JP3253966B2 - 幹細胞増殖因子 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 1.導入 本発明は、胚細胞腫瘍株およびヒトCD34＋細胞株から
単離された自己分泌成長因子に指向される。特に、幹細
胞増殖因子（SCPF）の生産、精製、および使用に関す
る。種々の細胞株において、本発明のタンパク質は、２
つの形態、可溶性形態および膜結合形態で存在し、膜結
合形態は、少ないパーセンテージのヒト骨髄細胞の表面
で検出され、これらの細胞の増殖を刺激する。従って、
SCPFは、造血性幹細胞の成長を増加することを含むがこ
れに限定されない広域な適用を有する。さらに、抗体に
よるそのタンパク質の除去は、腫瘍細胞成長の制御に有
用である。

2.発明の背景 自己分泌様式でその成長因子を生産する細胞にその刺
激効果を作用させる成長因子が記載されている。同じ因
子が、他の標的細胞に同様の活性を示し得る。しかし、
神経系から得られる腫瘍細胞が、造血系の細胞の成長を
調節する因子を生産することは、文献に記載されていな
かった。

2.1. 胚細胞腫瘍 中枢神経系の胚細胞腫瘍は希少であり、小児固形腫瘍
の３％未満である。これらの腫瘍は、最も一般的には松
果体および視床下部に生じるが、それらは視床および脳
幹神経節においても記載されている。組織学的には、こ
れらの腫瘍は、最も一般的には胚細胞腫であることが見
い出されている。より少数のサブタイプは、絨毛癌、胚
細胞腫瘍（embryonal germ cell tumor）、および混合
胚細胞腫瘍を含む。一般に、これらのタイプの腫瘍は、
いっそう悪い予後を有する。

これらの腫瘍の治療は多様であり、胚細胞腫の手術お
よび放射線治療、非胚細胞腫性胚細胞腫瘍、転移性疾
病、または再発性疾病の患者にとって重要な役割を果た
す集中的なプラチナベース化学療法プロトコールおよび
自己骨髄移植がある。心室（脳室）シャントを介して広
がった転移が報告されており、そしてシャントの路に沿
って何処でも生じ得る。頚部および肺の転移性沈積物が
報告されているが、最も一般的には、これらの沈積物
は、心室腹膜シャントおよび大きな腹膜移植片と関連す
る。頭蓋内胚細胞株腫瘍から培養された細胞株がまれに
報告されているが、いくつかの細胞株は、神経外起源の
胚細胞腫瘍に由来した。インビトロで継代された細胞株
は、ラット癌に由来した。これらの細胞株は、初期多能
性細胞の分化の研究で非常に価値があることが分かっ
た。

2.2. 造血細胞および成長因子 ヒトの薬において、造血を開始し調節する能力は、非
常に重要である（McCuneら、1988,Science 241:163
2）。悪性疾患を含む種々の疾病および免疫疾患は、リ
ンパ−造血系内の破裂に関するように考えられる。多く
のこれらの疾患は、前駆細胞を造血系に再居住させるこ
とにより緩和されそして／または治療され得、前駆細胞
が分化するように誘起された場合、患者の欠乏症は克服
される。ヒトにおいては、現在の補充療法は骨髄移植で
ある。白血病の治療での骨髄移植の使用は別として、現
在では、それは他の新形成で頻繁に用いられる（Epstei
nおよびSlease,1985,Surg.Ann.17:125）。しかし、この
タイプの治療は、侵入性手順を含んでいるため、（ドナ
ーとレシピエントの）両方にとって痛みが伴われ、そし
てレシピエントに重篤な合併症を与え、特に、移植片は
同種異型である場合、移植片対宿主疾病（Graft Versus
Host Disease）（GVHD）を生じる。従って、GVHDの危
険性は、他の致命的な疾病の患者への骨髄移植の使用を
制限する。造血疾患に対し潜在的にさらに刺激的な他の
治療は、コロニー刺激因子を１つまたは組合せによる患
者の治療である（Dexter,1987,J.Cell Sci.88:1）。

少数の自己修復性幹細胞が系統特異的な前駆細胞を生
じさせることによる血液細胞形成のプロセスは、特異的
ホルモンの制御下にあり、系統特異的な前駆細胞は、続
いて増殖し、分化し、成熟循環血液細胞を生産する。こ
れらのホルモンは、コロニー刺激因子（CSF）として集
合的に知られている（Metcalf,1985,Science 229:16;De
xter,1987,J.Cell Sci.88:1;GoldeおよびGasson,1988,S
cientific American,7月:62;TabbaraおよびRobinson,19
91,Anti−Cacer Res.11:81;Ogawa,1989,Environ.Health
Presp.80:199;Dexter,1989,Br.Med.Bull.45:337）。組
換えDNA技術の出現により、多数のこれらのCSFは、今や
クローン化され、そして発現されている（Souzaら、198
6,Science 232:61;Goughら、1984,Nature 309:763;Yoko
taら、1984,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:1070;Kawasa
kiら、1985,Science 230:291）。これらの組換えCSFは
今では入手可能であり、そしてそれらの治療の潜在能力
への広範囲な研究が始まった。薬におけるそれらの潜在
性使用は広くまで及び、輸血、骨髄移植、免疫抑制疾患
の矯正、癌治療、創傷治癒、および免疫応答の活性化の
ような領域を含む。（GoldeおよびGasson,1988,Scienti
fic American,7月:62）。造血性前駆細胞の増殖および
分化の誘導とは別に、CSFはまた、成熟血液細胞の多数
の機能の活性化を示し（Stanleyら、1976,J.Exp.Med.14
3:631;Schraderら、1981,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.7
8:323;Mooreら、1980,J.Immunol.125:1302;Kurlandら、
1979,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.76:2326;Handmanおよ
びBurgess,1979,J.Immunol.122:1134;Vadasら、1983,Bl
ood 61:1232;Vadasら、1983,J.Immunol.130:795）、成
熟造血細胞の移動に影響することを含む（Weibartら、1
986,J.Immunol.137:3584）。

3.発明の要旨 本発明は、幹細胞増殖因子（SCPF）、造血幹細胞を含
む種々の幹細胞集団の成長を刺激することにおけるその
使用、および胚細胞腫瘍または他の細胞株により生産さ
れる他の成長因子またはサイトカインを同定する方法に
関する。SCPFは、ヒト骨髄幹細胞の増殖を刺激する新規
な自己分泌成長因子のファミリーである。SCPFはまた、
32,000ダルトンの分泌形態および37,000ダルトンの分子
量の膜結合形態として751と称せられるネズミ細胞株に
より発現される。SCPFはまた、分子量23,000ダルトンの
ML−１と称される細胞株により発見される。SCPFは、CD
34⁺ヒト骨髄幹細胞と同様にそれを生産する細胞株の増
殖および成長を刺激する。

本発明は、一部、ネズミ751細胞株が自己分泌成長因
子を培養培地に放出するという本出願者の発見に基づ
く。精製32kDaタンパク質に対して生成するポリクロー
ナルウサギ抗体（SAM.1）は、751細胞により生産された
32kDaの分泌産物および37kDaの細胞結合タンパク質なら
びにML−１細胞により生産された23kDaのタンパク質の
両方を認識する。この抗体はまた、ヒト骨髄における細
胞集団を同定し得、正常（粘着涸渇した）骨髄細胞の2.
6％未満と反応する。このSCPF⁺骨髄細胞集団は、幹細胞
マーカーCD34を同時発現する。本明細書に記載の実施例
に示すように、SCPFの生物学的活性は、任意の公知の骨
髄コロニー刺激因子（CSF）（GM−CSF、Ｇ−CSF、Ｍ−C
SF、およびIL−３を含む）とは区別される。さらに、GM
−CSF、Ｇ−CSF、Ｍ−CSF、およびIL−３に特異的な工
程は、SCPFの生物学的活性を阻害しない。さらに、抗SC
PF抗体はSCF機能を中和しないので、SCPFはまた、ｃ−k
itオンコジーン産物（SCF）に対するリガンドとも区別
される。

本発明は、実施例の様式により記載されており、実施
例では、SCPFは、特定の細胞株、例えば、本明細書中に
記載される細胞株により生産された自己分泌成長因子と
して同定され、この因子の生化学的なおよび生物学的な
特性を特徴づける。これらの新規なタンパク質の広範囲
な種類の使用は、本明細書に記載の発明により包含され
る。

4.図面の簡単な説明 図1. フローサイトメトリー分析による表現型の特徴付
け。751細胞株は、非神経性外胚葉胚細胞（抗PAP、抗HC
G）、および神経起源の胚細胞（抗サイトケラチン、ビ
メンチン、NSE、GFAP、およびNFP）の細胞骨格構造に特
異的な抗原マーカーに対して指向する抗体で染色した。
抗HLAクラスＩをコントロールとして使用した。染色パ
ターンは、枠内に示すが、この細胞株がニューロン系統
またはグリア系統の細胞に分化し得る原子神経外胚葉細
胞であることを示している。

図2. ［³⁵S］−メチオニン代謝標識後の751細胞からの
上清のSDS−PAGEゲルのオートラジオグラフおよびAmbis
スキャン。上清は、インビトロでの成長の際に、751−G
C（＝元の胚細胞後）を³⁵S:−パルスした後、24時間で
回収した。751−T2（＝nu/nuネズミ継代細胞）は、原子
皮下腫瘍から単離した。751−Met nu/nuネズミ継代細胞
は、肝臓転移から単離した。Ambisスキャンは、32kDaタ
ンパク質に対して指向し、ネズミ腫瘍、転移腫瘍、およ
び組織培養でのみ継代した元の胚細胞株からの32kDaタ
ンパク質の分泌において量的な違いを示す。

図3. SAM.1抗体を用いて751細胞から精製した37kDAの
ゲル精製タンパク質（SCPF）のウエスタンブロット分
析。（Ａ）SDS−PAGEゲルのクマシーブルー染色は37kDa
タンパク質を示している。（Ｂ）パネル3Aにおけるゲル
のウエスタンブロット。

図4. 腫瘍成長の抗体阻害。SAM.1抗体（抗SCPF）を用
いて、軟寒天（メチルセルロース）での腫瘍細胞コロニ
ー形成を阻害した。棒グラフは、抗体濃度を関数として
コロニーの阻害（絶対数）を示す。NRSは、1:20希釈の
正常ウサギ血清である。下部のパネルは、メチレンブル
ーで染色した実際のコロニーを示す。

図5. 腫瘍成長の抗体阻害。この図は、DNA複製を測定
するトリチウム化チミジンの取り込みを関数としてSAM.
1抗体による腫瘍成長の阻害を示す。細胞を10,000細胞
／ウエルで96ウエルマイクロプレートに播き、そして希
釈を変えた抗血清を核ウエルに添加した。各希釈は、３
組で反復させた。培養48時間後、細胞を³H−チミジン
（1U/ウエル）で標識し、12時間再度培養し、その後細
胞を回収し、ラジオアイソトープの取り込みをシンチレ
ーションカウンターを用いて測定した。データは、751
細胞の増殖、そして非常に原始的な骨髄細胞株（BO−B
M.1）がこの抗体により阻害されるが、A251神経芽腫細
胞株は阻害されないことを示す。

図6. クロノジェニック活性から単離されたヒト骨髄芽
細胞のフローサイトメトリー分析:CD34発現。

図7. 長期インビトロ培養におけるCD34⁺細胞の複製:CD
34⁺細胞は、751細胞から精製したSCPFを用いて誘導し、
その後、インビトロ培養した。

図8. 751細胞由来SCPFに応答して生じる正常ヒト骨髄
の増殖：トリチウム化チミジン取り込みアッセイ。

図9. SAM.1（抗体SCPF）抗体で染色した粘着涸渇ヒト
骨髄（9A）および臍帯血（9B）のフローサイトメトリー
分析。黒線は、FITCヤギ抗ウサギコントロールを表し、
青線は、ヤギ抗マウスFITCコントロールを表す。HLAク
ラスＩ（緑線）をポジティブコントロールとして用い
た。

図10. 二重染色（SAM.1およびCD34）するヒト臍帯血の
集団の分析。

図11. 免疫磁気ビーズにより単離されたCD34⁺細胞に結
合するSAM.1の１色および２色のフローサイトメトリー
分析。（1a）ヤギ抗ウサギFITCコントロール、（1b）SA
M.1抗体で染色したCD34⁺細胞、（1c）HLAクラスＩマウ
スモノクローナル抗体で染色されたCD34⁺細胞、（2a）
ヤギ抗マウスPEコントロール、（2b）抗CD34抗体で染色
したCD34⁺細胞、（2c）ヤギ抗マウスFITCコントロー
ル、（3b）SAM.1（FITC）および抗CD34モノクローナル
抗体（PE）で二重染色したCD34⁺細胞。

図12. フローサイトメトリー分析による、SAM.1および
抗CD34の単独および組合せでの結合効率の比較。

図13. 751細胞由来のSCPFを用いるCD34⁺細胞の長期イ
ンビトロ培養。

図14. 751細胞由来のSCPFを用いる長期培養で増大した
CD34⁺細胞のフローサイトメトリー分析（３色）：ゲー
トＣ。

図15. 751細胞由来のSCPFを用いる長期培養で増大した
CD34⁺細胞のフローサイトメトリー分析（３色）：ゲー
トＢ。

図16. 751細胞由来のSCPFの骨髄クロノジェニック活
性。（Ａ）CSF（100u/ml GM−CSF、100u/ml IL−３、1u
/ml EPO）のみの混合物のBFU活性（Ｂ）種々の濃度での
SCPFのBFU活性。（Ｃ）100ng/mlのSCPFと混同したCSFの
BFU活性。データは、SCPFが単独でBFU活性を誘導し得る
こと（Ｂ）およびまたCSF混合物と相乗作用（synergise
s）すること（Ｃ）を示す。

図17. 751細胞由来のSCPFの骨髄クロノジェニック活
性。（Ａ）（100u/ml GM−CSF、100u/ml IL−３、1u/ml
EPO）のみの混合物のCFU−GM活性、（Ｂ）種々の濃度
でのSCPFのCFU−GM活性、（Ｃ）100ng/mlのSCPFと混同
したCSFのCFU−GM活性。データは、SCPFが単独でCFU−G
M活性を誘導し得ること（Ｂ）およびまたCSF混合物と相
乗作用すること（Ｃ）を示す。

図18. 751細胞由来のSCPFの骨髄クロノジェニック活
性。（Ａ）（100u/ml GM−CSF、100u/ml IL−３、1u/ml
EPO）のみの混合物のCFU−GEMM活性、（Ｂ）種々の濃
度でのSCPFのCFU−GEMM活性、（Ｃ）100ng/mlのSCPFと
混同したCSFのCFU−GEMM活性。データは、SCPFが単独で
CFU−GEMM活性を誘導し得ないこと（Ｂ）およびまたCSF
混合物と相乗作用すること（Ｃ）を示す。

図19. 抗ペプチド抗血清を用いるウエスタンブロット
分析。レーン１、２、および3:751細胞ライゼート（RPM
I＋10％FBS）をそれぞれ15μｌ、30μｌ、および40μl;
レーン４、５、および6:751細胞ライゼート（RPMI＋10
％FBS）＋ML−１細胞由来の50％無血清上清；それぞれ1
5μｌ、30μｌ、および40μl;レーン７、８、および９
は、ネガティブコントロールとして免疫前血清とブロッ
トした30μｌの751NA細胞ライゼートを示す。

図20. ML−１細胞由来のSCPFの生物活性。（Ａ）pH9.0
領域のIEFゲルによる細胞増殖、（Ｂ）pH5.0領域のIEF
ゲルによる細胞増殖。データは、生物活性がpI9.3を有
する物質（27kDa）に主に存在したことを示す。pH5.0領
域の物質に生物活性は観察されなかった。

図21. ML−１細胞由来のSCPFの２−Ｄゲル電気泳動。
ゲルは、Mono Sカラムからの50mM NaCl画分由来のSCPF
について予測される分子量範囲に分離した13のスポット
を示す。

5.発明の詳細な説明 本発明は、幹細胞増殖因子（SCPF）、従来技術または
組換えDNA技術によるSCPFの生産方法、SCPFの使用方
法、および細胞株に同様に由来するSCPFファミリーの他
のメンバーを同定および単離する方法に関する。

SCPFは新規な自己分泌成長因子であり、膜結合形態お
よび分泌形態の両方でネズミ751細胞株により発現され
る。SCPFの膜形態はまた、CD34⁺ヒト骨髄細胞の小画分
の細胞表面上で発現される。SCPFは、CD34⁺ヒトML−１
細胞株により発現され、そして細胞ライゼートから単離
されると23kDaの分子量および約7.7のpIを有する。さら
に、SCPFはCD34⁺骨髄幹細胞の増殖を刺激し、それは造
血細胞成長の促進を必要とする条件下、すなわち、骨髄
移植における使用のための幹細胞の培養、または造血を
調節するためのインビボにおける処置において有用であ
り得ることを示している。751細胞培養物中の抗体によ
るSCPFの除去は、腫瘍細胞コロニー形成の減少をもたら
し、SCPFが腫瘍細胞増殖の支持に関与しており、従って
SCPF活性の阻害が、特定の腫瘍の治療に有用であり得る
ことを示唆する。これは、抗SCPF抗体および751細胞の
同時注入により細胞株の腫瘍形成の減少が生じるインビ
ボ実験によりさらに支持される。さらに、膜形態のSCPF
はまた、抗SCPF抗体の使用による多能性骨髄幹細胞の小
集団の同定および単離のための細胞表面マーカーとして
有用であり得る。

