JPH05506659A - エピテリン類:新規なシステインに富む成長変調タンパク - Google Patents
エピテリン類:新規なシステインに富む成長変調タンパクInfo
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- JPH05506659A JPH05506659A JP91508010A JP50801091A JPH05506659A JP H05506659 A JPH05506659 A JP H05506659A JP 91508010 A JP91508010 A JP 91508010A JP 50801091 A JP50801091 A JP 50801091A JP H05506659 A JPH05506659 A JP H05506659A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
エビテリン類゛新現なシスティンに富む成長変調タンパク■、緒言
本発明は、本出願人が“エビテリン類(Eρ1thelins)”と名付けた新
規な一群の成長調節タンパク類、エビテリン類の調製法、およびその診断並びに
治療における使用に関する。本出願人は天然の細胞源から該エビテリン群の2種
、エビテリンlおよびエピテリン2を精製し、また数種の異なるエビテリン類を
コードするcDNAを単離した。エビテリン1およびエビテリン2は実質的な構
造上の類似性をもつにもかかわらず、機能的には別々のタンパクである。エビテ
リン1は二官能性の成長調節因子であって、幾つかの型の細胞の成長を促進し得
るが、その他の細胞の成育を阻害する。エビテリン2は成長阻害生活性に関して
はエビテリン1と機能的に類似している。しかし、逆にエピテリン2は明白にエ
ビテリン1の成長促進活性特性を発揮し得す、かつ実際にはこのエビテリン活性
と拮抗する。
2、 発明の背景
細胞の成長および分化は、促進、阻害および相乗的な因子並び(、こホルモンの
多様性により開始され、促進され、維持されかつ調節されているものと考えられ
る。
細胞のホメオスターシスメカニズムの変更および/または破壊が、腫瘍形成を含
む成長−関連疾患の基本的な原因であると思われる。成長調節因子はシグナルの
変換、細胞の連絡、成長並びに発生、胚形成、免疫応答、造血、細胞の生存並び
に分化、炎症、組織の治癒並びに改造作用、動脈硬化症および癌を包含する種々
様々な病理学的および生理学的諸過程に関与している。
上皮成長因子(EGP) 、)ランスフォーミング成長因子−α(TGFα)、
血小板由来の成長因子(PDGF>、繊維芽細胞成長因子(FGF) 、神経成
長因子(NGF) 、l−ランスフォーミング成長因子−β(TFGβ)、イン
シュリン成長因子りおよびII(IGFI。
IGF II) 、造血成長因子、例えばエリスロボエチン、コロニー刺激因子
((:SF 1sよび2)、インターロイキン類(IC−1〜8)、インターフ
ェロン類(IFNα、β、T)、腫瘍壊死因子αおよびβ(TNF αおよびβ
)、ロイコレグリン(Ieukoregulin)、オンコスタチン(onco
statin) M、アンフイレグリン(amphiregulin: AR)
、および他の充分に定義されていない諸因子などが、正常な生理学的条件下で、
あるいは外因性の刺激に応答して種々の型の細胞により生産される成長並びに分
化変調タンパクである。これら因子の殆どは自己分泌的におよびパラ分泌的様式
で機能すると思われる(例えば、ゴースチン(Goustin)等のCance
r Res、、 1986.46. Pll。
1015−1029; D−ゼングールト(Rozengurt)、 5cie
nce、 1986.234.1)Ill、 161−166:パルディー(P
ardee)、 Cancer Res、、+987.47. PP、148g
−1491:ザックス98g−1002;バギオリニ(Bagg io I i
n i)等、 J、 Cl1n、 Invest、、 1989.84. p
PB
1045−1049;クレメンズ&マクナーラン((jemens and M
cNurlan)、 BiocheffI、 J、。
L985.226. pp、 345−360;ナーザン(Natban)、
J、 1TIin、 Invest、、 1987.79.@pP。
319−326; スポーン&ロパーツ(Sporn and Roberts
>、 J、 Cl1n、 Invest、、 1986゜78、 pp、 32
9−332;オールド(Old>、 Nature、 19g7.326. P
P、 330−331;ブートラ−&セラミ(Beutler and (:e
rami)、 New EngI、 JlMed、、19B7.316. pP
、 379−385:ワインシュタイン(Weinstein)、 J、 Ce
1l Biochem、、 1987.33. pp、 213−224;ツア
ーリング(7,arling)等、 Proc、 Natl、 Acad、 S
ci、 USA、 1987.83. pp。
9739−9744 ;ショヤブ(Shoyab)等、 Proc、 Natl
、 Acad、 Sci、 ll5A、 1988.85.P1f+。
6528−6532:ショヤブ等、 5cience、 19g9.243.1
111.1074−1076;スポーン&トダロ(Sporn and Tod
aro)、 N−Engl−J、 Med、、 1985.303. pp、
878−880;スポーン&ロパーツ(Sporn and Roberts)
、 Nature、 1985.313. Pll、 745−747を参照の
こと)。
成長変調因子が癌の診断、予後および治療にふける潜在的な用途を有することか
ら、該因子の単離、その特徴付は岐びにその機能的メカニズムの明確化には非常
な興味がある。更に、これら因子に関する知見を得ることは正常な成長調節の隠
された基本的メカニズムの理解並びに癌細胞におけるその喪失を理解する上で大
きな助けとなる。
3、発明の概要
本発明はエビテリン、即ち新規な一群の低分子量の、システィンに富むタンパク
を提供することにあり、該タンパクは二官能性の成長調節活性を示す。また、本
発明は該エビテリンのヒト疾病の診断並びに治療における使用および生物学的に
活性なエピテリンの製造方法を提供することをも目的とする。該エピテリン群の
2種、即ちエビテリン1およびエピテリン2は見掛けの等質性にまで同定かつ精
製さね、その結果本出願人はこれら新規な成長変凱子の一次構造、物理的特性お
よび機能的特徴を決定することができた。該エビテリン群中の他の数種のエビテ
リンがC口NAクローニングにより同定された。エビテリン1は56個のアミノ
酸を含むポリペプチドであり、一方エビテリン2は57個のアミノ酸を含む。構
造的にはエビテリン1とエピテリン2とはアミノ酸レベルで47%の相同性を有
し、かつ各々は同等に配置されたンステイン残基を有する。
エビテリン類は天然源からの単離および精製により、化学的合成により、あるい
は組み変えDNA技術により製造できる。本明細書において実施例として更に充
分に記載される(第6節以降)本発明の特定の態様によれば、エビテリンLおよ
びエビテリン2はラットの腎組織から単離さね、その後ゲル浸透および逆相高速
液体クロマトグラフィー(HPL[:)の組み合わせにより見掛けの等質性にま
で精製される。第6節以降で更に記載されるように、本出願人はエビテリン1お
よび2の構造、物理、化学的並びに機能的な諸特徴に関して充分な特徴付けを行
った。
4、
第1図は粗抽畠物の分取ゲル浸透)IPLCの結果を示した図である。
第2図は第1図の28の実験からのプールした画分25〜28の分取逆相)IP
LCの結果を示した図である。
第3図は第2図からのプールした画分55〜59の半一分取逆相1(PLCの結
果を示した図である。
第4図は前の実験からのプール1bの解析的逆相HPLCの結果を示した図であ
る。
第5図は第3図からのプール2bの解析的逆相HPLCの結果を示した図である
。
第6図は第4図からの濃縮した画分51(A)および52 (B)の解析的ゲル
浸透クロマトグラフィーの結果を示した図である。
第7図は第5図からの濃縮した画分44 (A)および45 (B)の解析的ゲ
ル浸透クロマトグラフィーの結果を示した図である。
第8図は第2図からの画分50〜54の半一分取逆相HPLCの結果を示す図で
ある。
第9図は前の実験からの両分18〜23の解析的逆相■PLcの結果を示す図で
ある。
’JEIO図は第9図からの両分の解析的ゲル浸透クロマトグラフィーの結果を
示した図であり、クロマトグラフィーは第6.1節以降に記載のように実施した
。(A)濃縮画分360HPLC; (B)濃縮画分37のHPLC; (C)
濃縮画分38のHPLC; (D) A−Cからのプールした両分48および4
9を再度クロマトグラフィーにかけ、次いで濃縮した。
第11図はエビテリン1およびエピテリン2のトリセン(Tr 1cene)
−5OS−PAGE分析の結果を示す図である。パイオーラド(Bio−Rad
) ミニ−タンパク11電気泳動装置内で18%のミニゲル(0,75ma X
l0CII X 7CI11)を室温にて、一定の電位90Vにて15時間実
験した。乾燥試料を10μlの試料バッファー(50nM ) IJス、pH6
,8;12%(w/v)グリセロール:4%SO5,4%(V/V)メルカプト
エタノールおよび0.01%セルバブル−(serva blue)G)中に懸
濁し、95℃にて5分間インキュベートし、次いで該ゲル上に適用した。分子量
マーカーは、シアノゲンブロミド(シグマケミカル社(Sigma Chas、
Co、)による馬心臓のミオグロビンの開裂により得た5種のポリペプチドで
あった。(A):エビテリン1、(B):エビテリン2゜第12図はラットの腎
臓から精製したエピテリン1およびエビテリン2のアミノ酸配列であり、アミノ
酸に対する標準的単一文字コードを使用した。即ち、アラニン(A) ;アルギ
ニン(R) ;アスパラギン(N) ;アスパラギン酸(D);システィン(C
) ;グルタミン(Q);グルタミン酸(E)ニゲリシン(G):ヒスチジン(
H);イソロイシン(I);ロイシン(L):リジン(K);メチオニン(M)
;フェニルアラニン(F);プロリン(P);セリン(S) ;スレミニン(
T) ; l−リブトファン(w);チロシン(Y) ;およびバリン(V)。
オリゴヌクレオチドブライマーおよびプローブを設計するのに使用したペプチド
配列は下線を施して示した。
第13図はエビテリン1および2のバイトロバシー分析(カイト&トウーリトル
(Kyte and口oolittle))の結果を示す図であり、−二エピテ
リン1;−−−:エビテリン2゜
第14図は、A431細胞のDNAへの1251−デオキシウリジノ組込みの阻
害に関するエビテリン1およびエビテリン2のドーズ応答曲線である。・:エビ
プリン1:○:エビテリン2゜
第15図において、(A)は二十日ネズミケラチノサイトセルラインBa1b/
MKのDNAへの1251−デオキシウリジン組込みの促進に及ぼすエビテリン
1およびエビテリン2の効果を示す。5%の透析FBSを含む低カルシウム培地
中の2.000〜4、000個の細胞で、96ウエルプレートの1ウエルにつき
被覆した。次いで、第6.2節以降に記載の如< GSAアッセイを実施した。
・:エビテリン1:○:エピテリン2゜(B)はエビテリン1 (20ng/m
l)により誘発されたBa1b/Mに細胞の[lNAへの1251−デオキシウ
リジン組込みに及ぼす種々の濃度のエビテリン2の効果を示す図である。
第16図において、(A)はBa1b/MK細胞の成長に及ぼすエピテリン1お
よび上皮成長因子(EGF)の効果を示す図であり、このアッセイは第6.2節
以降に記載の如〈実施した。・:エビテリンl;O:EGP、また(B)は二十
日ネズミケラチノサイトのエビテリン1 (20ndml)により誘発された成
長に及ぼす種々の濃度のエビテリン20作用を示す図である。
第17図は、TFGβ(log/ml)の存在下での、軟質寒天培地中でのNR
に一5A6細胞コロニー形成に及ぼすエビテリン1および2の作用を示す図であ
る。使用したコロニー形成アッセイは第6.13節以降に記載しである。黒塗り
バー:エピテリン1;点描バー:土皮戊長因子:白抜きバー:エピテリン2;斜
線を施したバー=2On3/mlのエビテリンL +50011に/II+のエ
ピテリン2゜第18図はラットエビテリン先駆体cDNAj;よび推定されたア
ミノ酸配列を示す図である。
第19図はエピテリン自体と比較した、該589アミノ酸ラツト工ピテリン先駆
体の点描マ1−IJックス配列を示す図である。各点は10個の同等な残基中の
5個の伸張(stretch)を表す。
第20図において、(A)はラットエピテリン先駆体の複合二次構造分析の結果
を示し、(B)はラットエビテリン先駆体のバイトロバシーの結果を示す。 第
21図において、(A)はCDNAクローンから推定したヒト、ラットおよびマ
ウスエビテリン先駆体のタンパク配列を比較した結果を示し、該配列は単一文字
コードを使用して表示してあり、同一の残基は点で示した。最適の配列を得るた
めに間隙を設け、これらはダッシュで示した。この予想されたラフトエビテリン
のシグナル配列は下線を付して示し、7個のシスティンに富む特徴部分を四角で
囲んだ。各配列はヒト、ラットまたはマウス腎11RNAから単離したCDNA
およびPCRクローンに基づく共通部分を表している。矢印は、−匹のラットの
cDNAクローンには存在しない領域である、234 bpニゲリシン境界を示
す。また、(B)はラット、マウスおよびヒトエピテリン類のアミノ酸配列を示
す図である。更に、(C)は一致するシスティン特徴部分が該エビテリン類にお
いて保存されていることを示す。(D)は第22図はヒトエピテリン先駆体のヌ
クレオチドおよび推定されたアミノ酸配列を示す。該配列はヒト腎臓中心部RN
