CN101074262B

CN101074262B - 一种重组抗fl单克隆抗体及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN101074262B
Application number: CN2007101014815A
Authority: CN
Inventors: 郭亚军; 候盛; 王皓; 倪华; 陶静
Original assignee: ANTIBODIES NATIONAL ENGINEERING RESEARCH CENTER
Current assignee: Antibodies National Engineering Research Center
Priority date: 2006-05-17
Filing date: 2007-04-23
Publication date: 2011-05-25
Anticipated expiration: 2027-04-23
Also published as: CN101074262A

Abstract

本发明提供了一种重组抗FL单克隆抗体，轻链可变区具有SEQ ID NO：1听示的氨基酸序列，重链可变区具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。本发明还公开了编码该抗体的DNA分子，表达该抗体的载体以及被该表达载体转化的真核宿主细胞。本发明提供的抗FL单克隆抗体能在FL类药物过程中快速检测受试者血清中FL的浓度，同时也能快速检测患有某些恶性疾患的患者血清中FL浓度。

Description

一种重组抗FL单克隆抗体及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及抗体技术领域。具体地说，本发明涉及一种新的重组抗FL单克隆抗体，及其制备方法和用途。

背景技术

Flt3 Ligand(fms-like tyrosine kinase 3)(FL)是一种有效的造血刺激因子，不论在体外还是体内，均可影响造血干祖细胞的增殖和分化。FL可以有效促进小鼠及人的DC(一种少量的具有诱导、调节免疫反应的抗原递呈细胞)增殖，因此其作为研究工具及治疗手段得到广泛深入的研究。

造血系统的稳定是多能干细胞自我更新并分化为造血祖细胞的过程。这些前体细胞定向分化、成熟为不同谱系的分化终末细胞，循环于外周的血液。造血干细胞的增殖和分化受多种可溶性和膜结合型生长因子与细胞表面特异性受体结合的调节。细胞因子的受体可以分为两群：具有内源性酪氨酸激酶活性及不具有酪氨酸激酶活性。前者，也称为酪氨酸激酶受体(TKR)，可与多种配体结合，调节造血。Flt3 ligand(FL)是最近证实的在体内外均可以有效促进造血干祖细胞增殖分化的因子。最近几年，生长因子越来越多的用于血液及肿瘤等疾病的治疗以及自体或同种异体骨髓移植前的动员。

FL可以影响多能造血干细胞、祖细胞以及淋巴系、髓系多种谱系细胞的生长。FL单独对干、祖细胞的刺激增殖作用比较弱，但可以增加对其他生长因子的反应。已经证实FL与多种集落刺激因子、白细胞介素及可溶性血小板生成素具有协同作用，可促进定向和原始祖细胞的生长和集落形成。

在正常个体，血清FL水平通常很低(＜100pg/ml)，远低于结构上相似的其它生长因子，如ckitL及CSF-1，后两者在血清中的水平分别为2-6ng/ml及2-4ng/ml。血清中FL水平在一些特异性影响干细胞库的造血功能异常的疾病会显著改变(如Fanconi贫血，获得性再障)，但在影响红系的造血疾病则无变化(如地中海贫血或红细胞发育不全)。获得性再障或Fanconi贫血的患者，血清FL水平显著提高(可达10ng/ml)，这可能是干细胞扩增需要而导致的代偿反应。免疫抑制、输血或骨髓移植治愈的患者，FL水平恢复正常。类似的，接受放疗或化疗的患者，血清FL则下降。在这样的状况下，血清FL水平可能增加以刺激显著减少的HPC的产生。

FL是有效的造血生长因子，在造血干细胞的增殖、分化、维持及长期重建中发挥重要作用。其对淋巴细胞的增殖具有较强的作用，对髓系细胞作用较弱，对红系细胞则无作用。FL对造血功能的调节具有不同的作用，与其它细胞因子联合可产生协同或拮抗的效应。因为FL具有扩增DC、NK、T及B细胞的能力，因此还可以发挥免疫佐剂的作用。更为重要和有意义的是FL能够在体内扩增DC。FL的性质使其可望成为肿瘤及感染性疾病生物/免疫治疗的工具。FL还可成为用于研究的工具及移植的治疗。我们期望不久的将来，FL能在这些领域发挥更有意义的影响。

在FL进行临床前研究及临床研究的过程中，以及将来成为药物后患者应用的过程中，均需要检测受试者(动物或人)或患者的血清FL浓度，在某些造血系统的恶性疾患中，FL可能会异常高表达，因此，在这类患者的诊疗过程中，也需要检测患者血清中FL浓度。所以迫切需要一种灵敏度高，能快速、有效检测FL类药物及FL的产品。

