TW201425338A - 雙特異性抗體 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種雙特異性抗體，其由單鏈單元和單價單元組成，其中該單鏈單元針對免疫細胞具有特異性，該單價單元針對腫瘤細胞或微生物具有特異性。該單鏈單元包含與Fc片段融合的單鏈可變片段（scFv）且該單價單元包含輕鏈和重鏈對。本發明還提供雙特異性抗體的製備方法，這些抗體的藥學用途和診斷用途。

Description

雙特異性抗體
本發明的一個實施例提供了一種抗體，該抗體包含：(a)輕鏈-重鏈對，該輕鏈-重鏈對針對腫瘤細胞或微生物具有特異性；和(b)融合胜肽，該融合胜肽包含單鏈可變片段(scFv)和具有CH2結構域和CH3結構域的Fc片段，其中該融合胜肽針對免疫細胞具有特異性。
雙特異性抗體(BsAb)為具有兩種不同結合特異性的抗體或抗體類分子。BsAb廣泛應用於生物醫學，尤其是針對腫瘤的免疫治療中。目前，對於免疫治療研究的一個關注焦點為如何利用BsAb的細胞媒介的細胞毒性來殺死腫瘤細胞。BsAb可設計為同時標靶作用於腫瘤細胞和作用細胞，同時激發作用細胞使其殺滅腫瘤細胞。
BsAb可通過例如化學工程、細胞工程以及基因工程的方法製備。基因工程的優勢在於能夠容易地改造抗體，使得能夠設計和生產許多不同形式的雙特異性抗體片段，包括雙體，串聯的(tanderm)ScFv和單鏈雙體及其衍生物(參見Jin和Zhu,於「the design and engineering of IgG-Like bispecific antibodies」,RE Kontermann(編),Bispecific antibodies)。由於這些BsAb不具有IgG Fc結構域，因此它們的小尺寸使得它們滲透進入腫瘤的能力增強，但它們在體內具有相當短的半衰期並且缺乏ADCC作用，該作用與抗體的恒定區相關聯。
為了增強穩定性和治療能力，對重鏈進行重組基因改造以促進它們的異二聚化並獲得較高的含Fc的IgG類雙特異性抗體的產量。已經有幾種合理的設計方案用於改造抗體CH3鏈用於異二聚化，即，雙硫鍵、鹽橋、杵-臼(knobs-into-holes)。在並置的位置處產生杵(knob)和臼(hole)的基礎在於該杵和臼相互作用將有助於形成異二聚體，然而杵-杵和臼-臼相互作用因有利的相互作用缺失而不利於形成同二聚體。儘管該杵-臼方案解決了重鏈同二聚化問題，但這沒有解決來自兩種不同抗體的輕鏈和重鏈之間的錯配問題。雖然有可能對於兩種不同抗體識別相同的輕鏈，但使用具有相同輕鏈的兩種抗體序列構建BsAb的可能性非常小。
因此需要提供更好的易於製備的BsAb，並且該BsAb具有較好的臨床穩定性和效力和/或減弱的系統毒性。
在某些方面，該輕鏈-重鏈對針對腫瘤抗原具有特異性。一方面，該腫瘤抗原選自：EGFR、Her2、EpCAM、CD20、CD30、CD33、CD47、CD52、CD133、CEA、gpA33、黏蛋白、TAG-72、CIX、PSMA、葉酸鹽結合蛋白、GD2、GD3、GM2、VEGF、VEGFR、整合素(Integrin)、αVβ3、α5β1、ERBB2、ERBB3、MET、IGF1R、EPHA3、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP和肌腱蛋白(Tenascin)。一方面，該輕鏈-重鏈對針對較對應的非腫瘤細胞而言，在腫瘤細胞上過度表現的蛋白具有特異性。
在某些方面，該輕鏈-重鏈對針對病毒或細菌具有特異性。一方面，該輕鏈-重鏈對針對內毒素具有特異性。
在某些方面，該免疫細胞選自T細胞、B細胞、單核細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞、樹突細胞、巨噬細胞、自然殺手細胞、嗜酸性球、嗜鹼性球和肥大細胞。
在某些方面，該融合胜肽針對以下抗原具有特異性，該抗原選自CD3、CD16、CD19、CD28和CD64。
在某些方面，該輕鏈通過雙硫鍵與該重鏈結合。在某些方面，該重鏈通過一個或多個雙硫鍵與該融合胜肽結合。一方面，該重鏈包含人或者人源化的(humanized)Fc片段。一方面，該重鏈的Fc片段包含人IgG Fc片段。一方面，該融合胜肽的Fc片段包含人或者人源化的Fc片段。一方面，該融合胜肽的Fc片段包含人IgG Fc片段。
在某些方面，與野生型抗體片段相比，該重鏈和/或該融合胜肽的Fc片段包含一處或多處取代基，該取代基在該重鏈和Fc片段之間形成離子鍵。一方面，這些取代基選自表1。
在某些方面，與野生型抗體片段相比，該重鏈和/或該融合胜肽的Fc片段包含一處或多處取代基，該取代基在該重鏈和Fc片段之間形成杵-臼結構配對。一方面，這些取代基選自表2。
在某些方面，該CH2結構域位於該scFv片段和CH3結構域之間。一方面，該融合胜肽不包含CH1結構域。
在一個實施例中，本發明還提供一種包含上述任一實施例中的抗體的組合物。一方面，載體為藥物載體。
另一實施例提供了一種複合體，該複合體包含與一個或多個抗原結合的上述任一實施例中的抗體。
本發明進一步提供了一種抗體的製備方法，該方法包括：將(a)輕鏈-重鏈對和(b)融合胜肽混合，該輕鏈-重鏈對針對免疫細胞具有特異性，且該融合胜肽包含單鏈可變片段(scFv)和具有CH2結構域和CH3結構域的Fc片段，其中該融合胜肽對於腫瘤細胞具有特異性。一方面，本發明提供一種可通過該方法獲得的抗體。
定義
應注意非明確數量的實體限定應指一或多個(種)該實體；例如，「雙特異性抗體」應理解為表示一或多個(種)雙特異性抗體。同樣地，非明確數量限定的、術語「一個或多個」和「至少一個」本文中可互換使用。
本文使用的術語「多肽」用於包括單數的「多肽」以及複數的「多肽」，並且也指通過醯胺鍵(也稱為肽鍵)線性連接的單體(胺基酸)組成的分子。術語「多肽」是指兩個或多個胺基酸的任一條或多條鏈，而不是指特定長度的該產物。因此、肽、二肽、三肽、寡肽、「蛋白」、「胺基酸鏈」、或任何指兩個或多個胺基酸組成的一條或多條鏈的其他術語都包括在「多肽」的定義中，且術語「多肽」可代替這些術語的任何一個或與它們互換使用。術語「多肽」也用於指多肽的表現後修飾的產物，包括但不限於醣基化、乙醯化、磷酸化、醯胺化、通過已知的保護基/阻斷基衍生化、蛋白水解裂解或通過非自然產生的胺基酸的修飾。多肽可衍生自天然的生物源或通過重組技術生產，但不一定由指定核酸序列轉譯而成。其可以任何方式產生，包括通過化學合成方式。
本文使用的關於細胞、核酸(如DNA或RNA)的術語「分離的」，是指分別從其他的以天然來源的大分子存在的DNA或RNA分離的分子。本文使用的術語「分離的」也指通過重組DNA技術生產時基本不含細胞材料、病毒材料或培養基的核酸或肽，或經化學合成製備時基本不含化學前體或其他化學品。此外，「分離的核酸」是指包括非自然產生為片段的核酸片段，且這些片段自然狀態下不存在。本文中術語「分離的」也用於指從其他細胞蛋白或組織分離的細胞或多肽。分離的多肽是指包括純化的和重組的多肽。
本文使用的術語「重組」，在涉及多肽或多核苷酸時指自然狀態下不存在的多肽或多核苷酸的形式，其中一個非限制性的例子，可以通過將通常不會一起出現的多核苷酸或多肽組合在一起來實現。
「同源性」或「同一性」或「相似性」是指兩個肽鏈分子之間或兩個核酸分子之間的序列相似程度。同源性可通過比較每個序列中的位置來測定，可通過比對來進行比較。當在被比較的序列中的位置上有相同的鹼基或胺基酸時，在該位置上的分子為同源的。多個序列之間的同源度為這些序列共有的配對或同源位點數量的函數。「無關的」或「非同源的」序列與本發明的序列之一之間具有少於40%的同源性，但較佳地小於25%的同源性。
多核苷酸或多核苷酸區域(或多肽或多肽區域)與另一序列具有一定的百分比(例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%)的「序列同一性」是指，在比對時，在這兩個序列比較時該百分比的鹼基(或胺基酸)是相同的。此種比對和百分比同源性或序列同一性，可使用本領域中已知的軟體程序測定，例如，通過Ausubel等人編的Current Protocols in Molecular Biology(2007)中描述的那些軟體。較佳地，使用默認參數用於比對。BLAST是一種比對程序，使用默認參數。具體地，程序為BLASTN和BLASTP，使用如下默認參數：Genetic code=standard；filter=none；strand=both；cutoff=60；expect=10；Matrix=BLOSUM62；Descriptions=50 sequences；sort by=HIGH SCORE；Databases=non-redundant,GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+SwissProtein+SPupdate+PIR。這些程序的詳細信息，可於以下網址獲得：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi，2008年5月21日最後一次訪問。生物學等效的多核苷酸是具有上面提到的特定百分比的同源性，並編碼具有相同或相似的生物活性多肽的多核苷酸。
術語「等效核酸或多核苷酸」是指與該核酸的核苷酸序列或其互補序列具有一定程度的同源性，或序列同一性的核苷酸序列的核酸。雙股核酸的同源物是指包含特定核苷酸序列的核酸，該特定核苷酸序列具有與另一核酸或其互補序列具有一定程度的同源性。一方面，某核酸的同系物(homologs)能夠與該核酸或其互補序列雜交。同樣地，「等效的多肽」是指與參考多肽的胺基酸序列具有一定程度的同源性，或序列同一性的多肽。在一些方面，該序列同一性至少為約70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%。在某些方面，該等效序列保留了參考序列的活性(例如，抗原表位結合)或結構(例如，鹽橋)。
雜交反應可以在不同的「嚴格」條件下進行。通常，低嚴格雜交反應於約40℃在約10×SSC或同等離子強度/溫度的溶液中進行。中等嚴格雜交通常在約50℃於約6×SSC中進行，高度嚴格雜交反應通常在約60℃於約1×SSC中進行。雜交反應也可在本發明所述技術領域中具有通常知識者熟知的「生理條件」下進行。生理條件的一個非限制性例子是細胞中通常存在的溫度、離子強度、pH值和Mg2+濃度。
多核苷酸由4個核苷酸鹼基組成的特定序列組成：腺嘌呤(A)，胞嘧啶(C)，鳥嘌呤(G)，胸腺嘧啶(T)，在該多核苷酸為RNA時尿嘧啶(U)取代胸腺嘧啶。因此，術語「多核苷酸序列」是多核苷酸分子按字母順序排列的表示。該字母順序表示可以被輸入到電腦的數據庫中，該電腦中有中央處理單元，並且用於生物資訊學應用，如功能基因組學和同源性檢索。術語「多型性」是指共存有多於一種形式的基因或其一部分。基因的一部分具有至少兩種不同的形式，即，兩種不同的核苷酸序列時，該基因的該部分被稱為「基因的多型性區域」。多型性區域可以是單核苷酸，其同一性在不同的等位基因中不同。
術語「多核苷酸」和「寡核苷酸」可以互換使用，並涉及任何長度的核苷酸的聚合物形式，無論是去氧核醣核酸或核醣核酸或其類似物。多核苷酸可以有任何三維結構，並且可以具有任何已知或未知的功能。以下為多核苷酸的非限制性實施例：基因或基因片段(例如，探針、引子、EST或SAGE標籤)、外顯子、內含子、訊息RNA(mRNA)、轉移RNA、核醣體RNA，核酶、cDNA、dsRNA、siRNA、miRNA、重組多核苷酸、分支多核苷酸、質體、載體、分離的任意序列的DNA、分離的任意序列的RNA、核酸探針和引子。多核苷酸可以包括修飾的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸類似物。如果存在，則在多核苷酸的裝配之前或之後對鹼基結構進行修飾。該核苷酸序列可以被非核苷酸成分中斷。多核苷酸可在聚合後進一步修飾，如用標記成分結合。該術語也指雙股和單股分子。除非另外指出或要求，否則本發明的多核苷酸的任一實施例既包括雙股形式也包括已知的兩條互補單股形式或預計成為雙股形式的情況。
術語「編碼」在其應用於多核苷酸時指被認為「編碼」某一多肽的多核苷酸，以其天然的狀態或由本發明所述技術領域中具有通常知識者熟知的方法操作時，它可以被轉錄和/或轉譯以產生該多肽的mRNA和/或其片段。反義股是此種核酸的互補物，該編碼序列可以由其推導出。
