子に関する知見を得ることは正常な成長調節の隠 された基本的メカニズムの理解並びに癌細胞におけるその喪失を理解する上で大 きな助けとなる。 ３、発明の概要 本発明はエビテリン、即ち新規な一群の低分子量の、システィンに富むタンパク を提供することにあり、該タンパクは二官能性の成長調節活性を示す。また、本 発明は該エビテリンのヒト疾病の診断並びに治療における使用および生物学的に 活性なエピテリンの製造方法を提供することをも目的とする。該エピテリン群の ２種、即ちエビテリン１およびエピテリン２は見掛けの等質性にまで同定かつ精 製さね、その結果本出願人はこれら新規な成長変凱子の一次構造、物理的特性お よび機能的特徴を決定することができた。該エビテリン群中の他の数種のエビテ リンがＣ口ＮＡクローニングにより同定された。エビテリン１は５６個のアミノ 酸を含むポリペプチドであり、一方エビテリン２は５７個のアミノ酸を含む。構 造的にはエビテリン１とエピテリン２とはアミノ酸レベルで４７％の相同性を有 し、かつ各々は同等に配置されたンステイン残基を有する。 エビテリン類は天然源からの単離および精製により、化学的合成により、あるい は組み変えＤＮＡ技術により製造できる。本明細書において実施例として更に充 分に記載される（第６節以降）本発明の特定の態様によれば、エビテリンＬおよ びエビテリン２はラットの腎組織から単離さね、その後ゲル浸透および逆相高速 液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ［：）の組み合わせにより見掛けの等質性にま で精製される。第６節以降で更に記載されるように、本出願人はエビテリン１お よび２の構造、物理、化学的並びに機能的な諸特徴に関して充分な特徴付けを行 った。 ４、

【図面の簡単な説明】

第１図は粗抽畠物の分取ゲル浸透）ＩＰＬＣの結果を示した図である。 第２図は第１図の２８の実験からのプールした画分２５〜２８の分取逆相）ＩＰ ＬＣの結果を示した図である。 第３図は第２図からのプールした画分５５〜５９の半一分取逆相１（ＰＬＣの結 果を示した図である。 第４図は前の実験からのプール１ｂの解析的逆相ＨＰＬＣの結果を示した図であ る。 第５図は第３図からのプール２ｂの解析的逆相ＨＰＬＣの結果を示した図である 。 第６図は第４図からの濃縮した画分５１（Ａ）および５２　（Ｂ）の解析的ゲル 浸透クロマトグラフィーの結果を示した図である。 第７図は第５図からの濃縮した画分４４　（Ａ）および４５　（Ｂ）の解析的ゲ ル浸透クロマトグラフィーの結果を示した図である。 第８図は第２図からの画分５０〜５４の半一分取逆相ＨＰＬＣの結果を示す図で ある。 第９図は前の実験からの両分１８〜２３の解析的逆相■ＰＬｃの結果を示す図で ある。 ’ＪＥＩＯ図は第９図からの両分の解析的ゲル浸透クロマトグラフィーの結果を 示した図であり、クロマトグラフィーは第６．１節以降に記載のように実施した 。（Ａ）濃縮画分３６０ＨＰＬＣ；　（Ｂ）濃縮画分３７のＨＰＬＣ；　（Ｃ） 濃縮画分３８のＨＰＬＣ；　（Ｄ）　Ａ−Ｃからのプールした両分４８および４ ９を再度クロマトグラフィーにかけ、次いで濃縮した。 第１１図はエビテリン１およびエピテリン２のトリセン（Ｔｒ　１ｃｅｎｅ）　 −５ＯＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す図である。パイオーラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ ）　ミニ−タンパク１１電気泳動装置内で１８％のミニゲル（０，７５ｍａ　Ｘ 　ｌ０ＣＩＩ　Ｘ　７ＣＩ１１）を室温にて、一定の電位９０Ｖにて１５時間実 験した。乾燥試料を１０μｌの試料バッファー（５０ｎＭ　）　ＩＪス、ｐＨ６ ，８；１２％（ｗ／ｖ）グリセロール：４％ＳＯ５，４％（Ｖ／Ｖ）メルカプト エタノールおよび０．０１％セルバブル−（ｓｅｒｖａ　ｂｌｕｅ）Ｇ）中に懸 濁し、９５℃にて５分間インキュベートし、次いで該ゲル上に適用した。分子量 マーカーは、シアノゲンブロミド（シグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈａｓ、 　Ｃｏ、）による馬心臓のミオグロビンの開裂により得た５種のポリペプチドで あった。（Ａ）：エビテリン１、（Ｂ）：エビテリン２゜第１２図はラットの腎 臓から精製したエピテリン１およびエビテリン２のアミノ酸配列であり、アミノ 酸に対する標準的単一文字コードを使用した。即ち、アラニン（Ａ）　；アルギ ニン（Ｒ）　；アスパラギン（Ｎ）　；アスパラギン酸（Ｄ）；システィン（Ｃ ）　；グルタミン（Ｑ）；グルタミン酸（Ｅ）ニゲリシン（Ｇ）：ヒスチジン（ Ｈ）；イソロイシン（Ｉ）；ロイシン（Ｌ）：リジン（Ｋ）；メチオニン（Ｍ） 　；フェニルアラニン（Ｆ）；プロリン（Ｐ）；セリン（Ｓ）　；スレミニン（ Ｔ）　；　ｌ−リブトファン（ｗ）；チロシン（Ｙ）　；およびバリン（Ｖ）。 オリゴヌクレオチドブライマーおよびプローブを設計するのに使用したペプチド 配列は下線を施して示した。 第１３図はエビテリン１および２のバイトロバシー分析（カイト＆トウーリトル （Ｋｙｔｅ　ａｎｄ口ｏｏｌｉｔｔｌｅ））の結果を示す図であり、−二エピテ リン１；−−−：エビテリン２゜ 第１４図は、Ａ４３１細胞のＤＮＡへの１２５１−デオキシウリジノ組込みの阻 害に関するエビテリン１およびエビテリン２のドーズ応答曲線である。・：エビ プリン１：○：エビテリン２゜ 第１５図において、（Ａ）は二十日ネズミケラチノサイトセルラインＢａ１ｂ／ ＭＫのＤＮＡへの１２５１−デオキシウリジン組込みの促進に及ぼすエビテリン １およびエビテリン２の効果を示す。５％の透析ＦＢＳを含む低カルシウム培地 中の２．０００〜４、０００個の細胞で、９６ウエルプレートの１ウエルにつき 被覆した。次いで、第６．２節以降に記載の如＜　ＧＳＡアッセイを実施した。 ・：エビテリン１：○：エピテリン２゜（Ｂ）はエビテリン１　（２０ｎｇ／ｍ ｌ）により誘発されたＢａ１ｂ／Ｍに細胞の［ｌＮＡへの１２５１−デオキシウ リジン組込みに及ぼす種々の濃度のエビテリン２の効果を示す図である。 第１６図において、（Ａ）はＢａ１ｂ／ＭＫ細胞の成長に及ぼすエピテリン１お よび上皮成長因子（ＥＧＦ）の効果を示す図であり、このアッセイは第６．２節 以降に記載の如〈実施した。・：エビテリンｌ；Ｏ：ＥＧＰ、また（Ｂ）は二十 日ネズミケラチノサイトのエビテリン１　（２０ｎｄｍｌ）により誘発された成 長に及ぼす種々の濃度のエビテリン２０作用を示す図である。 第１７図は、ＴＦＧβ（ｌｏｇ／ｍｌ）の存在下での、軟質寒天培地中でのＮＲ に一５Ａ６細胞コロニー形成に及ぼすエビテリン１および２の作用を示す図であ る。使用したコロニー形成アッセイは第６．１３節以降に記載しである。黒塗り バー：エピテリン１；点描バー：土皮戊長因子：白抜きバー：エピテリン２；斜 線を施したバー＝２Ｏｎ３／ｍｌのエビテリンＬ　＋５００１１に／ＩＩ＋のエ ピテリン２゜第１８図はラットエビテリン先駆体ｃＤＮＡｊ；よび推定されたア ミノ酸配列を示す図である。 第１９図はエピテリン自体と比較した、該５８９アミノ酸ラツト工ピテリン先駆 体の点描マ１−ＩＪックス配列を示す図である。各点は１０個の同等な残基中の ５個の伸張（ｓｔｒｅｔｃｈ）を表す。 第２０図において、（Ａ）はラットエピテリン先駆体の複合二次構造分析の結果 を示し、（Ｂ）はラットエビテリン先駆体のバイトロバシーの結果を示す。　第 ２１図において、（Ａ）はＣＤＮＡクローンから推定したヒト、ラットおよびマ ウスエビテリン先駆体のタンパク配列を比較した結果を示し、該配列は単一文字 コードを使用して表示してあり、同一の残基は点で示した。最適の配列を得るた めに間隙を設け、これらはダッシュで示した。この予想されたラフトエビテリン のシグナル配列は下線を付して示し、７個のシスティンに富む特徴部分を四角で 囲んだ。各配列はヒト、ラットまたはマウス腎１１ＲＮＡから単離したＣＤＮＡ およびＰＣＲクローンに基づく共通部分を表している。矢印は、−匹のラットの ｃＤＮＡクローンには存在しない領域である、２３４　ｂｐニゲリシン境界を示 す。また、（Ｂ）はラット、マウスおよびヒトエピテリン類のアミノ酸配列を示 す図である。更に、（Ｃ）は一致するシスティン特徴部分が該エビテリン類にお いて保存されていることを示す。（Ｄ）は第２２図はヒトエピテリン先駆体のヌ クレオチドおよび推定されたアミノ酸配列を示す。該配列はヒト腎臓中心部ＲＮ ＡからのＰＣＲクローンに基づく。 第２３図はマウスエビテリン先駆体のヌクレオチドおよび推定されたアミノ酸配 列を示す。ＰＣＲクローンは成熟マウス腎臓ＲＮＡから得た。 第２４図はウシエピテリン先駆体のヌクレオチドおよび推定されたアミノ酸配列 （部分配列）を示す。該配列はウシ精巣ＲＮＡから得たＰＣＲクローンに基づく ものである。 第２５図は鶏エピテリン先駆体のヌクレオチドおよび推定されたアミノ酸配列（ 部分配列）を示す。該配列は鶏輸卵管ＲＮＡから得たＰＣＲクローンに基づくも の−に基づく発現構築物でトランスフェクションされたＣＯ８細胞からの３ＳＳ −システイノ標識上澄を示し、該発現構築物はレーン１：完全ラフトエピテリン コード領域を含むｃｒＥＰＮｌ、　６　；レーン２　：　２３４　ｂρニゲリシ ン含まないラットエビテリンｃＤＮＡイソ型を含むｃｒｔ！ＰＮ１．４　；およ びレーン３：擬似トランスフェクション（ｍｏｃｋ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ） コントロール。（Ｂ）は以下のｃＤＭ８発現構築物でトランスフェクションされ たＣＯ３細胞からのｊｓｓ−システィノ標識上澄を示し、該発現構築物はレーン １：成熟ラフトエビテリン１の該コード領域に先行するサルのＴＧＦ−β１シグ ナル配列を含むＣβｒＥＰＮ１；レーン２：ラットエビテリン２に基づく同様な プラスミドｃｉ３ｒＥＰＨ２゜ 第２７図はラット、マウスおよびヒト源かちのエピテリンのシスティンに富む特 徴部分間のクラスター解析のデンドログラム表示である。下方の図は該エビテリ ンブリカーサ内の７個の特徴部分の位置を示す、該先駆体の図である。クラスタ ル（ＣＬＩＩＳＴＡＬ）多重配ダｌプログラムを使用して、Ｐ［ＧＥＮＢ（カリ フォルニア州、マウンテンビューのインテリグネテイソクス社（Ｉｎｔｅｌｌｉ ｇｎｅｔｉｃｓ、　Ｉｎｃ、））上に２８個のシスティンに富む特徴部分が整列 した。対の類似性のカウントを差異マドＩＪックスに変形し、これをクラスタ分 析のワーズ（Ｗａｒｄ’ｓ＞法により解析した（ＳＰＳＳ／ＰＣ＋　；イリノイ 、シカゴ）。この方法では、分岐点を配置するために二乗したエフリブアン（Ｅ ｃｌｉｄｅａｎ）距離を使用する。 ５、　発明の詳細な説明 本発明は、「エビテリン」と命名した新規な一群の成長調節タンパクに関連する 。このエピテリンは有意な構造上の相同性をもつ数種の別々の構成員を含むよう に思われる。該エピテリン群の２つの構成員、エビテリン１および２は天然源か ら精製さね、かつこれらをコードするｃＤＮＡおよび該エビテリン群の他の構成 員も特にラット、ヒト、ウシ、二十日ネズミオよび鶏から単離された。 より詳しく言えば、本発明は該エビテリン群の各々のおよび全ての構成員、エビ テリン誘導体並びに類似体、エビテリンーコード核酸分子（例えば、ｃＤＮＡ、 ゲノＡＩＩＮＡ　、　ＲＮＡ　、アンチセンスＲＮＡ等）伝統的なおよび組み換 え［ｌＮＡに基づくエビテリンの製造法、組み換えエビテリン発現ベクター、お よび成熟および先駆体エピテリ人工ビテリンーコード核酸分子、抗−エビテリン 抗体およびエビテリンレセブターの診断および／または治療上の利用に関する。 ５．１．　エピテリン類の製造 個々のエビテリンは、天然源からの単離、固相ペプチド合成、および組み換えＤ ＮＡ技術を包含する幾つかの一般的方法によって製造できる。 ５、１．１．　天然細胞源からのエピテリンの単離および精製出願人のＤＮＡク ローニングに関する努力は種々のエビテリンをコードするａ＋ＲＮＡが広い種の 範囲の多数の異なる細胞型において発現されることを明らかにした。 その結果、出願人等は該エビテリン群の個々の構成員が広範な器官、組ｍＬｉ６ よび／または他の細胞源から単離できるものと予想した。該エビテリン類は相互 に分離でき、かつクロマトグラフィー技術（例えば、逆相液体、ゲル浸透、液体 交換、イオン交換、サイズ排除、ｋよびアフィニティークロマトグラフィー）、 遠心分離、電気泳動法、示差溶解度法などを包含する（但し、これらに制限され ない）当分野で公知の分離および精製技術を使用して、かかる細胞源から精製で きる。 第６０節以降において実施例としてより充分に記載される本発明の特定の態様で は、該エビテリン群の２種の構成員（エビテリン１および２）がラット腎臓組織 から単離され、引き続き特にゲル浸透右よび逆相高速液体クロマトグラフィー（ ＨＰＬ（：）の組み合わせを利用して見掛は上の等質性にまで精製された。