CN114656567A - 抗icos抗体及其应用 - Google Patents

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CN114656567A CN202111583805.XA CN202111583805A CN114656567A CN 114656567 A CN114656567 A CN 114656567A CN 202111583805 A CN202111583805 A CN 202111583805A CN 114656567 A CN114656567 A CN 114656567A
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陈振埕
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Abstract

本发明提供了抗ICOS抗体及其应用，属于生物技术领域，本发明抗体或抗原结合片段可以特异性结合ICOS，激活ICOS通路，共同刺激细胞因子的分泌，可用于癌症的治疗，也可以用于癌症的诊断和预后。

Description

抗ICOS抗体及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及抗ICOS抗体及其应用。
背景技术
诱导性共刺激分子(inducible costimulator,ICOS)是B7/CD28/CTLA-4免疫球蛋白超家族的成员，其为55kDa跨膜蛋白，以二硫键连接的同型二聚体的形式存在。ICOS仅仅在T淋巴细胞上表达，且发现于多种T细胞亚群上。ICOS以低含量存在于初始T淋巴细胞上，免疫活化后被快速诱导表达。ICOS与在B细胞或抗原呈递细胞(antigen presenting cell,APC)上表达的ICOS配体(ICOS ligand,ICOS-L)结合。作为共刺激分子，ICOS用以调节TCR介导的对抗原的免疫反应和抗体反应。ICOS在T细胞活化的后期阶段、记忆T细胞形成时是通过T细胞依赖性B细胞反应发挥作用；ICOS结合PI3K且活化激酶磷酸肌醇依赖性激酶1(PDK1)和蛋白激酶B(PKB)。ICOS活化后可防止细胞死亡且上调细胞代谢。
现有证据显示激动型的抗ICOS抗体可耗减T调节子细胞(Treg)，激活淋巴细胞释放细胞因子。
发明内容
本发明提供了激动型的抗ICOS抗体或抗原结合片段，这些抗体或抗原结合片段可以特异性结合ICOS，激活下游信号通路，刺激淋巴细胞释放细胞因子。
一些实施方案中提供了一种抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段特异性结合ICOS，并且至少包含以下中的一个或多个：
(a)HCDR1，包含如SEQ ID NO：1～3中任一项所示的氨基酸序列，或与其相比具有单一位点取代、缺失或插入的氨基酸序列；(b)HCDR2，包含如SEQ ID NO：4或5所示的氨基酸序列，或与其相比具有单一位点取代、缺失或插入的氨基酸序列；(c)HCDR3，包含如SEQ IDNO：6～8中任一项所示的氨基酸序列，或与其相比具有单一位点取代、缺失或插入的氨基酸序列；(d)LCDR1，包含如SEQ ID NO：9或10所示的氨基酸序列，或与其相比具有单一位点取代、缺失或插入的氨基酸序列；(e)LCDR2，包含如SEQ ID NO：11～13中任一项所示的氨基酸序列，或与其相比具有单一位点取代、缺失或插入的氨基酸序列；及/或(f)LCDR3，包含如SEQ ID NO：14或15所示的氨基酸序列，或与其相比具有单一位点取代、缺失或插入的氨基酸序列。
一些实施方案中提供了一种抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段特异性结合ICOS，并且包含：
(a)HCDR1，包含如SEQ ID NO：1～3中任一项所示的氨基酸序列，或与其相比具有单一位点取代、缺失或插入的氨基酸序列；(b)HCDR2，包含如SEQ ID NO：4或5所示的氨基酸序列，或与其相比具有单一位点取代、缺失或插入的氨基酸序列；(c)HCDR3，包含如SEQ IDNO：6～8中任一项所示的氨基酸序列，或与其相比具有单一位点取代、缺失或插入的氨基酸序列；(d)LCDR1，包含如SEQ ID NO：9或10所示的氨基酸序列，或与其相比具有单一位点取代、缺失或插入的氨基酸序列；(e)LCDR2，包含如SEQ ID NO：11～13中任一项所示的氨基酸序列，或其相比具有单一位点取代、缺失或插入的氨基酸序列；以及(f)LCDR3，包含如SEQID NO：14或15所示的氨基酸序列，或与其相比具有单一位点取代、缺失或插入的氨基酸序列。
一些实施方案中提供了一种抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段特异性结合ICOS，并且包含：
(a)HCDR1，包含如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，或与其相比具有单一位点取代、缺失或插入的氨基酸序列；(b)HCDR2，包含如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，或与其相比具有单一位点取代、缺失或插入的氨基酸序列；(c)HCDR3，包含如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，或与其相比具有单一位点取代、缺失或插入的氨基酸序列；(d)LCDR1，包含如SEQID NO：9所示的氨基酸序列，或与其相比具有单一位点取代、缺失或插入的氨基酸序列；(e)LCDR2，包含如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，或与其相比具有单一位点取代、缺失或插入的氨基酸序列；以及(f)LCDR3，包含如SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列，或与其相比具有单一位点取代、缺失或插入的氨基酸序列。
一些实施方案中提供了一种抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段特异性结合ICOS，并且包含：
(a)HCDR1，包含如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，或与其相比具有单一位点取代、缺失或插入的氨基酸序列；(b)HCDR2，包含如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，或与其相比具有单一位点取代、缺失或插入的氨基酸序列；(c)HCDR3，包含如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列，或与其相比具有单一位点取代、缺失或插入的氨基酸序列；(d)LCDR1，包含如SEQID NO：9所示的氨基酸序列，或与其相比具有单一位点取代、缺失或插入的氨基酸序列；(e)LCDR2，包含如SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列，或与其相比具有单一位点取代、缺失或插入的氨基酸序列；以及(f)LCDR3，包含如SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列，或与其相比具有单一位点取代、缺失或插入的氨基酸序列。
一些实施方案中提供了一种抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段特异性结合ICOS，并且包含：
(a)HCDR1，包含如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，或与其相比具有单一位点取代、缺失或插入的氨基酸序列；(b)HCDR2，包含如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，或与其相比具有单一位点取代、缺失或插入的氨基酸序列；(c)HCDR3，包含如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列，或与其相比具有单一位点取代、缺失或插入的氨基酸序列；(d)LCDR1，包含如SEQID NO：10所示的氨基酸序列，或与其相比具有单一位点取代、缺失或插入的氨基酸序列；(e)LCDR2，包含如SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列，或与其相比具有单一位点取代、缺失或插入的氨基酸序列；以及(f)LCDR3，包含如SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列，或与其相比具有单一位点取代、缺失或插入的氨基酸序列。
一些实施方案提供了抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段特异性结合ICOS，所述抗体或抗原结合片段至少包含如SEQ ID NO：1～3中任一项所示的HCDR1、如SEQID NO：4或5中所示的HCDR2、如SEQ ID NO：6～8中任一项所示的HCDR3、如SEQ ID NO：9或10所示的LCDR1、如SEQ ID NO：11～13中任一项所示的LCDR2和如SEQ ID NO:14或15所示的LCDR3中的一个、两个、三个、四个、五个或全部。
一些实施方案提供了抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段至少包含如SEQ ID NO：1～3中任一项所示的HCDR1、如SEQ ID NO：4或5所示的HCDR2、如SEQ ID NO：6～8中任一项所示的HCDR3、如SEQ ID NO：9或10所示的LCDR1、如SEQ ID NO：11～13中任一项所示的LCDR2和如SEQ ID NO:14或15所示的LCDR3。
一些实施方案提供了抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段至少包含如SEQ ID NO：1所示的HCDR1、如SEQ ID NO：4所示的HCDR2、如SEQ ID NO:6所示的HCDR3、如SEQ ID NO：9所示的LCDR1、如SEQ ID NO：11所示的LCDR2和如SEQ ID NO：14所示的LCDR3。
一些实施方案提供了抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段至少包含如SEQ ID NO：2所示的HCDR1、如SEQ ID NO：4所示的HCDR2、如SEQ ID NO：7所示的HCDR3、如SEQ ID NO：9所示的LCDR1、如SEQ ID NO：12所示的LCDR2和如SEQ ID NO：14所示的LCDR3。
一些实施方案提供了抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段至少包含如SEQ ID NO：3所示的HCDR1、如SEQ ID NO：5所示的HCDR2、如SEQ ID NO：8所示的HCDR3、如SEQ ID NO：10所示的LCDR1、如SEQ ID NO：13所示的LCDR2和如SEQ ID NO：15所示的LCDR3。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含重链可变区，所述重链可变区为鼠源或人源或人源化。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含轻链可变区，所述轻链可变区为鼠源或人源或人源化。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO：16～22中任一项所示的序列，或与SEQ ID NO：16～22中任一项所示序列相比具有至少有80％同一性的序列，或与SEQ ID NO：16～22中任一项所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包括轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：23～31中任一项所示的序列，或与SEQ ID NO：23～31中任一项所示序列相比至少有80％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：23～31中任一项所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示的重链可变区，以及氨基酸序列如SEQ ID NO：23所示的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含氨基酸序列如SEQ ID NO：17所示的重链可变区，以及氨基酸序列如SEQ ID NO：24所示的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含氨基酸序列如SEQ ID NO：18所示的重链可变区，以及氨基酸序列如SEQ ID NO：25所示的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示的重链可变区，以及氨基酸序列如SEQ ID NO：26所示的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示的重链可变区，以及氨基酸序列如SEQ ID NO：27所示的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示的重链可变区，以及氨基酸序列如SEQ ID NO：28所示的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示的重链可变区，以及氨基酸序列如SEQ ID NO：29所示的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示的重链可变区，以及氨基酸序列如SEQ ID NO：30所示的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含氨基酸序列如SEQ ID NO：21所示的重链可变区，以及氨基酸序列如SEQ ID NO：31所示的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含氨基酸序列如SEQ ID NO：22所示的重链可变区，以及氨基酸序列如SEQ ID NO：31所示的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述抗体或其片段还包含重链恒定区、轻链恒定区、Fc区或其结合。在一些实施方案中，所述重链恒定区和轻链恒定区为鼠源。在一些实施方案中，所述重链恒定区和轻链恒定区为人源。在一些实施方案中，轻链恒定区是κ或λ链恒定区。在一些实施方案中，抗体或其片段是IgG、IgM、IgA、IgE或IgD其中一种同种型。在一些实施方案中，同种型是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
在一些实施方案中，Fc是变体Fc区。在一些实施方案中，相对于亲本Fc区，变体Fc区具有一个或多个氨基酸修饰，如取代、缺失或插入。在一些实施方案中，相对于亲本Fc区活性，Fc区的氨基酸修饰改变了效应功能活性。在一些实施方案中，变体Fc区可以具有改变的(即，增加的或降低的)抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、补体介导的细胞毒性(CDC)、吞噬作用、调理作用或细胞结合。在一些实施方案中，相对于亲本Fc区，Fc区氨基酸修饰可以改变变体Fc区对FcγR(Fcγ受体)的亲和力。在一些实施方案中，所述Fc区来源于IgG1或IgG4。在一些实施方案中，Fc区突变是N297A。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的重链恒定区包含如SEQ ID NO：32或34所示的序列，或与SEQ ID NO：32或34所示序列相比具有至少有80％同一性的序列，或与SEQ ID NO：32或34所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的轻链恒定区包含如SEQ ID NO：33或35所示的序列，或与SEQ ID NO：33或35所示序列相比具有至少有80％同一性的序列，或与SEQ ID NO：33或35所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的重链恒定区包含如SEQ ID NO：32所示的序列，所述抗体或抗原结合片段的轻链恒定区包含如SEQ ID NO：33所示的序列。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的重链恒定区包含如SEQ ID NO：34所示的序列，所述抗体或抗原结合片段的轻链恒定区包含如SEQ ID NO：35所示的序列。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段是鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人源抗体。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段为分离的抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段为scFV、Fab、F(ab)2或IgG1。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段为单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体或多特异性抗体或抗原结合片段(例如双特异性抗体或抗原结合片段)。
在一些实施方案中，所述抗体的重链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：16所示的重链可变区和SEQ ID NO：32所示的重链恒定区，或与所述重链序列相比具有至少有80％同一性的序列，或与所述重链序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或所述抗体的轻链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：23所示的轻链可变区和SEQ IDNO：33所示的轻链恒定区，或与所述轻链序列相比具有至少有80％同一性的序列，或与所述轻链序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体的重链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：16所示的重链可变区和SEQ ID NO：32所示的重链恒定区，所述抗体的轻链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：23所示的轻链可变区和SEQ ID NO：33所示的轻链恒定区。