本文使用的術語「可檢測的標籤」指可直接或間接檢測的化合物或組合物，該化合物或組合物直接或間接地結合至待檢測的組合物(例如，多核苷酸或蛋白質，該蛋白如抗體)以獲得「有標籤的」組合物。該術語還包括，結合至該多核苷酸的序列，其通過插入序列的表現提供信號，如綠色螢光蛋白(GFP)等。該標籤自身可被檢測(例如放射性同位素標籤或螢光標籤)或者，在酶標籤情況下，可催化基質化合物或組合物的化學改變，該改變可被檢測。該標籤可用於小規模檢測或更適於高通量篩選。同樣地，合適的標籤包括但不限於放射性同位素、螢光染料、化學發光化合物、染料、和蛋白(包括酶)。該標籤可僅被檢測，也可被定量。僅被檢測的反應通常包括僅能證實其存在的反應，其中可被定量的反應通常包括具有可定量的(例如可通過數字報告的)值例如強度、極化和/或其他性質的反應。在發光或螢光分析中，可檢測的反應可直接使用與分析成分相關的實際上涉及結合的發光體或螢光基團，或間接使用與另一(例如報告分子或指示劑)成分連接的發光體或螢光基團。
本文使用的，「抗體」或者「抗原結合多肽」指特定識別並結合抗原的多肽或多肽複合體。抗體可為整個抗體也可為任何抗原結合片段或者其單鏈。因此術語「抗體」包括含有特定分子的任何蛋白或肽，該特定分子含有至少一部分的免疫球蛋白分子，該免疫球蛋白分子具有結合至抗原的生物活性。此種情況的實施例包括但不限於，重鏈或輕鏈或其配體結合部分的互補決定區(CDR)，重鏈或輕鏈可變區，重鏈或輕鏈恒定區，框架(FR)區或其任何部分，或結合蛋白的至少一部分。
本文使用的術語「抗體片段」或「抗原結合片段」為抗體的一部分，該抗體例如F(ab')2、F(ab)2、Fab'、Fab、Fv、scFv等。不管結構如何，與相同的抗原結合的抗體片段被認為是完整抗體。術語「抗體片段」包括適配體、適配體對映體(spiegelmers)和雙醴(diabodies)。術語「抗體片段」也包括任何合成的或基因改造的蛋白，它們與抗體一樣可結合至特定的抗原以形成複合體。
「單鏈可變片段」或「scFv」指免疫球蛋白的重鏈(VH)和輕鏈(VL)的可變區域的融合蛋白。在某些方面，這些區域用10至約25個胺基酸的短接頭胜肽連接。該接頭可富含甘胺酸以具有柔性，也含有絲胺酸或蘇胺酸以具有可溶性，且能將VH的N-末端連接至VL的C末端，反過來也一樣。該蛋白質保留了原始的免疫球蛋白的特性，只是去除了恒定區並引入了接頭。ScFv分子為本領域已知的，且描述於美國專利5,892,019中。
術語抗體包括多種廣泛類別的多肽，這些多肽可被生化識別。本發明所述技術領域中具有通常知識者應理解重鏈分為gamma、mu、alpha、delta、及epsilon(γ、μ、α、δ、ε)並具有一些亞類(例如，γ1~γ4)。該鏈的性質決定了抗體的「類」，如IgG、IgM、IgA、IgG或者IgE。免疫球蛋白亞類(同型)例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgG5等被很好表徵並在功能上具有特異性。本發明所述技術領域中具有通常知識者參考本發明可容易識別這些類和同型的每一種修飾形式，因此，這些形式在本發明範圍內。所有免疫球蛋白類明確地在本發明的範圍內，下列討論通常將針對免疫球蛋白分子的IgG類。關於IgG，標準免疫球蛋白分子包含兩個相同的輕鏈多肽(它們的分子量約為23,000道爾頓)和兩個相同的重鏈多肽(它們的分子量為53,000~70,000)。這四條鏈通常經雙硫鍵以「Y」型連接在一起，其中輕鏈在「Y」結構的口部開始支撐重鏈，並延伸穿過可變區。
本發明的抗體、抗原結合多肽、它們的變體或衍生物包括但不限於，多株抗體、單株抗體、多特異性抗體、人抗體、人源化的抗體、靈長類化的(primatized)抗體、或嵌合抗體、單鏈抗體、抗原表位結合片段，例如，Fab、Fab'和F(ab')2、Fd、Fvs、單鏈Fvs(scFv)、單鏈抗體、雙硫鍵連接的Fvs(sdFv)、包含VL結構域或VH結構域的片段、由Fab表現庫產生的片段、和抗獨特型(idiotypic)(抗-Id)抗體(包括，例如，本文揭露的抗Id抗體至LIGHT抗體)。本發明的免疫球蛋白分子或抗體分子可為任何類型的(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、免疫球蛋白分子的任何類(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亞類。
輕鏈分為kappa或lambda(κ、λ)。每類重鏈均可結合kappa或lambda輕鏈。通常，輕鏈和重鏈共價地結合在一起，且當這些免疫球蛋白由融合瘤、B細胞或基因改造的宿主細胞產生時，兩條重鏈的「尾部」部分通過共價雙硫鍵或非共價連接結合在一起。在該重鏈中，胺基酸序列從Y型結構的叉端的N末端向每條鏈的底部C末端延伸。
輕鏈和重鏈兩者都分成結構區和功能同源區。術語「恒定」和「可變的」為功能上的使用。在此，應認識到輕鏈可變結構域(VL)和重鏈可變結構域(VH)同時決定了抗原識別和特異性。相反地，輕鏈恒定結構域(CL)和重鏈恒定結構域(CH1，CH2或CH3)提供了重要的生物學性質，例如分泌、經胎盤的流動性、Fc受體結合，補體結合等。通常恒定區結構域的數量隨著遠離抗體的抗原結合位點或胺基端的末端位置而增加。N末端部分為可變區，而在C末端部分為恒定區；CH3和CL結構域實際上分別包含重鏈和輕鏈的羧基末端。
如上所述，該可變區域使得抗體能選擇性識別並特異性結合抗原上的抗原表位。即，抗體的VL結構域和VH結構域，或互補決定區(CDR)的亞類組合形成定義三維抗原結合位點的可變區域。這種四價抗體結構形成了抗原結合位點，該抗原結合位點存在於Y構型的每個臂的末端。更具體地，該抗原結合位點被每個VH和VL鏈(即，CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)上的三個CDR定義。在一些實施例中，例如，某些衍生自駱駝種或基於駱駝免疫球蛋白改造的免疫球蛋白，完整的免疫球蛋白分子可僅由重鏈組成，而沒有輕鏈。參見，例如，Hamers-Casterman等，Nature363：446-448(1993)。
自然產生的抗體中，存在於每個抗原結合域中的六個「互補決定區」或「CDR」是短的，非連續的胺基酸序列，它們具有特定的定位以形成抗原結合結構域，對於抗體假定其三維構型處於水環境中。該抗原結合結構域的其餘胺基酸，稱為「框架」區，具有更少的分子內可變性。該框架區主要採用β-折疊片構型，且CDR形成環，該環連接該β-折疊片結構，有時形成該β-折疊片結構的一部分。因此，框架區用於形成支架，該支架使CDR通過鏈內的、非共價作用在正確方向上定位。由該定位的CDR形成的抗原結合域定義了互補於免疫活性抗原表位的表面。該互補表面促進了抗體與其同源表位的非共價結合。本發明所述技術領域中具有通常知識者可對分別包括CDR和框架區的胺基酸針對任何給定的重鏈或輕鏈可變區容易地識別，因為它們已經被明確定義(參見，「Sequences of Proteins of Immunological Interest,」Kabat,E.,等,美國衛生和公共服務部(U.S.Department of Health and Human Services,),(1983)；Chothia和Lesk,J.MoI.Biol.,196：901-917(1987)，其在此通過引用以全文形式結合至本文)。
在本技術領域內使用和/或可接受的情況下，一個術語有兩個或兩個以上定義時，本文使用的術語的定義用於包括所有的含義，除非明確說明與此相反。一個具體的例子為，使用術語「互補決定區」(「CDR」)來描述在重鏈和輕鏈多肽的可變區中都存在的非連續的抗原結合位點。這種具體區域由Kabat等描述於美國衛生和公共服務部，「Sequences of Proteins of Immunological Interest」(1983)和由Chothia等描述與J.MoI.Biol.196：901-917(1987)中，其通過全文引用結合至本文。根據Kabat和Chothia的定義，CDR包括相互比較時重疊的胺基酸殘基，或胺基酸亞結構。然而，每種關於抗體或其變體的CDR的定義的應用都將在本文定義和使用的術語的範圍內。包含如以上引用的每一篇參考文獻定義的CDR的合適的胺基酸殘基列於下表中作為比較。包含特定CDR的精確殘基數將隨該CDR的序列和大小變化。如果給定該抗體的可變區胺基酸序列，則本發明所述技術領域中具有通常知識者通常可確定哪些殘基包含特定CDR。
Kabat等也定義了用於可變結構域序列的編號系統，該系統適用於任一種抗體。本發明所述技術領域中具有通常知識者可無歧異地將該「Kabat編號」系統用於任何可變結構域序列，而不依賴於該序列自身之外的任何實驗數據。本文使用的「Kabat編號」是指Kabat等描述的編號系統，其內容記載於美國衛生和公共服務部，「Sequence of Proteins of Immunological Interest」(1983)。
除了上表，Kabat編號系統描述的CDR區如下：CDR-H1在大約31號胺基酸處開始(即，第一半胱胺酸殘基後約9個殘基)，包括約5~7個胺基酸，並在下一個色胺酸殘基處終止。CDR-H2在CDR-H1的末端後第15個殘基處開始，包括約16~19個胺基酸，並在下一個精胺酸或賴胺酸殘基處終止。CDR-H3在CDR-H2的末端後約第33個胺基酸殘基處開始；包括3~25個胺基酸；並在序列W-G-X-G處終止，其中X為任意胺基酸。CDR-L1在約殘基24處開始(即，在半胱胺酸殘基之後)；包括大約10~17個殘基；並終止於下一個色胺酸殘基。CDR-L2在CDR-L1的末端後約16個殘基後開始，並包括約7個殘基。CDR-L3在CDR-L2的末端後約第33個殘基處開始(即，在半胱胺酸殘基之後)；包括約7~11個殘基，並在序列F或W-G-X-G處終止，其中X為任意胺基酸。
本文描述的抗體可來自任何動物源，包括鳥和哺乳動物。較佳地，抗體為人、鼠、驢、兔、山羊、豚鼠、駱駝、駝馬、馬或雞的抗體。在另一個實施例中，可變區可來自於軟骨魚(condricthoid)(例如，來自鯊魚)。
本文使用的術語「重鏈恒定區」包括來自免疫球蛋白重鏈的胺基酸序列。包含重鏈恒定區的多肽至少包含以下一種：CH1結構域，絞鏈(例如，上部絞鏈區、中間絞鏈區，和/或下部絞鏈區)結構域，CH2結構域，CH3結構域，或其變體或片段。例如，本發明中使用的抗原結合多肽可包含具有CH1結構域的多肽鏈；具有CH1結構域、至少一部分的絞鏈結構域和CH2結構域的多肽；具有CH1結構域和CH3結構域的多肽鏈；具有CH1結構域、至少一部分絞鏈結構域和CH3結構域的多肽鏈，或者具有CH1結構域，至少一部分絞鏈結構，CH2結構域，和CH3結構域的多肽鏈。在另一個實施例中，本發明的多肽包括具有CH3結構域的多肽鏈。另外，在本發明中使用的抗體可能缺少至少一部分CH2結構域(例如，所有的或一部分的CH2結構域)。如上文所述，但本發明所述技術領域中具有通常知識者應理解，重鏈恒定區可能會被修改，使得它們在胺基酸序列上與天然存在的免疫球蛋白分子不同。
本文所揭露的抗體的重鏈恒定區可以來自於不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的重鏈恒定區可以包含來自IgG1分子的CH1結構域和來自IgG3的分子的絞鏈區。在另一例子中，重鏈恒定區可以包含絞鏈區，該絞鏈區部分來自IgG1分子，且部分地來自IgG3分子。在另一例子中，重鏈部分可包含嵌合絞鏈，該嵌合絞鏈一部分來自IgG1分子，並且一部分來自IgG4分子。
本文使用的術語「輕鏈恒定區」包括來自抗體輕鏈的胺基酸序列。較佳地，所述輕鏈恒定區包括恒定kappa結構域和恒定lambda結構域中的至少一個。
「輕鏈-重鏈對」是指輕鏈和重鏈的集合，它們可通過輕鏈的CL結構域和CH1結構域之間的雙硫鍵形成二聚體。
如前面所指出的，各種免疫球蛋白類的恒定區的亞基結構和三維結構是已知的。本文使用的，術語「VH結構域」包括免疫球蛋白重鏈的胺基末端可變結構域，而術語「CH1結構域」包括免疫球蛋白重鏈的第一(多數為胺基末端)恒定區。CH1結構域鄰近VH結構域並且是免疫球蛋白重鏈分子的絞鏈區的胺基末端。
本文使用的術語「CH2結構域」包括一部分的重鏈分子，例如，該部分從抗體的約殘基244到殘基360延伸，使用常規的編號方案(殘基244至360，Kabat編號系統；和殘基231~340，EU編號系統；見Kabat等,美國衛生和公共服務部，「Sequences of Proteins of Immunological Interest」(1983)。CH2結構域是獨特的，因為它與另一個結構域配對不緊密。相反，兩個N-連接的支鏈的醣鏈插入至完整的天然IgG分子的兩個CH2結構域之間。有文獻記載，CH3結構域從CH2結構域延伸至IgG分子的C-末端，並包含約108個殘基。
本文使用的術語「絞鏈區」包括重鏈分子的將CH1結構域連接至CH2結構域的那一部分。該絞鏈區包含約25個殘基並且是柔性的，從而使兩個N-末端抗原結合區獨立地移動。絞鏈區可分為三個不同的結構域：上部、中部、和下部絞鏈結構域(Roux等人,J.Immunol161：4083(1998))。