SCPF、またはそのフラグメントおよび誘導体は、造血
の調節および特定の胚細胞の処置において広域な潜在的
適用を有し得る。

本発明のもう一つの実施態様では、胚細胞腫瘍株は培
養で生じ得る。このような腫瘍細胞は、特に造血系の細
胞、一般に種々の組織型の胚／幹細胞の成長増大活性を
有するサイトカインの供給源であり得る。

本発明は、以下のサブセクションでさらに詳細に説明
されるが、単に記載を目的とするだけであり、限定され
ない。議論を明解にするために、本発明は、特定のSCPF
および細胞株によって記載される。しかし、この原理
は、他の細胞株由来の他の自己分泌因子に同様に適用さ
れ得る。

5.1. SCPFを生産する細胞株 中枢神経系の胚細胞腫瘍は、胚発生で他の組織部位に
それらが移動する間、神経クレストに留まった原始細胞
の産物であると考えられている。このような腫瘍細胞
が、神経系外の組織に作用する種々のサイトカインを生
産し得る（Bhandar,1988,Med.Hypoth,27:291）。従っ
て、胚細胞腫瘍から生じる細胞株は、造血系の細胞を含
む種々の細胞タイプの増殖に影響する初期作用性成長因
子の供給源であり得る。

ネズミ751細胞株は、手術により除去した胚細胞腫瘍
から細胞株を樹立する過程で発見された。胚細胞腫瘍
は、腹膜腔（ventriculoperitoneal）シャントに沿って
複数の皮下塊を有すると診断された患者から得られた。
培養751細胞は、非粘着性であり、そしてインビトロで
７〜８時間の極度に短い倍加時間を示す。この迅速な成
長速度（kinetic）はまた、BNXマウスへの培養細胞の移
入の際、インビボにおいても確認された。培養細胞の移
入は、ネズミモデルでの外因性腫瘍の大部分に関する２
〜３カ月とは対照的に、７日で10³細胞の接種物から目
視可能な皮下腫瘍を発達させた。

特異的細胞決定因子を指向する抗体を用いるフローサ
イトメトリー分析は、751細胞が、適切な刺激の際に、
ニューロン細胞系統またはグリア細胞系統へとさらに分
化し得る原始脳神経外胚葉細胞株を表すことを示した。
従って、これは、成長および分化能力の両方を有する原
始多能性細胞株である。さらに、オンコジーンｃ−myc
およびｃ−fmsのmRNAは、オンコジーン配列のパネルに
特異的な分子プローブを用いて検出された。ｃ−fms
は、マクロファージコロニー刺激因子に対するレセプタ
ーであることが示されたので、751細胞は同じ様式で骨
髄の前駆細胞と関係があり得る。

ML−１細胞株は、以下に記載するように、CD34⁺ヒト
骨髄細胞の異種集団を751細胞から得た部分的に精製し
たSCPF画分で処理することにより樹立させた。細胞を、
以下に記載するように、751SCPF調製物の存在下で継代
培養し、そして外因性SCPFの非存在下で継続成長し得る
ML−１細胞株を単離した。この細胞株は、CD34⁺、CD3
8^-、HLADR⁺であるが、CD3^-、CDR^-、およびCD8^-でないこ
とが示される。

5.2. 幹細胞増殖因子 本明細書の実施例に記載されるとおり751細胞株によ
り生産される幹細胞増殖因子は、２つの形態、約32kDa
の分子量を有する分泌形態および37kDaの分子量の膜結
合形態で存在する。約7.0〜8.0範囲のP.Iを有する複数
のSCPFイソ型が同定される。

32kDa SCPFを用いて、ウサギにおいてポリクローナル
抗血清を生成させた。SAM.1と名付けられた特異的ポリ
クローナル抗体を用いて、751細胞による主要分泌タン
パク質のさらなる生化学的特徴付けを容易にした。抗体
は、ウエスタン免疫ブロッティング実験において751全
細胞ライゼートで37kDaのタンパク質種と反応したの
で、この抗体がSCPFタンパク質に特異的であることが最
初に示された。この所見は、目的のタンパク質が32kDa
の分泌形態および固定（anchoring）のためのトランス
メンブラン成分を含み得る37kDa分子量の膜形態で存在
し得ることを示す。従って、同じタンパク質が、可溶性
分子および相互作用する細胞間の細胞表面タンパク質の
両方として機能し得る。

このタンパク質（以降、幹細胞増殖因子、SCPFと称す
る）の生物学的活性を示すために、コロニー阻害アッセ
イを行い、このアッセイでは751細胞コロニー形成が種
々の濃度のウサギ抗血清の存在下で評価された。この結
果は、この抗体が腫瘍細胞コロニー形成を阻害すること
を明確に示し、分泌されたタンパク質が751細胞の成長
を促進する自己分泌成長因子であることを示した。さら
に、抗体の増殖阻害効果は、神経芽腫細胞株の成長が阻
害されない胚または幹細胞株に特異的である。

SCPFは、ネズミ751細胞株から精製され、そしてヒト
骨髄細胞の増殖を刺激するその能力についてテストし
た。SCPFはクロノジェニックアッセイで芽細胞の成長を
誘導した。これは、続いてフローサイトメトリー分析に
よりCD34マーカーおよびHLAクラスＩ抗原を発現するこ
とが示された。同じ細胞が長期Gordon培養においてSCPF
の非存在下で成長し、そして組換えGM−CSFの存在下で
再プレーティング（replating）効率について試験する
場合、細胞は応答して、顆粒球、単球、および混合表現
型のコロニーを生じさせた。従って、SCPFは、続くコロ
ニー刺激因子での刺激に応答して、分化能力を保持する
CD34⁺骨髄細胞集団の複製を誘導し得る。

抗SCPF抗体がヒト骨髄細胞と反応した場合、小さいが
検出可能な細胞画分がポジティブに染色されることが示
された。同じ細胞はまた、造血幹細胞により発現された
マーカーであると報告されたCD34タンパク質を発現す
る。しかし、SCPF産生751胚細胞腫瘍がCD34発現につい
てネガティブであること、および抗SCPFおよび抗CD34抗
体が精製CD34⁺細胞への結合において互いに拮抗的に阻
害しないという所見は、SAM.1抗体はCD34マーカーを指
向しないが、SCPFの膜形態を指向することを示す。SAM.
1抗体はネズミ、ウシ、およびヒツジ骨髄から得られる
細胞と反応しなかったので、SAM.1抗体は、異なる非ヒ
ト動物種の任意のタンパク質と交差反応しない。

SCPFの生物学的特性をさらに特徴づけるために、CD34
⁺細胞の長期培養を、751細胞株から精製された外因性SC
PFの存在下で開始した。組換えIL−３またはIL−６に応
答して迅速に増大した培養物とは異なって、SCPFを与え
た培養物は、次いでSCPFに応答して増殖し得るCD34⁺細
胞の残余集団を初期のうちに細胞死に至らせた。SCPF処
理細胞は、IL−３またはIL−６で成長した培養物と対比
して、形態学においてより均質である。しかし、SCPF処
理した培養物は、細胞表面マーカー発現に基づいて２つ
の細胞集団を生じた。両方の集団がCD34を発現するが、
１つの集団はCD38およびHLA−DR発現についてネガティ
ブであり、そしてもう一方は低レベルで両方のマーカー
を発現した。従って、まとめると、細胞は、他の分化シ
グナルに応答するそれらの能力を保持するが、SCPFは分
化を起こさずにCD34⁺骨髄細胞の増殖を誘導する自己分
泌成長因子である。この因子は培養細胞の悪性トランス
フォーメーションを誘導しない。なぜならば、SCPFを除
去すると、CD34⁺細胞の生存力が急速に低下したからで
ある。

さらに、SCPFは、他のコロニー刺激因子と組合せて使
用する場合、骨髄細胞における刺激効果を増加し得る。
しかし、SCPF生物学的活性は、GM−CSF、Ｇ−CSF、Ｍ−
CSF、およびIL−３を含む公知の造血成長因子と同様で
はない。さらに、ヒトGM−CSF、Ｇ−CSF、Ｍ−CSF、お
よびIL−３に特異的な抗体は、SCPFの生物学的活性を中
和しない。さらに、抗SCPF抗体は、最近同定された幹細
胞因子（SCF）の機能を阻害しない。このSCFは、ｃ−ki
tオンコジーンによりコードされたレセプターに対する
リガンドであることが示されている（Yokotaら、1984,P
roc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:1070;Williamsら、1990,C
ell 63:167;Zseboら、1990,Cell 63:195）。

ネズミ751細胞により生成したSCPFを、以下の実施例
に記載のとおり、ML−１細胞株の単離を促進するために
用いた。ML−１細胞株は、SCPF活性に対する標的細胞お
よびヒトSCPFの供給源の両方である。ML−１細胞ライゼ
ートから得られるSCPFは、以下に記載した尿素の存在下
での２次元ゲル電気泳動により決定されるように23kDa
の分子量および約7.7のpIを示す。ML−１により生成さ
れたSCPFは、SAM.1抗体（751細胞由来のSCPFに対して生
じた）と反応し、以下に記載のとおりヒト標的細胞でア
ッセイした場合の生物学的活性を示す。

5.3. SCPFコード化配列の単離 cDNAの調製のためのメッセンジャーRNA（mRNA）は、S
CPFを生成する細胞供給源から得られ得るが、SCPFにつ
いてのゲノム配列は任意の細胞供給源から得られ得る。
例えば、ML−１、751−NA、751−LIV、または751−LN細
胞は、SCPFについてのコード化配列の供給源としておよ
び／もしくはcDNAまたはゲノムライブラリーの調製のた
めに用いられ得る。SCPFコード化配列を含む遺伝学的に
設計された微生物または細胞株は、この目的のためにDN
Aの便利な供給源として使用され得る。

cDNAまたはゲノムライブラリーのいずれかが、当該分
野で周知の技術を用いて生成されるDNAフラグメントか
ら調製され得る。SCPFをコードするフラグメントは、精
製タンパク質から得られるアミノ酸配列情報に基づくSC
PF配列の一部分と相同なヌクレオチドプローブを用いて
このようなライブラリーをスクリーニングすることによ
り同定され得る。あるいは、抗体プローブは、λgt11の
ような発現クローニング方法により生成されるライブラ
リーをスクリーニングするために使用され得る（Young
およびDavis,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:1194−119
8）。コード化配列の部分は、クローニングおよび発現
に用いられ得るが、完全長のクローン、すなわち、SCPF
の全コード化領域を含むクローンが発現のために好まし
いとされ得る。これらの目的に対し、DNAの単離、適切
な制限フラグメントの生成、クローンおよびライブラリ
ーの構築、および組換え対のスクリーニングのための当
業者に周知の技術が用いられ得る。オリゴヌクレオチド
配列を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応により、独特な遺
伝子配列のコピー数を増加させ得る。このアプローチ
は、縮重オリゴヌクレオチドを用いて得られるより特異
的なプローブを提供し得る。例えば、Maniatisら、198
9,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Sprin
g Harbor Laboratory,N.Y.に記載の技術を参照。

SCPFコード化配列を同定およびクローン化するために
選択される方法にかかわらず、発現クローニング方法
は、スクリーニングする労力を十分に減少させるために
用いられ得る。最近、抗体遺伝子をクローニングおよび
発現するための１工程手順が報告された（McCafferty
ら、1990,Nature 347:552−554;WinterおよびMilstein,
1991,Nature 349:293−299）。この技術に基づき、SCPF
遺伝子は、同様に、λまたはfdのようなバクテリオファ
ージのコートタンパク質遺伝子に近接する部位でベクタ
ーに直接クローン化され得る。SCPF遺伝子を有するファ
ージは、その表面で融合タンパク質を発現するので、SC
PF特異的抗体を含むカラムが、結合活性でファージ粒子
を選択および単離するために使用され得る。Lambda−Za
p−bluescript（Stratagene,La Jolla,CA）を用いる市
販の発現クローニング系はまた、SCPF cDNAライブラリ
ーのクローニングおよび抗体スクリーニングのために使
用され得る。過渡的な遺伝子発現系は、正確なSCPF遺伝
子を同定するために用いられ得る。例えば、COS細胞系
（例えば、GerardおよびGluzman,1986,Mol.Cell.Biol.6
（12）4570−4577）が使用され得る。

ヌクレオチドコード化配列の縮重のために、任意のSC
PF遺伝子産物のアミノ酸配列をコードする他のDNA配列
は、SCPFのクローニングおよび発現のために本発明の実
施において用いられ得る。例えば、SCPEアミノ酸配列を
コードするヌクレオチド配列、もしくはSCPF遺伝子また
はそのcDNAに選択的にハイブリダイズするヌクレオチド
配列が、SCPFのクローニングおよび発現のために用いら
れ得る。このような配列の改変は、同じまたは機能的に
等価な遺伝子産物をコードする配列を生じる異なるヌク
レオチド残基の欠失、付加、または置換を含む。遺伝子
産物は、配列内にアミノ酸残基の欠失、付加、または置
換を含み得、サイレント変化を生じ、生物活性産物を生
産する。このようなアミノ酸置換は、関連する残基の極
性、電荷、可溶性、疎水性、親水性、および／または両
親媒性の性質の類似性に基づき行われ得る。例えば、負
に荷電したアミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミ
ン酸を含む；正に荷電したアミノ酸はリジンおよびアル
ギニンを含む；類似の親水性値を有する荷電していない
極性頭基を有するアミノ酸は以下を含む：ロイシン、イ
ソロイシン。バリン；グリシン、アラニン；アスパラギ
ン、グルタミン；セリン、トレオニン；フェニルアラニ
ン、チロシン。

さらに、コード化SCPFタンパク質の生物学的活性を実
質的に変化しない構造的な改変を含む他のDNA配列もま
た、本発明の実施において用いられ得る。このような改
変は、プロセッシング部位の付加および／またはグリコ
シル化部位の除去を作製するような、SCPFにおけるアミ
ノ酸残基の付加、欠失、または置換を含むが、これらに
限定されない。例えば、特定のタンパク質のＮ結合グリ
コシル化部位の除去により、酵母発現系で特に有用であ
る発現産物のグリコシル化が減少する。

5.4. 組換えDNA技術によるSCPFの発現 生物学的に活性なSCPFを発現させるために、SCPFをコ
ードしているヌクレオチド配列、または機能的に等価の
ヌクレオチド配列が、適切な発現ベクター、すなわち、
挿入コード化配列の転写および翻訳の必須要素を含むベ
クターに挿入される。SCPFコード化配列の改変型が、発
現産物の安定性、生産、精製、または収量を増大させる
ように設計され得た。例えば、SCPFおよび異種タンパク
質を含む融合タンパク質または開裂可能な融合タンパク
質の発現が設計され得る。このような融合タンパク質
は、アフィニティークロマトグラフィーにより容易に単
離され得る；例えば、異種タンパク質に特異的なカラム
上での固定による。開裂部位が、SCPF部分と異種タンパ
ク質との間に作られる場合、SCPFタンパク質は、開裂部
位を分断する適切な酵素または薬剤での処理によりクロ
マトグラフィーカラムから放出され得る（例えば、Boot
hら、1988,Immunol.Lett.19:65−70;およびGardella
ら、1990,J.Biol.Chem.265:15854−15859を参照）。

当業者に周知である方法が、SCPFコード化配列および
適切な転写／翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構
築するために使用され得る。これらの方法は、インビト
ロでの組換えDNA技術、合成技術、およびインビボでの
組換え／遺伝子技術を含む。例えば、Maniatisら、1989
Molecular Cloning A Laboratory Manual,Cold Spring
Harbor Laboratory,N.Y.に記載の技術を参照。

種々の宿主発現ベクター系が、SCPFコード化配列を発
現するために用いられ得る。これらは、以下のような微
生物を含むがこれらに限定されない;SCPFコード化配列
を含む組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNA、
またはコスミドDNA発現ベクターを用いて形質転換した
細菌;SCPFコード化配列を含む組換え酵母発現ベクター
を用いて形質転換した酵母；組換えウイルス発現ベクタ
ー（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV;タ
バコモザイクウイルス、TMV）を感染させたまたはSCPF
コード化配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例
えば、Tiプラスミド）を用いて形質転換した植物細胞
系;SCPFコード化配列を含む組換えウイルス発現ベクタ
ー（例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞
系；もしくはSCPFコード化配列を含む組換えウイルス発
現ベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイル
ス、ワクシニアウイルス）を感染させた動物細胞系、ま
たは安定な発現のために設計された形質転換動物細胞
系。SCPFは、炭水化物を含むことが確認されないので、
細菌発現系ならびに翻訳時および翻訳後の改変を提供す
る細菌発現系の両方が用いられ得る；例えば、哺乳動
物、昆虫、酵母、または植物の発現系。

用いる宿主／ベクター系に依存して、多数の適切な転
写および翻訳要素は、構成性プロモーターおよび誘導性
プロモーター、転写エンハンサー要素、転写ターミネー
ターなどを含み、発現ベクターで用いられ得る（例え
ば、Bitterら、1987,Methods in Enzymology 153:516−
544参照）。例えば、細菌系でクローニングする場合、
誘導性プロモーター、例えば、バクテリオファージγの
pl、plac、ptrp、ptac（ptrp−lacハイブリッドプロモ
ーター）などが用いられ得る。哺乳動物細胞系にクロー
ニングする場合、哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモー
ター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または
哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例えば、レトロ
ウイルス長末端反復；アデノウイルス後期プロモータ
ー；ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター）が用いられ
得る。組換えDNAまたは合成技術により生成されるプロ
モーターもまた、挿入SCPFコード化配列の転写を提供す
るために用いられ得る。