AからのPCRクローンに基づく。
第23図はマウスエビテリン先駆体のヌクレオチドおよび推定されたアミノ酸配
列を示す。PCRクローンは成熟マウス腎臓RNAから得た。
第24図はウシエピテリン先駆体のヌクレオチドおよび推定されたアミノ酸配列
(部分配列)を示す。該配列はウシ精巣RNAから得たPCRクローンに基づく
ものである。
第25図は鶏エピテリン先駆体のヌクレオチドおよび推定されたアミノ酸配列(
部分配列)を示す。該配列は鶏輸卵管RNAから得たPCRクローンに基づくも
の−に基づく発現構築物でトランスフェクションされたCO8細胞からの3SS
−システイノ標識上澄を示し、該発現構築物はレーン1:完全ラフトエピテリン
コード領域を含むcrEPNl、 6 ;レーン2 : 234 bρニゲリシ
ン含まないラットエビテリンcDNAイソ型を含むcrt!PN1.4 ;およ
びレーン3:擬似トランスフェクション(mock−transfected)
コントロール。(B)は以下のcDM8発現構築物でトランスフェクションされ
たCO3細胞からのjss−システィノ標識上澄を示し、該発現構築物はレーン
1:成熟ラフトエビテリン1の該コード領域に先行するサルのTGF−β1シグ
ナル配列を含むCβrEPN1;レーン2:ラットエビテリン2に基づく同様な
プラスミドci3rEPH2゜
第27図はラット、マウスおよびヒト源かちのエピテリンのシスティンに富む特
徴部分間のクラスター解析のデンドログラム表示である。下方の図は該エビテリ
ンブリカーサ内の7個の特徴部分の位置を示す、該先駆体の図である。クラスタ
ル(CLIISTAL)多重配ダlプログラムを使用して、P[GENB(カリ
フォルニア州、マウンテンビューのインテリグネテイソクス社(Intelli
gnetics、 Inc、))上に28個のシスティンに富む特徴部分が整列
した。対の類似性のカウントを差異マドIJックスに変形し、これをクラスタ分
析のワーズ(Ward’s>法により解析した(SPSS/PC+ ;イリノイ
、シカゴ)。この方法では、分岐点を配置するために二乗したエフリブアン(E
clidean)距離を使用する。
5、 発明の詳細な説明
本発明は、「エビテリン」と命名した新規な一群の成長調節タンパクに関連する
。このエピテリンは有意な構造上の相同性をもつ数種の別々の構成員を含むよう
に思われる。該エピテリン群の2つの構成員、エビテリン1および2は天然源か
ら精製さね、かつこれらをコードするcDNAおよび該エビテリン群の他の構成
員も特にラット、ヒト、ウシ、二十日ネズミオよび鶏から単離された。
より詳しく言えば、本発明は該エビテリン群の各々のおよび全ての構成員、エビ
テリン誘導体並びに類似体、エビテリンーコード核酸分子(例えば、cDNA、
ゲノAIINA 、 RNA 、アンチセンスRNA等)伝統的なおよび組み換
え[lNAに基づくエビテリンの製造法、組み換えエビテリン発現ベクター、お
よび成熟および先駆体エピテリ人工ビテリンーコード核酸分子、抗−エビテリン
抗体およびエビテリンレセブターの診断および/または治療上の利用に関する。
5.1. エピテリン類の製造
個々のエビテリンは、天然源からの単離、固相ペプチド合成、および組み換えD
NA技術を包含する幾つかの一般的方法によって製造できる。
5、1.1. 天然細胞源からのエピテリンの単離および精製出願人のDNAク
ローニングに関する努力は種々のエビテリンをコードするa+RNAが広い種の
範囲の多数の異なる細胞型において発現されることを明らかにした。
その結果、出願人等は該エビテリン群の個々の構成員が広範な器官、組mLi6
よび/または他の細胞源から単離できるものと予想した。該エビテリン類は相互
に分離でき、かつクロマトグラフィー技術(例えば、逆相液体、ゲル浸透、液体
交換、イオン交換、サイズ排除、kよびアフィニティークロマトグラフィー)、
遠心分離、電気泳動法、示差溶解度法などを包含する(但し、これらに制限され
ない)当分野で公知の分離および精製技術を使用して、かかる細胞源から精製で
きる。
第60節以降において実施例としてより充分に記載される本発明の特定の態様で
は、該エビテリン群の2種の構成員(エビテリン1および2)がラット腎臓組織
から単離され、引き続き特にゲル浸透右よび逆相高速液体クロマトグラフィー(
HPL(:)の組み合わせを利用して見掛は上の等質性にまで精製された。この
ようにして精製されたエビテリンLおよび2はそれぞtL56および57アミノ
酸残基を含む一本鎖ポリペプチドであり、有意の構造上の緒特性を有している。
機能的には、エビテリン1は真の二官能性の成長変調因子であって、細胞成長を
促進し、かつ阻害することができる。エビテリン2は、これが特異的にエピテリ
ン1により誘発された細胞成長促進活性と拮抗するという理由から、機能的には
異なるものと思われる。一般的には程度は低いが、エビテリン1と同様に、エビ
テリン2も細胞の成長を阻害できる。エビテリン1および2の機能、構造、物理
的並びに他の緒特性を決定し、第6.を節以降に記載した。第69節以降に記載
する精製エビテリンIおよび2の6一段階調製法ふよび/またはその変法も該エ
ピテリン群の他の構成員を単離するのに使用できる。
5、1.2. エピテリン類の化学的合成波エビテリン群の個々の構成員は化学
的方法を利用して製造でき、その対応するアミノ酸配列全体またはその部分を合
成できる。例えば、エピテリンは固相技術(スチュアート&ヤング(Stewa
rt and Young)、固相ペプチド合成(Solid PhasePe
ptide 5ynthesis)、 1984.第2版)により合成できる。
このようにして合成されたエピテリンの精製および/またはその生物学的に活性
な高次構造への再折り畳みは当業界で公知の種々の方法により達成できる。該合
成エビテリン類のアミノ酸組成はアミノ酸分析により確認できる。
5、1.3. 組み換えIINA技術を利用したエピテリン類の合成生物学的に
活性な成熟および先駆体エピテリン類は組み換え宿主細胞系内でのエビテリンー
コードDNAの発現により製造できる。遺伝子配列を単離するための一般的技術
、コード化タンパクを合成し得るベクターの構築、および生物学的に活性な組み
換えタンパクの発現および/または分泌は当分野で周知である。
組み換えDNA技術を利用したエビテリンの製造は記載上の目的で4一段階の工
程に分類できる。即ち、(1)該エビテリンの先駆体または成熟体のための該コ
ード配列(遺伝子)の単離または生成、(2)所定のエピテリンの合成を可能き
する発現ベクターの構築、(3)該エビテリン遺伝子を複製および発現できる適
当な宿主細胞のトランスフェクションまたは形質転換および/または該遺伝子生
成物の処理による該所定のエビテリンの製造、および(4)該所定のエピテリン
生成物の同定および精製の4一段階に分離できる。
ラットエビテリン先駆体、その発現、および成熟ラットエピテリン1および2の
発現は第71節以降に示される実施例で記載する。
5、 ]、、 3.1. エビテリン遺伝子の単離または生成種々の個々のエピ
テリン、またはその機能的な等傷物のヌクレオチドコード配列は、所定のエビテ
リン生成物を発現するであろう組み換え発現ベクターの構築に使用できる。エビ
テリンコードヌクレオチド配列は、エビテリノ一様の活性を示すあるいはエビテ
リンをコードするa+RNAを発現する種々の細胞源から得ることができる。本
出願人等はこの点に関連して、幾つかの適当なヒトおよび二十日ネズミの組織源
、例えば胎盤、結腸、腎臓、精巣、副腎、胸部、卵巣、十二指腸、胸腺、および
肺組織(但し、これらに制限されない)を同定した。
エビテリンコード配列はかかる細胞源から単離しかつ精製したRNAからcDN
Aクローニングにより、あるいはゲノムクローニングにより得ることができる。
クローンのcDNAまたはゲノムライブラリーの何れかが当分野で周知の技術を
使用して!!l!11でき、また既知のエビテリン1または2のアミノ酸配列お
よび/または該エビテリン遺伝子の任意の部分に実質的に相補的であるアミノ酸
配列から設計したヌクレオチドプローブを使用して、特定のエビテリンコードD
NAについてスクリーニングすることができる。完全な長さのクローン、即ち所
定の先駆体または成熟エピテ?Jンの全コード領域を含むクローンを発現ベクタ
ーを構築するのに選択することができる。
また、エビテリンコードDNAはその全体または部分を、当分野で標準的な技術
を利用して化学的合成法により合成できる。
ヌクレオチドコード配列の固有の縮退のために、実質的に同一のあるいは機能的
に等価なアミノ酸配列をコードする他のDNA配列を本発明の方法の実施のため
に利用できる。このようなエビテリンヌクレオチド配列の変更は、同一のまたは
機能的に等価な遺伝子生成物をコードする配列中に生ずる種々のヌクレオチドの
削除、付加、または置換を包含する。この遺伝子生成物は、サイレント変化を生
じ、結果として生活性生成物を形成する該配列内のアミノ蕾残基の削除、付加、
または置換を含むことができる。このようなアミノ酸置換は関与する残基の極性
、電荷、溶解度、親水性、疎水性、および/または両親媒性における類似性を基
にして行うことができる。例えば、負に帯電したアミノ酸はアスパラギン酸およ
びグルタミン酸を含み、正に帯電したアミノ酸はリジンおよびアルギニンを含み
、類似する親水性値をもつ非帯電極性基または無極性基を存するアミノ酸はロイ
シン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン
、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、チロシンヲ含ム。
5、1.3.2. エピテリン発現ベクターの構築種々のエピテリンの生物学的
に活性な成熟体または先駆体を発現するためには、高いレベルの転写並びに翻訳
のみならず、該遺伝子生成物の正Mな処理をもたらす発現ベクター/宿主系を選
択しなければならない。このことは、該発現構築物のエビテリン先駆体の全コー
ド配列を使用する場合には特に重要である。というのは、咳エピテリン類の成熟
体が細胞処理工程を介して大きな先駆体から誘導される可能性があるからである
。
当業者は、種々の動物/宿主発現ベクター系(即ち、適当な宿主細胞中のエビテ
リンコード配列の複製、転写および翻訳に必要な要素を含むベクター)を同様に
首尾よく使用することができる。これらの系は、ウィルス発現ベクター/哺乳類
宿主細胞系(例えば、サイトメガロウィルス、ワタシニアウイルス、アデノウィ
ルス、等)、昆虫ウィルス発現ベクター/昆虫細胞系(例えば、バキュロウィル
ス)、哺乳動物細胞のゲノム由来の非ウィルスプロモータ発現系(例えば、マウ
スメタロチオニン(a+etallothionine)プロモータ)等を包含
するが、これらに制限されない。適当な宿主細胞は哺乳類細胞を包含するが、こ
れらに制限されない。例えば、哺乳動物タンパクの一時的発現がCO3細胞宿主
を使用して速成でき、一方安定な発現はCHD細胞宿主を使用して達成できる。
これらベクターの発現要素はその強度並びに特異性にふいて変化する。使用する
宿主/ベクター系に依存して、多数の適当な転写並びに翻訳要素を使用できる。
例えば、哺乳動物細胞内でクローニングする場合、哺乳動物細胞(例えば、マウ
スメタロチオニンブロモータ)のゲノムからの、あるいはこれらの細胞内で成長
するウィルス(例えば、ワタシニアウイルス7.5にプロモータまたはモロニー
(Moloney)二十日ネズミザルコーマウィルスの長い末端繰り返し体)か
ら単離したプロモータを使用できる。組み換えDNAにより生成される、または
合成法により生成されるプロモータも該挿入された配列の転写のために利用でき
る。
特異的開始シグナルも、挿入されたコード配列の充分な翻訳のために必要である
。これらのシグナルはATG開始コドンおよび隣接配列を含む。独自の開始コド
ンおよび隣接配列を含む完全なエビテリン遺伝子が適当な発現ベクターに挿入さ
れた場合には、これ以上の追加の翻訳制御シグナルは必要とされない。しかし、
該コード配列の一部のみが挿入された場合には、該ATG開始コドンを含む外因
性の翻訳ル18シグナルを与える必要がある。更に、開始コドンは該エビテリン
コード配列の読み取り枠と一致していて、結果として全インサートの翻訳を保証
する必要がある。これらの外因的翻訳制御シグナルおよび開始コドンは合成方よ
び天然両者の種々の起源のものであり得る。発現の効率は転写増幅配列、エンハ
ンサ要素等を挿入することにより高めることができる。
DNAフラグメントをベクター内に挿入するための前に記載した方法の何れかを
利用して、興味のある該エビテリン遺伝子および適当な転写/翻訳制御シグナル
えDNA技術、合成技術およびインビボ組み換え技術を包含する。
例えば、発現ベクターとしてアデノウィルスを使用した場合、エビテリンコード
配列はアデノウィルス転写/翻訳制御複合体、例えば後期プロモータおよび三つ
感染宿主内でエピテリンを発現できるウィルスゲノムの非−必須領域で行われる
。同様に、ワタシニア7.5にプロモータが使用できる。
エピテリンを発現するのに使用できるもう一つの発現系は昆虫系である。この領
域(例えば、多角体遺伝子(polyhedrin gene))にクローン化
でき、AcNPVプロモータ(例えば、多角体プロモータ)の制御下におくこと
ができる。エビテリンコード配列の首尾よい挿入は該多角体遺伝子の不活性化お
よび非−閉鎖組み換えウィルス(即ち、該多角体遺伝子によりコードされるタン
パク質性のコートをもれる。
両種性ウィルス型パッケージングセルライン内で調製されたレトロウィルスベク
ターは多くの型の細胞内での効率的な発現を可能とする。この方法は該挿入タン
パクコード配列の細胞型特異的プロセッシング、調節または機能を評価すること
を可能とする。
更に、挿入された配列の発現を変調し、もしくは所定の様式で該遺伝子生成物を