本文使用的術語「雙硫鍵」包括兩個硫原子之間形成的共價鍵。胺基酸半胱胺酸含有巰基，該巰基可以與第二個巰基形成雙硫鍵或橋連。在大多數天然存在的IgG分子中，CH1和CL區由雙硫鍵連接並且兩個重鏈由兩個雙硫鍵連接，在對應於使用Kabat編號系統的239和242處(位置226或229，EU編號系統)連接。
本文使用的術語「嵌合的抗體」將用於指以下任何抗體：其中其免疫反應區或位點得自或來自第一物種且其恒定區(該恒定區可以是完整的，部分的或根據本發明修改過的)得自第二物種。在某些實施例中靶結合區或位點將來自非人類來源(例如小鼠或靈長類)且恒定區來自人。
本文使用的「百分比人源化」通過以下方式計算：測定人源化的結構域和種系結構域之間的框架胺基酸差值的數量(即，非CDR差)，用胺基酸總數減去該數量，然後除以胺基酸總數，再乘以100。
所謂「特異性結合」或「對...有特異性」，通常意味著抗體通過它的抗原結合結構域結合抗原表位，並且該結合使得抗原結合結構域和抗原表位之間必須有一些互補性。根據這個定義，抗體被認為是「特異性結合」至抗原表位，當它結合到該抗原表位時，經抗原結合結構域的結合比結合至隨機的，不相關的抗原表位更容易。本文中使用術語「特異性」以確定某一抗體結合至特定抗原表位的親和力。例如，抗體「A」可能被視為對於一給定的抗原表位比抗體「B」具有更高的特異性，或抗體「A」可被說成是結合至抗原表位「C」比其對於相關抗原表位「D」具有更高的特異性。
本文使用的術語「治療」是指治療性治療和預防或防治措施，其中對於受試者進行防止或減慢(減輕)不良的生理變化或疾病，如癌症的發展。有益的或所需的臨床結果包括但不限於，減輕症狀、降低疾病的程度、穩定(例如使其不惡化)疾病的狀態、延遲或減緩疾病發展、改善或緩和疾病狀態，並緩解(無論是部分或全部)，無論可否被檢測到。「治療」也可指與不接受治療時的預計存活時間相比能延長存活時間。那些需要治療的狀況包括那些已經具有病症或症狀以及那些容易具有病症或症狀或那些將對病症或症狀進行預防的情況。
所謂「受試者」或「個體」或「動物」或「患者」或「哺乳動物」是指任何受試者，特別是哺乳動物受試者，它們需要進行診斷、預後或治療。哺乳動物受試者包括人類、家養動物、農場動物、動物園、運動場、或寵物，如狗、貓、天竺鼠、兔、大鼠、小鼠、老鼠、馬、牛(cattle)、奶牛(cows)等。
本文使用的短語，如「需要治療的患者」或「需要治療的受試者」包括例如哺乳動物受試者，這些受試者將受益於本發明使用的抗體和組合物的給藥，例如進行檢測、診斷程序和/或治療。
雙特異性抗體
本發明的一個實施例提供了一種異二聚體抗體，該抗體包含兩個不同的抗原結合多肽單元。在某些方面，該異二聚體與其對應的同二聚體大小不同，可利用大小上的區別來促進分離異二聚體和同二聚體。
在某些方面，這兩個抗原結合多肽單元之一包含類似於野生型抗體的輕鏈-重鏈對。在整個本發明中，該單元也稱為「單價單元」。在某些方面，其他抗原結合多肽單元包含單鏈可變片段(scFv)。這樣的scFv可融合至抗體的恒定片段(Fc)。在本發明全文中此融合胜肽也被稱為「單鏈單元」。
令人驚奇的是，本發明證明這種非對稱的抗體是穩定的並具有高的抗原結合效率。這是令人意外的，因為已經證實在生理條件下即使是單鏈抗體的同二聚體都是不穩定的。例如，Ahmad等的「scFv Antibody：Principles and Clinical Application,」Clinical and Developmental Immunology,2012：980250(2012),顯示基於scFv的IgG類抗體不穩定，並且需要進一步改造以減少聚集並提高穩定性。
另外，因為具有非對稱性，異二聚體具有與由其中任一抗原結合多肽單元組成的同二聚體所不同的分子量。基於異二聚體和同二聚體之間的分子量差異，可以容易地將需要的異二聚體與同二聚體分離。
能夠容易地將異二聚體與同二聚體分離對於製備雙特異性抗體是特別有利的，該雙特異性抗體中兩個抗原結合多肽的每一個對於不同的抗原表位均具有特異性。這是因為兩種類型的同二聚體(即，包含單價單元或單鏈單元的同二聚體)都不具有所需的雙重特異性，而該異二聚體能提供該雙重特異性。
在一個實施例中，此種雙特異性抗體針對腫瘤細胞或微生物具有特異性且對於免疫細胞具有特異性，這使得腫瘤細胞或微生物能靠近免疫細胞，通過活性免疫反應導致腫瘤細胞或微生物被消除。
在一個特定方面，該單價單元對於腫瘤細胞或微生物有特異性，且該單鏈單元對於免疫細胞有特異性。有這樣排列的特異性的不對稱的雙特異性抗體也被稱為「單價單鏈雙特異性抗體」或「MSBODY」。與此相反，一種非對稱的雙特異性抗體，其中該單價單元具有對於免疫細胞的特異性，且該單鏈單元具有對於腫瘤細胞或微生物的特異性，該非對稱的雙特異性抗體稱為「SMBODY」。另一種雙特異性抗體具有兩個單鏈單元，其中一個具有對於腫瘤細胞或微生物的特異性，而另一個具有對於免疫細胞的特異性，該抗體稱為「SSBODY」。
該雙特異性抗體在某些方面是雙價的，包含兩個功能性的抗原結合位點。該雙特異性抗體，包括MSBODY、SMBODY和SSBODY，是明確地不同於包含四個功能性抗原結合位點和兩個不同的表位特異性的對稱的四價雙特異性抗體。該雙特異性抗體也不同於由二聚體化小抗體和二聚體化雙體-Fc形成的四價抗體。在一些實施例中，該雙特異性抗體是異二聚醴，並且該雙特異性抗體的Fc片段的CH3結構域能被突變以便於異二聚體的形成。
本發明的一個意外發現是，即使MSBODY和SMBODY具有相同的結合基序和相似的分子量，但在結合到靶腫瘤細胞時，MSBODY表現出比SMBODY更高的穩定性和親和力。在這種情況下，有趣的是，雖然抗Her2/抗CD3 MSBODY和SMBODY對Her2高表現細胞BT474產生了相似的細胞毒性，但MSBODY結構顯示出對於低Her2表現之乳腺癌細胞系(包括MCF-7和MDA-MB-231)的更高細胞毒性。並非所有表現腫瘤抗原的腫瘤細胞都一定高水平表現該抗原，因此MSBODY的這種能力在臨床應用中顯示出獨特的優勢。
出人意外地是，MSBODY也是一個有力的針對淋巴瘤和固態腫瘤的新型療法，因為在異種移植物模型中MSBODY顯示出高的抗腫瘤活性，包括人的胃癌和人的淋巴瘤。在人的胃癌異種移植物模型中，NOD/SCID小鼠皮下注射人的胃癌細胞系，NCI-N87，其為Her2高表現。每3天測量一次腫瘤體積，共33天。當T細胞單獨治療小鼠，腫瘤發生程度與未治療小鼠相同(即100%腫瘤形成)，抗Her2X抗CD3 MSBODY和T細胞組合治療的小鼠腫瘤形成和發展顯示出明顯的降低(即20%腫瘤形成)
在淋巴瘤異種移植物模型中，NOD/SCID小鼠靜脈注射人淋巴瘤細胞系，Raji。注射腫瘤細胞後大約27~33天，未治療和T細胞單獨治療的小鼠的體重均明顯下降。相比較而言，抗CD20X抗CD3 MSBODY和T細胞組合治療的小鼠並未表現出明顯的體重下降。未治療和T細胞單獨治療組的中位存活時間約為26~27.5天。在未治療組僅有四分之一的小鼠存活，且在T細胞單獨治療組四分之二的小鼠存活。相比之下，MSBODY和T細胞組合治療組的中位存活時間是不確定的(即第40天5隻小鼠全部存活)。
因此，在一個實施例中，提供的抗體包含：(a)輕鏈-重鏈對，其具有對於腫瘤細胞的特異性；及(b)融合胜肽，其包含單鏈可變片段(scFv)和Fc片段，該Fc片段包括CH2結構域和CH3結構域，其中該融合胜肽具有對於免疫細胞的特異性。
在另一實施例中，提供的抗體包含：(a)輕鏈-重鏈對，其對於微生物具有特異性，如GP120對於HIV、HA2對於流感、及志賀樣毒素2B對於大腸桿菌(E.Coli)；和(b)融合胜肽，其包含單鏈可變片段(scFv)和Fc片段，該Fc片段含有CH2結構域和CH3結構域，其中該融合胜肽對於免疫細胞具有特異性。
第1圖顯示出本發明的雙特異性抗體一個實施例。該抗體的左半部分(單價單元)是由輕鏈(6)和重鏈(3和4)組成。
第1圖中還顯示，一方面，所述輕鏈(6)包括CL結構域和VL結構域，VLa，標靶於抗原表位「a」。同樣地，除了含有推定的CH2和CH3結構域，該重鏈還包含CH1結構域和VH結構域，VHa，其也標靶於抗原表位「a」。一方面，該輕鏈和重鏈通過雙硫鍵結合，例如，在CL和CH1之間。
第1圖中還顯示了該單鏈單元，其包含單鏈Fv(scFv)片段(5)和恒定區(3)，該恒定區包括CH2和CH3。該scFv片段由VL(VLb)和VH(VHb)結構域組成，它們都標靶於抗原表位「b」，該抗原表位「b」不同於抗原表位「a」。
在某些方面，該單價單元的重鏈通過一個或多個雙硫鍵結合至融合胜肽。一方面，該一個或多個雙硫鍵形成於該CH1(或VLb)和CH2結構域之間的絞鏈區的胺基酸殘基之間。
在某些方面，該單鏈單元的CH2結構域位於scFv片段和CH3結構域之間。換句話說，該scFv片段連接於該Fc片段的CH2末端。在某些方面，該單鏈單元不包含CH1結構域。
一方面，該單價單元和單鏈單元之一或兩者都包含人抗體序列或人源化的序列。例如，在一個方面，該單價單元的重鏈包含人或人源化的Fc片段。在一個具體的方面，該重鏈的Fc片段包含人IgG Fc片段。
同樣地，在一個方面，該融合胜肽的Fc片段包含人或人源化的Fc片段。在一個具體的方面，該融合胜肽的Fc片段包含人IgG Fc片段。
可對抗體進行修改以進一步穩定或提高抗體的活性。比如，在一個態樣，與野生型的抗體片段相比，該單價單元重鏈的Fc片段和/或該融合胜肽的Fc片段可包含一處或多處取代基，這些取代基之間形成離子鍵。
一方面，該Fc片段之一含有一處或多處取代基，經在生理條件下有正電荷的胺基酸殘基取代，而另一Fc片段包含一處或多處取代基，經一個或多個在生理條件下具有負電荷的胺基酸殘基取代。一方面，該帶正電的胺基酸殘基可為精胺酸(R)，組胺酸(H)或賴胺酸(K)。另一方面，該帶負電荷的胺基酸殘基可為天冬胺酸(D)或谷胺酸(E)。可被取代的胺基酸殘基包括，但不限於，D356、E357、L368、K370、K392、D399和K409。下表2列出這些取代基的組合的非限制性實施例。
表2.導致在單價單元和單鏈單元之間形成離子鍵的胺基酸取代基的組合
在某些方面，與野生型的抗體片段比較，該單價單元重鏈的Fc片段和/或該融合胜肽的Fc片段可包含一處或多處取代基，這些取代基之間形成杵-臼結構對。杵-臼構型在本領域中是已知的。參見，例如Ridgway等的「‘Knob-into-holes’ engineering of antibody CH3 domains for heavy chain heterodimerization,」Protein Engineering 9(7)：617-21(1996)。
一方面，一個Fc片段上的K366被相對較大的胺基酸殘基取代，如酪胺酸(Y)或色胺酸(W)取代基。然後，另一Fc片段上的Y407可被相對較小的胺基酸殘基取代，如蘇胺酸(T)，丙胺酸(A)或纈胺酸(V)。下表3顯示了這些取代基的組合的一些非限制性實施例。
表3.導致在單價單元和單鏈單元之間形成杵-臼結構對的胺基酸取代基的組合
在某些方面，該抗體可包含離子鍵或杵-臼結構或兩者都有。下表4顯示了在這方面的一些實施例。
表4.胺基酸取代基的組合
在某些方面，本發明的雙特異性抗體的單價單元對於腫瘤細胞具有特異性。在一方面，該單價單元特異性識別腫瘤抗原。
「腫瘤抗原」是在腫瘤細胞中產生的抗原物質，即，它在宿主中觸發免疫反應。腫瘤抗原用於鑒定腫瘤細胞，並在癌症治療中用作可能的候選。身體中正常的蛋白質不是抗原。然而，在腫瘤發生過程中產生或過度表現了某些蛋白質，從而顯示為對於身體「外來」性。這可能包括很好地躲避免疫系統的正常蛋白，通常以極少量產生的蛋白質，通常僅在某些發育階段中產生的蛋白，或其結構由於突變被修改的蛋白。
大量的腫瘤抗原在本領域中是已知的，並且可以容易地確定通過篩選鑒定新的腫瘤抗原。腫瘤抗原的非限制性實施例包括EGFR、Her2、EpCAM、CD20、CD30、CD33、CD47、CD52、CD133、CEA、gpA33、黏蛋白、TAG-72、CIX、PSMA、葉酸結合蛋白、GD2、GD3、GM2、VEGF、VEGFR、整合素(Integrin)、αVβ3、α5β1、ERBB2、ERBB3、MET、IGF1R、EPHA3、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP和肌腱蛋白(Tenascin)。
