JP2004500902A - 切り詰められたｅｇｆレセプター - Google Patents

Abstract

本発明は、切り詰められたＥＧＦレセプター分子およびこれらの分子を含む薬学的組成物に関する。また本発明は、ＥＧＦレセプターリガンドをスクリーニングする方法およびこれらの分子の使用を含む治療方法にも関する。特に本発明は、全長のＥＧＦＲ細胞外ドメインと比較して少なくとも一つのＥＧＦＲリガンドに対して増大した結合親和性を有するように、ＣＲ２ドメインの実質的な部位を欠いた、切り詰められたＥＧＦＲ細胞外ドメインに関する。本発明は、乾癬、および乳房、脳、卵巣、頸、膵臓、肺、頭および首部のガン、および黒色腫、横紋筋肉腫、中皮腫および神経膠芽細胞腫を含むがこれらに限定されない腫瘍状態を治療または予防する方法を提供する。

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、切り詰められたＥＧＦレセプター分子およびこれらの分子を含む薬学的組成物に関する。また本発明は、ＥＧＦレセプターリガンドをスクリーニングする方法およびこれらの分子の使用を含む治療方法にも関する。
【０００２】
【従来の技術】
上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）ファミリーは、四つの別個のチロシンキナーゼレセプター、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ／ＥｒｂＢ１、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ２、ＨＥＲ３／ＥｒｂＢ３およびＨＥＲ４／ＥｒｂＢ４からなる（１）。これらのレセプターは、上皮、間葉およびニューロンの組織に広く発現され、発達と分化の際に重要な役割を演じる。これらは、ＥＧＦＲホモローグのホモ−またはヘテロ−二量体化（ｄｉｍｅｒｉｓａｔｉｏｎ）を誘導する少なくとも１２のリガンドのファミリーによって活性化される。ＥｒｂＢ２は、それ自体にリガンドを結合させることはできないが、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ／ＥｒｂＢファミリーの他のメンバーと共発現された場合には、全てのリガンドにとっての強力なコレセプターである。
【０００３】
ＥＧＦＲは、大きな（１１８６残基）、非触媒性制御領域に隣接した単一トランスメンブレン領域と細胞質チロシンキナーゼドメインとを備えた単量体糖タンパクである。配列分析により、細胞外ドメイン（残基１−６２１）が４つのサブドメイン、ここではＬ１、ＣＲ１、Ｌ２およびＣＲ２と称する（ＬおよびＣＲはそれぞれ大きい（ｌａｒｇｅ）およびＣｙｓ−リッチ（Ｃｙｓ−ｒｉｃｈ）の頭文字である）、を含むことが示された（２，３）。Ｌ１およびＬ２ドメインは、それぞれドメインＩおよびＩＩＩとも称される（４）。ＣＲドメインは、以前は、ドメインＩＩおよびＩＶ（４）、またはＳ１．１−Ｓ１．３およびＳ２．１−Ｓ２．３（Ｓは小さい（ｓｍａｌｌ）の略である）（２）と称されていた。
【０００４】
多くのガン細胞が、活性型ＥＧＦＲ（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｌｙ ａｃｔｉｖｅ ＥＧＦＲ）（５）または他のＥＧＦＲファミリーメンバー（６）を発現する。高レベルの活性化ＥＧＦＲが、膀胱、乳房、肺および脳の腫瘍に生じる。ＥＧＦＲに対する抗体は、ＥＧＦＲのリガンド活性化、および多くの上皮細胞系統の成長を阻害することができる。ヒト化キメラ抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体（Ｍａｂ）の繰り返し投与を受けた患者は、疾患安定の徴候を示した。大量投与の必要性、およびヒト化Ｍａｂの生産コストから、この種の治療の適用が制限され得る。これらの知見は、ＥＧＦレセプターアンタゴニストの開発が、魅力的な抗ガン剤であるかもしれないことを示唆している。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本願発明者らは、ＥＧＦＲ細胞外ドメインのＣＲ２ドメインにおける残基の欠失が、（ＥＧＦ）のような上皮成長因子および／またはトランスフォーミング成長因子−α（ＴＧＦ−α）に対して増強された親和性を備えた切り詰められた（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）細胞外ドメインを生じるという驚くべき知見を得た。この知見は、ＣＲ２領域における欠失または変異が、ＥＧＦに対するＥＧＦＲ結合親和性を低減することを示した最近報告された結果（８）に反するものである。
【０００６】
当業者であれば理解できるように、本発明の切り詰められたＥＧＦＲ細胞外ドメインは、ＥＧＦレセプターのリガンドのスクリーニングアッセイにおいて、大きな感度（鋭敏度）を示すことができる。さらに、本発明の切り詰められたＥＧＦＲ細胞外ドメインは、そのリガンドに対する高い親和性、および、そのｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＥＧＦ誘導増殖反応を競合的に阻害する能力から、治療可能性を有する。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
従って、本発明の第一の態様は、切り詰められたＥＧＦＲ細胞外ドメインを提供し、この切り詰められたＥＧＦＲ細胞外ドメインはＣＲ２ドメインの実質的な部位を欠き、この切り詰められたＥＧＦＲ細胞外ドメインは、全長のＥＧＦＲ細胞外ドメインと比較して、少なくとも一つのＥＧＦＲリガンドに対して増大した結合親和性を有する。
【０００８】
このＥＧＦＲリガンドは、例えば、アンフィレグリン（ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）、ヘパリン結合ＥＧＦ、β−セルリン、ＥＧＦまたはＴＧＦ−αとすることができる。第一の態様の好ましい実施態様では、切り詰められたＥＧＦＲ細胞外ドメインは、ＥＧＦおよび／またはＴＧＦ−αに対する増大した結合親和性を有する。
【０００９】
第一の態様のさらに好ましい実施態様では、切り詰められたＥＧＦＲ細胞外ドメインは、ＣＲ２ドメインの少なくとも第３から第７モジュールを欠失したものである。さらに好ましい実施態様では、この切り詰められたＥＧＦＲ細胞外ドメインは、ＣＲ２ドメインの少なくとも第２から第７モジュールを欠失したものである。この切り詰められたＥＧＦＲ細胞外ドメインは、ＣＲ２ドメインの第１モジュールの一部をさらに欠失したものであってもよい。
【００１０】
さらに好ましい実施態様では、切り詰められたＥＧＦＲ細胞外ドメインが、残基５１４−６２１を欠失したものである。さらに好ましい実施態様では、この切り詰められたＥＧＦＲ細胞外ドメインが、残基５０２−６２１を欠失したものである。
【００１１】
さらなる欠失または変異が、本発明の切り詰められたＥＧＦＲ細胞外ドメインのＬ１、ＣＲ１および／またはＬ２サブドメインに成されてもよい。ただし、これらのさらなる欠失または変異は、切り詰められたＥＧＦＲ細胞外ドメインの結合親和性に実質的に影響しないことを条件とする。好ましくは、しかしながら、本発明の切り詰められたＥＧＦＲ細胞外ドメインは、Ｌ１、ＣＲ１およびＬ２サブドメインを含む。
【００１２】
さらに好ましい実施態様では、切り詰められたＥＧＦＲ細胞外ドメインが、ＥＧＦＲ細胞外ドメインの残基１−４９２を含む。より好ましくは、切り詰められたＥＧＦＲ細胞外ドメインが、ＥＧＦＲ細胞外ドメインの残基１−５０１または残基１−５１３を含む。
【００１３】
さらに好ましい実施態様では、切り詰められたＥＧＦＲ細胞外ドメインが、Ｋ_ｄが３０ｎＭ未満、さらに好ましくは２５ｎＭ未満であるような、ＥＧＦに対する親和性を備える。
【００１４】
さらに好ましい実施態様では、切り詰められたＥＧＦＲ細胞外ドメインが、Ｋ_ｄが４５ｎＭ未満、さらに好ましくは４０ｎＭ未満であるような、ＴＧＦ−αに対する親和性を有する。
【００１５】
第二の態様では、本発明は、第一の態様の切り詰められたＥＧＦＲ細胞外ドメインをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００１６】