変性並びにプロセッシングする宿主細胞株を選択することができる。あるプロモ
ータからの発現をある誘導物質(例えば、メタロチオネインプロモータに対して
は亜鉛およびカドミウムイオン)の存在下で高めることができる。その結果、遺
伝的に操作されたエピテリンの発現を制御できる。このことは、クローン化外来
遺伝子のタンパク生成物が宿主細胞に対して致死的である場合には、重要である
。更に、タンパク生成物の変性(例えば、グリコリル化)およびプロセンシング
(例えば、開裂)は該タンパクの機能にとって重要である。種々の宿主細胞が、
タンパクの翻訳後のプロセッシングおよび変性のための特徴的なかつ特異的なメ
カニズムを有する。適当なセルラインまたは宿主系を選択することにより、該発
現された外来タンパクの正確な変性およびプロセッシングが保証できる。
組み換えコード配列を含み、生物学的に活性な成熟生成物を発現する宿主細胞を
少なくとも4種の一般的方法、即ち(a> DNA−DNA 、DNA−11N
AまたはRNA−アンチセンスRNAハイブリダイゼーション、(b)「マーカ
ー」遺伝子機能の有無、(C)該宿主細胞中でのエビプリンmRNA転写物の発
現により測定された転写のレベルの評価、および(d)イムノアッセイにより測
定される!熟遺伝子生成物の検出および後のその生物学的活性により同定できる
。
第一の方法において、発現ベクターに挿入されたエビテリンコード配列の存在は
、該エビテリンコード配列に対して相同のヌクレオチド配列を含むプローブを使
用したDNA−DNAハイブリダイゼーションにより検出できる。
第二の方法において、該組み換え発現ベクター/宿主系は、ある種の「マーカー
」遺伝子機能(例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質耐性、メトトレキセー
ト耐性、形質転換フェノタイプ、バキュロウィルス中での閉鎖体(occlus
ionbody)の形成等)の有無に基づいて同定し、かつ選ff11できる。
例えば、エビテリンコード配列が該ベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入され
た場合には、該コード配列を含む組み換え体は該マーカー遺伝子機能の無いこと
により同定できる。
また、マーカー遺伝子は、該エビテリンフード配列の発現の制御のために使用し
たものと同一または異なるプロモータの制御下で該エビテリン配列と縦列で配置
できる。誘発または選】りに応答する該マーカーの発現は該エビテリンコード配
列の発現を示す。
該第三の方法において、エビテリンコード領域に対する転写活性はハイブリダイ
ゼーションアッセイにより評価できる。例えば、ポリアデニル化RNAは、適当
なエビテリンコード配列またはその特定の部分に対して相同であるプローブを使
用したノーインプロットにより単離かつ解析できる。また、該宿主細胞の全核酸
はかかるプローブとのハイブリダイゼーションに対して抽出並びにアッセイでき
る。
該第四の方法においては、該成熟タンパク生成物の発現は免疫学的に、例えばウ
ェスタンプロット法、イムノアッセイ、例えばラジオイムノブレンビテーション
法、酵素−結合イムノアッセイ等により評価できる。しかし、該発現系の達成の
最終的なテストは該生物学的に活性なエピテリン遺伝子生成物の検出を包含する
。該宿主細胞が該遺伝子生成物を分泌する場合、培養したトランスフェクタント
宿主細胞から得た細胞を含まない培地がエビテリン活性につきアッセイされる。
該遺伝子生成物が分泌されない場合には、細胞溶解物をかかる活性につきアッセ
イできる。何れの場合においても、ここに記載した如き成長阻害および促進アッ
セイ等の生物学的アッセイを利用できる。
5、1.4. エピテリン誘導体、類似物質およびペプチド本発明では、エビテ
リンに関連する誘導体、類似物質およびペプチドの製造並びに使用をも意図して
おり、本発明の範囲内にはいる。成長変調活性を示すこのような誘導体、類似物
質およびペプチドにも、種々のエビテリン類と同様に、広範な腫瘍並びに他の成
長関連疾患の診断、予後および治療における用途を見出すことができる。このよ
うな誘導体、類似物質またはペプチドは元のエビテリンと比較して高いまたは低
い生物学的活性をもつことができるか、および/またはエビテリン成長阻害活性
(CIA)−感受性細胞範囲を拡張または制限でき、これらは依然として本発明
の範囲内にある。同様に、高いまたは低い成長促進活性(GSA)をもつ右よび
/またはエビテリンG’SAに応答する細胞の範囲を拡張または制限する、エビ
テリンに関連する該誘導体、類似物質およびペプチドに対しては、創傷および火
傷の治療を包含する有用な用途を見出すことができるが、これらに限定されない
。
本発明のエビテリン関連誘導体、類似物質およびペプチドは当分野で公知の様々
な手段により製造できる。遺伝子およびタンパクレベルでの手順および操作は本
発明の範囲内にある。
タンパクレベルにおいては、種々の化学的修飾を利用して、エビテリノ一様の誘
導体、類但物質またはペプチドを、当分野で公知の技術、例えばアセチル化、ホ
ルミル化、酸化、エンドペプチダーゼ(例えば、シアノゲンブロミド、トリプシ
ン、キモトリプシン、v8プロテアーゼ等)またはエキソペプチダーゼによる特
異的化学開裂(但し、これらに制限されない)により製造できた。
5.2. 抗−エピテリン抗体
エビテリンまたは関連タンパクを認識するポリクローナルおよびモノクローナル
抗体の製造も本発明の範囲内にある。
種々の当分野で公知の方法を使用して、エビテリン類のエピトープに対するポリ
クローナル抗体を製造することができる。抗体を製造するためには、種々の宿主
動物、例えばウサギ、マウス、ラット等(但し、これらに制限されない)をエビ
テリンまたは合成エビテリンペブテドの注射により感作する。該宿主の種に応じ
て、該免疫学的応答性を高めるために様々なアジュバントを使用することができ
、その例はフロイント(完全および不完全)、無機ゲル(例えば、水酸化アルミ
ニウム)、界面活性剤(例えば、リゾレシチン)、プルローニー/ り(Plu
ronic)ポリオール、ポリアニオン、油エマルション、キーホール(key
hole)笠貝ヘモシアニン、ジニトロフェノール、潜在的に有用なヒトアジュ
バント、例えばBCG (バシルカルメットーゲラン(bacille Cal
mette−Guerin))およびコリネバクテリウムバルブム(Coryn
ebacter i印parvum)を包含するが、これらに制限されない。
エビテリンのエピトープに対するモノクローナル抗体は、培地内でのセルライン
の連続培養により抗体を生産する任意の技術を利用して調製できる。これらの技
術はケーラー&ミルシュタイン(Kohler and Milstein)に
より初めて記載されたハイブリドーマ技術(Nature、 1975.256
. PP、 495−497)およびより最近のヒトB−細胞ハイブリドーマ技
術(コスポール(Kosbor)等、 1mmunology Today、
19g3゜4: 72)並びにEBV−ハイブリドーマ技術(フル(Cole)
等、モノクローナル抗体および癌治療(Monoclonal Antibod
ies and Cancer Therapy)、 1985.アランR,リ
ス社(Alan R,Li5s Inc、)、 pp、 77−96)等を包含
するがこれらに制限されない。
該分子のイデオタイブを含む抗体フラグメントは公知の技術により得ることがで
きる。例えば、このようなフラグメントは、該抗体分子のペプシン消化により調
製できるP(ab’)2フラグメント、該F(ab”)2フラグメントのジスル
フィド架橋を還元することにより得ることができるPab“フラグメント、およ
び該抗体分子をパパインおよび還元剤で処理することにより得ることができる2
種のPabフラグメントを包含するが、これらに制限されない。
エビテリンに対する抗体は、成熟エビテリンおよびその先駆体並びに亜成分型の
定性的検出、エビテリンタンパクのアフィニティー精製、エビテリンの生合成、
代謝および機能の解明においてその用途を見出すことができる。また、エビテリ
ンに対する抗体は診断薬および治療薬としても有用である。
5.3. エビテリンの生物学的プロフィール本出願人の初期のcDNへクロー
ニングに関する努力は、成長変調タンパクの該エピテリン群が幾つかの構造的に
類似する構成員からなることを示した。更に、エビテリンーフードmRNAは広
範囲のを索動物に及ぶ幾つかの型の組織で発現されると考えられる。これらの種
々のを索動物起源のエビテリン遺伝子の構造に関わる本出願人の初期のデータは
、該エビテリン遺伝子が決まった位置にあり、かつ少なくとも2億5千万年間か
なり一定に維持されてきたことを示唆している。種々のエピテリンは単鎖低分子
量タンパクであると考えられる。該エピテリン類について得られた何れの配列も
これまでに公知のあらゆるタンパクのものとは全く非相同である。興味あること
に、エビテリンの幾つかはホスホリパーゼA2の活性サイトと相同の領域を含む
。
ラット腎組織から精製したエビテリン1およびエビテリン2はそれぞtL56$
よび57アミノ酸を含むタンパクであり、47%のアミノ酸配列相同性および1
2個の同様に配置したシスティン残基を有する。かくして、両エピテリンのアミ
ノ酸の約175のがシスティンである。これら12個のシスティン残基の配置は
、これらの間のジスルフィド結合の形成を通して、そのパターンは三次構造レベ
ルにおいて多分亜鉛のフィンガー構造と類似する「システィンケージ」を形成す
ることを示唆する。本出願人はこのような特殊なまたは密接に関連したシスティ
ンパターンをもつ他のタンパクを知らない。この特有のシスティンパターンは精
製エビテリン1および2の一次構造のみならず、数種のエビテリンコードcDN
AおよびPIJtクローンから推定された構造にも見られる。従って、この固有
のシスティンのパターンは該エピテリン群の構成員の識別特徴であり、かつ恐ら
く重要な機能的役割を演じているものと思われる。加えて、ある15個の他のア
ミノ酸がこれら2種の精製エピテリン間に保存されている。
完全ラットエビテリン先駆体をコードするcDNAが噴離され、そのヌクレオチ
ドおよび推定されたアミノ酸配列が決定さ瓢箪18図に示されている。このラッ
トエビテリン先駆体は589個のアミノ酸残基を含むポリペプチドで構成さit
、、そのアミノ−末端の17残基はそのシグナルペプチドを含む。少なくとも7
種の完全かつ明白なエビテリン種が該ラット1ピテリン先駆体遺伝子内でコード
されているものと思われる。ラノトエピテリン先駆体c[)NAによりコードさ
れる該エビテリン間の高レベルの配列相同性は、第19図に示した如く、該ラッ
トエビテリン先駆体配列とそれ自体との比較により得られる7、5倍の内側同性
により明らかにすることができる。該ラットエビテリン先駆体の混成二次構造お
よびバイトロバシー解析をそれぞれ1W2OA図および!20B図に示した。ラ
ット、マウスおよびヒトのエビテリン先駆体の間のアミノ酸配列の整合性を第2
1A図に示した。
本出願人は、また完全ヒト、マウスおよびラットエビテリン先駆体DNA配列を
単離した。これらのエビテリン配列の混成の整合性を第21A図に示した。更に
、ウシおよび鳥類起源の種々のエビテリンをコードする多数のPCRクローンを
得た(算24図および第25図)。これら種々の配列の解析は、エピテリン類が
幾分異なる程度に、第21C図に示した如き高度に保存されたシスティン残基部
分(共通部分)により規定される明白な構造上の特徴をもつことを示す。この共
通した配列は該エビテリン類全体において一般的に保存されていると考えられる
が、起源とは無関係に、これまでに調べた全てのエビテリン種において、[CC
X−C[X−CCX5CCJなるシスティンコア残基部分が殆ど完全に保存され
ている。例外は該ラフトエピテリン先駆体の第一の完全繰り返し体を含み、そこ
ではシスティン−セリン置換が存在し、その残基部分はrscX、CCX、SC
X、CC」である。更に、該コア残基部分の25番目の位置のヒスチジン残基は
該エビテリン種全体に保存されているものと思われる。本出願人は、このコア残
基部分が全てのエビテリンについて固有の特徴であると考え、従って本発明はこ
の構造上の特徴を有する全てのタンパクを包含することを意図する。第218図
は整列させたヒト、ラットおよびマウスの成熟エビテリン1〜7のアミノ酸配列
を示す。第21C図に示した配列はこれら3種のエピテリン2〜7間に完全に保
存されている。エビテリンIの配列はこの配列からほんの僅かにずれている。
本出願人は多数のヒトおよび二十日ネズミの組!aおよびセルラインからのRN
Aをエビテリン転写体の存在につき調べた。その結果を以下の表1にまとめた。
胎盤 卵巣 脳
結腸 十二指腸 表皮
腎臓髄質 胸腺 肝臓
腎皮質 肺 下垂体
精巣 腎臓 羊膜
副腎 骨髄
胸部 小脳
CRL 7386 )IBLloo
Caki−I HEMP M[F−7
[RL 1550 CRO1572HTB27Cak i−2HTB132 T
47DHIIP 1477 CEMA−1
CCL 137 RSB2
u937 胸部Ca
117B131 ウイルムズ(Wiln’s) CaT474
TB36
胎盤 卵巣
腎臓 胸腺
膵臓
脳(皮質) 小脳
肺
胚d15
胚 ロ6
肝臓
結腸
十二指腸
骨格筋
CL51
C[:LSI (TPA)
精製したエビテリン1およびエビテリン2の生物学的特徴は第6.を節以降に幾
分詳細に記載する。これら両タンパクはIMの酢酸、IMの水酸化アンモニウム
、6Mの尿素および10−のナトリウムメタペリオデートで、56℃にて30分
間加熱することにより処理した後に安定となる。これら両タンパクの生活性は、
特にタンパク分解酵素および還元剤に対して敏感である。該エビテリン構造中の
少なくとも幾つかのジスルフィド結合が該生活性にとって必須であることは明ら