細菌系において、多数の発現ベクターが、発現される
SCPFの意図される使用に依存して有利に選択され得る。
例えば、大量のSCPFを生成する場合、容易に精製される
高レベルの融合タンパク質産物の発現を指向するベクタ
ーが所望され得る。SCPFの回収を助ける開裂部位を含む
ように設計されるベクターが好ましい。このようなベク
ターは、E.coli発現ベクターpUR278（Rutherら、1983,E
MBO J.2:1791）、E.coli発現ベクターpUR278では、SCPF
コード化配列がlac Zコード化領域とインフレームでベ
クターに連結され得、そのため、ハイブリッドSCPF−la
c Zタンパク質が生成される;pINベクター（Inouyeおよ
びInouye,1985,Nucleic acids Res 13:3101−3109;Van
HeekeおよびSchuster,1989,J.Biol.Chem.264:5503−550
9）；などを含むがこれに限定されない。。

酵母では、構成性または誘導性プロモーターを含む多
数のベクターが用いられ得る。概説については以下を参
照のこと、Current Protocols in Molecular Biology,V
ol.2,1988,Ausubelら編、Greene Publish.Assoc.＆ Wil
ey Interscience,Ch.13;Grantら、1987,Expression and
Secretion Vectors for Yeast,Methods in Enzymolog
y,WuおよびGrossman編、31987,Acad.Press,N.Y.,Vol.15
3,pp.516−544;Glover,1986,DNA Cloning,Vol.II.IRL P
ress,Wash.,D.C.,Ch.3;およびBitter,1987,Heterologou
s Gene Expression in Yeast,Methods in Enzymology,B
ergerおよびKimmel編、Acad.Press,N.Y.,Vol.152,pp.67
3−684;およびThe Molecular Biology of the Yeast Sa
ccharomyces,1982,Strathernら編、Cold Spring Harbor
Press,Vol.IおよびII。構成性酵母プロモーター（例え
ばADHまたはLEU2）、もしくは誘導性プロモーター（例
えばGAL）が、用いられ得る（Cloning in Yeast,Ch.3,
R.Rothstein,DNA Cloning Vol.11,A Practical Approac
h,DM Glover編、1986,IRL Press,Wash.,D.C.）。あるい
は、ベクターは酵母染色体に外来性DNA配列の組み込み
を促進するために用いられ得る。

植物発現ベクターを用いる場合、SCPFコード化配列の
発現は、任意の多数のプロモーターにより操作され得
る。例えば、ウイルスプロモーター、例えば、CaMVの35
S RNAおよび19S RNSプロモーター（Brissonら、1984、N
ature 310:511−514）、またはTMVのコートタンパク質
プロモーター（Takamatsuら、1987,EMBO J.6:307−31
1）が用いられ得る；あるいは、植物プロモーター、例
えば、RUBISCOの小サブユニット（Coruzziら、1984,EMB
O J.3:1671−1680;Broglieら、1984,Science 224:838−
843）；または熱ショックプロモーター、例えば、ダイ
ズhsp17.5−Ｅまたはhsp17.3−Ｂ（Gurleyら、1986,Mo
l.Cell.Biol.6:559−565）が用いられ得る。これらの構
築物は、Tiプラスミド、Riプラスミド、植物ウイルスベ
クター、直接DNA形質転換、マイクロインジェクショ
ン、エレクトロポレーションなどを用いて、植物細胞に
導入され得る。このような技術の概説については以下を
参照のこと、例えば、WeissbachおよびWeissbach,1988,
Methods for Plant Molecular Biology,Academic Pres
s,NY,Section VIII,pp.421−463;およびGriersonおよび
Corey,1988,Plant Molecular Biology,第２版,Blackie,
London,Ch.7−９。

SCPFを発現するために用いられ得る別の発現系は昆虫
系である。１つのこのような系では、Autographa calif
ornica核多角体病ウイルス（AcNPV）が、外来遺伝子を
発現するベクターとして用いられる。このウイルスは、
Spodoptera frugiperda細胞で成長する。SCPFコード化
配列は、ウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン
遺伝子）にクローン化され得、そしてAcNPVプロモータ
ー（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に置
かれ得る。SCPFコード化配列の挿入の成功により、ポリ
ヘドリン遺伝子の不活化および非閉塞性組換えウイルス
（すなわち、ポリヘドリン遺伝子によりコードされたタ
ンパク質性コートを欠くウイルス）の生産を生じ得る。
次いで、これらの組換えウイルスを用いて、挿入遺伝子
が発現されるSpodoptera frugiperda細胞に感染させ
る。（例えば、Smithら、1983,J.Viol.46:584;Smith,米
国特許第4,215,051号参照）。

真核生物系、および好ましくは哺乳動物発現系は、発
現した哺乳動物タンパク質の適切な翻訳後改変を生じさ
せ得る。一次転写物の適切なプロセッシング、グリコシ
ル化、リン酸化、および有利には遺伝子産物の分泌の細
胞機構を有する真核生物細胞は、SCPFの発現のための宿
主細胞として用いられ得る。宿主細胞株は好ましいとさ
れ得る。このような宿主細胞株は、CHO、VERO、BHK、He
La、COS、MDCK、−293、およびWI38を含むがこれらに限
定されない。

発現を指向するために組換えウイルスまたはウイルス
要素を用いる哺乳動物細胞系が設計され得る。例えば、
アデノウイルス発現ベクターを用いる場合、SCPFコード
化配列はアデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例え
ば、後期プロモーターおよび三部分リーダー配列に連結
され得る。次いで、このキメラ遺伝子は、アデノウイル
スゲノムにインビトロまたはインビボでの組換えにより
挿入され得る。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、
領域E1またはE3）における挿入により、生存し得そして
感染宿主でSCPFタンパク質を発現し得る組換えウイルス
を生じる（例えば、LoganおよびShenk,1984,Proc.Natl.
Acad.Sci.USA 81:3655−3659参照）。あるいは、ワクシ
ニアウイルス7.5Kプロモーターが用いられ得る。（例え
ば、Mackettら、1982,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:7415
−7419;Mackettら、1984,J.Virol.49:857−864;Panical
iら、1982,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:4927−4931参
照）。染色体外要素として複製する能力を有するウシパ
ピローマウイルスに基づくベクターが特に興味深い（Sa
rverら、1981,Mol.Cell.Biol.1:486）。このDNAがマウ
ス細胞に侵入した後しばらくして、プラスミドは約100
〜200コピー／細胞まで複製する。挿入cDNAの転写は、
宿主染色体へのプラスミドの組み込みを必要としない。
従って、高レベルの発現を生じる。これらのベクター
は、選択マーカー、例えば、neo遺伝子をプラスミドに
含むことにより、安定な発現のために用いられ得る。あ
るいは、レトロウイルスゲノムは、宿主細胞にSCPF遺伝
子の発現を導入および指向し得るベクターとして用いる
ために改変され得る（ConeおよびMulligan,1984,Proc.N
atl.Acad.Sci.USA 81:6349−6353）。高レベルの発現は
また、メタロチオニンII Aプロモーターおよび熱ショッ
クプロモーターを含むがこれらに限定されない誘導性プ
ロモーターを用いて達成され得る。

組換えタンパク質の長期の高収量生産のために、安定
な発現が好ましい。ウイルス複製起点を含む発現ベクタ
ーを用いるよりむしろ、宿主細胞は適切な発現制御要素
（例えば、プロモーター、エンハンサー配列、転写ター
ミネーター、ポリアデニル化部位など）および選択マー
カーにより制御されるSCPF cDNAを用いて形質転換され
得る。組換えプラスミドの選択マーカーは、選択に対す
る耐性を与え、そして細胞に対し、細胞の染色体にプラ
スミドを安定に組み込ませ成長させて、順番にクローン
化され得そして細胞株に広がり得る病巣を形成させる。
例えば、外来DNA導入後、作製された細胞は、栄養豊富
な培地で１〜２日間培養され得、次いで選択培地に切り
換えられる。以下を含むがこれらに限定されない多数の
選択系が用いられ得る：単純ヘルペスウイルスチミジン
キナーゼ（Wiglerら、1977,Cell 11:223）、ヒポキサン
チン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Sz
ybalskaおよびSzybalski,1962,Proc.Natl.Acad.Sci.USA
48:2026）、およびアデニンホスホリボシルトランスフ
ェラーゼ（Lowyら、1980,Cell 22:817）遺伝子は、それ
ぞれtk^-、hgprt^-、またはaprt^-細胞で使用され得る。ま
た、代謝拮抗物質耐性は、以下の遺伝子に関する選択性
の基準として用いられ得る:dhfr遺伝子はメトトレキセ
ートに対する耐性を与える（Wiglerら、1980,Natl.Aca
d.Sci.USA 77:3567;O'Hareら、1981,Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 78:1527）;gpt遺伝子はマイコフェノール酸に対
する耐性を与える（MulliganおよびBerg,1981,Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA 78:2072;neo遺伝子はアミノグリコシド
Ｇ−418に対する耐性を与える（Colberre−Garapinら、
1981,J.Mol.Biol.150:1）；およびhygro遺伝子はヒグロ
マイシンに対する耐性を与える（Santerreら、1984,Gen
e 30:147）。最近さらに別の選択遺伝子が記載された：
すなわちtrpBは、細胞にトリプトファンの代わりにイン
ドールを利用させる;hisDは、細胞にヒスチジンの代わ
りにヒスチノールを利用させる（HartmanおよびMulliga
n,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:8047）；およびODC
（オルニチンデカルボキシラーゼ）は、オルニチンデカ
ルボキシラーゼインヒビター、２−（ジフルオロメチ
ル）−DL−オルニチン、DFMOに対する耐性を与える（Mc
Conlogue L.,1987,Current Communications in Molecul
ar Biology,Cold Spring Harbor Laboratory編）。

5.5. SCPFの生成 本発明は、膜結合形態および分泌形態の両方のSCPFに
関する。SCPFは751およびML1細胞株により天然に分泌さ
れる。SCPFは、継続的な細胞株の馴化培地から単離され
得、そして種々のタンパク質精製手順を用いて均質にな
るまで精製され得る。あるいは、SCPFは、組換えDNA技
術により、または化学合成方法により生成され得る。

5.5.1. SCPFの精製 SCPFは、SCPFは分泌する細胞、すなわち、細胞株また
は遺伝的に設計した組換え宿主細胞発現系のいずれかの
培養上清から精製され得る。特定の実施態様では、以下
の実施例のように、751細胞株の馴化培地が回収され、S
CPFはSDS調製ゲル電気泳動により精製される。あるい
は、751またはML−１細胞ライゼートが、SCPFについて
の供給源として用いられ得る。SCPFはまた、抗SCPF抗体
を用いて免疫アフィニティー法により精製され得る。さ
らに、SCPFは等電点電気泳動法を用いて精製され得る。

細胞の粗培養培地からSCPFを精製する方法は、クロー
ン化した発現産物の精製のために適合させ得る。さら
に、SCPFコード化配列が開裂可能な融合タンパク質をコ
ードするように設計される場合、SCPFの精製はアフィニ
ティー精製技術を用いて容易に達成され得る。例えば、
プロテアーゼ因子X a開裂認識配列は、SCPFのカルボキ
シル末端とマルトース結合タンパク質との間に設計され
得る。得られた融合タンパク質は、マルトース結合タン
パク質が結合するアミロースを結合させたカラムを用い
て容易に精製され得る。次いで、SCPF融合タンパク質
は、マルトース含有緩衝液を用いてカラムから溶出さ
せ、続いて因子X aで処理される。開裂されたSCPFは、
マルトース結合タンパク質を除去するために第二のアミ
ロースカラム（New England Biolabs,Beverly,MA）を通
過させることによりさらに精製される。本発明のこの局
面を用いて、任意の開裂部位または酵素開裂基質は、SC
PF配列と精製のために用いられ得た結合パートナーを有
する第二ペプチドまたはタンパク質との間に設計され得
る。例えば、免疫アフィニティーカラムを調製し得るた
めの任意の抗原。

本発明のSCPFを単離するために用いられ得る手順は、
タンパク質物質の分離のために一般に用いられる手順を
含み、例えば、タンパク質用の一般的な沈澱剤を用いる
SCPF含有サンプルの処理、続いて、分画技術（例えばイ
オン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマト
グラフィー、限外濾過、およびそれらの種々の組合せ）
を含む。SCPFは、例えば、米国特許第4,885,236号およ
び第4,882,268号に記載の方法により細胞懸濁液から精
製され得る。本発明のポリペプチドの精製の他の方法
は、当業者に公知であり得る（例えば、本明細書に参考
として援用されるCurrent Protocols in Immunology,Co
liganら編、1992参照）。

SCPF含有画分は、適切な条件下でSDS−PAGEに供せら
れ得、そしてSCPF活性を含むゲルスライスまたはSCPFの
分子量に相当するゲルスライスが回収される。SDS−PAG
Eは、Laemmliら、（Nature,227:680,1970）の方法に従
って行われる。適切な範囲内の条件の変化は、精製手順
内に含まれると理解されている。

SDS−PAGEからのSCPF含有画分は単離され得、そして
さらにO'Farrell（J.Biol.Chem.250:4007,1975）の方法
により２次元ゲル電気泳動に供され得る。第一次元等電
点ゲルは、約3.8〜約8.0の間のpI値を有するタンパク質
を分析するために、広範囲な両性電解質を用いる標準方
法により実行される。pH2〜11の両性電解質溶液は、目
的のタンパク質のpIに依存して、種々の量で添加され
る。狭いpHでの広い増大した分析が所望される場合、狭
い範囲の両性電解質は2:1の割合で広範囲な両性電解質
に添加され得る。好ましくは、SCPFおよびその対応する
イソ型は、約５〜約９のpI、さらに特には約７〜約８の
pIを有するタンパク質を分離する両性電解質を用いて分
析される。第二次元ゲルは、10〜20％アクリルアミドゲ
ルとして流すが、しかし、任意の従来のスラブゲルが用
いられ得る。

２次元ゲル電気泳動により分解したタンパク質は、ク
マシーブルー染色および銀染色のような標準方法により
検出され得る。あるいは、ゲル中のタンパク質は、ブロ
ットトランスファーメンブランに電気泳動的に移し得、
Indiaインクまたはコロイド状ゴールドを用いる染色、
またはウエスタンブロッティングにより検出され得る。
好ましくは、本発明のSCPFは、本発明の抗体を用いてウ
エスタンブロッティングにより検出される。

SCPF含有画分はまた、逆相HPLCに供され得、そして例
えば、アセトニトリルを用いて溶出され得る。得られた
SCPFは、Ｎ末端アミノ酸配列を決定するに十分に純粋で
ある。この溶液は、真空下で乾燥され、少量のアセトニ
トリル95％＋TFA（0.08％）に再度溶解される。次い
で、濃縮したサンプルは、フェニルチオヒダントイン
（PTH）分析器に連結するシークエンサーに導入され
る。

ゲル精製したサイトカイン（例えば、本発明のSCPF）
の生物学的活性は、指標細胞株の増殖の刺激（および／
または阻害）についてのバイオアッセイでテストされ得
る。例えば、SCPF活性は、ML1、KG−1a、または部分精
製CD34⁺骨髄細胞でアッセイされ得る。

5.5.2 化学的合成方法 SCPF分子はまた、そのアミノ酸配列を基にして、固相
化学的合成技術により全体的にまたは部分的に生成され
得る。（Creighton,1983,Proteins Structures and Mol
ecular Principles,W.H.Freeman and Co.,N.Y.pp.50−6
0;StewartおよびYoung,1984,Peptide Synthesis,第２
版,Pierce Chemical co.を参照）。このアプローチは、
SCPFの１以上の生物学的に活性な領域に対応するそのセ
グメントを生成するのに特に有用である。

5.6. 抗SCPF抗体産生 本発明の範囲の中には、SCPFまたはその関連タンパク
質を認識するポリクローナル抗体およびモノクローナル
抗体の産生がある。

当該分野で公知の種々の手法が、SCPFのエピトープに
対するポリクローナル抗体の産生に用いられ得る。抗体
の産生のために、種々の宿主細胞がSCPFタンパク質また
はSCPFペプチドの注射により免疫化され得、それらには
ウサギ、ハムスター、マウス、ラットなどが含まれる
が、これらに限定されない。宿主の種類に応じて種々の
アジュバントを用い、免疫応答を高め得、それらには、
フロイント（完全および不完全）、鉱物性（mineral）
ゲル（例えば水酸化アルミニウム）、表面活性物質（例
えば、リゾレシチン）、プルロニックポリオール（plur
onic polyol）、ポリアニオン、ペプチド、油型乳剤、
キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノー
ル、および潜在的に有用なヒトアジュバント（例えば、
BCG（bacille Calmette−Guerin））およびCorynebacte
rium parvum）が挙げられるがこれらに限定されない。

本発明の特定の実施態様において、SCPF特異的抗体の
生成のため、ゲル精製されたSCPFを用いてウサギを免疫
化した。そのような抗血清の１つ（SAM.1）には、SCPF
と特異的に反応し、それによる自己分泌様式での751細
胞増殖の刺激の際にその活性が阻害される抗体が含まれ
ることが示された。セクション7.7.2（後出）を参照さ
れたい。