在一些实施方案中，所述抗体的重链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：17所示的重链可变区和SEQ ID NO：32所示的重链恒定区，或与所述重链序列相比具有至少有80％同一性的序列，或与所述重链序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或所述抗体的轻链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：24所示的轻链可变区和SEQ IDNO：33所示的轻链恒定区，或与所述轻链序列相比具有至少有80％同一性的序列，或与所述轻链序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体的重链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：17所示的重链可变区和SEQ ID NO：32所示的重链恒定区，所述抗体的轻链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：24所示的轻链可变区和SEQ ID NO：33所示的轻链恒定区。
在一些实施方案中，所述抗体的重链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：18所示的重链可变区和SEQ ID NO：32所示的重链恒定区，或与所述重链序列相比具有至少有80％同一性的序列，或与所述重链序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或所述抗体的轻链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：25所示的轻链可变区和SEQ IDNO：33所示的轻链恒定区，或与所述轻链序列相比具有至少有80％同一性的序列，或与所述轻链序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体的重链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：18所示的重链可变区和SEQ ID NO：32所示的重链恒定区，所述抗体的轻链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：25所示的轻链可变区和SEQ ID NO：33所示的轻链恒定区。
在一些实施方案中，所述抗体的重链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：16所示的重链可变区和SEQ ID NO：34所示的重链恒定区，或与所述重链序列相比具有至少有80％同一性的序列，或与所述重链序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或所述抗体的轻链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：23所示的轻链可变区和SEQ IDNO：35所示的轻链恒定区，或与所述轻链序列相比具有至少有80％同一性的序列，或与所述轻链序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体的重链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：16所示的重链可变区和SEQ ID NO：34所示的重链恒定区，所述抗体的轻链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：23所示的轻链可变区和SEQ ID NO：35所示的轻链恒定区。
在一些实施方案中，所述抗体的重链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：17所示的重链可变区和SEQ ID NO：34所示的重链恒定区，或与所述重链序列相比具有至少有80％同一性的序列，或与所述重链序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或所述抗体的轻链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：24所示的轻链可变区和SEQ IDNO：35所示的轻链恒定区，或与所述轻链序列相比具有至少有80％同一性的序列，或与所述轻链序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体的重链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：17所示的重链可变区和SEQ ID NO：34所示的重链恒定区，所述抗体的轻链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：24所示的轻链可变区和SEQ ID NO：35所示的轻链恒定区。
在一些实施方案中，所述抗体的重链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：18所示的重链可变区和SEQ ID NO：34所示的重链恒定区，或与所述重链序列相比具有至少有80％同一性的序列，或与所述重链序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或所述抗体的轻链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：25所示的轻链可变区和SEQ IDNO：35所示的轻链恒定区，或与所述轻链序列相比具有至少有80％同一性的序列，或与所述轻链序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体的重链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：18所示的重链可变区和SEQ ID NO：34所示的重链恒定区，所述抗体的轻链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：25所示的轻链可变区和SEQ ID NO：35所示的轻链恒定区。
在一些实施方案中，所述抗体的重链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：19所示的重链可变区和SEQ ID NO：34所示的重链恒定区，或与所述重链序列相比具有至少有80％同一性的序列，或与所述重链序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或所述抗体的轻链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：26所示的轻链可变区和SEQ IDNO：35所示的轻链恒定区，或与所述轻链序列相比具有至少有80％同一性的序列，或与所述轻链序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体的重链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：19所示的重链可变区和SEQ ID NO：34所示的重链恒定区，所述抗体的轻链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：26所示的轻链可变区和SEQ ID NO：35所示的轻链恒定区。
在一些实施方案中，所述抗体的重链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：19所示的重链可变区和SEQ ID NO：34所示的重链恒定区，或与所述重链序列相比具有至少有80％同一性的序列，或与所述重链序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或所述抗体的轻链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：27所示的轻链可变区和SEQ IDNO：35所示的轻链恒定区，或与所述轻链序列相比具有至少有80％同一性的序列，或与所述轻链序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体的重链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：19所示的重链可变区和SEQ ID NO：34所示的重链恒定区，所述抗体的轻链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：27所示的轻链可变区和SEQ ID NO：35所示的轻链恒定区。
在一些实施方案中，所述抗体的重链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：20所示的重链可变区和SEQ ID NO：34所示的重链恒定区，或与所述重链序列相比具有至少有80％同一性的序列，或与所述重链序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或所述抗体的轻链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：28所示的轻链可变区和SEQ IDNO：35所示的轻链恒定区，或与所述轻链序列相比具有至少有80％同一性的序列，或与所述轻链序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体的重链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：20所示的重链可变区和SEQ ID NO：34所示的重链恒定区，所述抗体的轻链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：28所示的轻链可变区和SEQ ID NO：35所示的轻链恒定区。
在一些实施方案中，所述抗体的重链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：20所示的重链可变区和SEQ ID NO：34所示的重链恒定区，或与所述重链序列相比具有至少有80％同一性的序列，或与所述重链序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或所述抗体的轻链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：29所示的轻链可变区和SEQ IDNO：35所示的轻链恒定区，或与所述轻链序列相比具有至少有80％同一性的序列，或与所述轻链序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体的重链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：20所示的重链可变区和SEQ ID NO：34所示的重链恒定区，所述抗体的轻链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：29所示的轻链可变区和SEQ ID NO：35所示的轻链恒定区。
在一些实施方案中，所述抗体的重链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：20所示的重链可变区和SEQ ID NO：34所示的重链恒定区，或与所述重链序列相比具有至少有80％同一性的序列，或与所述重链序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或所述抗体的轻链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：30所示的轻链可变区和SEQ IDNO：35所示的轻链恒定区，或与所述轻链序列相比具有至少有80％同一性的序列，或与所述轻链序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体的重链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：20所示的重链可变区和SEQ ID NO：34所示的重链恒定区，所述抗体的轻链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：30所示的轻链可变区和SEQ ID NO：35所示的轻链恒定区。
在一些实施方案中，所述抗体的重链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：21所示的重链可变区和SEQ ID NO：34所示的重链恒定区，或与所述重链序列相比具有至少有80％同一性的序列，或与所述重链序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或所述抗体的轻链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：31所示的轻链可变区和SEQ IDNO：35所示的轻链恒定区，或与所述轻链序列相比具有至少有80％同一性的序列，或与所述轻链序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体的重链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：21所示的重链可变区和SEQ ID NO：34所示的重链恒定区，所述抗体的轻链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：31所示的轻链可变区和SEQ ID NO：35所示的轻链恒定区。
在一些实施方案中，所述抗体的重链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：22所示的重链可变区和SEQ ID NO：34所示的重链恒定区，或与所述重链序列相比具有至少有80％同一性的序列，或与所述重链序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或所述抗体的轻链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：31所示的轻链可变区和SEQ IDNO：35所示的轻链恒定区，或与所述轻链序列相比具有至少有80％同一性的序列，或与所述轻链序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体的重链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：22所示的重链可变区和SEQ ID NO：34所示的重链恒定区，所述抗体的轻链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：31所示的轻链可变区和SEQ ID NO：35所示的轻链恒定区。
在一些实施方案中，所述抗体具有两条相同的重链和两条相同的轻链，Fc区配对形成二硫键。
在一些实施方案中，所述抗体选自36E5，37F6，37B1，36E5-chmrc，37F6-chmrc，37B1-chmrc，36E5-huV.1，36E5-huV.2，36E5-hu.V4，36E5-hu.V5，36E5-hu.V6，37B1-hu.V1和37B1-hu.V4。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段为分离的抗体或抗原结合片段。
本发明还提供了编码所述的抗体或抗原结合片段的核酸分子。在一些实施方案中，所述核酸分子为分离的核酸分子。
本发明还提供了一种包含所述的核酸分子的载体。在一些实施方案中，所述载体为分离的载体。
本发明还提供了一种包含所述核酸分子或载体的宿主细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞为分离的宿主细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞为CHO细胞、HEK细胞(如HEK293F细胞)、BHK细胞、Cos1细胞、Cos7细胞、CV1细胞或鼠L细胞。
本发明还提供了药物组合物，所述药物组合物包含所述的抗ICOS抗体或抗原结合片段，以及药学上可接受的载体。
本发明还提供了治疗方法和用途。在一些实施方案中，提供治疗癌症和肿瘤的方法，其包括施用有效量的本文所述的抗ICOS抗体、抗原结合片段或所述的药物组合物。在一些实施方案中，所述癌症和肿瘤选自黑色素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、肾细胞癌(RCC)、胃癌、膀胱癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、霍奇金氏淋巴瘤、卵巢癌、头颈鳞状细胞癌(HNSCC)和三阴性乳腺癌(TNBC)。在一些实施方案中，所述癌症选自黑色素瘤、胃癌、头颈鳞状细胞癌(HNSCC)、非小细胞肺癌(NSCLC)和三阴性乳腺癌(TNBC)。
本发明还提供了诊断方法和用途。在一些实施方案中，提供了检测样品中ICOS表达的方法，使样品与所述抗体或抗原结合片段进行接触，使得所述抗体或抗原结合片段结合ICOS，并检测其结合，即样品中ICOS的含量。在一些实施方案中，提供了所述抗体或抗原结合片段在制备用于诊断或预后癌症或肿瘤试剂盒中的应用。在一些实施方案中，提供了一种包含所述抗体或抗原结合片段的诊断或预后试剂盒。
本发明提供了抗ICOS抗体或抗原结合片段及其应用，本发明抗体或抗原结合片段可以特异性结合ICOS，激活下游信号通路，刺激淋巴细胞释放细胞因子。本发明抗体或抗原结合片段可以用于治疗或改善肿瘤和癌症，也可以用于癌症或肿瘤的诊断和预后。
附图说明
图1为本发明实施例中抗ICOS抗体与CHO-hICOS细胞的结合曲线。
图2显示本发明实施例中抗ICOS抗体能提高PBMC细胞分泌细胞因子；其中，抗ICOS抗体的浓度为2.5μg/ml。
术语
除非另作说明，否则下列的每一个术语应当具有下文所述的含义。
定义
应当注意的是，术语“一种”实体是指一种或多种该实体，例如“一种抗体”应当被理解为一种或多种抗体，因此，术语“一种”(或“一个”)、“一种或多种”和“至少一种”可以在本文中互换使用。
术语“多肽”旨在涵盖单数的“多肽”以及复数的“多肽”，并且是指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的氨基酸单体组成的分子。术语“多肽”是指两个或更多个氨基酸的任何单条链或多条链，并且不涉及产物的特定长度。因此，“多肽”的定义中包括肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于指两个或多个氨基酸链的任何其他术语，并且术语“多肽”可以用来代替上述任何一个术语，或者与上述任何一个术语交替使用。术语“多肽”也意在指多肽表达后修饰的产物，包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割或非天然发生的氨基酸修饰。多肽可以源自天然生物来源或通过重组技术产生，但其不必从指定的核酸序列翻译所得，它可能以包括化学合成的任何方式产生。