第三の態様では、本発明は、第二の態様のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。
【００１７】
第四の態様では、本発明は、第三の態様の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００１８】
第五の態様では、本発明は、第一の態様の切り詰められたＥＧＦＲ細胞外ドメインを産生する方法を提供し、この方法は、切り詰められたＥＧＦＲ細胞外ドメインの産生を可能にする条件下で第四の態様の宿主細胞を培養すること、および当該切り詰められたＥＧＦＲ細胞外ドメインを単離することを含む。
【００１９】
第六の態様では、本発明は第一の態様にかかる切り詰められたＥＧＦＲ細胞外ドメインと、薬学的に許容できるキャリアーまたは希釈剤とを含む薬学的組成物を提供する。
【００２０】
第七の態様では、本発明は、推定化合物を、ＥＧＦレセプターの活性を変更する能力に関してスクリーニングする方法を提供し、この方法は、推定化合物を、第一の態様にかかる切り詰められたＥＧＦＲ細胞外ドメインに曝し、かつ、この切り詰められたＥＧＦＲ細胞外ドメインの活性をモニタリングすることを含む。
【００２１】
第七の態様に関連して、適切なアッセイ処理が、マイクロプレートフォーマットで競合結合アッセイを含んでもよく、ここでは推定化合物が、切り詰められたＥＧＦレセプター細胞外ドメインに対するＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２のようなラベル化リガンドの結合を阻害する能力について調べられる。ラベルは、^１２５Ｉのようなラジオラベル化タグ、またはフルオレセインイソチオシアナートのような蛍光タグ、またはユーロピウムのようなランタニドイオンとすることができる。
【００２２】
第八の態様では、本発明は、患者のＥＧＦレセプターファミリーの分子によるシグナリングと関連した疾患を治療または予防する方法を提供し、この方法は、第一の態様にかかる切り詰められたＥＧＦＲ細胞外ドメインを患者に投与することを含む。
【００２３】
第八の態様の好ましい実施態様では、ＥＧＦレセプターファミリーの分子によるシグナリングと関連した疾患は、乾癬、および乳房、脳、卵巣、頸、膵臓、肺、頭および首部のガン、および黒色腫、横紋筋肉腫、中皮腫および神経膠芽細胞腫を含むがこれらに限定されない腫瘍状態から選択される。
【００２４】
第八の態様の方法は、単独で、または、他の治療法と組み合わせて用いることができる。例えば、第四の態様の方法は、腫瘍状態の治療における、抗ＥＧＦＲ抗体のような細胞傷害モダリティー、放射線療法または化学療法と組み合わせて用いることができる。
【００２５】
【発明の実施の形態】
ここで用いるにあたり、用語“ＥＧＦＲ”は、ＥＧＦレセプター、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ４のようなＥＧＦレセプターファミリーのメンバーを含むと解される。一般に、ＥＧＦレセプターファミリー分子は、類似のドメイン配列を示し、顕著な配列同一性、好ましくは少なくとも４０％の同一性を占める。
【００２６】
ここで用いるにあたり、用語“全長のＥＧＦＲ細胞外ドメイン”は、ＥＧＦレセプターの残基１−６２１からなる細胞外ドメインを指す。全長の細胞外ドメインのアミノ酸配列は、以前に記載されている（１３）。全長の細胞外ドメインは、Ｌ１、ＣＲ１、Ｌ２およびＣＲ２と称する４つのサブドメインを含む。ここで、ＬおよびＣＲはそれぞれ大きい（ｌａｒｇｅ）およびＣｙｓ−リッチ（Ｃｙｓ−ｒｉｃｈ）の頭文字である。
【００２７】
ＣＲ２サブドメインは、２または３のアミノ酸残基のリンカーにより連結され、以下のシステイン残基により結合された、以下の７つのモジュールからなる。
第１モジュール： ｃｙｓ残基 ４８２−４９９
第２モジュール： ｃｙｓ残基 ５０２−５１１
第３モジュール： ｃｙｓ残基 ５１５−５３１
第４モジュール： ｃｙｓ残基 ５３４−５５５
第５モジュール： ｃｙｓ残基 ５５８−５６７
第６モジュール： ｃｙｓ残基 ５７１−５９３
第７モジュール： ｃｙｓ残基 ５９６−６１２
【００２８】
ここに示された結果は、ＥＧＦＲ細胞外ドメインのＣＲ２領域における欠失が、ＥＧＦおよび／またはＴＧＦ−αの細胞外ドメインの結合親和性を予期することなく増加させることを示す。この情報を考慮すると、当業者であれば、多数の候補の切り詰められた細胞外ドメインを容易に生成し、これらの候補について、増加したリガンド親和性および治療能力をスクリーニングすることができる。
【００２９】
例えば、切り詰められた細胞外ドメインは、ここに記載または先に記載（８）されたような、組み換えＤＮＡ技術により調製することもできる。あるいは、切り詰められた細胞外ドメインは、全長の細胞外ドメインまたは全長のレセプターを、先に記載（９）されたような制限されたタンパク分解で処理することによっても調製できる。
【００３０】
結合親和性および阻害力は、バイオセンサー技術を用いて、切り詰められた細胞外ドメインの候補について測定することができる。
【００３１】
本発明の切り詰められたＥＧＦＲ細胞外ドメインは、実質的に単離された形態とすることができる。このタンパクは、タンパクの所望の目的を妨げないキャリアーまたは希釈剤と混合されてもよく、また、実質的に単離されたものであってもよい。本発明の切り詰められた細胞外ドメインは、実質的に精製された形態であってもよく、その場合には、調製物中にタンパクを９０％より多く含み、例えば、本発明のタンパクが、調製物中に９５％、９８％または９９％とされる。
【００３２】
本発明の内容において、切り詰められたＥＧＦＲ細胞外ドメインのアミノ酸配列は変性されてもよい。但し、その変性が、少なくとも一つのＥＧＦＲリガンドに関する、前記切り詰められた細胞外ドメインの結合親和性に負の影響を与えないことが条件である。例えば、変性された細胞外ドメインは、結合活性に必要でない、残基または配列の種々の置換、もしくは末端または内部残基または配列の欠失により、作製することができる。一般的に、置換は保存的に成されるべきである。すなわち、最も好ましい置換アミノ酸は、置換される残基と似た物理化学的特徴を有するものである。同様に、欠失または挿入法を用いる場合には、生物学的活性に与える欠失または挿入の可能性のある効果を考慮すべきである。切り詰められた細胞外ドメインの生物学的活性を保存するために、欠失および置換は、相同または保存的に置換された配列に行われ、これはすなわち所定の残基が生物学的に類似の残基で置換されることを意味する。保存的置換の例は、一つの脂肪残基を別のものと置換、例えばＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＭｅｔまたはＡｌａ同士で置換すること、または一つの極性残基を別のものと置換、例えばＬｙｓとＡｒｇの間、ＧｌｕとＡｓｐの間、またはＧｌｎとＡｓｎの間で置換することを含む。他のかかる保存的置換、例えば、類似の疎水特性を有する全体領域の置換が周知である。さらに、ヒト、マウスおよび他の哺乳動物のＥＧＦＲ間のアミノ酸の差異は、切り詰められたＥＧＦＲ細胞外ドメインの本質的な生物学的特徴を変更することなく行うことができるさらなる保存的置換を示唆している。
【００３３】
本発明に包含される変性は、結合親和性を維持する一次タンパクの種々の構造形態を含む。イオン化しうるアミノおよびカルボキシル基の存在により、例えば切り詰められた細胞外ドメインは、酸性または塩基性の塩の形態であってもよく、また、中性の形態であってもよい。また、個々のアミノ酸残基が、酸化または還元により変性されてもよい。
【００３４】
一次アミノ酸構造は、他の化学種、例えば、グリコシル基、脂質、ホスファート、アセチル基等と共有的または集合的接合を形成することにより、または、アミノ酸配列変異体を作製することにより変性することもできる。本発明の範囲内に含まれる他の変性は、例えば、Ｎ末端またはＣ末端融合のような組み換え培養における合成による、切り詰められた細胞外ドメインと、他のタンパクまたはポリペプチドとの共有的または集合的接合を含む。例えば、接合したポリペプチドは、タンパクのＮ末端領域におけるシグナル（またはリーダー）ポリペプチド配列であってもよい。これは、翻訳時または翻訳後に、タンパクの合成部位から、細胞膜または壁の内部または外部の機能部位へと、タンパクを輸送させる（例えば、イーストα−因子リーダー）。切り詰められたＥＧＦＲ細胞外融合物は、切り詰められた細胞外ドメインの精製または同定を容易にするため（例えばポリＨｉｓ）、またはｉｎ ｖｉｖｏで細胞外ドメインの安定性または輸送を増強するために添加されたペプチドを含んでもよい。