发明内容

本发明的需要解决的技术问题之一是提供一种重组的抗FL单克隆抗体，该抗体用于体外检测FL的浓度。

本发明需要解决的第二个技术问题是提供一种编码上述抗FL单克隆抗体的DNA分子。

本发明需要解决的第三个技术问题是提供一种表达载体。

本发明需要解决的第四个技术问题是提供一种真核宿主细胞。

本发明需要解决的第五个技术问题是提供一种上述单克隆抗体的用途。

本发明需要解决的第六个技术问题是提供一种该单克隆抗体的制备方法。

为达到上述发明目的，本发明一方面提供了一种重组的抗FL抗体，该抗体含有重链可变区和轻链可变区，其特征在于，轻链可变区具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，重链可变区具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

本发明另一方面提供了编码上述单克隆抗体的DNA分子。

在一个较佳的实例中，该DNA分子含有SEQID NO：3所示的编码所述单抗轻链可变区的核苷酸序列，以及SEQID NO：4所示的编码所述单抗重链可变区的核苷酸序列。

本发明第三方面提供了一种表达载体，该表达载体含有上述DNA序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列。

本发明第四方面提供了一种宿主细胞，其特征在于，它被上述表达载体转化。在一个较佳的实例中，该宿主细胞是CHO细胞。

本发明第五方而提供了一种抗FL单克隆抗体检测FL浓度的的方法，其特征在于，所述的方法为常规的ELISA法。

本发明第六方面提供了一种制备上述单克隆抗体的方法，其特征在于，该方法包括：

a)提供一表达载体，该表达载体含有上述DNA序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列；

b)用步骤a)所述的表达载体转化宿主细胞：

c)在适合所述单克隆抗体表达的条件下培养步骤b)所得的宿主细胞；和

d)分离纯化获得所述单克隆抗体。

本发明的优点在于本发明的单克隆抗体能在FL类药物进行临床前研究及临床研究的过程中，以及将来成为药物后患者应用的过程中，快速检测受试者(动物或人)或患者的血清中FL的浓度；同时在某些造血系统的恶性疾患中，异常高表达FL，本发明提供的单克隆抗体在这类患者的诊疗过程中，也能快速检测患者血清中FL浓度。本发明抗体用ELISA法检测FL特异性强、灵敏度高，优于市售抗体。

附图说明

图1：载体pMG18，并且标明了其中的元件及酶切位点，其中，hCMV pro为人巨细胞病毒主要早期启动子；Ck为人κ轻链恒定区基因；IgG1恒定区为人γ1重链恒定区基因；pA为多聚腺苷化信号；DHFR为二氢叶酸还原酶基因；AmpR为氨苄青霉素抗性基因。

图2：本发明所构建的pM载体，其中，Ck仍为人κ链(轻链)恒定区基因，IgG1 constant为小鼠γ1重链恒定区基因。

图3：本发明所构建的pM(H+L)载体，含有重组抗FL抗体重链全长和轻链全长基因。

图4：本发明抗FL单克隆抗体与市售抗体分别用于检测FL的灵敏度比较结果(■为本发明的单克隆抗体，○为市售抗体)。

具体实施方式

本发明涉及一种重组的抗FL抗体，该抗体包含重链可变区和轻链可变区，其特征在于，轻链可变区具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，重链可变区具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

单克隆抗体可用本领域技术人员熟知的各种方法来制得。例如，单克隆抗体可用杂交瘤方法(由Kohler等，Nature，256：495(1975)首先提出)制得，或用重组DNA方法(美国专利No.4,816,567)制得。单克隆抗体也可用例如Clackson等，Nature，352：624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)所述的技术从噬菌体抗体库中分离获得。

本发明还提供了编码本发明重组抗FL单克隆抗体的DNA分子。在一个较佳的实例中，该DNA分子含有SEQ ID NO：3所示的编码所述单抗轻链可变区的核苷酸序列，以及SEQ ID NO：4所示的编码所述单抗重链可变区的核苷酸序列。

在获得编码本发明重组抗FL单克隆抗体重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列后，通常可通过以下方法来制备本发明的单克隆抗体。

首先，提供含有编码本发明单克隆抗体的核苷酸序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列的表达载体。

