JPWO2019244973A1 - 標的細胞に対する免疫反応を活性化する方法およびその組成物 - Google Patents

Abstract

一実施形態において、抗原提示細胞と標的細胞を架橋し得る、抗原提示細胞上の抗原と標的細胞上の抗原を認識する多重特異性抗原結合分子を提供する。

Description

本発明は、一態様において、抗原提示細胞と標的細胞を架橋させることにより抗原提示細胞による標的細胞の貪食作用（Phagocytosis）を誘導し得る多重特異性抗原結合分子に関する。例えば、本発明は、抗原提示細胞と標的細胞を架橋させることにより抗原提示細胞による標的細胞の貪食作用を誘導し得る二重特異性抗体に関する。
本発明はまた、そのような多重特異性抗原結合分子を含む、抗腫瘍免疫応答の誘導用組成物やがんの治療または予防用組成物にも関する。本発明はさらに、そのような多重特異性抗原結合分子を投与する工程を含む、がんの治療または予防方法にも関する。

抗体は高い親和性で特異的に抗原と結合するタンパク質である。低分子化合物からタンパク質まで様々な分子が抗原となることが知られている。モノクローナル抗体の作製技術が開発されて以降、抗体改変技術が発達し、特定の分子を認識する抗体の取得が容易となった。
抗体は、血漿中での安定性が高く副作用が少ないことから、医薬品として注目されている。抗体は、抗原に結合する作用、アゴニスト作用やアンタゴニスト作用だけでなく、ADCC（Antibody Dependent Cytotoxicity：抗体依存性細胞傷害活性）、ADCP（Antibody Dependent Cell phagocytosis：抗体依存性細胞貪食作用）、CDC（補体依存性細胞傷害活性）といったエフェクター細胞による細胞傷害活性（エフェクター機能とも言う）を誘導する。このような抗体の機能を利用して、がん、免疫疾患、慢性疾患、感染症等の医薬品が開発されている（Nat Rev Drug Discov. 2018 Mar;17(3):197-223.（非特許文献１））。

例えば、近年がん治療においては腫瘍免疫療法が非常に大きな注目を浴びており、その中でもPD-1/PD-L1やCTLA-4等を標的とするチェックポイント阻害抗体は臨床で広く使用されている（非特許文献２,３,４）。チェックポイント阻害剤は免疫細胞を活性化する事によって抗腫瘍効果を引き起こす。しかしながら、チェックポイント阻害剤の問題点として、自己反応性免疫細胞の活性化による副作用のリスクと有効な患者も限られている事が挙げられている。従って、より副作用が少なく免疫細胞の抗腫瘍効果を引き出すことのできる薬剤、またはチェックポイント阻害剤の効果を効率的に高めることが出来る薬剤の開発が強く求められている。

抗原提示細胞は貪食した抗原をプロセシングした後に自らの主要組織適合遺伝子複合体（MHC）に提示することで抗原反応性T細胞を活性化する。抗原反応性T細胞はチェックポイント阻害剤の薬効に重要であると考えられている（非特許文献５）。

樹状細胞は代表的な抗原提示細胞の一種であり、抗原反応性T細胞を効率よく活性化出来る。従って、腫瘍免疫療法においても非常に重要な役割を担っていると考えられている（非特許文献６）。

樹状細胞を標的とする腫瘍免疫療法の1つとして、体外で培養した樹状細胞にがん抗原を貪食させた後に体内に移入し、腫瘍反応性T細胞を活性化する方法があり、既に前立腺癌の治療として承認されている（非特許文献７）。しかしながら、この方法においては人工的に誘導する樹状細胞の培養条件、活性化条件、樹状細胞の移入経路等、樹状細胞本来の機能を最大限発揮させるために最適化しなければいけない条件が多く存在し、未だ十分な薬効は得られていない。そこで近年、他の試みとして、樹状細胞上の抗原を認識する抗体にがん抗原をコンジュゲートし、体内に自然な状態で存在している樹状細胞に貪食させるという試みも臨床で検討されている（非特許文献８）。しかしながら、この方法で活性化される反応性T細胞は、当該抗体にコンジュゲートした抗原に対応するT細胞のみであり、他のがん抗原に反応するT細胞は活性化出来ない事が示唆されている（非特許文献９）。