“氨基酸”是指既含氨基又含羧基的有机化合物，比如α-氨基酸，其可直接或以前体的形式由核酸编码。单个氨基酸由三个核苷酸(所谓的密码子或碱基三联体)组成的核酸编码。每一个氨基酸由至少一个密码子编码。相同氨基酸由不同密码子编码称为“遗传密码的简并性”。氨基酸包括天然氨基酸和非天然氨基酸。天然氨基酸包括丙氨酸(三字母代码：ala，一字母代码：A)、精氨酸(arg，R)、天冬酰胺(asn，N)、天冬氨酸(asp，D)、半胱氨酸(cys，C)、谷氨酰胺(gln，Q)、谷氨酸(glu，E)、甘氨酸(gly，G)、组氨酸(his，H)、异亮氨酸(ile，I)、亮氨酸(leu，L)、赖氨酸(lys，K)、甲硫氨酸(met，M)、苯丙氨酸(phe，F)、脯氨酸(pro，P)、丝氨酸(ser，S)、苏氨酸(thr，T)、色氨酸(trp，W)、酪氨酸(tyr，Y)和缬氨酸(val，V)。
“保守氨基酸取代”是指一个氨基酸残基被另一个含有化学性质(例如电荷或疏水性)相似的侧链(R基团)的氨基酸残基所取代。一般而言，保守氨基酸取代不大会在实质上改变蛋白质的功能性质。含有化学性质相似侧链的氨基酸类别的实例包括：1)脂族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2)脂族羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；3)含酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸。
“VL、VH的保守氨基酸取代”的氨基酸数目可为约1个、约2个、约3个、约4个、约5个、约6个、约8个、约9个、约10个、约11个、约13个、约14个、约15个保守氨基酸取代，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括终点)或其中任何值。“重链恒定区、轻链恒定区、重链或轻链的保守氨基酸取代”的氨基酸数目可为约1个、约2个、约3个、约4个、约5个、约6个、约8个、约9个、约10个、约11个、约13个、约14个、约15个、约18个、约19个、约22个、约24个、约25个、约29个、约31个、约35个、约38个、约41个、约45个保守氨基酸取代，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括终点)或其中任何值。
本发明中关于细胞、核酸、多肽、抗体等所使用的术语“分离的”，例如“分离的”DNA、RNA、多肽、抗体是指分别于细胞天然环境中的其它组分如DNA或RNA中的一种或多种所分离的分子。本发明使用的术语“分离的”还指当通过重组DNA技术产生时基本上不含细胞材料、病毒材料或细胞培养基的核酸或肽，或化学合成时的化学前体或其他化学品。此外，“分离的核酸”意在包括不以天然状态存在的核酸片段，并且不会以天然状态存在。术语“分离的”在本发明中也用于指从其他细胞蛋白质或组织分离的细胞或多肽。分离的多肽意在包括纯化的和重组的多肽。分离的多肽、抗体等通常通过至少一个纯化步骤制备。在一些实施方案中，分离的核酸、多肽、抗体等的纯度至少为约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约99％，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括终点)或其中任何值。
术语“重组”涉及多肽或多聚核苷酸，意指天然不存在的多肽或多聚核苷酸的形式，不受限制的实施例可以通过组合产生通常并不存在的多聚核苷酸或多肽。
“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。可以通过比较每个序列中可以比对的位置来确定同源性。当被比较的序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则分子在该位置是同源的。序列之间的同源程度是由序列共有的匹配或同源位置的数目组成的一个函数。
“至少80％同一性”为约80％同一性、约81％同一性、约82％同一性、约83％同一性、约85％同一性、约86％同一性、约87％同一性、约88％同一性、约90％同一性、约91％同一性、约92％同一性、约94％同一性、约95％同一性、约98％同一性、约99％同一性，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括终点)或其中任何值。
多聚核苷酸或多聚核苷酸序列(或多肽或抗体序列)与另一序列有具有一定百分比(例如90％、95％、98％或者99％)的“同一性或序列同一性”是指当序列比对时，所比较的两个序列中该百分比的碱基(或氨基酸)相同。可以使用目测或本领域已知的软件程序来确定该比对和同一性百分比或序列同一性，比如Ausubel et al.eds.(2007)在CurrentProtocols in Molecular Biology中所述的软件程序。优选使用默认参数进行比对。其中一种比对程序是使用默认参数的BLAST，例如BLASTN和BLASTP，两者使用下列默认参数：Geneticcode＝standard；filter＝none；strand＝both；cutoff＝60；expect＝10；Matrix＝BLOSUM62；Descriptions＝50sequences；sortby＝HIGHSCORE；Databases＝non-redundant；GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBankCDStranslations+SwissProtein+SPupdate+PIR。生物学上等同的多聚核苷酸是具有上述指定百分比的同一性并编码具有相同或相似生物学活性的多肽的多聚核苷酸。
多聚核苷酸是由四个核苷酸碱基的特定序列组成：腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)，或当多聚核苷酸是RNA时胸腺嘧啶换为尿嘧啶(U)。“多聚核苷酸序列”可以以多聚核苷酸分子的字母表示。该字母表示可以被输入到具有中央处理单元的计算机中的数据库中，并用于生物信息学应用，例如用于功能基因组学和同源性搜索。
术语“多聚核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用，是指任何长度的核苷酸的聚合形式，无论是脱氧核糖核苷酸还是核糖核苷酸或其类似物。多聚核苷酸可以具有任何三维结构并且可以执行已知或未知的任何功能。以下是不受限制的多聚核苷酸的实施例：基因或基因片段(例如探针、引物、EST或SAGE标签)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核糖酶、cDNA、dsRNA、siRNA、miRNA、重组多聚核苷酸、分支的多聚核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多聚核苷酸可以包含修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在该修饰，则对核苷酸的结构修饰可以在组装多聚核苷酸之前或之后进行。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。聚合后可以进一步修饰多聚核苷酸，例如通过与标记组分缀合。这个术语也指双链和单链分子。除另有说明或要求外，本公开的任何多聚核苷酸的实施例包括双链形式和已知或预测构成双链形式的两种可互补单链形式中的每一种。
术语“编码”应用于多聚核苷酸时，是指被称为“编码”多肽的多聚核苷酸，在其天然状态或当通过本领域技术人员公知的方法操作时，经转录和/或翻译可以产生该多肽和/或其片段。
“抗体”、“抗原结合片段”是指特异性识别和结合抗原的多肽或多肽复合物。抗体可以是完整的抗体及其任何抗原结合片段或其单链。因此术语“抗体”包括分子中含有具有与抗原结合的生物学活性的免疫球蛋白分子的至少一部分的任何蛋白质或肽。抗体和抗原结合片段包括但不局限重链或轻链或其配体结合部分的互补决定区(CDR)、重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)、重链恒定区(CH)、轻链恒定区(CL)、框架区(FR)或其任何部分，或结合蛋白的至少一部分。CDR区包括轻链的CDR区(LCDR1-3)和重链的CDR区(HCDR1-3)。抗体及抗原结合片段可以特异性识别和结合一个或多个(如两个)抗原的多肽或多肽复合物。特异性识别和结合多个(如两个)抗原的抗体或抗原结合片段可以被称为多特异性(如双特异性)抗体或抗原结合片段。
术语“抗体片段”或“抗原结合片段”指抗体的一部分，本发明抗体片段的组成形式可类似于单特异性抗体片段中的F(ab’)2、F(ab)2、Fab'、Fab、Fv、scFv等。不管其结构如何，抗体片段与被完整抗体识别的同一抗原结合。术语“抗体片段”包括适体、镜像异构体和双价抗体。术语“抗原结合片段”还包括通过与特定抗原结合形成复合物起抗体作用的任何合成或基因工程蛋白质。
“单链可变片段”或“scFv”是指免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)的可变区的融合蛋白。在一些方面，这些区域与10个至约25个氨基酸的短接头肽连接。接头可以富含甘氨酸以增加柔韧性，以及富含丝氨酸或苏氨酸以增加溶解性，并且可以连接VH的N端和VL的C端，反之亦然。尽管该蛋白质被除去了恒定区和引入了接头，但其保留了原始免疫球蛋白的特异性。ScFv分子通常是本领域中已知的，例如在美国专利5,892,019中有相关描述。
术语“抗体”包括可以在生物化学上区分的各种广泛种类的多肽。本领域技术人员将会理解，重链的类别包括gamma、mu、alpha、delta或epsilon(γ、μ、α、δ、ε)，其中还有一些亚类(例如γ1-γ4)。该链的性质决定了抗体的“种类”分别为IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。免疫球蛋白亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgG5等已被充分表征并且赋予的功能特异性也已知。所有的免疫球蛋白种类都在本发明公开的保护范围内。在一些实施方案中，免疫球蛋白分子为IgG种类。这四条链通过二硫键以“Y”构型连接，其中轻链从“Y”口开始并延续通过可变区包围重链。
本发明公开的抗体、抗原结合片段或衍生物包括但不限于多克隆、单克隆、多特异性、全人源、人源化、灵长类化、嵌合抗体、单链抗体、表位结合片段(例如类Fab、类Fab'和类F(ab')2)、类单链Fvs(scFv)。
轻链可以分为kappa(κ)或lambda(λ)。每个重链可以与κ或λ轻链结合。一般来说，当由杂交瘤，B细胞或基因工程宿主细胞生产免疫球蛋白时，其轻链和重链通过共价键结合，两条重链的“尾巴”部分通过共价二硫键或非共价键结合。在重链中，氨基酸序列从Y构型的叉状末端的N末端延伸至每条链底部的C末端。免疫球蛋白κ轻链可变区为Vκ；免疫球蛋白λ轻链可变区为Vλ。
轻链和重链都分成结构和功能同源性的区域。术语“恒定的”和“可变的”根据功能被使用。轻链(VL)和重链(VH)链部分的可变区决定了抗原识别和特异性。轻链的恒定区(CL)和重链的恒定区(CH)赋予重要的生物学性质，如分泌、经胎盘移动、Fc受体结合、补体结合等。按照惯例，恒定区的编号随着它们变得更远离抗体的抗原结合位点或氨基末端而增加。N端部分是可变区，C端部分是恒定区；CH3和CL结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基端。
在天然存在的抗体中，假设抗体在含水环境中呈现其三维构型时，存在于每个抗原结合域中的六个“互补决定区”或“CDR”是形成抗原结合结构域的短的、非连续的与抗原特异性结合的氨基酸序列。抗原结合结构域中被称为“构架”区域的剩余其它氨基酸显示出较小的分子间可变性。构架区大部分采用β-折叠构象，CDR形成与之连接的环状结构，或在某些情况下形成β折叠结构的一部分。因此，框架区通过形成支架从而通过链间非共价相互作用使CDR定位在正确的方位上。具有特定位置的CDR的抗原结合域形成了与抗原上的表位互补的表面，该互补表面促进抗体和其抗原表位的非共价结合。对于给定的重链或轻链可变区，本领域普通技术人员都可以通过已知方法鉴定出包含CDR和框架区的氨基酸(参见Kabat,E.,et al.,U.S.Department of Health and Human Services,Sequences ofProteins of Immunological Interest,(1983)和Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.,196:901-917(1987))。
在本领域中使用和/或接受的术语有两个或多个定义的情况下，除非明确地对立指出，否则本文使用的术语的定义包括所有这些含义。一个具体的例子是使用“互补决定区”(“CDR”)一词来描述在重链和轻链多肽的可变区内发现的非连续的抗原结合位点。这一特定区域在Kabat et al.,U.S.Dept.of Health and Human Services,Sequences ofProteins of Immunological Interest(1983)和Chothia等在J.Mol.Biol.196:901-917(1987)有相关描述，其通过引用全部并入本文。
根据Kabat和Chothia定义的CDR包括相互比较时的氨基酸残基的重叠或子集。尽管如此，应用任一定义来指代抗体或其变体的CDR都在本发明范围内。包含特定CDR的确切残基编号将根据CDR的序列和大小而变化。本领域技术人员通常可以根据抗体的可变区氨基酸序列确定出CDR包含哪些特定的残基。
Kabat等人还定义了适用于任何抗体的可变区序列的编号系统。本领域普通技术人员可以不依赖于序列本身以外的其他实验数据将该“Kabat编号”系统应用到任何可变区序列。“Kabat编号”是指由Kabat et al.,U.S.Dept.of Health and Human Services在“Sequence of Proteinsof Immunological Interest”(1983)提出的编号系统。抗体还可以用EU或Chothia编号系统。
本发明公开的抗体可以来源于任何动物，包括鸟类和哺乳动物。较佳地，抗体是人源、鼠源、驴源、兔源、山羊源、骆驼源、美洲驼源、马源或鸡源抗体。
重链恒定区包括CH1结构域、铰链(例如上、中和/或下铰链区)结构域、CH2结构域、CH3结构域，或变体或片段中的至少一种。抗体的重链恒定区可以来源于不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的重链恒定区可以包括源自IgG1分子的CH1结构域和源自IgG3分子的铰链区。在另一实施方案中，重链恒定区可以包括部分源自IgG1分子和部分源自IgG3分子的铰链区。在另一实施方案中，部分重链可以包括部分源自IgG1分子和部分源自IgG4分子的嵌合铰链区。
“轻链恒定区”包括来自抗体轻链的一部分氨基酸序列。较佳地，轻链恒定区包含恒定κ结构域或恒定λ结构域中的至少一个。“轻链-重链对”是指可通过轻链的CL结构域和重链的CH1结构域之间的二硫键形成二聚体的轻链和重链的集合。
“VH结构域”包括免疫球蛋白重链的氨基末端可变结构域，“CH1结构域”包括免疫球蛋白重链的第一个(大部分氨基末端)恒定区。CH2结构域不与其它结构域紧密配对，而是在完整的天然IgG分子的两个CH2结构域之间插入两个N-连接的分支碳水化合物链。还有文献记载，CH3结构域从CH2结构域开始延伸到IgG分子的C-末端，大约包含108个残基。“铰链区”包括连接CH1结构域和CH2结构域的部分重链区域。所述铰链区包含约25个残基并且是有韧性的，从而使得两个N端抗原结合区能够独立移动。铰链区可以被细分为三个不同的结构域：上、中和下铰链结构域(Rouxetal.,J.Immunol 161:4083(1998))。
“二硫键”指两个硫原子之间形成的共价键。半胱氨酸的硫醇基团可以与第二个硫醇基团形成二硫键或桥接。在大多数天然存在的IgG分子中，CH1和CL区通过二硫键连接。
“嵌合抗体”指其可变区从第一个物种中获得或衍生，而其恒定区(可以是完整的、部分的或修饰过的)来源于第二个物种的任何抗体。某些实施方案中，可变区来自非人源(例如小鼠或灵长类动物)，而恒定区来自人源或鼠源。
“特异性结合”或“对……具有特异性”通常是指抗体或抗原结合片段与特定抗原通过其抗原结合结构域与表位互补性结合形成相对稳定的复合物。“特异性”可以用抗体或抗原结合片段与特定抗原或表位结合的相对亲和力表达。例如，如果抗体“A”比抗体“B”与同一抗原的相对亲和力大，可以认为抗体“A”比抗体“B”对该抗原具有更高的特异性。特异性结合可以用平衡解离常数(KD)来描述，较小的KD意味着较紧密的结合。确定两个分子是否特异性结合的方法是本领域内众所周知的，并包括例如平衡透析、表面等离子共振、生物膜层光学干涉测量法等。“特异性结合”抗原a的抗体包括与抗原a平衡解离常数KD小于或等于约100nM、小于或等于约10nM、小于或等于约5nM、小于或等于约1nM或小于或等于约0.5nM的抗体。
“治疗”是指治疗性治疗和预防性或防治性措施，其目的是预防、减缓、改善或停止不良的生理改变或紊乱，例如疾病的进程，包括但不限于以下无论是可检测还是不可检测的结果，症状的缓解、疾病程度的减小、疾病状态的稳定(即不恶化)、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善、缓和、减轻或消失(无论是部分还是全部)、延长与不接受治疗时预期的生存期限等。需要治疗的患者包括已经患有病症或紊乱的患者，容易患有病症或紊乱的患者，或者需要预防该病症或紊乱的患者，可以或预期从施用本发明公开的抗体或药物组合物用于检测、诊断过程和/或治疗中受益的患者。
“患者”指需要诊断、预后或治疗的任何哺乳动物，包括人类、狗、猫、兔子、鼠、马、牛等。
“约”指相关技术领域技术人员容易知道的相应数值的常规误差范围。在一些实施方式中，本文中提到“约”指所描述的数值以及其±10％、±5％或±1％的范围。
“EC50”即半最大效应浓度(concentration for 50％of maximal effect,EC50)是指能引起50％最大效应的浓度。
本发明中“亲本Fc区”可以为天然存在的Fc区，编码Fc区的基因可来自人、鼠、兔、骆驼、猴子，优选为人和小鼠；例如，亲本Fc区为SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:35中Fc区。
抗ICOS抗体
本发明提供了对ICOS蛋白具有亲和力的抗体或抗原其结合片段。受测抗体表现出有效的结合活性、生物学活性，并可用于治疗和诊断用途。比如，这些抗体或抗原结合片段可以激活下游信号通路，刺激淋巴细胞释放细胞因子，用于治疗各种类型的癌症、肿瘤或感染等相关疾病。
在一些实施方案中，所述抗体的重链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：16所示的重链可变区和如SEQ ID NO：32所示的重链恒定区，所述抗体的轻链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：23所示的轻链可变区和SEQ ID NO：33所示的轻链恒定区。