【００３５】
また、本発明の切り詰められたＥＧＦＲ細胞外ドメインは、イムノグロブリン分子の定常ドメインに融合されてもよい。例えば、イムノグロブリン分子重鎖および軽鎖のいずれかまたは両方の可変ドメインに代えて置換された切り詰められたＥＧＦＲ細胞外ドメイン、および、未変性の定常領域ドメインを有する組み換えキメラ抗体分子が産生されてもよい。これは、二価に示された切り詰められたＥＧＦＲ細胞外ドメインを有する単一のキメラ抗体を生じてもよい。切り詰められたＥＧＦＲ細胞外ドメインのかかる多価形態は、増強されたＥＧＦＲリガンドの結合親和性を有する。かかるキメラ抗体分子の構成に関する詳細は、ＷＯ８９／０９６２２およびＥＰ３１５０６２に開示されている。
【００３６】
ＴＧＦαは膜結合型で存在するので、本発明の切り詰められた細胞外ドメインは、ガン細胞に化合物を仕向けるために用いることができる。従って、切り詰められたＥＧＦＲ細胞外ドメイン融合物は、薬剤、アイソトープまたは毒素のようなガン細胞の診断または治療に用いられる化合物を含むことができる。
【００３７】
切り詰められたＥＧＦＲ細胞外ドメイン誘導体は、システインおよびリシン残基において、Ｍ−マレイミドベンゾイルスクシニミドエステルおよびＮ−ヒドロキシスクシニミドのような架橋結合剤によって得ることもできる。切り詰められた細胞外ドメインは、例えば、臭化シアン活性化、ビスオキシラン（ｂｉｓｏｘｉｒａｎｅ）活性化、カルボニルジイミダゾール活性化、またはトシル活性化アガロース構造のような種々の不溶性基質に対して反応性側鎖基を介して、あるいは、ポリオレフィン表面に対して（グルタルアルデヒド架橋結合を伴うまたは伴わずに）吸着させることにより、共有結合されてもよい。基質に結合したら、切り詰められた細胞外ドメインは、抗ＥＧＦＲ抗体またはＥＧＦに選択的に結合（アッセイまたは精製の目的で）させるために用いることができる。
【００３８】
構造的に束縛された本発明の細胞外ドメインの誘導体を用いることも望ましい。構造的束縛とは、ペプチドによって呈される三次元形状の安定性および好ましいコンホメーションを指す。構造的束縛は、ペプチドの一残基のコンホメーション可動性を制限することを含む局所的束縛；一部の二次構造ユニットを形成しうる残基の一つの基のコンホメーション可動性を制限することを含む領域的束縛；および全体的なペプチド構造に関与する全体的な束縛を含む。
【００３９】
本発明の切り詰められたＥＧＦＲ細胞外ドメインは、免疫原、レセプターベースのイムノアッセイ試薬、または、ＥＧＦまたは他の結合リガンドの親和精製処理の結合試薬として用いることができると解される。
【００４０】
切り詰められたＥＧＦＲ細胞外ドメインは、安定にトランスフェクトされたＥＧＦ応答性レポーター遺伝子を取り込む細胞ベースのアッセイを用いて、レセプター活性を変更する能力について調べることができる（１０）。このアッセイは、新たなリガンドの存在下における、レポーター遺伝子を活性化するＥＧＦの能力に関する。極めて敏感な検出システム（化学発光）を用いて、高速（６−８時間以内のホルモン暴露で結果を生じる）、高処理能力（アッセイは、自動化計測用の９６ウェルフォーマットで行われる）の分析法を与える。候補化合物が同定されたら、ＥＧＦ−Ｒを介したシグナル伝達と拮抗するそれらの能力について、ＥＧＦ媒介細胞増殖の阻害のような、多数の機械的なｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞アッセイを用いて評価することができる。最後に、腫瘍治療剤としての切り詰められたＥＧＦＲ細胞外ドメインの効力を、記載されているように（１１、１２）、腫瘍の同系移植片および異種移植片を有する動物においてｉｎ ｖｉｔｒｏで試験することができる。
【００４１】
本発明の切り詰められたＥＧＦＲ細胞外ドメイン（および本発明のアッセイ方法によって同定された物質）は、好ましくは、本発明の組成物を成すために、種々の成分と組み合わせられてもよい。好ましくは、組成物は、薬学的組成物（ヒトまたは動物に使用される）を生成するために、薬学的に許容できるキャリアーまたは希釈剤と組み合わせられる。適切なキャリアーおよび希釈剤は、例えばリン酸塩緩衝生理食塩水のような等張生理食塩水を含む。この組成物は、例えば、非経口、筋肉内、静脈内、皮下、眼内、経口または経皮的投与用に製剤化することができる。通常、各タンパクは、０．０１〜３０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ、さらに好ましくは０．１〜１ｍｇ／ｋｇ体重の投与量で投与することができる。
【００４２】
上記投与経路および投与量は、医師が特定の患者および状態について最適な投与経路および投与量を容易に決定できるものであることから、指針に過ぎない。本発明の切り詰められたＥＧＦＲ細胞外ドメインがＥＧＦＲリガンドに強く結合できる能力から、切り詰められた細胞外ドメインは、ＥＧＦＲリガンドの診断アッセイ、および診断および治療に使用するためのＥＧＦＲに対する抗体を生じることに有益である。さらに、精製された切り詰められたＥＧＦＲ細胞外ドメインは、直接的に治療に用いられて、ＥＧＦＲリガンドを結合または取り除き、その結果、これらのリガンドの活性を制御する手段を提供する。特に、本発明の切り詰められたＥＧＦＲ細胞外ドメインは、ＥＧＦ依存反応を阻害する目的で投与することができる。
【００４３】
この明細書を通して、用語“含む”は、記載の成分、数または工程、あるいは成分、数または工程の群の包含を意味するが、その他の成分、数または工程、あるいは成分、数または工程の群の排除を意味するものではないと解する。
【００４４】
本願明細書に含まれる刊行物、作用、物質、装置、物品などに関するあらゆる議論は、本発明の内容を提供するためのものに過ぎない。これらのいずれかまたは全ての事項が、本願の各クレームの優先日以前にオーストラリアに存在していたことから、従来技術の水準の一部を形成し本発明の属する分野の常識であるとされることには承認できるものではない。
【００４５】
実験の詳細
材料と方法
切り詰められた形態のｈＥＧＦＲ細胞外ドメインの発現に使用されるプラスミドの作製。切り詰められたｈＥＧＦＲ ｃＤＮＡの作製に用いられたプラスミドｐＥＧＦＲは、プラスミドｐＵＣ１８の多重クローニング部位にｈＥＧＦＲのヌクレオチド１６７−３９７０を含む（１３）。コーディングは、ＬａｃＺαペプチドに対して反対のセンスであり、挿入はｐＵＣ１８のＸｂａＩ部位の下流である。このプラスミドを、哺乳動物の発現ベクターｐＥＥ１４に挿入するための切り詰められた構成物の切除の際に後で用いた。
【００４６】
ｐＥＧＦＲ４７６の作製。ｈＥＧＦＲのヌクレオチド１６７−３１５０を含有する最初のプラスミドを、ｐＥＧＦＲからのＸｂａＩ／ＮｓｉＩフラグメントとＸｂａＩ／ＰｓｔＩ−切断ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ＋とのライゲーションにより作製した。このプラスミドから、４ｋｂｐのフラグメントＢｂｓＩ／ＢｇｌＩＩフラグメント（全体のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ＋とＥＧＦＲのヌクレオチド１６７−１１５０および２９５１−３１５０を含む）と、５２８ｂｐ ＢｂｓＩ／ＰｖｕＩＩフラグメント（ヌクレオチド１１５１−１６７９）を、ｈＥＧＦＲのアミノ酸４７４−４７６、エンテロキナーゼ切断部位、および精製を容易にするためのｃ−ｍｙｃエピトープタグをコードする７０ｂｐ ＰＣＲ誘導ＰｖｕＩＩおよびＢｇｌＩＩフラグメントを用いてリゲートした。前記７０ｂｐのＰＣＲカセットは、鋳型として類似する先の構成物（１５）を用いて作製した。哺乳動物細胞トランスフェクション用のプラスミド、ｐＥＧＦＲ４７６は、１．６ｋｂｐ ＸｂａＩ／ＥｃｏＲＶフラグメントのＸｂａＩ／ＳｍａＩ−切断ｐＥＥ１４を用いたライゲーションにより、前記プラスミドから作製した。
【００４７】