この ようにして精製されたエビテリンＬおよび２はそれぞｔＬ５６および５７アミノ 酸残基を含む一本鎖ポリペプチドであり、有意の構造上の緒特性を有している。 機能的には、エビテリン１は真の二官能性の成長変調因子であって、細胞成長を 促進し、かつ阻害することができる。エビテリン２は、これが特異的にエピテリ ン１により誘発された細胞成長促進活性と拮抗するという理由から、機能的には 異なるものと思われる。一般的には程度は低いが、エビテリン１と同様に、エビ テリン２も細胞の成長を阻害できる。エビテリン１および２の機能、構造、物理 的並びに他の緒特性を決定し、第６．を節以降に記載した。第６９節以降に記載 する精製エビテリンＩおよび２の６一段階調製法ふよび／またはその変法も該エ ピテリン群の他の構成員を単離するのに使用できる。 ５、１．２．　エピテリン類の化学的合成波エビテリン群の個々の構成員は化学 的方法を利用して製造でき、その対応するアミノ酸配列全体またはその部分を合 成できる。例えば、エピテリンは固相技術（スチュアート＆ヤング（Ｓｔｅｗａ ｒｔ　ａｎｄ　Ｙｏｕｎｇ）、固相ペプチド合成（Ｓｏｌｉｄ　ＰｈａｓｅＰｅ ｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ）、　１９８４．第２版）により合成できる。 このようにして合成されたエピテリンの精製および／またはその生物学的に活性 な高次構造への再折り畳みは当業界で公知の種々の方法により達成できる。該合 成エビテリン類のアミノ酸組成はアミノ酸分析により確認できる。 ５、１．３．　組み換えＩＩＮＡ技術を利用したエピテリン類の合成生物学的に 活性な成熟および先駆体エピテリン類は組み換え宿主細胞系内でのエビテリンー コードＤＮＡの発現により製造できる。遺伝子配列を単離するための一般的技術 、コード化タンパクを合成し得るベクターの構築、および生物学的に活性な組み 換えタンパクの発現および／または分泌は当分野で周知である。 組み換えＤＮＡ技術を利用したエビテリンの製造は記載上の目的で４一段階の工 程に分類できる。即ち、（１）該エビテリンの先駆体または成熟体のための該コ ード配列（遺伝子）の単離または生成、（２）所定のエピテリンの合成を可能き する発現ベクターの構築、（３）該エビテリン遺伝子を複製および発現できる適 当な宿主細胞のトランスフェクションまたは形質転換および／または該遺伝子生 成物の処理による該所定のエビテリンの製造、および（４）該所定のエピテリン 生成物の同定および精製の４一段階に分離できる。 ラットエビテリン先駆体、その発現、および成熟ラットエピテリン１および２の 発現は第７１節以降に示される実施例で記載する。 ５、　］、、　３．１．　エビテリン遺伝子の単離または生成種々の個々のエピ テリン、またはその機能的な等傷物のヌクレオチドコード配列は、所定のエビテ リン生成物を発現するであろう組み換え発現ベクターの構築に使用できる。エビ テリンコードヌクレオチド配列は、エビテリノ一様の活性を示すあるいはエビテ リンをコードするａ＋ＲＮＡを発現する種々の細胞源から得ることができる。本 出願人等はこの点に関連して、幾つかの適当なヒトおよび二十日ネズミの組織源 、例えば胎盤、結腸、腎臓、精巣、副腎、胸部、卵巣、十二指腸、胸腺、および 肺組織（但し、これらに制限されない）を同定した。 エビテリンコード配列はかかる細胞源から単離しかつ精製したＲＮＡからｃＤＮ Ａクローニングにより、あるいはゲノムクローニングにより得ることができる。 クローンのｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーの何れかが当分野で周知の技術を 使用して！！ｌ！１１でき、また既知のエビテリン１または２のアミノ酸配列お よび／または該エビテリン遺伝子の任意の部分に実質的に相補的であるアミノ酸 配列から設計したヌクレオチドプローブを使用して、特定のエビテリンコードＤ ＮＡについてスクリーニングすることができる。完全な長さのクローン、即ち所 定の先駆体または成熟エピテ？Ｊンの全コード領域を含むクローンを発現ベクタ ーを構築するのに選択することができる。 また、エビテリンコードＤＮＡはその全体または部分を、当分野で標準的な技術 を利用して化学的合成法により合成できる。 ヌクレオチドコード配列の固有の縮退のために、実質的に同一のあるいは機能的 に等価なアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列を本発明の方法の実施のため に利用できる。このようなエビテリンヌクレオチド配列の変更は、同一のまたは 機能的に等価な遺伝子生成物をコードする配列中に生ずる種々のヌクレオチドの 削除、付加、または置換を包含する。この遺伝子生成物は、サイレント変化を生 じ、結果として生活性生成物を形成する該配列内のアミノ蕾残基の削除、付加、 または置換を含むことができる。このようなアミノ酸置換は関与する残基の極性 、電荷、溶解度、親水性、疎水性、および／または両親媒性における類似性を基 にして行うことができる。例えば、負に帯電したアミノ酸はアスパラギン酸およ びグルタミン酸を含み、正に帯電したアミノ酸はリジンおよびアルギニンを含み 、類似する親水性値をもつ非帯電極性基または無極性基を存するアミノ酸はロイ シン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン 、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、チロシンヲ含ム。 ５、１．３．２．　エピテリン発現ベクターの構築種々のエピテリンの生物学的 に活性な成熟体または先駆体を発現するためには、高いレベルの転写並びに翻訳 のみならず、該遺伝子生成物の正Ｍな処理をもたらす発現ベクター／宿主系を選 択しなければならない。このことは、該発現構築物のエビテリン先駆体の全コー ド配列を使用する場合には特に重要である。というのは、咳エピテリン類の成熟 体が細胞処理工程を介して大きな先駆体から誘導される可能性があるからである 。 当業者は、種々の動物／宿主発現ベクター系（即ち、適当な宿主細胞中のエビテ リンコード配列の複製、転写および翻訳に必要な要素を含むベクター）を同様に 首尾よく使用することができる。これらの系は、ウィルス発現ベクター／哺乳類 宿主細胞系（例えば、サイトメガロウィルス、ワタシニアウイルス、アデノウィ ルス、等）、昆虫ウィルス発現ベクター／昆虫細胞系（例えば、バキュロウィル ス）、哺乳動物細胞のゲノム由来の非ウィルスプロモータ発現系（例えば、マウ スメタロチオニン（ａ＋ｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）プロモータ）等を包含 するが、これらに制限されない。適当な宿主細胞は哺乳類細胞を包含するが、こ れらに制限されない。例えば、哺乳動物タンパクの一時的発現がＣＯ３細胞宿主 を使用して速成でき、一方安定な発現はＣＨＤ細胞宿主を使用して達成できる。 これらベクターの発現要素はその強度並びに特異性にふいて変化する。使用する 宿主／ベクター系に依存して、多数の適当な転写並びに翻訳要素を使用できる。 例えば、哺乳動物細胞内でクローニングする場合、哺乳動物細胞（例えば、マウ スメタロチオニンブロモータ）のゲノムからの、あるいはこれらの細胞内で成長 するウィルス（例えば、ワタシニアウイルス７．５にプロモータまたはモロニー （Ｍｏｌｏｎｅｙ）二十日ネズミザルコーマウィルスの長い末端繰り返し体）か ら単離したプロモータを使用できる。組み換えＤＮＡにより生成される、または 合成法により生成されるプロモータも該挿入された配列の転写のために利用でき る。 特異的開始シグナルも、挿入されたコード配列の充分な翻訳のために必要である 。これらのシグナルはＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含む。独自の開始コド ンおよび隣接配列を含む完全なエビテリン遺伝子が適当な発現ベクターに挿入さ れた場合には、これ以上の追加の翻訳制御シグナルは必要とされない。しかし、 該コード配列の一部のみが挿入された場合には、該ＡＴＧ開始コドンを含む外因 性の翻訳ル１８シグナルを与える必要がある。更に、開始コドンは該エビテリン コード配列の読み取り枠と一致していて、結果として全インサートの翻訳を保証 する必要がある。これらの外因的翻訳制御シグナルおよび開始コドンは合成方よ び天然両者の種々の起源のものであり得る。発現の効率は転写増幅配列、エンハ ンサ要素等を挿入することにより高めることができる。 ＤＮＡフラグメントをベクター内に挿入するための前に記載した方法の何れかを 利用して、興味のある該エビテリン遺伝子および適当な転写／翻訳制御シグナル えＤＮＡ技術、合成技術およびインビボ組み換え技術を包含する。 例えば、発現ベクターとしてアデノウィルスを使用した場合、エビテリンコード 配列はアデノウィルス転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロモータおよび三つ 感染宿主内でエピテリンを発現できるウィルスゲノムの非−必須領域で行われる 。同様に、ワタシニア７．５にプロモータが使用できる。 エピテリンを発現するのに使用できるもう一つの発現系は昆虫系である。この領 域（例えば、多角体遺伝子（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ　ｇｅｎｅ））にクローン化 でき、ＡｃＮＰＶプロモータ（例えば、多角体プロモータ）の制御下におくこと ができる。エビテリンコード配列の首尾よい挿入は該多角体遺伝子の不活性化お よび非−閉鎖組み換えウィルス（即ち、該多角体遺伝子によりコードされるタン パク質性のコートをもれる。 両種性ウィルス型パッケージングセルライン内で調製されたレトロウィルスベク ターは多くの型の細胞内での効率的な発現を可能とする。この方法は該挿入タン パクコード配列の細胞型特異的プロセッシング、調節または機能を評価すること を可能とする。 更に、挿入された配列の発現を変調し、もしくは所定の様式で該遺伝子生成物を 変性並びにプロセッシングする宿主細胞株を選択することができる。あるプロモ ータからの発現をある誘導物質（例えば、メタロチオネインプロモータに対して は亜鉛およびカドミウムイオン）の存在下で高めることができる。その結果、遺 伝的に操作されたエピテリンの発現を制御できる。このことは、クローン化外来 遺伝子のタンパク生成物が宿主細胞に対して致死的である場合には、重要である 。更に、タンパク生成物の変性（例えば、グリコリル化）およびプロセンシング （例えば、開裂）は該タンパクの機能にとって重要である。種々の宿主細胞が、 タンパクの翻訳後のプロセッシングおよび変性のための特徴的なかつ特異的なメ カニズムを有する。適当なセルラインまたは宿主系を選択することにより、該発 現された外来タンパクの正確な変性およびプロセッシングが保証できる。 組み換えコード配列を含み、生物学的に活性な成熟生成物を発現する宿主細胞を 少なくとも４種の一般的方法、即ち（ａ＞　ＤＮＡ−ＤＮＡ　、ＤＮＡ−１１Ｎ ＡまたはＲＮＡ−アンチセンスＲＮＡハイブリダイゼーション、（ｂ）「マーカ ー」遺伝子機能の有無、（Ｃ）該宿主細胞中でのエビプリンｍＲＮＡ転写物の発 現により測定された転写のレベルの評価、および（ｄ）イムノアッセイにより測 定される！熟遺伝子生成物の検出および後のその生物学的活性により同定できる 。 第一の方法において、発現ベクターに挿入されたエビテリンコード配列の存在は 、該エビテリンコード配列に対して相同のヌクレオチド配列を含むプローブを使 用したＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションにより検出できる。 第二の方法において、該組み換え発現ベクター／宿主系は、ある種の「マーカー 」遺伝子機能（例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質耐性、メトトレキセー ト耐性、形質転換フェノタイプ、バキュロウィルス中での閉鎖体（ｏｃｃｌｕｓ ｉｏｎｂｏｄｙ）の形成等）の有無に基づいて同定し、かつ選ｆｆ１１できる。 例えば、エビテリンコード配列が該ベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入され た場合には、該コード配列を含む組み換え体は該マーカー遺伝子機能の無いこと により同定できる。 また、マーカー遺伝子は、該エビテリンフード配列の発現の制御のために使用し たものと同一または異なるプロモータの制御下で該エビテリン配列と縦列で配置 できる。誘発または選】りに応答する該マーカーの発現は該エビテリンコード配 列の発現を示す。 該第三の方法において、エビテリンコード領域に対する転写活性はハイブリダイ ゼーションアッセイにより評価できる。例えば、ポリアデニル化ＲＮＡは、適当 なエビテリンコード配列またはその特定の部分に対して相同であるプローブを使 用したノーインプロットにより単離かつ解析できる。