在一些实施方案中，所述抗体的重链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：17所示的重链可变区和SEQ ID NO：32所示的重链恒定区，所述抗体的轻链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：24所示的轻链可变区和SEQ ID NO：33所示的轻链恒定区。
在一些实施方案中，所述抗体的重链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：18所示的重链可变区和SEQ ID NO：32所示的重链恒定区，所述抗体的轻链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：25所示的轻链可变区和SEQ ID NO：33所示的轻链恒定区。
在一些实施方案中，所述抗体的重链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：16所示的重链可变区和SEQ ID NO：34所示的重链恒定区，所述抗体的轻链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：23所示的轻链可变区和SEQ ID NO：35所示的轻链恒定区。
在一些实施方案中，所述抗体的重链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：17所示的重链可变区和SEQ ID NO：34所示的重链恒定区，所述抗体的轻链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：24所示的轻链可变区和SEQ ID NO：35所示的轻链恒定区。
在一些实施方案中，所述抗体的重链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：18所示的重链可变区和SEQ ID NO：34所示的重链恒定区，所述抗体的轻链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：25所示的轻链可变区和SEQ ID NO：35所示的轻链恒定区。
在一些实施方案中，所述抗体的重链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：19所示的重链可变区和SEQ ID NO：34所示的重链恒定区，所述抗体的轻链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：26所示的轻链可变区和SEQ ID NO：35所示的轻链恒定区。
在一些实施方案中，所述抗体的重链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：19所示的重链可变区和SEQ ID NO：34所示的重链恒定区，所述抗体的轻链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：27所示的轻链可变区和SEQ ID NO：35所示的轻链恒定区。
在一些实施方案中，所述抗体的重链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：20所示的重链可变区和SEQ ID NO：34所示的重链恒定区，所述抗体的轻链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：28所示的轻链可变区和SEQ ID NO：35所示的轻链恒定区。
在一些实施方案中，所述抗体的重链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：20所示的重链可变区和SEQ ID NO：34所示的重链恒定区，所述抗体的轻链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：29所示的轻链可变区和SEQ ID NO：35所示的轻链恒定区。
在一些实施方案中，所述抗体的重链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：20所示的重链可变区和SEQ ID NO：34所示的重链恒定区，所述抗体的轻链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：30所示的轻链可变区和SEQ ID NO：35所示的轻链恒定区。
在一些实施方案中，所述抗体的重链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：21所示的重链可变区和SEQ ID NO：34所示的重链恒定区，所述抗体的轻链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：31所示的轻链可变区和SEQ ID NO：35所示的轻链恒定区。
在一些实施方案中，所述抗体的重链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：22所示的重链可变区和SEQ ID NO：34所示的重链恒定区，所述抗体的轻链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：31所示的轻链可变区和SEQ ID NO：35所示的轻链恒定区。
在一些实施方案中，本发明抗体含有两条相同的重链(或重链片段)和两条相同的轻链(或轻链片段)。
本领域普通技术人员还应当理解，本发明所公开抗体或抗原结合片段序列是可以被替换的，替换后其氨基酸序列不同于该抗体的天然存在的氨基酸序列。例如，替换后的氨基酸序列可以是与起始序列相似的，比如与起始序列具有一定比例的同一性，比如它可以与起始序列的同一性是约80％、约85％、约90％、约95％、约98％、约99％，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括终点)或其中任何值。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含氨基酸序列具有一个或多个修饰基团。例如，本发明公开的抗体或抗原结合片段可以包含有韧性的接头序列，或者可以被修饰以添加功能性基团(例如PEG、药物、毒素或标签)。
本发明公开的抗体、抗原结合片段包括被修饰的衍生物，即通过任何类型的分子与抗体或抗原结合片段的共价连接进行修饰，其中共价连接不会阻止抗体或抗原结合片段与表位结合。包括但不限制以下实例，抗体或抗原结合片段可以被糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割、连接至细胞配体或其他蛋白质等。众多化学修饰中的任一种修饰可以通过现有技术进行，包括但不限于特异性化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可以与治疗剂、药物前体、肽、蛋白质、酶、病毒、脂类、生物反应调节剂、药剂或PEG缀合。
抗体或抗原结合片段可通过将其偶联至化学发光化合物来被可检测地标记。然后通过检测在化学反应过程中出现的发光从而确定化学发光标记的抗体或抗原结合片段的存在。化学发光标记化合物的实例包括鲁米诺、异鲁米诺、芳香吖啶酯、咪唑、吖啶盐和草酸酯。
抗体和编码抗体的多聚核苷酸的制备方法
本发明还公开了编码本发明所述抗体、抗原结合片段、及其衍生物的多聚核苷酸或核酸分子。本发明公开的多聚核苷酸可以编码重链可变区、轻链可变区、Fc区、部分重链可变区、部分轻链可变区、重链或轻链等。制备抗体的方法是本领域公知的并且在本发明中有所描述。
在某些实施方案中，制备的抗体不会在待治疗的动物(例如人类)中引起有害的免疫应答。在一些实施方案中，本发明公开的抗体、抗原结合片段、或衍生物使用本领域公认的技术修饰以降低其免疫原性。例如，抗体可以被人源化、灵长类化、去免疫化或者可以制备嵌合抗体。这些类型的抗体来源于非人抗体，通常是鼠类或灵长类抗体，其保留或基本保留亲本抗体的抗原结合特性但在人体中免疫原性较低。其可以通过多种方法来实现，包括(a)将整个非人源的可变区移植到人源的恒定区以产生嵌合抗体；(b)将一个或多个非人类互补决定区(CDR)的至少一部分移植到人源的框架和恒定区中，保留或不保留关键的框架残基；或(c)移植整个非人源的可变区，但通过用类人源的部分置换表面残基从而“隐藏”它们。通常人框架区中的框架残基将被来自CDR供体抗体的相应残基取代，比如能够改善抗原结合的残基。这些框架替换可以通过本领域公知的方法鉴定，例如通过模拟CDR和框架残基的相互作用以鉴定对抗原结合起重要作用的框架残基和通过序列对比以鉴定特定位置上异常的框架残基。(参考美国专利5,585,089；Riechmann et al.,Nature 332:323(1988)；其全部内容通过引用并入本文)。可以使用本领域公知的多种技术使抗体人源化，例如CDR移植(EP239,400；WO 91/09967；美国专利5,225,539,5,530,101和5,585,089)，修复或者表面重排(EP592,106；EP519,596；Padlan,et al.,Molecular Immunology 28(4/5):489-498(1991)；Studnicka et al.,Protein Engineering 7(6):805-814(1994)；Roguska,etal.,Proc.Natl.Sci.USA 91:969-973(1994))，以及链的重排(美国专利5,565,332)，其全部内容通过引用并入本文。
去免疫化也可用于降低抗体的免疫原性。在本发明中，术语“去免疫化”包括改变抗体以修饰T细胞表位(参见例如WO/9852976A1和WO/0034317A2)。例如，分析来自起始抗体的重链可变区序列和轻链可变区序列，并产生来自每个可变区的人T细胞表位“图谱”，显示表位相对于互补决定区(CDRs)和序列内其它关键残基的位置。分析来自T细胞表位图的单个T细胞表位，以鉴定具有较低改变抗体活性风险的可选择的氨基酸取代。设计包含氨基酸取代组合的一系列可选的重链可变区序列和轻链可变区序列，随后将这些序列掺入到一系列结合多肽中。然后将包含修饰过的可变区和人类恒定区的完整重链和轻链的基因克隆到表达载体中，随后将质粒转入细胞系以产生完整的抗体。然后利用合适的生物化学和生物学实验中比较抗体，鉴定出最佳的抗体。
本发明公开的抗体或抗原结合片段的结合特异性可以通过体外实验，例如免疫共沉淀、放射免疫实验(RIA)或酶联免疫吸附实验(ELISA)来检测。
scFv的制备可参见生产单链单元的技术(美国专利4,694,778；Bird,Science242:423-442(1988)、Huston et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 55:5879-5883(1988)和Wardet al.,Nature 334:544-554(1989)和Nie et al.,Antibody Therapeutics 3(1):18-62(2020))。通过氨基酸桥接Fv区的重链和轻链片段形成单链单元，产生单链融合肽。也可以使用在大肠杆菌中组装功能性Fv片段的技术(Skerra et al.,Science 242:1038-1041(1988))。
可用于生产单链Fv(scFv)和抗体的技术的实例包括如美国专利4,946,778和5,258,498，以及Huston et al.,Methods in Enzymology 203:46-88(1991)、Shu et al.,Proc.Natl.Sci.USA 90:1995-1999(1993)和Skerra et al.,Science 240:1038-1040(1988)中所述。对于包括在人体内使用抗体和体外检测实验的某些用途，可以使用嵌合抗体、人源化抗体或全人源抗体。嵌合抗体是抗体的不同部分源自不同动物物种的一类分子，例如具有鼠源单克隆抗体的可变区和人源免疫球蛋白恒定区的抗体。生产嵌合抗体的方法是本领域已知的，参见Morrison,Science 229:1202(1985)；Oi et al.,BioTechniques 4:214(1986)；Gillies et al.,J.Immunol.Methods 125:191-202(1989)；Neuberger etal.,Nature372:604-608(1984)；Takeda et al.,Nature 314:452-454(1985)；和美国专利5,807,715、4,816,567和4,816,397，其全部内容通过引用并入本文。
此外，在Newman,Biotechnology 10:1455-1460(1992)中公开了另一种生产重组抗体的高效方法，特别地，该技术能产生含有猴可变区和人恒定区序列的灵长类抗体，该参考文献的全部内容通过引用并入本文。此外，该技术也在美国专利5,658,570、5,693,780和5,756,096中有所提及，每个专利的全部内容通过引用并入本文。
抗体可以通过本领域已知的多种方法制备，包括使用来自免疫球蛋白序列的抗体文库进行的噬菌体展示方法。也可参考美国专利4,444,887和4,716,111，以及PCT公布文本WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735和WO91/10741，每个专利的全部内容通过引用并入本文。
在另一实施方案中，使用常规方法(例如使用能够特异性结合编码鼠抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)，可以分离编码所需单克隆抗体的DNA并对其进行测序。分离的和亚克隆的杂交瘤细胞可以作为此类DNA的来源。一旦分离出来，DNA可以被置于表达载体中，然后被转染到原核或真核宿主细胞如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不产生其他免疫球蛋白的骨髓瘤细胞中。分离的DNA(如本文所述可以是合成的)也可用于制备抗体的恒定区和可变区的序列，如美国专利5,658,570中所述，其全部内容通过引用并入本文。该方法从所选细胞中提取RNA并转化成cDNA，然后使用Ig特异性引物通过PCR技术进行扩增。适于此目的的合适的探针在美国专利5,658,570中也有所提及。
此外，使用常规重组DNA技术，可将本发明的抗体的一个或多个CDR插入框架区，例如插入到人类框架区以构建人源化非全人源抗体。框架区可以是天然存在的或共有的框架区，优选人类框架区(参见Chothia et al.,J.Mol.Biol.278:457-479(1998)，其列出一系列人类框架区)。一些多核苷酸可以编码框架区和CDR组合产生的与目标抗原的至少一个表位特异性结合的抗体。在框架区内可以进行一个或多个氨基酸取代，可以选择能够改善抗体与其抗原结合的氨基酸取代。另外，可用此法进行参与链间二硫键形成的一个或多个可变区中半胱氨酸残基的取代或缺失，从而产生缺少一个或多个链间二硫键的抗体分子。本领域技术范围内的对多核苷酸进行的其他改变也涵盖于本发明中。
抗体可以通过使用常规重组DNA技术制备。使用本领域技术人员公知的技术可以选择、构建和培养生产抗体的载体及细胞系等。这些技术在各种实验室手册和主要出版物中均有描述，例如Recombinant DNA Technology for Production of ProteinTherapeutics in Cultured Mammalian Cells，D.L.Hacker,F.M.Wurm,in ReferenceModule in Life Sciences,2017，其全部内容包括补充内容通过引用并入全文。
在一些实施方案中，可以按常规方法根据本文所述抗体氨基酸序列设计合成编码抗体的DNA，将其置入表达载体中，然后转染宿主细胞，在培养基中培养被转染的宿主细胞产生单克隆抗体。在一些实施方案中，表达抗体载体包括至少一个启动子元件，抗体编码序列，转录终止信号和polyA尾。其他元件包括增强子，Kozak序列及插入序列两侧RNA剪接的供体和受体位点。可以通过SV40的前期和后期启动子，来自逆转录病毒的长末端重复序列如RSV、HTLV1、HIVI及巨细胞病毒的早期启动子来获得高效的转录，也可应用其它一些细胞的启动子如肌动蛋白启动子。合适的表达载体可包括pIRES1neo，pRetro-Off，pRetro-On，PLXSN，或者Plncx，pcDNA3.1(+/-)，pcDNA/Zeo(+/-)，pcDNA3.1/Hygro(+/-)，PSVL，PMSG，pRSVcat，pSV2dhfr，pBC12MI和pCS2等。常使用的哺乳动物细胞包括293细胞，Cos1细胞，Cos7细胞，CV1细胞，鼠L细胞和CHO细胞等。
在一些实施方案中，插入基因片段需含有筛选标记，常见的筛选标记包括二氢叶酸还原酶，谷氨酰胺合成酶，新霉素抗性，潮霉素抗性等筛选基因，以便于转染成功的细胞的筛选分离。将构建好的质粒转染到无上述基因的宿主细胞，经过选择性培养基培养，转染成功的细胞大量生长，产生想要获得的目的蛋白。
此外，可以使用本领域技术人员已知的标准技术在编码本发明所述抗体的核苷酸序列中引入突变，包括但不限于导致氨基酸取代的定点突变和PCR介导的突变。变体(包括衍生物)编码相对于原重链可变区和轻链可变区来说少于50个氨基酸的取代、少于40个氨基酸的替换、少于30个氨基酸的取代、少于25个氨基酸的取代、少于20个氨基酸的取代、少于15个氨基酸的取代、少于10个氨基酸的取代、少于5个氨基酸的取代、少于4个氨基酸的取代、少于3个氨基酸的取代或少于2个氨基酸的取代。或者可以沿着全部或部分编码序列时随机引入突变，例如通过饱和突变，以及可以筛选所得突变体的生物活性以鉴定保留活性的突变体。
治疗方法
本发明还提供了治疗方法和用途。在一些实施方案中，提供了用于治疗或改善各种类型的癌症、肿瘤或感染等相关疾病的方法，所述方法包括向患者施用有效剂量的抗ICOS抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，提供了抗ICOS抗体或抗原结合片段在用于治疗或改善癌症、肿瘤或感染等相关疾病中的应用。在一些实施方案中，提供了所述抗ICOS抗体或抗原结合片段在制备用于治疗或改善癌症、肿瘤或感染等相关疾病的药物中的应用。
对于任何特定患者的具体剂量和治疗方案将取决于各种因素，包括所使用的特定抗体或衍生物、患者的年龄和体重、一般健康状况、性别和饮食，以及给药时间、排泄频率、药物组合，以及所治疗的特定疾病的严重程度。由包括在本领域普通技术人员范围内的医疗护理人员对这些因素进行判断。所述剂量还将取决于待治疗的个体患者、给药途径、制剂类型、所用化合物的特性、疾病的严重程度以及所需的效果。所用剂量可以通过本领域熟知的药理学和药代动力学原理确定。
抗体或衍生物的施用方法包括但不限于真皮内、肌肉、腹腔、静脉、皮下、鼻腔、硬脊膜外和口服注射。药物组合物可以通过任何方便的途径施用，例如通过输注或推注，通过上皮或皮肤粘膜(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收，并且可以与其他生物活性剂共同施用。因此，含有本发明抗体或抗原结合片段的药物组合物可以口服给药、直肠给药、肠胃外给药、脑池内给药、阴道内给药、腹腔内给药、外敷(如通过粉末，软膏，滴剂或透皮贴剂)、口腔给药或通过口服或鼻腔喷雾给药。
本发明使用的术语“肠胃外”是指包括静脉内、肌肉内、腹腔内、胸骨内、皮下和关节内注射和输注的施用方式。
