PT97303A - Processo para a preparacao de novas proteinas moduladoras do crescimento (epitelinas) ricas em cisteina - Google Patents

Description

BRISTOL-MYERS SQUIBB COMPANY

"PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE NOVAS PROTEÍNAS MODULADORAS DO CRESCIMENTO (EPITELINAS) RICAS EM CISTEÍNA" 1. INTRODUÇÃO A presente invenção refere-se a uma nova família de proteínas reguladoras do crescimento que os requerentes designaram por ,'epitelinas,,, a métodos para a pro dução de epitelinas e às suas utilizações terapêuticas e de diagnóstico. Os requerentes, purificaram dois membros da fa mília das epitelinas, a epitelina 1 e a epitelina 2, a partir de fontes celulares naturais e isolaram os eADEs que codificavam diversas epitelinas direntes. A epitelina 1 e a epitelina 2 partilham de uma similaridade estrutural substancial embora sejam proteínas funcionalmente distintas. A epitelina 1 é um regulador bifuncional do cres cimento, capaz de estimular o crescimento de alguns tiposv de células embora iniba o crescimento de outras. A epitelina 2 é funcionalmente idêntica à epitelina 1, no que se refere à bioactividade inibidora do crescimento. No entanto, como contraste, a epitelina 2 não é aparentemente capaz de despo-letar a actividade estimuladora do crescimento caracterís-tica da epitelina 1 antagonizando, com efeito, a actividade - 2-

f da epitelina 1.

ANTECEDENTES DA PRESENTE INVENÇÃO 0 crescimento e diferenciação celulares parecem ser iniciados, promovidos, conservados e regulados por uma multiplicidade de factores e de hormonas estimuladoras , inibidoras e sinérgicas. A alteração e/ou ruptura do mecanismo de homeostase celular parece ser a causa fundamental das doenças relacionadas com o crescimento, incluindo as neoplasias. Os factores moduladores do crescimento encon tram-se implicados numa ampla variedade de processos patológicos e fisiológicos incluindo a transdução do sinal, a comunicação celular, o crescimento e desenvolvimento, a em-briogénese, a resposta imunitária, e hematopoiese, a sobrevi^ vencia e diferenciação celulares, a inflamação, a reparação e remodelação tecidulares, e aterosclerose e o cancro. 0 factor do crescimetno epidérmico (FCS) o factor** .detransformação do crescimento (FefTC), o factor do crescimento derivado das plaquetas (FCDP) , o factor do crescimento fibroblástico (FCF), o factor do crescimento dos nervos (FCN), o factor-/? de transformação do crescimento (F^TC),os factores insulínicos do crescimento I e II (FIC I, FIC II), os factores do crescimento hematopoiético tais como a eritropoietina, os factores de estimulação das coió nias (FEC 1 e 2), as interleucinas (IL-1 a 8), os interferões (IFN ¢^, à , V), os factores de necrose de tumor 0( e

(FNT o( e β ), a leuco -regulina, a oncostatina M, a anfirre-gulina (AR) e outros faotores menos definidos, sãoPPoteinas moduladoras do crescimento e diferenciação, produzidas por diversos tipos de células, quer em condições fisiológicas normais, quer como resposta a estímulos exógenos. A maioria destes faotores parece actuar de modo autocrónico e para crónico. Como documentação ver: Goustin e outros., 1986, Câncer Res. 46:1015-1029; Rozengurt, 1986, Science 234:161--166; Pardee, 1987, -Câncer Res. 47: 1488-1491 ; Sachs, 1986 , Sei. Amer. 254:40-47; Marshall, 1987, Cell 50:5-6; Melcher and Anderson, 1987, Cell 30:715-720; Namen et al., 1988, J. Exp. Med. 167:988-1002; Baggiolini et al., 1989, J. Clin. Invest. 84:1045-1049; Clements and McNurlan, 1985, Biochem, J. 226:345-360; Nathan, 1987, J. Clin. Invest. 79:319-326; Sporn and Roberts, 1986, J. Clin. Invest. 78:329-332; Old, 1987, Nature 326:330-331; Beutler e Cerami, 1987, New Engl. J. Med. 316:379-385; Weinstein, 1987, J. Cell. Biochem. 33:213-224; Zarling e outros, 1987, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83:9739-9744; Shoyab e outros, 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85:6528-6532; Shoyab e outros, 1989, Science 243:1074-1076; Sporn e Todaro, 1985, N. Engl. J. Med. 303:878-880; Sporn e Roberts, 1985, Nature 313:745-747).

Reveste-se de grande interesse o isolamento, caracterização e definição dos mecanismos funcionais dos faotores de modulação do crescimento devido à sua potencial utilização no diagnóstico, prognóstico e tratamento - 4 -

do canoro.

Para além disso, a aquisição de mais conhecimentos sobre estes factores seria de grande auxílio na percepção dos mecanismos básicos que se encontram por detrás do controlo normal do crescimento e a perda dos mesmos, nas células cancerígenas.

SUMÁRIO DA PRESENTE INVENÇÃO A presente invenção refere-se a epitelinas, uma nova família de proteínas de baixo peso molecular ricas em cisteína, que apresentam actividade bifuncional de regulação do crescimento, à utilização de epitelinas no diagnóstico e tratamento de doenças de seres humanos e a processos para a produção de epitelinas biologicamente activas. Identificaram-se dois membros da família das epitelinas, a epiteli-na 1 e a epitelina 2 e purificaram-se até a uma homogeneidade aparente, possibilitando aos requerentes determinar as estru turas primárias, as propriedades físicas e as características funcionais destes novos moduladores do crescimento. Identifi caram-se diversos outros membros da família das epitelinas por clonagem de cADN. A epitelina 1 é um polipéptido constituído por 56 aminoácidos, enquanto que a epitelina 2 é constituída por 57 aminoácidos. Estruturalmente, a epitelina 1 e a epitelina 2 partilham de uma homologia de 47 % ao nível dos aminoácidos e cada uma delas contém 12 resíduos de cisteína posicionados de modo idêntico.

Podem produzir-se as epitelinas por isola- 5- 5-

mento e purificação a partir de fontes naturais, por síntese química ou de acordo com a tecnologia recombinante do ADN. De acordo com um aspecto particular da presente inven ção que se descreve mais pormenorizadamente a título de exemplo (Secção 6, infra), isolou-se a epitelina 1 _e'a epltelina 2 a.partir de tecidos de rim de ratazana e purificaram-se, subsequen temente, até uma homogeneidade aparente, utilizando uma combinação de cromatografia por permeabilização de gel e croma-tografia líquida de elevado rendimento de fase inversa (CLER). Tal como se descreve mais adiante, na Secção 6, infra, os requerentes caracterizaram minuciosamente as epi-telinas 1 e 2, purificadas, no que se refere às suas caracte-rísticas estruturais, físicas, químicas e funcionais.

4. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS FIG. 1.CLER preparatória de permeabilização de gel do extrato impuro. FIG. 2. CLER preparatória de fase inversa das fracções 25 a 28 agregadas a partir de 28 ciclos da FIG. 1. FIG. 3· CLER semi-preparatória de fase inversa das fracçdes 55 a 59 agregadas a partir da FIG. 2. FIG. 4. CLER analítica de fase inversa do agregado 1b a partir do ciclo anterior. FIG. 5. CLER analítica de fase inversa do agregado 2b a partir da FIG. 3. *5 6 / FIG. 6. Cromatografia analítica de per-meação de gel das fracçôes 51(A) e 52(B) concentradas, a partir da FIG. 4. FIG. 7. Cromatografia analítica de permea ção de gel das fracçôes 44(A) e 45(B) concentradas da FIG. 5. FIG. 8. CLER semi-preparatória de fase in versa das fracçôes 50 a 54 da FIG. 2. FIG: 9. CLER analítica de fase inversa das fracçôes 18 a 23 a partir do ciclo anterior. FIG. 10. Cromatografia analítica de permea ção de gel das fracçôes da FIG. 9. Efectuou-se a cromatografia tal como se descreve na secção 6.1, infra. (A) CLER da fracção 38 concentrada; (B)'CLER da fracção 37 concentrada; (G) .CLER da fracção .38 concentrada ;;λ (D) recromatografia das ;frabçoes 48 e 49 de A a C agregadas e depois concentradas. FIG. 11. Análise Triceno-SDS-PAGE de epite-lina 1 e de epitelina 2. Fez-se passar um minigel a 18 % (0,75 mm x 10 cm x 7 cm) à temperatura ambiente a uma corrente constante de 90 volts durante 4,5 horas no mini aparelho de electroforese de proteína II da "Bio-Rad". Efectuou-se a suis pensão das amostras anidras em 10 yul de tampão de amostra (Tris 50 nM, pH 6,8, glicerol a 12 % (p/v), SDS a.4/5, merca-ptoetanol a 4 jl (v/v) e de azul de serva G. a 0,01 % ). Incubou-se a 95°C durante 5 minutos e depois aplicou-se sobre o gel. Os marcadores de peso molecular consistiam em cinco polipéptidos resultantes da clivagem da mioglobina de cora- - 7

ção de cavalo por brometo de cianogénio (Sigma Chem. Co.)· (A) epitelina 1; (B) epitelina 2. FIG. 12. Sequências aminoácidas e alinhamento da epitelina 1 e da epitelina 2 purificadas a partir de rim de ratazana. Utilizou-se o código normalizado de uma única letra para os aminoácidost Alanina (A); Arginina (R); Asparagina (N); Ácido Aspártico (D); Cisteína (C); Glu-tamina (Q); Ácido Glutâmico (E); Glicina (G); Histidina (H); Isoleucina (I); Leucina (L); Lisina (K); Metio-nina (M); Fenilalanina (F); Prolina (P); Serina (S); Treonina (T); Triptofano (W); Tirosina (Y); e Valina (V). As sequências peptídicas utilizadas para conceber os aprota-dores e sondas oligonucleotídicos encontrsm-se sublinhados. FIG. 13· Análise da hidropatia da epitelina 1 e 2 (Kyte e Doolittle).-, epitelina 1: ____, epi telina 2. FIG. 14. Curva de resposta à dose de epi^ telina 1 e da epitelina 2 na enibição da incorporação de 125 I-desoxiuridina no ADN das células A431· ·, epitelina 1; o, epitelina 2. FIG. 15. (A) Efeito da epitelina 1 e da 125 epitelina 2, sobre a estimulação da incorporação de I--desoxiuridina no ADN da linha celular queratinocítica do murino, Balb/MK. Colocaram-se 2 000-4 000 células por tubo em placas de 96 tubos num meio pobre em cálcio contendo 5 % de SFB dializado. Efectuaram-se então os ensaios GSA, tal 8 como se descreve na secção 6.2, infra. ·, epitelina 1; 0, epitelina 2. (B) Efeito de diversas concentrações de epi- 125 telina 2 sobre a incorporação de I-desoxiuridina no ADN das células Balb/MK induzida pela epitelina 1 (20 ng/ml). FIG. 16. (A) Efeito da epitelina 1 e do factor do crescimento epidérmico ;(FCE) no crescimento das células Balb/MK. Efectuaram-se os ensaios tal como se descreve na Secção 6.2, infra. ·, epitelina 1; o, FCE, (B) Efeito de diversas concentrações de epitelina 2 no cres cimento dos queratinócitos de murino induzido pela epitelina 1 (20 ng/ml). FIG. 17. Efeito das epitelinas 1 ê 2 na formação de colónias de células NRK-SA6 em agar macio na presença de FjlTC (1 ng/ml). 0 ensaio de formação de coió nias utilizado encontra-se descrito na Secção 6. 2.3, infra.

As barras a cheio, epitelina 1; as barras a ponteado representam o factor do crescimento epidérmico; as barras em aberto epitelina 2; as barras a tracejado, 20 ng/ml de epite lina 1 mais 500 ng/ml de epitelina 2. FIG. 18. cADN precursor dàu^itaLiina de rata zana e sequências aminoácidas deduzidas. FIG. 19. Alinhamento da matriz a pontos de 589 aminoácidos precursores da epitelina de ratazana comparados consigo próprios. Cada poáfeo representa uma faixa de cinco a dez resíduos idênticos. FIG. 20. (A) Análise da estrutura secundária composta do precursor da epitelina de ratazana. (B) Hidropatia do precursor da epitelina de ratazana. FIG. 21. (A) Comparação da sequên cia de .proteínas entre o precursor da epitelina de seres humanos, de ratazanas e de ratos deduzida a partir dos clones de cADN. Apresentam-se as sequências apresentando o código de uma única letra encontrando-se os resíduos idênticos indicados por pontos. Introduziram-se intervalos para se obter um alinhamento óptimo e que se encontram indicados por um travessão. A sequência principal prevista para a epitelina de ratazana encontra-se sublinhada e os sete motivos ricos em cisteína encontram-se dentro de uma caixa. Cada sequência representa um concenso com base nos clones cADN e PCR isolados a partir de ARN de rins de seres humanos, de ratazanas ou de ratos. As setas marcam as fronteiras de um exão de 234 bp, uma região que se encontra ausente num dos clones de cADN de ratazana. (B) Sequências aminoácidas das epitelinas de ratazanas, ratos e seres humanos. (C) Motivos consensuais de cisteina conservados entre as epitelinas. (D) Alinhamento do domínio C-terminal (aminoácidos 25^--315) de uma tiol-protease de tomate Lyoopersioon esculentum) com epitelinas 1 e 2. FIG. 22. Sequência aminoácida nucleotídica deduzida do precursor de epitelina humana. As sequências encontram-se baseadas nos clones PCR de ARN de me dula renal humana. FIG. 23. Sequência aminoácida niMlíècfcídimcteduzáda do precursor de epitelina do rato. Obtiveram-se os clones PCR a partir de ARN de rins de ratos adultos. FIG. 24. Sequência aminoácida nucleo-tídica deduzida do precursor de epitelina de bovino (sequência parcial). As sequêrcias baseiam-se nos clones PCR de ARN de testículos de bovino. FIG. 25. Sequência aminoácida nucleo-tídica deduzida do precursor de <’o epitelina de aves (sequên cia parcial). As sequências basearam-se em clones PCR de ARN do oviducto de ave. FIG. 26. Expressão da epitelina recom-binante nas células COS. (A) Sobrenadantes marcados com

Or 3S-cisteína de células COS transfectadas com as seguintes construções de expressão baseadas em cDM8: pista 1, crEPN1.6 contendo a região completa de código da epitelina de ratazana 2, crEPN1.4, contendo uma isoforma de cADN de epitelina de ratazana, que não possui um exão de 234 bp; pista 3, controlo ficticiamente transfectado. (B) Sobre- nadantes marcados com 3S-cisteína a partir de células COS transfectadas com as seguintes construções de expressão v de cDM8; pista 1, c^rEPNI contendo uma sequência principal TGF-yU 1 de simio, que precede a região de código da epitelina 1 madura de ratazana; pista 2, cy^rEPN2, um pláSm-í·-deo idêntico baseado na epitelina 2 de ratazana. FIG. 27. Dendograma de uma represen- 11 * tação de uma análise em cacho entre os motivos ricos em cis-teína da epitelina a partir de fontes humanas, de ratazanas e de ratos. A seguir, encontra-se um diagrama do precursor de epitelina indicando a posição dos 7 motivos no precursor. Alinharam-se os 28 motivos ricos em cisteina em PCGENE (Intel_ lignetics, Inc. Moutain View, CA) utilizando o programa de alinhamento múltiplo CLUSTAL. Transformaram-se os níveis de idêntico modo de emparelhamento numa matriz diferencial que se analisou utilizando o método de Ward da análise em cacho (SPSS/PC+, Chigago. IL). De acordo com este método, Utilizam-se distâncias Euclidianas, para se determinarem pontos de derivação.

5. DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA PRESENTE INVENÇÃO A presente invenção refere-se arruma nova família de proteínas reguladoras do crescimento designadas por "epitelinas". As epitelinas parecem englobar diversos membros distintos que partilham de uma homologia estrutural significativa. Codificaram-se a pa>rtir de fontes normais dois membros da famílina das epitelinas, a epitelina 1 e a epitelina 2 e isolaram-se os cADNs que codificam estes e diversos outros membros da família das epitelinas, a partir de ratazanas, seres humanos, bàvinos, murinos e aves, entre outras fontes celulares.

De um modo mais específico a presente invenção refere-se a cada um e a todos os membros da família das epitelinas, derivadose análogos de epitelinas, moléculas - 12 / de ácido nucleico que codificam as epitelinas (por exemplo cADNs, ADNs genómicos, ARNs, ARNs de sentido inverso, etc.), ADN tradicional e recombinante com base em métodos para a produção de epitelinas, de vectores de expressão recom binantes de epitelinas e diagnóstico e/ou utilização terapêuticas das epitelinas precursoras e maduras, moléculas de ácido nucleico que codificam as epitelinas, anticorpos anti--epitelinas e receptores de epitelina.