编码本发明单克隆抗体的DNA序列可用本领域技术人员熟知的常规手段来制得。例如，可根据本发明公开的序列人工合成或用PCR法扩增得到编码该单克隆抗体重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列。然后，用本领域熟知的各种方法通过选择合适的酶切位点将这些核苷酸序列插入合适的表达载体中，使它们分别在表达载体所携带的重链恒定区编码序列和轻链恒定区编码序列之前，并使它们在同一阅读框内。

本发明中所用的表达载体是本领域技术人员已知的各种市售的表达载体，例如购自Qiagen和Promega公司的表达载体，以及可购得的表达载体pMG 18(《根据INCP-9质粒序列进行环境监测的工具的开发》(DEVELOPMENT OFTOOLS FORENVIRONMENTAL MONITORING BASED ON INCP-9PLASMIDS SEQUENCES)，A.Created，R.Krasowiak，M.Titok，C.M.ThomasSchool of Biological Sciences，University of Birmingham，Edgbaston，Birmingham B15 2TT，UK and Faculty of Biology，Dept of Microbiology，Belarus State UniversityScoring Av.4，Minsk 220080 Belarus)。

随后，用上述获得的表达载体转化合适的宿主细胞。“宿主细胞”一般包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞和哺乳动物细胞。在本发明中，较佳的宿主细胞是CHO细胞。用表达载体转化宿主细胞的方法有很多种，所用的转化程序取决于待转化的宿主。将异源多核苷酸导入哺乳动物细胞中的力一法是本领域所知的，其包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、Polybrene(1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物)介导转染、原生质体融合、电穿孔、脂质体介导转染以及将DNA直接显微注射到胞核中。在本发明中，较佳的方法是电穿孔法或脂质体介导法等，例如可采用Invitrogen公司的脂质体法试剂盒来转染CHO细胞。

然后，在适合本发明单克隆抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞，然后用常规的免疫球蛋白纯化步骤，如蛋白A-Sepharose羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、离子交换层析、疏水层析、分子筛层析或亲和层析等本领域技术人员熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的重组抗FL单克隆抗体。

所得单克隆抗体可用常规手段来鉴定。单克隆抗体的结合特异性可用免疫沉淀或体外结合试验(如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))来测定。单克隆抗体的结合亲和力例如可用Munson等，Anal.Biochem.，107：220(1980)的Scatchard分析来测定。

下面将结合实施例进一步详细地描述本发明。然而应当理解，列举这些实施例只是为了起说明作用，而并不是用来限制本发明。

尽管本发明描述了以下具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。

实施例中未标明来源的均为市售。

实施例1从抗体库中筛选FL的抗体基因可变区

1)鼠源抗体库的构建

Flt3 Ligand(购自R&D System)与弗氏佐剂免疫Balb/C小鼠，免疫4次后，小鼠血清1∶500稀释后与FL显强阳性反应，取免疫后小鼠脾脏，按照Marks等人J.Mol.Biol.，222，581-597.Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227，381-388.Haidaris CG等人J Immunol Methods.2001 Nov 1；257(1-2)：185-202，Griffiths，A.D.等人EMBO J.，13，3245-3260(1994).Nissim，A.等人EMBO J.，13，692-698(1994)中描述的方法，构建鼠源抗体库。

2)筛选

将复苏的抗体库菌株1毫升加入新鲜LB培养基14毫升，于50毫升三角瓶中37℃培养16小时。

12000rpm高速离心10分钟，将上清液转移至无菌的50毫升离心管中，保存备用。确保其滴度应在2×10¹¹以上。Flt3 Ligand作为抗原，用常规方法包被25毫升细胞培养瓶。包被后的细胞瓶中加入不少于3×10¹⁰噬菌体，37℃温育1小时。倒掉瓶中的液体，用10毫升加入了1％Tween-20的PBS洗涤培养瓶10次。在培养瓶中加入1毫升对数期的TG1细胞，37℃温育震荡培养16小时。

重复上段所述步骤4次。

将上述获得的细胞稀释至10⁵细胞/毫升后在加有0.1氨苄青霉素的1.5％琼脂平板上培养，获得单克隆。

取上述平板上的克隆在96孔深孔板上进行培养，每孔一个克隆，共作960个克隆(10块96孔板)。

将上述深孔板在96孔板离心机上5000RPM离心20分钟后，将上清转移到新的无菌深孔板，封口后保藏于4度备用。

取96孔板10块，每孔中加入FL(10微克/毫升)10微升常规包被后，分别加入上述保存的上清10微升，37℃温育1小时后用含有1％Tween-20的PBS洗涤20次。加入1微升HRP标记的羊抗M13单抗(购自Pharmacia公司)，37℃温育30分钟后用1％Tween-20的PBS洗涤10次。