在某些方面，該單價單元針對在腫瘤細胞上相對於對應的非腫瘤細胞過度表現的蛋白具有特異性。這裏所用的「對應的非腫瘤細胞」是指與腫瘤細胞的起源具有相同細胞類型的非腫瘤細胞。值得注意的是，這種蛋白質未必與腫瘤抗原不同。非限制性實施例包括在大多數結腸癌、直腸癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌和胃腸道癌中過度表現的癌胚抗原(CEA)、海厄蛋白(heregulin)受體(HER-2，neu或c-erbB-2)，它們通常在乳腺癌、卵巢癌、結腸癌、肺癌、前列腺癌和子宮頸癌中過度表現；表皮生長因子受體(EGFR)，其在一系列固體腫瘤，包括乳腺瘤、頭和頸部腫瘤、非小細胞肺腫瘤和前列腺腫瘤中高表現；去唾液酸糖蛋白受體；轉鐵蛋白受體；絲胺酸蛋白酶抑制劑酶複合物受體，該受體於肝細胞上表現；成纖維細胞生長因子受體(FGFR)，該受體於胰腺導管腺癌細胞中過度表現；血管內皮生長因子受體(VEGFR)，用於抗血管生成基因治療；葉酸受體，該受體於90%的非黏液性卵巢癌中選擇性過度表現；細胞表面多醣蛋白質複合體；醣類受體；和多聚免疫球蛋白受體，該受體用於將基因傳遞至呼吸道上皮細胞，並有望用於治療肺部疾病，如囊性纖維化。
在某些方面，單價單元對於微生物具有特異性。微生物的非限制性實施例包括微生物表面受體和內毒素。內毒素的實施例包括，但不限於，脂多醣(LPS)和脂寡醣(LOS)。
在某些方面，該單鏈單元對於免疫細胞具有特異性。一方面，該免疫細胞選自T細胞、B細胞、單核細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞、樹突細胞、吞噬細胞、自然殺手細胞、嗜酸性粒細胞、嗜鹼性粒細胞和肥大細胞。
一方面，該單鏈單元特異性地識別選自以下的抗原：CD3、CD16、CD19、CD28和CD64。
本文提供了雙特異性配體中的每條多肽鏈的示例性序列。一方面，該單鏈單元的融合胜肽具有SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列。一方面，該單價單元的重鏈具有SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列。一方面，該單價單元的輕鏈具有SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列。
任何上述的抗體或多肽還可包括額外的多肽，例如，如本文所述的編碼的多肽，抗體恒定區的信號肽，該信號肽用於指導分泌，或如本文所述的其他異源多肽。
本發明所述技術領域中具有通常知識者還應當理解，本文所述的抗體可會被修改，以使得它們的胺基酸序列與天然存在的結合多肽不同，它們得自這些天然存在的結合多肽。例如，來自於指定的蛋白的多肽或胺基酸序列可與起始序列類似，例如，與起始序列具有一定百分比的同一性，例如，其可與起始序列有60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%的同一性。
此外，也可進行核苷酸或胺基酸取代、缺失或插入以在「非必需」胺基酸區域進行保守取代或改變。例如，來自指定的蛋白質的多肽或胺基酸序列可與啟動順序相同，除了一個或多個獨立的胺基酸的取代、插入或缺失，例如，1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、15個、20個或更多獨立的胺基酸取代、插入或缺失。在某些實施例中，來自指定的蛋白質的多肽或胺基酸序列相對於起始序列有1至5個、1至10個、1至15個或1至20個獨立的胺基酸的取代、插入或缺失。
在某些實施例中，抗原結合多肽包含通常不與抗體結合的胺基酸序列或一個或多個基團。在下面更詳細地描述了示例性的修改。例如，本發明的單鏈Fv抗體片段可包含柔性接頭序列，或可以被修改以添加的官能基團(例如，聚乙二醇(PEG)、藥物、毒素或標記物)。
本發明的抗體，其變體或衍生物包括被修改的衍生物，即，將任何類型的分子共價連接至抗體且該共價連接不會阻止抗體結合至抗原表位。例如，但不限於，該抗體可以被修改，例如，通過醣基化、乙醯化、PEG化、磷酸化、磷酸化、醯胺化、通過已知的保護/阻斷基團衍生、蛋白水解裂解、連接到細胞配體或其他蛋白等。眾多的化學修飾的任一種均可以通過已知的技術進行，包括，但不限於特定的化學裂解、乙醯化、甲醯化、衣黴素代謝合成等。此外，該抗體可以包含一種或多種非經典胺基酸。
在其它實施例中，本發明的抗原結合多肽可包含保守的胺基酸取代基。
「保守胺基酸取代基」是其中胺基酸殘基被具有類似側鏈的胺基酸殘基取代。具有類似側鏈的胺基酸殘基家族已在本領域中定義，其包括鹼性側鏈(例如賴胺酸、精胺酸、組胺酸)，酸性側鏈(例如天冬胺酸，谷胺酸)，不帶電荷的極性側鏈(例如，甘胺酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)，非極性側鏈(例如，丙胺酸、纈胺酸、亮胺酸、異亮胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蛋胺酸、色胺酸)，β-支鏈的側鏈(例如，蘇胺酸、纈胺酸、異亮胺酸)和芳香族側鏈(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。因此，免疫球蛋白多肽的非必需胺基酸殘基較佳地被來自相同側鏈家族的其他胺基酸殘基取代。在另一實施例中，一串胺基酸可被結構上類似的串取代，後者在順序上和/或側鏈家族的組成上不同。
在下表中提供了的保守性胺基酸取代基的非限制性實施例，其中相似性得分為0或更高表示在這兩個胺基酸之間有保守取代基。
在一些實施例中，所述抗體可以結合治療劑、藥物前體、肽、蛋白、酶、病毒、脂質、生物反應調節劑、藥劑或PEG。
該抗體可以連接至或融合至治療劑上，該治療劑可包括可檢測標記物，如放射性標記物、免疫調節劑、激素、酶、寡核苷酸、光活性治療劑或診斷劑、細胞毒性劑，其可為藥物或毒素、超音波增強劑、非放射性標記物、它們的組合和其他這類本領域已知的成分。
通過將其偶聯化學發光化合物，該抗體被可檢測地標記。然後，通過檢測化學反應過程中產生的發光來確定化學發光物標記的抗原結合多肽的存在。特別有用的化學發光物標記化合物的例子有發光胺(Luminol)、異發光胺、熱性(theromatic)吖啶鎓酯、咪唑、吖啶鎓鹽和草酸酯。
該抗體也可被可檢測地標記，使用螢光發光金屬如152Eu，或其他的鑭系標記。這些金屬可使用以下金屬螯合基團連接到抗體上，如二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)。將多種基團連接至抗體的技術是習知的，參見，例如，Arnon等,「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy」,in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy,Reisfeld等(編.),pp.243-56(Alan R.Liss,Inc.(1985)；Hellstrom等,「Antibodies For Drug Delivery」,in Controlled Drug Delivery(第二版),Robinson等(編),Marcel Dekker,Inc.,pp.623-53(1987)；Thorpe,「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review」,in Monoclonal Antibodies '84：Biological And Clinical Applications,Pinchera等(編),pp.475-506(1985)；「Analysis,Results,And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy」,in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy,Baldwin等(編),Academic Press pp.303-16(1985),以及Thorpe等,「The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates」,Immunol.Rev.(52：119-58(1982))。
編碼抗體的多核苷酸和抗體製備方法
本發明還提供了編碼本發明的抗體、其變體或衍生物的分離的多核苷酸或核酸分子。
例如，第2圖顯示編碼第1圖中顯示的抗體的每一條肽鏈的3種多核苷酸的結構。
本文提供了編碼雙特異性配體中的每條多肽鏈的示例性序列。一方面，該單鏈單元的融合胜肽由SEQ ID NO：2的核酸序列編碼。一方面，該單價單元的重鏈由SEQ ID NO：4的核酸序列編碼。一方面，該單價單元的輕鏈由SEQ ID NO：6的核酸序列編碼。
本發明的多核苷酸可以編碼該抗原結合多肽、其變體或衍生物的整個重鏈和輕鏈可變區，以同樣的多聚核苷酸分子或單獨的多聚核苷酸分子編碼。另外，本發明的多核苷酸可以編碼該抗原結合多肽、其變體或衍生物的一部分重鏈和輕鏈可變區，以同樣的多聚核苷酸分子或單獨的多聚核苷酸分子編碼。
抗體的製備方法在本技術領域是習知的，在此進行描述。在一些實施例中，本發明的抗原結合多肽的可變區和恒定區是完全人類的。完全人抗體可使用現有技術中描述的技術製備，並如本文所述。例如，抗特定抗原的完全人抗體可以通過將該抗原施用至基因轉殖動物來製備，該基因轉殖動物已被修改以產生此種響應抗原刺激的抗體，但其內源性基因座已被禁用。可以用來製造這種抗體的示例性的技術描述於美國專利：6,150,584、6,458,592、6,420,140，其全部內容通過引用併入本文。
在一些實施例中，所製備的抗體不會對待治療的動物(例如人)產生有害的免疫反應。在一個實施例中，本發明的抗原結合多肽，其變體或衍生物經本領域公認的技術修改以降低其免疫原性。例如，抗體可以製成人源化的、靈長類化的、去免疫的、或嵌合的抗體。這些類型的抗體來自於非人類抗體，通常為是鼠或靈長類動物的抗體，該抗體保留或基本保留了親本抗體的抗原結合性質，但它是在人體中免疫原性較低。這可以通過多種方法實現，包括(a)將整個非人類的可變結構域接枝到人恒定區以產生嵌合抗體；(b)將至少一部分的一種或多種非人類的互補決定區(CDR)接枝到人框架區和恒定區、保留或不保留關鍵框架殘基，或(c)移植整個非人類可變結構域，但用與人類類似的部分通過取代基表面殘基將它們「遮蓋」。這樣的方法揭露於Morrison等的Proc.Natl.Acad.Sci.USA 57：6851-6855(1984)；Morrison等的Adv.Immunol.44：65-92(1988)；Verhoeyen等的Science 239：1534-1536(1988)；Padlan,Molec.Immun.25：489-498(1991)；Padlan,Molec.Immun.31：169-217(1994),和美國專利第5,585,089、5,693,761、5,693,762和6,190,370號，所有文件在此以全文通過引用結合至本文。
去免疫也可用於降低抗體的免疫原性。本文使用的，術語「去免疫」包括改變抗體以修改T細胞抗原表位(見，例如，國際申請公開號WO/9852976 A1和WO/0034317 A2)。例如，本發明對來自起始抗體的可變重鏈和可變輕鏈序列進行了分析，並製作了來自每個V區域的人T細胞抗原表位「圖譜」，該圖譜顯示了互補性決定區(CDR)和該序列中的其它關鍵殘基有關的抗原表位的位置。可對來自該T細胞抗原表位圖譜的單個T細胞表位進行分析，以識別備選的胺基酸取代基，其低風險改變最終抗體活性。本發明設計了一系列可選的可變重鏈和輕鏈序列，包括胺基酸取代基的組合，並且這些序列隨後合併至一系列結合多肽中。通常，產生12至24種不同的抗體，並對其測試結合性和/或功能性。然後將包括修改過的可變區和人恒定區的完整的重鏈和輕鏈基因轉殖至表現載體中，將得到的質體導入細胞系中用於產生整個抗體。然後將這些抗體通過合適的生化和生物學分析進行比較，並識別最佳變量。
本發明的抗原結合多肽的結合特異性可通過體外實驗測得，例如免疫沉澱、放射免疫分析法(RIA)或酶聯免疫吸附法(ELISA)。
或者，描述的製備單鏈單元的技術(美國專利4,694,778號；Bird,Science 242：423-442(1988)；Huston等的Proc.Natl.Acad.Sci.USA 55：5879-5883(1988)；和Ward等的Nature 334：544-554(1989))可用於產生本發明的單鏈單元。經胺基酸橋連接Fv區的重鏈和輕鏈片段形成單鏈單元，獲得單鏈融合胜肽。在大腸桿菌(E.coli)中合成功能性Fv片段的技術也可以使用(Skerra等的Science 242：1038-1041(1988))。