また、該宿主細胞の全核酸 はかかるプローブとのハイブリダイゼーションに対して抽出並びにアッセイでき る。 該第四の方法においては、該成熟タンパク生成物の発現は免疫学的に、例えばウ ェスタンプロット法、イムノアッセイ、例えばラジオイムノブレンビテーション 法、酵素−結合イムノアッセイ等により評価できる。しかし、該発現系の達成の 最終的なテストは該生物学的に活性なエピテリン遺伝子生成物の検出を包含する 。該宿主細胞が該遺伝子生成物を分泌する場合、培養したトランスフェクタント 宿主細胞から得た細胞を含まない培地がエビテリン活性につきアッセイされる。 該遺伝子生成物が分泌されない場合には、細胞溶解物をかかる活性につきアッセ イできる。何れの場合においても、ここに記載した如き成長阻害および促進アッ セイ等の生物学的アッセイを利用できる。 ５、１．４．　エピテリン誘導体、類似物質およびペプチド本発明では、エビテ リンに関連する誘導体、類似物質およびペプチドの製造並びに使用をも意図して おり、本発明の範囲内にはいる。成長変調活性を示すこのような誘導体、類似物 質およびペプチドにも、種々のエビテリン類と同様に、広範な腫瘍並びに他の成 長関連疾患の診断、予後および治療における用途を見出すことができる。このよ うな誘導体、類似物質またはペプチドは元のエビテリンと比較して高いまたは低 い生物学的活性をもつことができるか、および／またはエビテリン成長阻害活性 （ＣＩＡ）−感受性細胞範囲を拡張または制限でき、これらは依然として本発明 の範囲内にある。同様に、高いまたは低い成長促進活性（ＧＳＡ）をもつ右よび ／またはエビテリンＧ’ＳＡに応答する細胞の範囲を拡張または制限する、エビ テリンに関連する該誘導体、類似物質およびペプチドに対しては、創傷および火 傷の治療を包含する有用な用途を見出すことができるが、これらに限定されない 。 本発明のエビテリン関連誘導体、類似物質およびペプチドは当分野で公知の様々 な手段により製造できる。遺伝子およびタンパクレベルでの手順および操作は本 発明の範囲内にある。 タンパクレベルにおいては、種々の化学的修飾を利用して、エビテリノ一様の誘 導体、類但物質またはペプチドを、当分野で公知の技術、例えばアセチル化、ホ ルミル化、酸化、エンドペプチダーゼ（例えば、シアノゲンブロミド、トリプシ ン、キモトリプシン、ｖ８プロテアーゼ等）またはエキソペプチダーゼによる特 異的化学開裂（但し、これらに制限されない）により製造できた。 ５．２．　抗−エピテリン抗体 エビテリンまたは関連タンパクを認識するポリクローナルおよびモノクローナル 抗体の製造も本発明の範囲内にある。 種々の当分野で公知の方法を使用して、エビテリン類のエピトープに対するポリ クローナル抗体を製造することができる。抗体を製造するためには、種々の宿主 動物、例えばウサギ、マウス、ラット等（但し、これらに制限されない）をエビ テリンまたは合成エビテリンペブテドの注射により感作する。該宿主の種に応じ て、該免疫学的応答性を高めるために様々なアジュバントを使用することができ 、その例はフロイント（完全および不完全）、無機ゲル（例えば、水酸化アルミ ニウム）、界面活性剤（例えば、リゾレシチン）、プルローニー／　り（Ｐｌｕ ｒｏｎｉｃ）ポリオール、ポリアニオン、油エマルション、キーホール（ｋｅｙ ｈｏｌｅ）笠貝ヘモシアニン、ジニトロフェノール、潜在的に有用なヒトアジュ バント、例えばＢＣＧ　（バシルカルメットーゲラン（ｂａｃｉｌｌｅ　Ｃａｌ ｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ））およびコリネバクテリウムバルブム（Ｃｏｒｙｎ ｅｂａｃｔｅｒ　ｉ印ｐａｒｖｕｍ）を包含するが、これらに制限されない。 エビテリンのエピトープに対するモノクローナル抗体は、培地内でのセルライン の連続培養により抗体を生産する任意の技術を利用して調製できる。これらの技 術はケーラー＆ミルシュタイン（Ｋｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）に より初めて記載されたハイブリドーマ技術（Ｎａｔｕｒｅ、　１９７５．２５６ ．　ＰＰ、　４９５−４９７）およびより最近のヒトＢ−細胞ハイブリドーマ技 術（コスポール（Ｋｏｓｂｏｒ）等、　１ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ、　 １９ｇ３゜４：　７２）並びにＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（フル（Ｃｏｌｅ） 等、モノクローナル抗体および癌治療（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄ ｉｅｓ　ａｎｄ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ）、　１９８５．アランＲ，リ ス社（Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ　Ｉｎｃ、）、　ｐｐ、　７７−９６）等を包含 するがこれらに制限されない。 該分子のイデオタイブを含む抗体フラグメントは公知の技術により得ることがで きる。例えば、このようなフラグメントは、該抗体分子のペプシン消化により調 製できるＰ（ａｂ’）２フラグメント、該Ｆ（ａｂ”）２フラグメントのジスル フィド架橋を還元することにより得ることができるＰａｂ“フラグメント、およ び該抗体分子をパパインおよび還元剤で処理することにより得ることができる２ 種のＰａｂフラグメントを包含するが、これらに制限されない。 エビテリンに対する抗体は、成熟エビテリンおよびその先駆体並びに亜成分型の 定性的検出、エビテリンタンパクのアフィニティー精製、エビテリンの生合成、 代謝および機能の解明においてその用途を見出すことができる。また、エビテリ ンに対する抗体は診断薬および治療薬としても有用である。 ５．３．　エビテリンの生物学的プロフィール本出願人の初期のｃＤＮへクロー ニングに関する努力は、成長変調タンパクの該エピテリン群が幾つかの構造的に 類似する構成員からなることを示した。更に、エビテリンーフードｍＲＮＡは広 範囲のを索動物に及ぶ幾つかの型の組織で発現されると考えられる。これらの種 々のを索動物起源のエビテリン遺伝子の構造に関わる本出願人の初期のデータは 、該エビテリン遺伝子が決まった位置にあり、かつ少なくとも２億５千万年間か なり一定に維持されてきたことを示唆している。種々のエピテリンは単鎖低分子 量タンパクであると考えられる。該エピテリン類について得られた何れの配列も これまでに公知のあらゆるタンパクのものとは全く非相同である。興味あること に、エビテリンの幾つかはホスホリパーゼＡ２の活性サイトと相同の領域を含む 。 ラット腎組織から精製したエビテリン１およびエビテリン２はそれぞｔＬ５６＄ よび５７アミノ酸を含むタンパクであり、４７％のアミノ酸配列相同性および１ ２個の同様に配置したシスティン残基を有する。かくして、両エピテリンのアミ ノ酸の約１７５のがシスティンである。これら１２個のシスティン残基の配置は 、これらの間のジスルフィド結合の形成を通して、そのパターンは三次構造レベ ルにおいて多分亜鉛のフィンガー構造と類似する「システィンケージ」を形成す ることを示唆する。本出願人はこのような特殊なまたは密接に関連したシスティ ンパターンをもつ他のタンパクを知らない。この特有のシスティンパターンは精 製エビテリン１および２の一次構造のみならず、数種のエビテリンコードｃＤＮ ＡおよびＰＩＪｔクローンから推定された構造にも見られる。従って、この固有 のシスティンのパターンは該エピテリン群の構成員の識別特徴であり、かつ恐ら く重要な機能的役割を演じているものと思われる。加えて、ある１５個の他のア ミノ酸がこれら２種の精製エピテリン間に保存されている。 完全ラットエビテリン先駆体をコードするｃＤＮＡが噴離され、そのヌクレオチ ドおよび推定されたアミノ酸配列が決定さ瓢箪１８図に示されている。このラッ トエビテリン先駆体は５８９個のアミノ酸残基を含むポリペプチドで構成さｉｔ 、、そのアミノ−末端の１７残基はそのシグナルペプチドを含む。少なくとも７ 種の完全かつ明白なエビテリン種が該ラット１ピテリン先駆体遺伝子内でコード されているものと思われる。ラノトエピテリン先駆体ｃ［）ＮＡによりコードさ れる該エビテリン間の高レベルの配列相同性は、第１９図に示した如く、該ラッ トエビテリン先駆体配列とそれ自体との比較により得られる７、５倍の内側同性 により明らかにすることができる。該ラットエビテリン先駆体の混成二次構造お よびバイトロバシー解析をそれぞれ１Ｗ２ＯＡ図および！２０Ｂ図に示した。ラ ット、マウスおよびヒトのエビテリン先駆体の間のアミノ酸配列の整合性を第２ １Ａ図に示した。 本出願人は、また完全ヒト、マウスおよびラットエビテリン先駆体ＤＮＡ配列を 単離した。これらのエビテリン配列の混成の整合性を第２１Ａ図に示した。更に 、ウシおよび鳥類起源の種々のエビテリンをコードする多数のＰＣＲクローンを 得た（算２４図および第２５図）。これら種々の配列の解析は、エピテリン類が 幾分異なる程度に、第２１Ｃ図に示した如き高度に保存されたシスティン残基部 分（共通部分）により規定される明白な構造上の特徴をもつことを示す。この共 通した配列は該エビテリン類全体において一般的に保存されていると考えられる が、起源とは無関係に、これまでに調べた全てのエビテリン種において、［ＣＣ Ｘ−Ｃ［Ｘ−ＣＣＸ５ＣＣＪなるシスティンコア残基部分が殆ど完全に保存され ている。例外は該ラフトエピテリン先駆体の第一の完全繰り返し体を含み、そこ ではシスティン−セリン置換が存在し、その残基部分はｒｓｃＸ、ＣＣＸ、ＳＣ Ｘ、ＣＣ」である。更に、該コア残基部分の２５番目の位置のヒスチジン残基は 該エビテリン種全体に保存されているものと思われる。本出願人は、このコア残 基部分が全てのエビテリンについて固有の特徴であると考え、従って本発明はこ の構造上の特徴を有する全てのタンパクを包含することを意図する。第２１８図 は整列させたヒト、ラットおよびマウスの成熟エビテリン１〜７のアミノ酸配列 を示す。第２１Ｃ図に示した配列はこれら３種のエピテリン２〜７間に完全に保 存されている。エビテリンＩの配列はこの配列からほんの僅かにずれている。 本出願人は多数のヒトおよび二十日ネズミの組！ａおよびセルラインからのＲＮ Ａをエビテリン転写体の存在につき調べた。その結果を以下の表１にまとめた。 胎盤　卵巣　脳 結腸　十二指腸　表皮 腎臓髄質　胸腺　肝臓 腎皮質　肺　下垂体 精巣　腎臓　羊膜 副腎　骨髄 胸部　小脳 ＣＲＬ　７３８６　）ＩＢＬｌｏｏ Ｃａｋｉ−Ｉ　ＨＥＭＰ　Ｍ［Ｆ−７ ［ＲＬ　１５５０　ＣＲＯ１５７２ＨＴＢ２７Ｃａｋ　ｉ−２ＨＴＢ１３２　Ｔ ４７ＤＨＩＩＰ　１４７７　ＣＥＭＡ−１ ＣＣＬ　１３７　ＲＳＢ２ ｕ９３７　胸部Ｃａ １１７Ｂ１３１　ウイルムズ（Ｗｉｌｎ’ｓ）　ＣａＴ４７４ ＴＢ３６ 胎盤　卵巣 腎臓　胸腺 膵臓 脳（皮質）　小脳 肺 胚ｄ１５ 胚　ロ６ 肝臓 結腸 十二指腸 骨格筋 ＣＬ５１ Ｃ［：ＬＳＩ　（ＴＰＡ） 精製したエビテリン１およびエビテリン２の生物学的特徴は第６．を節以降に幾 分詳細に記載する。これら両タンパクはＩＭの酢酸、ＩＭの水酸化アンモニウム 、６Ｍの尿素および１０−のナトリウムメタペリオデートで、５６℃にて３０分 間加熱することにより処理した後に安定となる。これら両タンパクの生活性は、 特にタンパク分解酵素および還元剤に対して敏感である。該エビテリン構造中の 少なくとも幾つかのジスルフィド結合が該生活性にとって必須であることは明ら かである。オリゴサツカライドおよび／または脂質部分がエピテリン１または２ の何れかの該活性に対して必須であるか否かは明確ではない。 エビテリン１および２は、特にヒトエビデルモイド癌細胞に対して成長阻害活性 を示す。しかし、本出願人の結果はエビテリン１がより強力な細胞成長阻害剤で あることを示唆している。例えば、精製したエビテリン１の計算された特異的活 性はエビテリン２の値のほぼ１０倍であり、かつエビテリン１はＡ４３１細胞の 成長阻害においてエビテリン２よりも約３６倍も強力であると思われる。更に、 少なくともテストしたセルライン、即ちヒト結腸癌細胞においては、エビテリン １について見られた阻害効果を、エビテリン２に発現させることは不可能であっ た。 もう一つの興味あることは、細胞成長促進生活性に関わるエビテリン１とエピテ リン２との間の機能上の相違である。本出願人は、エビテリン１がその成長阻害 生活性の他に幾つかのセルラインに対する細胞成長の強力な促進剤であることを 立証し、このことはエビテリン１が真の二官能性成長変調剤であるという結論に 導いた。逆に、本出願人のデータはエピテリン２が少なくとも該テストしたセル ラインにおいて成長促進効果を発揮し得ないという事実を示唆する。 