5.1. PRODUÇÃO DE EPITELINAS

Podem produzir-se individualmente as epitelinas de acordo com diversas abordagens gerais, incluindo o isolamento a partir de fontes naturais, a síntese peptídica em fase sólida e a tecnologia do ADN recombinante.

5.1.1. ISOLAMENTO E PURIFICAÇÃO DAS EPITELINAS A PARTIR DE FONTES CELULARES NATURAIS

Os esforços dos requerentes na clona-gem do ADN revelaram que os ARNs mensageiros que codificavam as diversas epitelinas se expressavam em diversos tipos de células diferentes, o que significava que se tratava de uma espécie com um âmbito muito alargado. Por este motivo, os requerentes previram que os membros individuais da família dás epitelinas podiam ser isolados a partir de uma ampla varie dade de orgãos, tecidos e/ou outras fontes celulares. Podem separar-se as epitelinas e purificar-se a partir das referidas fontes celulares, utilizando diversas técnicas de sepa- ração e purificação conhecidas na especialidade, que '^incluem, mas não se limitam a técnicas cromatográficas (como por exemplo, a cromatografia de fase inversa, a cromatografia de per-meação em gel, a cromatografia de permute de líquido, a cromatografia de permutãidêriões, a cromatografia de exclusão de tamanho, e a cromatografia de afinidade), a centrifugação, os procedimentos electroforéticos, a solubilidade diferencial, etc.

De acordo com um aspecto específico da presente invenção, que se escreve mais pormenorizadamente a título de exemplo na Secção 6., infra, isolaram-se dois mem bros da família das epitelinas (epitelina 1 e epitelina 2) a partir de tecidos do rim de ratazana que se purificaram, subsequentemente, até a uma homogeneidade aparente, utilizando, entre outros, uma combinação de cromatografias de permea-ção em gel e de cromatografia líquida de elevado rendimento de fase inversa (CLER). As epitelinas 1 e 2, purificadas de acordo com este processo, consistem em-cadeias únicas de poli-peptidos constituídas por 56 a 57 resíduos de aminoácidos, respectivamente e que compartilham características estruturais significativas.

Funcionalmente, a epitelina 1 parece consistir num verdadeiro modulador do crescimento, bifuncio nal, susceptível de estimular e de inibir o crescimento celu lar. A epitelina 2 parece ser funcionalmente distinta uma vez que antagoniza especificamente a actividade estimuladora 14 - do crescimento celular induzida pela epitelina 1. De modo idêntico à epitolina 1, embora geralmente a um nível menor, a epitelina 2 também é capaz de :inibir o crescimento celu lar. Determinaram-se as propriedades funcionais, estruturais , físicas e outras propriedades da epitelina 1 e da epitelina 2, que se encontram descritas na Secção 6*4, infra. 0 método constituído por seis fases, para a prepara ção de epitelina 1 e de epitelina 2 purificadas, encontra-se descrito na Secção 6., infra e/ou as suas modificações que também podem ser utilizadas para isolar outros membros da família das epitelinas.

5.1.2. SÍNTESE QUÍMICA DE EPITELINAS

Podem produzir-se membros individuais da família das epitelinas utilizando processos químicos para sintetizar, totalmente ou em parte, as sequências amino-ácidas correspondentes. Podem sintetizar-se, por exemplo, as epitelinas de acordo com técnicas de fase sólida (Ste-wart e Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2^ edição, 1984). Podem efectuar-se a purificação e/ou a reactivação nas conformações biologicamente activas das epitelinas sintetizadas de acordo com este processo, de acordo com diversas técnicas conhecidas na especialidade. Podem confirmar--se, por análise aminoácida, as composições aminoácidas das epitelinas sintetizadas. 15 - 15 -

5.1.3. SÍNTESE de epitelinas utilizando a

TECNOLOGIA DO ADN RECOMBINANTE

Podem produzir-se epitelinas precursoras e maduras biologicamente activas pela expressão dos ADNs que codificam a epitelina num sistema celular hospedeito recombinante. As técnicas gerais para o isolamento das sequências genéticas, a construção de vectores capazes de comandar a síntese das proteínas codificadas e a expressão e/ou secreção das proteínas recombinantes biologicamente activas são bem conhecidas na especialidade. A produção de uma epitelina utilizando a tecnologia do ADN recombinante pode dividir-se num processo em quatro fases com fins descritivos: (1) isolamento ou geração de uma sequência de código (gene) para uma: forma pre cursora ou madura da epitelina; (2) construção de um vec-tor de expressão capaz de comandar a síntese da epitelina de sejada; (3) transfecção ou transformação das células hospedeiras adequadas capazes de replicarem e de expressarem o gene da epitelina e/ou de processarem o gene de modo a produzir-se a epitelina desejada; e (4) identificação e puri^ ficação da epitelina desejada. A clonagem de um precursor de epite-^ lina de ratazana, a sua expressão e a expressão das epitelinas maduras 1 e 2 de ratazana encontram-se descritas atra vés dos exemplos apresentados na Secção 7., et seq, infra. 16 -

5.1.3.1. ISOLAMENTO 00 GERAÇÃO DE GENES DE EPITELINA

Podem utilizar-se as sequências que codificam o nucleotido de diversas epitelinas individuais ou os seus equivalentes funcionais para se construírem vecto-res de expressão recombinantes que comandarão a expressão da epitelina desejada. Podem obter-se as sequências nucleotí dicas que codificam a epitelina a partir de diversas fontes celulares que possuem actividades idênticas à epitelina ou que expressam o mARN que codifica as epitelinas. Com este os requerentes identificaram diversas fontes de tecidos de seres humanos e de murino que incluem mas não se limitam a tecidos da placenta, cólon, rim, testículos, supra-renais, mama, ovário, duodeno, timo e pulmão.

Podem obter-se as sequências que codificam a epitelina por elonagem de cADN a partir de ARN isolado e purificado a partir de tais fontes celulares ou por elonagem genómica. Podem preparar-se bibliotecas de cADN ou de ADN genómico de clones utilizando técnicas bem conhecidas nas especialidades e que podem ser rastreadas para os ADNs especiais que codificam as epitelinas com sondas núcleo tídicas concebidas a partir de sequências aminoácidas conheci^ das da epitelina 1 ou da epitelina 2 e/ou que são essencialmente complementares de qualquer porção do gene da epitelina. Podem seleccionar-se os clones em toda a sua extenção, isto é, aqueles que contêm toda a região codificante da epi- 17 - telina madura ou precursora desejada, construindo vectores de expressão.

De um modo alternativo, podem sintetizar-se totalmente ou em parte os ADNs que codificam as epi-telinas por síntese química utilizando técnicas normalizadas na especialidade.

Devido à degenerescência inerente às sequências que codificam o nucleotido, podem utilizar-se na prática dos métodos da presente invenção outras sequências de ADN que codifiquem essencialmente a mesma sequência ami-noácida ou uma sequência aminoácida funcionalmente equivalen te. Tais alterações das sequências nucleotídicas de epite-lina incluem eliminações, adições ou substituições de núcleo tidos diferentes originando uma sequência que codifica o meis mo gene ou um gene funcionalmente equivalente. 0 gene pode conter eliminações, adições ou substituições de resíduos aminoácidos na sequência o que origina alterações omissas pro duzindo-se assim um produto bioactivo. Podem efectuar-se estas substituições amino-acidas com base na similaridade de polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, .hidrofi-licidade e/ou na.natureza amfipática dos resíduos envolvidos. Por exemplo, os aminoácidos carregados negativamente incluem o ácido aspártico e o ácido glutâmico; os aminoácidos carregados positivamente englobam a lisina e a argi-nina; os aminoácidos com grupos polares não carregados ou com grupos não polares que possuem idênticos valores de hi- 18 -

drofilicidade incluem os seguintes: leucina, isoleucina, valina; glicina, alanina; asparagina; glutamina; serina; treonina; fenilalanina, tirosina.

5.1.3.2. CONSTRUÇÃO DE VECTORES DE EXPRESSÃO

DE EPITELINA

No sentido de se expressar formas precursoras, ou maduras, biologicamente activas, de diversas epi-telinas, deve seleccionar-se um sistema de expressão vector/ /hospedeiro que proporciona não só elevados níveis de transcrição e transferência mas também um processamento correcto do produto genético. Isto pode revestir-se de especial importância quando se utiliza a sequência de código completa de um precursor de epitelina na construção da expressão, uma vez que as formas maduras de epitelina parecem derivar de pre_ cursores maiores, através de fenómenos de processamento celu lares. 0 especialista poderá utilizar igualmente diversos sistemas vectores de expressão animal/hospe-deiro (isto é, vectores que contenham os elementos necessários para comandar a replicação, transcrição e transferências das sequências que codificam a epitelina numa célula hospedeira adequada). Neste sistema, encontram-se incluídos, embora não se limitem apenas a estes, os vectores de expressão de virus/sistemas celulares hospedeiros de mamíferos (por exemplo, citomegalovirus, o viros da vacinia, o adenovírus e similares; os sistemas vector de expressão de vírus de 19 - insectos/células de inseetos (como por exemplo o baculoví-rus); ou os sistemas de expressão de promotores não víricos derivados dos genomas de células de mamíferos (como por exemplo, o promotor da metalotionina do rato). As células hospedeiras adequadas incluem, mas não se limitam, às células dos mamíferos. Por exemplo, pode determinar-se a expres_ são transitória das proteínas dos mamíferos utilizando uma célula hospedeira COS, enquanto que a expressão estável pode ser atingida utilizando uma célula hospedeira CHO. A expressão dos elementos destes vecto res varia no que se refere ao seu rigor e especificidades. Dependendo do sistema hospedeiro/ vector utilizado, podem utilizar-se diversos elementos de transcrição e de transferência adequados. Por exemplo, quando se efectua a clonagem em sistemas celulares de mamíferos podem utilizar-se promotores isolados a partir do genoma de células de mamíferos (por exemplo o promotor da metalotionina do rato) ou a partir de vírus que se desenvolvem nessas células (por exemplo, o promotor de 7,5 K do vírus da vacinia ou a longa repetição terminal do vírus de sarcoma de murino de Moloneyl. Também se podem utilizar promotores produzidos de acordo com a tecnologia do ADN recombinante ou de acordo com técnicas de síntese para se obter a transcrição das sequências inseridas.

Também são necessários sinais específicos de iniciação para uma transferência eficaz das sequên cias que codificam as proteínas inseridas. Estes sinais - 20

incluem o codão de iniciação de ATG e as sequências adjacentes. Nos casos em que o gene completo da epitelina, incluindo o seu próprio codão de iniciação e as suas sequências adjacen tes, são inseridos nos vectores de expressão adequados, não são necessários sinais adicionais de controlo de transferência. No entanto, nos casos em que apenas uma porção de sequên cia de código é inserida, é necessário proporcionar sinais de controlo exógenos de transferência, incluindo o codão de ini ciação de ATG. Para além disso, o codão de iniciação tem.de se encontrar em- fase com a sequência de transcrição das sequências que codificam a epitelina para assegurar a transferência da inserção completa. Estes sinais exógenos de controlo de transferência e coddes de iniciação podem ser de diversas origens quer naturais quer de síntese. A eficácia da expre£ são pode ser intensificada pela inclusão de sequência-', atenu antes de transcrição, de elementos de intensificação, etc.

Pode utilizar-se qualquer um dos métodos previamente descritos para a inserção de fragmentos de ADN no interior de um vector para se construírem vectores de expressão que contenham o gene de epitelina com interesse e os sinais de controlo de transcrição/transferência adequados. Estes métodos podem englobar técnicas de ADN recombinante in vitro e técnicas de síntese e recombinações in vivo.

Por exemplo, nos casos em que se utili za um adenovirus como um vector de expressão, pode ligar-se uma sequência que codifica a epitelina a um complexo de con- 21 trolo de transcriçâo/transferência de adenovírus, por exemplo, o último promotor e a sequência principal tripartida. Este gene quimérico pode então ser inserido no genoma do adenovírus por recombinação in vitro ou in vivo. A inserção de uma região não essencial de um genoma vírico que é viável e capaz de expressar a epitelina em hospedeiros infectados. De modo idêntico, pode utilizar-se o promotor de 7,5 K de vacinia.

Um sistema de expressão alternativo que pode ser utilizado para expressar as epitelinas consiste num sistema de insecto. Num tal sistema, utiliza-se o vírus da poliedrose nuclear de Autographa californica (AcNPV). para se expressarem os genes estranhos. Desenvolvem-se os vírus em células Spodoptera frugiperda. Pode clonar-se uma sequência que codifica a epitelina em regiSes não essenciais (por exemplo no gene da poli-hedrina) do vírus e colocá-lo sob o controlo de um promotor AcNPV (por exemplo o promotor da poli-hedrina). A inserçaô bem sucedida de uma sequência que codifica a epitelina originará a inactivação do gene da poli-hedrina e a produção de um vírus recombinante não omisso (por exemplo, o vírus que não possui o revestimento protainá cio codificado com o gene da poli-hedrina). Utilizam-se então estes vírus recombinantes para infectar células de Spodo-doptera frugiperda nas quais o gene inserido se expressa.

Os vectores retrovírus preparados em linhas celulares amfotrópicas embaladas permitem uma expressão altamente eficaz em numerosos tipos de células. Este 22 ,4* / .¾ método permite determinar o processamento específico do tipo celular, a regulação ou a função da sequência inserida que codifica a proteína.

Para além disso, pode seleccionar-se a estirpe da célula hospedeira que modula a expressão das sequên cias inseridas o que modifica e processa o produto genético do modo desejado. Pode elevar-se a expressão de determinados pro motores na presença de determinados indutores (por exemplo, iões de zinco e de cádmio para promotores da metalotionina).No entanto a expressão de epitelinas construídas geneticamente pode ser controlada. Isto é um facto importante se a proteína do gene estranho clonado for letal para a célula hospedeira.

Para além disso, as modificações (como por exemplo a glicosi-lação) e o processamento ( como por exemplo a clivagem) dos produtos proteicos é importante para a função da proteína. Células hospedeiras diferentes possuem mecanismos caracterís-ticos e específicos para o processamento e modificação pós--transferencial das proteínas. Podem seleccionar-se as linhas celulares ou os sistemas hospedeiros adequados para se assegurar a modificação e processamento correctos da expressão da proteína estranha. 5.1.3.3. IDENTIFICAÇÃO DE TRANSFECTANTES OU DE TRANSFOR-

MANTES QUE EXPRESSAM 0 GENE DA EPITELINA

As células hospedeiras que contêm a sequência recombinante de código e que expressam o produto maduro biologicamente activo podem identificar-se de acordo com - 23 - pelo menos as quatro abordagens gerais: (a) hibridização ADN-ADN, ADN-ARN ou ARN-ARN inverso; (b) presença ou ausência de funções de gene 'tarcador"; (c) determinação do nível de transcrição medido pela expressão de transcrições de mARN de epitelina na célula hospedeira; e (d) de-tecção do gene maduro medido por imuno-ensaio e, por fim, de acordo com as suas actividades biológicas.

Na primeira abordagem, a presença de sequências que codificam a epitelina inseridas nos vectores de expressão pode ser detectada por hibridização ADN-ADN utilizando sondas constituídas por sequências nucleotídicas que são homólogas das sequências que codificam a epitelina.

Na segunda abordagem, pode identificar-se o sistema de vector de expressão/hospedeiro e selec-cionar-se com base na presença óu ausência de determinadas funções de gene "marcador" (por exemplo actividade da timi-dina-quinase, resistência aos antibióticos, resistência a um metotrexato, transformação de fenotipo, formação de corpos de oclusão no baculovírus, etc.). Por exemplo, se se inserir uma sequência que codifica a epitelina numa sequência do gene marcador do vector, os recombinantes que contenham a referida sequência de código podem ser identificados pela ausência da função do gene marcador. De um modo alternativo, pode colocar-se um gene marcador em série com a sequência da epitelina sob o controlo do mesmo promotor ou de um promotor diferente utilizado para controààr a expressão da sequência que codifica a epitelina. A expressão do marcador em res- posta y.· yà. .^indução'v·::ou selecção indica a expressão da sequência que codifica a epitelina.

De acordo com a;terceira abordagem, pode determinar-se a actividade transcricional para uma região que codifica a epitelina de acordo com ensaios de hibridização.

Por exemplo, pode isolar-se e analisar-se o ARN poliadenilado por análise de mancha de (Northern utilizando uma sonda homo Ioga da região adequada que codifica a epitelina ou de porções particultres desta. De um modo alternativo, podem extrair--se e determinar-se os ácidos nucleicos totais da célula ho£ pedeira para hibridização com .feâis sondas.