可以用於產生單鏈Fvs(scFvs)和抗體的技術實施例包括描述在美國專利第4,946,778號和5,258,498號；Huston等的Methods in Enzymology 203：46-88(1991)；Shu等的Proc.Natl.Sci.USA 90：1995-1999(1993)；和Skerra等的Science 240：1038-1040(1988)。對於某些應用，包括在人體內體內使用抗體和體外檢測分析，可較佳地使用嵌合的、人源化的或人抗體。嵌合抗體為抗體的不同部分來自不同動物種類的分子，例如含有來自鼠單株抗體的可變區和人免疫球蛋白恒定區的抗體。嵌合抗體的製造方法是本領域已知的。見，例如，Morrison,Science 229：1202(1985)；Oi等的BioTechniques 4：214(1986)；Gillies等的J.Immunol.Methods 125：191-202(1989)；美國專利第5,807,715；4,816,567和4,816397號，其全部內容通過引用的方式併入本文。
人源化的抗體為來自於非人類物種的抗體分子，並且該抗體分子結合所需的抗原，該抗體分子具有一個或多個來自非人類物種的互補決定區(CDR)和來自人免疫球蛋白分子的框架區。通常，在人框架區中的框架殘基將被來自CDR供體抗體的對應殘基取代，以改變或較佳地提高抗原結合能力。這些框架取代通過本領域已知的方法識別，例如，通過建立CDR和框架殘基的相互作用模型，以鑒定對於抗原結合和序列比較重要的框架殘基，以找出在特定位置的異常的框架殘基。(見，例如，Queen等的美國專利第5,585,089號；Riechmann等的Nature 332：323(1988)，其全部內容通過引用併入本文)。可使用多種本領域已知的技術對抗體進行人源化，這些技術包括，例如，CDR-移植(EP 239,400；PCT公開號WO 91/09967；美國專利第5,225,539；5,530,101和5,585,089號),飾面(veneering)或表面置換(resurfacing)(EP 592,106；EP 519,596；Padlan,Molecular Immunology 28(4/5)：489-498(1991)；Studnicka等的,Protein Engineering 7(6)：805-814(1994)；Roguska等的Proc.Natl.Sci.USA 91：969-973(1994))，和鏈改組(shuffling)(美國專利第5,565,332號,其全部內容通過引用結合至本文)。
完全人抗體對於人類患者的治療是特別理想的。人抗體可以通過本領域已知的多種方法製備，包括使用來自人免疫球蛋白序列的抗體庫的噬菌體展示方法。還參見，美國專利第4,444,887號和4,716,111號；和PCT公開號WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735和WO 91/10741，這些文件的每一個在此通過引用結合至本文。
也可以使用轉殖基因小鼠產生人抗體，該轉殖基因小鼠不能表現功能性內源性免疫球蛋白，但可以表現人免疫球蛋白基因。例如，可將人重鏈和輕鏈免疫球蛋白基因複合體隨機地或通過同源重組導入至小鼠胚胎幹細胞中。或者，除了人重鏈和輕鏈基因之外，還可將人可變區、恒定區和多變區導入至小鼠胚胎幹細胞中。可通過同源重組將該小鼠重鏈和輕鏈免疫球蛋白基因非功能性地分別給予或同時引入人免疫球蛋白基因座。具體地，JH區的純合缺失防止產生內源性抗體。修改後的胚胎幹細胞展開並微注射到囊胚中以產生嵌合體小鼠。然後飼養嵌合體小鼠用於產生表現人抗體的純合子後代。對該轉殖基因小鼠用選定的抗原以正常的方式免疫，例如，使用所需的靶多肽的全部或一部分。針對該抗原的單株抗體可從經免疫的轉殖基因小鼠用常規融合瘤技術獲得。該轉殖基因小鼠攜帶的人免疫球蛋白轉基因在B細胞分化過程中重新排列，並隨後進行類別轉化和體細胞突變。因此，使用該技術，能夠產生治療上有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗體。生產人抗體的該技術的概述，見Lonberg和Huszar Int.Rev.Immunol.73：65-93(1995)。用於生產人抗體和人單株抗體的技術和用於生產此種抗體的技術方案的詳細討論，參見，如PCT公開號WO 98/24893；WO 96/34096；WO 96/33735；美國專利第5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；和5,939,598號，它們通過引用以全文形式結合至本文。此外，如Abgenix公司(Freemont,Calif.)和GenPharm((San Jose,Calif.)等公司能提供針對選定的抗原的人抗體，使用與上述類似的技術獲得。
識別選定的抗原表位的完全人抗體也可使用被稱為「導向選擇」的技術產生。在該方法中，選定的非人類單株抗體，例如，小鼠抗體，用於引導識別相同抗原表位的完全人抗體的選擇。(Jespers等的Bio/Technology 72：899-903(1988)。還參見，美國專利第5,565,332號,其通過引用全文結合至本文)。
在另一實施例中，編碼所需的單株抗體的DNA很容易地使用常規方法分離和定序(例如，通過使用寡核苷酸探針，該探針能夠特異性結合至鼠抗體的重鏈和輕鏈的編碼基因)。分離和亞株的融合瘤細胞作為這種DNA的首選來源。分離後，該DNA可置於表現載體中，然後將該載體轉殖到原核或真核宿主細胞中，如大腸桿菌(E.coli)細胞、猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞，這些細胞不產生免疫球蛋白。更具體地，分離的DNA(可如本文所述進行合成)可用於轉殖恒定區和可變區序列用於製備抗體，如Newman等於1995年1月25日提交的美國專利5,658,570，其在此通過引入結合至本文。本質上講，這需要從選定的細胞中提取RNA，轉化成cDNA，並通過PCR使用Ig特異性引子放大。用於該目的的合適的引子也描述於美國專利5,658,570號中。如將在下面更詳細地討論的，表現所需的抗體的轉化的細胞可相對大量地培養以提供臨床上和商業應用上的免疫球蛋白。
此外，使用常規的重組DNA技術，本發明的抗原結合多肽的一個或多個CDR，可插入框架區內，例如，插入至人框架區以使非人類抗體人源化。該框架區可以是天然存在的或共有的框架區，且較佳地為人的框架區(見，例如，Chothia等的J.Mol.Biol.278：457-479(1998)，人的框架區的列表)。較佳地，該框架區和CDR的組合所產生的多核苷酸編碼多肽，該多肽特異性地結合至所需多肽的至少一個抗原表位，例如，LIGHT。較佳地，可在框架區內進行一個或多個胺基酸取代，並且，較佳地，該胺基酸取代基提高該抗體對抗原結合能力。此外，這種方法可用於獲得一個或多個可變區半胱胺酸殘基(該半胱胺酸殘基參與鏈內雙硫鍵形成)的胺基酸取代或缺失，這樣產生缺乏一個或多個鏈內雙硫鍵的抗體分子。其他對於該多核苷酸進行的改變都包含在本發明的範圍內，並在現有技術範圍內。
此外，可使用用於通過對來自小鼠抗體分子的基因剪接生產「嵌合抗體」的技術(Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA：851-855(1984)；Neuberger等的Nature 372：604-608(1984)；Takeda等的Nature 314：452-454(1985))，具有合適的抗原特異性，與具有合適生物活性的人抗體分子基因一起。如本文使用的，嵌合抗體為其中不同部分來自不同動物種類的分子，例如含有來自鼠單株抗體的可變區和人免疫球蛋白恒定區的抗體。
然而，另一種用於產生重組抗體的高效方法揭露於Newman,Biotechnology 10：1455-1460(1992)。具體地，該技術導致產生含有猴可變結構域和人恒定序列的靈長類化的抗體。該文件通過引用全文結合至本文中。此外，這種技術也被描述在共同轉讓的美國專利號5,658,570、5,693,780和5,756,096，其中每一篇通過引用併入本文。
或者，產生抗體的細胞系可使用本發明所述技術領域中具有通常知識者熟知的技術選擇和培養。這樣的技術描述在多種實驗室手冊和主要出版物中。在這方面，本文中適合使用的技術如下所述描述於Current Protocols in Immunology,Coligan等編,Green Publishing Associates and Wiley-Interscience,John Wiley和Sons,New York(1991)，其通過引用以全文併入本文中，包括補充參考。
此外，本發明所述技術領域中具有通常知識者習知的標準技術可用於在編碼本發明抗體的核苷酸序列中引入突變，包括，但不限於，定點突變和PCR媒介的突變，這產生胺基酸取代。較佳地，所述變體(包括衍生物)，相對於參考可變重鏈區，CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、輕鏈可變區、CDR-L1、CDR-L2或CDR-L3，編碼少於50個胺基酸取代基、少於40個胺基酸取代基、少於30個胺基酸取代基、少於25個胺基酸取代基、少於20個胺基酸取代基、少於15個胺基酸取代基、少於10個胺基酸取代基、少於5個胺基酸取代基、少於4個胺基酸取代基、少於3個胺基酸取代基、或少於2個胺基酸取代基。或者，可將沿著全部或部分的編碼序列隨機引入突變，例如通過飽和誘變，可對所得到的突變體針對生物活性篩選，以確定保留有活性的突變。
治療和診斷方法
本文所述的，本發明的抗原結合多肽、變體或衍生物可用於與癌症或傳染病相關的某些治療和診斷方法中。
本發明還涉及基於抗體的治療，此種治療包括將本發明的雙特異性抗體給予至患者，例如動物、哺乳動物和人，用於治療本文描述的一種或多種疾病或狀況。本發明的治療化合物包括但不限於，本發明的抗體(包括如本文所述的它們的變體和衍生物)和核酸或編碼本發明的抗體的多核苷酸(包括如本文所述的它們的變體和衍生物)。
本發明的抗體也可以用於治療，抑制或預防疾病，病症或狀況，包括惡性的疾病，病症，或與這樣的疾病或病症相關的狀況，如與增加細胞存活或抑制細胞凋亡相關的疾病，例如癌症(如濾泡淋巴瘤、具有p53基因突變的癌、激素依賴性腫瘤，包括但不限於結腸癌、心臟腫瘤、胰腺癌、黑色素瘤、視網膜母細胞瘤、膠質母細胞瘤、肺癌、腸道癌、睾丸癌、胃癌、神經母細胞瘤、黏液瘤、子宮肌瘤、淋巴瘤、內皮瘤、骨母細胞瘤、骨巨細胞瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、腺瘤、乳腺癌、前列腺癌、卡波西氏肉瘤和卵巢癌)，自體免疫紊亂(如，多重硬化症、乾燥綜合症、格雷夫斯病(Grave's disease)、橋本氏甲狀腺炎、自身免疫性糖尿病、膽汁性肝硬化、白塞氏病、克羅恩氏病、多肌炎、全身性紅斑狼瘡和免疫相關的腎小球腎炎、自身免疫性胃炎、自身免疫性血小板減少性紫癜和類風濕關節炎)和病毒感染(如皰疹病毒、痘病毒和腺病毒)、炎症、移植物抗宿主病(急性和/或慢性)、急性移植物排斥、和慢性移植物排斥。本發明的抗原結合多肽，其變體或衍生物用於抑制癌症的生長、發展和/或轉移，特別是上面列出的或下面段落中列出的那些。
可以用本發明的抗體或其變體或衍生物治療、預防、診斷和/或預測的與增加細胞存活相關的其他疾病或狀況，包括但不限於，惡性腫瘤的發展和/或轉移，以及相關疾病，如白血病(包括急性白血病(例如，急性淋巴細胞白血病，急性髓細胞白血病(包括顆粒球、前骨髓性顆粒球、骨髓單核、單核細胞、紅白血病))和慢性白血病(例如，慢性骨髓細胞性(顆粒球性)白血病和慢性淋巴細胞性白血病))、真性紅細胞增多症、淋巴瘤(例如，何杰金氏病(Hodgkin's disease)和非何杰金氏病)、多發性骨髓瘤、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's macfoglobulinemia)、重鏈病，和固體腫瘤包括，但不限於，肉瘤和癌，例如纖維肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌瘤、結腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、乳頭狀囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝癌、膽管細胞癌、絨毛膜上皮癌、精原細胞瘤、胚胎癌、腎母細胞瘤(Wilm's tumor)、宮頸癌、睾丸腫瘤、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經膠質瘤、星形細胞瘤、髓母細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細胞瘤、少突膠質細胞瘤、聽神經瘤、腦膜瘤(menangioma)、黑色素瘤、神經母細胞瘤和視網膜母細胞瘤。