ｐＥＧＦＲ５０１およびｐＥＧＦＲ５１３の作製。いずれの作製においても、３つのオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲを用いて、ｈＥＧＦＲ ｃＤＮＡのフラグメント（それぞれ、ヌクレオチド１１２１〜１７６０または１１２１〜１７９７）、それに続くエンテロキナーゼ切断部位、ｃ−ｍｙｃエピトープタグ、および終止コドンをコードする配列を製造した。ＰＣＲの上流プライマーは、ｈＥＧＦＲ ｃＤＮＡのヌクレオチド１１２１−１１４０の任意の選択に対応するが、二つの重複する下流プライマーは、それぞれヌクレオチド１７６０または１７９７に隣接するさらなる配列を構成するように用いられた。このＰＣＲ産物を、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてクローン化した。いずれの場合も、これによって、ｈＥＧＦＲのヌクレオチド１７３８から始まる新たに作製された配列を有するＡｐａＩフラグメントを切断することが可能となり、これが後に、ｐＥＧＦＲの巨大なＡｐａＩフラグメント（ヌクレオチド１７３７までのｈＥＧＦＲ ｃＤＮＡを備えた全体のｐＵＣ１８配列を含む）に挿入されて、コード配列に隣接するＸｂａＩ制限部位を備えた切り詰められたｈＥＧＦＲをコードするプラスミドを調製する。これらのｐＵＣ１８ベースのプラスミドから、切り詰められたｈＥＧＦＲ ｃＤＮＡを有するフラグメントをＸｂａＩ切断によって切断し、プラスミドｐＥＥ１４のＸｂａＩ部位に挿入し、哺乳動物細胞トランスフェクション用のプラスミドｐＥＧＦＲ５０１およびｐＥＧＦＲ５１３をそれぞれ調製した。
【００４８】
突然変異誘発。ｐＥＧＦＲ５０１の切り詰められたｈＥＧＦＲ ｃＤＮＡを有する１．７ｋｂｐのフラグメントを、突然変異誘発のためにＭ１３ｍｐ１８（１６）に導入した。ＵＳＢ−Ｔ７ ＧｅｎＴＭ ｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発キットを用いて、オリゴヌクレオチド指向ｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発を行って、切り詰められたヒトｓＥＧＦＲ５０１細胞外ドメインの３つの単一部位変異体を生じた。すなわち、残基Ｇｌｕ３６７、Ｇｌｙ４４１およびＧｌｕ４７２をそれぞれ、Ｌｙｓに変異させて、ニワトリのＥＧＦＲの対応する残基に調和させた（４）。変異を含むクローンを、プローブとして^３２Ｐ−ラベル化変異原オリゴヌクレオチドを用いたコロニーハイブリダイゼーション（１７）によって同定し、変異をＤＮＡ配列分析によって確認した（１８）。哺乳動物細胞発現のためのビヒクルは、ＸｂａＩ切断によりＭ１３ ＲＦ−ＤＮＡから変異ｓＥＧＦＲ５０１ ｃＤＮＡを有する１．７ｋｂｐフラグメントを切断し、プラスミドｐＥＥ１４（１６）のＸｂａＩ部位にそれを挿入することによって各変異体について生成した。
【００４９】
細胞培養、ＤＮＡトランスフェクションおよびタンパク分析。一時的トランスフェクションアッセイのために、１０％の胎児ウシ血清（ＦＣＳ）を添加したＤＭＥＭに維持したヒト２９３Ｔ繊維芽細胞を、製造者の指示するところに従ってＦｕＧＥＮＥ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｓｙｄｎｅｙ， ＮＳＷ）を用いてプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。上清を、トランスフェクションから４８時間後に回収し、細胞溶解物をＮＰ−４０溶解バッファーに調製した。分泌されたＥＧＦＲ変異体を特徴決定するために、上清および溶解物の分注物を、ｃ−ｍｙｃタグへのモノクローナル抗体（９Ｅ１０）、またはＭａｂ２２５（ＨＢ−８５０８， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、すなわちｈＥＧＦＲの細胞外ドメインを認識する構造依存モノクローナル抗体（１９）で免疫沈降させた。免疫複合体を、プロテインＡ−セファロースビーズ（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｂｉｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｔｙ． Ｌｔｄ．， Ｇｙｍｅａ， ＮＳＷ）で回収し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（１０％ゲル）で分画しニトロセルロース膜に移した。切り詰められたｈＥＧＦＲ細胞外ドメインと変異体を、膜にホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−接合Ｍａｂ９Ｅ１０（Ｒｏｃｈｅ）でプロービングし、Ｐｉｅｒｃｅ Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ基質で化学発光検出することによって同定した。
【００５０】
ｓＥＧＦＲ５０１を発現する安定な細胞系統を、選択可能なマーカーとしてグルタミンシンテターゼを用いて、ＣＨＯＫ（７）からＬｅｃ８変異細胞系統に確立した（１５）。メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）耐性細胞コロニーの上清を、バイオセンサー分析によって（以下参照）、またはニトロセルロースへのドットブロッティングおよびＨＲＰ−Ｍａｂ９Ｅ１０でプロービングすることによって、分泌されたレセプターに関してスクリーニングした。単一の細胞系統を、限界希釈によってクローニングのために選択した。
【００５１】
ｓＥＧＦＲ５０１タンパクを発現するＬｅｃ８細胞を、１．７Ｌの作動容積で、７０ｇのＦｉｂｒａ−Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｋｓを用いて、Ｃｅｌｌｉｇｅｎ Ｐｌｕｓバイオリアクター（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ， ＵＳＡ）で培養した。非必須アミノ酸、ヌクレオシドおよび１０％ＦＣＳを添加したグルタミンを含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を用いた連続潅流培養を、６週間行った。選択圧は、発酵の間、２５μＭ ＭＳＸで維持した。潅流速度は、残留グルコースレベルが１．０−１．５ｇ／Ｌ、対応する乳酸濃度が２．０−２．３ｇ／Ｌとするのに必要な値に調節した。
【００５２】
切り詰められたＥＧＦＲ細胞外ドメインの精製。バイオセンサーおよびＡＵＣ分析のために、ｓＥＧＦＲ切り詰められたタンパク（４Ｌ）を含有する調整培地を、アジ化ナトリウム（０．０２％（ｗ／ｖ））を含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ）（ＴＢＳＡ）でｐＨ８．０に調節し、遠心して微粒子を除いてから、アガロースに共有結合したモノクローナル抗体９Ｅ１０のカラムで４℃で親和的精製により、ペプチド溶出を用いて、ｃ−ｍｙｃ−タグタンパクを回収した（１５）。溶出したタンパクを、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００（ＨＲ１０／３０， Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）で、室温で、ＴＢＳＡバッファーを用いて、０．８ｍｌ／分の流速で、サイズ排除クロマトグラフィーによりさらに精製した。タンパクを、２８０ｎｍの吸収により検出した。
【００５３】
ＢＩＡｃｏｒｅ結合アッセイ。タンパク−タンパク相互作用を、表面プラスモン共鳴検出（ＢＩＡｃｏｒｅ ２０００または３０００， ＢＩＡｃｏｒｅ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、機器光学バイオセンサーで、リアルタイムにモニタした。組み換えｈＥＧＦまたはｈＴＧＦ−α（Ｇｒｏｐｅｐ， Ａｄｅｌａｉｄｅ， Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を、先に記載されているように（２０）、ＳＭＡＲＴシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いた微小調整用ＲＰ−ＨＰＬＣによって、固定化の直前に精製した。このタンパクを、４μｌ／分の流速で、アミンカップリング化学（Ｎ−ヒドロキシスクシニミドとＮ−エチル−Ｎ’−ジメチルアミノプロピル−カルボジイミド）を用いてバイオセンサー表面に固定化した。通常、１００−２００ＲＵが、０．１−０．２ｎｇ／ｍｍ^２で固定される（２０）。固定化レベルの自動化ターゲッティングは、ＢＩＡｃｏｒｅ ３．１コントロールソフトウェア（２１）を用いて行われる。