恐らく最も興味あることは、エピテリン２がエビテリン１の示す該促進活性と特 異的に拮抗するという本出願人の更なる発見である。これらのおよび／または他 のエビテリン間の機能上の相互関係は現時点では未解決であるが、エピテリン２ がエビテリン１により誘発された該促進活性の制御体として機能する可能性があ る。本出願人は、エビテリン１と２との間のおよび／または該エビテリン群の他 の構成員間のアゴニスト／拮抗剤としての機能上の関連性が正常なおよび抑制の ない細胞成長並びに発生間の釣り合いを制御し、さもなくばこれに影響を与える 可能性があると推測する。この点に関連して、細胞ホメオスタシスがかかる相互 関係に関与するエビテリンまたはエビテリン群により与えられる臨界的機能の喪 失によって変更もしくは破壊さＬ結果として抑制のない細胞増殖が生じ得る。 エビテリン類、抗−エピテリン抗体、および／またはエビテリンレセブターの治 療上での使用を通して、細胞ホメオスタシスが変調さ汰および／または回復され る。 該エビテリン先駆体からの個々の残基部分を発現する能力は判別プロセッング（ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）が他の活性分子を遊離する か否かを決定するのに役立つであろう。候補となるエフェクタまたはブロッカ− （ｂｌｏｃｋｅｒｓ）を選択するためには、’Ｊ２１Ａ図に示した該システィン に富む残基部分の配列を整列させて、クラスター解析する。その結果を第２７図 にデンドログラムとして示した。全１場合において、最小非類似残基部分が他の ２種の先駆体内の同一の位置に見−っだ。これらの知見に基づいて、該始原エビ テリン遺伝子は儒歯目動物と人類とが分岐する前に７−倍の複製を受けるものと 提案できる。この解析は、また該エビテリン先駆体の第５番目の繰り返し体がエ ビテリン１に最も類似しており、かつ成長促進活性をもつ候補であることを示す 。更に、第二の繰り返し体はエビテリン２に最も類似し、エビテリン１のフィト ジエン効果の拮抗体の候補である。 該エビテリン遺伝子は幾つかの興味ある特徴をもつ。該遺伝子の偏在する発現は 、より限られた分布を有する前に記載した分子とは対照的に、正常な上皮紹の成 長の維持においである役割を演じている。該エビテリン先駆体の高い繰りし性お よびシスティンに富む構造は新規なかつ進化論的に保存された残基部７Ｅ規定す る。更に、これら残基部分の少なくとも２種はタンパク分解的にプロセッシング されて活性な成長調節剤となり得る。この構成はプロオピオメラノコルチン（Ｐ ＯＭＯ１即ち組織特異的にプロ七ツシングされて種々の生活性ペプチドを遊離す るプロホルモンの構成と類似する（スミス＆ファンダー（Ｓｍｉｔｈ　ａｎｄ　 Ｐｕｎｄｅｒ）。 Ｅｎｄｏｃｒ、　Ｒｅｖ、、　１９８８．９．　ｐｐ、　１５９−７９）。 上皮細胞の成長に及ぼすエピテリン１と２との相反する活性は、天然産の構造的 に関連した分子が該親分子の拮抗剤またはサプレッサーとして機能する他の系を 連想させる。その例はインターロイキン−ルセプタ拮抗剤であるＩＬ−１ｒａ　 （バーｇ） 等、　Ｎａｔｕｒｅ、　１９９０．３４３．　Ｐｐ、　３４１−４６）、Ｋｒｅ ｖ−１（北南等、　Ｃｅ１ｌ、　１９８９．５６．　Ｐａ＋B ７７−８４）、ラス（ｒａｓ）誘発形質転換を抑制するタンパク、およびアクチ ビン（リング化ｉｎｇ）等、　Ｎａｔｕｒｅ、　１９８６．３２１．　ＰＰ、　 ７７９−８２）の生物学的活性と相反する活性の性腺タンパクであるインヒビン （リング化ｉｎｇ）等、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ’ａｄ、　Ｓｃｉ、口 、Ｓ。 Ａ、、　１９８５．８２．　ＰＰ、　７２１７−２１）を包含する。エビテリン トおよび２の細胞レセプタの更なる研究が、これらの分子がいかにしてその相反 するシグナルを伝達するかを明らかにするために必要とされる。両活性が同一の 転写体の生成物であるという発見は興味をそそる。結局、組織的、空間的または 一時的特異的プロセッシングが上皮ホメオスタシスの調節の固有の手段を与える かもしれない。 本出願人は、エビテリンタンパク、エビテリン類似体および誘導体、エビテリン ーコード核酸分子、抗−エビテリン抗体およびエビテリンレセブタの診断ふよび ／または治療上の用途を含む本発明の組成物の広範囲に渡る用途をも意図してい る。 ５、４．１．　エピテリンタンパク エピテリンタンパク、エピテリン類似体および誘導体、並びにこれらを含有す種 々のエビテリノおよびエピテリン組成物が種々の治療上の目的を達成するために 使用できる。特に、エビテリン１およびエピテリン２との間に観測された機能上 の多様性により、本出願人はこれら２種のエピテリンが種々の目的で使用できる と考えた。しかし、これらの機能上の差異にもかかわらず、エビテリンｌおよび エピテリン２両者は抗−腫瘍剤として有用である。というのは、これら両者が腫 瘍細胞の成長を阻害する能力をもっこ七が立証されたからである。但し、本出願 人の初期のデータはエビテリンｌがより強力および／または有効な腫瘍阻害剤で あることを示唆している。使用するエビテリン類の特定の組み合わせおよび／ま たは他の因子との組み合わせは、関与するターゲット細胞の種類並びに所定の特 定の目的に依存するであろう。 インビボでの使用に対しては、本発明の組成物は種々の方法、例えば注射、注入 、局所的、非経口等にれらに限定されない）により投与できる。投与は任意の生 理的に許容される担体、例えば燐酸緩衝塩水、塩水、滅菌水等に溶軟分散した状 態で行うことができる。エビテリンおよび関連分子はリポソーム中に封入しても よく、また腫瘍または細胞特異性抗原を認識し、かつこれに結合する抗体と組み 合わせて、本発明の組成物の「ターゲティング（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）Ｊ手段を 与えることができる。 エビテリンは腫瘍細胞内で分化停止を誘発するためにインビボで使用できる。 このような細胞は正常な細胞のＷＥ胞胞化化特性通常の経路からそらさね、かつ 継続的に分化し得る。逆に、正常な細胞は、多くの状況の下では更に細胞分化し 得ない細胞に分化する。かくして、腫瘍内で正常な細胞分化を再活性化し、かつ 最終的に連続的な腫瘍の成長を停止させるエビテリンの能力については、腫瘍の 治療上の養生において、価値ある用途を見出すことができる。 エピテリンおよび関連誘導体、類似体、およびそのペプチドは、腫瘍および成長 関連疾患の治療において、単独でまたは少なくとも１種の他の抗−増殖性化合物 、例えばインターフェロン、ＴＦＧ−β、腫瘍壊死因子等と共に使用できる。癌 も同様に、該癌細胞内でのエビテリンの産生を誘発することにより治療すること がラインの成長を阻害して、これに敏感でない細胞ｄ献りすることが可能である 。 このようにして、望ましからぬ細胞がエビテリンの成長阻害活性に敏感である場 合には、異種混合物またはセルラインを該望ましからぬ細胞から開放できる。例 えば、本発明の化合物は自己骨髄移植のために該骨髄から悪性細胞を除去し、か つ再注入の前に血液中での該悪性細胞の増殖を阻害または排除するためにインビ 上旦で使用できる。 与えられた細胞の増殖を阻害するのに必要なエピテリンの最も有効な濃度は、種 々の濃度のエビテリンを対象とする腫瘍細胞に添加し、細胞増殖の阻害量を追跡 することにより決定できる。個々の誘発体および／またはその組み合わせの最も 有効な■は咳癌細胞内でのエピテリンの産生を追跡することにより決定できる。 細胞成長の促進はエビテリン１、エビテリノ一様分子および恐らく該エビテリン 群の他の構成員により誘起できる。このエビテリンの生活性に基づく広範囲の治 療上の用途は、創傷の治癒および組織改造作用を包含するが、これらに制限され ない。更に、エビテリン１またはエビテリン１一様分子を同時に投与するこ々に よりあるいは併用せずに、エビテリン２のエビテリンＩ−阻害活性を中和できる 抗体も創傷の治！ｉ！ｉ＄よび組織改造において有用であり得る。 本発明の組成物は正常な細胞の増殖を包含するヒトの皮膚疾患、例えば乾廚の治 療にふける用途も見出すことができる。乾廚の病因は既知ではないが、この疾病 は迅速な上皮細胞増殖および交代を含む。随伴する迅速なケラチノサイトの交代 は角化を変調し、該疾病の肥厚化した表皮およびりんせつ特性をもたらす。エビ テリン１はケラチノサイトの成長および増殖を促進するので、このエビプリン１ −誘発性活性を効果的に阻害する治療により、該疾病の発症および進行を阻止で きる。従って、転摩患者中のエビテリン１の内因性のまたは異常に高いレベルを もたらす要因を阻害することのできる組成物がこの疾病を治癒するのに有効であ る。本出願人は、エビテリン２が特異的に該エビテリン１−誘発性のケラチノサ イト刺激を阻害することを立証した。この点に関連して、エビプリン２−含有組 成物は転層の治療において特に有用である。同様に、エビテリン１の刺激活性を 中和できる抗体をエビテリン１の活性を阻害するのに使用できる。 本出願人は、また他の治療上の目的、例えば血管形成、腎形成、骨再吸収、免疫 応答、シナプスおよび二ニーロンエフェクタ機能、アラキドン酸カスケード、お よび生殖腺機能並びに再生機能の変調（これらに制限されない）のためにエビテ リン類およびエピテリン〜様の分子の利用をも包含する。 本発明はエビテリンおよび関連分子の多数の診断的用途をも意図する。本発明の 実施において、目的とするポリペプチドは標識、例えば放射性同位体、酵素、螢 光発光物質、化学発光物質、酵素フラグメント、粒子等と結合することができる 。このような化合物は細胞上に存在するエビテリンレセブタの数を決定するのに 利用できる。エビテリンレセブタの同定は該細胞のエビテリンおよび関連分子の 生物学的効果に対する潜在的応答性の指標となる。エピテリン順、エビテリンー 関連分子お、よび／またはこれらに対する抗体は媒体、特に生理的媒体中でのエ ビテリンの検出のための競合的アッセイにおいて利用できる。当分野で公知の広 範な診断アッセイが使用できる。 体液および組織内のエビテリンの存在およびその濃度はある種の癌および他の成 長関連疾患の存在およびその広がりと直接または逆に関連している。エビテリン を検出および／または定量し得るアッセイは成長関連疾患の診断並びに予後にお ける用途を見出すことができる。 更に、エビテリンレセプタを発現する悪性細胞は、レセプタ結合アッセイにおい て標識したエビテリンまたはエビテリン関連分子を使用することにより、あるい は該エビテリンレセブタ自体に対する抗体を使用することにより検出することが できる。細胞はエビテリンレセブタの存在およびその密度に従ってｆｆ１ｌＪで き、その結果かかる細胞のエビテリンの生物学的活性に対する感受性を予測する 手段が与えられる。 ５．４．２．　エビテリンーコード核酸分子エビテリンーコ〜ド核酸分子または そのフラグメントはエピテリンをコードするｒｎＲＮＡを検出し、定量するため のプローブきして使用できる。既知の遺伝子の全てまたは一部を含む配列を検出 ために核酸プローブを使用するアッセイは当分野で周知である。エピテリンｍＲ ＮＡ濃度は腫瘍の発生および／または存在並びに転摩等（これに制限されない） の他のヒト疾患の発病および／またはその進行の徴候となる可能性がある。従っ て、エビテリンｍＲＮＡを検出かつ定量できるアッセイは価値ある診断手段を与 える。 アンチセンスエビプリンＲＮＡ分子は、治療上の目的が所定のエビテリンの存在 を排除したい場合には、エビテリンをコードするｄＮＡの翻訳を阻害するために 治療上有用である。例えば、エビテリンアンチセンスＲＮＡは、エビテリン１が 病因物質である疾患の治療においてエビテリン１拮抗試薬として有用であり得る 。また、エビテリンアンチャンスＲＮＡはエビテリン機能のメカニズムを検討す る上で有用である。 エビテリンコード核酸分子は、上記の第５．１．３．節で別途論議した如く、組 み換えエピテリンタンパクおよびその関連分子の製造に利用できる。 ペルーフリーズ（Ｐｅｌ−Ｆｒｅｅｚｅ；アーカンサス、ロジャーズ）からラッ トの腎臓を得た。凍結ラット腎ＩＩ（湿潤重量４３０　ｇ）を、２３４８ｍ１ノ エタノール（９８℃、１９ｍ１の濃ＨＣ１１８１，５ｍｇ（Ｄフェニルメチル− スルホニルフルオライドおよび２．８ｍｌのアブロトニ７　（ａｐｒｏｔｏｎ　 ｉｎ）　（２３Ｔ１口／ｍ１：ウシ肺由来のもの；シグマ社製（ＳｉｇｍａＣｈ ｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）を含む抽出用緩衝液２３７０ｍ１中に懸濁した。この組 織を４℃にて４〜６時間に渡り解凍し、この混合物をワーリングブレンダーでホ モジナイズした。 この混合物を４℃にて一夜撹拌し、ツルバール（Ｓｏｌｖａｌｌ）　Ｇ５−３０ −ター内で９、０００ｒｐｍｌこて４０分間還Ｉじ都連し、得られた上澄液（２ ，２００ｍｌ）を注意して取り出した。クロロホルム（２，２００ｍ　ｌ）　ｉ ６よび２２０ｉ１の酸性水（３７５ｍｌの水＋７．