かである。オリゴサツカライドおよび/または脂質部分がエピテリン1または2
の何れかの該活性に対して必須であるか否かは明確ではない。
エビテリン1および2は、特にヒトエビデルモイド癌細胞に対して成長阻害活性
を示す。しかし、本出願人の結果はエビテリン1がより強力な細胞成長阻害剤で
あることを示唆している。例えば、精製したエビテリン1の計算された特異的活
性はエビテリン2の値のほぼ10倍であり、かつエビテリン1はA431細胞の
成長阻害においてエビテリン2よりも約36倍も強力であると思われる。更に、
少なくともテストしたセルライン、即ちヒト結腸癌細胞においては、エビテリン
1について見られた阻害効果を、エビテリン2に発現させることは不可能であっ
た。
もう一つの興味あることは、細胞成長促進生活性に関わるエビテリン1とエピテ
リン2との間の機能上の相違である。本出願人は、エビテリン1がその成長阻害
生活性の他に幾つかのセルラインに対する細胞成長の強力な促進剤であることを
立証し、このことはエビテリン1が真の二官能性成長変調剤であるという結論に
導いた。逆に、本出願人のデータはエピテリン2が少なくとも該テストしたセル
ラインにおいて成長促進効果を発揮し得ないという事実を示唆する。
恐らく最も興味あることは、エピテリン2がエビテリン1の示す該促進活性と特
異的に拮抗するという本出願人の更なる発見である。これらのおよび/または他
のエビテリン間の機能上の相互関係は現時点では未解決であるが、エピテリン2
がエビテリン1により誘発された該促進活性の制御体として機能する可能性があ
る。本出願人は、エビテリン1と2との間のおよび/または該エビテリン群の他
の構成員間のアゴニスト/拮抗剤としての機能上の関連性が正常なおよび抑制の
ない細胞成長並びに発生間の釣り合いを制御し、さもなくばこれに影響を与える
可能性があると推測する。この点に関連して、細胞ホメオスタシスがかかる相互
関係に関与するエビテリンまたはエビテリン群により与えられる臨界的機能の喪
失によって変更もしくは破壊さL結果として抑制のない細胞増殖が生じ得る。
エビテリン類、抗−エピテリン抗体、および/またはエビテリンレセブターの治
療上での使用を通して、細胞ホメオスタシスが変調さ汰および/または回復され
る。
該エビテリン先駆体からの個々の残基部分を発現する能力は判別プロセッング(
differential processing)が他の活性分子を遊離する
か否かを決定するのに役立つであろう。候補となるエフェクタまたはブロッカ−
(blockers)を選択するためには、’J21A図に示した該システィン
に富む残基部分の配列を整列させて、クラスター解析する。その結果を第27図
にデンドログラムとして示した。全1場合において、最小非類似残基部分が他の
2種の先駆体内の同一の位置に見−っだ。これらの知見に基づいて、該始原エビ
テリン遺伝子は儒歯目動物と人類とが分岐する前に7−倍の複製を受けるものと
提案できる。この解析は、また該エビテリン先駆体の第5番目の繰り返し体がエ
ビテリン1に最も類似しており、かつ成長促進活性をもつ候補であることを示す
。更に、第二の繰り返し体はエビテリン2に最も類似し、エビテリン1のフィト
ジエン効果の拮抗体の候補である。
該エビテリン遺伝子は幾つかの興味ある特徴をもつ。該遺伝子の偏在する発現は
、より限られた分布を有する前に記載した分子とは対照的に、正常な上皮紹の成
長の維持においである役割を演じている。該エビテリン先駆体の高い繰りし性お
よびシスティンに富む構造は新規なかつ進化論的に保存された残基部7E規定す
る。更に、これら残基部分の少なくとも2種はタンパク分解的にプロセッシング
されて活性な成長調節剤となり得る。この構成はプロオピオメラノコルチン(P
OMO1即ち組織特異的にプロ七ツシングされて種々の生活性ペプチドを遊離す
るプロホルモンの構成と類似する(スミス&ファンダー(Smith and
Punder)。
Endocr、 Rev、、 1988.9. pp、 159−79)。
上皮細胞の成長に及ぼすエピテリン1と2との相反する活性は、天然産の構造的
に関連した分子が該親分子の拮抗剤またはサプレッサーとして機能する他の系を
連想させる。その例はインターロイキン−ルセプタ拮抗剤であるIL−1ra
(バーg)
等、 Nature、 1990.343. Pp、 341−46)、Kre
v−1(北南等、 Ce1l、 1989.56. Pa+B
77−84)、ラス(ras)誘発形質転換を抑制するタンパク、およびアクチ
ビン(リング化ing)等、 Nature、 1986.321. PP、
779−82)の生物学的活性と相反する活性の性腺タンパクであるインヒビン
(リング化ing)等、 Proc、 Natl、 Ac’ad、 Sci、口
、S。
A、、 1985.82. PP、 7217−21)を包含する。エビテリン
トおよび2の細胞レセプタの更なる研究が、これらの分子がいかにしてその相反
するシグナルを伝達するかを明らかにするために必要とされる。両活性が同一の
転写体の生成物であるという発見は興味をそそる。結局、組織的、空間的または
一時的特異的プロセッシングが上皮ホメオスタシスの調節の固有の手段を与える
かもしれない。
本出願人は、エビテリンタンパク、エビテリン類似体および誘導体、エビテリン
ーコード核酸分子、抗−エビテリン抗体およびエビテリンレセブタの診断ふよび
/または治療上の用途を含む本発明の組成物の広範囲に渡る用途をも意図してい
る。
5、4.1. エピテリンタンパク
エピテリンタンパク、エピテリン類似体および誘導体、並びにこれらを含有す種
々のエビテリノおよびエピテリン組成物が種々の治療上の目的を達成するために
使用できる。特に、エビテリン1およびエピテリン2との間に観測された機能上
の多様性により、本出願人はこれら2種のエピテリンが種々の目的で使用できる
と考えた。しかし、これらの機能上の差異にもかかわらず、エビテリンlおよび
エピテリン2両者は抗−腫瘍剤として有用である。というのは、これら両者が腫
瘍細胞の成長を阻害する能力をもっこ七が立証されたからである。但し、本出願
人の初期のデータはエビテリンlがより強力および/または有効な腫瘍阻害剤で
あることを示唆している。使用するエビテリン類の特定の組み合わせおよび/ま
たは他の因子との組み合わせは、関与するターゲット細胞の種類並びに所定の特
定の目的に依存するであろう。
インビボでの使用に対しては、本発明の組成物は種々の方法、例えば注射、注入
、局所的、非経口等にれらに限定されない)により投与できる。投与は任意の生
理的に許容される担体、例えば燐酸緩衝塩水、塩水、滅菌水等に溶軟分散した状
態で行うことができる。エビテリンおよび関連分子はリポソーム中に封入しても
よく、また腫瘍または細胞特異性抗原を認識し、かつこれに結合する抗体と組み
合わせて、本発明の組成物の「ターゲティング(targeting)J手段を
与えることができる。
エビテリンは腫瘍細胞内で分化停止を誘発するためにインビボで使用できる。
このような細胞は正常な細胞のWE胞胞化化特性通常の経路からそらさね、かつ
継続的に分化し得る。逆に、正常な細胞は、多くの状況の下では更に細胞分化し
得ない細胞に分化する。かくして、腫瘍内で正常な細胞分化を再活性化し、かつ
最終的に連続的な腫瘍の成長を停止させるエビテリンの能力については、腫瘍の
治療上の養生において、価値ある用途を見出すことができる。
エピテリンおよび関連誘導体、類似体、およびそのペプチドは、腫瘍および成長
関連疾患の治療において、単独でまたは少なくとも1種の他の抗−増殖性化合物
、例えばインターフェロン、TFG−β、腫瘍壊死因子等と共に使用できる。癌
も同様に、該癌細胞内でのエビテリンの産生を誘発することにより治療すること
がラインの成長を阻害して、これに敏感でない細胞d献りすることが可能である
。
このようにして、望ましからぬ細胞がエビテリンの成長阻害活性に敏感である場
合には、異種混合物またはセルラインを該望ましからぬ細胞から開放できる。例
えば、本発明の化合物は自己骨髄移植のために該骨髄から悪性細胞を除去し、か
つ再注入の前に血液中での該悪性細胞の増殖を阻害または排除するためにインビ
上旦で使用できる。
与えられた細胞の増殖を阻害するのに必要なエピテリンの最も有効な濃度は、種
々の濃度のエビテリンを対象とする腫瘍細胞に添加し、細胞増殖の阻害量を追跡
することにより決定できる。個々の誘発体および/またはその組み合わせの最も
有効な■は咳癌細胞内でのエピテリンの産生を追跡することにより決定できる。
細胞成長の促進はエビテリン1、エビテリノ一様分子および恐らく該エビテリン
群の他の構成員により誘起できる。このエビテリンの生活性に基づく広範囲の治
療上の用途は、創傷の治癒および組織改造作用を包含するが、これらに制限され
ない。更に、エビテリン1またはエビテリン1一様分子を同時に投与するこ々に
よりあるいは併用せずに、エビテリン2のエビテリンI−阻害活性を中和できる
抗体も創傷の治!i!i$よび組織改造において有用であり得る。
本発明の組成物は正常な細胞の増殖を包含するヒトの皮膚疾患、例えば乾廚の治
療にふける用途も見出すことができる。乾廚の病因は既知ではないが、この疾病
は迅速な上皮細胞増殖および交代を含む。随伴する迅速なケラチノサイトの交代
は角化を変調し、該疾病の肥厚化した表皮およびりんせつ特性をもたらす。エビ
テリン1はケラチノサイトの成長および増殖を促進するので、このエビプリン1
−誘発性活性を効果的に阻害する治療により、該疾病の発症および進行を阻止で
きる。従って、転摩患者中のエビテリン1の内因性のまたは異常に高いレベルを
もたらす要因を阻害することのできる組成物がこの疾病を治癒するのに有効であ
る。本出願人は、エビテリン2が特異的に該エビテリン1−誘発性のケラチノサ
イト刺激を阻害することを立証した。この点に関連して、エビプリン2−含有組
成物は転層の治療において特に有用である。同様に、エビテリン1の刺激活性を
中和できる抗体をエビテリン1の活性を阻害するのに使用できる。
本出願人は、また他の治療上の目的、例えば血管形成、腎形成、骨再吸収、免疫
応答、シナプスおよび二ニーロンエフェクタ機能、アラキドン酸カスケード、お
よび生殖腺機能並びに再生機能の変調(これらに制限されない)のためにエビテ
リン類およびエピテリン〜様の分子の利用をも包含する。
本発明はエビテリンおよび関連分子の多数の診断的用途をも意図する。本発明の
実施において、目的とするポリペプチドは標識、例えば放射性同位体、酵素、螢
光発光物質、化学発光物質、酵素フラグメント、粒子等と結合することができる
。このような化合物は細胞上に存在するエビテリンレセブタの数を決定するのに
利用できる。エビテリンレセブタの同定は該細胞のエビテリンおよび関連分子の
生物学的効果に対する潜在的応答性の指標となる。エピテリン順、エビテリンー
関連分子お、よび/またはこれらに対する抗体は媒体、特に生理的媒体中でのエ
ビテリンの検出のための競合的アッセイにおいて利用できる。当分野で公知の広
範な診断アッセイが使用できる。
体液および組織内のエビテリンの存在およびその濃度はある種の癌および他の成
長関連疾患の存在およびその広がりと直接または逆に関連している。エビテリン
を検出および/または定量し得るアッセイは成長関連疾患の診断並びに予後にお
ける用途を見出すことができる。
更に、エビテリンレセプタを発現する悪性細胞は、レセプタ結合アッセイにおい
て標識したエビテリンまたはエビテリン関連分子を使用することにより、あるい
は該エビテリンレセブタ自体に対する抗体を使用することにより検出することが
できる。細胞はエビテリンレセブタの存在およびその密度に従ってff1lJで
き、その結果かかる細胞のエビテリンの生物学的活性に対する感受性を予測する
手段が与えられる。
5.4.2. エビテリンーコード核酸分子エビテリンーコ〜ド核酸分子または
そのフラグメントはエピテリンをコードするrnRNAを検出し、定量するため
のプローブきして使用できる。既知の遺伝子の全てまたは一部を含む配列を検出
ために核酸プローブを使用するアッセイは当分野で周知である。エピテリンmR
NA濃度は腫瘍の発生および/または存在並びに転摩等(これに制限されない)
の他のヒト疾患の発病および/またはその進行の徴候となる可能性がある。従っ
て、エビテリンmRNAを検出かつ定量できるアッセイは価値ある診断手段を与
える。
アンチセンスエビプリンRNA分子は、治療上の目的が所定のエビテリンの存在
を排除したい場合には、エビテリンをコードするdNAの翻訳を阻害するために
治療上有用である。例えば、エビテリンアンチセンスRNAは、エビテリン1が
病因物質である疾患の治療においてエビテリン1拮抗試薬として有用であり得る
。また、エビテリンアンチャンスRNAはエビテリン機能のメカニズムを検討す
る上で有用である。
エビテリンコード核酸分子は、上記の第5.1.3.節で別途論議した如く、組
み換えエピテリンタンパクおよびその関連分子の製造に利用できる。
ペルーフリーズ(Pel−Freeze;アーカンサス、ロジャーズ)からラッ
トの腎臓を得た。凍結ラット腎II(湿潤重量430 g)を、2348m1ノ
エタノール(98℃、19m1の濃HC1181,5mg(Dフェニルメチル−
スルホニルフルオライドおよび2.8mlのアブロトニ7 (aproton
in) (23T1口/m1:ウシ肺由来のもの;シグマ社製(SigmaCh
emical Co、)を含む抽出用緩衝液2370m1中に懸濁した。この組
織を4℃にて4〜6時間に渡り解凍し、この混合物をワーリングブレンダーでホ
モジナイズした。
この混合物を4℃にて一夜撹拌し、ツルバール(Solvall) G5−30
−ター内で9、000rpmlこて40分間還Iじ都連し、得られた上澄液(2
,200ml)を注意して取り出した。クロロホルム(2,200m l) i