【００５４】
分析の前に、ｓＥＧＦＲ６２１（２３）、ｓＥＧＦＲ５０１およびｓＥＧＦＲ５０１変異体サンプルを、微小調整用サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ １２ ３．２／３０， Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）により特徴決定してサイズ均質性を確かめ（２０）、プールされた画分を、適切な濃度までＢＩＡｃｏｒｅバッファー（ＨＢＳ：３．４ｍＭ ＥＤＴＡ， ０．１５ｍＭ ＮａＣｌ，および０．００５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０を含む１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．４）に希釈した。通常、１０−１０００ｎＭの濃度のサンプル（３０μｌ）を、流速５または１０μｌ／分で、センサー表面に連続的に注入した。注入段階の完了後、分離を同じ流速でＢＩＡｃｏｒｅバッファーで観察した。センサー表面およびサンプルブロックを２５℃に維持した。結合したレセプターを溶出し、注入間で４０μｌの１０ｍＭ ＨＣｌを用いて表面を再生した。この処理は、レセプターの再注入において同じシグナルを示すことから示されるように、センサー表面に固定されているｈＥＧＦまたはｈＴＧＦ−αを変性しなかった。
【００５５】
速度論的速度定数（ｋａ、ｋｄ）は、先に記載されているように（２２）ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ３．０２ソフトウェア（ｈｔｔｐ／／ｗｗｗ．ｂｉａｃｏｒｅ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｅｖａｌ３．ｈｔｍｌ）を用いて、あるいはＣＬＡＭＰ（２３、２４）一般的な分析法を用いて決定された。平衡結合定数（ＫＡ、ＫＤ）を、定常状態平衡を定義する等式を用いて（ＫＡ^＊Ｃｏｎｃ^＊Ｒｍａｘ／（ＫＡ^＊Ｃｏｎｃ^＊ｎ）； ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ３．１）、結合データの直接非線形最小自乗分析によって決定した。また、このデータをスキャッチャードフォーマットにプロットした（Ｒｅｑ／ｎＣ対Ｒｅｑ、Ｒｅｑは平衡におけるバイオセンサー反応であり、ｎは結合価、Ｃは濃度である）（２５）。
【００５６】
分析的超遠心。先に記載されているように（２３）、石英窓を有するセルを備えたＡｎ６０−Ｔｉローターを用いて、吸収光学を備えたＢｅｃｋｍａｎ ＸＬ−Ａ分析的超遠心（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ， ＣＡ）を用いて実験を行った。遠心実験は、１００μｌのサンプルボリュームを用いて２０℃で行った。１２０００および２００００ｒｐｍで得られた平衡沈降分布を２８０または２９０ｎｍでモニタし、プログラムＳＥＤＥＱ１Ｂを用いて分析した（２６）。ＥＧＦの部分比容積は、０．７１ｍｌ／ｇとされた（２３）。
【００５７】
化学架橋結合。化学的架橋結合したｓＥＧＦＲ５０１ダイマーを、室温で１時間１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４においてｓＥＧＦＲ５０１（５μＭ）をｍＥＧＦ（２０μＭ）とインキュベーションし、終濃度０．５ｍＭまでビス（スルホスクシニミジル）スベラート（ＢＳ３， Ｐｉｅｒｃｅ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ， ＵＳＡ）を添加し、かつ、さらに３０分間インキュベーションすることによって生成した。この反応を、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）を終濃度１０ｍＭとなるまで添加して終了した。モノマー−ダイマー分離を、Ｎｏｖｅｘ非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１０％）で行った。タンパクを、ポリ（ビニルジフルオリド）（ＰＶＤＦ）膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ， Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ， ＵＳＡ）に移し、抗ＥＧＦＲ Ｍａｂ５２８（１９）（０．５μｇ／ｍｌ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼラベル化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）でインキュベーションし、ＥＣＬ検出（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）することによって同定した。
【００５８】
細胞増殖アッセイ。ＢａＦ／３ＥＲＸ細胞、すなわちヒトＥＧＦＲでトランスフェクトしたＢａＦ／３細胞から得られた細胞系統（Ｌｕｄｗｉｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｍｅｌｂｏｒｕｎｅから入手）を三回洗浄し、残留ＩＬ−３を除き、ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＣＳに再懸濁した。細胞を、２００μｌ当たり２ｘ１０^４細胞で、Ｂｉｏｍｅｋ ２０００ロボティックオートサンプラー（Ｂｅｃｋｍａｎ）を用いて９６ウェルプレートにまき、１０％ＣＯ_２で３７℃で４時間インキュベートした。適切な濃度のｓＥＧＦＲ５０１またはｓＥＧＦＲ６２１または抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体Ｍａｂ５２８を、最初の滴定点まで添加し、一定量のｍＥＧＦ（２０７ｐＭ）を用いて、または用いずに二重に９６ウェルを通じて二倍希釈で滴定した。３Ｈ−チミジン（０．５μＣｉ／ウェル）を添加し、プレートを５％ＣＯ_２で３７℃で２０時間インキュベートした。次いで細胞を３０分間室温で０．５ＭのＮａＯＨで溶解した後、自動ハーベスターを用いてニトロセルロースフィルターマットに回収した（Ｔｏｍｔｅｃ， Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ， ＵＳＡ）。このマットを、マイクロ波中で乾燥させ、プラスチックカウンティングバッグに移し、シンチラント（１０ｍｌ）を添加した。^３Ｈチミジンの取り込みを、自動化ベータカウンター（１２０５ Ｂｅｔａｐｌａｔｅ， Ｗａｌｌａｃ， Ｆｉｎｌａｎｄ）を用いて調べた。
【００５９】
【実施例】
実施例１：切り詰められたＥＧＦＲ細胞外ドメインの生成および精製
一時的にｓＥＧＦＲ４７６、ｓＥＧＦＲ５０１およびｓＥＧＦＲ５１３を発現する細胞からの調整培地の事前分析は、後者の二つの切り詰められたレセプターのみが、ＢＩＡｃｏｒｅバイオセンサーに固定されたｈＥＧＦに対して検出可能な結合を与えたことを示した（データ示さず）。ｓＥＧＦＲ５０１を発現する安定にトランスフェクトされたＬｅｃ８細胞を生成し、物理的−化学的特徴決定のために、〜１．８ｍｇ／Ｌ発酵培地の収量の切り詰められたレセプタータンパクを生成するために用いた。
【００６０】