Carter PJ, Lazar GA. Nat Rev Drug Discov. 2018 Mar;17(3):197-223. Safety, Activity, and Immune Correlates of Anti-PD-1 Antibody in Cancer. N Engl J Med 2012; 366:2443-2454 Atezolizumab in patients with locally advanced and metastatic urothelial carcinoma who have progressed following treatment with platinum-based chemotherapy: a single-arm, multicentre, phase 2 trial. The LancetVolume 387, Issue 10031, 7-13 May 2016, Pages 1909-1920 Improved Survival with Ipilimumab in Patients with Metastatic Melanoma. N Engl J Med 2010; 363:711-723 PD-1 blockade induces responses by inhibiting adaptive immune resistance. Nature volume 515, pages 568-571 (27 November 2014) Cancer immunotherapy via dendritic cells. Nature Reviews Cancer volume 12, pages 265-277 (2012) Sipuleucel-T Immunotherapy for Castration-Resistant Prostate Cancer. July 29, 2010, N Engl J Med 2010; 363:411-422 Induction of Antigen-Specific Immunity with a Vaccine Targeting NY-ESO-1 to the Dendritic Cell Receptor DEC-205. Science Translational Medicine 16 Apr 2014:Vol. 6, Issue 232, pp. 232ra51 Pages 385-392 A Phase II Randomized Study of CDX-1401, a Dendritic Cell Targeting NY-ESO-1 Vaccine, in Patients with Malignant Melanoma Pre-Treated with Recombinant CDX-301, a Recombinant Human Flt3 Ligand. 2016 ASCO Annual Meeting, Abstract #:9589

一態様において、本発明は上記のような状況に鑑みてなされたものであり、樹状細胞等の抗原提示細胞を利用する新規の腫瘍免疫療法の提供を目的とする。

上記目的を達成するために鋭意研究した結果、本発明者らは、抗原提示細胞上の抗原と標的細胞上の抗原を認識する多重特異性抗原結合分子を用いて抗原提示細胞と標的細胞を架橋し、抗原提示細胞による標的細胞の貪食を促進できることを見出した。