５ｆｉｉ＋の濃１（ＣＩ）を 該上澄液に添加し、得られた混合物を約１時間激しく撹拌し、室温にて放置して 、２相に分離させた。上部の水性相を注意して取り出し、Ｎｏ、　３スペクトロ ボア（Ｓｐｅｃｔｒｏρｏｒｅ）透析チューブ（遮断分子量約３．０００＞中に 入れて、４℃にて０、ＩＭの酢酸溶液１７Ｉｌに対して透析した。この透析バッ ファーは２日間の期間中３回交換した。この透析内液（ｒｅｔｅｎａｔｅ）を凍 結乾燥し、この凍結乾燥物質（４，５５ｇ；粗抽出物と呼ぶ）を後に使用するま で一２０℃にて保存した。 ６、１．１　分取ゲル浸透クロマトグラフィーバイオーシ、Ｌ　（Ｂ　１ｏ−５ ｉ　］）　］ＴＳＫ−２５０力５ム２１．５　Ｘ６００　ｓｓ；バイオラド（Ｂ ｉｏＲａｄ）製）を高速液体クロマトグラフィー（ＩＩＰＬｃ）系（ウォーター ズ（Ｗａｔｅｒｓ）　）に取り付けた。上記の粗抽出物（２５ａ＋ｇ／ｍｌ）を ０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含有する５０％アセトニトリル／水に 溶解した。この混合物の３ｍｌアリコートを注入し、イソクラティック溶出を０ ．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリルの移動相を使用して実施した。流量は む１／分とし、チャート速度を０．２５　ａｉ／分とした。６ｍ１ずっの両分を 集めた。このクロマトグラフィーは室温にて実施した。各両分からのアリコート を蒸発させ、罵６．２．　ｌ、節以降に記載するように、Ａ４３１ヒトエビデル モイド癌細胞に関して、成長阻害活性（ＣＩＡ）につき３回アッセイした（第１ 図）。 遅く溶出する微小ピーク（画分２５−２８）は興味ある新規な活性を有する物質 を含む。５７回に渡る同様な実験から得られた画分２５−２８をプールし、濃縮 し、凍結乾燥した。この凍結乾燥した物質は４７３　ｆｆ１ｇであり、全体で約 し１刈０５ＧＩＡ単位を有識凍結乾燥した両分（上記の第６．１．２．節）を０ ，１％ＴＦＡの水溶液２４０　ｉｆに溶解し、この混合物を遠心分離処理し、得 られた上澄液を注意して取り出した。最終体積は約２５０　ｍｌであった。１２ ５１のこの混合物を、ＨＰＬＣ装置に取りつけた分取パーティシル（Ｐａｒｔｉ ｓｉ　ｌ）　１００ＤＳ−３カラム（１０μ、２．２ｘ２５ａｏ；）７７トマン （Ｗｈａｔ＋ｎａｎ））にイソクラティック方式で注入した。流量は４ｍ１／分 に設定した。一旦該試料を該カラムに通した後、該カラムを１５０１１１１の０ ，１％ＴＦＡ水溶液で洗浄した。線型勾配を該−次溶媒（０，１％ＴＦＡ水溶液 ）と二次溶媒（０，１％ＴＦＡを含むアセトニトリル）との間に設定した。該勾 配条件は２７０分間はＯ対４５％とし、４５分間は４５対１００％とした。１４ ｓｌずつの画分を集め、各両分のアリコートをＣＩＡにつきアッセイした。 活性の４つのブロードなピークが観測された（第２図）。第二の実験を上記の如 〈実施した。２つの初期溶出ピーク、即ちピークａおよびｂ、はそれぞれエピテ リン１および２を含有しており、そこでこれらを更に精製並びに特徴付けした。 エビテリン１および２のさらなる精製は別々に以下に記載する。 ６、１．４．　逆相およびゲル浸透ＨＰＬＣによるエビテリン１の更なる精製２ つの実験からの画分５５−５９　慄２図）をプールし、０．１％ＴＦＡ水溶液で ２倍に希釈した。この混合物をイソクラティック方式で半一分取μｍボンダバッ ク（Ｂｏｎｄａｐａｋ）−［１８カラム（７，８Ｘ　３００　ｍｍ　；ウォータ ーズ（ｌｌａｔｅｒｓ））に室温にて２＋ｎｌ／分なる流量で注入した。−次溶 媒（０，１％ＴＦＡ水溶液）と二次溶媒（０，１％ＴＦＡを含むアセトニトリル ）との間の線型勾配条件は１，８分間は０対１８％とし、２０分間は１８対１８ ％とし、２４０分間は１８対３鶴とし、１０分間は３４対１００％とした。流量 は該勾配溶出中ずっと２　ｉｔ／分に設定し、７ＩＩｌｌずつの両分を集めた。 アリコートを取り出し、ＧＩＡにつきアッセイした。２つのピークが、それぞれ アセトニトリルの濃度約２４％および２５％にて溶出した両分に見られた（第３ 図）。 画分３０−３４をプールした。４５ｍ１の０．１％ＴＦＡ水溶液をこのプールし た両分に添加した。この混合物をイソクラティック方式で半一分取μｍボンダバ ック（Ｂｏｎｄａｐａｋ）−ＣＮカラム（３，９Ｘ　３００　ａｎ　；ウォータ ーズ（Ｗａｔｅｒｓ））に室温にてｌ　ａｌｌ／分なる流量で注入した。線型勾 配条件は１分間は０対１０％とし、１９分間は１０対１０％とし、２００分間は １０対３０％とし、７分間は３０対１００％とした。流量は０．５ｓｌ／分に設 定し、１．５ｓｌずつの両分を集めた。該活性の殆どはアセトニトリル濃度約２ １．５％にて該カラムから溶出された両分中に存在した（第４図）。 画分３６−４３をプールし、０．１％ＴＦＡ／Ｈ，Ｏで最終体積が１１５　ｍｌ となるように希釈し、正確に上で画分３０−３４について記載したようにクロマ トグラフィー処理した。該活性の殆どはアセトニトリル濃度それぞれ約２２．５ ％および２３．５％にて該カラムから溶出された２つのピーク中に存在した（第 ５図）。 画分５１および５２（第４図）はそれぞれスピード−バク（ｓｐｅｅｄ−ｖａｃ ）濃縮装置（サバン）　（Ｓａｖａｎｔ））を使用して、体積約７０μｌにまで 濃縮し、これに等体積の０．１％ＴＰ＾を含むアセトニトリルを添加した。この １４０μｌの試料を、縦列に配置したバイオ−シル（Ｂ　１ｏ−Ｓ　ｉ　Ｉ）　 ＴＳＫ−２５０カラム（それぞれ７．５　Ｘ３００　ｍ制パイオーラド（Ｂｉｏ −Ｒａｄ）製）上に注入した。溶出は室温にて、５０％アセトニトリル／Ｈ２０ （０，１％ＴＦＡを含む）の移動相を使用して実施した。流量は０．４ｓｌ／分 に設定し、チャート速度は０．２５ｃｍ／分に設定した。各ｆｌ、４ｍｌの両分 を集め、その７１ＪコートをＧＩＡにつきアッセイした。画分５１オよび５２の クロマトグラフィープロフィールをそれぞれ第６Ａ図および第６Ｂ図に示した。 画分４４および４５（ｌＥｓ図）は別々に７０μｌにまで濃縮し、次いで上記の 如くゲル浸透クロマトグラフィーにかけた。そのクロマトグラフィープロフィー ルを第７図に与えた。 ６、１．５．　逆相およびゲル浸透ＨＰＬＣによるエピテリン２の更なる精製２ つの実験からの画分５ｌ−５４（第２図）をプールし、０．１％ＴＦＡ／Ｈ２０ で２倍に希釈した。この混合物を半一分取μｍボンダバック（Ｂｏｎｄａｐａｋ ）−ＣＩ８カラム（７，８Ｘ　３０叩；ウォーターズ（Ｉｌａｔｅｒｓ）　）に 室温にて２ｓｌ／分なる流量で適用した。−次溶媒（０，１％ＴＦＡ水溶液）と 二次溶媒（０，１％ＴＦＡを含むアセトニトリル）との間の線型勾配条件は１． ８分間は０対１８％とし、２０分間は１８対１８％とし、２４０分間は１８対３ ４％とし、１０分間は３４対１００％とした。流量は該勾配溶出中ずっと２　＋ ｓｌ／分に設定し、７ｓｌずつの画分を集めた。アリコートを取り出し、ＧＩＡ につきアッセイした。 そのクロマトグラフィープロフィールを第８図に示した。活性の主ピークは、ア セトニ）ＩＪルの濃度約２０．５％にて溶出した両分に見られた。 両分１ｇ−２３をプールし、０．１％ＴＦＡ／Ｈ，０で最終体積が１１０　ｍｌ となるように希釈した。この混合物をμｍボンダバック（Ｂｏｎｄａｐａｋ）− ＣＮカラム（３，９Ｘ３００　ｗ；　ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ））に室温に て１＋ｎｌ／分なる流量で適用した。勾配条件は１分間は０対ｌＯ％とし、１９ 分間は１０対１０％とし、２００分間は１０対３０％とし、７分間は３０対１０ ０％とした。流量は０．５ｓｌ／分に設定し、１．５ｓｌずつの両分を集めた。 該活性はアセトニトリル濃度約１８％にて該カラムから溶出された画分中に存在 したく第９図）。 画分３６および３８（第８図）をそれぞれ体積約７０μｌにまで濃縮し、これに 等体積の０．１％ＴＦ＾を含むアセトニトリルを添加した。この１４０μｌの試 料を、２つ並べて配置したパイオーシル（Ｂ　１ｏ−Ｓ　ｉ　Ｉ　）ＴＳＫ−２ ５０カラム（それぞれ７．５　Ｘ３００　ｍ；バイオラド（ＢｉｏＲａｄ）製） 上に適用した。溶出は室温にて、５０％アセトニトリル／Ｈ２０（０，１％ＴＦ Ａを含む）の移動相を使用してイソクラティック方式で実施した。流量は０．４ ｓｌ／分に設定し、各０．４＋ｓｌの両分を集め、そのアリコートをＣＩＡにつ きアッセイした。画分３６．３７オよび３８のクロマトグラフィープロフィール をそれぞれ第１０Ａ図、第１０Ｂ図および第１０Ｃ図に示した。 第１０＾−０図からの両分４８および４９をプールし、約７０μｌにまで濃縮し 、次いで上記の如くゲル浸透クロマトグラフィーにかけた。そのクロマトグラフ ィープロフィールを第１００図に与えた。 細胞成長阻害活性（ＣＩＡンに関するアッセイを平底型９６ウエルプレート　（ フアシヨン（Ｆａｌｃｏｎ）３０７２）内で実施した。外陰部細胞（Ａ４３１） のヒトエビデルモイド癌をＣＩＡ様のテスト細胞として使用した。テスト培地（ ５％の加熱不活性化した子牛血清（ＦＢＳ）を補充したＤＭＥＭ、ペニシリン／ ストレプトマイシン（ＰＳ）、およびグルタミン）５０μβ中に分散させた３、 ５Ｘ１０’個の細胞を、周辺ウェルを除く全てのウェルに入れた。該周辺ウェル には５０μｌのＰＢＳを入れた。３時間後に、テスト培地中のテスト試料５０μ ｌを各ウェルに添加し、一方でコントロールウェルには５０μｌのテスト培地の みを添加した。該テスト試料の各濃度に対して３個ずつのウェルを使用した。プ レートを３７℃にて２〜３日間インキュベートした。次いで、＋２’！−ヨー　 ト−２’−”’ｌ−テｔキシウ’Ｊ　シン（１２ｓＩ−ＩＵｄＲ，４Ｃｉ／ｍｇ −０，５ｍＣｉ／＋＋Ｉｌ　、ｔスト培地中２μｊ！／ｍｌ）の溶液１００μｌ を各ウェルに添加し、該プレートを３７℃にてインキュベートした。４〜６時間 後、該培地を該ウェルから吸い取り、これらを次に１回２００μｌのＰＢＳで洗 浄した。次いで、各ウェルに２００μｌのメタノールを添加し、プレートを室温 にて１０分間インキュベートし、メタノールを吸引により除去した。２００μｌ の１Ｍ水酸化ナトリウムを各ウェルに添加し、該プレートを３７℃にて３０分間 インキュベートした。水酸化ナトリウムをタイタテックブラグズ（ｔｉｔｅｒｔ ｅｋ　ｐｌｕｇｓ；フローラブズ製（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｓ））を使用して除去し た。このプラグを１２　Ｘ　７５ｍｍのプラスチックチューブに移し、取り込ま れた１２’ｌ−１１１ｄＲを定量するためにガンマカウンターでカウントした。 ２４−ウェルのコスタ−（（：ｏｓｔａｒ）プレート内で、１国１の低カルシウ ム培地（ワイスマン＆アーロンソン＜ｌ１ｅｉｓｓｏ＋ａｎ　ａｎｄ　Ａａｒｏ ｎｓｏｎ）、　Ｃｅ１ｌ、　１９ｇ３．３２．９ｐ、、　５９９−６０６；カー ペンタ−＆ツエンデグット（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ　ａｎｄ　Ｚｅｎｄｅｇｕｔ） 、　Ａｎａｌ。 Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１９８５．１５３．　ＰＰ、　２７９−２８２）に分散し たＢａ１ｂ／ＭＫ細胞をウェル当たりの密度ｌＸ１０４細胞で被覆し、３７℃に て４〜６時間インキュベートした。次いで、該培地を除去し、テスト化合物を種 々の濃度で含むｆｍｌの培地（各々３個）で置換した。コントロールウェルには 該テスト化合物を含まない培地のみを添加した。 これらのプレートを３７℃にて４日間インキュベートし、次いで該培地を除去し 、ウェルを２回ＩＬｌｌの燐酸緩衝塩水ですすぎ、該細胞をトリプシン−Ｅ［ｌ ＴＡで分離し、計数した。 また、Ｂａ１ｂ／ＭＫ細胞を９６ウエルプレート中で指示細胞として使用して、 前の節で記載した如く、ＤＮＡに組み込んだ１２５Ｉ−デオキシウリジンを使用 してテスト物質の成長阻害活性（ＣＩＡ）または成長促進活性（ＧＳＡ）を評価 した。 ６．２．３．　軟ＪｔｌＫ天コロニーアッセイ１０％の加熱して不活性化したＦ ＢＳを含むＩ１ＭＥＭ中の０．５％寒天（アガーノープル（Ａｇａｒ　Ｎｏｂｌ ｅ）　；　ミシガン州、デトロイトのディフコラボラトリーズ社（口ｉｆｃ。 １、ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））のベース層０．３８ＩＩｌをコスタ−組織培養 プレートに添加した。同一の培地−ＰＢＳ混合物を含有する０、３％の寒天溶液 ０．３８ａ＋ｌ、６−１２Ｘ１０’テスト細胞および種々の濃度のテストタンパ クを該寒天のベース層上に重ねた。これらのプレートを５％ＣＯ７含有空気の湿 潤雰囲気内で３７℃にてインキュベートした。コロニーが形成されたがこれらは 固定かつ染色されず、該コロニーの数は７〜１０日の間に計数した。コロニーは 少なくとも８個の細胞を含むクラスターとして定義した。 タンパク（１，０−２０Ｍｇ）を１．