本發明的抗體也可用於治療由微生物引起的傳染病，或用於殺死微生物，這通過標靶微生物和免疫細胞以消除該微生物來實現。一方面，所述微生物包括RNA病毒和DNA病毒的病毒、革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性細菌、原生動物或真菌。在下表4中提供了傳染病及相關微生物的非限制性實施例。
表6.傳染病和相關微生物源。
任何特定患者使用的具體的劑量和治療方案將取決於多種因素，包括使用的特定抗原結合多肽、其變體或衍生物、患者的年齡、體重、總體健康狀況、性別和飲食及給藥時間、排泄率、藥物組合、待治療的具體疾病的嚴重程度。由醫療護理者對這些因素的判斷在本技術領域內的普通技術範圍內。用量也將取決於待治療的個體病人、給藥途徑、製劑的類型、所使用的化合物的特徵、疾病的嚴重程度和預期的效果。所用的量可通過本領域已知的藥物學和藥物動力學的原理決定。
給予抗原結合多肽、其變體或衍生物的方法包括但不限於皮內、肌內、腹膜內、靜脈內、皮下、鼻內、硬膜外和口服途徑。該抗原結合多肽或組合物可以通過任何方便的途徑給藥，例如通過輸注或大劑量注射，通過上皮或黏膜與皮膚內層(例如，口腔黏膜、直腸和腸黏膜等)吸收，並且可以與其他生物活性劑一起給藥。因此，本發明的含抗原結合多肽的藥物組合物可被口服給藥、直腸給藥、非腸道給藥、腦池內給藥、陰道內給藥、腹膜內給藥、局部給藥(如經粉劑、軟膏、滴劑或透皮貼劑)、含服給藥(bucally)或作為口腔或鼻腔噴劑。
本文使用的術語「非腸道」是指包括靜脈內、肌內、腹膜內、胸骨內、皮下和關節內注射和輸注的給藥模式。
給藥可以是全身或局部給藥。此外，還可能需要的是通過任何合適的途徑，包括腦室內和鞘內注射引入本發明的抗體進入中樞神經系統；腦室導管可促進腦室注射，例如，將導管連接到一個儲液庫，如奧瑪耶(Ommaya)儲液庫。也可以肺部給藥，例如，通過使用吸入器或霧化器，含霧化劑的配方進行。
還可能需要的是將本發明的抗原結合多肽或組合物局部給藥至需要治療的區域，這可通過，例如但不限於，在手術過程中局部灌注、局部應用，例如與手術後傷口敷料結合，通過注射、通過導管、通過栓劑、或通過植入物實現，所述植入物為多孔的、無孔的、或凝膠狀材料、包括膜如塞拉斯提克(sialastic)膜或纖維。較佳地，當給予本發明的蛋白質(包括抗體)時必須小心使用不吸收蛋白質的材料。
在另一實施例中，抗原結合多肽或組合物可以在囊泡中，特別是微脂體中遞送(見Langer,1990,Science 249：1527-1533；Treat等的in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer,Lopez-Berestein和Fidler(編),Liss,New York,pp.353-365(1989)；Lopez-Berestein,同上,pp.317-327；同上)。
在還另一實施例中，抗原結合多肽或組合物可通過控制釋放系統遞送。在一個實施例中，可使用泵(參見Sefton,1987,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：201；Buchwald等,1980,Surgery 88：507；Saudek等,1989,N.Engl.J.Med.321：574)。在另一實施例中，可使用聚合物材料(參見，Medical Applications of Controlled Release，Langer和Wise(編),CRC Pres.Boca Raton,Fla.(1974)；Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design and Performance,Smolen和Ball(編),Wiley,New York(1984)；Ranger和Peppas,J.,1983,Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23：61；還參見Levy等的1985,Science 228：190；During等,1989,Ann.Neurol.25：351；Howard等,1989,J.Neurosurg.71：105)。在還另一實施例中，控制釋放系統可以被放置在治療目標附近，即，大腦附近，因此需要全身劑量的一小部分(參見，例如，Goodson,in Medical Applications of Controlled Release,supra,vol.2,pp.115-138(1984))。其他控制釋放系統討論於Langer的綜述中(1990,Science 249：1527-1533)。
在一個具體實施例中，本發明的組合物包含編碼蛋白的核酸或多核苷酸，該核酸可以體內給予，以促進其編碼的蛋白的表現，通過將其構建為合適的核酸表現載體的一部分並將其給予，以使其進入細胞內，例如，通過使用逆轉錄病毒載體(見美國專利第4,980,286號)，或通過直接注射，或通過使用微粒轟擊(如基因槍，Biolistic，Dupont)，或用脂類或細胞表面受體或轉染劑塗覆，通過將其連接至同源異型框類肽並施用，該同源異型框類肽已知能進入核內(見，例如，Joliot等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：1864-1868)等。或者，可將核酸經細胞內引入，並結合至宿主細胞DNA中，通過同源重組進行表現。
本發明的抗體的量，在治療、抑制、和預防可以通過標準的臨床技術確定的炎症，免疫或惡性疾病、病症或症狀方面是有效的。此外，在體外實驗中可以任選用量以幫助確定最佳的劑量範圍。配方中使用的精確劑量也將取決於給藥途徑，和疾病、病症或狀況的嚴重性，並應根據醫生的判斷和每個病人的具體情況確定。可從來自體外或動物模型試驗系統的劑量-反應曲線推算出有效劑量。
作為一個一般命題，本發明的抗原結合多肽對於患者的給藥劑量通常為0.1 mg/kg至100 mg/kg患者體重，在0.1 mg/kg和20 mg/kg患者體重之間，或1 mg/kg至10 mg/kg患者體重之間。一般來說，人抗體比來自其他物種的抗體在人體內有更長的半衰期，由於有對於外源多肽的免疫反應。因此，低劑量的人抗體，減少給藥頻率通常是允許的。另外，本發明的抗體的給藥劑量和頻率可通過加強抗體的吸收和組織滲透(例如，進入大腦)來降低，該加強通過修飾例如脂化來實現。
治療感染或惡性的疾病，症狀或病症的方法，該方法包括給予本發明抗體、該抗體的變體，該治療通常在體外進行試驗，然後在一個可以接受的動物模型中針對所期望的治療或預防活性進行體內試驗，然後用於人類。合適的動物模型，包括轉殖基因動物，對於本發明所述技術領域中具有通常知識者是習知的。例如，本文描述的用於證明抗原結合多肽的治療效果的體外分析，包括抗原結合多肽對於細胞系或患者組織樣本的作用效果。抗原結合多肽對細胞系和/或組織樣本的作用效果可利用本發明所述技術領域中具有通常知識者已知的技術測定，這些技術例如本文其他地方所披露的分析。根據本發明，可以使用體外分析以確定是否特定的抗原結合多肽給藥被指示，包括在體外細胞培養分析，其中患者組織樣本在培養基中培養，並暴露於化合物或以其他方式給予化合物，觀察這種化合物對於該組織樣本的作用。
各種遞送系統是已知的，並可用於給予本發明的抗體或編碼本發明抗體的多核苷酸，例如，將其包封在脂質體，微粒，微膠囊中，能表現該化合物的重組細胞，受體媒介的內吞作用(參見，例如，Wu和Wu,1987,J.Biol.Chem.262：4429-4432),構建核酸作為逆轉錄病毒或其他載體(construction of a nucleic acid as part of a retroviral or other vector)等。
另一實施例中，本發明的組合物與抗腫瘤劑、抗病毒劑、抗菌劑或抗生素劑或抗真菌劑。本領域已知的這些試劑的任一種可在本發明的組合物中給予。
在另一實施例中，本發明的組合物與化學治療劑聯合給藥。可與本發明的組合物一起施用的化學治療劑包括但不限於，抗生素衍生物(例如，阿黴素、博來黴素、柔紅黴素和放線菌素D)；抗雌激素(例如，他莫昔芬)；抗代謝物(例如，氟尿嘧啶、5-FU、氨甲喋呤、氟尿苷、干擾素α-2b、谷胺酸、普卡黴素、巰基嘌呤和6-硫鳥嘌呤)；細胞毒性劑(例如，亞硝脲氮芥、BCNU、環己亞硝脲、CCNU、阿糖胞苷、環磷醯胺、雌二醇氮芥、羥基脲、丙卡巴肼、絲裂黴素、白消安、順鉑和硫酸長春新堿)，激素類(例如醋酸甲羥孕酮、雌莫司汀磷酸鈉、乙炔雌二醇、雌二醇、醋酸甲地孕酮、甲基睾丸酮、己烯雌酚二磷酸酯、氯烯雌醚和睾內酯)；氮芥衍生物(例如，美法蘭、瘤可寧雙氯乙基甲胺(氮芥)和塞替派)；類固醇及其組合(如，倍他米松(bethamethasone)磷酸鈉)；及其他(例如，氮烯唑胺(dicarbazine)、天冬醯胺酶、米托坦、硫酸長春新鹼、硫酸長春鹼和依妥普賽)。
在其他實施例中，本發明的組合物與細胞因子組合施用。可以與本發明的組合物共同施用的細胞因子包括，但不限於，IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、抗CD40、CD40L和TNF-α。
在其他實施例中，本發明的組合物與其他的治療或預防方案，例如，放射治療組合施用。
組合物
本發明還提供了藥物組合物。這樣的組合物包括有效量的抗體和可接受的載體。在一個具體的實施例中，術語「藥學上可接受的」是指由聯邦或州政府的管理機構批准的或美國藥典或其它普遍認可的藥典中列出的用於在動物中，並且更具體地用於人類的情況。另外，「藥學可接受載體」通常為無毒的固體，半固體或液體填充劑、稀釋劑、封裝材料或任何類型的製劑助劑。
術語「載體」是指用於實施治療的稀釋劑、佐劑、賦形劑或載體(vehicle)。這樣的藥物載體可以是無菌液體，例如水和油類，包括石油、動物油、植物油或合成來源的油類，如花生油、豆油、礦物油、芝麻油等。藥物組合物靜脈內給藥時水是一種較佳地的載體。鹽溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液也可以被用作液體載體，特別是用於注射溶液。合適的藥物賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽糖(malt)、大米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如有需要，該組合物也可以含有少量的潤濕劑或乳化劑，或pH緩衝劑，如乙酸鹽，檸檬酸鹽或磷酸鹽。抗菌劑如苄醇或羥苯甲酸甲酯，抗氧化劑如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉，螯合劑如乙二胺四乙酸，和調節張力的試劑如氯化鈉或葡萄糖也可以使用。這些組合物可採取溶液、懸浮液、乳劑、片劑、丸劑、膠囊劑、粉劑、緩釋製劑等形式。該組合物可以配製成栓劑，使用傳統的黏合劑和載體如甘油三酯。口服配方可包括標準載體，例如藥物級的甘露糖醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。合適的藥物載體的實施例描述於E.W.Martin,的Remington's Pharmaceutical Sciences中，通過引用結合至本文。這樣的組合物包含治療有效量的抗原結合多肽，較佳地以純化形式，與合適量的載體一起，以便向患者提供合適施用的形式。配方應適合施用的模式。母本製劑可以封裝在安瓿瓶，一次性注射器或玻璃或塑料製成的多劑量小瓶中。
在一個實施例中，所述組合物按照常規程序配製為適用於向人體靜脈內給藥的藥物組合物。通常情況下，用於靜脈內給藥的組合物是無菌等滲含水緩衝液。在必要的情況下，該組合物還可以包含增溶劑和局部麻醉劑，如利多卡因，以在注射部位緩解疼痛。通常，這些成分單獨或混合在一起供應，以單位劑量形式，例如，在一個密封的容器如安瓿瓶或指示活性劑的量的小袋(sachette)中以乾燥的凍幹粉末或無水濃縮物的形式。當組合物通過輸注給藥時，可以免去含有藥用級無菌水或鹽水的輸液瓶。當組合物是通過注射給藥時，可提供注射用無菌水或生理鹽水的安瓿瓶，以便在給藥前混合各成分。
本發明的化合物可以配製成中性或鹽的形式。藥學上可接受的鹽包括與陰離子形成的那些鹽，如來自鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的鹽，和與陽離子形成的那些鹽，例如來自鈉、鉀、銨、鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、組胺酸、普魯卡因等的鹽。
實施例
實施例1抗Her2/neu-抗CD3雙特異性抗體的製備。
材料