SCPFのエピトープに対するモノクローナル抗体は、培
養物中での継続的な細胞株による抗体分子の産生を提供
する任意の技術を用いることにより調製され得る。これ
らにはKohlerおよびMilstein（1975,Nature 256,495−4
97）により初めて記載されたハイブリドーマ技術、およ
びより最近のヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kosbor
ら、1983,Immunology Today 4:72;Coteら、1983,Proc.N
atl.Acad.Sci.80:2026−2030）およびEBV−ハイブリド
ーマ技術（Coleら、1985,Monoclonal Antibodies and C
ancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.,pp.77−96）が挙げら
れるが、これらに限定されない。適当な抗原特異性のマ
ウス抗体分子からの遺伝子とともにヒト抗体分子からの
遺伝子をスプライシングすることによる「キメラ抗体」
の産生に開発された技術を用い得る（例えば、Morrison
ら、1984,Proc.Natl.Acad.Sci.,81:6851−6855;Neuberg
erら、1984,Nature,312:604−608;Takedaら、1985,Natu
re 314:452−454）。さらに、一本鎖抗体の産生につい
て記載された技術（米国特許第4,946,778号）が一本鎖
抗体を産生するために適応される。

分子の結合部位を含む抗体フラグメントは、既知の方
法により生成され得る。例えばそのようなフラグメント
にはＦ（ab'）_２フラグメント（抗体分子のペプシン消
化により生成され得る）およびFabフラグメント（Ｆ（a
b'）_２フラグメントのジスルフィド架橋を還元すること
により生成され得る）が挙げられるが、これらに限定さ
れない。

SCPFに対する抗体は、成熟形態、前駆体形態、および
サブ成分状態で、膜に結合したSCPFまたは分泌されたSC
PFの、質的な検出および量的な検出において、SCPFタン
パク質のアフィニティー精製において、SCPF生合成、代
謝、および機能の解明において、ならびに免疫原性エピ
トープをコードする遺伝子配列のSCPF発現ライブラリー
のスクリーニングにおいて、その使用が見出され得る。
SCPFに対する抗体はまた、胚細胞または他の腫瘍の診断
および治療剤としても有用であり得る。

5.7. SCPFの使用 SCPFの機能的活性および標的細胞特異性は、インビト
ロおよびインビボでの幅広い使用を提供する。成長刺激
活性を示すSCPF、またはそのフラグメントおよび誘導体
を含む任意の化合物を、単独で、あるいは他の生物学的
に活性な成長因子、インヒビター、もしくは免疫調整剤
とともに、本発明の実施および方法において用い得る。
SCPF、SCPF関連分子、およびその組成物は、造血幹細胞
を含むがそれに限定されない胚／幹細胞の増殖を増大さ
せることにおいて特に有用であり得る。

造血幹細胞に外因性遺伝子を安定に組み込むことを達
成しようとする最近の試みにおける主な障害は、既知の
サイトカインには、そのような細胞を分化することなく
増殖する刺激能力がないということである。SCPFは、精
製CD34⁺細胞を細胞周期に入るように誘導して、長期培
養において増殖させ得ることが示された（セクション7.
2.5.、後出）。鎌状細胞貧血を含むがそれに限定されな
い造血疾患の遺伝子治療における使用のために、SCPFを
用いて幹細胞の遺伝子操作を容易にし得る。

SCPFが自己分泌成長因子であり、また造血系統の細胞
上で働くという発見は、SCPFが異なる組織起源の原始胚
／幹細胞に特異的なサイトカインであり得るということ
を意味する。幹細胞集団は脳、肝臓、および皮膚を含む
種々の器官および組織に存在するということが示され
た。さらに、脱毛もまた、毛包を取り巻く幹細胞の増殖
の欠陥に関係する。従って、SCPFは、脱毛を含むがそれ
に限定されない、幹細胞集団（その起源組織に関係な
く）の成長を必要とする状態を処置するために有用な物
質であり得る。

さらに、SCPFレセプターを発現する細胞が、標識した
SCPFまたはSCPF関連分子をレセプター結合アッセイにお
いて用いることにより、あるいはSCPFレセプター自体を
指向する抗体を用いることにより検出され得る。細胞
は、SCPFに対するレセプターの存在および密度によって
区別され得、それによりそのような細胞のSCPFの生物学
的活性に対する応答性を予測し得る。

5.8. 胚細胞由来のサイトカインを同定する方法 本発明は、種々の胚／幹細胞に関する生物学的活性を
有する成長因子もしくはサイトカインの同定および単離
の新規なアプローチを示す。任意の胚細胞腫瘍は、手術
用材料から入手し得、本発明の実施のためのインビトロ
培養用に調製され得る。この細胞株は、特定のマーカー
の発現もしくは特定の成長因子に対する応答を基にして
選択され得、そして粘着性および非粘着性の両方の細胞
集団が維持され得る。確立された細胞株の組織系統の特
徴付けは、白血球抗原および中間フィラメントを含む種
々の細胞表面要素および内部の細胞骨格要素（internal
cytoskeltal element）に対する抗体を用いるフローサ
イトメトリー分析により決定され得る。さらに、オンコ
ジーン（ｃ−myc、ｃ−fms、ｃ−ras、ｃ−myb、ｃ−fo
s、ｃ−src、ｃ−erb、ｃ−neu、ｃ−ros、およびｃ−s
isを含む）は、分子プローブの使用により試験され得
る。

確立された細胞株により産生される新規なサイトカイ
ンを同定するために、細胞は代謝的に標識されそして分
泌されたタンパク質はSDS−PAGEにより分析され得る。
あるいは、培養上清は、生物学的アッセイにおいて特定
のサイトカインに応答することが公知であるインジケー
ターとして用いられる種々の細胞タイプに作用させる
（apply）ことにより直接分析され得る。主要なタンパ
ク質をSDS−PAGEによりおよび／または生物学的活性に
より同定したら、そのタンパク質は、SDS−分離用（pre
parative）ゲル、イオン交換クロマトグラフィー、およ
び等電点ゲルにより精製され得る（セクション5.5.1、
後出参照）。タンパク質の純度SDS−PAGEにより確認さ
れ、タンパク質アッセイにより定量化され、それらの活
性はバイオアッセイにおいて確認され、そしてポリクロ
ーナル抗体およびモノクローナル抗体の産生のための免
疫原として用いられ得る。

精製されたタンパク質はさらに、異なる組織タイプの
種々のインジケーター細胞株の増殖の刺激および／また
は阻害をバイオアッセイにおいてテストされ得る。放射
性標識されたタンパク質もまた用いられ、アフィニティ
ー標識のような方法により、それらの細胞表面レセプタ
ーが同定され得る。サイトカインの生合成経路の研究、
そのタンパク質のアフィニティー精製、およびコード化
配列の分子クローニングに対する発現ライブラリーの免
疫スクリーニングのために、サイトカインに対する特定
の抗体が用いられ、膜形態および分泌形態のサイトカイ
ンが、例えば先に記載したアプローチおよび技術を用い
て、同定および定量され得る。

6.実施例:SCPFを産生する751細胞株の生成 以下のセクションは、胚細胞腫瘍株の確立途上で発見
された751細胞株を記載する。751細胞株の成長はこれま
で記載されなかった１以上の成長因子によって調節され
る。

6.1. 材料および方法 6.1.1. 細胞培養 751細胞株を、10％ウシ胎児血清、Ｌ−グルタミン、
および抗生物質（ペニシリン／ストレプトマイシン）を
補充したRPMI1640中で維持した。生存率および細胞濃度
をトリパンブルー排除を用いて評価した。細胞濃度を１
×10⁵細胞/mlとなるように調整して75cmの細胞培養フラ
スコに播き、次いで、空気中５％CO₂の雰囲気下で37℃
でインキュベートした。

6.1.2. 動物 ３重免疫不全（triple−immune−deficient）by/mu/x
idの雌のマウス（BNXマウス）をHarlan Sprague Dawley
Inc.,INより入手し、無菌動物コロニー中に維持した。
マウスには滅菌Rodent Bloxおよび酸性化した水を無制
限に与え、７〜９週齢で実験に用いた。

6.1.3. インビトロ細胞増殖速度実験（kinetics） 751細胞株のインビトロ増殖速度実験を以下のように
行った。初期の増殖曲線の研究を行って、開始時の最適
な細胞濃度を得た。従って、初期の増殖曲線は、５×10
³、５×10⁴、および１×10⁵細胞／ウェルで行った（ru
n）。細胞計測は、12時間の間隔で７日間行った。全て
の細胞数／サンプルは、３組で行った。これらの予備研
究は、続く全ての増殖曲線の最適な細胞数が５×10⁴で
あることを明らかにした。次いで、最終濃度（容量2ml
中の）が５×10⁴/ウェルとなるように751細胞を12ウェ
ルのプレートに播いた。全ての計測は12時間の間隔で７
日間行い、そして生存率％も記録した。全ての細胞数／
サンプルを３組で行った。

6.1.4. インビボ細胞増殖速度実験（kinetics） 751細胞株がBNXマウスに移植され得る能力をテストし
た。腫瘍成長の速度を測定するために、751−NA細胞株
のLog₁₀連続希釈物をBNXマウスの後躯の皮下に接種した
（.1ml）。希釈物当たり８匹のマウスを用いた。接種し
たマウスの腫瘍の出現を１週間に２回検査した。一旦腫
瘍が顕性になると、腫瘍のサイズをカリパスを用いて２
日毎に測定した。腫瘍の測定は、２つの直交する直径を
測定することによって行い、腫瘍の面積はその２つの値
を一緒に乗じることにより推定した。

6.1.5. フローサイトメトリー分析 751細胞もしくはML−１細胞を、以下の白血球細胞表
面マーカーに特異的なモノクローナル抗体を用いてスク
リーニングした:CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD1
0、CD14、CD19、CD20、CD33、CD34、CD38、CD56、HLAク
ラスＩおよびクラスII。これらの抗体は、Becton Dicki
nson,CAにより入手可能であった。フローサイトメトリ
ー分析を以下のように行った（Griebelら、1988）。751
腫瘍細胞を遠心分離し（1,000rpm、10分間）、そして0.
2％ゼラチン、1mMアジ化ナトリウム、および２％正常ウ
サギ血清を含む0.1M PBS中に２×10⁷の濃度で再懸濁し
た。50μｌの細胞懸濁液を、96ウェル平底マイクロタイ
タープレート中の50μｌの適切なモノクローナル抗体に
添加し、４℃で30分間インキュベートした。次いで、こ
の細胞を氷冷PBS−ゼラチンで３回洗浄し、そしてFITC
で標識したＦ（ab）'2ヤギ抗マウス免疫グロブリン（重
鎖および軽鎖特異的）、（Cooper Biomedical,Malvern,
PA）100μｌ（PBS−ゼラチンで1/75に希釈されている）
と一緒にさらに30分間４℃でインキュベートした。全て
のサンプルから、２ミリミクロンを通す前濾過により細
胞凝集体を除去した。FACS分析の直前にナイロンモノフ
ィラメントメッシュにかけた（Small Parts Inc.,Miam
i,FL）。非特異的標識を検出するために、適切なコント
ロールを含んだ。これらのコントロールにおいて、骨髄
は、FITCで標識したＦ（ab）'2単独または無関係な抗原
に特異的なモノクローナル抗体とマッチしたイソタイプ
とのいずれかと反応した。FITCで標識した751腫瘍細胞
を、Becton Dickinson Fac−Scanフローサイトメーター
を用いて分析した。20,000細胞からのデータを集めてモ
ノクローナル抗体の反応性のパターンを分析した。フォ
ワードアングル光散乱（forward angle light scatte
r）（FALS）対90％光散乱（LI90）の２パラメーター分
析を用いてFALS対蛍光のブロットを排除し、蛍光対細胞
数のヒストグラムとした。データはまた、所定の表現型
マーカーに対してポジティブであった細胞の％として得
た。

種々の抗原に対する抗体は、販売元から購入した：抗
サイトケラチン、抗NF200、抗NF160、抗NF68（Sigma,S
t.Louis,MO）；抗ビメンチン（Boeringer Mannheim）；
抗GFAPおよび抗NSE（Dakopatts,Glostrup,Denmark）。F
ITC結合二次抗体試薬は、Sigmaから購入した。

6.2 結果 6.2.1. 病歴 1989年に、19才の白人女性が彼女のかかりつけの医師
に頭痛および複視を訴えた。彼女はCTスキャンにより大
きな鞍上塊を有していると診断された。この塊を外科的
に小さくして腹膜腔脳室内（ventriculoperitoneal（V
P））シャントをその場所に入れた。術後の局所的放射
線照射により総用量5000cGyが投与された。彼女が１年
後に再び頭痛を訴えるまで、残った腫瘍をコントロール
しながら見かけ上健康であった。彼女はまたVPシャント
に沿って多数の皮下の塊を見出された。身体検査は彼女
の頭蓋骨の右側のVPシャントの近くに１つ、およびシャ
ントのチューブに沿って胸郭（chest wall）上に２つの
塊があることを明らかにした。彼女の頭部のCTスキャン
は、シャントの近くに局所的な再発および軟組織塊があ
ることを明らかにした。さらに、彼女の腹部には転移し
た沈着物が見出された。この頭蓋骨上の病巣を吸引し
た；この領域からの細胞の細胞の性質（cytology）は、
胚細胞腫瘍と一致していた。1990年２月、さらに組織の
性質（histology）を定義するために、胸郭の塊の１つ
を切除した。腫瘍の組織学的検査は、非胚細胞腫（non
−germinomatous）混合胚細胞腫瘍が小さな原始細胞の
顕著な集団を有し、1989年に行われた始めのバイオプシ
ーと類似していることを明らかにした。

6.2.2. 751細胞株の起源 1990年２月の手術の時に、小部分の胸郭の腫瘍を、細
胞単離および細胞培養中でのインビトロ増殖のために、
研究所へ送付した。腫瘍は約3mmの部分に分かれてい
た。細切した腫瘍をベルセン（versene）−トリプシン
を用いて37℃で10分間制限消化した。酵素処理の後、未
消化の組織を沈降によって除去し、上清の流体を集め、
遠心分離し、そして細胞ペレットを回収した。細胞ペレ
ットを再懸濁し成長培地で培養した。

一次培養物を毎日試験し、培地を週毎に交換した。元
の細胞培養物は、プラスチック皿に粘着細胞および非粘
着細胞のどちらも含んでいた。次の２カ月間にわたり、
形態的に異なる細胞タイプの数は、共培養物として複製
している２つの明確な集団のみが現れる時点まで減衰し
た。一つは粘着細胞として成長し、もう一つは非粘着細
胞として成長していた。この胚細胞株を培養して約16週
経ったとき、非粘着細胞は粘着集団より成長しており、
限界希釈によってクローン化されて主な細胞タイプとな
り、751−NAと名付けられた。驚くべきことに、751−NA
は、核型分析および種々の細胞酵素のネズミイソ型の発
現により決定されたとおりネズミ細胞株であることが見
出された。751−NAは、前述の成長培地を用いて多重細
胞集団継代（multiple−cell−population passage）に
よりインビトロ培養で、安定な形態で維持された。751
−NA細胞株からネズミ腫瘍モデルを発生させるために、
細胞をベージュ色でヌードなｘ−染色体性免疫不全（BN
X）マウスの皮下組織に注入し、（組織学的外見は元の
患者の腫瘍と類似している）胚細胞腫瘍を発生させた。
BNXマウス由来の皮下部位の腫瘍は無菌的に除去され、
ベルゼントリプシン処理されて（前出）、新規な非粘着
細胞株がインビトロ培養において再確立された;751−MU
と名付けられた。肝臓およびリンパ節ドレナージ中の転
移した沈着物からさらに２つの細胞株を確立し、それぞ
れ751−LIVおよび751−LNと名付けた。

6.2.3. 751細胞株の特徴付け 確立された751細胞株の特徴付けは、増殖速度および
表現型の両方を試験した。インビトロでの増殖は、増殖
曲線分析を用いて試験し、遅滞期をほとんど有さないか
全く有さないユニークな増殖パターンを示したが、生存
率は始めに対数増殖し、短い定常期に続いて劇的に減少
した。成長の速さは７〜８時間の対数期の間の倍加時間
を計算することにより示す。

インビボの細胞株の増殖を、BNXネズミモデルを用い
て評価した。マウスに注入された場合の細胞の増殖速度
を測定するために、種々の751細胞株の連続的な対数希
釈物を、後躯の皮下組織に接種した。マウスを１週間に
２回検査し、そして腫瘍の２つの直交する直径を測定し
た。接種物からは、接種後20日で顕性の100細胞くらい
の腫瘍が生じたことが見出された。報告されたほとんど
のネズミの腫瘍モデルで見出されたように、１×10³細
胞の接種により、２〜３ヶ月ではなくむしろたった７日
間で腫瘍が生じた。さらに、報告されたほとんどの腫瘍
は５×10⁵細胞より少ない接種物では成長しない。

この細胞集団（751−NA、751−LIV、751−LN）の起源
を決定するために、神経外胚葉胚細胞、ニューロン系
統、およびグリア細胞系統に特異な細胞決定基に対する
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方を
用いて、細胞をフローサイトメトリーにより分析した。
以下の抗体を用いて、この研究を完遂した：胎盤アルカ
リホスファターゼ（PAP）およびヒト絨毛性ゴナドトロ
ピン（XCG）をマーカーとして用いて、非ニューロン細
胞の胚細胞を検出した；サイトケラチン（抗ヒトまたは
抗ラット）およびビメンチン（抗ヒト）を神経外胚葉起
源の胚細胞のマーカーとして用いた；グリア線維酸性タ
ンパク質（Glial Fibrally Acidic Protein:GFAP）をグ
リア系統のマーカーとした；および神経特異的エノラー
ゼ（NSE）、ならびに神経フィラメントタンパク質（NF
P）−68,150および200をニューロン系統の細胞のマーカ
ーとした。結果は、細胞集団（751−NA、751−MU、751
−LN）が、適切な条件下で、ニューロン系統またはグリ
ア系統のいずれかの細胞を形成し得る原始脳胚細胞であ
ることを示した（図１参照）。