ペプチド溶出を用いたＭａｂ９Ｅ１０抗−ｃ−ｍｙｃペプチド親和性カラムから精製されたｓＥＧＦＲ５０１は、サイズ排除クロマトグラフィーで単一の対称ピークを示し（〜８０ｋＤａの見かけの分子量）、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥで〜７０ｋＤａの単一バンドとして移動した（示さず）。ｓＥＧＦＲ５０１は、Ｎ末端アミノ酸配列分析において独特の予想される配列、ＬＥＥＫＫＶＸＱＧＴ（１３）を与えた。サイクル７のＸは、その位置にジスルフィド結合したシステイン残基が存在するためである。ヒトｓＥＧＦＲ５０１アポプロテインの計算された分子量は〜５７．５ｋＤａであることから、ＳＥＤ−ＰＡＧＥで約７０ｋＤａの見かけの分子量は、グリコシレーション不完全Ｌｅｃ８細胞について報告された残留グリコシレーションによるものである（３３）。ｓＥＧＦＲ５０１に８つの潜在的Ｎ結合グリコシレーション部位が存在し（１３）、３７℃でｓＥＧＦＲ５０１をペプチド−Ｎ−グリコシダーゼ（ＰＮＧアーゼ）とインキュベーションすることにより、５７−５８ｋＤａの見かけの分子量で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上を移動する主要なバンドの生成がもたらされる（データ示さず）。グリコシレーションが正しいプロセッシングに必要であるが、生物学的活性に必要でないという考えと一致して、以前に、ＢＩＡｃｏｒｅ分析を用いて、ＰＮＧアーゼを用いた炭水化物の除去が固定されたリガンドに対するｓＥＧＦＲ６２１の結合に影響しないことを示した。次の全ての実験は、〜７０ｋＤａのｓＥＧＦＲ５０１を用いて実施した。
【００６１】
実施例２：ｓＥＧＦＲ５０１の親和的結合
ＢＩＡｃｏｒｅバイオセンサーを用いて、ｓＥＧＦＲ５０１とｈＥＧＦまたはｈＴＧＦ−αとの間の相互作用の平衡結合定数および速度の両方を調べた。この相互作用は以前に詳細に研究されているので（２３、２７）、全長の細胞外ドメイン（ｓＥＧＦＲ６２１）を、表面反応性のための陽性コントロールとして用いた。
【００６２】
ｓＥＧＦＲ５０１またはｓＥＧＦＲ６２１と、ｈＥＧＦまたはＴＧＦ−αとの間の相互作用の典型的センサグラム（ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍ）を図１に示す。視覚的検定は、試験した濃度範囲にわたって曲線が平衡に近づいたことを示した。さらに、ｈＴＧＦ−αセンサグラムは、より速く、かつ事実上完全な分離を示すと思われる。スキャッチャードフォーマット（図２）の平衡結合データの熱力学的分析は、ｓＥＧＦＲ５０１と、固定されたｈＥＧＦまたはｈＴＧＦ−αとの間の相互作用については３０および４７ｎＭのＫＤ値（それぞれ、相関係数Ｒ＝０．９９３および０．９９９）を示し、かつ、ｓＥＧＦＲ６２１との対応する相互作用については４１２および９６１ｎＭ（それぞれ、Ｒ＝０．９９７および０．９９９）を示した。スキャッチャードトランスフォーメーションにより得られた値は、安定状態平衡を定義する等式（ＫＡ^＊Ｃｏｎｃ^＊Ｒｍａｘ／（ＫＡ^＊Ｃｏｎｃ^＊ｎ）； ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ３．１）を用いて、結合データの直接非線形最小自乗分析によっても確認した（データ示さず）。この分析を用いて、３２および４６ｎＭのＫＤ値を、ｓＥＧＦＲ５０１と、固定されたｈＥＧＦおよびｈＴＧＦ−αとの間の相互作用についてそれぞれ算出し、かつ、全長細胞外ドメイン（ｓＥＧＦＲ６２１）と、固定されたｈＥＧＦおよびｈＴＧＦ−αとの間の相互作用についてそれぞれ５７０および９５９ｎＭを算出した。ｓＥＧＦＲ６２１を用いて得られた値は、以前に報告されていたものと一致し（２３）、表面能力を確認できる。
【００６３】
個々の速度定数は、一次速度論が影響する思われる曲線の一部から決定され（２７、２８）、対応する分離定数が計算される（表１）。この方法で計算されたＫＤ値と平衡結合データから得られた値との間には良好な一致が存在する。ｈＴＧＦ−αに対してｓＥＧＦＲ５０１およびｓＥＧＦＲ６２１の両方を用いて得られた結合曲線が、ｈＥＧＦ表面に対しての対応するデータよりも、１：１モデルによりよく適合すると思われることは興味深い（事実上完全な分離によって示唆される）。
【表１】

【００６４】
実施例３：ｓＥＧＦＲ５０１のアンタゴニスト活性
高い親和性でｓＥＧＦＲ５０１がＥＧＦに結合するという観察から、ｓＥＧＦＲ５０１が、ＢａＦ／３ＥＲＸ細胞系統を用いた細胞ベースアッセイにおいて、ＥＧＦＲの細胞分裂促進性刺激の競合阻害剤として作用しうるか否かを調べてみることにした。この細胞系統は、約３０ｐＭのＥＣ５０でｍＥＧＦに反応する（図３Ａ）。競合アッセイ（図３Ｂ）は、最大刺激を引き起こす（図３Ａ）一定濃度のｍＥＧＦ（２０７ｐＭ）、および種々のレベル（０．０００４５−０．５μＭ）のｓＥＧＦＲ５０１、ｓＥＧＦＲ６２１、またはヒト類表皮癌細胞系統Ａ４３１における上皮成長因子レセプターに対して生じた中和抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体Ｍａｂ５２８を用いた（１９）。この抗体は、ヌードマウスにおいて、高い数のＥＧＦレセプターを有するＡ４３１細胞異種移植の増殖を妨げることを示している。ｓＥＧＦＲ５０１（ＩＣ５０＝０．０２μＭ）は、全長細胞外ドメイン（ＩＣ５０＝０．１５μＭ）よりもほぼ１０倍強力であり、Ｍａｂ５２８抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体（ＩＣ５０＝０．０６μＭ）よりも約３倍強力であった。
【００６５】
実施例４：ｓＥＧＦＲ５０１の二量体化
化学的架橋結合は、ｓＥＧＦＲ５０１がリガンドの存在下で二量化複合体を形成したことを示した。２０μＭのｍＥＧＦの存在下で、単一の高分子量種（見かけＭｒが１８００００Ｄａ）が、化学的架橋結合後に形成された。これは、架橋結合がリガンドの不在下で試みられた場合には、検出できなかった（図４）。ウェスタンブロッティングを用いて、観察されたバンドの信頼性を確認したが、同様のデータは銀またはクーマシーブルー染色で得られた。さらに、０．２５ｍｌ／分の流速でＰＢＳの移動相で展開したＴＳＫ Ｇ２０００ＳＷカラムを用いて、反応混合物のサイズ排除クロマトグラフィー分析を行うことにより、ダイマーに対応する見かけのＭｒ１５８０００のピークが示された（データ示さず）。同様の結果が、ｓＥＧＦＲ６２１を用いて以前に得られている。
【００６６】
分析的超遠心は、ｓＥＧＦＲ５０１のＥＧＦ結合部位が等モル比のリガンドおよびレセプターで飽和し、２：２ＥＧＦ／ｓＥＧＦＲ５０１複合体の形成を導いた（図５）。２０μＭのＥＧＦのみのこのデータは（図５Ａ）、分子量５９８０Ｄａの単一の溶質を示唆し、これは、アミノ酸組成から計算された値（６０４０Ｄａ）と一致する。１０μＭのｓＥＧＦＲ５０１単独について調べた分子量（６５６００Ｄａ）および部分比容積（ｐａｒｔｉａｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｖｏｌｕｍｅ）（０．７１ｍｌ／ｇ）は、沈降平衡分布（図５Ａ）から計算され、既知のアミノ酸組成、および炭水化物組成について１２％（ｗ／ｗ）の計算された値に基づいている。
【００６７】
ＥＧＦ（２０μＭ）およびｓＥＧＦＲ５０１（１０μＭ）の混合物の沈降平衡データは、二つの種を仮定して分析された（図５Ａ）。第一の種の分子量は、フリーのＥＧＦ（６０００Ｄａ）について得られた値に固定され、第二の種の分子量および重量フラクションは適切なパラメーターとして用いられた。かかる条件下では、第二の種の分子量は、ｓＥＧＦＲ５０１とその複合体の重量平均分子量に良好な近似を与える。最適値は、重量平均ＭＷ１０６４００Ｄａの複合体を示し、１：１複合体に予想される値（７１６００Ｄａ）より高く、二量体２：２ＥＧＦ／ｓＥＧＦＲ５０１複合体の顕著な比率の形成とより一致する（以下参照）。高速メニスカス消耗実験（Ｈｉｇｈ−ｓｐｅｅｄ ｍｅｎｉｓｃｕｓ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）を行って、ＥＧＦを用いたｓＥＧＦＲ５０１の飽和に必要なモル比を調べた（図５Ｂ）。ｓＥＧＦＲ５０１（５μＭ）の溶液をＥＧＦで滴定して、フリーのＥＧＦがメニスカスで検出可能であるモル比を調べた。この結果は、これが５μＭ ＥＧＦ以上で起こることを示し、等モル比がｓＥＧＦＲ５０１のＥＧＦ結合部位の飽和に必要であることを示唆した。平衡分析（図５Ａ）から得られたＥＧＦ／ｓＥＧＦＲ５０１複合体の観察された重量平均分子量と併せて考慮して、これらのデータは、ＥＧＦ／ｓＥＧＦＲ５０１二量化種の化学量論が２：２であり２：１でないことを確認する。
【００６８】