6よび220i1の酸性水(375mlの水+7.5fii+の濃1(CI)を
該上澄液に添加し、得られた混合物を約1時間激しく撹拌し、室温にて放置して
、2相に分離させた。上部の水性相を注意して取り出し、No、 3スペクトロ
ボア(Spectroρore)透析チューブ(遮断分子量約3.000>中に
入れて、4℃にて0、IMの酢酸溶液17Ilに対して透析した。この透析バッ
ファーは2日間の期間中3回交換した。この透析内液(retenate)を凍
結乾燥し、この凍結乾燥物質(4,55g;粗抽出物と呼ぶ)を後に使用するま
で一20℃にて保存した。
6、1.1 分取ゲル浸透クロマトグラフィーバイオーシ、L (B 1o−5
i ]) ]TSK−250力5ム21.5 X600 ss;バイオラド(B
ioRad)製)を高速液体クロマトグラフィー(IIPLc)系(ウォーター
ズ(Waters) )に取り付けた。上記の粗抽出物(25a+g/ml)を
0.1%のトリフルオロ酢酸(TFA)を含有する50%アセトニトリル/水に
溶解した。この混合物の3mlアリコートを注入し、イソクラティック溶出を0
.1%TFAを含む50%アセトニトリルの移動相を使用して実施した。流量は
む1/分とし、チャート速度を0.25 ai/分とした。6m1ずっの両分を
集めた。このクロマトグラフィーは室温にて実施した。各両分からのアリコート
を蒸発させ、罵6.2. l、節以降に記載するように、A431ヒトエビデル
モイド癌細胞に関して、成長阻害活性(CIA)につき3回アッセイした(第1
図)。
遅く溶出する微小ピーク(画分25−28)は興味ある新規な活性を有する物質
を含む。57回に渡る同様な実験から得られた画分25−28をプールし、濃縮
し、凍結乾燥した。この凍結乾燥した物質は473 ff1gであり、全体で約
し1刈05GIA単位を有識凍結乾燥した両分(上記の第6.1.2.節)を0
,1%TFAの水溶液240 ifに溶解し、この混合物を遠心分離処理し、得
られた上澄液を注意して取り出した。最終体積は約250 mlであった。12
51のこの混合物を、HPLC装置に取りつけた分取パーティシル(Parti
si l) 100DS−3カラム(10μ、2.2x25ao;)77トマン
(What+nan))にイソクラティック方式で注入した。流量は4m1/分
に設定した。一旦該試料を該カラムに通した後、該カラムを1501111の0
,1%TFA水溶液で洗浄した。線型勾配を該−次溶媒(0,1%TFA水溶液
)と二次溶媒(0,1%TFAを含むアセトニトリル)との間に設定した。該勾
配条件は270分間はO対45%とし、45分間は45対100%とした。14
slずつの画分を集め、各両分のアリコートをCIAにつきアッセイした。
活性の4つのブロードなピークが観測された(第2図)。第二の実験を上記の如
〈実施した。2つの初期溶出ピーク、即ちピークaおよびb、はそれぞれエピテ
リン1および2を含有しており、そこでこれらを更に精製並びに特徴付けした。
エビテリン1および2のさらなる精製は別々に以下に記載する。
6、1.4. 逆相およびゲル浸透HPLCによるエビテリン1の更なる精製2
つの実験からの画分55−59 慄2図)をプールし、0.1%TFA水溶液で
2倍に希釈した。この混合物をイソクラティック方式で半一分取μmボンダバッ
ク(Bondapak)−[18カラム(7,8X 300 mm ;ウォータ
ーズ(llaters))に室温にて2+nl/分なる流量で注入した。−次溶
媒(0,1%TFA水溶液)と二次溶媒(0,1%TFAを含むアセトニトリル
)との間の線型勾配条件は1,8分間は0対18%とし、20分間は18対18
%とし、240分間は18対3鶴とし、10分間は34対100%とした。流量
は該勾配溶出中ずっと2 it/分に設定し、7IIllずつの両分を集めた。
アリコートを取り出し、GIAにつきアッセイした。2つのピークが、それぞれ
アセトニトリルの濃度約24%および25%にて溶出した両分に見られた(第3
図)。
画分30−34をプールした。45m1の0.1%TFA水溶液をこのプールし
た両分に添加した。この混合物をイソクラティック方式で半一分取μmボンダバ
ック(Bondapak)−CNカラム(3,9X 300 an ;ウォータ
ーズ(Waters))に室温にてl all/分なる流量で注入した。線型勾
配条件は1分間は0対10%とし、19分間は10対10%とし、200分間は
10対30%とし、7分間は30対100%とした。流量は0.5sl/分に設
定し、1.5slずつの両分を集めた。該活性の殆どはアセトニトリル濃度約2
1.5%にて該カラムから溶出された両分中に存在した(第4図)。
画分36−43をプールし、0.1%TFA/H,Oで最終体積が115 ml
となるように希釈し、正確に上で画分30−34について記載したようにクロマ
トグラフィー処理した。該活性の殆どはアセトニトリル濃度それぞれ約22.5
%および23.5%にて該カラムから溶出された2つのピーク中に存在した(第
5図)。
画分51および52(第4図)はそれぞれスピード−バク(speed−vac
)濃縮装置(サバン) (Savant))を使用して、体積約70μlにまで
濃縮し、これに等体積の0.1%TP^を含むアセトニトリルを添加した。この
140μlの試料を、縦列に配置したバイオ−シル(B 1o−S i I)
TSK−250カラム(それぞれ7.5 X300 m制パイオーラド(Bio
−Rad)製)上に注入した。溶出は室温にて、50%アセトニトリル/H20
(0,1%TFAを含む)の移動相を使用して実施した。流量は0.4sl/分
に設定し、チャート速度は0.25cm/分に設定した。各fl、4mlの両分
を集め、その71JコートをGIAにつきアッセイした。画分51オよび52の
クロマトグラフィープロフィールをそれぞれ第6A図および第6B図に示した。
画分44および45(lEs図)は別々に70μlにまで濃縮し、次いで上記の
如くゲル浸透クロマトグラフィーにかけた。そのクロマトグラフィープロフィー
ルを第7図に与えた。
6、1.5. 逆相およびゲル浸透HPLCによるエピテリン2の更なる精製2
つの実験からの画分5l−54(第2図)をプールし、0.1%TFA/H20
で2倍に希釈した。この混合物を半一分取μmボンダバック(Bondapak
)−CI8カラム(7,8X 30叩;ウォーターズ(Ilaters) )に
室温にて2sl/分なる流量で適用した。−次溶媒(0,1%TFA水溶液)と
二次溶媒(0,1%TFAを含むアセトニトリル)との間の線型勾配条件は1.
8分間は0対18%とし、20分間は18対18%とし、240分間は18対3
4%とし、10分間は34対100%とした。流量は該勾配溶出中ずっと2 +
sl/分に設定し、7slずつの画分を集めた。アリコートを取り出し、GIA
につきアッセイした。
そのクロマトグラフィープロフィールを第8図に示した。活性の主ピークは、ア
セトニ)IJルの濃度約20.5%にて溶出した両分に見られた。
両分1g−23をプールし、0.1%TFA/H,0で最終体積が110 ml
となるように希釈した。この混合物をμmボンダバック(Bondapak)−
CNカラム(3,9X300 w; ウォーターズ(Waters))に室温に
て1+nl/分なる流量で適用した。勾配条件は1分間は0対lO%とし、19
分間は10対10%とし、200分間は10対30%とし、7分間は30対10
0%とした。流量は0.5sl/分に設定し、1.5slずつの両分を集めた。
該活性はアセトニトリル濃度約18%にて該カラムから溶出された画分中に存在
したく第9図)。
画分36および38(第8図)をそれぞれ体積約70μlにまで濃縮し、これに
等体積の0.1%TF^を含むアセトニトリルを添加した。この140μlの試
料を、2つ並べて配置したパイオーシル(B 1o−S i I )TSK−2
50カラム(それぞれ7.5 X300 m;バイオラド(BioRad)製)
上に適用した。溶出は室温にて、50%アセトニトリル/H20(0,1%TF
Aを含む)の移動相を使用してイソクラティック方式で実施した。流量は0.4
sl/分に設定し、各0.4+slの両分を集め、そのアリコートをCIAにつ
きアッセイした。画分36.37オよび38のクロマトグラフィープロフィール
をそれぞれ第10A図、第10B図および第10C図に示した。
第10^−0図からの両分48および49をプールし、約70μlにまで濃縮し
、次いで上記の如くゲル浸透クロマトグラフィーにかけた。そのクロマトグラフ
ィープロフィールを第100図に与えた。
細胞成長阻害活性(CIAンに関するアッセイを平底型96ウエルプレート (
フアシヨン(Falcon)3072)内で実施した。外陰部細胞(A431)
のヒトエビデルモイド癌をCIA様のテスト細胞として使用した。テスト培地(
5%の加熱不活性化した子牛血清(FBS)を補充したDMEM、ペニシリン/
ストレプトマイシン(PS)、およびグルタミン)50μβ中に分散させた3、
5X10’個の細胞を、周辺ウェルを除く全てのウェルに入れた。該周辺ウェル
には50μlのPBSを入れた。3時間後に、テスト培地中のテスト試料50μ
lを各ウェルに添加し、一方でコントロールウェルには50μlのテスト培地の
みを添加した。該テスト試料の各濃度に対して3個ずつのウェルを使用した。プ
レートを37℃にて2〜3日間インキュベートした。次いで、+2’!−ヨー
ト−2’−”’l−テtキシウ’J シン(12sI−IUdR,4Ci/mg
−0,5mCi/++Il 、tスト培地中2μj!/ml)の溶液100μl
を各ウェルに添加し、該プレートを37℃にてインキュベートした。4〜6時間
後、該培地を該ウェルから吸い取り、これらを次に1回200μlのPBSで洗
浄した。次いで、各ウェルに200μlのメタノールを添加し、プレートを室温
にて10分間インキュベートし、メタノールを吸引により除去した。200μl
の1M水酸化ナトリウムを各ウェルに添加し、該プレートを37℃にて30分間
インキュベートした。水酸化ナトリウムをタイタテックブラグズ(titert
ek plugs;フローラブズ製(Flow Labs))を使用して除去し
た。このプラグを12 X 75mmのプラスチックチューブに移し、取り込ま
れた12’l−111dRを定量するためにガンマカウンターでカウントした。
24−ウェルのコスタ−((:ostar)プレート内で、1国1の低カルシウ
ム培地(ワイスマン&アーロンソン<l1eisso+an and Aaro
nson)、 Ce1l、 19g3.32.9p、、 599−606;カー
ペンタ−&ツエンデグット(Carpenter and Zendegut)
、 Anal。
Biochem、、 1985.153. PP、 279−282)に分散し
たBa1b/MK細胞をウェル当たりの密度lX104細胞で被覆し、37℃に
て4〜6時間インキュベートした。次いで、該培地を除去し、テスト化合物を種
々の濃度で含むfmlの培地(各々3個)で置換した。コントロールウェルには
該テスト化合物を含まない培地のみを添加した。
これらのプレートを37℃にて4日間インキュベートし、次いで該培地を除去し
、ウェルを2回ILllの燐酸緩衝塩水ですすぎ、該細胞をトリプシン−E[l
TAで分離し、計数した。
また、Ba1b/MK細胞を96ウエルプレート中で指示細胞として使用して、
前の節で記載した如く、DNAに組み込んだ125I−デオキシウリジンを使用
してテスト物質の成長阻害活性(CIA)または成長促進活性(GSA)を評価
した。
6.2.3. 軟JtlK天コロニーアッセイ10%の加熱して不活性化したF
BSを含むI1MEM中の0.5%寒天(アガーノープル(Agar Nobl
e) ; ミシガン州、デトロイトのディフコラボラトリーズ社(口ifc。
1、aboratories))のベース層0.38IIlをコスタ−組織培養
プレートに添加した。同一の培地−PBS混合物を含有する0、3%の寒天溶液
0.38a+l、6−12X10’テスト細胞および種々の濃度のテストタンパ
クを該寒天のベース層上に重ねた。これらのプレートを5%CO7含有空気の湿
潤雰囲気内で37℃にてインキュベートした。コロニーが形成されたがこれらは
固定かつ染色されず、該コロニーの数は7〜10日の間に計数した。コロニーは
少なくとも8個の細胞を含むクラスターとして定義した。
タンパク(1,0−20Mg)を1.5nlのマイクロヒュージ(Llicro
f uge)ポリプロピレン管内で乾燥し、100μ&の0.05M Tr 1
s−)1cI (pH7,5)中に溶解した鵠の尿素中に懸濁した。次いで4μ
lの2−メルカプトエタノールを該混合物に添加し、その内容物を混合し、窒素
でフラッシングし、25℃にてインキュベートした。2.5時間後、t5μlの
新たに蒸溜した4−ビニルピリジンを該混合物に添加し、咳管を再度窒素でフラ
ッシングし、25℃にて2時間インキュベートした。この反応混合物を10%T
F八でp)12.0の酸性とした。S−ピリジルエチル化タンパクをパーティシ
ル(Partisil) 50DS−3カラム(t6 x 1005m ;)7
−/トマン(llhatman) )を使用して逆相HPLCで精製した。流量
1 ml/分にて、55分間アセトニトリルの濃度を直線状にcIv分)増大さ
せた。該−次溶媒としては0.1%TFA/)1,0を使用した。S−ピリジル
エチル化−エビゾリン1 (SPE−エビゾリン1)および5PE−エビゾリン
2は、それぞれ未処理のエビゾリンよりも約2〜3%高いアセトニトリル濃度で
ある約25%および23%で溶出された。
6.3.2. 5PE−エビゾリン1および5PE−エビゾリン2の酵素的開裂
エンドペプチダーゼLys−CおよびTPCK−) IJプシンによる開裂を、
25℃にて16時間60μlの0. LM Tris−酢酸(pH8,0>中で
実施した。酵素/基質比は1〜5(w/w)であった。エンドペプチダーゼ−A