加入含有0.025％DAB显色剂的PBS 200微升和1微升1％的H₂O₂，37℃温育显色20分钟后在读板机上读取595纳米处的光吸收。

根据光吸收读数确定显色反应强的孔，这些孔相对应的克隆即为亲和力较强的抗体可变区克隆。本试验结果共筛选出316个阳性克隆，根据其读数确定其中5个亲和力最强的克隆，用于下一步的研究。

3)抗体可变区编码序列向表达载体的克隆

使上述5个克隆的菌株在100毫升LB培养基中扩增，然后按照生产商说明书用Promega公司的质粒DNA抽提纯化试剂盒(

Plus SV Minipreps DNAPurification System)纯化质粒DNA。

用XbaI和NheI限制性酶酶切上述质粒DNA后在1.5％琼脂糖凝胶电泳上分离酶切片段，取417bp左右的带进行胶回收，所得片段即为重链可变区。PCR扩增后，进行序列测定。用XbaI和BsiWI限制性酶酶切上述质粒DNA后在1.5％琼脂糖凝胶电泳上分离酶切片段，取321bp左右的带进行胶回收，所得片段即为轻链可变区。PCR扩增后，进行序列测定。确定正确序列后，化学合成法合成轻链全长序列，5’端设计HindIII酶切位点，恒定区为小鼠κ轻链恒定区序列，3’端设计EcoRI酶切位点。

PCR法自小鼠脾细胞扩增IgG1重链恒定区序列，并将CH1起始氨基酸突变为Ala-Ser，同时含有了NheI酶切位点，3’端设计BamHI酶切位点，扩增后测序验证无误后，NheI和BamHI双酶切小鼠IgG1恒定区片段和pMG18，将小鼠IgG1恒定区连入pMG18，构建的新载体命名为pM。

用XbaI和NheI限制性酶酶切表达载体pM。该表达载体的酶切图谱如图2所示。然后将上述重链可变区插入该表达载体的XbaI/NheI位点中。同样，利用HindIII和EcoRI限制性酶将抗体轻链全长cDNA插入到pM载体的HindIII/EcoRI位点中，从而构建得到含有重组抗FL抗体重链全长和轻链全长基因的表达载体pM(H+L)，如图3所示。

4)CHO细胞的转染与重组克隆的筛选

上述构建的带有抗体基因的表达载体分别转化大肠杆菌DH5α菌株中接种于100毫升LB培养基中进行扩增，用Qiagen公司的超纯质粒DNA纯化试剂盒(Ultrapure Plasmid DNA Purification Kit)抽提纯化质粒DNA。采用Invitrogen公司的脂质体法试剂盒(lipofectamine 2000 transfection reagent，11668-027)，将上述纯化的质粒DNA转染CHO细胞，操作参照厂家的说明书进行。

转化的CHO细胞在MTX选择培养基上进行连续9周的选择，最后在96孔板上进行极限稀释培养，连续进行3次，进行单克隆化。

挑出的单克隆细胞系在RPMI 1640培养基上进行培养，对上清进行Western印迹试验，根据染色反应判断表达强度，挑选出12个表达强的克隆作为候选细胞株。

5)单克隆抗体的纯化

用Protein A亲和层析柱从细胞培养上清中直接分离纯化出上述单克隆抗体，经SDA-PAGE电泳证明，所得产物纯度大于90％。亲和层析的产物再次经过分子筛层析，获得了纯度＞98％的样品。将这些样品用于以下的进一步分析与研究中。

实施例2抗体基因在CHO细胞中的表达强度

将上述筛选得到的12个高表达候选克隆培养于10cm的组织培养皿中，如下所述用ELISA法测定抗体的表达量。将羊抗鼠IgG(Fc)包被于ELISA板，4℃过夜，经2％BSA于37℃封闭2小时，加入待测的培养上清和标准品(鼠IgG1)，37℃孵育2小时，加入HRP一羊抗鼠IgG(κ)进行结合反应，37℃孵育1小时，加入TMB于37℃作用10分钟，最后用H₂SO₄终止反应，测A₄₅₀值。下表1中显示了上述筛选获得的12个候选克隆的表达量。