751細胞のさらなるフローサイトメトリー表現型決定
は、以下に対応する抗体によるポジティブな蛍光細胞の
以下の平均％（括弧内）を示した：抗ラットサイトケラ
チン８（0.86）；抗ラットサイトケラチン19（0.40）；
抗ヒトビメンチン（1.29）；マウス抗ヒトモノクローナ
ルNF−68（33.16）；ウサギ抗ヒトポリクローンアルNF
−150（64.54）；マウス抗ヒトモノクローナルNF160
（8.50）；マウス抗ヒトモノクローナルNF−200（61.1
3）;HPAP（56.28）；ウサギ抗ヒトポリクローナルGFAP
（67.69）；ウサギ抗ヒトポリクローナルNSE（78.3
4）；およびヤギ抗ヒトHCG（50.04）。

最初の研究は、751細胞株がHPCA−１（CD−34）を含
む任意の公知のヒト白血球マーカーを発現するかどうか
を確かめるために設計された。CD45、CD19、CD20、CD
3、CD4、CD8、CD2、CD5、CD7、CD10、CD14、CD71、およ
びCD34の発現に関する751細胞株のFACS分析は、この原
始細棒株がCD34マーカーを含む全ての白血球マーカーが
全くないことを示した。しかし、続く核型分析は、751
細胞がネズミであることを明らかにした。従って、751
細胞によって産生されるSCPFは、起源がネズミであるこ
とが予想される。驚くべきことに、「ネズミ」SCPFは、
ヒト標的細胞に対して生物学的活性を有する。

6.2.4. 751細胞株によるオンコジーン発現 細胞の悪性の表現型の発現におけるプロトオンコジー
ンの役割（インビトロおよびインビボの両方）を、多く
の細胞培養系において調査した。多くの異なるオンコジ
ーンに対するDNAプローブを用いて、ノーザン分析を行
った。これらの分析は、751細胞がオンコジーンｃ−myc
ならびにオンコジーンレセプターｃ−fmsのmRNAを十分
に含んでいることを示した。これは、特に重要である。
なぜなら、ｃ−fmsオンコジーンはマクロファージ−コ
ロニー刺激因子（Ｍ−CSF）のレセプターとして供され
るからである。Ｍ−CSFレセプターは、脳内の小グリア
細胞（microglia）に関しては記載されているが、神経
起源の原始細胞におけるその存在は未だに報告されてい
ない。しかし、Ｍ−CSFレセプターは、骨髄内の前駆細
胞上に見出され、そして単球／マクロファージ細胞の系
統特異的分化に関与する成長因子の一つである。このレ
セプターの発現は、原始胚細胞の増殖および分化におけ
るＭ−CSFの役割を示す。

7.実施例:751細胞株に由来する幹細胞増殖因子 以下に記載する実験は、SCPFが分泌される場合には32
kDaであり、そして細胞に結合する場合には37kDaである
ことを示す。精製したタンパク質の２次元ゲル電気泳動
は、PIが約7.0〜8.0の範囲のタンパク質の複数のイソ型
の存在を示す。

7.1. 材料および方法 7.1.1. 放射性標識およびポリアクリルアミドゲル電気
泳動 751細胞株を、30mlの培養フラスコ中で、10⁶細胞/m.
の密度になるまで、10％ウシ胎児血清および抗生物質
（ペニシリン／ストレプトマイシン）を補充したDulbec
coの最少必須培地（DMEM）中で成長させた。一旦必要な
密度が達成されたら、細胞を成長培地がなくなるように
洗浄し、そしてメチオニンを含まない75％DMEMにメチオ
ニンおよび２％の［³⁵S］−メチオニン（Amersham,IL）
を含む25％DMEMを補充して再培養し、そして再インキュ
ベートした。24時間間隔で、上清を採取し、非粘着細胞
を除くように成形し、そして−20℃で保存した。次い
で、この³⁵Sで標識された上清をサンプル緩衝液（Tris
−HCl、２−メルカプトエタノール、10％グリセロー
ル、２％SDS、および0.001％ブロモフェノールブルー）
に添加し、そして100℃で５分間加熱した。次いで、こ
のサンプルをSDS−PAGEに適用して先に記載したように
電気泳動した。電気泳動後、ゲルをTCA（10％、w/v）；
氷酢酸（10％、v/v）およびメタノール（30％、v/v）中
で固定した。固定後、ゲルをFluoro−hance^TM（Researc
h Products Inc.,Prospect IL）にさらに30分間浸漬し
た。ゲルを取り出して、ファイバー紙（予め湿潤させ
た）上に置き、そして真空下で加熱しながら（60℃）乾
燥させた。乾燥後、このゲルを高速Ｘ線フィールド（fi
eld）（Kodak X−omat AR）に曝し、−70℃で24〜48時
間保持し、その後オートラジオグラフを現像として分析
した。

751細胞株の細胞ライゼート、精製タンパク質、およ
び上清を、電気泳動用緩衝液で溶解し、Laemmeli（197
0）の不連続緩衝液システムを用いて12％SDS−ポリアク
リルアミドゲルで分析した。他に言及しない限り、電気
泳動は変性条件下で行った。各実験において、分子量マ
ーカー（Bio Rad Laboratories）を同時に泳動し、そし
てクマシーブルーで染色することにより可視化した。

7.1.2. SCPFのゲル精製 無血清上清を、培養48時間後の751−NA細胞から採取
した。上清をSavant濃縮を用いて20倍に濃縮し、次いで
透析した。次いで、濃縮されたサンプルを12％の分離SD
S−PAGEにかけた。SDSゲル電気泳動の後、このゲルを0.
3M CuCI₂によるネガティブ染色を行った。目的のタンパ
ク質のバンドをゲルから取り出し、小断片に切って200
μｌの溶出緩衝液（g25mM Tris−グリシン、pH8.3）と
一緒に透析バッグ（12−14,000分子量区分）に入れた。
次いで、このサンプルを100V、４℃で18時間電気溶出
（electro−eluted）した。電気溶出後、電流を30〜40
秒間逆流させて透析バッグを取り出し、サンプルを採取
して一晩透析した。全ての水簸（elutriation）調製物
を、免疫原として用いる前にSDS−PAGEにより純度に関
して検査するか、または細胞増殖アッセイにおける使用
に関して検査した。

7.1.3. 抗SCPF抗体の調製物 ニュージーランドシロウサギを免疫前に採血し、そし
て免疫前血清を用いて基線を確立した。ウサギをRibiア
ジュバントを含む751細胞株由来の７μｇの精製SCPFポ
リペプチドで皮下に免疫化した。最初の注射の２週間後
に、ウサギにポリペプチドおよびRibiアジュバントを含
む第２回目の注射を行った。ウサギは免疫原およびRibi
アジュバントにより最低５回の皮下接種を受けた。ウサ
ギを各接種時点で採血し、そしてその血清を、32kDaの
タンパク質に反応性である抗体の存在についてウエスタ
ンブロットにより試験した。32kDaのタンパク質に特異
的な抗体を高濃度に含む全血清をアリコートし、そして
−70℃で保存した。

7.1.4. ウエスタン免疫ブロッティング 751−NA腫瘍細胞株の細胞ライゼートを電気泳動緩衝
液中に調製し、そしてタンパク質をSDS−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動（laemmeli,1970）を用いて分離し
た。ゲル中に存在するタンパク質を、Towbinら、1979に
よって記載された技術に基づいて、BioーRad Semi−Dry
Transblot Apparatusを用いて、ニトロセルロースに移
した。このゲルをエレクトロブロット緩衝液（25mM Tri
s、192mMグリシン、および５％v/vメタノール、pH8.3）
で平衡化した。ニトロセルロールメンブランもまたこの
緩衝液で平衡化した。平衡化した後、ニトロセルロース
メンブランをプラチナ陽極上の濾紙の上に置き、次いで
ゲルを一番上に置いて次に予め浸漬した濾紙を置いた。
陰極を配置した後、サンプルを25ボルトで35〜40分間ブ
ロット／電気泳動した。移動後、メンブラン／ブロット
を、ゼラチンおよびTween20を含むリン酸緩衝化生理食
塩水（PBS−gel−tween）で４回洗浄した。このブロッ
トを、予めPBS−Tweenで希釈したウサギポリクローナル
抗体と共に一晩インキュベートした。インキュベーショ
ンの後、このブロットをPBS−Gel−Tweenで４回洗浄
し、次いでペルオキシダーゼで標識したヤギ抗ウサギ抗
体（Sigma,St.Louis,MO）と一緒に１時間インキュベー
トした。次に、PBS−Tweenで２回洗浄し、その後PBSの
みで２回洗浄した。基質（0.05％（w/v）４−クロロ−
１−ナフトールおよび30％H₂O₂）を添加しそしてブロッ
トを暗所で室温で60分間インキュベートした。ポジティ
ブな反応は暗青色のバンドの出現により示された。

7.1.5. クロノジェニックアッセイ 751腫瘍株は、10％FBSを補充したメチルセルロース含
有DMEM中でコロニー（128細胞／コロニーより多い）を
形成し得る。10³細胞を1.0mlのメチルセルロースに添加
し、これにさらに32kDaタンパク質に対するポリクロー
ナルウサギ抗体の種々の希釈物を100μｌの容量で添加
した。このサンプルを十分混合して、20mmペトリ皿に播
き、そして空気中５％CO₂雰囲気下で37℃でインキュベ
ート（inoculated）した。培養48時間後に、倒立光学顕
微鏡でコロニーの数を計数した。

種々のコロニー刺激因子に特異的な抗体をGenzyme（B
oston,MA）から購入した。

7.1.6. 長期培養物（Gordon型培養物） ヒト造血幹細胞を長期インビトロ培養で増殖させるた
めに、可溶性因子および細胞接触依存性因子を提供する
ために粘着細胞集団が必要とされる。ヒト骨髄吸引物
（marrow aspirate）を保存料を含まないヘパリンを含
む培地中に回収し、そして25cm²組織培養フラスコ中の
長期培養培地に希釈して最終容量8ml（２×10⁷の有核細
胞を含む）となるようにした（Gordonら、1987、Exp.He
matol.15:772）。成長培地は、イノシトール（40mg/m
l）、葉酸（10mg/ml）、ヒドロコルチゾン（10^-6M）、
２−メルカプトエタノール（２×10^-4M）、およびウマ
血清とFBSとを1:1で混合して最終血清濃度が25％となる
ようにしたものを補充したα−MEMから構成されてい
る。付着を容易にするために、培養物を37℃で置いた。
４日後、この培地および非粘着細胞を回収し、Ficoll/H
ypaqueで遠心分離して顆粒球および赤血球を除き、そし
て低い密度の画分を培養フラスコに戻した。その後、集
密的粘着細胞単層が形成されるまで、成長培地の半分お
よび非粘着細胞を１週間毎に新鮮な培地と交換した。

培地および非粘着細胞を長期培養物から取り出し、そ
して2mlの新鮮な培地を添加した。次いで、このフラス
コに2000ラドで放射線照射して粘着層内に存在する造血
細胞を除去した。放射線照射後、この培地を取り出し、
精製した細胞集団を含む8mlの新鮮な培地と交換して、
それらが培養物中で骨髄造血を再構成して開始するかど
うかを決定した。コントロールとして、いくつかの長期
培養物を培地のみで再構成し、放射線照射が全ての造血
前駆体を排除するのに十分であることを示した（ネガテ
ィブコントロール）。さらに、いくつかの長期培養物を
正常骨髄細胞で再構成した（ポジティブコントロー
ル）。再構成に続いて、培地の半分および非粘着細胞を
毎週採取し、計数して、成長因子を含むメチルセルロー
ス培養物中に播いた。さらに、特定の時点で、培養フラ
スコを犠牲にして、粘着細胞をトリプシン処理し、造血
コロニーアッセイのために単一細胞懸濁物を得た。

7.1.7. インビトロ前駆細胞アッセイ 以下のアッセイは、細胞のCFU活性の測定に用いた標
準プロトコルであった。

コロニー形成前単位（Pre−CFU）アッセイを設計して
ヒト骨髄の初期造血前駆体を検出した（Smithら、199
1、Blood、77:2122）。単離された細胞をrIL−１α（10
0U/ml）およびrIL−３（50ng/ML）と一緒にインキュベ
ートし、培養７日後に採取し計数した。１×10⁵細胞
は、0.36％アガロース中の1000U/mlの組換えGM−CSFと
ともに播かれ、コロニー（＞50細胞）を、インキュベー
ション後14日間計数した。

骨髄単球／赤血球前駆細胞（CFU−GEMM）および赤血
球系の前駆細胞（BFU−Ｅ）を検出するために、組み合
わせたCFU−GEMM/BFU−Ｅアッセイを用いた（Ashら、19
81、Blood 58:309）。簡潔に述べると、１×10⁵の精製
幹細胞を、直径35mmのプレートに、５×10⁵M 2−メルカ
プトエタノール、30％FBS、100U/mlのヒトrIL−３およ
び1.0U/mlのEpoおよび0.9％メチルセルロースを補充し
た総容量1.0mlのIscove改変Dulbecco培地中に播いた。
培養物を、空気中に５％CO₂および10％O₂を含む湿潤雰
囲気下で14日間37℃でインキュベートした。コロニー
（＞50細胞）を倒立顕微鏡を用いて計数した。

CFU−GMの代表である初期造血前駆体もまた検出され
た（Iscoveら、1971、Blood 37:1）。簡潔に述べると、
１×10⁵精製幹細胞を、２％FBS、0.6％Ｌ−グルタミ
ン、0.9％メチルセルロース、および100U/mlのヒト組換
えrIL−３を補充したα−MEM総容量1.0mlで直径35mmの
ペトリ皿に播いた。培養物をCFU−GEMMアッセイに関し
て記載したようにインキュベートし、そして倒立顕微鏡
を用いてコロニーを計数した。

7.2. 結果 7.2.1. SCPFの生物化学的同定 751細胞株によって分泌されるタンパク質を可視化す
るために、パルスチェイス実験を［³⁵S］−メチオニン
を用いて行った。細胞をメチオニンを含まない培地中で
12時間標識し、その後細胞をメチオニンを含む非放射性
の成長培地に置いた。次いで、³⁵Sで標識した上清をSDS
−PAGEにかけた。１つの主要なタンパク質は751腫瘍細
胞から分泌されることが見出され、計算された見かけの
分子量（回帰分析による）は32kDaであることを示し
た。さらに、このタンパク質の最大分泌は培養後24〜36
時間で起こることが見出された（図２）。

このタンパク質の単離は、分泌されたポリペプチドを
SDS−PAGEによって分離し、分子量マーカーと比較した
移動度によって32kDaのポリペプチドを同定することに
より達成した。一旦同定すると、タンパク質をエレクト
ロブロットによりニトロセルロースに移し、そして32kD
aタンパク質に相当する領域を切り出してジメチルスル
ホキシド（DMSO）中で溶解した。これを生成されるポリ
クローナル抗体の生成のためにウサギに接種した。

抗体の特異性は、ウエスタン免疫ブロット技術を用い
て、751−LNの全細胞ライゼートに対してテストした。
この系では、タンパク質をBio−Rad semi−dry transfe
r apparatusを用いてニトロセルロースに移し、次い
で、改変した比色定量ELISAに供した。ポジティブバン
ド反応は、暗青色バンドの出現により示された。これら
のアッセイは、見かけの分子量が37kDa（回帰分析によ
り計測）の単一のタンパク質と特異的に反応するポリク
ローナル抗体を示した（図３）。このことは、分泌され
たタンパク質の分子量（32kDa）に関連して次のことを
示唆する：（１）シグナル配列は分泌されたタンパク質
を細胞表面に輸送するために存在する；（２）分子に対
するトランスメンブラン成分は、タンパク質を膜に固定
（anchor）する；および（３）このタンパク質には２つ
の形態が存在し、１つは膜結合種（37kDa）であり、他
方は分子量が32kDaの可溶性細胞外種である。両形態
は、正常な胚細胞発生の間に、細胞−細胞相互作用に追
加的に関与する膜結合形態をとりながら「成長因子」と
して作用し得る。

7.2.2. SCPFによる胚細胞腫瘍株の自己分泌成長調節 細胞株751によって産生された32kDaタンパク質に対し
て誘導されたポリクローナル抗体を用いて、メチルセル
ロース中でコロニー阻害アッセイを行った。先の実験
で、751細胞がメチルセルロース中で48時間以内に50細
胞より多いコロニーを形成することを示した。もし32kD
aのタンパク質が、腫瘍細胞の成長を調節する自己分泌
因子なら、タンパク質がその細胞レセプターに結合する
ことをブロックすることにより細胞の複製およびコロニ
ーの成長が減少するはずである。ウサギポリクローナル
抗32kDa抗体の連続希釈を用いて、751−NA、751−MU、
および751−LN腫瘍細胞を種々の血清希釈物を含むメチ
ルセルロース中に混合して、37℃で48時間インキュベー
トし、次いで新しく形成されたコロニーを計数した。1/
20の逆希釈（reciprocal dilution）のとき、抗体はコ
ロニー形成を98％阻害した。この阻害は、抗体濃度依存
性を示し、著しい阻害（＞25％）は1/120の血清希釈で
生じた。1/20希釈の正常ウサギ血清は、コロニー形成を
ブロックしなかった（図４）。さらに、抗37kDa抗体が
細胞増殖をブロックする能力を³Hチミジン取り込みアッ
セイにおいてテストした（図５）。この図は、抗体が実
際に細胞増殖を阻害すること、ならびに751−Mu Metお
よびBo Bm.1細胞のみが阻害されたので、この阻害が胚
／幹細胞に対して特異的であることを示す。A251神経芽
細胞腫細胞株は阻害されなかった。