De acordo com quarta abordagem, pode determinar-se a expressão da proteína madura imunologicamente, por exemplo por análise da mancha de Western, ensaios imuno-lógicos tais como radioimunoprecipitação, ensaios imunológi-oos ligados a enzimas e similares. Contudo o último ensaio para se verificar o sucesso do sistema de expressão envolve a detecção do gene de epitelina biologicamente activo. Se a célula hospedeira segregar o gene, o meio livre de células obtido a partir das células hospedeiras transfectantes culti vadas é ensaiado ípara se verificar a actividade da epitelina. Quando o produto genético não é segregado, podem ensaiar-se os lisados celulares para se verificar a referida actividade. Em qualquer um dos casos, podem utilizar-se ensaios biológicos tais como ensaios de inibição do crescimento e de estimulação do crescimento aqui descritos. - 25 - - 25 - 5.1.4

DERIVADOS, ANÁLOGOS E PÉPTIDOS DE EPITELINA A produção e utilização de derivados, análogos e péptidos relacionados com as epitelinas também se encontram abrangidos pelo âmbito da presente invenção. Estes derivados, análogos e péptidos, que apresentam actividade moduladora do crescimento, podem, de modo idêntico às diversas epitelinas, serem aplicáveis no diagnóstico, prognóstico e tratamento de uma ampla variedade de neoplasias e de outras doenças relacionadas com o crescimento. Tais derivados , análogos e péptidos podem possuir actividades biológicas aumentadas ou diminuídas em comparação com as epitelinas nativas e/ou podem aumentar ou limitar a gama de células sus^ ceptíveis à actividade inibidora do crescimento (AIC) da epi telina e encontrar-se-ão também abrangidas pelo âmbito da pre senta invenção. De modo idêntico, a produção e utilização de derivados, análogos e péptidos relacionados com as epitelinas que apresentam actividade estimuladora do crescimento intensificada ou diminuída (AEC) e/ou aumentam ou limitem a gama de células responsáveis para a AEC da epitelina podem ser aplicadas de um modo útil incluindo mas não se limitando ao tratamento de feridas e de queimaduras.

Os derivados análogos e péptidos rela cionados com a epitelina referidos na presente invenção podem ser produzidos de acordo com uma ampla variedade de meios conhecidos na especialidade. Os procedimentos e manipulações gené ticos e os níveis de proteína encontram-se abrangidos pelo

í p> âmbito da presente invenção.

Ao nível das proteínas, podem efectuar--se numerosas modificações químicas para se produzirem deri^ vados, análogos e péptidos semelhantes à epitelina, de acordo com técnicas conhecidas na especialidade que incluem mas não se;limitam à acetilação, formilação, oxidação, clivagem química específica por endopeptidases (por exemplo brometo de cianogénio, tripsina, quimiotripsina, protease V8 e similares) ou por exopeptidases, etc..

5.2. ANTICORPOS ANTI-EPITELINA

Também se encontra abrangida pela presente invenção a produção de anticorpos policlonais e monoclo-nais que reconhecem as epitelinas ou as proteínas com ela re lacionadas.

Podem utilizar-se diversos procedimentos conhecidos na especialidade para a produção de anticor pos policlonais para epítopes de epitelinas. Para a produção de anticorpos podem imunizar-se diversos animais hospedei^ ros por injecção com uma epitelina ou com um péptido de síntese de epitelina, incluindo mas não se limitando a coelhos, ratos, ratazanas, etc. Podem utilizar-se diversos adjuvantes para aumentar a resposta imunológica dependendo da espécie do hospedeiro incluindo, mas não se limitando, ao adjuvante de Freund (completo ou incompleto), geles minerais (tais como hidróxido de alumínio), substâncias tensioactivas (tais como - 27 -

lisolecitina), polióis plurónicos, polianiões, emulsões oleo sas, hemocianinas de molúsculo, dinitrofenol e adjuvantes humanos potencialmente úteis tais como a BCG (bacilo de Ca^ mette-Guerin) e Corynebacterium parvum.

Pode preparar-se umaaráti corpo monoclo-nal para um epítope de uma epitelina utilizando qualquer técnica que proporcione a produção de moléculas de anticorpo através de linhas celulares contínuas em cultura. Estas técni cas incluem mas não se limitam à técnica do hibridoma originalmente descrita por Kohler e Milstein ("Nature"; 256, 1975; p. 495-497) e à técnica mais recente do hibridoma das células B humanas (Kosbor e outros; "immunology Today"; 4 : 72; 1983) e à técnica do hibridoma EBV (Cole e outros, Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, Alan R. Liss, Inc., 1985; p. 77-96).

Os fragmentos de anticorpo que contêm o idiotipo da molécula podem ser originados de acordo com técnicas conhecidas. Estes fragmentos incluem, por exemplo, embora não se limitem, ao fragmento ? FÇab’^ que pode ser produzido por digestão de pepsina da molécula do anticorpo; aos fragmentos Fab* que podem ser originados por redução das ligações dissulfureto do fragmento Fíab'^ e aos dois fragmentos Fab que podem ser originados por tratamento da molécula do anticorpo com papaína e um agente redutor.

Os anticorpos para as epitelinas podem ser utilizados na detecção qualitativa das epitelinas maduras e dos seus precursores e das suas formas sub-componentes, na purificação por afinidade das proteínas de epitelina e na elucidação da biossíntese da epitelina, no metabulismo e função da mesma. Os anticorpos para as epitelinas também podem ser úteis como agentes de diagnóstico e terapêuticos.

5.3. CARACTERÍSTICAS BIOLÓGICAS DAS EPITELINAS

Os esforços iniciais dos requerentes na clonagem do cADN indicaram que as proteínas moduladoras do crescimento da família das epitelinas são constituídas por diversos membros estruturalmente idênticos. Para além disso, parece que o mARN que codifica as epitelinas se expressa em diversos tipos de tecidos numa larga gama de cordados. Os dados iniciais dos requerentes tendo em vista a estrutura dos genes da epitelina a partir dessas diversas fontes de cor dados sugeriram que o gene da epitelina se encontrava no mesmo local e se mantinha constante de um modo notável durante pelo menos 250 milhões de anos. As diversas epitelinas parecem consistir em proteínas de baixo peso molecular de cadeia simples. Nenhuma das cadeias obtidas para as epitelinas possuia uma homologia significativa em relação a qualquer proteína anteriormente conhecida. É interessante referir que diversas epitelinas contêm uma região homóloga do sítio activo da fos-folipase A2. A epitelina 1 e a epitelina 2 purificadas a partir de tecidos renais de ratazanas são proteínas de respectivamente 56 e 57 aminoácidos, que compartilham de uma hemologia da sequência aminoácida de 47 % e de 12 resíduos de - 29 - / cisteina identicamente:posicionados. Deste modo, aproximada-mente um quinto dos aminoácidos de ambas as epitelinas são cisteínas. 0 posicionamento destes 12 resíduos de cisteina sugerem que, através da formação de ligações dissulfureto entre eles o padrão comanda a formação de uma "prisãodde cis-teína" ao nível da estrutura terciária que talvez não seja diferente das estruturas em forma de dedo de zinco. Os requerentes não conhecem qualquer outra proteína que possua esta característica ou um padrão de cisteina que se encontre estrei tamente relacionada com este. Este padrão único de cisteina observa-se não s6 nas estruturas primárias das epitelinas 1 e 2 purificadas, mas também nas estruturas deduzidas a partir das sequências de diversos cADNs que codificam as epitelinas e clones de PCR. Parece que este padrão único de cisteina consiste no entanto numa característica distinguível dos membros da família das epitelinas e que desempenha como tal uma importante função. Para além disso, alguns líãípia^: aminoácidos encontram-se conservados entre estas duas epitelinas purificadas.

Isolou-se um cADN que codifica o precursor completo da epitelina de ratazana e determinou-se as suas sequências aminoácidas núcleo tídldas e dedutíveis tal como se indica na fig. 18. 0 precursor dá epitelina de ratazana era constituído por um polipéptido de 589 resíduos aminoácidos cujos 17 resíduos aminoterminais englofcavamco seu péptido principal. Parece que pelo menos sete espécies com pletas e distintas de epitelinas eram codificadas pelo gene - 30 , precursor da epitelina de ratazana. O elevado nível de homo-logia sequencial entre as epitelinas codificadas pelo cADN da epitelina de ratazana puderam ser visualizadas por homologia interna de 7,5 vezes gerada por comparação da sequência pre cursora de epitelina de ratazana consigo própria tal como se ilustra na fig. 19. A estrutura secundária composta e a análise hidropática do precursor da epitelina de ratazana encontram-se indicadas nas fig. 20A e fig. 20B respectivamente. Os alinhamentos da sequência aminoácida entre os precursores da epitelina de ratazana, de rato e humana encontram-se indi^ cados na fig. 21A.

Os requerentes também isolaram as sequências de ADN precursoras da epitelina completas dos seres humanos, dos ratos e das,: ratazanas. Um alinhamento composto destas sequências de epitelina encontrasse- indicado na fig. 21 A. Para além disso, obtiveram-se numerosos clones de PCR que codificavam diversas epitelinas de origem bovina e de aves fig. 24. 25). A análise das diversas sequências indicou que as epitelinas compartilhavam, em :graus um pouco diferentes , uma característica estrutural distinta definida pelo motivo cisteína altamente conservado (consensos) tal como se indica na fig. 21C. Embora esta sequência de consenso pareça encontrar-se geralmente conservada entre as epitelinas, um motivo nuclear de cisteina de "CCXgCCxgCCx^CC” encontra--se quase sempre completamente conservado em todas as espécies de epitelinas examinadas até à data tendo em conta a ori gem. As excepções incluem a primeira repetição completa do - 31 precursor de epitelina de ratazana em que as substituições de cisteína por serina se encontram presentes e o motivo é »SCxgCCx6SCx5CC".

Para além disso, o resíduo de estidina na 25^ posição do motivo nuclear também pareoe conservar-se entre as espécies dè epitelina. Os requerentes créãn que o motivo.:' principal representa uma característiea única de todas as epitelinas e, de acordo com o anteriormente exposto, consideram que a presente invenção engloba todas as proteínas que possuam esta característiea estrutural. A fig. 21B indica a sequência aminoácida das epitelinas de 1 a 7 alinhadas maduras de seres humanos,ratazanas e de ratos. A sequência representada pela fig. 21C encontra-se completamente conservada entre as epitelinas 2 a 7 nestas tris espécies. As sequências de epitelina 1 divergem apenas ligeiramente desta sequência.

Os requerentes examinaram o ARN de um grande número de tecidos e de linhas celulares de seres huma nos e de murinos para verificarem a presença de transcrições de epitelina encontrando-se os resultados destes ensaios . resumidos no quadro I, a seguir. - 32 -

QUADRO I

DISTRIBUIÇÃO DA EXPRESSÃO DAS TRANSCRIÇÕES DE EPITELINA EM DIVERSOS TECIDOS E CÉLULAS DE SERES HUMANOS E DE MURINOS SERES HUMANOS FORTE + Fraca + Placenta Ovário Cólon Duodeno Medula renal Timo Córtex renal Pulmão Testíoulos Supra-renais Mama Rim CRL 7386 HBL100 Caki-1 HE PM CRL 1550 CRO 1572 Caki-2 HTB132 HUF 1477 CCL 137 HSB2 U937 HTB131 BT474 HTB36 (utilizando uma sonda Negativè de ratazana) Cérebro

Epiderme Fígado

Pituitária

Amnio

Medula óssea Cerebelo MCF~7 HTB27

T47D CEMA-1

Ca da Mama Ca de wilm - 33 - 33

Quadro I (Cont. RATO

Forte + Fraca + Negativa Intestino Fetal Coração Nenhuma Placenta Ovário Rim Timo Pâncreas Cérebro Sárebels (Córtex) Pulmão Embrionário d15 Embrionário Fígado Cólon D6 Duodeno Músculo Esquelético CCL5-1 CCL51 (TPA)

As característioas biológicas da epitelina 1 e da epitelina 2 purificadas encontrara-se descritas de um modo um pouco detalhado na Secção 6.4, infra. Ambas as proteínas são estáveis após tratamento com ácido acético 1M, hidró xido de amónio 1M, ureia 6M, metaperiodato de sódio 10mM e aquecimento a 56$C durante 30 minutos. As bioactividades de ambas as proteínas são sensíveis a,enzimas proteolíticos e agen tes redutores. É evidente qpe pelo menos algumas ligaçQes dissulfureto na estrutura da epitelina são essenciais para a Ç* r bioact-ividade. Não parece que os radicais oligossacarídicos e/ou lípidicos sejam essenciais para a actividade quer da epitelina 1 quer da epitelina 2. A epitelina 1 e a epitelina 2 apresentam actividade inibidora do crescimento sobre, entre outros, célu las de carcinomas epidermóides humanos. Os dados dos requeren tes sugerem contudo que a epitelina 1 é um inibidor mais poten te do crescimento celular. Por exemplo, a actividade específica calculada da epitelina 1 purificada e aproximadamente dez vezes a da epitelina 2 e a epitelina 1 parece ser aproximadamente 36 vezes mais potente que a epitelina 2 na inibição do crescimento das células A431. Para além disso, pelo menos numa linha celular ensaiada, a linha celular do carcinoma do cólon humano, a epitelina 2 foi incapaz de despolotar o efeito inibidor observado com a epitelina 1.

Reveste-se ainda de mais interesse a diver gência funcional entre a epitelina 1 e a epitelina 2 no que se refere à bioactividade estimuladora do crescimento celular.

Os requerentes demonstraram que a epitelina 1, para além da sua sb4oactividade inibidora do crescimento, é um estimulador potente do crescimento celular em diversas linhas celulares o que conduziu os requerentes a concluírem que a epitelina 1 é um verdadeiro modulador bifuncional do crescimento. Em contra£ te, os dados dos requerentes sugerem que a epitelina 2 é incapaz de despolotar o efeito estimulador do crescimento, pelo menos nas linhas celulares ensaiadas.

Talvez se revista ainda de mais interesse o facto dos requerentes terem descoberto posteriormente que a epitelina 2 antagoniza de:um modo específico as actividades esti muladoras exercidas pela epitelina 1. Apesar da inter-relação funcional entre estas e/ou outras epitelinas não ser perfeita mente conhecida até à presente data, é possível que a epitelina 2 possa funcionar como um controlo sobre a actividade esti muladora induzida pela epitelina 1. Os requerentes puseram a hipótese de que uma relação de afinidade funcional agonista/ /antagonista entre a epitelina 1 e a epitelina 2, e/ou entre outros membros da família das epitelinas podia controlar ou de algum modo influenciar o balanço entre o crescimento celular normal e não reprimido e o desenvolvimento. Deste ponto de vista, a homeostase celular podia ser alterada ou destruída pela perda de uma função crítica proporcionada por uma epitelina ou epitelinas envolvidas numa tal inter-relação originando por exemplo uma proliferação celular irreprimível. Através da utilização terapêutica das epitelinas, de anticorpos anti--epitelina e/ou de receptores de epitelina poder-se-ia modular a homoestase celular e/ou restaurá-la

Verificou-se a capacidade para se expressarem motivos individuais a partir dos precursores de epitelina para se determinar se processamentos diferenciais libertavam outras moléculas activas. No sentido de seleccionar vecto res ou bloqueadores candidatos, as sequências dos motivos ricos em cisteína indicados na fig. 21A foram alinhadas e analisadas em série. Apresentam-se os resultados através do dendograma - 36 apresentado na fig. 27. Em todos os casos descobriu-se pelo menos um motivo diferente na mesma posição no precursor de outras duas espécies. Com base nestas descobertas, póe-se a hipótese de que o gene primordial da epitelina fosse submetido a sete replicações antes da divergência entre roedores e seres humanos. Esta análise também indica que a quinta repetição do precursor da epitelina é mais idêntica à epite-linâ 1 e que é um candidato para possuir a actividade estimu ladora do crescimento. Para além disso, a segunda repetição & mais idêntica à epitelina 2 e é um candidato antagonista dos efeitos mitogénicos da epitelina 1. 0 gene da epitelina possui diversas carac terísticas intrigantes. A expressão ubíqua do gene sugere que desempenha uma função na manutenção do: crescimento celular epi telial normal em contraste com as moléculas anteriormente de£ critas que possuem uma distribuição mais restrita. A estrutura altamente repetitiva e rica em cisteína do precursor de epitelina define um novo motivo evolicionariamente conservado. Para além disso, pelo menos dois destes motivos podem ser pro teoliticamente processados nos reguladores activos do crescimento. Esta configuração é idêntica à da pro-opiomelanocortina (FOMC), uma pro-hcrmona que é processada de um modo específico no tecido: para libertar uma diversidade de péptidos bio activos (Smith e Funder; "Endocr. Rev." £; 198®; p. 159— -79). .