表1候选克隆在CHO细胞中的表达量

细胞株编号	1A4	2B6	3C3	4D9	5E4	6F1	7G2	8H5	9A2	8F3	9F4	6D2	5F3
														表达量(微克/毫升)	179.4	142.6	112.9	256.4	178.9	143.8	201.5	301.4	273.1	132.9	283.2	142.9	129.3

从上表1可以看出，8H5，9F4和9A2具有很高的表达水平。

实施例3抗FL单克隆抗体基因的DNA测序

根据系谱，对上述获得的8H5细胞株的抗FL抗体基因进行DNA测序。结果如下：SEQ ID NO：3显示了其轻链可变区基因序列(5′到3′)321bp其推测的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：1中；SEQ ID NO：3显示了8H5重链可变区基因序列((5′到3′)417bp)，其推测的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：2中。

实施例4单克隆抗体亲和力研究

按以下方法对各克隆的细胞培养液进行纯化：10000rpm离心除去细胞和细胞碎片，100kD截留分子量的滤膜超滤浓缩至1/10体积，超滤缓冲液是100mMTris-HCl，pH7.5。过SPA-sepharose亲和层析柱，上样液为100mM Tris-HCl，pH7.5，洗脱液为20mM柠檬酸，pH3.0，100mM NaCl。分子筛(Sephadex G200)层析，洗脱液为100mM Tris-HCl，pH7.5，得纯品。

亲和力测定采用Scatchard分析法(Munson等人，1980，Anal.BioChem.，107：220)进行。结果表明，8H5，9F4和9A2三种单抗的亲和力分别达到6.32×10^-10，1.78×10^-9和8.2×10^-8。

实施例5抗FL单克隆抗体的对FL的检测试验以及与市售抗体的比较

1.试剂和材料

1.1 Flt3 Ligand(R&D，308-FK/CF)。

1.2本发明抗FL单抗：构建的工程细胞(8H5)经无血清发酵，proteinA亲和层析纯化获得。

1.3市售抗FL单抗，R&D，MAB308。

1.4羊抗人FL多克隆抗体(R&D，AF-308-NA)。

1.5驴抗羊IgG(H+L)多抗，HRP标记，Immuclub Lab.SA0060。

1.6 HRP显色底物：TMB，上海科华公司，分A液及B液，临用前，两者等体积混合。

1.7终止液：0.5 mol/L硫酸。

1.8 pH＝7.2的PBS：称取KH₂PO₄ 0.21g，NaCl 9.0g，Na₂HPO₄.12H₂O 0.97g，加注射用水溶解至1000ml。

1.9包被缓冲液：20mmol/l pH＝9.6的碳酸钠缓冲液。

1.10封闭缓冲液：称取3g牛血清白蛋白，加入pH7.2的PBS溶解至100ml。

1.11洗涤缓冲液：取1ml Tween20，加入PBS至1升。

2.方法：夹心ELISA法

2.1本发明重组抗FL单抗或市售单抗稀释于包被缓冲液中，浓度1.0μg/ml，包被96孔酶标板，0.1ml/well，37℃2h。

2.2洗涤：洗涤缓冲液洗涤2遍，每次均在吸水纸上拍干。

2.3封闭：封闭缓冲液加满孔后37℃2h。

2.4洗涤：洗涤缓冲液洗涤3遍，每次均在吸水纸上拍干。

2.5加抗原：加入用封闭缓冲液稀释至50，25，12.5，6.25，3.125(ng/mL)的Flt3 Ligand，0.1ml/well，设2复孔。

2.6 37℃2h。

2.7洗涤：洗涤缓冲液洗涤5遍，每次均在吸水纸上拍干。

2.8加入羊抗人Flt3 Ligand多抗：PBS 1∶1000稀释，37℃1h。

2.9洗涤：洗涤缓冲液洗涤5遍，每次均在吸水纸上拍干。

2.10加入HRP标记的驴抗羊抗体，PBS 1∶2000稀释，37℃1h。

2.11洗涤：洗涤缓冲液洗涤5遍，每次均在吸水纸上拍干。

2.12显色：加显色底物100μL/孔，避光显色5～20min(显色时间视显色情况而定)，加终止液50μL/孔。

2.13酶标仪读数：测量450nm光吸收，以630nm为参考波长。

2.14用标准品浓度(对数)与A450/630nm值做直线回归方程。

本发明抗体用该法检测Flt3 Ligand灵敏度高，可以达到3ng/mL，特异性强，而市售同类抗体检测Flt3 Ligand灵敏度只有30ng/ml。本发明抗体的灵敏度为市售抗体的10倍，如图4所示。