５ｎｌのマイクロヒュージ（Ｌｌｉｃｒｏ ｆ　ｕｇｅ）ポリプロピレン管内で乾燥し、１００μ＆の０．０５Ｍ　Ｔｒ　１ ｓ−）１ｃＩ　（ｐＨ７，５）中に溶解した鵠の尿素中に懸濁した。次いで４μ ｌの２−メルカプトエタノールを該混合物に添加し、その内容物を混合し、窒素 でフラッシングし、２５℃にてインキュベートした。２．５時間後、ｔ５μｌの 新たに蒸溜した４−ビニルピリジンを該混合物に添加し、咳管を再度窒素でフラ ッシングし、２５℃にて２時間インキュベートした。この反応混合物を１０％Ｔ Ｆ八でｐ）１２．０の酸性とした。Ｓ−ピリジルエチル化タンパクをパーティシ ル（Ｐａｒｔｉｓｉｌ）　５０ＤＳ−３カラム（ｔ６　ｘ　１００５ｍ　；）７ −／トマン（ｌｌｈａｔｍａｎ）　）を使用して逆相ＨＰＬＣで精製した。流量 １　ｍｌ／分にて、５５分間アセトニトリルの濃度を直線状にｃＩｖ分）増大さ せた。該−次溶媒としては０．１％ＴＦＡ／）１，０を使用した。Ｓ−ピリジル エチル化−エビゾリン１　（ＳＰＥ−エビゾリン１）および５ＰＥ−エビゾリン ２は、それぞれ未処理のエビゾリンよりも約２〜３％高いアセトニトリル濃度で ある約２５％および２３％で溶出された。 ６．３．２．　５ＰＥ−エビゾリン１および５ＰＥ−エビゾリン２の酵素的開裂 エンドペプチダーゼＬｙｓ−ＣおよびＴＰＣＫ−）　ＩＪプシンによる開裂を、 ２５℃にて１６時間６０μｌの０．　ＬＭ　Ｔｒｉｓ−酢酸（ｐＨ８，０＞中で 実施した。酵素／基質比は１〜５（ｗ／ｗ）であった。エンドペプチダーゼ−Ａ ｒｇおよびＳ、オーレウス（ａｕｒｅｕｓ）　Ｖｌｌプロテアーゼ消化は３７℃ にて１６時間、８０ｔｔｉｔの０．０５　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ８，０ ）　、Ｏ−１Ｍ重炭酸アンモニウム中で実施した。酵素／基質比はこの場合も１ 〜５とした。 ６、３．３．　ペプチドの単離 ペプチドをＨＰＬＣ装置（ウォーターズ（ｉｌａｔｅｒｓ）　）に取りつけた逆 相ＨＰＬＣＣ１８（４，６Ｘ１００１ＩＩｆｌ＋；）７−／トマン（Ｗｈａｔｍ ａｎ）　）上で分離した。酸性にした試料（ｐＨ２，０）を０．１％ＴＦＡ　（ −次溶媒）で平衡化したカラムに流量１ｍｌ／分で適用し、該カラムを約１５ｍ １の０．１％ＴＦＡで洗浄した。該−次溶媒と二次溶媒（（１，１％　ＴＦＡを 含むアセトニトリル）との間の線型勾配を使用した。勾配条件は１２５分間は流 量０．５ｍｌ／分にてＯ対５０％とした。 ６、３．４　アミノ酸分析 乾燥試料を、１０５℃にて１６時間、テフロン−封止ガラス加水分解バルブ（ピ アース（Ｐｉｅｒｃｅ））内で、減圧下にて１％（Ｖ／Ｖ）のフェノールを含有 する定常的に沸騰させたＨＣＩ　（５，７Ｍ；ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ））で加 水分解した。この加水分解生成物をスピードバク（Ｓｐｅｅｄ　Ｖａｃ）濃縮器 （サーバントインスツルメンツ（ＳａｖａｎｔＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）製）で 乾燥し、室温にて２０分間フェニルイソチオシアネートで処理した（ｄｅｒｉｖ ｉｔｉｚｅｄ）。フェニルチオカルバミルアミノ酸誘導体を、オクタデシル（Ｏ ｃｔａｄｅｃｙｌ）カラム（ｔ５Ｘ２５０　ｍ；　ＩＢＭ）上で逆相ＨＰＬＣに より分析した。−次溶媒、即ち０．１５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ６，４＞、０． ０５％トリエチルアミン（酢酸でＰｔ１６．４まで滴定した）と、二次溶媒、即 ち６０％ア七ト二トリル溶液との間に線型の勾配を設定し、３８℃にて流量を１ ｍｌ／分とした。 ６、３．５．　アミノ酸配列決定 ペプチド配列はアプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅ ｍ）モデル４７５気相配列決定装置により、ヒユーイック（Ｈｅｗｉｃｋ）等の Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｆｆｌ、、　１９８１．２５６゜ｐｐ、　７９９０−７ ９９７に記載の方法に従って決定した。エドマン（Ｅｄｍａｎ）分解の３つの予 備サイクルを、試料を各実験にかける前に実施した。トリアゾリン誘導体をフェ ニルチオヒダントインアミノ酸に転化するために２５％ＴＦＡを使用した。フェ ニルチオヒダントインアミノ酸の同定はオンラインでモデル１２０Ａ　ＰＴＩ（ 分析器（アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅａ＋） 社製）により、バンカピラー＆フッド（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ　ａｎｄ　Ｈｏ ｏｄ）の５ｃｉｅｎｃｅ、　１９８３．２１９．　ｐｐ、　６５０−６５９に記 載の方法に従って実施した。 ６．３．６．トリンンードデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気 泳動ンヤージャー＆ゲブハード（Ｓｃｈａｇｅｒ　ａｎｄ　Ｇｅｂｈａｒｄ）の Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１９８７．　１６６゜ｐｐ、　３６Ｂ−３７９に記載の方 法に従って、タンパクをトリシンードデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミ ドスラブゲル（通常のまたはミニバイオ−ラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）装Ｗ！１）上 で分析した。タンパクは銀染色（レイ（Ｗｒａｙ）等、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃ ｈｅｍ、。 エビゾリン１およびエビゾリン２はＩＭの酢酸、６Ｍの尿素、０．０１Ｍのナト リウムメタペリオデートと共に５６℃にて３０分間の処理に対して耐性であり、 かつ種々のグリコシダーゼまたはリパーゼによる処理に対して耐性である。しか し、エビゾリン活性は還元、還元および４−ビニルピリジン処理並びにプロトコ −ル、例えばトリプシン、エンドペプチダ−ゼＬｙｓ−Ｃ、およびエンドペプチ ダ−ゼＧｌｕ−Ｃ（ＶＢ）による消化に対して感受性をもつ。これらの結果は、 これらの因子が生物学的活性に対して必須のジスルフィド結合状態のシスティン を含むタンパクであるこきを示唆している。これらのタンパクは、生物学的活性 に対しては有害なオリゴサツカライドおよび／または脂質部分を含まない。 ６、ｔ２．　エビゾリン１および２の精製および幾つかの物理的特性エビゾリン ［および２の精製の概要をそれぞれ以下の表ＩおよびＩ＋に示した。 これら両因子を類似する６一段階のプロトコールにより見掛は上相間となるまで 精製した。初期段階の両分はＡ４３１細胞に対して多様な成長阻害活性物質を含 む。 エビゾリン１および２は初期画分中の全ＣＩＡのほんの僅かな部分を構成するに すぎず、精製の初期段階においてその特異的活性を定量することを極めて困難な ものとしている。精製エビゾリン１の特異的活性は約２．ｌＸ１０’単Ｕｒｎｇ タンパクであるが、精製エビゾリン２は３．８Ｘ１０’単位／ｍｇタンパクとい うより低い特異的活性を有していた。 粗精製物　４，５５０．０００　１，２８３．１００”　２Ｂ２　−分取ＴＳＫ −２５０４７３，０００１１２，２００”　２３７　−公司こ　０ＤＳ　（ｂ） 　１７．６００　１４．１００　８０１　１００半分取Ｃ１８ｌｂ　１．５１０ 　２．０８０　１．３７７　１４．８２ｂ　３．４６０　５，４６０　１．５７ ８　３８．７Ａｎａ１．　Ｃｙａｎｏ　］、ｂ　６０　７１３　１１．８８９　 ３．４２ｂ　７３　１．１９０　１６．３０１　８−４Ａｎａ１．　Ｔｓｋ−２ ５０ｌｂ　４１　Ａ４５　２０．６０９　６．０２ｂ　６２　１．３０５　２１ ，０４８　９．３１）＝１１半のＧＩＡは、Ａ４３１細胞への１２５１−標識チ オキシウリジンの組み込みを５０％阻害するに必要な量である。 ２）：これらの両分には他の成長阻害活性が存在する。これらの値は全活性を含 むものである。 表ＩＩＩエピテリン２の精製の概要（ＧＩＡ）画分　タンパク、μｇＧＩＡｊ１ 位１）特異的活性（単位ｈ）　収率（１）粗精製物　４，５５０．ＯＯｏ　１． ２８３，１００”　２８２　−分取ＴＳＫ−２５０４７３，０００１１２，２０ ０”＋　２３７　−公司こ　０口５（ｂ）　２４．５００　９．５６７　４３２ 　１００半分取Ｃ１ｇ　４，７６０　１，１９０　２５０　１２．４Ａｎａｌ、 　Ｃｙａｎｏ　１６９　４６０　２．７４１　ｔｌｌＡｎａｌ、　ＴＳｋ−２５ ０３７１４１３，８１０１５１）：１半位のＧＩＡは、Ａ４３１細胞への１２５ １−標識デオキシウリジンの組み込みを５σ％阻害するに必要な量である。 ２）：これらの両分には他の成長阻害活性が存在する。これらの値は全活性を含 むものである。 ＴＳＫ−２５０カラム上でのゲル浸透クロマトグラフィーにより測定したエビゾ リンＬおよび２の分子量はそれぞれ約４．５００および約３．７００　（第６． ７および１０図）であった。５ＰＥ−エビゾリン１または２は同様なゲル浸透ク ロマトグラフィーにより測定した分子量約１３．０００を示した。 第１１図は還元条件下での１８％ポリアクリルアミドゲル内でのエピテリン１お よび２の分析結果を示す図である。エビテリン１およびエピテリン２は、中央値 の相対的分子量それぞれ約５．５００および６．０００を有する単一のバンドと して該ゲル中を移動した。同様な結果が、タンパクを非還元条件下で電気泳動し た場合にも観測された。かくして、エピテリンは単一鎖の低分子量タンパクであ る。 ６、　ｔ　３．　エビテリン１およびエピテリン２の化学的構造エビテリンＬお よび２のアミノ酸配列はＳ−ピリジルエチル化タンパク、およびから推定した。 エビテリン［および２のアミノ酸配列を第１２図に示した。 エビテリン１および２のタンパク配列をナショナルバイオメディカルリサーチフ ァウンデーションＮａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ 　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）データベース（公開物数（ｒｅ　１ｅａｓｅ）　２２ ）、ジエネティックシーケンスデータバンク〔ボルトベラネク＆ニューマン（Ｂ ｏｌｔ　Ｂｅｒａｎｅｋ　ａｎｄ　Ｎｅｗｍａｎ）、　ロスアラモスナショナル ラボラトリ−（Ｌｏｓ　Ａｌａｍｏｓ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙ）　；公開物数６１）、およびヨーロピアンモレキュラーバイオロジーラボラ トリ−（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ＢｉｏｌｏｇｙＬａｂｏｒａ ｔｏｒｙ）データバンク（公開物数２０）の全てのタンパクと比較した。これら のコンピュータを使用した検索はこれら両タンパクが新規なものであり、かつ該 ３つのデータバンクの全てのタンパクに対して有意の相同性をもたないことが明 らかとなった。 エビテリン１および２はそれぞれ５６および５７個のアミノ酸残基をもち、計算 された分子量それぞれ６０６０および６０９４をもつ一本鎮ポリペプチドである 。エビテリン１および２はそのアミノ酸レベルにおいて４７％の相同性をもつ。 これら両タンパクは１２個のシスティン残基をもち、４組の２重システィン残基 を有する。かくして、これら両タンパク中のアミノ酸残基の約２１％がシスティ ンである。更に、該エビテリン１および２中の単一システィン残基と２重システ ィン残基との間の間隔は同一である。これらのタンパク中の領内ジスルフィド結 合の数または位置は現時点ては未知であるが、類似するまたは同一のパターンを もつことが予想される。これら両タンパクは、また約１３％のヒドロキシアミノ 酸（セリンとスレオニンとを一緒に）を含む。エビテリン１および２のアミノ酸 配列を第１２図に示す。 システィン残基の保存に加えて、１５個の他の残基がエピテリン１とエビテリン ２との間で保存されている。 エビテリンＬおよび２のバイトロバジ−プロフィールを第１３図に示す。エビテ リン１のバイトロバジ−プロフィールはエピテリン２のそれと幾分類似するが、 エビテリン２はエビテリン１よりも一層親水性であると思われる。 ６、　ｔ　ｔ　エピテリン１およびエピテリン２の生物学的効果種々の濃度のエ ビテリン１およびエビテリン２による、′２Ｓ１−デオキシウリジンのヒトエピ デルモイド癌Ａ４３１細胞のＤＮＡへの組み込み阻害を第１４図に与えた。 ＤＮＡの５０％阻害は１２．８ｎｇ／ウェルのエビテリン［および４５０ｎｇ／ ウェルのエビテリン２において観測された。即ち、５０％阻害は約２１ｎＭ濃度 のエビテリン１および約０．７５μｍ濃度のエピテリン２において見られた。