7.2.3. SCPFとヒト骨髄細胞集団との相互作用 以下に記載した実験結果は、抗SCPF抗体（SAM.1）が
骨髄細胞の小集団と特異的に相互作用していること、さ
らに、この集団がCD34⁺の区分に入るようであることを
示す。最終的には、抗SCPFはCD34タンパク質とは異なる
マーカーを認識し、そして幹細胞集団の概要説明に重要
であり得る。

751細胞の原始的性質により、およびそれが自己分泌
成長因子（SCPF）により調節されるようなので、以下の
実験は、精製された天然のタンパク質が骨髄細胞と相互
作用するかどうかを決定するために設計された。この相
互作用は（１）骨髄−メチルセルロースクロノジェニッ
クアッセイ；（２）³H−チミジン取り込みアッセイ；お
よび（３）フローサイトメトリーを用いて分析した。図
３は、クマシーブルーで染色したSDS−PAGEゲルおよび
これらのアッセイに用いた精製された天然の37kDaタン
パク質のSAM.1ポリクローナル抗体を用いたウエスタン
ブロットを示す。37kDaに移動した単一のバンドがゲル
上に存在した（図3A）。SAM.1抗体と反応させた場合の
このゲルのニトロセルロースブロットは、同じ位置のバ
ンドを明らかにした（図3B）。精製したSCPFを種々の濃
度でクロノジェニックアッセイに用いた場合（表１）、
はっきりとした形態のコロニーは観察されなかった。

しかし、これらのアッセイにおいて、非常に散開した
クラスター内の芽様細胞（blast−like cell）が観察さ
れた。これらの芽様細胞をクロノジェニックアッセイか
ら取り出し、間質供給層（stromal feeder layer）あり
またはなしで懸濁培養内に入れ、SCPFを用いて増殖させ
た。間質供給層なしの懸濁物を、培養後96時間で採取
し、モノクローナル抗体HPCA−１（抗CD34）を用いるフ
ローサイトメトリー分析を行った。イソ型のコントロー
ルをネガティブコントロールとして用い、W6/32（抗ヒ
トHLAクラス１）モノクローナルをポジティブコントロ
ールとした。図６は、これらの細胞のフローサイトメト
リー分析である。全ての細胞は、W6/32抗HLAクラスＩで
染色され、さらに、高い％の細胞が抗CD34とも反応し
た。そのことは、必ずしも全ての細胞がCD34⁺ではない
ことを明らかにした。これは、（１）懸濁培養での増殖
の前に、クロノジェニックアッセイから非CD34⁺細胞が
除去されること、または（２）懸濁培養中に細胞が分化
することに起因し得る。しかし、これは、SCPFタンパク
質がCD34⁺表現型の細胞と相互作用することを示す。間
質供給層を有する長期培養に入れた細胞（図７）を、Go
rdon培養条件下での継続的な増殖について分析した。

図７は、これらの細胞がSCPF非存在下で長期Gordon培
養中で増殖したことを示す。間質細胞は、良好な増殖お
よび生存を維持するために、可溶性因子にも細胞−細胞
接触にも重要であるようである。間質馴化培地に与えら
れた細胞は増殖も生存もしなかった。細胞を72時間目に
Gordon培養から取り出し、そして組換えGM−CSF存在下
での複製効率をテストした（表２）。

コロニーアッセイにおいて誘導させ、次いで、Gordon
培養中で増殖させた細胞は、GM−CSFに応答し得、そし
て顆粒球（Ｇ）、単球（Ｍ）、および混合GM細胞のコロ
ニーを形成し得た。従って、そのことは、それらが系統
分化を受けて骨髄細胞になる能力を示す。³Hチミジン取
り込みによって測定されたように、骨髄細胞の増殖もま
たSCPFが骨髄起源の細胞を増殖へ誘導することを示した
（図８）。

先の実験から、SCPFが骨髄細胞集団と相互作用するこ
とは明らかである。ポリクローナルウサギ抗体（SAM.
1）が、細胞株751由来のSCPFに対して産生され、そして
そのSCPFが細胞に結合したので、骨髄細胞のフローサイ
トメトリー分析を行って、SCPFと相互作用する骨髄中の
細胞の表現型の性質を確かめた。SAM.1がヒト骨髄細胞
を認識する能力を、粘着力が涸渇したヒト骨髄細胞およ
びヒトの臍帯血の両方を新規な造血幹細胞の供給源とし
て用いてテストした。図９は、SAM.1が骨髄中の細胞の
非常に少ない集団（2.5％）および臍帯血中の非常に少
ない細胞集団（1.96％）に結合することを示す。この集
団を明確にする試みにおいて、二色FACS分析を、抗CD34
フィコエリトリン（PE）標識抗体およびSAM.1蛍光イソ
チオシアネート（FITC）システムを用いて行った（図1
0）。これらの実験および751細胞がCD34を発現せず、そ
の結果、SAM.1がCD34マーカー自身を指向しないという
先の所見から、SAM.1は、CD34マーカーおよびSCPFの両
方を同時に発現する細胞集団を認識することが明らかで
ある。

CD34⁺およびSCPF⁺である細胞集団は、試験した全細胞
集団の1.65％を示す（図10）。SAM.1がネズミ、ウシ、
およびヒツジの骨髄中の細胞集団を認識する能力もまた
フローサイトメトリーにより試験した。全ての場合にお
いて、SAM.1は、これらの非ヒト種の骨髄由来の任意の
有意な細胞集団を認識しなかった。

フローサイトメトリー研究を、抗SCPF抗体を用いて精
製CD34⁺細胞に関して行った。CD34⁺集団を、抗CD34モノ
クローナル抗体とカップリングさせた免疫磁気ビーズを
用いて正常ヒト骨髄から分離し、フローサイトメトリー
に用いるまで液体窒素で保存した（Kesslerら、1987、B
lood 70:321）。単色分析および二色分析のどちらに関
しても、SAM.1はCD34選択集団を認識した（図11）。さ
らに、SAM.1と抗CD34との間には競合はない（図12）。
これらの実験において、CD34⁺細胞はSAM.1のみまたはSA
M.1/抗CD34の混合物とともにインキュベートした。図12
から観察し得るように、抗CD34は、SAM.1がこれらの細
胞に結合する能力に干渉しなかった。これらの実験を、
CD34⁺細胞を抗CD34単独またはSAM.1/抗CD34の混合物と
ともにインキュベートすること以外は反復した。図12A
に示すように、SAM.1は、抗CD34抗体の結合に干渉しな
かった。このことは、SAM.1抗体が異なる細胞表面抗原
を認識することをさらに示す。

7.2.4. 751細胞由来のSCPFを用いるCD34⁺細胞の長期培
養 CD34⁺細胞の長期培養は、外因的に添加した精製天然S
CPFの存在下で開始した。外因的に添加した成長因子が
ないコントロール培養、ならびに100U/mlのインターロ
イキン３（IL−３）および100U/mlのインターロイキン
６（IL−６）を有する培養を含んだ。精製CD34⁺細胞を2
00,000細胞/mlで24ウェルプレートのウェルに播き、適
切な成長因子を添加した。種々の濃度の精製SCPF（１μ
g/ml〜10ng/ml）を添加した。３日毎に、培養培地を交
換し、外因性の成長因子を添加した。全ての培養を毎日
試験して細胞の生存および状態を評価した。

これらの研究の結果を図13にまとめた。IL−３または
IL−６を与えた培養物は、非生存細胞がほとんど存在せ
ずに急速に増殖した。７日目までに培養物は継代を必要
とした。一方、SCPF処理した培養物は、急速に細胞生存
率が減少し、その結果、７日目までにわずか10〜15％の
細胞が生存するのみであった。しかし、この残ったCD34
⁺細胞集団は今やSCPF応答性であり、12週間にわたって
培養物中で増殖した。コントロール培養（成長因子な
し）は、それらが最終的に死滅するまで３週間維持し
た。IL−３もしくはIL−６を与えた細胞は混合した状態
であり、粘着細胞および非粘着細胞の両方を含んでい
た。細胞遠心分離（cytocentrifuged）調製物は、培養
物が多くの成熟顆粒球細胞ならびに成熟芽様細胞を含む
ことを示す。これらのIL−３およびIL−６処理細胞を16
週間まで継続的に維持した。SCPF処理した細胞はサイズ
がより均一であり、全て単核で外見は芽様であり、そし
て非粘着性である。用量応答実験から、SCPFの最適濃度
は50ng/mlと10ng/mlとの間にあるようである。

培養12週間後、SCPF処理したCD34⁺細胞を、CD34、CD3
8、およびDR/HLAクラスII発現の有無に関してフローサ
イトメトリーによって試験した。図14および15に示した
データは、SCPFで増殖したCD34⁺細胞が、サイズに基づ
くと２つの形態の集団からなることを示す。図14（ゲー
ト領域Ｃ）は、表現型がCD34⁺、CD38^-、およびDR^-であ
る小さな細胞を示す。大きな集団（図15−ゲート領域
Ｂ）は、CD34⁺、CD38^low、およびDR^lowである。従っ
て、SCPFは、インビトロ培養物中のCD34⁺細胞がCD34⁺の
表現型を維持している間は、その増殖を誘導し得る−−
すなわち、CD34⁺細胞は分化せずに増殖する。SCPFで増
殖したCD34⁺細胞およびIL−３で増殖したCD34⁺細胞の両
方の複製効率を培養８週間後にテストした（表３）。

データは、IL−３存在下で増殖した細胞の複製が乏し
い（組換えIL−３およびGM−CSFを用いる）ことをさら
に示唆する。一方、SCPFで処理したCD34⁺細胞は、IL−
３およびGM−CSF存在下で良好な複製効率であり、その
ことは、SCPFで増殖させた細胞の原始的性質をさらに示
す。SCPFは、CD34⁺細胞にいかなる悪性の表現型も与え
ない。なぜなら、CD34⁺細胞は、SCPFがなくなると４〜
５日後に死滅するからである。

主なシグナルとして、この成長因子が骨髄幹細胞と相
互作用する能力に関して行った研究は、SCPFがBFUコロ
ニーおよびCFU−GMコロニーのどちらも誘導し得ること
を示す（図16および17）。SCPFは、CFU−GEMMを誘導し
得るようではない。しかし、この因子は、コロニー刺激
因子（GM−CSF、IL−３およびEPO）の混合物の活性を促
進し得、それによりBFUコロニー（図16AおよびＣ）、CF
U−GMコロニー（図17AおよびＣ）、ならびにCFU−GEMM
コロニー（図18AおよびＣ）に対するCSF活性を著しく増
加させる。

7.2.5. SCPFによるCD34⁺細胞の細胞周期への誘導 以下の実験により、SCPFおよびIL−３が精製CD34⁺骨
髄細胞を複製に誘導する能力を分析した。結果は、SCPF
およびIL−３はどちらも、単独で与えられた場合に、細
胞周期に入るために細胞を刺激し得たことを示す。これ
らの２つのサイトカインを組み合わせて培養細胞に添加
する場合、G2期にある細胞の％の増加にさらなる効果が
ある（表４）。

7.2.6. 抗体阻害研究 以下の研究は、SCPFにより誘導された芽細胞コロニー
の形成を中和するためにヒトGM−CSF、Ｇ−CSF、Ｍ−CS
F、およびIL−３に特異的なポリクローナル抗体のメチ
ルセルロース骨髄コロニーアッセイにおける使用を試験
した（表５）。

データは、これらのポリクローナル抗体がSCPFによる
芽細胞コロニーの誘導を中和し得なかったが、SAM.1は
それらの誘導を中和し得たことを示す。しかし、SAM.1
抗体は、GM−CSFおよびIL−３のヒト幹細胞因子（SCF）
促進を阻害し得なかった。このことは、SCPFが公知のCS
Fと同一ではないこと、およびSAM.1抗体がSCFの機能を
阻害しないので、SCPFはSCFとは機能的に異なるようで
あることを示す。

7.2.7. 二次元ゲル電気泳動 化学物質。アクリルアミド、N,N'−メチレンビスアク
リルアミド、尿素、過硫酸アンモニウム、N,N,N,N,−テ
トラメチルエチレンジアミン、およびAG 501−X8分析用
混合床樹脂をBio−Rad（Rockville Centre,NY）から購
入した。Pharmalyte pH3−10およびBiolyte pH3−10両
性電解質ならびに分子量標準（M_r20,100、トリプシンイ
ンヒビター（大豆）;24,000、トリプシノーゲン;29,00
0、カルボニッックアンヒドラーゼ;36,000、グリセルア
ルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ;45,000、アル
ブミン（卵）;66,000、アルブミン（ウシ）;97,400、ホ
スホリラーゼB;116,000、β−ガラクトシダーゼ）をSig
ma Chemical Co.（St.Louis,MO）から購入した。BCA Pr
otein Assay ReagentsをPierce（Rockford,IL）から購
入した。全ての他の化学物質は分析用でありFisher Sci
entificまたはSigma Chemical Co.のいずれかから購入
した。

第一次元。等電点電気泳動ゲル（IEF）（O'Farrell,
J.Biol.Chem.,250:4009,1975）を内径0.3cmの11cm長の
ガラス管中で作製し、底部をパラフィルムで密封した。
チューブゲルは、４％アクリルアミド、9M尿素、２％No
nidet P−40、および２％両性電解質を含み、これを２
段階で調製した。第１に以下の成分を混合し、AG 501−
X8樹脂（45mg/ml混合物）の存在下で約10分間穏やかに
撹拌した：アクリルアミドストック溶液（38％（w/v）
アクリルアミドおよび２％（w/v）N,N'−メチレンビス
アクリルアミド（H₂O中））2.5ml、10％（w/v）Nonidet
P−40（H₂O中）5.0ml、尿素13.75g、およびH₂O 3.75m
l。次いでアクリルアミド混合物をガラスウール栓を通
して濾過し、樹脂を除去した。第２に各タンパク質につ
いて、4.23mlアクリルアミド混合物、５％pH3−10両性
電解質（50％Pharmalytesおよび50％Biolytes）、適当
な容量の可溶化タンパク質サンプル、および脱イオン水
を混合することによりゲルを調製し、全容量4.98mlを得
た。約２分間脱気した後、調製したばかりの10％（w/
v）過硫酸アンモニウム5.0μｌおよびN,N,N,N−テトラ
メチルエチレンジアミン3.5μｌを添加した。迅速にゲ
ルをキャストし（0.76mlゲル混合物／チューブ）、脱イ
オン水を重層し、そして３時間重合させた。全てのタン
パク質サンプルを、ゲル混合物に添加する前に、13,000
×ｇで３分間遠心分離した。

このチューブを、Bio−Rad Model 155ゲル電気泳動セ
ル（下方（陽極）チャンバーに0.01Mリン酸、上方（陰
極）チャンバーに脱気した0.02M水酸化ナトリウムを含
む）中に置いた。等電点電気泳動を室温で18時間350Vの
一定電圧下で行った。等電点電気泳動が完了した後、空
気充填シリンジ／ゴム管状アセンブリをチューブの塩基
性側の末端に取り付け、少量の圧力を加えることによ
り、ゲルを穏やかにガラス管から外した。IEFのpHグラ
ジエントを表面電極（Bio−Rad）を用いて決定した。次
いでゲルを5.0ml平衡緩衝液（0.062M Tris−HCl、pH6.8
中2.3％ドデシル硫酸ナトリウム、５％β−メルカプト
エタノール、および10％（v/v）グリセロール）中で10
分間穏やかに撹拌し、またはエタノール／ドライアイス
浴で急速に凍結し、使用するまで−70℃で保存した。

第二次元。サンプルをLaemmliの方法に従って４％ア
クリルアミド濃縮用ゲルを用いて10％ゲル（1.5mm厚
さ、14.5cm長さ）上でスラブSDS−PAGEにより分離し
た。第一次元IEFゲルおよび分子量標準（平衡緩衝液中
１％アガロースに埋包された）を0.125M Tris−HCl、pH
6.8中１％アガロースを用いて濃縮用ゲルにつなげた。
電気泳動を、染料がゲルの約100％の長さまで流れるま
で、100mA/ゲルの一定電流を用いて室温（20〜25℃）で
行った。

固定および染色。二次元スラブゲル内で分離したタン
パク質をメタノール／酢酸／水（40/10/50）中で一晩固
定した。固定ゲルを標準法によりクマシーブルーで染色
するか、または以下の変法に従って銀染色した。固定ゲ
ルを染色前に最低１時間、20％エタノールを３回交換し
て洗浄した。染色は標準法により行った（Merrilら、Me
thods Enzymol.,104:441,1984）。ゲルを絶えず穏やか
に撹拌しながら30〜45分間染色した。次いで、染色した
ゲルを染色を発色させる前に20％エタノールを２回交換
して総計で20分間洗浄した。ゲルをエタノール／酢酸／
水（20/10/70）中に置くことにより染色の発色を停止さ
せた。バックグラウンド染色は、ゲルをKodak Rapid Fi
xer（フィルム強度）に２〜５分間置くことにより除去
した。次いで、ゲルを総計で30分間水を３回交換し、そ
の後５分間Kodakハイポ清浄剤中で洗浄して、ゲルから
固定液を除去した。ハイポ清浄剤を、最小限１時間20％
エタノールを３回交換して洗浄することにより、ゲルか
ら除去した。最後に、各ゲルを２枚のBioGelWrap（BioD
esign,Inc.,Carmel,NY）間に挟み込むことにより染色ゲ
ルを室温で乾燥した。