施用方式可以是全身施用或局部施用。此外，可能需要通过任何合适的途径将本发明的抗体引入中枢神经系统，包括脑室内和鞘内注射；脑室内注射可以通过脑室内导管连接到如贮液囊(可以是Ommaya贮液囊)来辅助注射。也可以通过肺部给药，例如通过使用吸入器或喷雾器，以及使用雾化的制剂。
本发明抗体可以局部施用于需要治疗的区域；可以通过但不限于以下方式：手术期间局部输注，例如与手术后伤口敷料联合的局部应用，通过注射，通过导管，借助栓剂或借助植入物来实现，所述植入物是多孔的、无孔的或凝胶状的材料，包括膜(例如硅橡胶膜)或纤维。优选地，当施用本发明的蛋白质(包括抗体)时，必须注意使用不吸收蛋白质的材料。
在一些实施方案中，本发明组合物包含编码抗体的核酸或多聚核苷酸，可以通过将其构建为合适的核酸表达载体的一部分来体内施用所述核酸以促进其编码的蛋白质的表达，然后通过下述方式施用上述部分载体使其变为胞内部分，例如通过使用逆转录病毒载体(参见美国专利4,980,286)，或通过直接注射，或通过使用微粒轰击(例如基因枪；Biolistic，Dupont)，或用脂质或细胞表面受体或转染试剂包被，或者通过与已知进入细胞核的同源异型盒类肽连接施用(参见例如Joliot et al.,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:1864-1868)等等。可选地，核酸可以通过同源重组在引入细胞内并整合至宿主细胞DNA中用于表达。
在一些实施方案中，本发明抗体施用于患者的剂量为0.01mg/kg至100mg/kg患者体重，或0.1mg/kg至20mg/kg患者的体重。在初始剂量之后可随后给予第二剂或多剂该抗体或抗原结合片段，其剂量与初始剂量大致相同或较少，其中该随后的剂量可相隔至少1天至3天；或至少一星期。可以通过例如脂质化等修饰来增强抗体的摄取和组织穿透能力(例如进入脑内)，从而减少本发明抗体的施用的剂量和频率。
通常在进行体外测试用于治疗疾病的方法，包括施用本发明所述抗体或衍生物，然后在可接受的动物模型中体内测试期望的治疗性或预防性活性，最后施用于人体。合适的动物模型(包括转基因动物)是本领域普通技术人员所公知的。例如，用于证明本发明所述抗体、抗原结合片段的治疗用途的体外测定包括抗体对细胞系或患者组织样品的影响。抗体对细胞系和/或组织样品的作用可以利用本领域技术人员已知的技术进行检测，例如本发明其他部分公开的技术。根据本发明的内容，可用于确定是否施用特异性抗体的体外测定实验包括体外细胞培养实验，其中患者组织样品在培养物中培养，并暴露于或以其他方式施用化合物，并观察这种化合物对组织样品的影响。
各种已知输送系统可用于施用本发明抗体或衍生物或编码其的多核苷酸，例如包封于脂质体、微粒、微胶囊、能够表达所述化合物的重组细胞、受体介导的内吞作用(参见例如Wu and Wu,1987,J.Biol.Chem.262:4429-4432)、作为逆转录病毒或其它载体的一部分的核酸的构建等。
联合疗法
在一些实施方案中，本发明抗ICOS抗体或抗原结合片段可以结合其它治疗或预防方案，包括施用一种或多种本发明抗体或抗原结合片段以及一种或多种其它治疗剂或方法一起使用或组合使用。在一些实施方案中，其他治疗方案包括但不限于放射疗法、化学疗法、激素疗法等。对于组合治疗，抗体可以与其它治疗剂可同时或分开施用。当分开施用时，可以在施用另一种其它治疗剂之前或之后施用本发明抗体。
在一些实施方案中，本发明抗体与化疗剂组合施用。在一些实施方案中，化学治疗剂包括但不限于卡培他滨(capectiabine)、环磷酰胺、达卡巴嗪、替莫唑胺、环磷酰胺、多西他赛、多柔比星、柔红霉素、顺铂、卡铂、表柔比星、艾日布林、5-FU、吉西他滨、伊立替康、伊沙匹隆、甲氨蝶呤、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、nab-紫杉醇、(蛋白质结合紫杉醇)、培美曲塞、长春瑞滨和长春新碱。在一些实施方案中，本发明抗体与(Celgene)一起施用。在一些实施方案中，本发明抗体与至少一种激酶抑制剂一起施用。在一些实施方案中，激酶抑制剂包括但不限于埃罗替尼、阿法替尼、吉非替尼、克唑替尼、达拉菲尼、曲美替尼、威罗菲尼和考比替尼(cobimetanib)。
在一些实施方案中，本发明抗体与激动剂抗OX40抗体一起施用。在一些实施方案中，本发明抗体与抗CTLA4抗体一起施用。在一些实施方案中，本发明抗体与伊匹单抗(ipilimumab)一起施用。
在一些实施方案中，本发明抗体与PD-1疗法一起施用。示例性PD-1疗法包括但不限于纳武单抗(BMS-936558、MDX-1106、ONO-4538)；pidilizumab、lambrolizumab/派姆单抗(KEYTRUDA，MK-3475)；durvalumab(抗PD-L1抗体、MEDI-4736；AstraZeneca/MedImmune)；RG-7446；avelumab(抗PD-L1抗体；MSB-0010718C；Pfizer)；AMP-224；BMS-936559(抗PD-L1抗体)；AMP-514；MDX-1105；ANB-011；抗LAG-3/PD-1；抗PD-1抗体(CoStim)；抗PD-1抗体(Kadmon Pharm.)；抗PD-1抗体(Immunovo)；抗TIM-3/PD-1抗体(AnaptysBio)；抗PD-L1抗体(CoStim/Novartis)；RG7446/MPDL3280A(抗PD-L1抗体，Genentech/Roche)；KD-033、PD-1拮抗剂(Agenus)；STI-A1010；STI-A1110；TSR-042；以及针对程序性死亡1(PD-1)或程序性死亡配体1(PD-L1)的其他抗体。
药物组合物
本发明还提供了药物组合物。这样的组合物包含有效剂量的抗ICOS抗体或抗原结合片段以及药学上可接受的载体。在一些实施方案中，药物组合物包含0.1％-90％的抗ICOS抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，药物组合物还包含抗癌剂(例如免疫检查点抑制剂)。
在一些实施方案中，术语“药学上可接受的”是指由政府的监管机构批准的或公认药典中列出的用于动物，特别是用于人类的物质。此外，“药学上可接受的载体”通常指是任何类型的无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或制剂助剂等。
术语“载体”是指可以与活性成分一起施用于患者的稀释剂、佐剂、赋形剂或载体。这此类药物载体可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动植物或合成来源的油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当药物组合物静脉内给药时，水是优选的载体。盐水溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液也可用作液体载体，特别是用于注射溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如有需要，组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐。抗菌剂如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯、抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠、螯合剂如乙二胺四乙酸，以及调节张力的试剂如氯化钠或右旋葡萄糖也是可以预见的。这些组合物可以采取溶液、悬液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、散剂、缓释制剂等形式。该组合物可以用传统的粘合剂和载体如甘油三酯配制成栓剂。口服制剂可以包括标准载体，例如药物等级的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药物载体的实例在E.W.Martin的Remington'sPharmaceutical Sciences中有描述，在此通过引用并入本发明。此类组合物将含有临床有效剂量的抗体或抗原结合片段，优选以纯化后的形式，连同合适数量的载体，以提供适合于患者的给药形式。该制剂应该适用于给药模式。肠胃外给药的制剂可以封装在安瓿瓶、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。
在一些实施方案中，根据常规步骤将组合物配制成适合静脉内注射于人体的药物组合物。用于静脉内给药的组合物通常是在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。组合物还可包含增溶剂和局部麻醉剂如利多卡因，从而缓解注射部位的疼痛。一般而言，有效成分以单位剂量形式单独供给或混在一起供给，如以干燥的冻干粉末或无水浓缩物的形式装在可指示活性剂份量的密封容器(如安瓿瓶或小袋)中。在通过输注施用组合物的情况下，可以用含有无菌药用级水或盐水的输液瓶来分装组合物。在通过注射施用组合物的情况下，可以使用注射用的无菌水或盐水的安瓿瓶，使得可以在施用之前混合有效成分。
本发明的化合物可以配制成中性的或盐的形式。药学上可接受的盐包括衍生自如盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的阴离子形成的盐，以及衍生自如钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的阳离子形成的盐。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到或采用现有技术进行制备。
实施例1:
1.1抗原的制备
hICOS-Fc的制备：将人ICOS胞外结构域(SEQ ID NO:49)通过连接子(IEGRMD，SEQID NO:50)与人Fc(SEQ ID NO:51)构建成hICOS-Fc(SEQ ID NO:52)。将hICOS-Fc的基因序列克隆至表达载体中，然后转染宿主细胞后纯化，获得hICOS-Fc。
小鼠ICOS-Fc的制备：将小鼠ICOS胞外结构域(SEQ ID NO:53)通过连接子(IEGRMD，SEQ ID NO:50)与人Fc(SEQ ID NO:51)构建成小鼠ICOS-Fc(SEQ ID NO:54)。将小鼠ICOS-Fc的基因序列克隆至表达载体中，然后转染宿主细胞后纯化，获得小鼠ICOS-Fc。
人ICOS胞外结构域的氨基酸序列：
MKSGLWYFFLFCLRIKVLTGEINGSANYEMFIFHNGGVQILCKYPDIVQQFKMQLLKGGQILCDLTKTKGSGNTVSIKSLKFCHSQLSNNSVSFFLYNLDHSHANYYFCNLSIFDPPPFKVTLTGGYLHIYESQLCCQLK(SEQID NO:49)
小鼠ICOS胞外结构域的氨基酸序列：
MKPYFCRVFVFCFLIRLLTGEINGSADHRMFSFHNGGVQISCKYPETVQQLKMRLFREREVLCELTKTKGSGNAVSIKNPMLCLYHLSNNSVSFFLNNPDSSQGSYYFCSLSIFDPPPFQERNLSGGYLHIYESQLCCQLKLWL(SEQ ID NO:53)
人Fc的氨基酸序列：
PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:51)
hICOS-Fc的氨基酸序列：
MKSGLWYFFLFCLRIKVLTGEINGSANYEMFIFHNGGVQILCKYPDIVQQFKMQLLKGGQILCDLTKTKGSGNTVSIKSLKFCHSQLSNNSVSFFLYNLDHSHANYYFCNLSIFDPPPFKVTLTGGYLHIYESQLCCQLKIEGRMDPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:52)
小鼠ICOS-Fc的氨基酸序列：
MKPYFCRVFVFCFLIRLLTGEINGSADHRMFSFHNGGVQISCKYPETVQQLKMRLFREREVLCELTKTKGSGNAVSIKNPMLCLYHLSNNSVSFFLNNPDSSQGSYYFCSLSIFDPPPFQERNLSGGYLHIYESQLCCQLKLWLIEGRMDPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:54)
1.2抗ICOS抗体的制备方法
抗体实例相关的氨基酸序列和核酸序列见表1-8，抗体的重链、轻链组成见表1，36E5、37F6和37B1为鼠源抗体，36E5-chmrc、37F6-chmrc和37B1-chmrc为嵌合抗体，36E5-hu.V1、36E5-hu.V2、36E5-hu.V4、36E5-hu.V5、36E5-hu.V6、37B1-hu.V1和37B1-hu.V4为人源化抗体。
将抗体的重链和轻链的氨基酸序列依照宿主细胞密码子偏好性特点进行序列优化，得到重链和轻链的DNA序列。为了便于在宿主细胞中表达，分别在重链和轻链的氨基酸端添加了信号肽：如，鼠源抗体36E5的重链的信号肽为
MYLGLSCVFIVFLLKGVQC(SEQ ID NO:42)，鼠源抗体36E5的轻链的信号肽为MRPSIQFLGLLLFWLHGTQC(SEQ ID NO:43)；鼠源抗体37F6的重链的信号肽为MYLGLSCVFIVFLLKGVQC(SEQ ID NO:42)，鼠源抗体37F6的轻链的信号肽为MRPSIQFLGLLLFWLHGAQC(SEQ ID NO:44)；鼠源抗体37B1的重链的信号肽为MKCSWVIFFLMAMVIGISS(SEQ ID NO:45)，鼠源抗体37B1的轻链的信号肽为MRCLAEFLGLLVLWIPGTIG(SEQ ID NO:46)。嵌合抗体及人源化抗体的重链的信号肽为MEFGLSWVFLVAILKGVQC(SEQ ID NO:47)，嵌合抗体及人源化抗体的轻链的信号肽为MDMRVLAQLLGLLLLCFPGARC(SEQ ID NO:48)。
将优化并合成的序列分别克隆至载体(载体可选pCDNA3.1TM(+))中，然后分别抽提大量质粒，重链和轻链按质粒摩尔比1:1瞬时表达转染至HEK293F细胞。细胞表达后培养液经由固定化金属亲和层析(IMAC)采用Protein A柱(GE Healthcare)纯化分泌的含两条重链和两条轻链的抗体蛋白，使抗体的纯度＞95％，测序结果与预计的序列相同，用于亲和力检测和生物活性鉴定。
表1抗体的组成(VH、VL分别表示重链和轻链的可变区，CH、CL分别表示重链和轻链的恒定区)
Figure BDA0003427150130000261
表2抗体CDR区的氨基酸序列
Figure BDA0003427150130000262
表3抗体CDR区的组成
名称 CDR1序列号 CDR2序列号 CDR3序列号
36E5的HCDR 1 4 6
36E5的LCDR 9 11 14
37F6的HCDR 2 4 7
37F6的LCDR 9 12 14
37B1的HCDR 3 5 8
37B1的LCDR 10 13 15
表4鼠源抗体可变区的氨基酸序列
Figure BDA0003427150130000271
表5人源抗体可变区的氨基酸序列
Figure BDA0003427150130000272
Figure BDA0003427150130000281
表6抗体恒定区的氨基酸序列
Figure BDA0003427150130000282
Figure BDA0003427150130000291
表7鼠源抗体的相关核酸序列(下划线标出信号肽的核酸序列)
Figure BDA0003427150130000292
Figure BDA0003427150130000301
Figure BDA0003427150130000311
实施例2抗体结合活性的测定
鼠源抗体采用ELISA方法，先包被10ng的小鼠ICOS-Fc，4℃过夜；洗涤后，再孵育抗ICOS抗体和对照抗体，最后通过HRP标记驴抗小鼠IgG(上海生工，货号D110085)进行标记显色；检测所得的EC50值如表8。其中，对照抗体37A10S713见专利CN107530428A，重链恒定区来源于人IgG1，轻链恒定区为κ轻链恒定区；对照抗体表达的细胞为HEK293F。
表8鼠源抗体与抗原结合的EC50值
Figure BDA0003427150130000312
实施例3抗体亲和力的测定
通过生物光干涉检测抗ICOS抗体的亲和力，ForteBio亲和力测定按照现有的常规方法(Estep,P等MAbs,2013,5(2):270-8)，具体实验方法为：传感器在分析缓冲液(如PBS)中线下平衡20分钟，然后上机检测60秒建立信号基线，上机加载纯化后抗体至相应传感器(ForteBio)上，最后进行ForteBio亲和力测量；采用SA传感器吸附生物素化的抗体，再分别检测抗体与hICOS-Fc抗原的结合与解离，各约5min，结果如表9。最后都用1:1结合模型进行动力学的分析。
如表9所示，抗体37B1-chmrc、37B1-hu.V1和37B1-hu.V4能明显结合hICOS-FC，且37B1-hu.V1和37B1-hu.V4的亲和力优于对照抗体37A10S713的亲和力。
表9抗体与hICOS-FC的亲和力
Figure BDA0003427150130000313
Figure BDA0003427150130000321
实施例4抗体与表达ICOS的CHO的结合活性
通过将带有人ICOS胞外端cDNA的pCMV载体(Invirogen公司)转染CHO细胞产生过表达人ICOS的CHO细胞(CHO-hICOS细胞)。将CHO-hICOS细胞(0.5×106个细胞)与抗体在PBS(含0.1％BSA)中置于冰上孵育40分钟。然后将细胞洗涤两次，并与PE标记山羊抗人IgG Fc二抗(Invitrogen，货号12-4998-82)在PBS(含0.1％BSA)中置于冰上孵育25分钟。将细胞洗涤两次，在Accuri C6系统(BD Biosciences)上进行流式细胞术分析，结果见图1。其中，对照抗体JMab136的序列见专利CN100482688C(其重链恒定区为人IgG1的重链恒定区，轻链恒定区为κ轻链恒定区)，对照抗体314.8的序列见专利WO2012131004A2(其重链恒定区为人IgG1的重链恒定区，轻链恒定区为κ轻链恒定区)，对照抗体表达的细胞为HEK293F。
如图1A、1B和1C所示，本申请嵌合抗体和人源化抗体均能结合表达ICOS的CHO细胞。
实施例5细胞因子的检测
试验方法：将来自健康供体的PBMC采用金黄色葡萄球菌肠毒素C(SEC)和抗ICOS抗体刺激，48h后收集上清液；参考R&D的Quantikine ELISA Kit说明书(IFN-γ、TNF-α和IL-10)，检测IFN-γ、TNF-α和IL-10的含量。
如图2所示，本申请抗ICOS嵌合抗体能提高细胞分泌IFN-γ、TNF-α和IL-10，尤其显著提高细胞分泌IFN-γ和IL-10。
序列表
<110> 百奥泰生物制药股份有限公司
<120> 抗ICOS抗体及其应用
<150> PCT/CN2020/138748
<151> 2020-12-23
<160> 54
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Asp Tyr Trp Met Asn
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Asp Tyr Trp Ile Asn