rgおよびS、オーレウス(aureus) Vllプロテアーゼ消化は37℃
にて16時間、80ttitの0.05 M Tris−HCI (pH8,0
) 、O−1M重炭酸アンモニウム中で実施した。酵素/基質比はこの場合も1
〜5とした。
6、3.3. ペプチドの単離
ペプチドをHPLC装置(ウォーターズ(ilaters) )に取りつけた逆
相HPLCC18(4,6X1001IIfl+;)7−/トマン(Whatm
an) )上で分離した。酸性にした試料(pH2,0)を0.1%TFA (
−次溶媒)で平衡化したカラムに流量1ml/分で適用し、該カラムを約15m
1の0.1%TFAで洗浄した。該−次溶媒と二次溶媒((1,1% TFAを
含むアセトニトリル)との間の線型勾配を使用した。勾配条件は125分間は流
量0.5ml/分にてO対50%とした。
6、3.4 アミノ酸分析
乾燥試料を、105℃にて16時間、テフロン−封止ガラス加水分解バルブ(ピ
アース(Pierce))内で、減圧下にて1%(V/V)のフェノールを含有
する定常的に沸騰させたHCI (5,7M;ピアース(Pierce))で加
水分解した。この加水分解生成物をスピードバク(Speed Vac)濃縮器
(サーバントインスツルメンツ(SavantInstruments)製)で
乾燥し、室温にて20分間フェニルイソチオシアネートで処理した(deriv
itized)。フェニルチオカルバミルアミノ酸誘導体を、オクタデシル(O
ctadecyl)カラム(t5X250 m; IBM)上で逆相HPLCに
より分析した。−次溶媒、即ち0.15M酢酸ナトリウム(pH6,4>、0.
05%トリエチルアミン(酢酸でPt16.4まで滴定した)と、二次溶媒、即
ち60%ア七ト二トリル溶液との間に線型の勾配を設定し、38℃にて流量を1
ml/分とした。
6、3.5. アミノ酸配列決定
ペプチド配列はアプライドバイオシステム(Applied Biosyste
m)モデル475気相配列決定装置により、ヒユーイック(Hewick)等の
J、Biol、 Cheffl、、 1981.256゜pp、 7990−7
997に記載の方法に従って決定した。エドマン(Edman)分解の3つの予
備サイクルを、試料を各実験にかける前に実施した。トリアゾリン誘導体をフェ
ニルチオヒダントインアミノ酸に転化するために25%TFAを使用した。フェ
ニルチオヒダントインアミノ酸の同定はオンラインでモデル120A PTI(
分析器(アプライドバイオシステム(Applied Biosystea+)
社製)により、バンカピラー&フッド(Hunkapiller and Ho
od)の5cience、 1983.219. pp、 650−659に記
載の方法に従って実施した。
6.3.6.トリンンードデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動ンヤージャー&ゲブハード(Schager and Gebhard)の
Biochem、、 1987. 166゜pp、 36B−379に記載の方
法に従って、タンパクをトリシンードデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミ
ドスラブゲル(通常のまたはミニバイオ−ラド(Bio−Rad)装W!1)上
で分析した。タンパクは銀染色(レイ(Wray)等、 Anal、 Bioc
hem、。
エビゾリン1およびエビゾリン2はIMの酢酸、6Mの尿素、0.01Mのナト
リウムメタペリオデートと共に56℃にて30分間の処理に対して耐性であり、
かつ種々のグリコシダーゼまたはリパーゼによる処理に対して耐性である。しか
し、エビゾリン活性は還元、還元および4−ビニルピリジン処理並びにプロトコ
−ル、例えばトリプシン、エンドペプチダ−ゼLys−C、およびエンドペプチ
ダ−ゼGlu−C(VB)による消化に対して感受性をもつ。これらの結果は、
これらの因子が生物学的活性に対して必須のジスルフィド結合状態のシスティン
を含むタンパクであるこきを示唆している。これらのタンパクは、生物学的活性
に対しては有害なオリゴサツカライドおよび/または脂質部分を含まない。
6、t2. エビゾリン1および2の精製および幾つかの物理的特性エビゾリン
[および2の精製の概要をそれぞれ以下の表IおよびI+に示した。
これら両因子を類似する6一段階のプロトコールにより見掛は上相間となるまで
精製した。初期段階の両分はA431細胞に対して多様な成長阻害活性物質を含
む。
エビゾリン1および2は初期画分中の全CIAのほんの僅かな部分を構成するに
すぎず、精製の初期段階においてその特異的活性を定量することを極めて困難な
ものとしている。精製エビゾリン1の特異的活性は約2.lX10’単Urng
タンパクであるが、精製エビゾリン2は3.8X10’単位/mgタンパクとい
うより低い特異的活性を有していた。
粗精製物 4,550.000 1,283.100” 2B2 −分取TSK
−250473,000112,200” 237 −公司こ 0DS (b)
17.600 14.100 801 100半分取C18lb 1.510
2.080 1.377 14.82b 3.460 5,460 1.57
8 38.7Ana1. Cyano ]、b 60 713 11.889
3.42b 73 1.190 16.301 8−4Ana1. Tsk−2
50lb 41 A45 20.609 6.02b 62 1.305 21
,048 9.31)=11半のGIAは、A431細胞への1251−標識チ
オキシウリジンの組み込みを50%阻害するに必要な量である。
2):これらの両分には他の成長阻害活性が存在する。これらの値は全活性を含
むものである。
表IIIエピテリン2の精製の概要(GIA)画分 タンパク、μgGIAj1
位1)特異的活性(単位h) 収率(1)粗精製物 4,550.OOo 1.
283,100” 282 −分取TSK−250473,000112,20
0”+ 237 −公司こ 0口5(b) 24.500 9.567 432
100半分取C1g 4,760 1,190 250 12.4Anal、
Cyano 169 460 2.741 tllAnal、 TSk−25
0371413,810151):1半位のGIAは、A431細胞への125
1−標識デオキシウリジンの組み込みを5σ%阻害するに必要な量である。
2):これらの両分には他の成長阻害活性が存在する。これらの値は全活性を含
むものである。
TSK−250カラム上でのゲル浸透クロマトグラフィーにより測定したエビゾ
リンLおよび2の分子量はそれぞれ約4.500および約3.700 (第6.
7および10図)であった。5PE−エビゾリン1または2は同様なゲル浸透ク
ロマトグラフィーにより測定した分子量約13.000を示した。
第11図は還元条件下での18%ポリアクリルアミドゲル内でのエピテリン1お
よび2の分析結果を示す図である。エビテリン1およびエピテリン2は、中央値
の相対的分子量それぞれ約5.500および6.000を有する単一のバンドと
して該ゲル中を移動した。同様な結果が、タンパクを非還元条件下で電気泳動し
た場合にも観測された。かくして、エピテリンは単一鎖の低分子量タンパクであ
る。
6、 t 3. エビテリン1およびエピテリン2の化学的構造エビテリンLお
よび2のアミノ酸配列はS−ピリジルエチル化タンパク、およびから推定した。
エビテリン[および2のアミノ酸配列を第12図に示した。
エビテリン1および2のタンパク配列をナショナルバイオメディカルリサーチフ
ァウンデーションNational Biomedical Re5earch
Foundation)データベース(公開物数(re 1ease) 22
)、ジエネティックシーケンスデータバンク〔ボルトベラネク&ニューマン(B
olt Beranek and Newman)、 ロスアラモスナショナル
ラボラトリ−(Los Alamos National Laborator
y) ;公開物数61)、およびヨーロピアンモレキュラーバイオロジーラボラ
トリ−(European Mo1ecular BiologyLabora
tory)データバンク(公開物数20)の全てのタンパクと比較した。これら
のコンピュータを使用した検索はこれら両タンパクが新規なものであり、かつ該
3つのデータバンクの全てのタンパクに対して有意の相同性をもたないことが明
らかとなった。
エビテリン1および2はそれぞれ56および57個のアミノ酸残基をもち、計算
された分子量それぞれ6060および6094をもつ一本鎮ポリペプチドである
。エビテリン1および2はそのアミノ酸レベルにおいて47%の相同性をもつ。
これら両タンパクは12個のシスティン残基をもち、4組の2重システィン残基
を有する。かくして、これら両タンパク中のアミノ酸残基の約21%がシスティ
ンである。更に、該エビテリン1および2中の単一システィン残基と2重システ
ィン残基との間の間隔は同一である。これらのタンパク中の領内ジスルフィド結
合の数または位置は現時点ては未知であるが、類似するまたは同一のパターンを
もつことが予想される。これら両タンパクは、また約13%のヒドロキシアミノ
酸(セリンとスレオニンとを一緒に)を含む。エビテリン1および2のアミノ酸
配列を第12図に示す。
システィン残基の保存に加えて、15個の他の残基がエピテリン1とエビテリン
2との間で保存されている。
エビテリンLおよび2のバイトロバジ−プロフィールを第13図に示す。エビテ
リン1のバイトロバジ−プロフィールはエピテリン2のそれと幾分類似するが、
エビテリン2はエビテリン1よりも一層親水性であると思われる。
6、 t t エピテリン1およびエピテリン2の生物学的効果種々の濃度のエ
ビテリン1およびエビテリン2による、′2S1−デオキシウリジンのヒトエピ
デルモイド癌A431細胞のDNAへの組み込み阻害を第14図に与えた。
DNAの50%阻害は12.8ng/ウェルのエビテリン[および450ng/
ウェルのエビテリン2において観測された。即ち、50%阻害は約21nM濃度
のエビテリン1および約0.75μm濃度のエピテリン2において見られた。従
って、エビテリン1は、このアッセイではエビテリン2よりも約36倍も強力で
ある。
種々の腫瘍および非腫瘍性ヒトセルライン並びに数種のヒト以外のセルラインの
DNAへの1251−デオキシウリジンの組み込みに及ぼすエビテリンの効果を
調べた。エピテリン1 (テストした最大ドーズ: 20 ng/+il)はヒ
ト結腸癌セルラインHCT 116の成長を僅かに阻害したが、エビテリン2(
テストした最大ドーズ:270ng/ml)はこのセルラインに対して何隻効果
を示さなかった。これら両タンパクはミンク肺CCL 64細胞およびサル腎1
icosi細胞のDNAへの+ts(−デオキシウリジンの組み込みを有意に阻
害した。これらタンパクのいずれもテストした最大ドーズ(エビテリン1に対し
て2(1ng/mlおよびエピテリン2に対して270ng/ml)においてヒ
ト繊維芽細胞および幾つかの他のヒト腫瘍細胞に対して有意な作用を何等示さな
かった。
二十日ネズミケラチノサイト(Balb/MK細胞)のDNAへの1251−デ
オキシウリジンの組み込みに及ぼすエビテリン1および2の種々の濃度の効果を
調べた。データを第15A図に示す。エビテリン1は濃度−依存的に1251−
デオキシウリジンの組み込みを促進し、一方エピテリン2は何等有意な効果を示
さなかった。しかし、エピテリン2はエビテリン1により誘発されたBa1b/
MK細胞への1251−デオキシウリジンの組み込みを阻害した(34158図
)。この点に関連して、50%阻害はエビテリン2約21nMにおいて観測され
た。かくして、エピテリン2はこの系のエビテリン1の効果と拮抗する。
二十日ネズミのケラチノサイトセルラインBa1b/Mにの継続的成長はEGF
、 TGFα、またはアンフィレギュリン(AR)に依存している。Ba1b
/MK細胞はEGFまたはエビテリン1のない状態では増殖しなかった(第16
A図)が、エビテリン2はこれら細胞の成長に何等有意な作用を示さなかった。
しかし、エビテリン2はドーズ依存的にBa1b/MK細胞のエビテリン1−誘
発成長を阻害しく第168図)、その50%阻害は約7nMのエビテリン2で観
測された。EGPまたはTGFαはTFGβの存在下でラット腎細胞NRに一5
A6の足場(anchorage)−独立性成長を誘発した(ロバーツ(Rob
erts)等、 Proc、 Natl、 Acad、 Sci、 [1,S、
A、、 1981.78. PP、 5339−T344)
。EGFと同様に、エピテリン1はドーズ依存的にNRK細胞の足場−独立型の
成長を誘発した(第17図)が、エビテリン2は誘発しなかった。エピテリン2
は(約85nMの濃度において)軟質寒天中でのエビテリン1−誘発性コロニー
形成を約50%阻害した。更に、エビテリン1は単分子層中のNRに細胞にマイ
トジェン活性を及ぼしたが、エビテリン2は該活性を示さなかった。
エビテリン1もエビテリン2も、”5l−EGFのそのレセプタへの結合に有意
な影響を与えなかったが、このことはこれらのエビテリン類がEGFレセプタを
介してその生物学的効果を媒介しないことを示唆している。
縮重オリゴヌクレオチドの2つのプールを、エピテリン2からのペプチド配列に
TQCPDDおよび)l[:CPQDTに基づいて合成した(これらのプールは
、それぞれセンスおよびアンチセンス配向状態にある256オよび128個の縮
重オリゴヌクレオチドを含む)。これらのオリゴヌクレオチドを、3′−末端上
にT、7トラツク(track)を含むオリゴヌクレオチド、X5CT17で感
作したラット腎臓RNA由来の一本ficDNA鋳型で、40サイクルのPCR
増幅におけるプライマーとして使用した(プローマン(Plowman)等、
Proc、 Natl、 Acad、 Sci、 U、S、A、、 1990.