As actividades opostas da epitelina 1 e da epitelina 2 sobre o crescimento das células epiteliais faz - 37

lembrar outros sistemas em que moléculas estruturalmente rela cionadas naturais actuam como antagonistas ou supressoras das moléculas da mesma família. Como exemplo destes factos, podem referir-se: IL-1ra, um antagonista do receptor da interleu- cina-1 .(Hannum e outros; "Nature"; 343; p.1990; p. 336-40;

Eisenberg e outros; "Nature"; 343; 1990; p. 341-46); Krev--1 (Kitayama e outros; "Cell""; 56_; 1989’; p. 77-84), uma proteína que suprime a transformação induzida por ras; e a inibina (Ling e outros; "Proc. Natl. Acad. Sei." U.S.A. 82; 1985; p. 7217-21), uma proteína gonadal que se opõe ao efeito biológico da actividade (Ling e outros; "Nature"; 3215 1986; p. 779-82). Foram necessários estudos posteriores para identificar os receptores celulares para as epitelinas 1 e 2 para definir o modo como estas moléculas mediavam os seus sinais de oposição. A descoberta de que ambas as activida-des eram produtos da mesma transcrição é exasperante. É concebível que o processamento específico do tecido, o processamento espacialmente específico ou o processamento temporal- ' mente específico possa proporcionar o único meio de regulação da homeostase epitelial.

5.4. UTILIZAÇÃO DAS EPITELINAS, DAS MOLÉCULAS

DE ACIDO NUCLEICO ÔUE. CODIFICAM AS EPITELINAS DOS ANTICORPOS ANTI-EPITELINAS E DOS RECEPTORES DAS EPITELINAS

Os requerentes preveem uma ampla variedade de utilizações para as composições da presente invenção, inclu- - 38-|

indo as utilizações de diagnóstico e/ou terapiuticas de proteínas de epitelinas, ou de análogos de epitelinas ou de deri_ vados de epitelinas de moléculas de ácido nucleieo que eodifi cam as epitelinas e de anticorpos anti-epitelinas e de reeep tores de epitelinas.

5.4.1. PROTEÍNAS DE EPITELINAS

As proteínas de epitelinas, os seus análogos e derivados, assim como as composições que os conte nham,· podem ser utilizados separadamente ou em combinação uns· com os outros e/ou com outros factores de crescimento biologicamente activos, inibidores ou agentes imunomodulado-res para regularem o crescimento e/ou o desenvolvimento das células dos cordados in vivo e in vitro.

Podem utilizar-se epitelinas diferentes composições de epitelinas para se atingirem diferentes objec tivos terapêuticos. Dada a diversidade funcional observada, especialmente entre a epitelina 1 e a epitelina 2, Os requerentes prevêm que estas duas epitelinas possam ser úteis teo±> em vista diferentes oi> jectivos. No entanto, apesar das suas diferenças funcionais, tanto a epitelina 1 como a epitelina 2 podem ser úteis como agentes anti-cancerígenos uma vez que ambas demonstram capacidade de inibir o crescimento de células neoplásicas, embora os dados iniciais dos requerentes sugiram que a epitelina possa ser um inibidor de tumores mais poderoso, e/ou eficaz. A combinação especial de epitelinas e/ou de outros factores utilizados dependerá do tipo de células alvo 39-

envolvidas assim como do objectivo especial desejado.

Para utilização in vivo as composições que constituem o objectivo da presente invenção, podem ser· administradas de acordo com diversas vias incluindo, mas não se limitando, a injecções, infusões, administração tópica, parentérica, etc. A administração pode ser efectuada de acor do com qualquer veículo fisiologicamente aceitável, incluindo a solução salina de fosfato tamponada, solução salina, água esterilizada, etc. As epitelinas e as.moléculas com elas relacionadas podem ser encapsuladas em lipossomas e podem ser conjugadas com anticorpos que reconhecem e se ligam ao tumor ou a antigenos específicos de células, proporcionando assim um meio para "projectar" as composições da presente invenção.

As epitelinas podem ser úteis in vivo para induzirem a diferenciação terminal nas células cancerígenas. Estas células divergiram do curso normal das caracte-rísticas de diferenciação celulares das células normais e são capazes de proliferar continuamente. As células normais, em contraste, diferenciam-se em células que são incapazes, na maãoria das circunstâncias, de divisões celulares· posteriores. Deste modo, a capacidade das epitelinas para reactivar a dife renciação celular normal em tumores e, por último, para parar o contínuo crescimento do tumor, podem constituir uma utilização valiosa na terapia dos tumores.

Podem utilizar-se epitelinas, .'os seus derivados, análogos e peptidos separadamente ou com pelo - 40 - menos um outro composto anti-proliferativo, incluindo, por exemplo, interferão, TEG- β , factores de necrose de tumor, etc., no tratamento de doenças neoplásicas e de outras doenças relacionadas com o crescimento. Também podem tratar-se os carcinomas induzindo a produção de epitelinas nas células de carcinomas.

Os compostos da presente invenção podem ser utilizados in vitro para inibir o crescimento das células ou de linhas celulares sensíveis às epitelinas para se fazer a distinção das células que não são sensíveis à epitelina. De acordo com este procedimento , podem libertar-se misturas heterogéneas ou linhas celulares de células indesejáveis se essas células indesejáveis forem sensíveis à actividade inibi-dora do crescimento da epitelina. Por exemplo, os compostos da presente invenção podem ser utilizados in vitro para eliminar células malignas a partir de células malignas da medula para transplantações autólogas da medula e para eliminar ou inibir a proliferação de células malignas no sangue antes da reinfusão.

Pode determinar-se a concentração mais efi caz de epitelinas para inibir a proliferação de uma dada célu la adicionando diversas concentrações de epitelinas às célu-las cancerígenas com interesse e monitorizando a quantidade de inibição da proliferação celular. Pode determinar-se a concentração mais eficaz de indutores individuais e/ou de combi nações de indutores monitorizando a produção de epitelinas nas células de carcinomas. - 41

Pode induzir-se a estimulação do crescimento celular através da epitelina 1 , de moléculas idênticas à epitelina 1 e talvez através de outros membros da família das epitelinas. Previ-se uma ampla diversidade de aplicações terapêuticas com base nesta bioactividade da epitelina que inclui, mas não se limita, à cicatrização de feridas e à remodelação de tecidos. Para além disso, os anticorpos capazes de neutralizar a actividade inibidora da epitelina 1 ou da epitelina 2 também podem ser úteis na promoção da cicatrização de ferimentos e na remodelação tecidular com ou sem a administração simultânea de epitelina 1 ou de moléculas idênticas à epitelina T.

As composições da presente invenção também podem ser utilizadas no tratamento de doenças da pele humana envolvendo a proliferação de células normais tais como a psoríase. Embora a patogénese da psoríase não seja ainda conhecida, a doença envolve uma rápida e recidivante proliferação das células epiteliais. A rápida proliferação, em simultâneo, dos queratinócitos altera a queratinização originando epiderme mais espessa e a descamação característica da doença. Uma vez que a epitelina 1 estimula o crescimento e a proliferação dos queratinócitos uma terapia-eficaz de inibição da actividade induzida pela epitelina 1 pode impedir o aparecimento dos primeiros sintomas de desenvolvimento da doença. Por este motivo, as composições susceptíveis de inibir níveis endógenos ou, anormalmente elevados de epitelina 1, nos pacientes com psoríase, podem ser eficazes na 42 cura da doença. Os requerentes demonstraram que á epitelina 2 inibe de um modo específico a estimulação induzida pela epitelina 1, nos queratinocitos. Tendo em vista este objec-tivo, as composições que contêm epitelina 2 podem ser especialmente úteis no tratamento da psoríase. De modo idêntico os anticorpos capazes de neutralizar a actividade estimuladora da epitelina 1 podem ser utilizados para inibir a acti vidade da epitelina 1.

Os requerentes também prevêem a utilização de epitelinas e de moléculas idênticas a epitelinas com outras finalidades terapêuticas, incluindo, mas não se limitando , à modulação da angiogénese, da formação renal, da reabsorção óssea, de respostas imunitárias, de funções efecto-ras das sinapses e dos neurónios, da cascata araquidónica e das funções gonádicas e reprodutoras.

Prevêem-se numerosas utilizações com fins de diagnóstico, para as epitelinas e moléculas com elas relacionadas. Na prática da presente invenção, os polipepti-dos que constituem o objectivo da referida invenção podem ser unidos a um marcador tal como um radioisótopo, um enzima, um composto fluorescente, um composto quemiluminescente, um frag mento enziraático, uma particula etc. Podem utilizar-se tais compostos para efectuar a titulação do número de receptores de epitelina numa célula. A identificação de receptores de epitelina é uma indicação de uma potencial resposta da célula aos efeitos biológicos das epitelinas e das moléculas com elas relacionadas. As epitelinas, as moléculas relacionadas com as epitelinas e/ou os anticorpos para as referidas epiteliL nas podem ser utilizados em ensaios competitivos para a detec ção de epitelinas em meios, especialmente em meios fisiológicos. Podem utilizar-se diversos ensaios de diagnóstico conhecidos na especialidade. A presença e os níveis de epitelinas nos fluídos e tecidos orgânicos podem encontrar-se directa ou inversamente relacionados com a presença e malignidade de determinados cancros e de outras doenças relacionadas com o crescimento. Os ensaios através dos quais se possa fazer a detecção e/ou quantificação das epitelinas podem ser utilizados no diagnóstico e prognóstico de doenças relacionadas com o crescimento.

Para além disso, as células malignas que expressam os receptores da epitelina podem ser detectadas uti lizando epitelinas marcadas radioactivamente ou moléculas relacionadas com epitelinas marcadas radioactivamente no en saio de ligação ao receptor ou através da utilização de anticorpos para o próprio receptor da epitelina. Podem distinguir-se as células de acordo com a presente invenção e densidade dos receptores da epitelina, proporcionando assim um meio para se prever a susceptibilidade de tais células às actividades biológicas das epitelinas.

5.4.2. MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLEICO QUE CODIFICAM A EPITELINA

As moléculas de ácido nucléico ou os seus - 44 -

fragmentos que codificam a epitelina podem ser utilizadas . como sondas para detectar e quantificar os mARNs que codificam as epitelinas. Os ensaios nos quais se utilizam sondas de ácido nucleico para se detectar as sequências incluem total_ mente ou em parte uma sequência de um gene conhecido e são bem conhecidos na especialidade. Os níveis de mARN das epitelinas podem indicar o aparecimento e/ou existência de uma neoplasia assim como 'aparecimento dos primeiros sintomas e/ou propensão para outras doenças humanas incluindo, mas não se li mitando, à psoriase. Deste modo, os ensaios através dos quais se pode efectuar a detecção e a quantificação do mARN de epitelina podem proporcionar um importante ..método de diagnóstico.

As moléculas de ArN de sentido inverso da epitelina podem ser úteis terapeuticamente para inibirem a transferência dos mARNs que codificam a epitelina quando o obe jectivo terapêutico envolve a pretensão de eliminar a presença de uma dada epitelina. Por exemplo, o ARN inverso da epitelina 1 pode ser útil como agente antagonizante da epitelina 1 no tratamento de doenças para as quais a epitelina 1 é o agente causador. Adicionalmente, os ARNs de sentido inverso da epitelina podem ser úteis na elucidação dos mecanismos fun cionais das epitelinas.

As moléculas de ácido nucleico que codificam a epitelina podem ser úteis na produção de proteínas da epitelina recombinante e de moléculas com ela relacionadas,tal como se expõe separadamente na Secção 5.1.3·, supra. 6. EXEMPLO: PREPARAÇÃO DE EPITELINA 1 E DE EPITELINA 2

PURIFICADAS, A PARTIR DO RIM DA RATAZANA

6.1. PROCEDIMENTOS DE PURIFICAÇÃO 6.1.1 EXTRACÇÃO COM ÁCIDO ETANÓLICO

Obtiveram-se os rins das ratazanas a partir de Pel-Freez (Rogers, Arkansas). Efectuou-se uma suspen ção de rins de ratazana congelados (430 g de peso seco) em 2370 ml de tampão de extracção que consistia em 2348 ml de etanol (98 %), 19 ml de HC1 concentrado, 81,5 mg de fluoreto de fenilmetil-sulfonilo e 2,8 ml de aprotinina (23 TlU/ml a partir de pulmão de bovino; Sigma Chemical Co.), Deixou-se descongelar o tecido a 4®C durante 4-6 horas e homogeneizou--se a mistura num misturador de Waring. Agitou-se a mistura a 4'®C durante a noite, centrifugou-se a 9 000 rpm num rotor Sorvall GS-3 durante 40 minutos e removeu-se cuidadosamente o sobrenadante (2 200.ml). Adicionou-se clorofórmio (2 200 ml) e 220 ml de água acidificada (375 ml de água + 7,5 ml de HC1 concentrado) ao sobrenadante, agitou-se vigorosamente a mistura durante aproximadamente uma hora e deixou-se em repouso à temperatura ambiente para a separar em duas fases. Removeu-se cuidadosamente a fase aquosa superior e dializou--se com 17 litros de ácido acético 0,1 Ma 4^C num tubo de diálise N2 3 Spectropore (peso molecular de admissão de apro ximadamente 3 000). Mudou-se o tampão de diálise três vezes durante ;um período de dois dias. Liofilizou-se o produto

retido e designou-se o material liofilizado (4,55 g), como "extracto impuro" e armazenou-se a -20^C até utilização pos terior.

6.1.2. CROMATOGRAFIA PREPARATÓRIA DE PERMEABILIZAÇÃO EM

GEL

Ligou-se uma coluna Bio-Sil TSK-250 (21,5 x 600 ml) (BioRad) a um sistema de cromatografia líqu.i da de elevado rendimento (CLER) (Waters). Dissolveu-se o extracto impuro (25 mg/ml) em 50 % de acetonitrilo/água com 0,1 % de ácido trifluoroacético (TFA). Injectou-se uma aliquota de 3 ml da mistura e efectuou-se a eluição isocraticamente com uma fase móvel de 50 % de acetonitrilo com 0,1 % de TFA. 0 débito foi de 4 ml/minuto e a velocidade foi ajustada para 0,25 cm/minuto. Recolheram-se fracções de seis ml. Efectuou -se a cromatografia à temperatura ambiente. Efectuou-se a eva poração de uma aliquota de cada fracção e ensaiou-se em tripli cado para se observar a actividade inibidora do crescimento (AIC) em células A431 de carcinoma epidermoide humano, tal como se descreve na Secção 6.2.1., infra, (fig. 1). 0 menor e último pico de eluição (fracções 25-28) continha as novas actividades com interesse. Agre garam-se as fracções 25-28 de 57 processamentos idênticos,concentraram-se e liofilizaram-se. 0 material liofilizado pesava 473 mg e possuia um total de aproximadamente 1,1 x 10 unidades de AIC. - 47 / .¾ /

6.1.3. CLER DE FASE IMVERSA DE FRACÇÕES PREPARATÓRIAS TSK - 250

Dissolveram-se as fracções liofiliza-das (Secção 6.1.2., supra) em 240 ml de 0,1 % de TF A em.’ água; centrifugou-se a mistura e removeu-se cuidadosamente o sobrenadante. 0 volume final era de aproximadamente 250 ml.

Injectou-se isocraticamente 125 ml desta mistura numa coluna preparatória Partisil 10 0DS-3 (10 micra, 2,2 x 25 cm;

Whatman) ligada a um sistema de CLER. Ajustou-se o débito para 4 ml/minuto. Uma vez passada a amostra através da coluna lavou-se a coluna com 150 ml de TFA a 0,1 % em água. Gerou-se o gradiente linear entre o dissolvente primário, TFA a 0,1 % em água e o dissolvente secundário, acetonitrilo conten do TFA a 0,1 %. As condições do gradiente eram as seguintes: 0 a 45% em 270 minutos e 45 a 100 % em 45 minutosRecolheram-se fracções de 14 ml e ensaiaram-se aliquotas de cada frac ção para se observar AIC. Observaram-se quatro largos picos de actividade (fig. 2). Efectuou-se uma segunda passagem, tal como se descreveu anteriormente. Os dois picos precoces de eluição, pico a e pico b continham, respectivamente, epi-telina 2 e epitelina 1 e foram posteriormente purificados e caracterizados. As purificações posteriores da epitelina 1 e da epitelina 2 encontram-se descritas separadamente adiante .