沈降平衡を、ある範囲のＥＧＦ濃度の存在下で、ｓＥＧＦＲ５０１（５μＭ）について得られたデータの分析に用いた（図５Ｃ）。“第二の”種に得られた重量平均分子量は、ＥＧＦ／ｓＥＧＦＲ５０１の比が１：１に増加するにつれ急速に増加し、２：１より上の比率で約１０８０００付近でプラトーになる（図５Ｃ）。図５Ａのデータも、１：１および２：２の混合物が、単量体および二量体ｓＥＧＦＲ５０１複合体の重量フラクション、それぞれ５７％と３１％で複合体形成すると仮定して適合化できた。同様のデータはｓＥＧＦＲ６２１を用いて得られた（２３）。
【００６９】
実施例５：ｓＥＧＦＲ５０１−４４１変異体結合研究
バイオセンサー分析を用いて、固定されたｈＥＧＦおよびｈＴＧＦ−α表面の両方に対する一時的に発現されたｓＥＧＦＲ５０１変異体の結合を分析した。トランスフェクトされた細胞系統からの培養上清における変異体タンパクの存在を、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体Ｍａｂ５２８を用いたイムノブロッティング、および、表面に固定されたＭａｂ５２８を用いたバイオセンサー分析の両方によって調べた。全細胞系統からの培養上清は、Ｍａｂ表面に対する明白な結合を示した（４４１＞４７２＝ｗｔ＞３６７）（データ示さず）。
【００７０】
以前の実験では、Ｇｌｕ３６７Ｌｙｓ変異体およびＧｌｕ４７２Ｌｙｓ変異体が、ｈＥＧＦセンサー表面を通過させた際に、ｓＥＧＦＲ５０１に対して類似した結合特性を示した（データ示さず）。Ｍａｂ５２８表面はＧｌｙ４４１Ｌｙｓ変異体がｓＥＧＦＲ５０１よりも高い濃度で存在していたことを示したが、Ｇｌｙ４４１Ｌｙｓ変異体は、はるかに低い結合を示した。興味深いことに、同一サンプルを平行ｈＴＧＦ−αセンサー表面に通したときに、Ｇｌｙ４４１Ｌｙｓ変異体は最も高い結合を示したが、Ｇｌｕ３６７Ｌｙｓ変異体、Ｇｌｕ４７２Ｌｙｓ変異体、および野生型ｓＥＧＦＲ５０１の結合は類似しているがより低かった。
【００７１】
全バイオセンサー分析のために、一時的にトランスフェクトされた２９３Ｔ繊維芽細胞からの調節培地に存在する変異タンパクを、９Ｅ１０モノクローナル抗体を用いた親和精製、およびＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００およびＳｕｐｅｒｏｓｅ １２でのサイズ排除クロマトグラフィーを組み合わせることによって濃縮および精製した。固定されたｈＥＧＦおよびｈＴＧＦ−α表面（それぞれ、１６０および１３２ＲＵ固定化）で得られたセンサグラムは、図６Ａ、Ｂに示されている。以前の実験で観察したように、Ｇｌｕ３６７ＬｙｓとＧｌｕ４７２Ｌｙｓ変異体の結合特性は、図１に示されているｓＥＧＦＲ５０１から本質的に区別できないが（データ示さず）、Ｇｌｙ４４１Ｌｙｓ変異体は、ｈＴＧＦ−α表面に選択的結合を示した（図６Ａ、Ｂ）。平衡結合データのスキャッチャード分析（図６Ｃ、Ｄ）は、ＴＧＦ−α表面に対する結合がｓＥＧＦＲ５０１を用いて観察したときと似ているが（ＫＤ＝７７ｎＭ、相関係数Ｒ＝０．９９９）、Ｇｌｙ４４１Ｌｙｓ変異体のＥＧＦ表面への反応性は顕著に低減していた（ＫＤ＝４５５ｎＭ、Ｒ＝０．９９５）。同様の値（７８ｎＭおよび４６９ｎＭ）は、安定状態平衡を定義する等式を用いて結合データ（データ示さず）の直接非線形最小自乗分析によって得られた。
【００７２】
結合データの速度論的分析（表２）は、固定されたＴＧＦ−αとの相互作用は、５．２−６．９ｘ１０−５Ｍ−１ｓ−１の結合速度定数（ｋａ）かつ０．０２５ｓ−１の分離速度定数（ｋｄ）によって記述され、３６−４４ｎＭのＫＤ＝ｋｄ／ｋａを与えることを示した。ＥＧＦとの対応する相互作用は、１．９−２．３ｘ１０−５Ｍ−１ｓ−１のｋａ、および０．１０３ｓ−１の顕著に速いｋｄにより記述され、４４２−５４５ｎＭのＫＤ＝ｋｄ／ｋａを与え、熱力学的分析の結果と一致する。
【００７３】
【表２】

【００７４】
論考
高い親和性でｈＥＧＦおよびｈＴＧＦ−αに結合する切り詰められた形態のＥＧＦＲ細胞外ドメイン（ｓＥＧＦＲ５０１）の特徴（表１、図１および２）が記載されている。ｈＥＧＦがｓＥＧＦＲ５０１に結合する際の１３−２１ｎＭのＫＤ値は、全長のＥＧＦＲ細胞外ドメインの化学的に架橋したダイマーに観察される値（１５−３０ｎＭ）と類似しており、Ａ４３１腫瘍細胞、トランスフェクトされたＳｆ９昆虫細胞、またはＣＨＯ細胞のいずれから誘導される可溶性全長ＥＧＦＲ細胞外ドメインについて一般的に報告されている値よりも１０〜２５倍も高い。
【００７５】
ＣＲ２の殆どを欠くｓＥＧＦＲ５０１は、リガンド誘導レセプター二量化を示し（図４および５）、二量体化に重要な領域がＣＲ２を含みそうもないことを示した。また、ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマーおよびニューレグリン（ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ）の状況とは対照的に、膜固定は、高い親和性ダイマーの生成に必要でないことも確認される。超遠心分析は、ｓＥＧＦＲ５０１の結合部位が飽和され、ｓＥＧＦＲ５０１が５μＭという比較的低い濃度であっても（３２０μｇ／ｍｌ）、１：１よりも高いモル比で（図５Ｃ）、二量体化の程度がプラトーになり始めたことを示した。これは、有利に小角Ｘ線散乱データ、および以前の分析的超遠心分析と匹敵する。これは、ＥＧＦ／ｓＥＧＦＲの比が１：１である場合に、ＥＧＦまたはＴＧＦ−α結合により誘導されたｓＥＧＦＲ６２１二量化が最大に達することを示したものである。
【００７６】
リガンドに対するその高い親和性およびモデル細胞システムにおけるＥＧＦ誘導増殖反応を競合的に阻害できる能力から（図３）、ｓＥＧＦＲ５０１が治療的能力を備えることが考えられる。この阻害は、レセプターに対して生じた中和モノクローナル抗体（Ｍａｂ５２８）（そのキメラ形態（Ｃ２２５）が現在のところ臨床試験中である）を用いた同様のアッセイで達成される阻害よりも大きい。
【００７７】
ｓＥＧＦＲ５０１は、ニワトリのＥＧＦＲを用いて観察されたｈＴＧＦ−αおよびｈＥＧＦとの間の差別的結合の原因となる残基を調べるためにも用いられた（９）。これらのデータは、ｈＥＧＦＲにおけるＧｌｙ４４１に対応する、ニワトリのＥＧＦＲにおけるＬｙｓ４４２が、ｈＴＧＦ−αおよびｈＥＧＦ結合間の区別の原因残基であることを示す。
【００７８】
上記明細書に挙げた全ての刊行物を、参照として含める。本発明の記載された方法およびシステムの種々の修正および変更は、本発明の範囲および精神から離れることなく、当業者にとって自明である。本発明は特定の好ましい実施態様に関連して記載されているが、請求の範囲に記載した発明がかかる特定の実施態様に不当に制限されるべきでないと解するべきである。分子生物学または関連する技術分野の当業者にとって明らかな、本発明を実施するための記載された方式の種々の変更は、本発明の範囲内である。
【００７９】
「参考文献」

【図面の簡単な説明】
【図１】ｓＥＧＦＲ５０１およびｓＥＧＦＲ６２１と、固定されたｈＥＧＦまたはｈＴＧＦ−αとの間の相互作用のＢＩＡｃｏｒｅ分析。［Ａ］：ｓＥＧＦＲ５０１（１４０、１２０、１００、８０、６０および４０ｎＭ）を、固定されたｈＥＧＦ（１６０ＲＵ固定化）上に通過させた。サンプル（３０μｌ）を１０μｌ／分の流速で注入した。［Ｂ］：ｓＥＧＦＲ５０１を固定されたｈＴＧＦ−α（１３２ＲＵ固定化）上に通過させた。実験の詳細はパネルＡの通りであった。［Ｃ］：ｓＥＧＦＲ６２１（１０００、９００、８００、７００、６００および５００ｎＭ）を固定されたｈＥＧＦ上に通過させた。［Ｄ］ＥＧＦＲ６２１（パネルＣの濃度）を固定されたｈＴＧＦ−α上に通過させた。実施温度は２５℃であった。注入段階の最後に、分離をセンサー表面を流れるバッファーのみでモニタした。この表面を、１０ｍＭのＨＣｌを用いてサンプル間に再生した。サンプルが平行の空のチャネル（ｐａｒａｌｌｅｌ ｂｌａｎｋ ｃｈａｎｎｅｌ）を通ったときに得られたシグナルを電子的に差し引いて、比感度（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を与えた。
【図２】平衡結合データのスキャッチャード分析。分離定数（ＫＤ＝１／ＫＡ）を、図１で得られた平衡結合反応から、スキャッチャードフォーマットにそのデータをプロットすることにより算出した（Ｒｅｑ／ｎＣに対するＲｅｑ；実験方法を参照）。このデータに適合する直線の傾きがＫＡを与える。［Ａ］：ｓＥＧＦＲ５０１対ｈＥＧＦ；［Ｂ］：ｓＥＧＦＲ５０１対ｈＴＧＦ−α；［Ｃ］：ｓＥＧＦＲ６２１対ｈＥＧＦ；［Ｄ］：ｓＥＧＦＲ６２１対ｈＴＧＦα。