抗人Her2的人源化的單株抗體賀癌平的VL和VH的編碼多核苷酸，抗人CD3人源化的單株抗體HOKT3的VL和VH的編碼多核苷酸，IgG1重鏈恒定區CH1的編碼多核苷酸，絞鏈的絞鏈區和Fc的編碼多核苷酸，和CL的kappa鏈恒定區的多核苷酸得自於Life TechnologiesInc.(Carlsbad,CA)。連接OKT3ScFv和VL和VH的接頭序列(GGGGS)3使用常規方法合成。
方法和結果
1.表現載體的構建
pcDNA3.1(-)用作表現載體以製備賀癌平重鏈表現構建。pcDNA3.1(+)Hygro用作表現載體以製備賀癌平輕鏈表現構建和HOKT3單鏈構建。根據VL、VH、ScFv、CH1和Fc的序列以及pcDNA3.1(-)和pcDNA3.1(+)Hygro載體的多轉殖位點設計引子(表7)。利用重疊延伸PCR法將VL和CL、VH和CH1、CH1和Fc、ScFv VL和VH、ScFv和Fc片段連接起來。
表7. PCR引子序列
VL、CL、VH和CH1的PCR放大條件包括：在95℃孵育5分鐘，然後25個循環：95℃變性30秒，56℃黏著30秒，72℃延伸1分鐘；以72℃閉合延伸10分鐘。第3圖提供了顯示PCR產物的凝膠圖片。
Fc和ScFv的PCR放大條件是相似的，除了在25個循環中的每一輪包括95℃變性1分鐘，56℃黏著1分鐘，以及72℃延伸2分鐘。第4圖提供了顯示PCR產物的凝膠圖片。
使用重疊延伸PCR將賀癌平的VH和CH1、以及VL和CL連接。等量的回收VH和CH1，或VL和CL，及CH1和Fc彼此分別作為模板和引子使用。其他條件類似於常規PCR，進行2個循環條件為：95℃變性2分鐘，55℃黏著2分鐘，72℃延伸2分鐘。然後加入VH5'末端寡核苷酸引子和CL3'末端引子，按以下條件25個循環：95℃變性1分鐘，56℃黏著1分鐘，72℃延伸2分鐘。結束循環包括72℃延伸10分鐘。
用於VH-CH1和Fc，ScFv和Fc的重疊延伸PCR連接的條件包括使用回收的VHCH1以及等量的Fc、ScFv和Fc作為模板和引子。最初的孵育包括2個循環的以下反應：95℃變性2分鐘，55℃黏著2分鐘，以及72℃延伸3分鐘。然後加入VH5'末端寡核苷酸引子和CL3'末端引子，然後按以下條件25個循環反應：95℃變性1分鐘，56℃黏著1分鐘，72℃延伸3分鐘。結束循環包括72℃延伸10分鐘。第5圖提供了顯示PCR產物的凝膠圖片。
使用DNA片段回收試劑盒收集PCR產物，並且VH-CH1-Fc片段使用NheI和Xhol雙酶切分離。然後將該片段插入至pcDNA3.1(-)載體並命名為pcDNA3.1(-)-Herceptin heavy chain。同樣地，用於HOKT3的ScFv-Fc片段(經Nhel和Xhol雙酶切)，賀癌平的VL-CL片段(經Nhel和BamHI雙酶切)，也插入至pcDNA3.1(+)Hygro載體中並分別命名為pcDNA3.1(+)Hygro-HOKT3single chain和pcDNA3.1(+)Hygro-Herceptin light chain。
2.點突變
點突變利用試劑盒Site-Directed Mutagenesis Kit和pcDNA3.1(-)-Herceptin heavy chain和pcDNA3.1(+)Hygro-HOKT3single chainFc的引子(表8)進行。該反應按照試劑盒說明書進行。該突變通過定序確定(定序載體顯示於第6~8圖中)。
表8.定點突變引子序列
下表9顯示了抗Her2/neu-抗CD3雙特異性抗體的每條鏈的序列。
表9.雙特異性抗體的多肽序列和核酸序列
3.放大
將重組質體轉化至大腸桿菌(E.coli)TOP10中。挑取單株並在含有100 mg/L氨苄青黴素的LB培養基中生長，於37℃振盪條件下培養16小時。然後8000×g離心10分鐘收集細菌。使用Tiangen內毒素試劑盒(endotoxin kit)分離質體，將該質體溶解於1 ml洗脫EB緩衝液中。使用1.42 ml異丙醇和0.42 ml NaCl使質體沉澱，然後用70% 0.5 ml乙醇洗滌兩次，然後超淨台中風乾，然後溶解於滅菌超純水(1mL)中。於OD260/280測量質體濃度。OD260/280值位於1.8至1.9之間表明其為高純度的質體DNA。
4.在哺乳動物細胞293F中轉染和表現MSBODY
在轉染之前24小時，於37℃，8% CO2，130 rpm條件下，將1×106的293F細胞接種於125 ml燒瓶中的28 ml的293 freestyle培養基中。將100 μl 293 fectin加入至1 ml的OPtiMEM中，攪拌條件下，室溫孵育5分鐘。同時，重組質體pcDNA3.1(+)Hygro-HOKT3single chain LDY，pcDNA3.1-Herceptin heavy chain TKK(-)和pcDNA3.1(+)Hygro-Herceptin light chain以3：2：1的比例混合。DNA總量為30 μg，溶解於1 ml OPtiMEM中。DNA和293 fectin完全混合，並且總體積為2 ml，在室溫孵育15分鐘。然後將該混合物加入至細胞培養物中。在37℃培養細胞，且培養箱中有5% CO2，以130 rpm培養5天。通過SDS-PAGE和西方墨點法檢測細胞上清液中的抗體表現(第9圖)。該抗體，指MSBODY，包含對Her2/neu有特異性的單價輕鏈/重鏈單元，和對CD3有特異性的單鏈單元。
5.抗體純化。
將細胞培養基於2000×g離心，收集上清並用0.22 μm過濾器過濾。將收集的液體用10倍(以體積算)結合緩衝液(9.5 mM NaH2PO4+40.5 mM Na2HPO4，pH7.0)稀釋，然後通過Sepharose Fast Flow protein A親和色譜柱(購自GE公司，5ml體積)、Fab Affinity KBP Agarose親和填料(購自ACROBiosystems公司，5 ml體積)，和SP陽離子交換色譜柱(購自GE公司，10ml)進行純化，依使用手冊操作。將純化的蛋白用6%凝膠SDS-PAGE和考馬斯亮藍染色檢測(見第10圖)。
實施例2雙特異性抗體的結合活性分析
抗Her2/neu-抗-CD3雙特異性抗體(MSBODY)結合至有Her2和CD3的細胞的能力使用BT474和週邊血單核細胞(PBMC)進行檢測。
自細胞培養物中收集3×105的BT474細胞，並用50 μl PBS、10 nM賀癌平或10 nM雙特異性抗體孵育。30分鐘後，將細胞用1% FBS/PBS洗兩次，然後與2.5 μl PE標記的抗人IgG Fc混合。該混合物於室溫下孵育30分鐘，且該細胞再次用1% FBS/PBS洗滌。然後將該樣品在FACS設備上進行檢測。
如第11A圖所示，賀癌平(黑虛線)和抗her2X抗CD3MSBODY(黑實線)雙特異性抗體都結合至乳腺癌細胞系BT474，其中灰線為陰性對照。結果顯示該雙特異性抗體可有效地結合至Her2表現癌細胞。
週邊血單核細胞(PBMC)也表現CD3。製備1.5×106 PBMC細胞並用50 μl PBS、12.5 nM hOKT3或12.5 nM雙特異性抗體孵育。雙特異性配體(黑實線)結合的PBMC細胞數與HOKT3結合的細胞(黑虛線)一樣高(第11B圖)。
實施例3 雙特異性抗體BT-474細胞的細胞毒性測試
BT-474細胞用作靶細胞，接種於96孔板(10000個細胞/孔)中。24小時後，加入分離的人PBMC(作用細胞)，然後將該混合物與HOKT3抗體、MSBODY、人IgG蛋白或單獨與PBS共孵育(40：1作用細胞-靶細胞(E-T)比)。第12圖提供了對於每種抗體的細胞聚集的圖片。很明顯對照組樣品(PBS)和人IgG樣品沒有細胞聚集，而MSBODY誘導下具有與HOKT3相同數量的細胞聚集。
測量對於MSBODY、賀癌平、HOKT3，和賀癌平+HOKT3的抗體誘導的細胞毒性，使用人IgG作為對照。BT-474細胞(靶細胞)首先用5 μM CFSE染色然後與人PBMC(作用細胞：E-T比：5：1)混合。將相同濃度的賀癌平、HOKT3、賀癌平+HOKT3、MSBODY和人IgG加入至細胞培養物中。孵育24小時後，收集細胞並用1 μg/ml PI染色，使用流式細胞儀計數(MoFlo XDP，Beckman Coulter)。如果細胞被CFSE和PI二重染色則計為死細胞。以死細胞數量和細胞總量之間的比率計算細胞死亡率。以測量的細胞死亡率和自然細胞死亡率之間的差值來計算細胞毒性。結果顯示於第13圖中，第13圖顯示，與賀癌平和HOKT3相比，甚至與賀癌平和HOKT3組合比較，MSBODY導致產生最高的細胞毒性。
另一細胞毒性研究使用人T淋巴細胞作為作用細胞以及BT-474作為靶細胞進行。BT-474細胞首先用5 μM CFSE染色。第二天，將人PBMC與50 nM人IgG、賀癌平+HOKT3、MSBODY或PBS混合，室溫放置30分鐘。將細胞用1% FBS-PBS洗滌兩次，然後用20% FBS重懸浮。然後將處理的PBMC細胞加入至BT-474細胞中，以20：1、10：1、5：1、2.5：1和1.25：1的效靶比加入。將混合的細胞孵育48小時(第14圖)。然後將收集的細胞染色並計數。如第14圖所示，與同賀癌平和HOKT3預混合的PBMC相比，孵育MSBODY的PBMC致死細胞量最大。
由此該實施例出乎意料地顯示，MSBODY在導致細胞聚集方面和HOKT3同樣有效，並且比賀癌平和HOKT3兩者都具有更高的細胞毒性。
實施例4 抗體之間的比較
該實施例將MSBODY與其他類型的抗體進行比較，這些其他類型的抗體針對Her2/neu和CD3之一或兩者都有特異性，該實施例顯示MSBODY的出乎意料的高活性和高穩定性。
本實施例中測試的各種類型的抗體顯示於第15A至15E圖中。第15A圖顯示了MSBODY，其中單價單元具有賀癌平的VH和VL，且單鏈單元包含HOKT3的VH和VL。第15B圖中的抗體幾乎為MSBODY的鏡像，稱為「SMBODY」。該SMBODY具有單價單元和單鏈單元，該單價單元包含HOKT3的VH和VL，且該單鏈單元含有賀癌平的VH和VL。
第15C圖中的抗體，稱為「SSBODY」，包含兩個單鏈單元，一個具有賀癌平的VH和VL，而另一個具有HOKT3的VH和VL。如圖所示，MSBODY、SMBODY和SSBODY都包含任選的鹽橋和「杵」-「臼」結構。
第15D圖顯示了雙單鏈抗體(稱為「賀癌平單鏈」)，其中兩個單鏈單元都包含賀癌平的VH和VL。其中該抗體具有單一特異性。最後，第15E圖顯示了一種雙單鏈抗體，該抗體具有兩個單鏈單元，該單鏈單元含有HOKT3的VH和VL，本文中其被稱為「HOKT3單鏈」。
為了將MSBODY和SMBODY對Her2表現細胞的結合親和力進行比較，將3×105 BT-474細胞用不同稀釋濃度的純化的MSBODY或SMBODY於50 μl的Dulbecco’s PBS+1%胎牛血清(1% FBS-PBS)緩慢攪拌下室溫(RT)孵育30分鐘。然後將細胞用1% FBS-PBS洗兩次，並於50 μl含10 μg/ml PE偶聯的小鼠抗人IgG Fc抗體(Biolegend,409304)的1% FBS-PBS中孵育30分鐘。將細胞再洗兩次，重懸浮於1% FBS-PBS中，並進行流式細胞檢查。
在所述的結合分析中使用的BT-474細胞使用流式細胞儀(MoFlo XDP，Beckman Coulter)分析以檢測結合細胞的抗體(第16圖A和B部分)。使用(GraphPad Prism5)得到數值和圖表分析。測定的平均螢光強度繪製成抗體濃度的函數以通過單點結合(One Site Binding)(雙曲線)法測定Kd。結果顯示於第17圖中，第17圖中顯示在與Her2表現細胞結合方面MSBODY的親和力約為SMBODY的兩倍。
與SMBODY和多種單鏈抗體比較，MSBODY的熱穩定性通過熱挑戰分析測量。賀癌平、賀癌平單鏈、MSBODY和SSBODY稀釋至0.5mg/mL並於37℃至82℃之間的各種溫度等級(5℃等級)放置一小時。
Her2蛋白(2.5 μg/ml)於4℃孵育過夜然後用3% FBS處理2小時。用PBST洗3次之後，將抗體稀釋至1 nM並與Her2反應1小時。隨後，將抗人IgG Fc-HRP(1：10K)加入並於反應溫度放置半小時。然後將該樣品用PBST洗滌5次並用TMB染色，在OD450處讀數。第18圖顯示了熱挑戰曲線。Y軸溫度，T50，指示其中在熱挑戰之後仍有50%的抗體保留對於Her2的結合能力的溫度。該結合曲線標準化為100%最大結合。可看出MSBODY比SMBODY、SSBODY和賀癌平單鏈抗體保留了更高的熱穩定性，這接近於完整尺寸的賀癌平。該結果非常出乎意料，因為已知單鏈抗體是不穩定的。