6.1.4. PURIFICAÇÃO POSTERIOR DA EPITELINA 1 POR CROMATO-GRAFIA DE FASE INVERSA E POR CLER DE PERMEAÇÃO OU PERMEABILIZAÇÃO EM GEL

Agregaram-se as fracções 55-59 (fig. 2) de duas passagens e diluiram-se duas vezes com TFA a 0,1 % em água. Injectou-se a mistura isocraticamente numa coluna semi-preparatória ( ^u-Bondapak-C18 (7,8 x 300 mm. Waters) a um débito de 2 ml/minuto à temperatura ambiente. As condições de gradiente linear entre o dissolvente primário, água‘can TFA do dissdvaitè searriáridV;aoetaiitrilõ cm ΊΡΑ á 0··:!$ fírpà de D .a. I8$;en %8 minutos, de 18 a 18 % em 20 minutos, de 18 a 34 % em 240 minutos e de 34 a 100 % em 10 minutos. 0 débito foi de 2 ml/minuto ao lon go de todo o gradiente; recolheram-se fracções de 7 ml.Toma ram-se aliquotas e ensaiaram-se quanto a AIC. Observaram-se dois picos de actividade que se eluiram a concentrações de acetonitrilo de aproximadamente 24 % e 25 % respectivamente (fig. 3).

Agregaram-se as fracções 30-34. Adicionou-se 45mtde TFA a 0,1 % em água à fracção agregada. Aplicou -se a mistura isocraticamente numa coluna yuBondapak-CN (3,9 x 300 mm, Waters) a um débito de 1 ml/minuto à temperatura ambiente. As condições de gradiente foram de 0 a 10 % em 1 minuto, de 10 a 10 % em 19 minutos, de 10 a 30 % em 200 minu tos, e de 30 % a 100 % em 7 minutos. 0 débito foi de 0,5 ml/ /minuto e recolheram-se fracções de 1,5 ml. A maioria da actividade emergiu da coluna a aproximadamente uma concentra- - 49 - ção de acetonitrilo de 21,5 í (fig. 4).

Agregaram-se as fracções 36-43 e dilui-ram-se eom TFA a 0,1 %/E^O até a um volume final de 115 ml ezéféctuou-se a sua cromatografia exactamente como se descre^ veu para as fracções 30-34 anteriores. A maioria da activi-dade eluiu-se a partir da coluna em dois picos que se elui-ram a aproximadamente 22,5 % e 23,5 % de acetonitrilo (fig.5).

Concentraram-se individualmente as fracções 51 e 52 (fig. 4), utilizando um concentrador speed-vac(savant) até a um volume de aproximadamente 70 yul ao qual se adicionou um igual volume de acetonitrilo contendo TFA a 0,1 %. Injectou-se esta amostra de 140 yul em duas colunas Bio-Sil TSK-250 (7,5 x 300 mm cada, Bio-Rad) organizadas em série.

Efectuou-se a êluição isocraticamente com uma fase móvel de acetonitrilo a 50 %/E^O com TFA a 0,1 % , à temperatura ambiente. 0 débito era de 0,4 ml/minuto e a velocidade de 0,25 cm/minuto; recolheram-se fracções de 0,4 ml e ensaiaram-se aaialíquotas:quaat-Q.Jbactividade AIC. · As caracterís-ticas cromatográficas das fracções 51 e 52 encontram-se indi cadas respectivamente nas figs. 6A e 6B.

Concentraram-se individualmente as fracções 44 e 45 (fig. 5) até 70 yul e depois submeteram-se a uma cromatografia por permeabilização de gel tal como anterior-mente se^descreveu. Fornecem-se as características cromatográficas na fig. 7· 50-

6.1.5. PURIFICAÇÃO POSTERIOR DA EPITELINA 2 POR CLER DE FASE INVERSA E DE PERMEABILIZAÇÃO EM.GEL

Agregaram-se as fracções 50-54 (fig.2) de duas passagens e diluiram-se , duas vezes, TFA a 0,1 % / /H^O. Aplicou-se a mistura numa coluna semi-preparatória /u-Bondapak-Cl8 (7,8 x 30 mm, Waters) a um débito de 2 ml/ /minuto. As condições do gradiente linear entre o dissolvente primário, água TFA a 0,1 % e o dissolvente secundário, ace-tonitrilo com TFA a 0,1 % foram de 0 a 18 % em 1,8 minutos, de 18 a 18 % em 20 minutos, de 18 a 34 % em 240 minutos e de 34 a 100 % era 10 minutos. 0 débito foi de 2 ml/minuto ao longo de todo o gradiente; recolheram-se fracções de 7 ml. Tomaram-se alíquotas, que se ensaiaram quanto à actividade AIC. Indica-se na fig. 8 as características cromatográficas. 0 pico principal de actividade eluiu-se a uma concentração de acetonitrílo de, aproximadamente, 20,5 %.

Agregaram-se as fracções 18-23 e, diluiram-se com TFA a 0,1 #/H20, até a um volume final de 110 ml. Aplicaram-se as misturas numa coluna yu-Bondapak-CN (3,9 x x 300 mm, Waters), a um débito de 1 ml/minuto à tempera-, tura ambiente. As condições do gradiente foram de 0 a 10# em 1 minuto, 10 a 10 % em 19 minutos, 10 a 30 % em 200 minutos, e 30 a 100 % em 7 minutos. 0 débito foi de 0,5 ml/minuto;reco_ lheram-se fracções de 1,5 ml. A actividade emergiu a partir da coluna, a uma concentração de acetonitrílo de, aproximadamente , 18 % (fig. 9).

Concentraram-se, individualmente, as frac- - 51

ções 36-38 (Fig. 8) até aproximadamente 70 /11,2 que se adicionou igual volume de acetonitrilo contendo TFA a 0,1 %. Aplicou-se esta amostra de 140 jal a duas colunas Bio-Sil TSK-250 (7,8 x 300 mm cada, Bio-Rad), colocadas em série. Efectuou--se a eluição isocraticamente com uma fase móvel de 50 % de acetonitrilo/H^O com TFJf a 0,1 % . 0 débito foi de 0,4 ml/minuto; recolheram-se fracções de 0,4 ml e ensaiaram-se aliquotas quanto à actividade para AIC. Nas figs. 10A, 10B e 10C indicam-se, respectivamente, as características cro-matográficas das fracções 36, 37 e 38.

Agregaram-se as fracções 48 e 49 da fig. 10A-C e concentraram-se até aproximadamente 70 /xl e depois submeteram-se a uma cromatografia de permeabilização em gel tal como anteriormente se descreveu. Apresentam-se na fig. 10D as características da recromatografia.

6.2. BIOENSAIOS

6.2.1. ACTIVIDADE INIBIDORA DO CRESCIMENTO CELULAR UTILIZAN DO A INCORPORAÇÃO DE 125I-DESOXIURIDINA N0 ADN

Efectuaram-se os ensaios da actividade inibidora do crescimento celular (AIC) em placas de 96 tubos de fundo plano (Falcon 3072). Utftiéfdò^se· caiD-sélulaS: de ensátoipqra AIC células do carcinoma epidermoide da vulva humana (A431)· Colocaram--se em todos os tubos, com excepção dos tubos periféricos, 3,5 x 104 células em 50 /il de meio de ensaio (DMEM enrique eido com soro de feto de bovino a 5 %, inactivado pelo calor 52

(SFB), penicilina/estreptomicina (PE) e glutamina). Os tubos periféricos receberam 50 >ul de FSB; Três horas mais tarde, adicionou-se 50 μΐ de amostra de ensaio ao meio de ensaio de cada um dos tubos, enquanto que os tubos de contro lo receberam apenas 50 μΐ de meio de ensaio. Utilizaram-se três tubos para cada concentração de amostra de ensaio. Incu baram-se as placas a 37®C durante 2-3 dias. Depois, adicio- 1 pς nou-se a cada tubo 100 μΐ de uma solução de I-iodo-2'-125 125 I-desoxiuridina ( I-IUdr, 4Ci/mg-0,5 mCi/ml, 2 μΐ/ /ml em meio de ensaio e incubaram-se as placas a 37Q-C. Decor ridas 4 a 6 horas, aspirou-se o meio dos tubos que depois se lavaram, uma vez,com 200 yul de SFB. Depois, adicionou-se 200 jtil de metanol a cada tubo, incubaram-se as placas durante 10 minutos à temperatura ambiente e eliminou-se o metanol por as^ piração. Adicionou-se a cada tubo 200 μΐ de hidróxido de sódio 1M, incubaram-se as placas durante 30 minutos a 37'^C. Eliminou-se o hidróxido de sódio com tampões titertek (Flow j

Labs). Transferiram-se os tampões para tubosplástidos de'12x75 mm / e efectuou-se a contagem num contador gama para quantificar 125 a incorporação de I-IUdR.

6.2.2. ENSAIOS DE ACTIVIDADE ESTIMULADORA E IN1BIDO-RA DO CRESCIMENTO CELULAR UTILIZANDO QUERATI-NÓCITOS DE MURINO

Colocaram-se células balb/MK a 1 x 10^ células por tubo em 1 ml de meio pobre em cálcio (Weissaman e Aaronson; "Cell"; 32, 1983; p. 599-606; Carpenter e Zen- degut; "Anal. Biochem."; 153; 1985; p. 279-282) em placas de Costar de 24 tubos e incubaram-se a 37~C durante 4 a 6 horas. Depois eliminaram-se os meios e substituiram-se por 1 ml de meio contendo diversas concentrações do composto de ensaio em triplicado. Os tubos de controlo receberam apenas meio sem qualquer material de ensaio. Incubaram-se as placas a 37^0 durante 4 dias e depois eliminou-se o meio, lavaram-se os tubos duas vez com 1 ml de uma solução salina de fosfato tampão e destacaram-se as células com tripsina--EDTA e contaram-se.

Também se utilizaram células Balb-MK como células indicadoras em placas de 96 tubos para se determinar a actividade inibidora do crescimento (AIC) ou a actividade estimuladora do crescimento (AEC) de um material de ensaio 125 utilizando a incorporação de i-desoxiuridina no ADN,tal como se descreveu na secção anteiror.

6.2.3· ENSAIO DE COLÓNICAS EM AGAR MACIO

Adicionou-se a 24 tubos de Costar de pia cas de cultura de tecidos, uma camada base de 0,38 ml de agar a 0,5 % (Agar Noble: Difco Laboratories, Detroit, Michigan) em DMEM contendo SFB inactivado pelo calor a 10 %. Colocou--se sobre a camada base de agar, 0,38 ml de agar a 0,3 í con

O tendo a mesma mistura de meio-SFB, 6 a 12 x 10J células de ensaio e as proteínas de ensaio, a diversas concentrações. Incubaram-se as placas a 37®;C em atmosfera húmida, com CO2 a 5 % em ar. Enumeraram-se as colónias que não se fixaram - 54 - nem coraram e determinou-se o número de colónias, entre o 7-e o 102 dias. Definiram-se as colónias como um cacho de pelo menos 8 células.

6.3. DETERMINAÇÕES DAS ESTRUTURAS PRIMÁRIAS

6.3.1. REDUÇÃO E S-PIRIDILETILAÇÃO

Secaram-se proteínas (10-20 jig) em tubos de polipropileno de uma microfuga de 1,5 ml, suspenderam-se em 100/il de ureia 3 M em Tris-HCL 0,05 M, a pH 7,5. Depois adicionou-se 4 μΐ de 2-mercaptoetanol à mistura, misturaram-se os componentes, submeteram-se a um jacto de azoto e incubaram-se a 25^C· Decorridas 2,5 horas, adicionou-se 4,5/n de 4-vinilpiridina recentemente destilada à mistura, submeteu-se novamente o tubo a um jacto de azoto e incubou-se durante 2 horas a 25-C. Apidififiou-se a mistura reaccional para pH 2,0 com TFA a 10 %. Purificou-se a proteína S-piridiletilada por CLER de fase inversa utilizando uma coluna Partisil 5 0DS-3 (4,6 x 100 mm, Whatman). Fez- -se subir a concentração de acetonitrilo linearmente (1 %/ /minuto) durante 55 minutos a um débito de 1 ml/minuto. 0 dissolvente primário foi TFA a 0,1 ^/H^O. A epitelina 1--S-piridiletilada (SPE-Epitelina 1) e a SPE-Epitelina 2 eluiram a aproximadamente 25 % e 23 % de acetonitrilo respec_ tivamente, a concentrações de acetonitrilo, aproximadamente de 2 a 3% superiores, às epitelinas não tratadas. - 55

6.3*2. CLIVAGEM ENZIMÃTICA DE SPE-EPITELINA 1 E DE SPE-EPITELINA.2

Levou-se a efeito a clivagem com endo-peptidase Lis-C e TPCK-tripsina em 60 ^ul de um tampão de Tris-ácido acético 0,1 M, a pH 8,0 a·25-C durante 16 horas. A proporção enzima/substrato era de 1 para 5 (p/p). Efectua ram-se as digestões com endopeptidase-Arg e aureus V8 protease em 80yul de Tris-HCL 0,05 M, a pH.8,0, bicarbonato de amónio 0,1 Ma 37Ç;C durante 16 horas. A proporção enzima/substrato era novamente de 1 para 5.

6.3.3. ISOLAMENTO DQJ PÉPTIDO

Separaram-se os péptidos numa coluna C18 (4,6 x 100 mm, Whatman) de CLER de fase inversa ligada a um sistema de CLER (Waters). Aplicou-se a amostra acidificada (pH 2,0) numa coluna equilibrada com TFA a 0,1 % (dissolvente primário), a um débito de l.,minuto/ml e lavou-se po£ teriormente a coluna com aproximadamente 15 ml de TFA a 0,1 %. Utilizaram-se gradientes lineares entre o dissolvente primário e o dissolvente secundário (acetonitrilo com TFA) a 0,1 %). As condições do gradiente foram de 0 a 50 % em 125 minutos a um débito de 0,5 ml/minuto.

6.3.4. ANÃLISE AMINOÁCIDA

Hidrolizaram-se as amostras anidras com HCL em constante ebulição (5,7 M, Pierce) contendo 1 % (v/v) de fenol, a pressão reduzida num balão de hidrólise de vidro vedado com Teflon (Pierce) a 105°C~ durante 16 horas.

Secaram-se os hidrolisados num concentrador (Savant Instruments.) e derivaram-se com fenilisotiocianato durante 20 minutos à temperatura ambiente. Analisaram-se os derivados ami_ noácidos de feniltiocarbamilo por CLER de fase inversa numa coluna Octadecílica (4,5 x 250 mm, IBM). Efectuou-se o gra diente linear entre o dissolvente primário acetato de sódio 0,15 M a pH 6,4, trietilamina a 0,05 % titulada para pH 6,4 com ácido acético e o dissolvente secundário 60 % de aceton:i trilo a um débito de 1 ml /minuto a 38Q’C.

6.3.5. DETERMINAÇÃO DA SEQUÊNCIA AMINOÁCIDA

Determinaram-se as sequências peptídicas com um sequenciador de fase gasosa modelo 475 da Applied Biosystem tal como se descreveu anteriormente (Hewick e > outros; "J. Biol. Chem."; 256; 1981; p. 7990-7997). Efec-tuaram-se três pré-ciclos de degradação de Edman antes de se aplicar a amostra em cada uma das passagens. Utilizou-se TFA a 25 fe para converter os derivados de triazolina em amino-ácidos de feniltio-hidantoína. A identificação dos amino-ácidos de feniltio-hidantoína foi efectuada em linha num ana lisador do modelo 120A PTH (Applied Biosystem) tal como descrito (Hunkapiller e Hood; "Science"; 219; 1983; p. 650- -659). 6.3.6. ELECTROFORESE EM GEL DE SULFATO SÕDICO DE POLIACRILAMIDA DE TRICINA-

DODECILO

Analisaram-se as proteínas em placas-^de

- 57 -V gel de tricina/sulfato dodecílico de sódio/poliacr.ilamida (sistema normal ou mini Bio-Rad) de acordo com o método de Gabhard; "Biochem"; 166; 1987; p. 368-379. Detectaram-se proteínas por coloração com prata (Wray e outros; "Anal. Bio chem".; 118; 1981; p. 197-203).

6.4. CARACTERÍSTICAS DAS EPITELINAS 1 e 2 6.4.1. PROPRIEDADES FÍSICAS E QUÍMICAS A epitelina 1 e a epitelina 2 são resistentes ao tratamento com ácido acético 1 M, hidróxido de amó nio 1 M, ureia 6 M, metaperiodato de sódio 0,01 M, ao aquecimento a 56^C durante 30 minutos e ao tratamento com diversas glicosidades ou lipases. No entanto, a actividade da epitelina é sensível à redução,4-vinilpiridina e à digestão com proteinases tais como a tripsina, a endopro teinase Lis-C e a endoproteinase Glu-C (V8). Estes resultados indicam que estes factores são proteínas contendo cis-teínas em ligações dissulfureto que são essenciais para a actividade biológica. 6.4.2. PURIFICAÇÃO DA EPITELINA 1 E DA EPITELINA 2

E DETERMINADAS PROPRIEDADES FÍSICAS

Os resumos de purificação da epitelina 1 e da epitelina 2 encontram-se indicados respectivamente nos quadros I e II. Purificaram-se ambos os factores até uma homogeneidade aparente de acordo com um protocolo idêntico -58-( em seis fases. As fracções das primeiras fases continham uma multiplicidade de actividades inibidoras do crescimento sobre as células A431. As epitelinas 1 e 2 constituem apenas uma fracção muito pequena das primeiras fracções da AIC total tornando muito difícil quantificar as suas actividades especí^ ficas nas primeiras fases de purificação. A actividade específica da epitelina 1 purificada foi aproximadamente de 2^,1 x x 10 unidades/mg de proteína enquanto que a epitelina 2 puri ficada possuía uma actividade específica muito inferior de q 3,8 x 10 unidades/mg de proteína.