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Asp Tyr Tyr Ile His
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gln Ile Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Phe Glu Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly Gln Ile Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Phe Glu Thr Tyr Tyr
20 25 30
Ser Asp Ser Val Lys Gly
35
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Trp Ile Asp Pro Ala Leu Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe Gln
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Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Pro Met Ile Ala Ser Pro Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val
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<210> 7
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Pro Met Val Thr Ser Pro Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Trp Asn Asp Tyr Asp Gly Gly Phe Ala Tyr
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys His Ile Ala
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Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr
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Asp Thr Ser Ser Leu Gln Pro
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Asp Thr Ser Thr Leu Gln Pro
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Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser
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Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Phe Thr
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Met Gln His Leu Glu Tyr Pro His Thr
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Glu Val Lys Leu Glu Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Pro Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gln Ile Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Phe Glu Thr Tyr Tyr Ser Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Pro Glu Asp Met Gly Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ser Leu Pro Met Ile Ala Ser Pro Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp
100 105 110
Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<400> 17
Glu Val Lys Leu Glu Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Pro Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gln Ile Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Phe Glu Thr Tyr Tyr Ser Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Pro Glu Asp Met Gly Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ser Leu Pro Met Val Thr Ser Pro Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp
100 105 110
Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<400> 18
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Val Arg Ser Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Asn Asp Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Asn Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Ala Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Ala Leu Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Ala Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Tyr Ala Trp Asn Asp Tyr Asp Gly Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115
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<212> PRT
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<400> 19
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gln Ile Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Phe Glu Thr Tyr Tyr Ser Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ser Leu Pro Met Ile Ala Ser Pro Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp
100 105 110
Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
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<210> 20
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gln Ile Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Phe Glu Thr Tyr Tyr Ser Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ser Leu Pro Met Ile Ala Ser Pro Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 21
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Asn Asp Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Asp Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Ala Leu Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Tyr Ala Trp Asn Asp Tyr Asp Gly Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 22
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Asn Asp Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Asp Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Ala Leu Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Tyr Ala Trp Asn Asp Tyr Asp Gly Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 23
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
Asp Ile His Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys His
20 25 30
Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
His Asp Thr Ser Ser Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ser Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 24
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys His
20 25 30
Ile Ala Trp Tyr Gln Tyr Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
His Asp Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ser Ser Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 25
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Ile Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro His Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys
100 105 110
<210> 26
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys His
20 25 30
Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
His Asp Thr Ser Ser Leu Gln Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Arg Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 27
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys His
20 25 30
Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
His Asp Thr Ser Ser Leu Gln Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 28
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys His
20 25 30
Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
His Asp Thr Ser Ser Leu Gln Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 29
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys His
20 25 30
Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
His Asp Thr Ser Ser Leu Gln Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Arg Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 30
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys His
20 25 30
Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Thr Ser Ser Leu Gln Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Arg Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 31
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Met Asn Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro His Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 32
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly
1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu
50 55 60
Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile
65 70 75 80
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
85 90 95
Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp
145 150 155 160
Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg
165 170 175
Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln
180 185 190
His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn
195 200 205
Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly
210 215 220
Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met
245 250 255
Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu
260 265 270
Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe
275 280 285
Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn
290 295 300
Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr
305 310 315 320
Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
325 330
<210> 33
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
35 40 45
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
65 70 75 80
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
85 90 95
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
100 105
<210> 34
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 35
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 36
<211> 429
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
atgtacttgg gactgagctg tgtattcatt gtttttctct taaaaggtgt ccagtgtgag 60
gtgaagctgg aagagactgg aggaggcttg gtgcaacctg ggaggcccat gaaactctcc 120
tgtgttgcct ctggattcac ttttagtgac tactggatga actgggtccg ccagtctcca 180
gagaaaggac tggagtgggt agcacaaatt agaaacaaac cttataattt tgaaacatat 240