从以上结果可以看出，本发明抗体与市售抗体比较具有特异性强、亲和力高的优点，作为检测抗体，灵敏度高于市售抗体，因此，本发明抗体可以替代市售抗体用于制备检测FL浓度的试剂。

此外，市售的检测试剂盒通常是利用ELISA双抗体夹心法原理，预先将抗体包被于试剂盒中，用于检测相应的抗原物质，这种方法更加简便、快速。因此，本发明抗体也可以替代现有检测试剂盒中的包被抗体，用于制备检测FL浓度的试剂盒。

序列表

<110>上海中信国健药业有限公司

<120>一种重组抗FL单克隆抗体及其制备方法和用途

<150>CN200610026637.3

<151>2006-05-17

<160>4

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)...(107)

<223>轻链可变区氨基酸序列

<400>1

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Asn Gly Ser Gln Thr Leu Glu Ser Asn

20 25 30

Ala Gly Cys Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Thr Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Gln Ser Leu Arg Cys Ser Gly Leu Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ile Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Lys Tyr Phe Cys Pro His Phe Lys Met Leu Arg Leu

85 90 95

Lys Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210>2

<211>139

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)...(139)

<223>重链可变区氨基酸序列

<400>2

Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Met Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Trp Thr Tyr Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Gln Ile Pro Met Lys Pro Asp His Asp Ala Ser Asn His Ala Lys

50 55 60

Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser

65 70 75 80

Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Glu Asn Gly Ile Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Gly Ser Gly Asn Pro Ile Asp Asn Cys Gly His Gly Thr

100 105 110

Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Thr Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro

115 120 125

Leu Val Pro Gly Cys Ser Asp Thr Ser Gly Ser

130 135

<210>3

<211>321

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)...(321)

<223>轻链可变区核苷酸序列

<400>3

gacattgtgc tgacccagtc tcaaaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60

gtcacctgca acggcagtca gactttggaa agtaatgcag gctgctatca acagaaacca 120

ggtcaatctc ctaaaacact gatttactcg caatccttgc ggtgtagtgg actccctgat 180

cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcattctca ccatcagcaa tgtgcagtct 240

gaagacttgg caaaatattt ctgtccgcac tttaagatgt tacgcttaaa gttcggaggg 300

gggaccaagc tggaaattaa a 321

<210>4

<211>417

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)...(417)

<223>重链可变区核苷酸序列

<400>4

gaagtgaagc ttgaggagtc tggaggaggc ttggtgcatc ctggaggatc catgagactc 60

tcctgtgttg cctctggact cactttcagt aactactgga cgtactgggt ccgccagtct 120

ccagagaagg ggcttgagtg ggttgctgaa attccaatga aacctgatca tgatgcatca 180

aatcatgcga agactgtgaa agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaagtagt 240

gtctacctgc aaatgaataa cttaagagct gaagaaaatg gcatttatta ctgtaccggg 300

tccggcaatc ctatcgacaa ctgcggtcac ggaacctcag tcaccgtctc ttcagctaca 360

acaacagccc catctgtcta ccccttggtc cctggctgca gtgacacatc tggatcc 417

Claims

1.一种重组抗FL单克隆抗体，它包含重链可变区和轻链可变区，其特征在于，轻链可变区具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，重链可变区具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

2.一种DNA分子，其特征在于，它编码权利要求1所述的单克隆抗体。

3.权利要求2所述的DNA分子，其特征在于，该DNA分子含有SEQ ID NO：3所示的编码所述单抗轻链可变区的核苷酸序列，以及SEQ ID NO：4所示的编码所述单抗重链可变区的核苷酸序列。

4.一种表达载体，其特征在于，它含有权利要求2所述的DNA序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列。

5.一种真核宿主细胞，其特征在于，它被权利要求4所述的表达载体转化。

6.权利要求5所述的真核宿主细胞，其特征在于，它是CHO细胞。

7.一种制备权利要求1所述的单克隆抗体的方法，其特征在于，该方法包括：

a)提供一表达载体，该表达载体含有权利要求2所述的DNA序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列；

b)用步骤a)所述的表达载体转化真核宿主细胞；

c)在适合所述单克隆抗体表达的条件下培养步骤b)所得的真核宿主细胞；和

d)分离纯化获得所述单克隆抗体。

8.权利要求1所述的单克隆抗体在制备检测FL浓度的试剂中的应用。

9.权利要求1所述的单克隆抗体在制备检测FL浓度的试剂盒中的应用。