QUADRO II

Resumo da Purificação da Epitelina . 1 (GIA) Fracção Proteína - pE GIA 1 Unidades Actividade Específica Unidades/mg Rendimento % Bruta Prep TSK-250 4,550,600 473,000 1 ,283,1002 112,2002 282 237 Ί Lm··' Prep. ODS (b) 17,600 O O 801 100 Semi-Prep. C18 1b 1 ,510 3,460 2,080 1,377 14,8 2b 5,460 1 ,578 38,7 Anal. Ciano 1b 60 713 11,889. 3,4 2b 73 1 ,190 16,301 8,4 Anal. Tsk-250 1b 41 845 20,609 6,0 2b 62 1 ,305 21,048 9,3 Λ TJtoa. unidade GIA consiste na quantidade do factor necessário para inibir em 50 % a incorporação de desoxiuridina 125 - marcada com DI, nas células A431. 2

Nestas fracções encontram-se presentes outras activida-· des inibidoras do crescimento. Estes valores englobam todas as actividades.

QUADRO III

Resumo da Purificação da Epitelina 2 (GIA)

Fracção Proteína·., Ug 1-r GIA 1 Unidade Actividade Específica Unidades/mg Rendimento % Bruta 4,550,000 1 ,283,1001 2 282 Prep TSK-250 473,000 112,2002 237 - Prep. ODS (b) 24,500 9,567 432 100 Semi-Prep. C18 4,760 1,190 250 12,4 Anal. Ciano 169 460 2,741 4,8 Anal, TSK-250 37 141 3,810 1,5 1

Uma unidade de GIA consiste na quantidade de factor necessária para inibir em 50 % a incorporação de desoxiuridina 125 marcada com I, nas células A431* 2

Nestas fracções encontram-se presentes outras actividades inibidoras do crescimento. Estes valores, englobam todas as actividades. 60

Determinou-se o peso molecular da epi-telina 2 por cromatografia de permeabilização em gel em colunas TSK-250 e esse peso molecular foi respectivamente de — 4 500 e de — 3 700 (fig. 6, 7 e 10). As SPE-epitelinas 1 ou 2 apresentaram um peso molecular de - 13 000 segundo uma cro matografia de permeabilização em gel idêntica. A fig. 11 apresenta uma análise da epi^ telina 1 e da epitelina 2 gel de poliacrilamida a 18 % em condições redutoras. A epitelina 1 e a epitelina 2 migraram no gel como bandas únicas com pesos moleculares médios relativos de 5 500 e de 6 000 respectivamente. Obtiveram-se resultados idênticos quando se efectuou a electroforese das proteínas em condições não redutoras. Deste modo, as epiteli-nas são proteínas de baixo peso molecular e de cadeia simples.

6.4.3. ESTRUTURA QUÍMICA DA EPITELINA 1 E DA EPITELINA 2

Deduziram-se as sequências aminoácidas da epitelina 1 e da epitelina 2 a partir de análises micro-sequenciais de proteínas S-piridiletiladas e de fragmentos gerados pela endoproteinase Lis-C, Staphyloooccal aureus 78 e tripsina TPCK. Na fig. 12 apresentam-se as sequências aminoácidas da epitelina 1 e da epitelina 2.

As sequências proteicas da epitelina 1 e da epitelina 2 foram comparadas com todas as proteínas existentes na base de dados da National Biomedical Research - 61

Foundation (versão 22), Genetic Sequence Data Bank (Bolt Beranek and Newman, Los Alamos National Laboratory; versão 61) e com a base de dados do European Molecular Biology Labo ratory (versão 20). Estas pesquisas/-' efectuadas em computador revelaram que ambas as proteínas eram novas e que não compartilhavam qualquer homologia significativa com qualquer proteína existente nas três bases de dados. A epitelina 1 e a epitelina 2 são poli péptidos de cadeia simples com respectivamente 56 e 57 resíduos aminoácidos,que possuem pesos moleculares calculados de, respectivamente, 6060 e 6094. A epitelina 1 e a epite lina 2 compartilham, ao nível aminoácido, de uma homologia de 47 %. Ambas as proteínas contêm 12 resíduos de cisteína com quatro duplos resíduos de cistexna.i« Deste modo, cerca de 21 % dos resíduos aminoácidos em ambas as proteínas são cisteínas.Para além disso, o.intervalo entre os resíduos de cisteína simples e os resíduos de cisteína duplos, na epitelina 1 e na epitelina 2, são idênticos. Apesar do número ou da posição das ligações de dissulfureto intrac&deias nestas proteínas não ser presentemente conhecido,'espera-se que se mantenha um padrão semelhante ou idêntico. Ambas as proteínas também contêm aproximadamente 13 % de hidróxi-amino-ácidos (serina e treonina) em conjunto. Na fig. 12 apresenta-se o alinhamento aminoácido da epitelina 1 e da epitelina 2. Para além de se encontrarem conservados os resíduos de cisteína, encontram-se também conservados 15 outros resíduos entre a epitelina 1 e a epitelina 2.

Na fig. 13 apresentam-se as caracte- -62-/

‘i rísticas hidropáticas das epitelinas 1 e 2. As caracterís-ticas das epitelinas 1 e 2. As características hidropáticas da epitelina 1 apresentam alguma similaridade com as da epitelina 2 embora a epitelina 2 pareça ser mais hidrofílica do que a epitelina 1. 6.4.4. PROPRIEDADES BIOLÓGICAS DA EPITELINA 1 E DA EPITELINA 2

Na fig. 14 apresenta-se a inibição da 125 * incorporação de : I-desoxiuridina no ADN das células A431 do carcinoma epidermoide humano, provocada por diferentes concentrações de epitelina 1 e epitelina 2 purificadas. Observou-se uma inibição de 50 % da síntese do ADN a 12,8 ng/ /tubo de epitelina 1 e de 450 ng/tubo de epitelina 2. Deste modo, ocorreu uma inibição de 50 % a uma concentração aproximada de ,21 nM de epitelina 1 e a uma concentração aproximada de 0,75 yuM de epitelina 2. Deste modo verifica-se que a epitelina 1 é aproximadamente 36 vezes mais potente do que a epitelina 2 neste ensaio.

Também se estudou o efeito da epitelina 125 na incorporação de I-desoxiuridina no ADN de diversas^ li^ nhas celulares, tumorigenas e não tumorigenas, humanas assim como em diversas linhas celulares não-humanas. A epitelina 1 (dose máxima ensaiada de 20 ng/ml) inibiu levemente o cres cimento da linha celular HCT 116 do carcinoma das células do cólon hamano, enquanto que a epitelina 2 (270 ng/ml, dose máxima ensaiada) não mostrou qualquer efeito sobre esta linha celular. Ambas as proteínas inibiram de um modo sig- 125 nificativo a incorporação de I-desoxiuridina no ADN da linha celular 64, do pulmão das martas e, das células C0S1 do rim do macaco. Nenhuma das proteínas exibiu qualquer efei_ to significativo sobre os fibroblastos e outras células cancerígenas humanas na dose máxima ensaiada (20 ng/ml para a epitelina 1 e 270 ng/ml para a epitelina 2).

Também se estudaram os efeitos de diver sas concentrações de epitelina 1 e de epitelina 2 na incor-125 poração de 3I-desoxiuridina no ADN dos queratinócitos de murino (células Balb/MK). Os dados encontram-se indicados na fig. 15A. A epitelina 1 estimulou a incorporação 125 de I-desoxiuridina de um modo dependente da dose, enquanto que a epitelina 2 não mostrou possuir qualquer efeito signifi^ cativo. No entanto, a epitelina 2 inibiu a incorporação de 125 I-desoxiuridina induzida pela epitelina 1 nas células Balb/ /MK (fig. 15B). No que se refere a este ponto, observou-se uma inibição de 50 % a uma concentração de £21 nM de epitelina 2.

T

Deste modo, a epitelina 2 antagoniza o efeito da epitelina 1, neste sistema. 0 crescimento contínuo de uma linha celu lar de queratinocitos de murino, Balb/MK, depende de EGF, TGF^ ou de anfirregulina (AR). As células Balb/MK não proliferam na ausania de EGF ou de epitelina 1 (fig. 16A), enquanto a epitelina 2 não apresentou qualquer efeito significativo 64 sobre o crescimento dessas células. No entanto, a epitelina 2 inibiu o crescimento das células Balb/MK induzida pela epi telina 1 de um modo independente da dose (fig. 16B); observou-se uma inibição a 50 % a uma concentração de -7..nM de epitelina 2. EGF ou TGF©^ induzem o crescimento independente da fixação das células da NRK-SA6 do rim da ratazana na presença de TFG^0 (Roberts e outros;"Proc. Natl. Acad. Sei."; USA; 78; 1981; p. 5339-5344). De modo idên tico à EGF,a epitelina 1 induz o crescimento das células NRK de um modo independente da fixação e de um modo dependente da dose (fig. 17) enquanto a epitelina 2 não o faz. A epitelina 2 (a uma concentração de -85 nM) inibiu aproxima-damente 50 % da formação de colónias induzidas pela epitelina 1 em agar macio. Para além disso, a epitelina 1, mas não a epitelina 2, apresentou uma actividade mitogénica sobre as células NRK em monocamada.

Nem a epitelina 1 nem a epitelina 2 125 afectaram de modo significativo a ligação de I-EGF aos seus receptores o que sugere que as epitelinas não efectuam a mediação dos seus efeitos biológicos através dos seus receptores de EGF.

7. EXEMPLO; CLONAGEM DE cADN DO PRECURSOR DA EPITELINA E DA EXPRESSÃO TRANSITÓRIA DO PRECURSOR E DAS

FORMAS MADURAS

7.1.CLONAGEM DE cADN DE PCR

Sintetizaram-se dois oligonucleotidos degenerados, ócmbase nas sequências peptídicas KTQCPDD e HCCPQDT a partir da epitelina 2 (os agregados continham 256 e 128 oligonucleótidos degenerados em sentido normal e inverso respectivamente). Utilizaram-se estes oligonucleótidos como apontadores numa amplificação de 40 ciclos de PCR com uma matriz de cADN de cordão único derivada do ARN do rim da ratazana preparado com XSCT17, um oligonucleotido contendo uma sequência na sua extremidade 3' (Plowman e outros; "Proc. Natl. Acad. Sei."; USA 87; 1990; p. 4905--08). Marcou-se uma sonda oligonudeotídica, com base na sequência KYGCCPMP dá epitelina 2 (23-mero degenerado 256 32 vezes), com [φ1- P]ATP e utilizou-se para se efectuar o rastreio dos produtos de ®'CR. A hibridização desta sonda com uma mancha Southern de produtos de PCR revelou duas bandas principais de 120 pares de bases (pb) e de 600 pb e uma banda menor de 325 pb. Subclonaram-se e sequenciaram-se estes fragmentos o que revelou que todos eles possuiam em comum uma extremidade 5’ que codificava a epitelina 2. 0 fragmento de 325 pb possuia umai sequência de transcrição aberta que codificava tanto a epitelina 1 como a epitelina 2, enquanto o fragmento de 600 pb se estendia para além da extremidade 3' e continha uma cópia adicional do motivo rico em cisteína. Deste modo, a epitelina 1 e a epitelina 2 parecem tratar-se de produtos com um arranjo em série de uma única transcrição. Utilizaram-se os mesmos preparadores de PCR para se isolarem fragmentos idênticos do cADN do precursor da epitelina a partir de seres humanos, de bovinos, de ratos 66 - e de aves o que demonstrou que existia uma forte conservação evolucionária do motivo rico em cisteína.

Obtiveram-se os cADNs completos da epi_ telina a partir de fontes humanas, de ratazanas e de ratos utilizando um protocolo de PCR para se isolarem as extremidades 5’ e 3' das mensagens que possuíam uma sequência central conhecida e efectuando o rastreio das bibliotecas ^gt10. Utilizou-se particularmente uma estratégia de PCR com preparadores de epitelina exactos orientados nos sentidos 3' e 5' em combinação com preparadores que recosiam o prolongamento natural poli (A) ou sequência de síntese de poli(A) sobre o cADN da extremidade 5’ (Plowman e outros; "Proc. Natl. Acad. Sei."; USA 87_; 1990; p. 4905-08). Construiu-se uma biblioteca de cADN de rim de ratazana em „Àgt10 (Plowan e outros; "Mol. Cell. Biol."; 10; 1990; p. 1969-81) e isolou--se um cADN de epitelina de ratazana completo por rastreio 5 com 2,0 x 10 recombinantes com sondas de epitelina origi nadas por PCR. Também se utilizaram estas sondas para se obter o gene de epitelina do rato a partir da biblioteca gené-mica das células-T do rato (Stratagene, La Jolla, GA). Efec_ tuou-se a sequenciação de diversos clones gerados por PCR, clones de cADN de ratazana e clones genómicos de rato em ambas as bandas utilizando polimerase T7 com preparadores oligonucleotídicos (Tabor e Richardson; "Proc. Natl. Acad. Sei."; USA 84; 1987; p. 4767-71). A sequência composta do cADN da epitelina de ratazana (fig. 18) possuia uma extensão de 2150 pb que se aproximava estreitamente da transcrição de 2,3 kiloba-ses observada por análise northern com o mARN do rim da rata zana. A sequência preconiza uma pré-proteína de 589 resíduos com uma região de 30 pb na extremidade 5' não transferida e uma região de 343 pb na extremidade 3’ não transferida. 0 primeiro AUG encontra-se seguido de um péptido principal hidrofóbico N-terminal de 16 aminoácidos e de um precursor de epitelina madura de 573 aminoácidos com um que se pre viu ser de 61 597. 0 precursor não possuia domínio de trans^ membrana, possuia 3 sítios potenciais de glicosilação ligados à extremidade N e 88 resíduos de cisteína. 0 precursor da epitelina possuia uma organização altamente repetitiva (fig. 19) contendo 7 cópias em série de um motivo de consenso de 55 a 57 aminoácidos VXCX^gCXgCCXgCCXgCCXDX^CCPX^CX gCXg. Duas das repetições representavam moléculas activas conhecidas , epitelina 1 e epitelina 2. As sequências aminoácidas previsíveis para os precursores da epitelina do rato e de se^ res humanos continham respectivamente 589 e 593 resíduos e apresentavam uma identidade sequencial de 86 % (no rato) e 75 % (nos seres humanos) com a proteína de ratazana (fig. 21 A). Podem também existir isoformas adicionais de epitelina uma vez que o clone de cADN de ratazana possui uma eliminação de 234 pb (fig. 21 A, aminoácidos 398-475), uma sequência de transcrição conservada e um motivo quimérico gerado. Esta eliminação é provavelmente o resultado de uma união alternativa uma vez que as suas fronteiras determinam precisamente a localização das junções exão-intrão no gene da epitelina do rato. - 68 - A comparação da sequência da epitelina com a da proteína disponível e com as bases de dados da sequência de ADN revelaram três regiões com homologia para proteínas conhecidas. Os primeiros 41 aminoácidos que se encontram a seguir à sequência principal do precursor da epitelina contêm 6 resíduos de cisteína organizados num modelo idêntico ao da metade N-terminal dos outros sete motivos ricos em cisteína. A sequência CPDGQFCPVACC encontra-se completamente conservada entre as epitelinas dos seres huma-os, ratazanas e ratos e em conformidade com um padrão de consenso presente numa família de toxinas de cobras (Duf-ton; "J. Mol. Evol."; 20j 1984; p. 128-34). Existe uma segunda região de homologia em três dos motivos ricos em cisteína da epitelina de ratazana (CCXgHXgC), e em conformidade com uma região de consenso que circunda um sítio ac-tivo de fosfolipase A2 (Gomez e outros; "J. Eur. J. Bio-chem."; 186; 1989; p. 23-33)· Finalmente, existe uma ex tensa homologia entre os 12 motivos de cisteína da epitelina e o domínio regulador C-terminal de uma tiol-protease de tomate (fig. 21D). Pôs-se hipótese de que este domínio não catalítico regulasse a actividade da protease ligando--se a metais pesados. Os resíduos alternativos de cisteína e de histidina no precursor da epitelina remanescem a domínios de ligação a metais de uma variedade de proteínas, apesar de os motivos das epitelinas não se encontrem, em conformidade com estes ou com quaisquer outras ligações a metais consensuais e conhecidas. A análise de Northern - 69 -

demonstrou que uma transcrição de epitelina de 2,3 kilobases se expressa de um modo ubícuo e que é predominante no rim, placenta, coração, duodeno, colon e córtex cerebral do adulto. Para além disso, encontra-se presente numa ampla variedade de linhas celulares de tumores epiteliais. A análise Southern indica que o precursor de epitelina é codificado por uma unica cópia de gene. Estes resultados sugerem um mecanismo pós-transcricional para a geração das moléculas activas, a partir do precursor da epitelina.