染色ゲルの撮影。銀染色ゲルの直接現像をKodak Elec
trophoresis Duplicating Filmを用いて製造者の指示に
従って行った。このフィルムはゲルに見出されるタンパ
ク質を永久的に記録し、照明ボックスの助けによりいく
つかのゲルにわたってタンパク質パターンの視覚マッチ
ングを行い得る。いくつかの場合では、Kodak Ektapan
4×５インチシートフィルムを用いてゲルを撮影し、16
×20インチのオルトフィルム上に現像した。得られた現
像写真は、透明フィルム基材上に大きな黒点としてタン
パク質のスポットを示した。これらの現像写真を大判に
すると試験が容易であり、そしてタンパク質パターンの
違いを正確に直接現像写真上に記録できた。

7.2.8 SCPF活性についてのバイオアッセイ SDS−PAGEゲル（１−Ｄまたは２−Ｄのいずれか）か
ら溶出したタンパク質中のSCPFの存在または非存在を、
本発明者らの研究室において生育させたCD34⁺細胞株（M
L−１）による［³H］−メチルチミジン（［³H］Tdr）取
り込みを用いる増殖アッセイにおいて測定した（セクシ
ョン8.1を参照のこと）。あるいは、他のCD34⁺細胞（例
えばKG−1a CD34⁺細胞（ATCC CCL 246.1））がアッセイ
に用いられてSCPF活性について調製物をテストした。

簡単にいえば、１×10⁵ML−１細胞を、10％FBSおよび
Ｌ−グルタミンを含有するIscoves改変Dulbecco培地を
入れた丸底96ウエルマイクロタイタープレートのウエル
中に100μl/ウエルの容量で播種した。連続２倍希釈し
た推定SCPFタンパク質調製物をウエルに３つ組で添加し
た（100μl/ウエル）。次いで、培養物を大気中５％CO₂
の湿潤雰囲気下で37℃で48時間インキュベートした。イ
ンキュベートした後、培養物を培養の最後の16〜18時間
ウエル当たり１μCiの［³H］−Tdrで標識した。ラジオ
アイソトープ取り込み量を液体シンチレーション計数に
より定量した。表６および７は、それぞれKG−1aおよび
ML−１細胞を用いるバイオアッセイについてのトリチウ
ム化チミジン取り込みを示す。SDS−PAGEの37kDタンパ
ク質から単離した推定SCPF（セクション7.1.2.を参照の
こと）の２倍希釈物をテストし、そしてトリチウム化チ
ミジン取り込みの結果はSCPF生物活性が調製物中に存在
することを示した（コントロールと比較）。

SDS−PAGE上で同定された37kDタンパク質から単離し
た調製物を用いて、２−Ｄゲルを流した。クマシーブル
ーで染色した後、複数のSCPFイソ型が２−Ｄゲル上で同
定された。ゲルを切片に分け、８枚のタンパク質含有ス
ライスを取り出した。タンパク質を８枚のスライスから
上述の7.1.2.に記載のようにして溶出した。バイオアッ
セイを各スライスからの溶出タンパク質に関して行っ
た。トリチウム化チミジンの取り込みは、スライス４番
において見られたイソ型から生成されたタンパク質調製
物と相関した（表８、データはCPMで示す）。スライス
４番において同定されたSCPFイソ型は、表面電極分析に
より決定されるように、pH7.0〜8.0の範囲のタンパク質
を表す。この画分の生物活性は、バイオアッセイにおい
てサイトカインの２倍希釈物により見られるように典型
的な希釈効果を示した。

表８で同定された生物活性データは、SAM.1抗体を用
いるウエスタンブロット分析によりさらに確認された。
上述のように流した二次元ゲル（pHグラジエントゲルお
よび続く分子量ゲル）をニトロセルロースフィルターま
たはPVDFフィルター上にブロットし、そして一次抗体と
してSAM.1および二次抗体としてアルカリホスファター
ゼ結合ヤギ抗ウサギIgG（H ＆ L）を用いて標準ハイブ
リダイゼーション法を用いてハイブリダイズした（BioR
ad）。このデータは、抗体がpH範囲が7.0〜8.0のタンパ
ク質と強く反応することを明らかにし、このpH範囲は、
SCPF生物活性を示した領域と一致した。

SCPFは、SAM.1または他のSCPF特異的抗体を用いて、
標準免疫アフィニティー法により２−Ｄゲル上で別々の
スポットから、均一になるまでさらに精製した（Curren
t Protocols in Immunology,第８章、Coligen,ら，編、
1992）。SCPFは免疫アフィニティーマトリックスから溶
出され、次いで上述のように等電点電気泳動にかけられ
るが、好ましくはpH範囲はpH6〜８のより狭い範囲で行
う。ゲル中で分離したタンパク質は、次いで上述のバイ
オアッセイにおいてSCPF生物活性についてスクリーニン
グされ得る。

7.2.9 ネズミ751細胞株由来のSCPFの配列分析 37kDaタンパク質の17kDaフラグメントを、RPMI−1640
培地中で生育させた751細胞の調整無血清上清から濃縮
および精製した。簡単にいえば、751細胞を10％FCS含有
RPMI−1640培地中で約80％集密になるまで増殖させた。
次いで培養物を２回PBSで洗浄し無血清RPMI中で培養し
た。インキュベートしてから12時間後、細胞を回収し、
上清を集め、４℃での低速遠心分離により清澄化した。
上清を凍結乾燥して乾燥させ、−20℃で保存した。凍結
乾燥したタンパク質を0.1％トリフルオロ酢酸（pH1.9）
中に再懸濁し、４℃で一晩透析し、その後低速遠心分離
した。

約200μｌの調製物を0.1％TFA、pH1.9中で平衡化した
逆相HPLCカラム（Waters,Novapak−C18）に注入し、そ
して0.1％TFA、pH1.9中の０〜20％のアセトニトリルの
直線グラジエントで10分間で溶出し、次いで0.1％TFA、
pH1.9中の20％〜60％のアセトニトリルで１時間溶出し
た。画分を集め、各々のアリコートをSAM.1抗体を用い
るウエスタン分析を用いて分析した。SAM.1ポジティブ
ポリペプチドは、30〜33％アセトニトリルの範囲で溶出
した。次いで、サンプルをSDS−PAGEにより精製した。

SAM.1ポジティブポリペプチドは約17kDに移動した。
このバンドをSDSゲルから切り出し、リジル−Ｃエンド
ペプチダーゼで消化してフラグメントを形成させた。こ
のフラグメントを逆相C8カラム（Waters）上で分画し
た。次いで、ペプチドを自動アミノ酸シーケンサーを用
いて記載されるように配列決定した（Hunkapellerら，
「Methods of Protein Microcharacterization,Gas−ph
ase protein/peptide sequencer」、D.E.Shireley,編、
Clifton,NJ,Humana Press,223〜247頁、1986）。

タンパク質データベース（Dayhoff）検索により独特
である４つのペプチドを抗ペプチド抗血清の産生のため
に合成した。抗体を、以下のようにしてペプチドに対し
て生じさせた（ウサギにおいて、HTI Bio−Products,Ra
mona,CA）。０日目の初回免疫は完全フロイントアジュ
バント（CFA）中に乳化した300μｇ抗原であった。21、
42、および63日目に行ったブースト免疫は、不完全フロ
イントアジュバント（IFA）中に乳化した300μｇ抗原で
あった。ウサギを各接種時点ならびに接種後の49、77、
および84日目に採血し、そして血清を、SCPFタンパク質
に反応性の抗体の存在について751細胞ライゼートを用
いてウエスタンブロットによりテストした。

ペプチドKDRGAGALに対して合成した抗体は、ウエスタ
ンブロット上で２つのタンパク質（17kDaおよび37kDa）
と特異的に反応した。図19は、以下の細胞ライゼートと
の抗ペプチド血清反応性のウエスタンブロット分析を示
す：レーン１、２、および3:それぞれ15μｌ、30μｌ、
および40μｌの751細胞ライゼート（RPMI＋10％FBS）；
レーン４、５、および6:それぞれ15μｌ、30μｌ、およ
び40μｌの751細胞ライゼート（RPMI＋10％FBS）＋50％
無血清上清（ML−１細胞由来）；レーン７、８、および
９は、ネガティブコントロールとして免疫前血清を用い
てブロットして30μｌの751NA細胞ライゼートを示す。

37kDaのバンドをゲルから切り出し、上記のようにし
て抽出し、そして以下の8.4に記載のようにして造血細
胞のコロニーアッセイにより生物活性についてテストし
た。

7.2.10 他の成長因子との相乗作用についてのアッセイ ML−１細胞株を、ヒト死体椎体由来の骨髄から免疫選
抜したCD34⁺から単離および精製した（セクション8.1を
参照のこと）。免疫選抜したCD34⁺細胞をサイトカイン
に曝す前および後にCD34−PE、CD38−FITC、およびCr−
PerCPで染色した。CD34⁺細胞（２×10⁵個）を種々のサ
イトカインを単独または組み合わせて添加したまたは添
加しない1.0mlのDulbecco培地中で培養した（表９およ
び表10を参照のこと）。細胞を培養前に数え、そして培
養６日後に再度数えた。次いで、細胞をSCPF抗体SAM.1
で染色し、FACS分析にかけた。CD34⁺細胞を、サイド光
散乱（side scatter）およびPE蛍光に従って、リストモ
ードでゲートした。２つの異なるサイズのCD34⁺細胞集
団（大および小）が、フォワード光散乱（forward ligh
t scatter）に基づいて同定された。これらの細胞をCD3
8およびDr発現について分析した。データを大および小C
D34⁺細胞集団についてそれぞれ表９および10中に示す。
これらの結果はSCPFおよびIL−３が、それらが単独で与
えられた場合、細胞周期に入るように細胞を刺激し得た
ことを示す。SCPF＋IL−３の組合せは、大CD34⁺細胞の
総数ならびに小CD34⁺細胞の総数の増大において相加的
そしておそらく相乗的な作用を有する。

8.実施例：ヒトML−１細胞株由来幹細胞増殖因子 以下に記載の実験は、ヒト細胞株ML−１由来のSCPF
が、約23kDaの分子量および約7.7のpI（尿素の存在下の
2Dゲル電気泳動により決定された）ならびに約27kDa
（一次元ゲル電気泳動から決定された）を有することを
示す。

8.1 ML−１細胞株の起源 CD34⁺富化骨髄細胞の不均一な集団をヒト死体椎体か
ら調製した（一般的にLa Russa,ら、Exp.Hem.,20:442,1
992;Stanley,ら,J.Immunol.,149:689,1992;Kessler,ら,
Blood（増補１）、70:321a,1987）。これらの細胞を、2
0％ウシ胎児血清（FBS）、Ｌ−グルタミン、ペニシリン
／ストレプトマイシン、および100ng/ml細胞株751由来S
CPFを補足したIscoves改変Dubbeccos最少必須培地（IMD
M）において、大気中５％CO₂雰囲気下で37℃でインビト
ロ培養した。

３日ごとに外因性の細胞株751由来SCPFを42日間にわ
たって補足した（100ng/ml）。この期間中、細胞の計数
を毎日単位で行った。生存細胞数は培養９〜10日頃減少
した。細胞増殖によって示されるように、培養ほぼ14日
目に、細胞は細胞株751由来SCPFに応答性になるようで
あった。

初期培養から42日後、残存細胞を、細胞株751由来SCP
F（100ng/ml）を１週間に一度補足した上記培地におい
て継代培養し、維持した。継代培養からほぼ４〜６週
間、細胞は外因性の細胞株751由来SCPFの非存在下で成
長し得ることが明らかとなった。このことは細胞株（ML
−１）がそれ自身の成長因子を生産し得ることを示唆し
た。次いで、ML−１細胞株を分析し、存在する固有の細
胞表面マーカーのレパートリーを決定し、CD34⁺、HL
A^-、DR⁺、CD38^-、CD2^-、CD3^-、CD4^-、およびCD8^-である
ことが分かった。表11は、フローサイトメトリー表現型
分析の結果を示す。

さらに、ML−１細胞を核型分析し、種々の逆位および
転座が見られた。特定のパターンは、以下の通りであ
る:46,XY,del（4q），−5,del（7q），−8,＋ｉ（8q）x
2,−12,＋der（12）ｔ（8q;12q）,del（16q），−17,＋
der（17）ｔ（5q;17q）,20p＋。

8.2 SCPFのゲル精製 ML−１細胞の後期対数期まで成長させ、そして２μg/
mlアプロチニンを含有するTBS中0.1％Triton X−100で
可溶化した。細胞ライゼートを、分子量の概算値を得る
ために1D Tris−トリシンゲル（Schaggerおよびvon Jag
ow,Anal,Biochem.,166:368,1987）上で、そして等電点
の概算値を得るために等電点電気泳動ゲル（pI3〜10、F
MC）上で電気泳動した。

全細胞ライゼートのドデシル硫酸ナトリウム（SDS）
中での一次元ゲル電気泳動をTris−トリシンゲル（Scha
ggerおよびvon Jagow,Anal.Biochem.,166:368,1987）を
用いて行った。アクリルアミド濃度は、濃縮用ゲルにつ
いては５％Ｔ、３％Ｃであり、分離用ゲルについては10
％Ｔ、３％Ｃであった。ゲルをクマシーブルーで染色す
るか、あるいはImmobilon−Ｐ（PVDF）膜にブロット
し、抗SCPF抗体（SAM.1）を用いてウエスタン法により
プローブした。ウエスタンブロットは標準法により行っ
た。PVDF膜を、0.05％Tween−20を含有するTris生理食
塩水、pH8中で作製された５％blotto（Carnation脱脂粉
乳）でブロックした。一次抗体（SAM.1）をblottoで1/
1,000に希釈し、室温で２時間または低温下で一晩ブロ
ットと共にインキュベートした。二次抗体を、アルカリ
ホスファターゼ結合抗ウサギ抗体でり、これをblottoで
1/5,000に希釈し、上述と同様にしてブロットとインキ
ュベートした。免疫応答性タンパク質は、ブロットをア
ルカリホスファターゼに対する基質と標準法によりイン
キュベートすることにより明らかにされた。新鮮な調製
物において、抗体は、約27kDaの１つのバンドを明らか
にした。他方で、４℃で短時間保存した調製物は２つの
バンドを生じ、これは主要バンドは約27kDaであり、そ
して別の弱いバンドはほぼ14.5kDaのバンドであった。1
4.5kDaバンドの強度は保存が長いほど増大し、これによ
りこのバンドはある種のタンパク質分解事象により27kD
aバンドから誘導されたことが示唆された。

ヒトSCPFのpIを決定するために、まずトリトンライゼ
ートをAmiconミクロ濃縮器に通して画分を濃縮し、0.06
％CHAPSを含有する10mM Tris緩衝液（pH7）で塩を取り
除いた。タンパク質を、平床電気泳動（BioRad）により
IsoGel Agarose IEF（FMC）ゲル（pI範囲３〜10）を用
いて等電点に集めた。等電点に集めた後、タンパク質を
Tris生理食塩水、pH7.5中で30分間圧ブロットすること
によりImmobilon P膜に移した。SCPFを、抗SCPF抗体（S
AM.1）およびアルカリホスファターゼ結合二次抗体を用
いてウエスタンブロットにより同定した。この方法を用
いて、２つのバンドがpI5.15（14.5kDa）およびpI9（27
kDa）で同定された。

2Dゲル電気泳動については、上述のようにして0.1％T
riton X−100中に可溶化した細胞ライゼート由来のタン
パク質を、Semple−Rowlandら,Electrophoresis,12:30
7,1991の手順に従って2Dゲル電気泳動により分離した。
第一次元は、pHが５と９との間に及び7M尿素中５％アク
リルアミド等電点電気泳動ゲルであった。キャリア両性
電解質（Pharmacia）をpH範囲３〜10の４％v/v濃度で用
いた。300μｇの全タンパク質を第一次元ゲル混合物に
重合前に添加した。サンプルを室温で16時間750vで泳動
し、最後に１時間1000vで泳動した。pHを表面電極を用
いて測定した。第二次元は、12％アクリルアミドSDSス
ラブゲル（厚さ1mm）であり、これをブロモフェノール
ブルー染料マーカーがゲルの底に達するまで一定電流
（20mA/ゲル）で泳動した。ゲルをクマシーブルーまた
は銀のいずれかで染色するか（Wrayら,Anal,Biochem.11
8:197,1981）、あるいはImmobilon P（PVDF）膜（Milli
pore）に電気ブロットした。分子量標準（200、97、6
9、46、30、および21.5kDa、Amarsham Rainbowマーカ
ー）を第二次元においてゲルに目盛りをつけるために用
いた。