87. pp、 490T−
08)。エビテリン配列:にYGCCPMP (256縮重の23−マー)に基
づくオリゴヌクレオチドプローブを[r−”P] ATPで標識し、PCR生底
物をスクリーニングするのに使用した。
このPCR生成物のサザンプロットへのこのプローブのハイブリッド化は120
塩基対(bp)および600 bpの主バンドおよび325bρの微/J’J<
ンドを示した。これらのフラグメントをサブクローニングし、かつ配列決定した
ところ、これらが全て共通の5°−末端コードエビテリン2を有することが示さ
れた。該325 bpのフラグメントはオーブン読み取り枠を有し、鉄枠はエビ
テリン1および2の両者をコードし、一方で600 bpの主バンドは更に3゛
−末端にまで広がり、システィンに富む残基部分の付随的な複製を含んでいた。
従って、エビテリンlおよび2は単一の転写の縦列に配置された生成物であると
考えられる。これらと同一のPCRプライマーを使用して、ヒト、ウシ、マウス
および鶏のcDNA由来のエビテリン先駆体の同様なフラグメントを単離した。
その結果、強力な進化的な該システィンに富む残基部分の保存が立証された。
完全なエビテリンcDNAを、既知の中心的配列を有するメツセージの5゛−お
よび3′−末端を単離するためのPCRプロトコールおよびλgtloライブラ
リーのスクリーニングを利用してラット、マウスおよびヒトから得た。特に、3
゛および5°方向に配向した正確なエビテリンプライマーを、天然産のポリ(A
)テイルまたは5゛末端の広がったcDNA上に付加された合成ポリ(A)トラ
ックにアニールされるプライマーとの組み合わせを用いたPCR法を利用したく
プローマン(Plowman)等、 Proc。
Natl、 Acad、 Sci、 U、S、A、、 1990.87. PP
、 4905−08) 、ラット腎@1cDNAライブラリーをAgtlO中に
構築しくプローマン(Plowman)等、Mol、Ce1l Bio+、、
1990゜】0.pp、 1969−81) 、完全な長さのラットエビテリン
cDNAを、PCR法で形成したエビテリンブローブをもつ2.OXIO’組み
換え体をスクリーニングすることにより単離した。これらのプローブは、またマ
ウスT[ゲノムライブラリー(ストラタジーヌ(Stratagene)、ラジ
ョラ、CA)からマウスエピテリン遺伝子を得るために使用した。数種のPCR
法で形成したクローン、即ちラフ) cDNAクローンおよびマウスゲノムクロ
ーンを、両ストランドにつき、オリゴヌクレオチドプライマーと共にT7ボリメ
ラーゼを使用して配列決定した(テーパー&リチャードソン4767−71)。
該ラットエピテqンcONAの複合配列(第18図)は215(lbρの長さを
有し、これはラット腎’anRNAについてのノーザン分析により示されるよう
に、はぼ2.3kbの転写物に近似される。この配列は30bρ5−未翻訳領域
を含む58ト残基のプレタンパクおよび343 bpの3′−未翻訳領域である
と予想される。第一のAIJGは、16個のアミノ酸からなるN−末端疎水性シ
グナルペプチドと、予想されたMr61.597を有する573アミノ酸からな
る成熟エビテリン先駆体を伴う。この先駆体は質膜領域、3個の潜在的なN−結
合グリコシル化サイトおよび88システイン残基をもたない。このエビテリン先
駆体は、55−57アミノ酸の一致した残基部分: VXCXs−scx、cc
x、ccx、ccx口X、HCCPX、CX、−、CX、)7縦列コピーを含む
高度に繰り返し性のある構! (第19図)を有する。該繰り返し体の2つが既
知のエビテリン1および2を表す。
該マウスおよびヒトエビテリン先駆体の予想されたアミノ酸配列はそれぞれ58
9および593個の残基を含み、ラットタンパクとの86% (マウス)および
75%(ヒト)の配列同一性を示す(第21A図)。エピテリンの付随的なイソ
型も存在し得る。というのは、一つのラットcDNAのクローンが234bρ(
第21A図、アミノ酸398−475)の欠落を有し、読み取り枠を維持し、か
つキメラ残基部分を生成したからである。この欠落は交互ヌブライシングの結果
であると思われる。というのは、その境界が正確に該マウスエビテリン遺伝子内
のエクソン−イントロン接合の位置に認められるからである。
このエビテリン配列と入手可能なタンパクおよびDNA配列データバンクとの比
較により、既知のタンパクとの相同性を有する3つの領域が存在することが明ら
かとなった。該エビテリン先駆体のシグナル配列に続く第一の41アミノ酸は6
個のシスティン残基を含み、該残基は他の7個のシスティンに富む残基部分のN
−末端の半分に類似するパターンで配置されている。該配列: CP[1GOP
CPVACCはヒト、ラットおよびマウスのエビテリンに完全に保存されており
、一群のヘビ毒に存在する共通パターンと一致している(ダフトン(Dufto
n)、 J、 Mol、 Evol、、 19B4゜20、 pp、128−3
4)。相同性の第二の領域はラットエビテリンの該システィンに富む残基部分の
3個の中に存在(C(:X、HX2C) L、ホスホリパーゼA2の活性サイト
の回りの共通部分と一致する(ゴメツ(Goa+ez)等、 J、 Eur、
J、 [liochem、、 1989.186゜pp、 23−33)。最後
に、広い相同性が該エビテリンの12システイン残基部分きトマトチオールプロ
テアーゼのC−末端調節ドメインとの間に存在する(第210図)。
この非触媒的ドメインは重金属と結合により該プロテアーゼの活性を調節するも
のと仮定されている。該エビテリン先駆体の交互のシスナインおよびヒスチジン
残基は種々のタンパクの金属−結合ドメインの存在を暗示しているが、該エビテ
リン残基部分は任意の公知の金属−結合共通部分とは一致していない。ノーザン
分析は2.3kbのエピテリン転写体がいたるところで発現さ右、成人の腎臓、
胎盤、心臓、十二指腸、結腸、および大脳皮質において支配的であることを立証
している。更に、これは種々様々な上皮腫瘍セルラインに存在する。サザン分析
は該エビテリン先駆体が単一の複製遺伝子によりコードされることを示している
。これらの結果は、該エビテリン先駆体からの活性分子の生成の転写後のメカニ
ズムを示唆している。
7、乙 CO8細胞内での発現
ラフトエビテリンの生化学的諸性質はサイトメガロウィルスの即時型プロモータ
の制御下でその完全コード配列を発現ベクター中に挿入することにより測定でき
る(シード&アルフォ(Seed and Aruffo)、 Proc、 N
atl、 Acad、 Sci、U、S、A−。
19g7.84. PP、 3365−69)。より詳細には、該完全ラットエ
ビテリンコード配列を含む1.6kbフラグメントをcDM8を主体とする発現
ベクター中に挿入して発現ベクターcrEPN1.6を形成した。類似する構築
体crEPN1.4を1個のエクソン欠落を有するエビテリンcDNへからの1
.35kbフラグメントを挿入することにより調製し、かくしてアミノ酸398
−475を排除した。分泌プラスミドCβrEPN1およびc B rEPN2
を、合成した以下のオリゴヌクレオチド上に含まれるサルのTGF−β1シグナ
ル配列:
MPPSGLRLLPLL
LPLLIILLVLTPSRPAA
CTACCGCTGCTGTGGCTACTGGTGCTGACGCCTAGC
CGGC[:GGCCGC3゜GATGGCGACGACACCGATGACC
ACGACTGCGGATCGGCCGGCCGG 5゜とPCR法で形成した
エピテリン1によび2のコード配列を含む5acl I−Xbalフラグメント
を、旧ndlllおよびXbalで消化したcDM8sllプラスミドに結合す
ることにより構築した。プラスミドcOM8slIは変性cDM8ベクターであ
り、ここでは固有の5acllサイトがクレノー(Klenow)により除去さ
れている。この新規な5aclJサイトは該エビテリンコード配列を有する枠中
に該シグナルペプチドの最後のグリシンを配置する。これらの発現プラスミドを
感応性のMC1061/P3バクテリア内で成長させ、0EAE−デキストラン
法(シード&アルフt(Seed and Aruffa)、 Proc。
Natl、 Acad、 Sci、口、S、A、、 1987.84. PP、
3365−69)を利用してCO5−1細胞に導入した。トランスフェクショ
ンの48時間後に、該細胞を燐酸緩衝塩水で洗浄し、250 μci/mlのj
5S−システィン(110t)II:i/mJニューイングランドヌクレアー(
NewlEngland Nuclear))を補充した血清を含まないMEM
(4ml/100 n++nプレート)中で16時間標識した。標識した上澄を
0.IN酢酸溶液に対して透析し、乾燥し、1+nlずつを10%または15%
SO3−ポリアクリルアミドゲル上で実験した。
一時的に発現されたタンパクは35S−システィンで標識した上澄の5OS−P
AGE分析により容易に検出された。この組み換えタンパクは約75にの分子量
を有し、これは予想された62になる値よりも僅かに高い。これは多分グリコジ
ル化によるものであろう(lE26A図のレーン1)。エピテリンをコードする
が、C−末端領域のエクソンを欠く類似の構築物は78アミノ酸の欠落に比例し
て平均のMr68 Kで移動した。該先駆体がプロセッシングされてより小さな
形状のものとなる証拠は見出されなかった。成熟組み換えエビテリン1および2
タンパクを発現するために、そのコード領域を発現ベクター(それぞれCβrB
PN1およびCPrBPN2)の合成シグナルペプチド配列の背後に配置した。
これにより、COS細胞から6にタンパクの分泌が見られた(3g26B図)。
これらの構築物でトランスフェクションされた咳細胞はその成長が阻害され、か
つ形態の変更を示し、擬似トランスフェクションについて見られる完全な単分子
層と比較して、多くの細胞が指輪状の外観を示した。
CPrEPN1 )ランスフェクションからの上澄を、バイオ−シル(Bio−
Sil) TSK−250カラム上で部分的に精製しくショヤブ(Shoyab
)等、 1990.87. pp、 4905−09)、画分をA431細胞に
及ぼす成長阻害活性(CIA)につきアッセイした。これらの細胞は活性エビテ
リン1を分泌(約256IA単位月00胴プレート)シたが、擬似トランスフェ
クションした細胞からの上澄は検出可能な活性をもたなかった(ICIA単位は
細胞成長の50%阻害を達成するに必要とされる物質の量に対応)。
エビテリン1はA431細胞に阻害効果を及ぼし、数種の上皮セルラインに対し
てマイトジェンとして作用する(上記の第6節参照)。更に、エビテリン1はト
ランスフォーミング成長因子ベクターの存在下でラット腎臓の繊維芽細胞の足場
−独立性成長を誘発できる(第17図)。逆に、エビテリン2は繊維芽細胞の誓
合類のケラチノサイトの成長に影響を与えず、これら両系において(ドーズ依存
的様式で)エビテリン1の該マイトジェン効果に対抗する(第17図)。プロセ
ッシングされていないエビテリン先駆体はこれらのいずれのアッセイにおいても
活性を示さなかった。多分この完全な先駆体は該プロセッシングされた形状のも
のきは完全に異なる役割、例えば金属イオンのキレート化、あるいはプロテアー
ゼおよびホスホリパーゼの調節等の役割を演するものと思われる。
Figure 1
保持時間(分)
Figure 2
保持時間(分)
Figure 3
保持時間(分)
Figure 4
保持時間(分)
Figure 5
保持時間(分)
日gure 6A Figure 6BFigure 8
保持時間(分)
Figure 9
保持時間(分)
Figure 10A
画分番号
Figure 10B
画分番号
Figure 10C
画分番号
Figure 10D
画分番号
Figure If
Figure 12
Figure 13
残基
Figure 14
タンパク(ng/ウェル)
Figure 15A
Figure 15B
タンパク (ng/ml)
Figure 16A
Figure 16B
Figure 17
Fzgure け
MWILVSWLALVARLVAGTOCATCT;C;ATCC−、C5T
CAC::7GGCTCCCC,−^G丁GGC入AGGC丁CGTCGC7C
G入AC八CACτに X0
PDGCF’ CPVACCLDOGGANYSCCAG入τGCTC入ATT
CT GCCCT GTTGCCτCC丁GCCτ”、CACCAにGGAGG
λG(CAACτ入CAGCP50
CCNPLLDTWPI 工 TSRRLDGS丁GCTGTAACCCTCT
TCTGGACACATG(−CCτ入τAAτAACCAGCCGTCCT