7.2. EXPRESSÃO NAS CÉLULAS COS

Determinaram-se as propriedades bioquímicas da epitelina de ratazana inserindo a sua sequência de código completa num vector de expressão sob o controlo do pro motor primário imediato ao citomegalovirus (Seed e Aruffo; ”Proc. Natl. Acad. Sei.”; U.S.A. 84; 1987; p. 3365-69).

De um modo específicç inseriu-se um fragmento de 1,6 kb contendo a sequência completa que codifica a epitelina de ratazana, num vector de expressão cDM8 originando o vector de expressão orEPN3f.6. Preparou-se uma construção idêntica, crEPN1.4, por inserção de um fragmento de 1,35 kb, a partir de cADN de epitelina, que possuía uma eliminação de um único exão eliminando deste modo os aminoácidos 398-475. Cons-truiram-se os plasmídeos de secreção, rEPNS,,liganflcP.a sequência principal de síntese TGF-^1 de símio contida nos oligonucleétidos 70

MaPPSG-LRLLPLL 5' AGCTTCTGCAGGGGCGGGGCCTCCCCC ATGCCGGCGTCGGGGCTGCGGCTGCTGCCGCTGCTG 3’ AGACGTCCCCGCCCCGGAGGGGG TACGGCGGGAGGCCCGACGCCGACGACGGCGACGAC LPLLWLLVLTPSRPAA CTACGGCTGCTGTGGCTACTGGTGCTGACGCCTAGCCGGCCGGCCGC 3’ GATGGCGACGACACCGATGACCACGACTGCGGATCGGCCGGCCGG 5' e fragmentos SacII-Xbal originados por PCR contendo a sequência de código de epitelina 1 e de epitelina 2 no p-lasmídeo cDMÓSII degerido com HindIII e Xbal. O plasmídeo cDM8S I um vector cDM8 modificado em que se eliminou o único sítio SacII com Klenow.

Um novo sítio SacII coloca uma glicina final do péptido principal em sequência com a sequência de código da epitelina. Desen-vo3heram-se os plasmídeos de expressão em bactérias competentes MC1061/P3 e introduziram-se em células COS-1, utilizando o método de DEAE-dextrano (Seed e aruffo; "Proe. Natl. Acad. Sei." U.S.A.; 84 ; 1987; p. 3365-69)· Quarenta e oito horas após a transfecção lavaram-se as células com uma solução salina de fosfato tampão e marcaram-se durante 16 horas em MEM isento de soro (4 ml por placa de 100 mm) enriquecido com 250 |iCi/ml de S-cástema (1100 Ci/mmole, New England Nuclear). Dializa-ram-se os sobrenadantes marcados radioactivamente contra ácido acético 0,1 M, secaram-se e fez-se uma passagem de equivalentes de 1 ml em geles de SDS-poliacrilamida a 10 % e a 15 %.

Detectou-se facilmente a proteína que transitoriamente expressa por análise SDS-PAGE dos sobrenadan-t-es marcados com S-cisteína. A proteína recombinante possuia 71

uma massa molecular de aproximadamente 75K, ligeiramente sup£ rior à preconizada de 62 K possivelmente devido a glicosi-lação (fig. 26A, pista 1). Uma construção idêntica que codificava uma isoforma de epitelina mas que não possuia um exão na região C-terminal, migrou com médio de 68 K proporcional à eliminação de 78 aminoacidos. Não existe qualquer prova de que o precursor fosse processado em formas menores. Para expressar as formas maduras recombinantes da epitelina 1 e epitelina 2 colocaram-se as suas regiões de código num vec-tor de expressão depois de uma sequência peptídica principal (c/?rEPN1 rEPN2, respectivamente) o que originou na secreção de proteínas de 6K a partir das células COS (fig. 26B). Inibiu-se o crescimento das células transfectadas com essas construções e exibiram uma morfologia alterada apresentando diversas células, uma aparência de anel em sinete em comparação com as monocamadas intactas observadas numa transfecção simulada. Purificou-se parcialmente o sobrena-dante de transfecção οβτΕΐΝΪ numa coluna Bio-Sil TSK-250 (Shoyab e outros; 87»; 1990; p. 4905-09) e ensaiaram-se as fracções quanto à actividade inibidora do crescimento (AIC) sóbre as células A431- Estas células segregaram epite lina 1 activa (aproximadamente 25 unidades AlC/placa de 100 mm), enquanto o sobrenadante das células simultaneamente transfectadas não demonstrou qualquer actividade detectável (1 unidade AIC corresponde à quantidade de material necessário para se efectuar uma inibição de 50 % do crescimento celular). -72-/

A epitelina 1 possui o efeito inibidor nas células A431 e actua como agente mitogénico sobre diver sas linhas celulares epiteliais normais (ver secção 6., supra). Para além disso, a epitelina 1 pode induzir o crescimento independente da fixação dos fibroblastos do rim da ratazana na presença do factor

transformação do cresci- mento (fig. 17). Em contraste, a epitelina 2 não possui qual quer efeito no crescimento dos queratinocitos dos fibroblastos e opõe-se aos efeitos mitogénicos da epitelina 1 (de um modo dependente da dose) em ambos os sistemas (fig. 17). 0 precursor não tratado da epitelina não demonstrou qualquer actividade em qualquer destes ensaios. Talvez o precursor intacto, desempenhe uma função totalmente diferente, das for mas tratadas, tais como a quelaçâo de iões metálicos ou a . regulação de proteases e de fosfolipases.

Claims (30)

1. -73- / REIVINDICAÇÕES 1.- Processo para produzir uma proteína reguladora do crescimento celular a partir de um tecido de um mamífero em que essa proteína que possui uma actividade reguladora do crescimento celular é constituída por uma cadeia simples com aproximadamente 60 resíduos de aminoãcidos possuindo ge nericamente a seguinte sequência de aminoãcidos: x2 CX5 _ 6 CX5 C CXg CCX6 c cxdx2hc cpx4cx5_6 cx2 em que o símbolo C representa, cisteína; o símbolo D representa ácido aspártico; o símbolo H representa histidina; o símbolo P representa prolina; e o símbolo X representa qualquer radical aminoáci_ do; caracterizado pelo facto de se isolar essa proteína por croma tografia, centrifugação, electroforese, técnicas de solubilidade diferencial ou através de uma sua combinação.
2. 2.- Processo de. acordo com a reivindicação 1, carac- -74- / de planceta, cólon, rim, testículos, glândulas supra-renais, ma ma, ovário, duodeno, timo ou pulmão de seres humanos, ratos, murganhos, vacas ou galinhas.
3. 3. - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto de o polipeptido possuir uma sequência de resíduos aminoácidos constituída por: CX5_6CX5CCXgCCX6CCX5CCX5CX5-6C em que o símbolo C representa cisterna; e o símbolo X representa qualquer aminoácido.
4. 4. - Processo de acordo com qualquer das reivindicaçêes 1 ou 2, caracterizado pelo facto de o polipeptido possuir uma sequência de resíduos aminoácidos constituída por: ccx8ccx6ccx5cc em que o símbolo C representa cisterna; e o símbolo X representa qualquer aminoácido.
5. 5. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de o tecido de mamífero ser tecido de um ser humano e por o polipeptido ser constituído por uma sequência de resíduos aminoácidos em conformidade com -75- .¾ ATG7GGACCC7GG7GAGC7GGGTGGCC7TAÀCAGCAGGGCTGG * GGCTOGàA'— jwGu a GC 10C PEGQFCPVACCLDPGGASYS CCAGA7GG7CAGT7CTGCCC7GTGGCCTGCTGCCTGGACCCCGGAGGAGCCAGC7ACAGC ISO C CRPLLDKWP77LSRHLG'GP 7GCTGCCG7CCCCT7C7GGACAAA7GGCCCACAACAC7GAGCAGGCA7C7GGGTGGCCCC 220 CQVDAHCSAGHSCIF7VSG7 TGCCAGGTTGATGCCCACTGCTCTGCCGGCCACTCCTGCATCTTTACCGTCTCAGGGACT 280 S SCCPFPEAVACGDGHHCCP TCCAG7TGCTGCCCCTTCCCAGAGGCCGTGGCATGCGGGGATGGCCATCACTGCTGCCCA 340 RGFHCSADGRSCFQRSGNNS CGGGGC7TCCACTGCAGTGCAGACGGGCGATCCTGCT7CCAAAGATCAGGTAACAACTCC 400 VGAI.QCPDSQFECPDFS7CC G7GGGTGCCA7CCAG7GCCC7GA7AGTCAG77CGAATGCCCGGAC7TCTCCACG7GC7GT 460 VMVDGSWGCCPMPQASCCED G7TA.7GG7CGÀ7GGC7CC7GGGGG7GC7GCCCCA7GCCCCAGGC77CCTGC7GTGAAGAC 520 RVHCCPHGAFCDLVH7RCIT AGGG7GCAC7GC7G7CCGCACGG7GCC77C7GCGACC7GG77CACACCCGC7GCA7CACA 580 P7G7H?LAXKL'PAQR7NRAV CCCACGGGCACCCACCCCCTGGCAAAGAAGC7CCC7GCCCAGAGGACTAACAGGGCAGTG 640 ALSSSVMCPDARSRCPDGS7 GCC7TG7CCAGCTCGG7CA7G7GTCCGGACGCACGGTCCCGG7GCCCTGA7GGTTC7ACC 700 C. C E L ? SC KYGCCPMPNA7CC 7GCTGTGAGCTGCCCAGTGGGAAGTA7GGCTGCTGCCCAA7GCCCAACGCCACCTGC7GC 760 SDHLH CCP-QD7VCDLIQSXC 7CCGA7CACCTGCACTGC7GCCCCCAAGACACTG7G7G7GACC7GA7CCAGAG7AAG7GC 820 LSKENA77DLL7KLPAH7VG C7C7CCAAGGAGAACGCTACCACGGACCTCCTCAC7AAGCTGCC7GCGCACACAGTGGGG 880 D’VKCDMEVSCPDGY7CCRLQ GATG7GAAA7G7GACA7GGAGG7GAGCTGCCCAGA7GGC7A7ACCTGCTGCCG7CTACAG 940 SGAWGCCPF7QAVCCEDHIH 7CGGGGGCC7GGGGC7GCTGCCC7T77ACCCAGGC7G7G7GC7G7GAGGACCACATACAC 1000 CCPAGF7CD7QKG7CEQGPH 7GCTGTCCCGCGGGGTTTACGTGTGACACGCAGAAGGGTACCTG7GAACAGGGGCCCCAC 1060 -76- V r * QVPWMEKAPAHLSLPDPQAL CAGGTGCCC7GGATGG AGAAGGCCCCAGC7CACCTCAGCCTGCCAGACCCACAAGCCTTG 112 Q X R D V ? C D N V s s c ? s S D 7 C c Q AAGAGAGA7G7CCCC7G > 1 CAGCAGCTGTCCC7C C7CCGA' 7ACC7GCTGCCAA 1130 L T S G E W G C c ? I ? E A V C c s D H CTCACGTCTGGGGAGTGGGGCTGCTGTCCAATCCCAGAGGC7GTCTGC7GC7CGGACCAC 124 0 QHCCPQGYTCVAEGQCQRGS CAGCACTGCTGCCCCCAGGGCTACACGTGTGTAGCTGAGGGGCAGTGTCAGCGAGGAAGC 13 00 ) E IVAGLEXKPARRASLSHPR GAGATCGTGGCTGGACTGGAGAAGATGCCTGCCCGCCGGGCTTCCTTATCCCACCCCAGA 13 6 0 D IGCDQKTSCPVGQTCCF5L GACATCGGCTGTGACCAGCACACCAGCTGCCCGGTGGGGCAGACCTGCTGCCCGAGCCTG 1420 GGSWACCQLPHAVCCEDRQH GGTGGGAGCTGGGCG7GCTGCCAGTTGCCCCÂTGCTGTGTGCTGCGAGGATCGCCAGCAC 1480 CCP. AGYTCNVKARSCEKEVV TGCTGCCCGGCTGGCTÀCACCTGCAACG7GAAGGC7CGA7CCTGCGAGAAGGAAG7GG7C 154 0 SAQPA7FLARSPHVGVXDVE TC7GCCCAGCC7GCCACCTTCCTGGCCCGTAGCCC7CACG7GGG7G7GAAGGACG7GGAG 1600 CGEGKFCHDNQTCCRDNRQG TGTGGGGAAGGACAC7TCTGCCATGA7AACCAGACCTGCTGCCGAGACAACCGACAGGGC 16 60 WACCPYRQGVCCADRRHCCP } TGGGCC7GCTGTCCC7ACCGCCAGGGCG7C7G77G7GC7GATCGGCGCCACTGC7G7CCT 172 0 AGFRCAARGTXCLRREAPRW GC7GGC7TCCGCTGCGCAGCCAGGGG7ACCAAG7G777GCGCAGGGAGGCCCCGCGC7GG 17 8 0 1819 DAPLRDPALRQLL GACGCCCCTTTGAGGGACCCAGCC7TGAGACAGC7GC7G

   .% mero 282 ao 337; 206 ao 262; 59 ao 114; 124 ao 180; 364 ao 418; 442 ao 497; ou 519 ao 574.
6. 6.- Processo de acordo com a reivindicação 2, carac-terizado pelo facto de o tecido de mamífero ser tecido de rato e por o polipeptido ser constituído por uma sequência de resíduos aminoãcidos em conformidade com 150 r u G Q C ? V A C C L D Q G G A N Y S CCAGATGGTCAATT CTG CCCTGTTGC CTGCTG CCTTGACCAGGGAGGAGCCAACTACAGC C c N P L L D T W ? I I T S R R L D G S TG CTG 7AACCCTCTTCTGGACACÀTG 1. U.L3 UÍ..AGÀ.L Vjrow - uL C Q I R D H C P D G Y s c L L T V S G T TGCCAGATCCG TGACCACTGTCCTGATGGCTACTC TTG TCTTCTCACTGTGTCTGG GACT S S O n P F S E G V 5 c D D G Q H C C P TCCAGCTGCTGCCCGTTCTCTGAGGGTGTATCTTGTGATGATGGCCÀGCACTGCTGCCCC R G F K C SADGKSCSQISDSLL CGGGGCTTCCACTGTAGTGCGGATGGGAAATCCTGCTCTCAGATATCAGATAGCCTCPTG GAVQCPGSQFECPDSATCCI GGTGCTGTCCAGTGTCCTGGTAGCCAGTTCGAATGTCCTGACTCCGCCACCTGCTGTATT MIDGSWGCCPMPQASCCEDR ATGATTGATGGTTCCTGGGGGTGCTGCCCCATGCCCCAGGCCTCTTGCTGTGAAGACÀGA VHCCPHGASCDLVHTRCISP GTGCATTGCTGTCCCCACGGGGCCTCCTGTGACCTGGTTCACACGCGATGCATTTCACCC TGTHP LLKXFPAQRTNRAVA ACGGGCACCCACCCCTTACTAAAGAAATTCCCCGCACAAAGGACCAACAGGGCAGTGGCT FPFSVVCPDAKTQCPDDSTC TTCCCTTTTTCCGTGGTGTGCCCTGATGCTAAGACCCAGTGCCCTGATGACTCTACCTGC CELPT GKYGCCPMPNAICCS TGTGAGCTACCCACTGGGAAGTATGGCTGTTGTCCAATGCCCAACGCCATCTGCTGTTCC DHLHC CPQDT VCDLIQSKCI GACCACCTGCACTGCTGCCCCCAGGACACTGTATGTGACCTGATCCAGAGCAAGTGCATA SXDYT TDLMTKLPGYPVNEV TCCAAGGACTACACCACAGATCTCATGACCAAGCTGCCTGGATACCCAGTGAATGAGGTG KCDLEVSCPDGYTCCRLHTG AAGTGCGACTTGGAGGTGAGCTGTCCTGATGGC7ACACCTGCTGCCGCCTCAACACTGGG AVGCC PFTKAVCCEDHIHCC GCCTGGGGCTGCTGTCCATTCACCAAGGCTGTGTGTTGTGAAGACCACATTCACTGCTGC PAGFQ CHTETGTCELGVLQV CCAGCCGGGTTTCAGTGTCACACAGAGACAGGAACCTGTGAACTGGGAGTCCTTCAGGTA 210 270 330 390 450 510 570 630 690 750 810 870 930 990 1050