従 って、エビテリン１は、このアッセイではエビテリン２よりも約３６倍も強力で ある。 種々の腫瘍および非腫瘍性ヒトセルライン並びに数種のヒト以外のセルラインの ＤＮＡへの１２５１−デオキシウリジンの組み込みに及ぼすエビテリンの効果を 調べた。エピテリン１　（テストした最大ドーズ：　２０　ｎｇ／＋ｉｌ）はヒ ト結腸癌セルラインＨＣＴ　１１６の成長を僅かに阻害したが、エビテリン２（ テストした最大ドーズ：２７０ｎｇ／ｍｌ）はこのセルラインに対して何隻効果 を示さなかった。これら両タンパクはミンク肺ＣＣＬ　６４細胞およびサル腎１ ｉｃｏｓｉ細胞のＤＮＡへの＋ｔｓ（−デオキシウリジンの組み込みを有意に阻 害した。これらタンパクのいずれもテストした最大ドーズ（エビテリン１に対し て２（１ｎｇ／ｍｌおよびエピテリン２に対して２７０ｎｇ／ｍｌ）においてヒ ト繊維芽細胞および幾つかの他のヒト腫瘍細胞に対して有意な作用を何等示さな かった。 二十日ネズミケラチノサイト（Ｂａｌｂ／ＭＫ細胞）のＤＮＡへの１２５１−デ オキシウリジンの組み込みに及ぼすエビテリン１および２の種々の濃度の効果を 調べた。データを第１５Ａ図に示す。エビテリン１は濃度−依存的に１２５１− デオキシウリジンの組み込みを促進し、一方エピテリン２は何等有意な効果を示 さなかった。しかし、エピテリン２はエビテリン１により誘発されたＢａ１ｂ／ ＭＫ細胞への１２５１−デオキシウリジンの組み込みを阻害した（３４１５８図 ）。この点に関連して、５０％阻害はエビテリン２約２１ｎＭにおいて観測され た。かくして、エピテリン２はこの系のエビテリン１の効果と拮抗する。 二十日ネズミのケラチノサイトセルラインＢａ１ｂ／Ｍにの継続的成長はＥＧＦ 　、　ＴＧＦα、またはアンフィレギュリン（ＡＲ）に依存している。Ｂａ１ｂ ／ＭＫ細胞はＥＧＦまたはエビテリン１のない状態では増殖しなかった（第１６ Ａ図）が、エビテリン２はこれら細胞の成長に何等有意な作用を示さなかった。 しかし、エビテリン２はドーズ依存的にＢａ１ｂ／ＭＫ細胞のエビテリン１−誘 発成長を阻害しく第１６８図）、その５０％阻害は約７ｎＭのエビテリン２で観 測された。ＥＧＰまたはＴＧＦαはＴＦＧβの存在下でラット腎細胞ＮＲに一５ Ａ６の足場（ａｎｃｈｏｒａｇｅ）−独立性成長を誘発した（ロバーツ（Ｒｏｂ ｅｒｔｓ）等、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　［１，Ｓ、 Ａ、、　１９８１．７８．　ＰＰ、　５３３９−T３４４） 。ＥＧＦと同様に、エピテリン１はドーズ依存的にＮＲＫ細胞の足場−独立型の 成長を誘発した（第１７図）が、エビテリン２は誘発しなかった。エピテリン２ は（約８５ｎＭの濃度において）軟質寒天中でのエビテリン１−誘発性コロニー 形成を約５０％阻害した。更に、エビテリン１は単分子層中のＮＲに細胞にマイ トジェン活性を及ぼしたが、エビテリン２は該活性を示さなかった。 エビテリン１もエビテリン２も、”５ｌ−ＥＧＦのそのレセプタへの結合に有意 な影響を与えなかったが、このことはこれらのエビテリン類がＥＧＦレセプタを 介してその生物学的効果を媒介しないことを示唆している。 縮重オリゴヌクレオチドの２つのプールを、エピテリン２からのペプチド配列に ＴＱＣＰＤＤおよび）ｌ［：ＣＰＱＤＴに基づいて合成した（これらのプールは 、それぞれセンスおよびアンチセンス配向状態にある２５６オよび１２８個の縮 重オリゴヌクレオチドを含む）。これらのオリゴヌクレオチドを、３′−末端上 にＴ、７トラツク（ｔｒａｃｋ）を含むオリゴヌクレオチド、Ｘ５ＣＴ１７で感 作したラット腎臓ＲＮＡ由来の一本ｆｉｃＤＮＡ鋳型で、４０サイクルのＰＣＲ 増幅におけるプライマーとして使用した（プローマン（Ｐｌｏｗｍａｎ）等、　 Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、、　１９９０． ８７．　ｐｐ、　４９０T− ０８）。エビテリン配列：にＹＧＣＣＰＭＰ　（２５６縮重の２３−マー）に基 づくオリゴヌクレオチドプローブを［ｒ−”Ｐ］　ＡＴＰで標識し、ＰＣＲ生底 物をスクリーニングするのに使用した。 このＰＣＲ生成物のサザンプロットへのこのプローブのハイブリッド化は１２０ 塩基対（ｂｐ）および６００　ｂｐの主バンドおよび３２５ｂρの微／Ｊ’Ｊ＜ ンドを示した。これらのフラグメントをサブクローニングし、かつ配列決定した ところ、これらが全て共通の５°−末端コードエビテリン２を有することが示さ れた。該３２５　ｂｐのフラグメントはオーブン読み取り枠を有し、鉄枠はエビ テリン１および２の両者をコードし、一方で６００　ｂｐの主バンドは更に３゛ −末端にまで広がり、システィンに富む残基部分の付随的な複製を含んでいた。 従って、エビテリンｌおよび２は単一の転写の縦列に配置された生成物であると 考えられる。これらと同一のＰＣＲプライマーを使用して、ヒト、ウシ、マウス および鶏のｃＤＮＡ由来のエビテリン先駆体の同様なフラグメントを単離した。 その結果、強力な進化的な該システィンに富む残基部分の保存が立証された。 完全なエビテリンｃＤＮＡを、既知の中心的配列を有するメツセージの５゛−お よび３′−末端を単離するためのＰＣＲプロトコールおよびλｇｔｌｏライブラ リーのスクリーニングを利用してラット、マウスおよびヒトから得た。特に、３ ゛および５°方向に配向した正確なエビテリンプライマーを、天然産のポリ（Ａ ）テイルまたは５゛末端の広がったｃＤＮＡ上に付加された合成ポリ（Ａ）トラ ックにアニールされるプライマーとの組み合わせを用いたＰＣＲ法を利用したく プローマン（Ｐｌｏｗｍａｎ）等、　Ｐｒｏｃ。 Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、、　１９９０．８７．　ＰＰ 、　４９０５−０８）　、ラット腎＠１ｃＤＮＡライブラリーをＡｇｔｌＯ中に 構築しくプローマン（Ｐｌｏｗｍａｎ）等、Ｍｏｌ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏ＋、、　 １９９０゜】０．ｐｐ、　１９６９−８１）　、完全な長さのラットエビテリン ｃＤＮＡを、ＰＣＲ法で形成したエビテリンブローブをもつ２．ＯＸＩＯ’組み 換え体をスクリーニングすることにより単離した。これらのプローブは、またマ ウスＴ［ゲノムライブラリー（ストラタジーヌ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ラジ ョラ、ＣＡ）からマウスエピテリン遺伝子を得るために使用した。数種のＰＣＲ 法で形成したクローン、即ちラフ）　ｃＤＮＡクローンおよびマウスゲノムクロ ーンを、両ストランドにつき、オリゴヌクレオチドプライマーと共にＴ７ボリメ ラーゼを使用して配列決定した（テーパー＆リチャードソン４７６７−７１）。 該ラットエピテｑンｃＯＮＡの複合配列（第１８図）は２１５（ｌｂρの長さを 有し、これはラット腎’ａｎＲＮＡについてのノーザン分析により示されるよう に、はぼ２．３ｋｂの転写物に近似される。この配列は３０ｂρ５−未翻訳領域 を含む５８ト残基のプレタンパクおよび３４３　ｂｐの３′−未翻訳領域である と予想される。第一のＡＩＪＧは、１６個のアミノ酸からなるＮ−末端疎水性シ グナルペプチドと、予想されたＭｒ６１．５９７を有する５７３アミノ酸からな る成熟エビテリン先駆体を伴う。この先駆体は質膜領域、３個の潜在的なＮ−結 合グリコシル化サイトおよび８８システイン残基をもたない。このエビテリン先 駆体は、５５−５７アミノ酸の一致した残基部分：　ＶＸＣＸｓ−ｓｃｘ、ｃｃ ｘ、ｃｃｘ、ｃｃｘ口Ｘ、ＨＣＣＰＸ、ＣＸ、−、ＣＸ、）７縦列コピーを含む 高度に繰り返し性のある構！　（第１９図）を有する。該繰り返し体の２つが既 知のエビテリン１および２を表す。 該マウスおよびヒトエビテリン先駆体の予想されたアミノ酸配列はそれぞれ５８ ９および５９３個の残基を含み、ラットタンパクとの８６％　（マウス）および ７５％（ヒト）の配列同一性を示す（第２１Ａ図）。エピテリンの付随的なイソ 型も存在し得る。というのは、一つのラットｃＤＮＡのクローンが２３４ｂρ（ 第２１Ａ図、アミノ酸３９８−４７５）の欠落を有し、読み取り枠を維持し、か つキメラ残基部分を生成したからである。この欠落は交互ヌブライシングの結果 であると思われる。というのは、その境界が正確に該マウスエビテリン遺伝子内 のエクソン−イントロン接合の位置に認められるからである。 このエビテリン配列と入手可能なタンパクおよびＤＮＡ配列データバンクとの比 較により、既知のタンパクとの相同性を有する３つの領域が存在することが明ら かとなった。該エビテリン先駆体のシグナル配列に続く第一の４１アミノ酸は６ 個のシスティン残基を含み、該残基は他の７個のシスティンに富む残基部分のＮ −末端の半分に類似するパターンで配置されている。該配列：　ＣＰ［１ＧＯＰ ＣＰＶＡＣＣはヒト、ラットおよびマウスのエビテリンに完全に保存されており 、一群のヘビ毒に存在する共通パターンと一致している（ダフトン（Ｄｕｆｔｏ ｎ）、　Ｊ、　Ｍｏｌ、　Ｅｖｏｌ、、　１９Ｂ４゜２０、　ｐｐ、１２８−３ ４）。相同性の第二の領域はラットエビテリンの該システィンに富む残基部分の ３個の中に存在（Ｃ（：Ｘ、ＨＸ２Ｃ）　Ｌ、ホスホリパーゼＡ２の活性サイト の回りの共通部分と一致する（ゴメツ（Ｇｏａ＋ｅｚ）等、　Ｊ、　Ｅｕｒ、　 Ｊ、　［ｌｉｏｃｈｅｍ、、　１９８９．１８６゜ｐｐ、　２３−３３）。最後 に、広い相同性が該エビテリンの１２システイン残基部分きトマトチオールプロ テアーゼのＣ−末端調節ドメインとの間に存在する（第２１０図）。 この非触媒的ドメインは重金属と結合により該プロテアーゼの活性を調節するも のと仮定されている。該エビテリン先駆体の交互のシスナインおよびヒスチジン 残基は種々のタンパクの金属−結合ドメインの存在を暗示しているが、該エビテ リン残基部分は任意の公知の金属−結合共通部分とは一致していない。ノーザン 分析は２．３ｋｂのエピテリン転写体がいたるところで発現さ右、成人の腎臓、 胎盤、心臓、十二指腸、結腸、および大脳皮質において支配的であることを立証 している。更に、これは種々様々な上皮腫瘍セルラインに存在する。サザン分析 は該エビテリン先駆体が単一の複製遺伝子によりコードされることを示している 。これらの結果は、該エビテリン先駆体からの活性分子の生成の転写後のメカニ ズムを示唆している。 ７、乙　ＣＯ８細胞内での発現 ラフトエビテリンの生化学的諸性質はサイトメガロウィルスの即時型プロモータ の制御下でその完全コード配列を発現ベクター中に挿入することにより測定でき る（シード＆アルフォ（Ｓｅｅｄ　ａｎｄ　Ａｒｕｆｆｏ）、　Ｐｒｏｃ、　Ｎ ａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ−。 １９ｇ７．８４．　ＰＰ、　３３６５−６９）。より詳細には、該完全ラットエ ビテリンコード配列を含む１．６ｋｂフラグメントをｃＤＭ８を主体とする発現 ベクター中に挿入して発現ベクターｃｒＥＰＮ１．６を形成した。類似する構築 体ｃｒＥＰＮ１．４を１個のエクソン欠落を有するエビテリンｃＤＮへからの１ ．３５ｋｂフラグメントを挿入することにより調製し、かくしてアミノ酸３９８ −４７５を排除した。分泌プラスミドＣβｒＥＰＮ１およびｃ　Ｂ　ｒＥＰＮ２ を、合成した以下のオリゴヌクレオチド上に含まれるサルのＴＧＦ−β１シグナ ル配列： ＭＰＰＳＧＬＲＬＬＰＬＬ ＬＰＬＬＩＩＬＬＶＬＴＰＳＲＰＡＡ ＣＴＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＣＴＡＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＣＧＣＣＴＡＧＣ ＣＧＧＣ［：ＧＧＣＣＧＣ３゜ＧＡＴＧＧＣＧＡＣＧＡＣＡＣＣＧＡＴＧＡＣＣ ＡＣＧＡＣＴＧＣＧＧＡＴＣＧＧＣＣＧＧＣＣＧＧ　５゜とＰＣＲ法で形成した エピテリン１によび２のコード配列を含む５ａｃｌ　Ｉ−Ｘｂａｌフラグメント を、旧ｎｄｌｌｌおよびＸｂａｌで消化したｃＤＭ８ｓｌｌプラスミドに結合す ることにより構築した。プラスミドｃＯＭ８ｓｌＩは変性ｃＤＭ８ベクターであ り、ここでは固有の５ａｃｌｌサイトがクレノー（Ｋｌｅｎｏｗ）により除去さ れている。この新規な５ａｃｌＪサイトは該エビテリンコード配列を有する枠中 に該シグナルペプチドの最後のグリシンを配置する。これらの発現プラスミドを 感応性のＭＣ１０６１／Ｐ３バクテリア内で成長させ、０ＥＡＥ−デキストラン 法（シード＆アルフｔ（Ｓｅｅｄ　ａｎｄ　Ａｒｕｆｆａ）、　Ｐｒｏｃ。 Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、口、Ｓ、Ａ、、　１９８７．８４．　ＰＰ、 　３３６５−６９）を利用してＣＯ５−１細胞に導入した。