2Dゲルおよびブロットは、全細胞ライゼート中で２つ
のスポットのみが抗体と相互作用することを示した。こ
のゲルを8M尿素中で流してタンパク質構造を分離させる
と、完全分子に埋め込まれたいくつかのアミノ酸が暴露
された。その結果、小さなバンドは、17kDaの見かけ分
子量および約7.05のpIを有していた。大きなバンドは23
kDaの見かけ分子量および約7.7のpIを有していた。平床
IEFゲルと2Dゲルとにおいて得られる値の差異は、おそ
らく尿素の存在による。平床IEF系では、尿素が用いら
れないので、その結果、タンパク質は折り畳みが解除さ
れない。

Aurodyeで染色した同じゲルおよびブロッティング後
の銀染色ゲルの第２ブロットの試験は、23kDaの分子量
を有する十分に分解された強いスポットおよび17kDaの
やや弱い強度のスポットを明らかにし、これらのスポッ
トは抗体により明らかにされた位置に相当する。これら
のスポットはまた、クマシーブルーで染色した伴ゲルに
おいても見られた。

8.3 SCPFのイオン交換精製 SCPFをDEMEセルロース（DE52、Whatman）およびCM−
セルロース（BioRad、充填済カラム）上のクロマトグラ
フィーでML−１ライゼートから精製した。14.5kDaタン
パク質（pI5.15）は10mM Tris−HCl、pH7、0.06％CHAP
S、および1mM PMSF中でDEAEに吸着した。カラムを０〜
1.0MのNaCl直線グラジエントで展開した。14.5kDaタン
パク質は0.2Mと0.35Mとの間のNaClで溶出した。27kDaタ
ンパク質（pI9）は、DEAEに結合しなかったが、他方大
部分の細胞性タンパク質は結合し、従ってこの工程で除
去される。素通り画分を集め、10mM MES、pH6.0に対し
て透析し、そして同じ緩衝液で平衡化したCM−セルロー
ス上でクロマトグラフィーによって分析した。CM−セル
ロースカラムもまた上述と同様にNaCl直線グラジエント
で展開した。再度、27kDaタンパク質は、これらの条件
下ではこのカラムに認められる程度には結合しないが、
結合した細胞性タンパク質の第２のセットから分離され
る。

サンプルを、タンパク質を結合させるMono Sカラムを
通してクロマトグラフィーから回収した。このカラムを
NaClの直線グラジエント（0.1から0.5M）で50分間展開
する。２つのタンパク質ピークが抗SAM抗体と十分に交
差反応した。第１のピークは50mM NaClで溶出し、そし
て第２のピークは100mM NaClで溶出した。第２のピーク
は、ウエスタンブロット上で抗体とのより強い反応を与
えた。２つの画分は、２−Ｄゲル電気泳動および抗SAM
抗体を用いるウエスタンブロット分析により決定された
いくつかの同じタンパク質を含有していた。

8.4 ML−１由来のヒトSCPFの生物活性 上述した平床免疫電気泳動ゲル由来の画分を、市販の
バイオアッセイ法（Almar Biosciences Inc.,Sacrament
o,CA）を用いてテストした。このアッセイは、代謝活性
の検出に基づいて蛍光／比色成長指標を取り込む。この
レドックス指標は、細胞成長培地が細胞増殖によって還
元されると、蛍光を発光し、そして変色を生じさせる。

KG−1A細胞（ATCC CCL 246−１）を容量100μｌで96
ウエルマイクロプレートに１×10⁵細胞／ウエルで播種
した。２組のウエルにサンプル希釈液（100μｌ）を添
加し、増殖速度の増大により示されるように生物活性に
ついてテストした。次いで、プレートを空気中５％CO₂
の湿潤雰囲気下で37℃で48時間インキュベートした。イ
ンキュベートした後、Alamar blue試薬を培養容量の10
％に等しい量（20μｌ）で添加し、このプレートをさら
に６時間インキュベーターに戻した。変色は570nmの波
長で測定した。バックグラウンド吸光度を600nmで測定
し、そしてこれを差し引いた。図20AおよびＢに示した
データはバックグラウンドを差し引いた吸光度である。
テストしたサンプルはIEFゲルのpH9.0（Ａ）および5.0
（Ｂ）由来の領域であった（これらはML−１細胞からの
ライゼートが等電点で集められた領域である）。これら
の領域（Ｉ−9.1〜Ｉ−9.4およびＩ−5.1〜Ｉ−5.6）は
また、SAM.1抗体を用いて免疫反応性についても分析し
た（ウエスタンブロット分析）。生物活性はpI−9.0領
域でのみ見られた。サンプルＩ−9.3が最大の生物活性
を有するようであった。テストしたpI5.0画分のいずれ
においても活性は見られなかった。このバイオアッセイ
法を用いて、上述した２−Ｄゲルから単離および精製し
たタンパク質（pI7.7、23kDa）がヒトSCPFペプチドであ
ることが分かる。

さらに、クロマトグラフィー後に回収した部分精製調
製物を、免疫選抜ヒト骨髄CD34＋細胞の細胞増殖の刺激
について、既出の記載のようにして、クロノジェニック
アッセイにおいてテストした（Colony Assays of Hemat
opoietic Cells Using Methylcellulose Media.An Intr
oductory Technical Manual.Prepared by the staff of
the Terry Fox Laboratory Media Preparation Servic
e,Vancouver,B.C.,Canada V5Z 1L3,1992を参照のこ
と）。簡単にいえば、希釈細胞を、培養皿で必要とされ
た最終濃度の10倍でReady−Mix Methylcelluloseを予め
分注したチューブに添加した（例えば、２組のアッセイ
培養が所望される場合、3mlのReady−Mixを入れた15ml
容チューブに1mlあたり２×10⁶細胞を0.3mlを添加する
か、または４組のアッセイが所望される場合、5mlのRea
dy−Mixを入れた15ml容チューブに0.5mlを添加すること
による）。これにより1.1mlの最終プレート混合物当た
り２×10⁵細胞の最終濃度が得られる。10倍濃度の細胞
懸濁液を加えることにより、細胞は最終容量の10分の１
の容量で加えられる。Ready−Mix Methylcelluloseを大
量に購入した場合（例えば１ボトル当たり100ml）、こ
の全体の量を、16ゲージの平端針をつけた5ml容のディ
スポーザブルシリンジを用いて、15ml容チューブに5ml
容量のうち3mlとして前もって分注しておかねばならな
い。細胞をチューブに添加した直後、内容物を強くボル
テックス撹拌して、細胞をむらなく懸濁させた（3mlの
最終メチルセルロース混合物の約３分の２がチューブの
側壁に付着している）。ボルテックス撹拌した後、チュ
ーブを数分間放置し、存在するいかなる大きな気泡をも
表面に浮き上がらせる（５分で十分である）。（これは
細胞が培養される混合物であるため、細胞は、必要であ
れば、プレートする前に室温で数時間この状態で、続く
コロニー形成に悪影響を及ぼさずに放置され得ることに
留意されたい）。次に、最終細胞含有混合物を1.1ml容
量で、滅菌35mmペトリ皿中にプレートした。プレートし
た各チューブについて、16ゲージ平端針をとりつけた新
たな滅菌ディスポーザブル3ml容シリンジを用いた。次
いで、この皿を100mmペトリ皿の中に２つずつ置いた。
３番目の35mm皿（蓋なし）を水皿のために加えた。水皿
の目的は、続く２〜３週間のインキュベート期間の間、
最大湿度が得られるようにすることである。アッセイ培
養に用いられる35mmペトリ皿は、それらが線維芽細胞を
付着および成長させ得ないことについて予備テストし
た。これは、骨髄細胞がたいていの供給者により市販さ
れているいわゆるペトリ（非組織培養用）皿において培
養される場合に容易に生じ、そしてこれが生じる場合、
造血コロニー形成はしばしばあいまいになるか、または
阻害さえされる。皿を回転および傾斜させることによ
り、粘性のメチルセルロース混合物が各皿の表面にわた
って均一に広がり、メニスカスを皿の全ての面の壁に付
着させる。3mlの滅菌水を各水皿に添加した。

培養物を37℃湿潤インキュベーター中の水平なトレー
上に置き、大気中５％CO₂の内部雰囲気を維持した。イ
ンキュベーション10〜12日後、培養皿を取り出し、１度
に１つずつ60mm区画化組織培養皿の中に置き（蓋をつけ
たまま）、倒立顕微鏡を用いてインサイチュでのコロニ
ーを記録した。コロニー数は、最も多い成熟型の赤血球
コロニー形成細胞由来（すなわちCFU−Ｅおよび成熟BFU
−Ｅ由来）のより小さい赤血球コロニーを含んでいた。
次いで、皿をさらに８〜10日間インキュベーターに戻し
た。この時間の最後で、より大きな赤血球コロニー（原
始BFU−Ｅ由来）、全顆粒球形成コロニー（CFU−GM由
来）、および多系統細胞含有コロニー（CFU−GEMM由
来）は同じ皿において最も容易に区別され、そして最も
正確に計数された。

調製物は、短期間（３日）および長期増殖アッセイに
おいてDNA合成を５〜10倍刺激することを示した。この
約23kDaの画分はまた、上述のようにして骨髄細胞およ
び臍帯血液細胞のメチルセルロースに基づくアッセイに
おいてCFU−GEMM、CFU−GM、およびBFU−Ｅ前駆細胞数
を増大させた。臍帯血由来CD34＋細胞をこの画分で処理
したとき、CD34＋/CD38−表現型を有する細胞の５倍の
増大が12日間にわたって観察された。

タンパク質スポットはまた、50mM NaClおよび100mM N
aClでMono Sカラムから溶出した物質の２−Ｄゲルから
切り出し、各画分を用いて刺激したPDL−１（CD34＋）
細胞を用いる標準コロニー形成アッセイを用いて生物活
性について分析した。あるいは、生物活性は、トリチウ
ム化チミジン取り込みまたは比色アッセイにより測定さ
れ得、これは上述したように、単離したばかりの34＋ま
たは当業者に公知の他の利用可能なCD34＋細胞を用いて
行われ得る。生物活性を、50mMで溶出したピークから同
定されたSAM.1反応性スポットおよび100mMで溶出したピ
ークから同定されたSAM.1反応性スポットについて測定
した。100mM画分における主要スポットのみが単離さ
れ、PDL−１生物活性アッセイにより、ポジティブであ
ることが分かった。これらのタンパク質を配列決定し、
いくつかは脂質結合性タンパク質であることが分かっ
た。

50mM画分からSCPFについて予想される分子量範囲に分
離した約13個のスポット（図21）もまた単離し、生物活
性についてテストした。ゲルのウエスタンブロットは、
いくつかのスポットがSAM.1抗体と相互作用することを
示した。伴ゲルをPVDFに対して電気ブロットし、そして
クマシーブルーで染色した（例えば、Coligan,ら,1992,
前出、Unit8.10,参考として援用）。スポット９は、抗
体ポジティブであり、これを伴われるPVDFブロットから
切り出した。スポット９はまた生物活性であることが見
出されたが、このタンパク質はＮ末端でブロックされて
いたので、配列分析を行うことはできなかった。スポッ
ト９におけるタンパク質の配列は現在では慣例的な方法
により決定され得、この方法としては、酵素分解フラグ
メント化およびタンパク質がブロックされるときに通常
用いられる標準法によるペプチド配列分析が挙げられ
る。このような方法は当業者に周知である。スポット８
は、SAM.1抗体とは反応性ではなかったが、PDL−１アッ
セイにおいて生物活性であった。スポット８の配列分析
は、これがマンガン（Mn）スーパーオキシドジスムター
ゼであることを明らかにした。

関連SCPFスポットのpIは、２−Ｄゲル電気泳動により
決定されるように、図20に示す。pIは、サンプルが尿素
で変性された後、２−Ｄゲルから決定した。（これは、
IEFにより分析した場合（ここではタンパク質は尿素で
変性されていない）の天然状態のタンパク質とは異な
る）。13個のスポットは約6.2〜7.8の範囲のpIおよび23
〜27kDa範囲のMWを有していた。

8.5 SCPFと種々のサイトカインに対する抗体との反応
性 SCPFが既に同定されたサイトカインであるかまたは新
規なタンパク質であるかを決定するために、ウエスタン
ブロット分析を行った。表12は、抗SAM.1、抗hIL−３、
抗hIL−11、抗hGM−CSF、抗hSCF、抗hIL−1a、抗hIL−
β、および抗hG−CSFとそれら自身（ポジティブコント
ロールとして）およびSCPFとの反応性の結果を示す。SA
M.1以外の抗体はどれもSCPFと反応しなかった。

9.細胞株の寄託 751細胞株およびML−１細胞株はアメリカンタイプカ
ルチャーコレクション（American Type Culture Collec
tion,Rockville,MD）に寄託されており、以下の受諾番
号を有する：細胞株 受諾番号 751−NA−15 CRL 10992 ML−１ CRL 11451 本発明は、本発明の個々の局面の１つの説明として意
図されている記載の特定の実施態様によって限定され
ず、そして機能的に等価な任意の細胞株、DNA構築物、
または因子は本発明の範囲内にある。実際、本明細書中
に示されそして記載されている説明に加えてなされる本
発明の種々の改変は、前述の記載および添付の図面から
当業者に明らかとなるものである。このような改変は添
付の請求の範囲の範囲内にあることが意図される。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ // Ａ６１Ｋ 38/22 Ａ６１Ｐ 7/00 39/395 35/00 Ａ６１Ｐ 7/00 (Ｃ１２Ｐ 21/00 35/00 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ａ６１Ｋ 37/24 (72)発明者 ローマン，パトリシア ディー. アメリカ合衆国 フロリダ 32817，オ ーランド，ミッション ベイ ブールバ ード 3396，アパートメント 187 (72)発明者 デンスロー，ナンシー ディー. アメリカ合衆国 フロリダ 32607，ゲ インズビル，エヌ．ダブリュー．７ティ ーエイチ プレイス 3515 (56)参考文献 特表 平７−508640（ＪＰ，Ａ) Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｆｏｒｕｍ，Ｖｏ ｌｕｍｅ 43，ｐａｇｅｓ 609−613 （1992) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 14/00 - 14/825 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (14)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下の特性を有するポリペプチドを含む幹
   細胞増殖因子（SCPF）： （ａ）ヒトCD34⁺骨髄幹細胞の増殖を刺激する； （ｂ）尿素の存在下での二次元ゲル電気泳動により決定
   された約23kDaの分子量を有する； （ｃ）ドデシル硫酸ナトリウムの存在下での一次元ポリ
   アクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）により決定
   された約27kDaの分子量を有する； （ｄ）尿素の存在下での二次元ゲル電気泳動により決定
   された約7.7の等電点を有する； （ｅ）尿素の非存在下でのフラットベッドゲル電気泳動
   により決定された約９の等電点を有する； （ｆ）CFU−GEMM由来の多系統細胞の増殖を刺激する；
   および、 （ｇ）MonoSに結合するが、DEAEセルロースにもCMセル
   ロースにも結合しない。
2. 【請求項２】胚細胞腫瘍株により産生される、請求項１
   に記載のSCPF。
3. 【請求項３】ATCCに寄託されて受託番号CRL 11451を有
   する細胞株ML−１により産生される、請求項１に記載の
   SCPF。
4. 【請求項４】請求項１に記載の幹細胞増殖因子に免疫特
   異的に結合する抗体フラグメントを産生する方法であっ
   て、請求項１に記載の幹細胞増殖因子に対する抗体を産
   生する工程、および該抗体から免疫特異的フラグメント
   を産生する工程を包含する、方法。
5. 【請求項５】請求項４に記載の方法によって調製された
   抗体または抗体フラグメントであって、請求項１に記載
   の幹細胞増殖因子に免疫特異的に結合する、抗体または
   抗体フラグメント。
6. 【請求項６】請求項１に記載の幹細胞増殖因子の存在を
   検出する方法であって、サンプルと請求項５に記載の抗
   体または抗体フラグメントとを接触させる工程、および
   該抗体または抗体フラグメントの結合を検出する工程を
   包含する、方法。
7. 【請求項７】請求項１に記載の幹細胞増殖因子を産生す
   る細胞の存在を検出する方法であって、サンプルと請求
   項５に記載の抗体または抗体フラグメントとを接触させ
   る工程、および該抗体または抗体フラグメントの結合を
   検出する工程を包含する、方法。
8. 【請求項８】前記細胞が、白血病細胞、再生不良性貧血
   細胞、異常ニューロン、または脾機能亢進と関連する細
   胞である、請求項７に記載の方法。
9. 【請求項９】前記抗体または抗体フラグメントが検出可
   能に標識されている、請求項６または７に記載の方法。
10. 【請求項１０】前記検出可能な標識が、ラジオアイソト
    ープ、蛍光性化合物、生物発光性化合物、化学発光性化
    合物、および酵素からなる群から選択される、請求項９
    に記載の方法。
11. 【請求項１１】ATCC受託番号CRL 11451を有し、かつ請
    求項１に記載の幹細胞増殖因子を産生する、ML−１とし
    て同定される、細胞株。
12. 【請求項１２】幹細胞増殖因子を産生する方法であっ
    て、請求項１に記載される特性を有する単離可能なポリ
    ペプチドの発現を可能にする条件下で、ATCC受託番号CR
    L 11451を有する細胞株ML−１から細胞を培養する工程
    を包含する、方法。
13. 【請求項１３】請求項１に記載の幹細胞増殖因子を含
    む、エクスビボでヒト骨髄幹細胞の増殖を刺激するため
    の組成物であって、ここで該刺激が該骨髄幹細胞を該幹
    細胞増殖因子と接触させることを包含する、組成物。
14. 【請求項１４】前記骨髄幹細胞がCD34⁺である、請求項1
    3に記載の組成物。