   *·> ? W Η K X V T A S L s L P D ? Q I L K N * uuA.uí.w-nuu a uAUbcLLl L CCT CAG CCT GCCAGACCCACAGATCTTGAA GAA7 DVPCDDFS S c P S N N T c C R L S GA7GTCCCC7G7GA7GAC77CÀG TAGCTGTCGTTCTAACAA' TACCTG CTGCAGACTCAGT SGDWGCCP I P E A V c C L D H Q H TCTGGGGACTGGGGCTGCTGTCCCATCCCAGAGGCTGTCTGCTGCTTAGACCACCAGCAT 1230 CCPQGFKCMDEGY CQKGDRM TGCTGCCCTCAGGGTTTCAAATGTATGGATGAGGGGTACTGTCAGAAGGGAGACAGAATG .1290 VAGLEKKPVRQTTLLQHGÍ5I GTGGCTGGCCTGGAGAAGATGCCTGTCCGCCAGACAACTCTGCTCCAACATGGAGATATT 1350 GCDQHTSCPVGQTCCPSLKG GGTTGTGACCAGCATACCAGCTGCCCAGTAGGGCAAACATGCTGCCCAAGCCTGAAGGGA 1410 S w A C C Q L ? K A V C C E D R Q K c C AG TTGGGCCTGCTGCCAGTTGCCCCA TGC TGT GTGCTG TGAGGA CCGGCA GCACTG' TTGC 1470 ? A G Y T C N V K A R T C E K D A G S V CCGGCTGGGTA CAC CTGCAACGTGAAGGCGAG AACCTGTGAGAAGGATGCAGGCTCTGTC 1530 Q p S M D L T F G S K V G N V Ξ C G A G CAGCCTTCCATGGACCTGACCTTTGGCTCTAAGGTTGGGAATGTGGAATGTGGTGCCGGA 1590 HFCHDNQSCCKDSQGGWACC CATTTCTGCCATGATAACCAGTCCTGTTGTAAAGACAGCCAAGGAGGCTGGGCCTGCTGT 1650 PYVKGV CCRDGRHCCPIGFH | CCCTATGTAAAGGG7GTCTGCTGTAGAGATGGÂCGTCACTG77GTCCCATTGGCTTCCAC 1710 CSAKG7KCLRKK7PRWDILL TGTTCAGCCAAGGGAACCAAGTGTTTGCGGAAGAAGACCCCTCGCTGGGACATACTTTTG 1770 1797 RDPAPRPLL AGGGATCCAGCCCCAAGACCGCTACTG -80- / mero 280 ao 335; 205 ao 261; 59 ao 114; 123 ao 179; 362 ao 416; 440 ao 495; ou 515 ao 570.
7. 7.- Processo de acordo com a reivindicação 2, carac-terizado pelo facto de o tecido de mamífero ser tecido de murganho e por o polipeptido ser constituído por nma sequência | de resíduos aminoácidos em conformidade com i -81- / .... — — - Λ W * V W Λ.^ι ww w IULa ur. 1 uaLji. .wwuxwwwWx x wwWwwwaw ww v- « ww - auu w ^uaaLALaI; ;ui PDGQFCPVACCLDQGGANYS CCAGATGGGCAG7TC7GCCC7G7TGCCTGC?GCCT7GACCAGGGAGGAGCCAAC7ACAGC 67 127 ccnplldtwpritshhldgs tgctgtaaccctcttctggacacatgscctagaataacgagccatcatctagatggctcc cqthghcpagysclltvsgt tgccagacccatggccactgtcctgctggctattcttgtcttctcactgtgtctgggact 187 247 S SCCFF5KGVSCGDGYHCC? TCCAGCTGCTGCCCGTTCTCTAAGGGTGTGTCTTGTGGTGATGGCTACGACTGCTGCCCC 307 QGFHCSAD GKSCFQHS DNPL CAGGGCTTCCAC7GTAGTGCAGATGGGAAA7CCTGCTTCCAGATG7CAGATAACCCCTTG 367 GAVQCPGSQFECPDSATCCI GG7GC7G7CCAG7G7CCTGGGAGCCAG777GAÀ7G7CCTGAC7C7GCCACC7GC7GCA77 ' 427 HVDGSWGCCPMPQASCCEDR ATGGTTGATGGTTCGTGGGGATGT7G7CCCATGCCCCAGGCC7CTTGCTGTGAAGACAGA 487 VHCCPHGASCDLVKTRCVSP G7GCA77GC7G7CCCCATGGGGCC7CC7G7GACCTGGTTCACACACGA7GCG7TTCACCC 547 TGTHTLLXKFPAQK7NRAVS ACGGGCACCCACACCCTAC7AAAGAAG77CCCTGCACAAAAGACCAACAGGGCAGTG7CT 607 LPFSVVCPDAKTQCPDDSTC TTGCCT77TTCTG7CG7GTGCCCTGATGCTAAGACCCAGTG7CCCGATGATTC7ACCTGC 667 C.-FLP T G K Y G CCP Μ P NA I ’ C C S TGTGAGC7ACCCACTGGGAAG7ATGGCTGCTGTCCAATGCCCAATGCCÀ7CTGCTGTTCC 727 DKLHCCPQDTVCDLIQSKCL GACCACCTGCACTGCTGCCCCCAGGACACTG7A7G7GACCTGATCCAGAGTAAGTGCCTA 787 SK-NYTTDLLTKLPGYPVKEV TCCAAGAACTACACCACGGATCTCCTGACCAAGCTGCCTGGATACCCAGTGAAGGAGGTG 847 K CDMEV S CPEGYT CCRLNTG AAGTGCGACATGGAGGTGAGC7GCCCTGAAGGATATACCTGCTGCCGCC7CAACACTGGG 907 AWGCCPFAKAVCCEDHIHCC GCCTGGGGCTGCTGTCCA777GCCAAGGCCG7G7GTTG7GAGGATCACA77CATTGCTGC 967 PAGFQCHTEKGTCEKGILQV CCGGCAGGG7TTCAG7G7CACACAGAGAAAGGAACCTGCGAAA7GGGTA7CCTCCAAGTA 1027 1087 1087 S G D W G N Q H PWMKKVIAPRRLPDPQILKS L·^· w«L wwn· *jr\Awrw^ww 1 Ur.iAuuLwLwLbwLbt wivwUiwAUwuALAUr.* w* ^ gÂnuAu 1 DTPCDDFTRCPTNNTC CKLN GATACACCTTGTGATGACTTCACTAGGTGTCCTACAAACAÂTACCTGCTGCÀÀACTCAAT IPEAVCCS TCTGGGGACTGGGGCTGCTGTCCCATCCCAGAGGCTGTCTGCTGCTCAGACAACCAGCAT CCPQGFTCLAQGYCQKGDTM TGCTGCCCTCAGGGCTTCACATGTCTGGCTCAGGGGTACTGTCAGAAGGGAGACACAATG VAGLEKIPARQTTPLQIGDI GTGGCTGGCCTGGAGAAGATACCTGCCCGCCAGACAACCCCGCTCCAAATTGGAGATATC GCDQHTSCPVGQTCCPSLKG GGTTGTGACCAGCATACCAGCTGCCCAGTAGGGCAAACCTGCTGCCCAAGCCTCAAGGGA SWACCQLPHAVCCEDRQKCC AGTTGGGCCTGCTGCCAGCTGCCCCATGCTGTGTGCTGTGAGGACCGGCAGCACTGTTGC pagytcnvkartcekdvdfi CCGGCCGGGTACACCTGCAATGTGAAGGCGAGGACCTGTGAGAAGGATGTCGAT7TTATC QPPVLLTLGPKVGNVECGEG CAGCCTCCCGTGCTCCTGACCCTCGGCCCTAAGGTTGGGAATGTGGAGTG7GGAGAAGGG HFCHDKQTCCKDSAGVWACC CATTTCTGCCATGATAACCAGACCTGTTGTAAAGACAGTGCAGGAGTCTGGGCCTGC7GT PYLKGVCCRDGRKCCPGGFH CCCTACCTAAAGGGTGTCTGCTGTAGAGATGGACGTCACTGTTGCCCCGGTGGCTTCCAC CSARGTKCLRKKIPRWDMFL TGTTCAGCCAGGGGÀACCAAGTGTTTGCGAAAGAAGATTCCTCGCTGGGACATGTTTTTG RDPVPRPLL AGGGATCCGGTCCCAAGACCGCTACTG 1147 1207 1267 1327 1387 1447 1507 1567 1627 1687 1747 1774 -83-

   mero 280 ao 335; 205 ao 261; 59 ao 114; 123 ao 179; 362 ao 416; 440 ao 495; ou 515 ao 570.
8. 8. - Processo para produzir uma proteína reguladora do crescimento celular, caracterizado pelo facto de: a) se proceder à montagem por meios químicos de um ) polipeptido que possui uma sequência de resíduos de aminoáci- dos tal como descrita na reivindicação 5 englobando os resíduos aminoácidos desde aproximadamente o número 282 ao 337; 206 ao 262; 59 ao 114; 124 ao 180; 364 ao 418; 442 ao 497; ou 519 ao 574, uma sequência de resíduos de aminoácidos substancialmente como se descreveu na reivindicação 6 possuindo resíduos de aminoácidos desde aproximadamente o número 280 ao 335; 205 ao 261; 59 ao 114; 123 ao 179; 362 ao 416; 440 ao 495; ou 515 ao 570, ou uma sequência substancialmente como des_ crita na reivindicação 7 possuindo resíduos de aminoácidos des_ ^ de o número 280 ao 335: 205 ao 261; 59 ao 114; 123 ao 179; 362 ao 416; 440 ao 495; ou 515 ao 570; e b) se proceder à dobragem do polipeptido montado quimi camente segundo uma conformação biologicamente activa.
9. 9. - Processo para produzir uma proteína reguladora do crescimento celular por meios recombinantes, caracterizado pelo facto de*. -84- ✓ f cia de uma forma madura ou precursora da proteína reguladora do crescimento celular; b) se construir um vector de expressão susceptível de dirigir a síntese da sequência do ADN isolado ou gerado; c) se transfectar ou transformar uma célula hospedeira susceptível de replicar ou expressar o gene regulador do crescimento celular e/ou se processar o produto genético para produzir a proteína reguladora do crescimento celular; e d) se identificar e purificar a proteína reguladora do crescimento celular.
10. 10.- Processo de acordo com a reivindicação 9, cara£ terizado pelo facto de a sequência de ADN codificadora para a proteína reguladora do crescimento celular estar substancial, mente em conformidade com as representações indicadas nas reivindicações 6, 5 e 7 ou indicadas a seguir: P Q Ν τ V C C 'vCCAGAA*mC 1VS I U > U I dltoskclsken umCuiuACCuAGAGiAAGiGCC i C i CCAAGuAGAA A T CGCTACG DLLTKLPAHTVQDVKCDMEV u*»Cu i l- ‘ CmCu^muu i GluluuACACACAG iGuAGGATG i CAAG iGCGACATGGAGu i G 5CPD0YTCCRLQSGAWGCCP AGCTG:c:aGACGAC7ACACCTGCTGCCGCCTACAG7CCG5GGCC7GGGGCTGCTGCCCT FVQAV CCEDHVHCCPSGFRC i i I G7GCAuuC'.u7u iGCTG. uAGGACCA iG7GCACTGC iGCCCGTCCGGG. 17AGG7G7 DTE KGVCEQG7RQVPWMK KA GACACAGAGAAGGGTG7G7G7GAGCAGGGGACCCGCCAGG7GCCG7GGATGAAGAAAGCC PAHLSLLDLGAVEGDVPCDN CCAGCCCACC7CAGCC7GCTGGACCTCGGAGCAGTGGAGGGGGACGTCCCCTG7GA7AAC VTSCPSSTTCCRLKSGEWAC G7CACCAGC7GTCCT7C7TCCACTACC7GCTG7CGACTCAAG7C7GGGGAG7GGGCC7GC CPAPEAVCCSOHQHCCPQD 7G7CC7GC7CCAGAGGCTG7C7GCTGCTCGGACCACCAGCAC7GC7G7CCCCAAGATAC KWGCCPHPXGVCCRDEEHCC AAG7GGGG77G77GCCCCA7GCCGXGAGGCGTG7GCTGCCGGGATGAGGAGCAC7GC7G7 PHS7SCDLERGRCVSPTGDV CCCCAC í v.
11. CACCAGCiGiuA171GGAGCGCGGGCGCTG7G7G7CCCC7ACGGGGGACG t C PHATKFPAWKRPRGAAAQPR CCCA7GGCCACCAAAT7CCCGGCC7GGAAGAGACCGCGCGG7GC7GCGGCACAGCCCCGG C P D TG7CCCGAC LRV PAVVGDVKCDDEHS CTCCuCGitCCAGCAGTGGi TGGiuACGTGAAG7G76ACGATGAGA7GAGC GNTCCRLSSGQWGCCPLEQA GGGAACACGTGC7GCAGGC7GAGC7CCGGGCAGTGGGGG7GCTGCCCGCTGGAGCAGGCC VCCPDHIHCCPQD GTG7GCTGCCCCGACCACATCCAC7GCTGCCCCCAAGATAC

    ϋ.- rrocesso ae acorao com a reivmaicaçmao y, carac-terizado pelo facto de a sequência de ADN codificadora da proteína reguladora do crescimento celular ser produzida por clo-nagem de ADNc a partir de ARN isolado a partir de uma fonte ex traída de seres humanos, murganhos, ratos, vacas ou galinhas.
12. 12. - Processo de acordo com a reivindicação 9, carac-terizado pelo facto de a sequência de ADN codificadora da proteína reguladora do crescimento celular ser produzida por clo-nagem genómica.
13. 13. - Processo de acordo com a reivindicação 9, carac-terizado pelo facto de a sequência de ADN codificadora da proteína reguladora do crescimento celular ser produzida por síntese química.
14. 14. - Processo de acordo com a reivindicação 9, carac-terizado pelo facto de a célula hospedeira ser uma célula de ovário do hamster Chinês.
15. 15. - Processo de acordo com a reivindicação 9, carac-terizado pelo facto de a célula hospedeira ser uma célula COS.
16. 16. - Método para o tratamento de neoplasias num animal, caracterizado por se administrar a esse animal pelo menos -87-

    que iniba a proliferação de células neoplásicas.
17. 17. - Método de acordo com a reivindicação 16, carac-terizado pelo facto de a epitelina ser a epitelina 1.
18. 18. - Método de acordo com a reivindicação 16, carac- ) terizado pelo facto de a epitelina ser a epitelina 2.
19. 19. - Método para promover a cicatrização de ferimentos, caracterizado pelo facto de se administrar ao local do ferimento pelo menos uma epitelina numa quantidade eficaz, compreendida entre 1 ng/ml e 1000 ng/ml, para estimular o desenvolvimento celular.
20. 20. - Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo facto de a epitelina ser a epitelina 1.
21. 21. - Método para promover a cicatrização de ferimentos, caracterizado pelo facto de se administrar ao local do ferimen to um antagonista da epitelina 2 numa dose eficaz, compreendida entre 1 ng/ml e 1000 ng/ml, que iniba a actividade da epitelina 2 antagonizadora da epitelina 1.
22. 22. - Método de acordo com a reivindicação 21, carac- / 88- - r — — nistrado com uma epitelina susceptível de promover o crescimen to celular.
23. 23. - Método de acordo com a reivindicação 21, carac-terizado pelo facto de o antagonista da epitelina 2 ser coadmi nistrado com a epitelina 1.
24. 24. - Método de acordo com a reivindicação 21, carac-terizado pelo facto de o antagonista da epitelina 2 incorporar um anticorpo anti-epitelina 2.
25. 25. - Método de acordo com a reivindicação 24, carac-terizado pelo facto de o anticorpo anti-epitelina 2 ser coadministrado com uma epitelina susceptível de promover o crescimento celular.
26. 26. - Método de acordo com a reivindicação 24, carac-terizado pelo facto de o anticorpo anti-epitelina 2 ser coadministrado com a epitelina 1.
27. 27. - Método para o tratamento de psoríase, caracteri-zado pelo facto de se administrar a um paciente que sofra de psoríase uma composição eficaz para inibir a actividade estimuladora do desenvolvimento da epitelina, numa quantidade apro -89-

    ximadamente compreendida entre 1 ng/ml e 1000 ng/ml.
28. 28. - Método de acordo com a reivindicação 27, carac-terizado pelo facto de a composição incorporar um antagonista da epitelina 1.
29. 29, - Método de acordo com a reivindicação 28, carac-terizado pelo facto de o antagonista da epitelina 1 ser a ep_i telina 2.
30. 30,- Método de acordo com a reivindicação 28, carac-terizado pelo facto de o antagonista da epitelina 1 ser um anticorpo anti-epitelina 1. Lisboa, 25 de Fevereiro de 1992 d Agr»nt? Oficial da Propriedade Industrial »