tattcagatt ctgtgaaagg cagattcacc atctcaagag atgattccaa aagtagcgtc 300
tacctgcaaa tgaacaactt aagacctgaa gacatgggtg tctattactg ttcacttcct 360
atgatagcga gtccctcata ctggtacttc gatgtctggg gcgctgggac cacggtcacc 420
gtctcctca 429
<210> 37
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
atgagaccgt ctattcagtt cctggggctc ttgttgttct ggcttcatgg tactcagtgt 60
gacatccaca tgacacagtc tccatcctca ctgtctgcat ctctgggagg caaagtcacc 120
atcacttgca aggccagcca agacattaac aagcatatag cttggtacca acacaagcct 180
ggaaaaggtc ctaggcttct catacatgac acatcttcat tgcagccagg catcccctca 240
aggttcagtg gaagtgggtc tgggagagat tattccttca gcatcagcaa cctggagcct 300
gaagatattt caacttatta ttgtctacag tatgataatc tattcacgtt cggctcgggg 360
acaaagttgg aaataaaa 378
<210> 38
<211> 429
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
atgtacttgg gactgagctg tgtattcatt gtttttctct taaaaggtgt ccagtgtgag 60
gtgaagctgg aagagactgg aggaggcttg gtgcaacctg ggaggcccat gaaactctcc 120
tgtgttgcct ctggattcac ttttagtgac tactggataa actgggtccg ccagtctcca 180
gagaaaggac tggagtgggt agcacaaatt agaaacaaac cttataattt tgaaacatat 240
tattcagatt ctgtgaaagg cagattcacc atctcaagag atgattccaa aagtagcgtc 300
tacctgcaaa tgaacaactt aagacctgaa gacatgggtg tctattactg ttcacttcct 360
atggtaacga gtccttcata ctggtacttc gatgtctggg gcgcagggac cacggtcacc 420
gtctcctca 429
<210> 39
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
atgagaccgt ctattcagtt cctggggctc ttgttgttct ggcttcatgg tgctcagtgt 60
gacatccaga tgacacagtc tccatcctca ctgtctgcat ctctgggagg caaagtcacc 120
atcacttgca aggccagcca agacattaac aaacatatag cttggtacca gtacaagcct 180
ggaaaaggtc ctaggcttct catacatgac acatctacat tgcagccagg catcccatca 240
agattcagtg gaagtgggtc tgggagagat tattccttca gcatcagcaa cctggagcct 300
gaagatattt caagttatta ttgtctacag tatgataatc tattcacgtt cggcccgggg 360
acaaagttgg aaataaaa 378
<210> 40
<211> 414
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
atgaaatgca gctgggtcat cttcttcctg atggcaatgg ttataggaat cagttcagag 60
gttcagctgc agcagtctgg gtcagagctt gtgaggtcag gggcctccgt caagttgtcc 120
tgcacagctt ctggcttcaa cattaacgac tactatatac actgggtgaa ccagaggcct 180
gaacagggcc tggcgtggat tggatggatt gatcctgcac ttggtgatac tgagtatgcc 240
ccgaagttcc agggccaggc cactatgact gcagacacat cctccaacac agcctacctg 300
caactcagca gcctgacatc tgaggacgct gccgtctatt actgttatgc atggaatgat 360
tacgacgggg gttttgctta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc tgca 414
<210> 41
<211> 396
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
atgaggtgcc tagctgagtt cctggggctg cttgtgctct ggatccctgg aaccattggg 60
gatattgtga tgactcaggc tgcaccctct gtaattgtca ctcctggaga gtcagtatcc 120
atctcctgta ggtctactaa gagtctcctg catagtaatg gcaacactta cttgtattgg 180
ttcctgcaga ggccaggcca gtctcctcag ctcctaatat atcggatgtc caaccttgcc 240
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cacacgttcg gaggggggac caagctggaa gtaaaa 396
<210> 42
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
Met Tyr Leu Gly Leu Ser Cys Val Phe Ile Val Phe Leu Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys
<210> 43
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
Met Arg Pro Ser Ile Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Phe Trp Leu His
1 5 10 15
Gly Thr Gln Cys
20
<210> 44
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
Met Arg Pro Ser Ile Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Phe Trp Leu His
1 5 10 15
Gly Ala Gln Cys
20
<210> 45
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Met Val Ile Gly
1 5 10 15
Ile Ser Ser
<210> 46
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
Met Arg Cys Leu Ala Glu Phe Leu Gly Leu Leu Val Leu Trp Ile Pro
1 5 10 15
Gly Thr Ile Gly
20
<210> 47
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys
<210> 48
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
Met Asp Met Arg Val Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys
1 5 10 15
Phe Pro Gly Ala Arg Cys
20
<210> 49
<211> 140
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
Met Lys Ser Gly Leu Trp Tyr Phe Phe Leu Phe Cys Leu Arg Ile Lys
1 5 10 15
Val Leu Thr Gly Glu Ile Asn Gly Ser Ala Asn Tyr Glu Met Phe Ile
20 25 30
Phe His Asn Gly Gly Val Gln Ile Leu Cys Lys Tyr Pro Asp Ile Val
35 40 45
Gln Gln Phe Lys Met Gln Leu Leu Lys Gly Gly Gln Ile Leu Cys Asp
50 55 60
Leu Thr Lys Thr Lys Gly Ser Gly Asn Thr Val Ser Ile Lys Ser Leu
65 70 75 80
Lys Phe Cys His Ser Gln Leu Ser Asn Asn Ser Val Ser Phe Phe Leu
85 90 95
Tyr Asn Leu Asp His Ser His Ala Asn Tyr Tyr Phe Cys Asn Leu Ser
100 105 110
Ile Phe Asp Pro Pro Pro Phe Lys Val Thr Leu Thr Gly Gly Tyr Leu
115 120 125
His Ile Tyr Glu Ser Gln Leu Cys Cys Gln Leu Lys
130 135 140
<210> 50
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
Ile Glu Gly Arg Met Asp
1 5
<210> 51
<211> 231
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
1 5 10 15
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
20 25 30
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
35 40 45
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
50 55 60
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
65 70 75 80
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
85 90 95
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
100 105 110
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
115 120 125
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
130 135 140
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
145 150 155 160
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
165 170 175
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
180 185 190
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
195 200 205
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 52
<211> 377
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
Met Lys Ser Gly Leu Trp Tyr Phe Phe Leu Phe Cys Leu Arg Ile Lys
1 5 10 15
Val Leu Thr Gly Glu Ile Asn Gly Ser Ala Asn Tyr Glu Met Phe Ile
20 25 30
Phe His Asn Gly Gly Val Gln Ile Leu Cys Lys Tyr Pro Asp Ile Val
35 40 45
Gln Gln Phe Lys Met Gln Leu Leu Lys Gly Gly Gln Ile Leu Cys Asp
50 55 60
Leu Thr Lys Thr Lys Gly Ser Gly Asn Thr Val Ser Ile Lys Ser Leu
65 70 75 80
Lys Phe Cys His Ser Gln Leu Ser Asn Asn Ser Val Ser Phe Phe Leu
85 90 95
Tyr Asn Leu Asp His Ser His Ala Asn Tyr Tyr Phe Cys Asn Leu Ser
100 105 110
Ile Phe Asp Pro Pro Pro Phe Lys Val Thr Leu Thr Gly Gly Tyr Leu
115 120 125
His Ile Tyr Glu Ser Gln Leu Cys Cys Gln Leu Lys Ile Glu Gly Arg
130 135 140
Met Asp Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
145 150 155 160
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
165 170 175
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
180 185 190
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
195 200 205
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
210 215 220
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
225 230 235 240
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
245 250 255
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
260 265 270
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
275 280 285
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
290 295 300
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
305 310 315 320
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
325 330 335
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
340 345 350
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
355 360 365
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
370 375
<210> 53
<211> 144
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
Met Lys Pro Tyr Phe Cys Arg Val Phe Val Phe Cys Phe Leu Ile Arg
1 5 10 15
Leu Leu Thr Gly Glu Ile Asn Gly Ser Ala Asp His Arg Met Phe Ser
20 25 30
Phe His Asn Gly Gly Val Gln Ile Ser Cys Lys Tyr Pro Glu Thr Val
35 40 45
Gln Gln Leu Lys Met Arg Leu Phe Arg Glu Arg Glu Val Leu Cys Glu
50 55 60
Leu Thr Lys Thr Lys Gly Ser Gly Asn Ala Val Ser Ile Lys Asn Pro
65 70 75 80
Met Leu Cys Leu Tyr His Leu Ser Asn Asn Ser Val Ser Phe Phe Leu
85 90 95
Asn Asn Pro Asp Ser Ser Gln Gly Ser Tyr Tyr Phe Cys Ser Leu Ser
100 105 110
Ile Phe Asp Pro Pro Pro Phe Gln Glu Arg Asn Leu Ser Gly Gly Tyr
115 120 125
Leu His Ile Tyr Glu Ser Gln Leu Cys Cys Gln Leu Lys Leu Trp Leu
130 135 140
<210> 54
<211> 381
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
Met Lys Pro Tyr Phe Cys Arg Val Phe Val Phe Cys Phe Leu Ile Arg
1 5 10 15
Leu Leu Thr Gly Glu Ile Asn Gly Ser Ala Asp His Arg Met Phe Ser
20 25 30
Phe His Asn Gly Gly Val Gln Ile Ser Cys Lys Tyr Pro Glu Thr Val
35 40 45
Gln Gln Leu Lys Met Arg Leu Phe Arg Glu Arg Glu Val Leu Cys Glu
50 55 60