測量MSBODY和SMBODY的抗體誘導的細胞毒性，使用人IgG作為對照。相對高水平地表現Her2蛋白的高Her2 BT-474細胞，和相對低水平地表現Her2蛋白的低Her2細胞例如MCF-7和MDA-MB-231，首先用5μM CFSE染色，然後與人PBMC(作用細胞)混合(E-T比：5：1)。將相同濃度的MSBODY、SMBODY和人IgG加入至該細胞培養物中。孵育48小時後，收集細胞並用1 μg/ml PI染色，使用流式細胞儀計數(MoFlo XDP，Beckman Coulter)。如果細胞被CFSE和PI雙重染色則被計為死細胞。以死細胞數量和細胞總量之間的比率計算細胞死亡率。以測量的細胞死亡率和自然細胞死亡率之間的差值來計算細胞毒性。結果顯示於第19圖中，第19圖中顯示MSBODY和SMBODY都產生相似的對於高Her BT474細胞的細胞毒性。然而，該MSBODY顯示了對於低Her2乳腺癌細胞系例如MCF-7和MDA-MB-231的顯著更高的細胞毒性。
實施例5 其它單價單鏈雙特異性抗體的製備
上述實施例顯示了製備和測試特異性單價單鏈雙特異性抗體(MSBODY)的方法，該雙特異性抗體包含對於Her2/neu有特異性的單價單元和對於CD3有特異性的單鏈單元。使用同樣的方法，可製備和使用其他的此種MSBODY，且每種都具有識別腫瘤細胞的單價單元和識別作用細胞的單鏈單元。
腫瘤形成率實驗-NOD/SCID小鼠皮下注射人胃癌細胞系NCI-N87(Her2高表現)和體外培養的T細胞，用或者不用MSBODY治療。NOD/SCID小鼠為5~6周齡；腫瘤細胞系為NCI-N87；腫瘤體積每3天測量一次，連續監測33天。實驗分成三組，每組5隻小鼠；組A，每隻小鼠僅皮下注射NCI-N87細胞(2X106)，腫瘤形成率為100%；組B，陰性對照，NCI-N87細胞(2X106)和T細胞(2X106)混合注射每隻細胞，且腫瘤形成率為100%；組C，實驗組，NCI-N87細胞(2X106)和抗Her2X抗CD3 MSBODY包被的T細胞(2X106)混合皮下注射小鼠，且腫瘤形成率為20%。結果顯示在第20圖，表示在體內人胃癌異種移植物模型中MSBODY有高抗腫瘤活性。
例如，一種MSBODY可包含具有抗體的經修飾的輕鏈和重鏈的單價單元，此種抗體例如利妥昔單抗(rituximab)，抗AC133抗體和西妥昔單抗(cetuximab)。利妥昔單抗序列的重鏈和輕鏈序列顯示於下表中。
13隻雌性NOD/SCID小鼠隨機分成A，B，C三組。組A有4隻小鼠，作為對照組，靜脈注射PBS；組B有4隻小鼠，作為陰性對照組，靜脈注射T細胞；組C有5隻小鼠，作為實驗組，靜脈注射抗CD20X抗CD3 MSBODY包被的T細胞。每3天測量一次所有小鼠的體重。第一天培養的Raji細胞(1X106/隻小鼠)通過尾部注射至小鼠；腫瘤細胞靜脈注射2天后，通過OKT3和IL2放大的T細胞(連續培養20天)分為兩部分，一部分(1.8X108個細胞)離心去除上清並重懸浮到2毫升1% FBS-PBS中，再加入抗CD20X抗CD3 MSBODY 225微克，室溫孵育30分鐘；另一部分(1.2X108個細胞)離心去除上清並重懸浮到10毫升1% FBS-PBS，作為對照組。孵育結束後，細胞離心去除上清並重懸浮到20毫升PBS中，計數並離心去除未結合的MSBODY；重懸浮兩部分T細胞於PBS中並將這些細胞注射到小鼠中(1.6X107個/隻小鼠)。注射後6天，通過OKT3和IL2放大的人的T細胞(連續培養24天)通過尾部注射到小鼠中(1.6X107個/隻小鼠)。注射後9天，通過OKT3和IL2放大的人的T細胞(連續培養24天)通過尾部注射到小鼠中(1.6X107個/隻小鼠)。注射後12天，通過OKT3和IL2放大的人的T細胞(連續培養24天)通過尾部注射到小鼠中(1.6X107個/隻小鼠)。注射後16天，通過OKT3和IL2放大的人的T細胞(連續培養24天)通過尾部注射到小鼠中(1.6X107個/隻小鼠)。結果顯示在第21A至21B圖中，表明抗CD20X抗CD3 MSBODY MSBODY和T細胞組合治療的小鼠體重沒有明顯降低並且中位生存率是不確定的(即5隻小鼠在第40天都存活)。
抗AC133抗體序列的重鏈和輕鏈序列顯示於下表中。
西妥昔單抗的重鏈和輕鏈顯示於下表中。
如上所述的每一條重鏈可被修飾以引入鹽橋和/或「杵」進入「臼」中。此種修飾的實施例顯示於表1~3中。
本發明不限於所描述的具體實施例的範圍內，這些具體實施例用作本發明的各個方面的單獨描述，並且任何在功能上等同的組合物和方法都在本發明的範圍內。對於本發明所述技術領域中具有通常知識者顯而易見的是，可以對本發明的方法和組合物進行各種修改和變化而不脫離本發明的精神或範圍。因此，應理解本發明覆蓋了本發明的修改和變體，只要它們在所附權利要求及其等同物的範圍內。
在本說明書中提到的所有出版物和專利申請在本文中均引用至此，其引用程度如同每個單獨的出版物或專利申請被具體地和單獨通過引用結合至此。
第1圖顯示了本發明的雙特異性抗體的一個實施例的結構。
第2圖顯示了第1圖雙特異性抗體的每條鏈的表現載體的構造。
第3圖為1%瓊脂凝膠電泳圖：泳道(lane)M：DL2000標記(marker)；泳道1：賀癌平(Herceptin)VH；泳道2：賀癌平VL；泳道3：人IgG1 CH區域(CH1+絞鏈+Fc)；泳道4：人IgCL。
第4圖為1%瓊脂凝膠電泳圖：泳道M：DL1000 DNA標記；泳道1：人源化的OKT3(HOKT3)VH-接頭；泳道2：接頭-HOKT3 VL。
第5圖為1%瓊脂凝膠電泳圖：泳道M：DL10000 DNA標記；泳道1：HOKT3單鏈。
第6~8圖為用於定點突變的質體的限制圖譜。
第9圖顯示了6%凝膠SDS-PAGE圖和西方墨點法(Western blot)圖。樣品為293F細胞上清液。泳道M：蛋白標記；泳道1：賀癌平mAb；泳道2：T366W修飾的HOKT3單鏈+Y407A修飾的賀癌平重鏈+賀癌平輕鏈；泳道3：T366W K392D和K409D修飾(TKK)的HOKT3單鏈+D356K D399K Y407A修飾(DDY)的賀癌平重鏈+賀癌平輕鏈；泳道4：K392D和K409D修飾(KK)的HOKT3單鏈+D356K D399K修飾(DD)的賀癌平重鏈+賀癌平輕鏈；泳道5：T366W K392D和K409D修飾(TKK)的HOKT3單鏈+L368R D399K Y407A修飾(LDY)的賀癌平重鏈+賀癌平輕鏈；泳道6：T366W K392D和K409D修飾(TKK)的HOKT3單鏈+D399K Y407A修飾(DY)的賀癌平重鏈+賀癌平輕鏈。
第10圖顯示了6%凝膠SDS-PAGE電泳，並用考馬斯亮藍(Coomassie Brilliant Blue)染色結果，該圖顯示：泳道M：蛋白標記物；泳道1：純化的MSBODY；泳道2：賀癌平；泳道3：HOKT3單鏈。
第11A及11B圖分別顯示了抗Her2X抗CD3MSBODY結合至BT474細胞(A)和週邊血單核細胞(PBMC)(B)的細胞表面結合的流式細胞分析，其中，灰線：PBS對照；黑實線：MSBODY；黑虛線：賀癌平。
第12圖包括四張顯示細胞聚集的顯微鏡圖片。
第13圖顯示抗體媒介的細胞毒性。
第14圖顯示不同效靶比之抗體媒介的細胞毒性。
第15A至15E圖顯示了實施例4中檢測的某些抗體的結構。A：MSBODY；B：SMBODY；C：SSBODY；D：賀癌平單鏈抗體；E：HOKT3單鏈抗體。
第16圖顯示了將抗Her2x抗CD3 MSBODY和SMBODY結合至BT474細胞(A)和PBMC細胞(B)的結合情況。
第17圖顯示了MSBODY比SMBODY對BT474細胞具有更高的結合活性。
第18圖顯示了熱挑戰分析(thermal challenge assay)的結果。
第19圖顯示了抗體媒介的對BT474、MCF-7和MDA-MB-231細胞的細胞毒性的結果。
第20圖顯示了抗Her2X抗CD3 MSBODY對有NCI-N87和T細胞的NOD/SCID小鼠的體內治療的結果。
第21A及21B圖顯示了抗CD20X抗CD3 MSBODY對人淋巴瘤raji細胞的異種移植物模型的體內治療的結果。
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Claims (26)

  1. 一種抗體，包含：(a)一單價單元，其由針對腫瘤細胞或微生物有特異性的輕鏈-重鏈對組成；和(b)一單鏈單元，其由融合胜肽組成，所述融合胜肽包含單鏈可變片段(scFv)和具有CH2結構域和CH3結構域的Fc片段，其中所述融合胜肽針對免疫細胞具有特異性。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之抗體，所述輕鏈-重鏈對針對腫瘤抗原具有特異性。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之抗體，所述腫瘤抗原選自：EGFR、Her2、EpCAM、CD20、CD30、CD33、CD47、CD52、CD133、CEA、gpA33、黏蛋白、TAG-72、CIX、PSMA、葉酸鹽結合蛋白、GD2、GD3、GM2、VEGF、VEGFR、整合素、αVβ3、α5β1、ERBB2、ERBB3、MET、IGF1R、EPHA3、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP和肌腱蛋白。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之抗體，所述輕鏈-重鏈對針對在腫瘤細胞上相對於對應的非腫瘤細胞過度表現的蛋白具有特異性。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之抗體，所述輕鏈-重鏈對針對病毒或者細菌具有特異性。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之抗體，所述輕鏈-重鏈對針對內毒素具有特異性。
  7. 如申請專利範圍第1~6項中任一項所述之抗體，所述免疫細胞選自T細胞、B細胞、單核細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞、樹突細胞、吞噬細胞、自然殺手細胞、嗜酸性粒細胞、嗜鹼性粒細胞和肥大細胞。
  8. 如申請專利範圍第1~7項中任一項所述之抗體，所述融合胜肽針對選自CD3、CD16、CD19、CD28和CD64的抗原具有特異性。
  9. 如申請專利範圍第1~8項中任一項所述之抗體，所述輕鏈通過雙硫鍵與所述重鏈結合。
  10. 如申請專利範圍第1~9項中任一項所述之抗體，所述重鏈通過一個或多個雙硫鍵與所述融合胜肽結合。
  11. 如申請專利範圍第1~10項中任一項所述之抗體，所述重鏈包含人或者人源化的Fc片段。
  12. 如申請專利範圍第11項所述之抗體，所述重鏈的Fc片段包含人IgG Fc片段。
  13. 如申請專利範圍第1~12項中任一項所述之抗體，所述融合胜肽的Fc片段包括人或者人源化的Fc片段。
  14. 如申請專利範圍第13項所述之抗體，所述融合胜肽的Fc片段包括人IgG Fc片段。
  15. 如申請專利範圍第1~14項中任一項所述之抗體，與野生型抗體片段相比，所述重鏈和/或所述融合胜肽的Fc片段包含一處或多處胺基酸取代基，所述取代基在所述重鏈和Fc片段之間形成離子鍵。
  16. 如申請專利範圍第15項所述之抗體，所述取代基選自表2。
  17. 如申請專利範圍第1~16項中任一項所述之抗體，與野生型抗體片段相比，所述重鏈和/或所述融合胜肽的Fc片段包含一處或多處取代基，所述取代基在所述重鏈和Fc片段之間形成杵-臼結構配對。
  18. 如申請專利範圍第17項所述之抗體，所述取代基選自表3。
  19. 如申請專利範圍第1~18項中任一項所述之抗體，所述抗體還包含可檢測的標籤。
  20. 如申請專利範圍第1~19項中任一項所述之抗體，所述CH2結構域位於所述scFv片段和CH3結構域之間。
  21. 如申請專利範圍第1~20項中任一項所述之抗體，所述融合胜肽不包含CH1結構域。
  22. 一種組合物，包含如申請專利範圍第1~21項中任一項所述之抗體和載體。
  23. 如申請專利範圍第22項所述之組合物，所述載體為藥物載體。
  24. 一種複合體，所述複合體包含如申請專利範圍第1~21項中任一項所述之抗體，所述抗體與一個或多個抗原結合。
  25. 一種抗體的製備方法，所述方法包括：將(a)由輕鏈-重鏈對組成的一單價單元和(b)由融合胜肽組成的一單鏈單元所混合，其中所述單價單元對針對免疫細胞具特異性，所述單鏈單元包含單鏈可變片段(scFv)和具有CH2結構域和CH3結構域的Fc片段且肽針對腫瘤細胞具有特異性。
  26. 一種利用如申請專利範圍第25項所述之方法製得的抗體。
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