【図３】ｓＥＧＦＲ５０１によるＥＧＦ−刺激化細胞有糸分裂誘発の阻害。［Ａ］ｍＥＧＦの連続希釈を用いたＢａＦ／３ＥＲＸ細胞による^３Ｈ−チミジン取り込みの刺激。このデータを、シグモイダル関数に適合させ［−］ＥＣ_５０を決定した。［Ｂ］：ｍＥＧＦ（２０７ｐＭ）を用いて刺激した細胞ＢａＦ／３ＥＲＸ細胞の有糸分裂反応の、ｓＥＧＦＲ５０１（■−■）、ｓＥＧＦＲ６２１（●−●）、または抗ＥＧＦＲ抗体Ｍａｂ５２８（▲−▲）による阻害。各点は、三重にアッセイされた。誤差棒が示されている。
【図４】ｍＥＧＦとインキュベートした後のｓＥＧＦＲ５０１ダイマーの共有架橋。ｓＥＧＦＲ５０１（５μＭ）を、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）中のｍＥＧＦ（２０μＭ）と共に（＋）または伴わずに（−）室温で１時間インキュベートし、次いでビス（スルホスクシニミジル）スベラート（ＢＳ３， Ｐｉｅｒｃｅ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ， ＵＳＡ）を０．５ｍＭの終濃度まで添加し、さらに３０分間インキュベーションを行った。この反応を終了させ、ダイマー形成の程度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および抗ＥＧＦＲ Ｍａｂ５２８［７］（０．５μｇ／ｍｌ）およびホースラディッシュペルオキシダーゼラベル化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いたイムノブロッティングでモニタし、ＥＣＬで検出した（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）。ｓＥＧＦＲ５０１を検出するために用いられた抗体（Ｍａｂ５２８）はコンホメーション依存性であることから、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析が必要である。
【図５】分析的超遠心を用いたＥＧＦ／ｓＥＧＦＲ５０１相互作用の分析。［Ａ］ＥＧＦ、ｓＥＧＦＲ５０１、およびＥＧＦとｓＥＧＦＲ５０１との混合物の沈降平衡分析。平衡分布は、１２０００ｒｐｍで、２０℃で１６時間遠心した後に得られた。（□）２０μＭ ＥＧＦ；（○）１０μＭ ｓＥＧＦＲ５０１、（△）２０μＭ ＥＧＦ＋１０μＭ ｓＥＧＦＲ５０１。ＥＧＦおよびｓＥＧＦＲ５０１のデータに引かれた最適な線は、単一種に対するものであり、それぞれ、６０００および６５６００の分子量値に対するものである。ＥＧＦ／ｓＥＧＦＲ５０１混合物に対するデータに引かれた線は、６０００に固定された第一種の分子量と、第二種の分子量について１０６４００の適合した値を備えた二つの種を仮定して計算した最適の線である。はめ込み：ＥＧＦ／ｓＥＧＦＲ５０１混合物の最適に対する残りのプロット。［Ｂ］ｓＥＧＦＲ５０１に対するＥＧＦ結合の化学量論のメニスカス消耗沈降分析。５μＭのｓＥＧＦＲ５０１と異なるモル比のＥＧＦ：ＥＧＦＲとを含む溶液を、１６時間、２００００ｒｐｍ、２０℃でＸＬＡ分析的超遠心により遠心した。かかる条件下で、ｓＥＧＦＲ５０１および、そのＥＧＦとの複合体を、上清におけるメニスカス残留未結合ＥＧＦから消耗する。２８０ｎｍにおける光学密度測定は、メニスカスに近い未結合ＥＧＦの量を評価可能にする。［Ｃ］上記のパネルＡの条件下で示された濃度におけるｓＥＧＦＲ５０１（５μＭ）およびＥＧＦの混合物について計算した“第二”種の重量平均分子量について得られたデータ。実線は、ＫＤが３０ｎＭ、二量体化定数が４μＭに基づく模擬曲線に対応する。
【図６】固定されたｈＥＧＦおよびｈＴＧＦ−αに対するＧｌｙ４４１Ｌｙｓ ｓＥＧＦＲ５０１変異体の結合のＢＩＡｃｏｒｅ分析。精製したＧｌｙ４４１Ｌｙｓ ｓＥＧＦＲ５０１（２４−３８５ｎＭ）を、図１に記載した実験条件を用いて、固定されたｈＴＧＦ−α（パネルＡ）またはｈＥＧＦ（パネルＢ）上に通した。これらのセンサーグラム（ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍ）から得られた平衡結合値を用いた、対応するスキャッチャード分析が、下に示されている（パネルＣ、Ｄ）。

Claims (22)

1. 全長のＥＧＦＲ細胞外ドメインと比較して少なくとも一つのＥＧＦＲリガンドに対して増大した結合親和性を有するように、ＣＲ２ドメインの実質的な部位を欠いた、切り詰められたＥＧＦＲ細胞外ドメイン。
2. ＥＧＦおよび／またはＴＧＦ−αに対する増大した結合親和性を有する、請求項１記載の切り詰められたＥＧＦＲ細胞外ドメイン。
3. ＣＲ２ドメインの少なくとも第３から第７モジュールを欠失した、請求項１または２記載の切り詰められたＥＧＦＲ細胞外ドメイン。
4. ＣＲ２ドメインの少なくとも第２から第７モジュールを欠失した、請求項１ないし３のいずれか一項に記載の切り詰められたＥＧＦＲ細胞外ドメイン。
5. ＣＲ２ドメインの第１モジュールの一部をさらに欠失した、請求項１ないし４のいずれか一項に記載の切り詰められたＥＧＦＲ細胞外ドメイン。
6. 残基５１４−６２１を欠失した、請求項１ないし５のいずれか一項に記載の切り詰められたＥＧＦＲ細胞外ドメイン。
7. 残基５０２−６２１を欠失した、請求項１ないし６のいずれか一項に記載の切り詰められたＥＧＦＲ細胞外ドメイン。
8. Ｌ１、ＣＲ１およびＬ２サブドメインを含む、請求項１ないし７のいずれか一項に記載の切り詰められたＥＧＦＲ細胞外ドメイン。
9. ＥＧＦＲ細胞外ドメインの残基１−４９２を含む、請求項１ないし８のいずれか一項に記載の切り詰められたＥＧＦＲ細胞外ドメイン。
10. ＥＧＦＲ細胞外ドメインの残基１−５０１または残基１−５１３を含む、請求項１ないし９のいずれか一項に記載の切り詰められたＥＧＦＲ細胞外ドメイン。
11. Ｋｄが３０ｎＭ未満であるようなＥＧＦに対する親和性を備える、請求項１ないし１０のいずれか一項に記載の切り詰められたＥＧＦＲ細胞外ドメイン。
12. Ｋｄが４５ｎＭ未満であるようなＴＧＦ−αに対する親和性を備える、請求項１ないし１０のいずれか一項に記載の切り詰められたＥＧＦＲ細胞外ドメイン。
13. 請求項１ないし１２のいずれか一項に記載の切り詰められたＥＧＦＲ細胞外ドメインをコードするポリヌクレオチド。
14. 請求項１３記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
15. 請求項１４記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
16. 請求項１ないし１２のいずれか一項に記載の切り詰められたＥＧＦＲ細胞外ドメインを含むキメラまたは融合構成物。
17. 切り詰められたＥＧＦＲ細胞外ドメインがイムノグロブリン定常ドメインに接合した、請求項１６記載のキメラまたは融合構成物。
18. 切り詰められたＥＧＦＲ細胞外ドメインの産生を可能にする条件下で請求項１５記載の宿主細胞を培養すること、および当該切り詰められたＥＧＦＲ細胞外ドメインを単離することを含む、切り詰められたＥＧＦＲ細胞外ドメインを産生する方法。
19. 請求項１ないし１２のいずれか一項に記載の切り詰められたＥＧＦＲ細胞外ドメインまたは請求項１６または１７記載のキメラまたは融合構成物と、薬学的に許容できるキャリアーまたは希釈剤とを含む薬学的組成物。
20. 推定化合物を、請求項１ないし１２のいずれか一項に記載の切り詰められたＥＧＦＲ細胞外ドメインに曝し、かつ、この切り詰められたＥＧＦＲ細胞外ドメインの活性をモニタリングすることを含む、ＥＧＦレセプターの活性を変更する能力に関して推定化合物をスクリーニングする方法。
21. 請求項１ないし１２のいずれか一項に記載の切り詰められたＥＧＦＲ細胞外ドメインを患者に投与することを含む、患者のＥＧＦレセプターファミリーの分子によるシグナリングと関連した疾患を治療または予防する方法。
22. 前記ＥＧＦレセプターファミリーの分子によるシグナリングと関連した疾患が、乾癬、並びに、乳房、脳、卵巣、頸、膵臓、肺、頭および首部のガン、および黒色腫、横紋筋肉腫、中皮腫および神経膠芽細胞腫を制限することなく含む腫瘍状態から選択される、請求項２１記載の方法。

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