cTAGATGGCTCC2P゜
GAVQ(PG5QFECPD5ATCC!GGTGCTGTCCAGTGTC
;τ5GTACC:AG−τCG入kTGτcCゴ°GACTCCcCCACC
TCC?GTATT 4T0
X 工 DGSWGCCPMPQASCCEDR入TG入TTGATGCh τ
C−7CGSSG−,GCTGCCCCAτCCCCCAG(、CCτCTTG
CTGTG入AGACAGA@510
PAGFQCHT Σ TGTCΣ LGVLQVCCAGCCGGGTττC
ACT(TCACAC^G入cλc入GG入kCCτGTG入入CτGGGAG
τccrrc^GGτA 10T0
1050Fi 18 (Cont、)
P 掃 M X X ’) T A S L S L P D P Q I L
に NCCCTGGATGAAA1vIGCτCACGaCCτC:CTCA
にCごTGCCAGACCC入CAGλTCTTG入AG入Aτ 1F1゜
t)VPCDDFSSCPSNNTCCRL5GATGTCCCCTGTにA7
CACATCAGTAGごτa7c:τ=Cτ入^CAAτACCτCC丁CC
ACACTCAGT ’−jー、0
3WACCQLP)IAVcc Σ DRQHCC八〇TTGへCCC?CCT
QCCAGT′TCC:CCATにCTGτcTGCフCTGAGG八CCCG
CAGへACTCTTCC14V0
PAGYTCNVXARTCEKDAGSVCCGC;CTCGGフA(入CC
τCC入ACGτGλAGGCGAGλλCCTGTにAG入λGG入TGCλ
GGCTCTGTC15F10
RDPAPRPLL
入GGGATCCAGCCCCkAGkCCGCTkCTG 1797Figu
re 19
エビテリン(アミノ酸残基数)
Figure 2OA
Figure 20B
残基
Figure 21 A
Figure 21 B
Figure 21C
vxCX5−6Cx5CCx8CCx6CCxDx2HCCPX4Cx5.Cx
2Figure 21 D
Figure 22
cap 入 GFTCDTQKG 丁 CEQGP)!τcc’raTcccc
cccccTTTxcc’rc’rcxcxcccxcAAcccτ入CCTC
,TG入^CλにGGGf:CCC■b1060
Flgure 22 fcont、)
Figure 23
Figure 23 (Con【、)
Figure 24
Figure 25
LRVPAVVGDVKCDDEMSCPDCTCCGCGTCCCAGCAG
TGCTTG+TGACGTGAAGTGTGACGATGAGATGAG:T
GTCCCGAC240Figure 26
A B
Figure 27
・ J
シグナル 1234567
Epn2 Epnl
要約書
「エビテリン」と命名した一群の新規な成長調節タンパクを開示する。該エビテ
リンは有意な構造上の相同性を有する幾つかの別個の構成員を含む。このエピテ
リン群の2つの構成員、即ちエビテリン1およびエピテリン2が天然源から精製
された。更に、種々のを索動物源から、ヒト、マウスおよびラットエビテリン先
駆体を包含する成熟および先駆体エピテリンをコードするcDNAおよびPCR
クローンを得、かつその配列決定を行った。ラットエビテリン先駆体およびその
成熟型の組み換え発現をも開示する。精製エビテリンIは2感応性の成長調節因
子であって、幾つかの型の細胞の成長を促進できるが、他の細胞の成長を阻害す
る。
精製エピテリン2は、成長阻害生活性に関してはエビテリン11!:同様に機能
する。
しかし、これきは対照的にエビテリン2は見掛は上はエビテリン1の成長促進活
性特性を発揮できず、かつ実際にはこのエビテリン1の活性と拮抗する。
国際調査報告
Claims (51)
- 1.実質的に第22図に記載したアミノ酸残基番号約1〜593までのアミノ酸 配列を含むことを特徴とするヒトエピテリン先駆体。
- 2.実質的に第22図に記載したアミノ酸残基番号約282〜337までのアミ ノ酸配列を含むことを特徴とするヒトエピテリン1。
- 3.実質的に第22図に記載したアミノ酸残基番号約206〜262までのアミ ノ酸配列を含むことを特徴とするヒトエピテリン2。
- 4.実質的に第22図に記載したアミノ酸残基番号約59〜114までのアミノ 酸配列を含むことを特徴とするヒトエピテリン。
- 5.実質的に第22図に記載したアミノ酸残基番号約124〜180までのアミ ノ酸配列を含むことを特徴とするヒトエピテリン。
- 6.実質的に第22図に記載したアミノ酸残基番号約364〜418までのアミ ノ酸配列を含むことを特徴とするヒトエピテリン。
- 7.実質的に第22図に記載したアミノ酸残基番号約442〜497までのアミ ノ酸配列を含むことを特徴とするヒトエピテリン。
- 8.実質的に第22図に記載したアミノ酸残基番号約519〜574までのアミ ノ酸配列を含むことを特徴とするヒトエピテリン。
- 9.実質的に第22図に記載したヌクレオチド残基番号約41〜1819までの ヌクレオチド配列を含むことを特徴とするヒトエピテリン先駆体をコードする核 酸分子。
- 10.請求の範囲第9項に記載の核酸分子と相補的であるアンチーセンスリボ核 酸分子。
- 11.実質的に第18図に記載したアミノ酸残基番号約1〜589までのアミノ 酸配列を含むことを特徴とするラットエピテリン先駆体。
- 12.実質的に第18図に記載したアミノ酸残基番号約280〜335までのア ミノ酸配列を含むことを特徴とするラットエピテリン1。
- 13.実質的に第18図に記載したアミノ酸残基番号約205〜261までのア ミノ酸配列を含むことを特徴とするラットエピテリン2。
- 14.実質的に第18図に記載したアミノ酸残基番号約59〜114までのアミ ノ酸配列を含むことを特徴とするラットエピテリン。
- 15.実質的に第18図に記載したアミノ酸残基番号約123〜179までのア ミノ酸配列を含むことを特徴とするラットエピテリン。
- 16.実質的に第18図に記載したアミノ酸残基番号約362〜416までのア ミノ酸配列を含むことを特徴とするラットエピテリン。
- 17.実質的に第18図に記載したアミノ酸残基番号440〜495までのアミ ノ酸配列を含むことを特徴とするラットエピテリン。
- 18.実質的に第18図に記載したアミノ酸残基番号515〜570までのアミ ノ酸配列を含むことを特徴とするラットエピテリン。
- 19.実質的に第18図に記載したヌクレオチド残基番号約31〜1797まで のヌクレオチド残基配列を含むことを特徴とするラットエピテリン先駆体をコー ドする核酸分子。
- 20.請求の範囲第19項に記載の核酸分子と相補的であるアンチーセンスリボ 核酸分子。
- 21.実質的に第23図に記載したアミノ酸残基番号約1〜589までのアミノ 酸配列を含むことを特徴とするマウスエピテリン先駆体。
- 22.実質的に第23図に記載したアミノ酸残基番号約280〜335までのア ミノ酸配列を含むことを特徴とするマウスエピテリン1。
- 23.実質的に第23図に記載したアミノ酸残基番号約205〜261までのア ミノ酸配列を含むことを特徴とするマウスエピテリン2。
- 24.実質的に第23図に記載したアミノ酸残基番号約59〜114までのアミ ノ酸配列を含むことを特徴とするマウスエピテリン。
- 25.実質的に第23図に記載したアミノ酸残基番号約123〜179までのア ミノ酸配列を含むことを特徴とするマウスエピテリン。
- 26.実質的に第23図に記載したアミノ酸残基番号約362〜416までのア ミノ酸配列を含むことを特徴とするマウスエピテリン。
- 27.実質的に第23図に記載したアミノ酸残基番号約440〜495までのア ミノ酸配列を含むことを特徴とするマウスエピテリン。
- 28.実質的に第23図に記載したアミノ酸残基番号約515〜570までのア ミノ酸配−列を含むことを特徴とするマウスエピテリン。
- 29.実質的に第23図に記載したヌクレオチド残基番号約8〜1774までの ヌクレオチド残基配列を含むことを特徴とするマウスエピテリン先駆体をコード する核酸分子。
- 30.請求の範囲第29項に記載の核酸分子と相補的であるアンチーセンスリボ 核酸分子。
- 31.以下のアミノ酸残基配列: 【配列があります】 (ここで、Cはシステイン、Dはアスパラギン酸、Hはヒスチジン、Pはプロリ ン、およびXは任意のアミノ酸残基を表す)を含むポリペプチド。
- 32.以下のアミノ酸残基配列: 【配列があります】 (ここで、CはシステインおよびXは任意のアミノ酸残基を表す}を含むポリペ プチド。
- 33.以下のアミノ酸残基配列: 【配列があります】 (ここで、CはシステインおよびXは任意のアミノ酸残基を表す)を含むポリペ プチド。
- 34.腫瘍細胞と、腫瘍細胞の成長を阻害するのに有効な少なくとも1種のエピ テリンとを接触することを含む腫瘍細胞の成長を阻害する方法。
- 35.該エピテリンがエピテリン1である請求の範囲第34項に記載の方法。
- 36.該エピテリンがエピテリン2である請求の範囲第34項に記載の方法。
- 37.動物に腫瘍細胞の増殖を阻害するのに有効な量で、少なくとも1種のエピ テリンを投与することを含む該動物中の腫瘍の治療方法。
- 38.該エピテリンがエピテリン1である請求の範囲第37項に記載の方法。
- 39.該エピテリンがエピテリン2である請求の範囲第37項に記載の方法。
- 40.創傷部位に、細胞成長の促進に有効な少なくとも1種のエピテリンを投与 することを含む刺傷治癒促進方法。
- 41.該エピテリンがエピテリン1である請求の範囲第40項に記載の方法。
- 42.創傷部位に、エピテリン2のエピテリン1−拮抗活性を阻害するのに有効 な投与量で、エピテリン2拮抗剤を投与することを含む創傷治癒促進方法。
- 43.該エピテリン2拮抗剤を、細胞成長を促進し得るエピテリンと共に投与す る請求の範囲第42項に記載の方法。
- 44.該エピテワン2拮抗剤をエピテリン1と共に投与する請求の範囲第42項 に記載の方法。
- 45.該エピテリン2拮抗剤が抗−エピテリン2抗体を含む請求の範囲第42項 に記載の方法。
- 46.該抗−エピテリン2抗体を、細胞成長を促進し得るエピテリンと共に投与 する請求の範囲第45項に記載の方法。
- 47.該抗−エピテリン2抗体を、エピテリン1と共に投与する請求の範囲第4 5項に記載の方法。
- 48.乾癬を患う患者に、エピテリンの成長促進活性を阻害するのに有効な組成 物を投与することを含む乾癬の治療方法。
- 49.該組成物がエピテリン1の拮抗剤を含む請求の範囲第48項に記載の方法 。
- 50.該エピテワン1拮抗剤がエピテリン2を含有する請求の範囲第49項に記 載の方法。
- 51.該エピテリン1拮抗剤が抗−エピテリン1抗体を含有する請求の範囲第4 9項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
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US504,508 | 1990-04-03 | ||
US8379691A | 1991-03-13 | 1991-03-13 | |
US83796 | 1991-03-13 | ||
PCT/US1991/002321 WO1991015510A1 (en) | 1990-04-03 | 1991-04-03 | Epithelins: novel cysteine - rich growth modulating proteins |
Publications (1)
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---|---|
JPH05506659A true JPH05506659A (ja) | 1993-09-30 |
Family
ID=26769756
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP91508010A Pending JPH05506659A (ja) | 1990-04-03 | 1991-04-03 | エピテリン類:新規なシステインに富む成長変調タンパク |
Country Status (1)
Country | Link |
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JP (1) | JPH05506659A (ja) |
-
1991
- 1991-04-03 JP JP91508010A patent/JPH05506659A/ja active Pending
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