Leu Thr Lys Thr Lys Gly Ser Gly Asn Ala Val Ser Ile Lys Asn Pro
65 70 75 80
Met Leu Cys Leu Tyr His Leu Ser Asn Asn Ser Val Ser Phe Phe Leu
85 90 95
Asn Asn Pro Asp Ser Ser Gln Gly Ser Tyr Tyr Phe Cys Ser Leu Ser
100 105 110
Ile Phe Asp Pro Pro Pro Phe Gln Glu Arg Asn Leu Ser Gly Gly Tyr
115 120 125
Leu His Ile Tyr Glu Ser Gln Leu Cys Cys Gln Leu Lys Leu Trp Leu
130 135 140
Ile Glu Gly Arg Met Asp Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
145 150 155 160
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
165 170 175
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
180 185 190
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
195 200 205
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
210 215 220
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
225 230 235 240
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
245 250 255
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
260 265 270
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
275 280 285
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
290 295 300
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
305 310 315 320
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
325 330 335
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
340 345 350
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
355 360 365
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
370 375 380

Claims (10)

1.一种抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段特异性结合ICOS，所述抗体或抗原结合片段至少包含如SEQ ID NO：1～3中任一项所示的HCDR1、如SEQ IDNO：4或5所示的HCDR2、如SEQ ID NO：6～8中任一项所示的HCDR3、如SEQ ID NO：9或10所示的LCDR1、如SEQ ID NO：11～13中任一项所示的LCDR2和如SEQ ID NO：14或15所示的LCDR3中的一个或多个。
2.如权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段至少包含如SEQ ID NO：1～3中任一项所示的HCDR1、如SEQ ID NO：4或5所示的HCDR2、如SEQID NO：6～8中任一项所示的HCDR3、如SEQ ID NO：9或10所示的LCDR1、如SEQ ID NO：11～13中任一项所示的LCDR2和如SEQ ID NO：14或15所示的LCDR3。
3.如权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段至少包含如SEQ ID NO：1所示的HCDR1、如SEQ ID NO：4所示的HCDR2、如SEQ ID NO:6所示的HCDR3、如SEQ ID NO：9所示的LCDR1、如SEQ ID NO：11所示的LCDR2和如SEQ ID NO：14所示的LCDR3；或
所述抗体或抗原结合片段至少包含如SEQ ID NO：2所示的HCDR1、如SEQ ID NO：4所示的HCDR2、如SEQ ID NO：7所示的HCDR3、如SEQ ID NO：9所示的LCDR1、如SEQ ID NO：12所示的LCDR2和如SEQ ID NO：14所示的LCDR3；
所述抗体或抗原结合片段至少包含如SEQ ID NO：3所示的HCDR1、如SEQ ID NO：5所示的HCDR2、如SEQ ID NO：8所示的HCDR3、如SEQ ID NO：10所示的LCDR1、如SEQ ID NO：13所示的LCDR2和如SEQ ID NO：15所示的LCDR3。
4.如权利要求1-3任一项所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO：16～22中任一项所示的序列，或与SEQ ID NO：16～22中任一项所示序列相比具有至少80％同一性的序列，或与SEQ ID NO：16～22中任一项所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
5.如权利要求1-4任一项所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：23～31中任一项所示的序列，或与SEQ ID NO：23～31中任一项所示序列相比具有至少80％同一性的序列，或与SEQ ID NO：23～31中任一项所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
6.如权利要求1-5任一项所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包含重链恒定区，所述重链恒定区包含如SEQ ID NO：32或34所示的序列，或与SEQID NO：32或34所示序列相比具有至少有80％同一性的序列，或与SEQ ID NO：32或34所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或
所述抗体或抗原结合片段包含轻链恒定区，所述轻链恒定区包含如SEQ ID NO：33或35所示的序列，或与SEQ ID NO：33或35所示序列相比具有至少有80％同一性的序列，或与SEQID NO：33或35所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
7.如权利要求1-6任一项所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体的重链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：16所示的重链可变区和SEQ ID NO：32所示的重链恒定区，或与所述重链序列相比具有至少有80％同一性的序列，或与所述重链序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；所述抗体的轻链从氨基端至羧基端包含如SEQ IDNO：23所示的轻链可变区和SEQ ID NO：33所示的轻链恒定区，或与所述轻链序列相比具有至少有80％同一性的序列，或与所述轻链序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；或
所述抗体的重链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：17所示的重链可变区和SEQ IDNO：32所示的重链恒定区，或与所述重链序列相比具有至少有80％同一性的序列，或与所述重链序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；所述抗体的轻链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：24所示的轻链可变区和SEQ ID NO：33所示的轻链恒定区，或与所述轻链序列相比具有至少有80％同一性的序列，或与所述轻链序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；或
所述抗体的重链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：18所示的重链可变区和SEQ IDNO：32所示的重链恒定区，或与所述重链序列相比具有至少有80％同一性的序列，或与所述重链序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；所述抗体的轻链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：25所示的轻链可变区和SEQ ID NO：33所示的轻链恒定区，或与所述轻链序列相比具有至少有80％同一性的序列，或与所述轻链序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；或
所述抗体的重链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：16所示的重链可变区和SEQ IDNO：34所示的重链恒定区，或与所述重链序列相比具有至少有80％同一性的序列，或与所述重链序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；所述抗体的轻链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：23所示的轻链可变区和SEQ ID NO：35所示的轻链恒定区，或与所述轻链序列相比具有至少有80％同一性的序列，或与所述轻链序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；或
所述抗体的重链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：17所示的重链可变区和SEQ IDNO：34所示的重链恒定区，或与所述重链序列相比具有至少有80％同一性的序列，或与所述重链序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；所述抗体的轻链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：24所示的轻链可变区和SEQ ID NO：35所示的轻链恒定区，或与所述轻链序列相比具有至少有80％同一性的序列，或与所述轻链序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；或
所述抗体的重链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：18所示的重链可变区和SEQ IDNO：34所示的重链恒定区，或与所述重链序列相比具有至少有80％同一性的序列，或与所述重链序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；所述抗体的轻链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：25所示的轻链可变区和SEQ ID NO：35所示的轻链恒定区，或与所述轻链序列相比具有至少有80％同一性的序列，或与所述轻链序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；或
所述抗体的重链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：19所示的重链可变区和SEQ IDNO：34所示的重链恒定区，或与所述重链序列相比具有至少有80％同一性的序列，或与所述重链序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；所述抗体的轻链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：26所示的轻链可变区和SEQ ID NO：35所示的轻链恒定区，或与所述轻链序列相比具有至少有80％同一性的序列，或与所述轻链序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；或
所述抗体的重链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：19所示的重链可变区和SEQ IDNO：34所示的重链恒定区，或与所述重链序列相比具有至少有80％同一性的序列，或与所述重链序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；所述抗体的轻链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：27所示的轻链可变区和SEQ ID NO：35所示的轻链恒定区，或与所述轻链序列相比具有至少有80％同一性的序列，或与所述轻链序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；或
所述抗体的重链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：20所示的重链可变区和SEQ IDNO：34所示的重链恒定区，或与所述重链序列相比具有至少有80％同一性的序列，或与所述重链序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；所述抗体的轻链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：28所示的轻链可变区和SEQ ID NO：35所示的轻链恒定区，或与所述轻链序列相比具有至少有80％同一性的序列，或与所述轻链序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；或
所述抗体的重链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：20所示的重链可变区和SEQ IDNO：34所示的重链恒定区，或与所述重链序列相比具有至少有80％同一性的序列，或与所述重链序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；所述抗体的轻链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：29所示的轻链可变区和SEQ ID NO：35所示的轻链恒定区，或与所述轻链序列相比具有至少有80％同一性的序列，或与所述轻链序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；或
所述抗体的重链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：20所示的重链可变区和SEQ IDNO：34所示的重链恒定区，或与所述重链序列相比具有至少有80％同一性的序列，或与所述重链序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；所述抗体的轻链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：30所示的轻链可变区和SEQ ID NO：35所示的轻链恒定区，或与所述轻链序列相比具有至少有80％同一性的序列，或与所述轻链序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；或
所述抗体的重链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：21所示的重链可变区和SEQ IDNO：34所示的重链恒定区，或与所述重链序列相比具有至少有80％同一性的序列，或与所述重链序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；所述抗体的轻链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：31所示的轻链可变区和SEQ ID NO：35所示的轻链恒定区，或与所述轻链序列相比具有至少有80％同一性的序列，或与所述轻链序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；或
所述抗体的重链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：22所示的重链可变区和SEQ IDNO：34所示的重链恒定区，或与所述重链序列相比具有至少有80％同一性的序列，或与所述重链序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；所述抗体的轻链从氨基端至羧基端包含如SEQ ID NO：31所示的轻链可变区和SEQ ID NO：35所示的轻链恒定区，或与所述轻链序列相比具有至少有80％同一性的序列，或与所述轻链序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
8.一种编码如权利要求1-7任一项所述的抗体或抗原结合片段的核酸分子。
9.一种包含如权利要求7所述的核酸分子的载体或宿主细胞。
10.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含如权利要求1-7任一项所述的抗体或抗原结合片段，以及药学上可接受的载体。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024061930A1 (en) * 2022-09-22 2024-03-28 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale New method to treat and diagnose peripheral t-cell lymphoma (ptcl)

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WO2024061930A1 (en) * 2022-09-22 2024-03-28 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale New method to treat and diagnose peripheral t-cell lymphoma (ptcl)

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