トランスフェクショ ンの４８時間後に、該細胞を燐酸緩衝塩水で洗浄し、２５０　μｃｉ／ｍｌのｊ ５Ｓ−システィン（１１０ｔ）ＩＩ：ｉ／ｍＪニューイングランドヌクレアー（ ＮｅｗｌＥｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ））を補充した血清を含まないＭＥＭ （４ｍｌ／１００　ｎ＋＋ｎプレート）中で１６時間標識した。標識した上澄を ０．ＩＮ酢酸溶液に対して透析し、乾燥し、１＋ｎｌずつを１０％または１５％ ＳＯ３−ポリアクリルアミドゲル上で実験した。 一時的に発現されたタンパクは３５Ｓ−システィンで標識した上澄の５ＯＳ−Ｐ ＡＧＥ分析により容易に検出された。この組み換えタンパクは約７５にの分子量 を有し、これは予想された６２になる値よりも僅かに高い。これは多分グリコジ ル化によるものであろう（ｌＥ２６Ａ図のレーン１）。エピテリンをコードする が、Ｃ−末端領域のエクソンを欠く類似の構築物は７８アミノ酸の欠落に比例し て平均のＭｒ６８　Ｋで移動した。該先駆体がプロセッシングされてより小さな 形状のものとなる証拠は見出されなかった。成熟組み換えエビテリン１および２ タンパクを発現するために、そのコード領域を発現ベクター（それぞれＣβｒＢ ＰＮ１およびＣＰｒＢＰＮ２）の合成シグナルペプチド配列の背後に配置した。 これにより、ＣＯＳ細胞から６にタンパクの分泌が見られた（３ｇ２６Ｂ図）。 これらの構築物でトランスフェクションされた咳細胞はその成長が阻害され、か つ形態の変更を示し、擬似トランスフェクションについて見られる完全な単分子 層と比較して、多くの細胞が指輪状の外観を示した。 ＣＰｒＥＰＮ１　）ランスフェクションからの上澄を、バイオ−シル（Ｂｉｏ− Ｓｉｌ）　ＴＳＫ−２５０カラム上で部分的に精製しくショヤブ（Ｓｈｏｙａｂ ）等、　１９９０．８７．　ｐｐ、　４９０５−０９）、画分をＡ４３１細胞に 及ぼす成長阻害活性（ＣＩＡ）につきアッセイした。これらの細胞は活性エビテ リン１を分泌（約２５６ＩＡ単位月００胴プレート）シたが、擬似トランスフェ クションした細胞からの上澄は検出可能な活性をもたなかった（ＩＣＩＡ単位は 細胞成長の５０％阻害を達成するに必要とされる物質の量に対応）。 エビテリン１はＡ４３１細胞に阻害効果を及ぼし、数種の上皮セルラインに対し てマイトジェンとして作用する（上記の第６節参照）。更に、エビテリン１はト ランスフォーミング成長因子ベクターの存在下でラット腎臓の繊維芽細胞の足場 −独立性成長を誘発できる（第１７図）。逆に、エビテリン２は繊維芽細胞の誓 合類のケラチノサイトの成長に影響を与えず、これら両系において（ドーズ依存 的様式で）エビテリン１の該マイトジェン効果に対抗する（第１７図）。プロセ ッシングされていないエビテリン先駆体はこれらのいずれのアッセイにおいても 活性を示さなかった。多分この完全な先駆体は該プロセッシングされた形状のも のきは完全に異なる役割、例えば金属イオンのキレート化、あるいはプロテアー ゼおよびホスホリパーゼの調節等の役割を演するものと思われる。 Ｆｉｇｕｒｅ　１ 保持時間（分） Ｆｉｇｕｒｅ　２ 保持時間（分） Ｆｉｇｕｒｅ　３ 保持時間（分） Ｆｉｇｕｒｅ　４ 保持時間（分） Ｆｉｇｕｒｅ　５ 保持時間（分） 日ｇｕｒｅ　６Ａ　Ｆｉｇｕｒｅ　６ＢＦｉｇｕｒｅ　８ 保持時間（分） Ｆｉｇｕｒｅ　９ 保持時間（分） Ｆｉｇｕｒｅ　１０Ａ 画分番号 Ｆｉｇｕｒｅ　１０Ｂ 画分番号 Ｆｉｇｕｒｅ　１０Ｃ 画分番号 Ｆｉｇｕｒｅ　１０Ｄ 画分番号 Ｆｉｇｕｒｅ　Ｉｆ Ｆｉｇｕｒｅ　１２ Ｆｉｇｕｒｅ　１３ 残基 Ｆｉｇｕｒｅ　１４ タンパク（ｎｇ／ウェル） Ｆｉｇｕｒｅ　１５Ａ Ｆｉｇｕｒｅ　１５Ｂ タンパク　（ｎｇ／ｍｌ） Ｆｉｇｕｒｅ　１６Ａ Ｆｉｇｕｒｅ　１６Ｂ Ｆｉｇｕｒｅ　１７ Ｆｚｇｕｒｅ　け ＭＷＩＬＶＳＷＬＡＬＶＡＲＬＶＡＧＴＯＣＡＴＣＴ；Ｃ；ＡＴＣＣ−、Ｃ５Ｔ ＣＡＣ：：７ＧＧＣＴＣＣＣＣ，−＾Ｇ丁ＧＧＣ入ＡＧＧＣ丁ＣＧＴＣＧＣ７Ｃ 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ｖｘＣＸ５−６Ｃｘ５ＣＣｘ８ＣＣｘ６ＣＣｘＤｘ２ＨＣＣＰＸ４Ｃｘ５．Ｃｘ ２Ｆｉｇｕｒｅ　２１　Ｄ Ｆｉｇｕｒｅ　２２ ｃａｐ　入　ＧＦＴＣＤＴＱＫＧ　丁　ＣＥＱＧＰ）！τｃｃ’ｒａＴｃｃｃｃ ｃｃｃｃｃＴＴＴｘｃｃ’ｒｃ’ｒｃｘｃｘｃｃｃｘｃＡＡｃｃｃτ入ＣＣＴＣ ，ＴＧ入＾ＣλにＧＧＧｆ：ＣＣＣ■b１０６０ Ｆｌｇｕｒｅ　２２　ｆｃｏｎｔ、） Ｆｉｇｕｒｅ　２３ Ｆｉｇｕｒｅ　２３　（Ｃｏｎ【、） Ｆｉｇｕｒｅ　２４ Ｆｉｇｕｒｅ　２５ ＬＲＶＰＡＶＶＧＤＶＫＣＤＤＥＭＳＣＰＤＣＴＣＣＧＣＧＴＣＣＣＡＧＣＡＧ ＴＧＣＴＴＧ＋ＴＧＡＣＧＴＧＡＡＧＴＧＴＧＡＣＧＡＴＧＡＧＡＴＧＡＧ：Ｔ ＧＴＣＣＣＧＡＣ２４０Ｆｉｇｕｒｅ　２６ Ａ　Ｂ Ｆｉｇｕｒｅ　２７ ・　Ｊ シグナル　１２３４５６７ Ｅｐｎ２　Ｅｐｎｌ 要約書 「エビテリン」と命名した一群の新規な成長調節タンパクを開示する。該エビテ リンは有意な構造上の相同性を有する幾つかの別個の構成員を含む。このエピテ リン群の２つの構成員、即ちエビテリン１およびエピテリン２が天然源から精製 された。更に、種々のを索動物源から、ヒト、マウスおよびラットエビテリン先 駆体を包含する成熟および先駆体エピテリンをコードするｃＤＮＡおよびＰＣＲ クローンを得、かつその配列決定を行った。ラットエビテリン先駆体およびその 成熟型の組み換え発現をも開示する。精製エビテリンＩは２感応性の成長調節因 子であって、幾つかの型の細胞の成長を促進できるが、他の細胞の成長を阻害す る。 精製エピテリン２は、成長阻害生活性に関してはエビテリン１１！：同様に機能 する。 しかし、これきは対照的にエビテリン２は見掛は上はエビテリン１の成長促進活 性特性を発揮できず、かつ実際にはこのエビテリン１の活性と拮抗する。 国際調査報告

Claims (51)

【特許請求の範囲】
1. １．実質的に第２２図に記載したアミノ酸残基番号約１〜５９３までのアミノ酸 配列を含むことを特徴とするヒトエピテリン先駆体。
2. ２．実質的に第２２図に記載したアミノ酸残基番号約２８２〜３３７までのアミ ノ酸配列を含むことを特徴とするヒトエピテリン１。
3. ３．実質的に第２２図に記載したアミノ酸残基番号約２０６〜２６２までのアミ ノ酸配列を含むことを特徴とするヒトエピテリン２。
4. ４．実質的に第２２図に記載したアミノ酸残基番号約５９〜１１４までのアミノ 酸配列を含むことを特徴とするヒトエピテリン。
5. ５．実質的に第２２図に記載したアミノ酸残基番号約１２４〜１８０までのアミ ノ酸配列を含むことを特徴とするヒトエピテリン。
6. ６．実質的に第２２図に記載したアミノ酸残基番号約３６４〜４１８までのアミ ノ酸配列を含むことを特徴とするヒトエピテリン。
7. ７．実質的に第２２図に記載したアミノ酸残基番号約４４２〜４９７までのアミ ノ酸配列を含むことを特徴とするヒトエピテリン。
8. ８．実質的に第２２図に記載したアミノ酸残基番号約５１９〜５７４までのアミ ノ酸配列を含むことを特徴とするヒトエピテリン。
9. ９．実質的に第２２図に記載したヌクレオチド残基番号約４１〜１８１９までの ヌクレオチド配列を含むことを特徴とするヒトエピテリン先駆体をコードする核 酸分子。
10. １０．請求の範囲第９項に記載の核酸分子と相補的であるアンチーセンスリボ核 酸分子。
11. １１．実質的に第１８図に記載したアミノ酸残基番号約１〜５８９までのアミノ 酸配列を含むことを特徴とするラットエピテリン先駆体。
12. １２．実質的に第１８図に記載したアミノ酸残基番号約２８０〜３３５までのア ミノ酸配列を含むことを特徴とするラットエピテリン１。
13. １３．実質的に第１８図に記載したアミノ酸残基番号約２０５〜２６１までのア ミノ酸配列を含むことを特徴とするラットエピテリン２。
14. １４．実質的に第１８図に記載したアミノ酸残基番号約５９〜１１４までのアミ ノ酸配列を含むことを特徴とするラットエピテリン。
15. １５．実質的に第１８図に記載したアミノ酸残基番号約１２３〜１７９までのア ミノ酸配列を含むことを特徴とするラットエピテリン。
16. １６．実質的に第１８図に記載したアミノ酸残基番号約３６２〜４１６までのア ミノ酸配列を含むことを特徴とするラットエピテリン。
17. １７．実質的に第１８図に記載したアミノ酸残基番号４４０〜４９５までのアミ ノ酸配列を含むことを特徴とするラットエピテリン。
18. １８．実質的に第１８図に記載したアミノ酸残基番号５１５〜５７０までのアミ ノ酸配列を含むことを特徴とするラットエピテリン。
19. １９．実質的に第１８図に記載したヌクレオチド残基番号約３１〜１７９７まで のヌクレオチド残基配列を含むことを特徴とするラットエピテリン先駆体をコー ドする核酸分子。
20. ２０．請求の範囲第１９項に記載の核酸分子と相補的であるアンチーセンスリボ 核酸分子。
21. ２１．実質的に第２３図に記載したアミノ酸残基番号約１〜５８９までのアミノ 酸配列を含むことを特徴とするマウスエピテリン先駆体。
22. ２２．実質的に第２３図に記載したアミノ酸残基番号約２８０〜３３５までのア ミノ酸配列を含むことを特徴とするマウスエピテリン１。
23. ２３．実質的に第２３図に記載したアミノ酸残基番号約２０５〜２６１までのア ミノ酸配列を含むことを特徴とするマウスエピテリン２。
24. ２４．実質的に第２３図に記載したアミノ酸残基番号約５９〜１１４までのアミ ノ酸配列を含むことを特徴とするマウスエピテリン。
25. ２５．実質的に第２３図に記載したアミノ酸残基番号約１２３〜１７９までのア ミノ酸配列を含むことを特徴とするマウスエピテリン。
26. ２６．実質的に第２３図に記載したアミノ酸残基番号約３６２〜４１６までのア ミノ酸配列を含むことを特徴とするマウスエピテリン。
27. ２７．実質的に第２３図に記載したアミノ酸残基番号約４４０〜４９５までのア ミノ酸配列を含むことを特徴とするマウスエピテリン。
28. ２８．実質的に第２３図に記載したアミノ酸残基番号約５１５〜５７０までのア ミノ酸配−列を含むことを特徴とするマウスエピテリン。
29. ２９．実質的に第２３図に記載したヌクレオチド残基番号約８〜１７７４までの ヌクレオチド残基配列を含むことを特徴とするマウスエピテリン先駆体をコード する核酸分子。
30. ３０．請求の範囲第２９項に記載の核酸分子と相補的であるアンチーセンスリボ 核酸分子。
31. ３１．以下のアミノ酸残基配列： 【配列があります】 （ここで、Ｃはシステイン、Ｄはアスパラギン酸、Ｈはヒスチジン、Ｐはプロリ ン、およびＸは任意のアミノ酸残基を表す）を含むポリペプチド。
32. ３２．以下のアミノ酸残基配列： 【配列があります】 （ここで、ＣはシステインおよびＸは任意のアミノ酸残基を表す｝を含むポリペ プチド。
33. ３３．以下のアミノ酸残基配列： 【配列があります】 （ここで、ＣはシステインおよびＸは任意のアミノ酸残基を表す）を含むポリペ プチド。
34. ３４．腫瘍細胞と、腫瘍細胞の成長を阻害するのに有効な少なくとも１種のエピ テリンとを接触することを含む腫瘍細胞の成長を阻害する方法。
35. ３５．該エピテリンがエピテリン１である請求の範囲第３４項に記載の方法。
36. ３６．該エピテリンがエピテリン２である請求の範囲第３４項に記載の方法。
37. ３７．動物に腫瘍細胞の増殖を阻害するのに有効な量で、少なくとも１種のエピ テリンを投与することを含む該動物中の腫瘍の治療方法。
38. ３８．該エピテリンがエピテリン１である請求の範囲第３７項に記載の方法。
39. ３９．該エピテリンがエピテリン２である請求の範囲第３７項に記載の方法。
40. ４０．創傷部位に、細胞成長の促進に有効な少なくとも１種のエピテリンを投与 することを含む刺傷治癒促進方法。
41. ４１．該エピテリンがエピテリン１である請求の範囲第４０項に記載の方法。
42. ４２．創傷部位に、エピテリン２のエピテリン１−拮抗活性を阻害するのに有効 な投与量で、エピテリン２拮抗剤を投与することを含む創傷治癒促進方法。
43. ４３．該エピテリン２拮抗剤を、細胞成長を促進し得るエピテリンと共に投与す る請求の範囲第４２項に記載の方法。
44. ４４．該エピテワン２拮抗剤をエピテリン１と共に投与する請求の範囲第４２項 に記載の方法。
45. ４５．該エピテリン２拮抗剤が抗−エピテリン２抗体を含む請求の範囲第４２項 に記載の方法。
46. ４６．該抗−エピテリン２抗体を、細胞成長を促進し得るエピテリンと共に投与 する請求の範囲第４５項に記載の方法。
47. ４７．該抗−エピテリン２抗体を、エピテリン１と共に投与する請求の範囲第４ ５項に記載の方法。
48. ４８．乾癬を患う患者に、エピテリンの成長促進活性を阻害するのに有効な組成 物を投与することを含む乾癬の治療方法。
49. ４９．該組成物がエピテリン１の拮抗剤を含む請求の範囲第４８項に記載の方法 。
50. ５０．該エピテワン１拮抗剤がエピテリン２を含有する請求の範囲第４９項に記 載の方法。
51. ５１．該エピテリン１拮抗剤が抗−エピテリン１抗体を含有する請求の範囲第４ ９項に記載の方法。