本発明はこのような知見に基づくものであり、例示として、下記〔１〕〜〔２３〕の態様を提供するものである。
〔１〕抗原提示細胞上の第一の抗原に結合する第一の抗原結合ドメイン、および、標的細胞上の第二の抗原に結合する第二の抗原結合ドメインを含む、多重特異性抗原結合分子。
〔２〕前記標的細胞ががん細胞である、〔１〕に記載の多重特異性抗原結合分子。
〔２−１〕前記標的細胞が細菌である、〔１〕に記載の多重特異性抗原結合分子。
〔２−２〕前記標的細胞が、ウィルスなどが感染した細胞である、〔１〕に記載の多重特異性抗原結合分子。
〔３〕前記抗原提示細胞および前記標的細胞を前記多重特異性抗原結合分子を介して架橋することで前記抗原提示細胞による前記標的細胞の貪食作用（Phagocytosis）を誘導し得る、〔１〕または〔２〕に記載の多重特異性抗原結合分子。
〔３−１〕前記標的細胞が、破砕されていない標的細胞である、〔３〕に記載の多重特異性抗原結合分子。
〔４〕前記抗原提示細胞内に取り込まれた前記標的細胞に由来する複数種の抗原ペプチドが前記抗原提示細胞に提示される、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の多重特異性抗原結合分子。
〔５〕前記抗原提示細胞のMHCクラスIタンパク質に提示される前記標的細胞に由来する抗原ペプチドが、前記標的細胞上の第二の抗原とは異なる抗原または前記標的細胞上の第二の抗原に由来する、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の多重特異性抗原結合分子。
〔６〕前記抗原提示細胞が樹状細胞である、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の多重特異性抗原結合分子。
〔７〕前記樹状細胞にクロスプレゼンテーションを誘導し得る、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の多重特異性抗原結合分子。
〔８〕前記抗原提示細胞上の第一の抗原が、樹状細胞表面上の抗原であり、樹状細胞クロスプレゼンテーションを誘導し得る抗原である、
〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の多重特異性抗原結合分子。
〔９〕前記樹状細胞表面上の抗原が、Cタイプレクチン受容体またはインテグリン受容体である、〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の多重特異性抗原結合分子。
〔１０〕前記抗原提示細胞上の第一の抗原が、CLEC9A、DEC205およびCD207からなる群から選択される抗原である、〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の多重特異性抗原結合分子。
〔１１〕前記標的細胞上の第二の抗原が、GPC3、IL6R、およびEpCAMからなる群から選択される抗原である、〔１〕〜〔１０〕のいずれかに記載の多重特異性抗原結合分子。
〔１２〕前記抗原結合分子が抗体である、〔１〕〜〔１１〕のいずれかに記載の多重特異性抗原結合分子。
〔１３〕第一の抗原結合ドメインが、
（１）配列番号１４に示されるCDR1配列、配列番号１５に示されるCDR2配列、および配列番号１６に示されるCDR3配列を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号１８に示されるCDR1配列、配列番号１９に示されるCDR2配列、および配列番号２０に示されるCDR3配列を含む軽鎖可変領域；
（２）配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号２１に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；または
（３）配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖
を有し、
第二の抗原結合ドメインが、
（４）配列番号２２に示されるCDR1配列、配列番号２３に示されるCDR2配列、および配列番号２４に示されるCDR3配列を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号２６に示されるCDR1配列、配列番号２７に示されるCDR2配列、および配列番号２８に示されるCDR3配列を含む軽鎖可変領域；
（５）配列番号２５に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号２９に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；または
（６）配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖
を有する、〔１〕〜〔１２〕のいずれかに記載の多重特異性抗原結合分子。
〔１３−１〕第一の抗原結合ドメインが、
（１）配列番号１４に示されるCDR1配列、配列番号１５に示されるCDR2配列、および配列番号１６に示されるCDR3配列を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号１８に示されるCDR1配列、配列番号１９に示されるCDR2配列、および配列番号２０に示されるCDR3配列を含む軽鎖可変領域；
（２）配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号２１に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；または
（３）配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖
を有し、
第二の抗原結合ドメインが、
（４）配列番号５６に示されるCDR1配列、配列番号５７に示されるCDR2配列、および配列番号５８に示されるCDR3配列を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号６０に示されるCDR1配列、配列番号６１に示されるCDR2配列、および配列番号６３に示されるCDR3配列を含む軽鎖可変領域；
（５）配列番号５９に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号６３に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；または
（６）配列番号５４に示されるアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号５５に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖
を有する、〔１〕〜〔１２〕のいずれかに記載の多重特異性抗原結合分子。
〔１４〕第一の抗原結合ドメインが、
（１）配列番号３０に示されるCDR1配列、配列番号３１に示されるCDR2配列、および配列番号３２に示されるCDR3配列を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号３４に示されるCDR1配列、配列番号３５に示されるCDR2配列、および配列番号３６に示されるCDR3配列を含む軽鎖可変領域；
（２）配列番号３３に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号３７に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；または
（３）配列番号７に示されるアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖
を有し、
第二の抗原結合ドメインが、
（４）配列番号２２に示されるCDR1配列、配列番号２３に示されるCDR2配列、および配列番号２４に示されるCDR3配列を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号２６に示されるCDR1配列、配列番号２７に示されるCDR2配列、および配列番号２８に示されるCDR3配列を含む軽鎖可変領域；
（５）配列番号２５に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号２９に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；または
（６）配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖
を有する、〔１〕〜〔１２〕のいずれかに記載の多重特異性抗原結合分子。
〔１５〕前記多重特異性抗原結合分子が抗原提示細胞の活性化剤と併用されるか、または、抗原提示細胞の活性化剤とコンジュゲートされている、〔１〕〜〔１４〕のいずれかに記載の多重特異性抗原結合分子。
〔１６〕前記コンジュゲートされている活性化剤は、前記多重特異性抗原結合分子が有するFc領域またはFab領域にコンジュゲートされている、〔１０〕に記載の多重特異性抗原結合分子。
〔１７〕前記抗原提示細胞の活性化剤が、樹状細胞活性化剤またはT細胞活性化剤である、〔１５〕または〔１６〕に記載の多重特異性抗原結合分子。
〔１８〕前記樹状細胞活性化剤が、インターフェロンα（IFNα）、ポリI:C（poly-I:C）またはT細胞活性化剤である、〔１５〕または〔１６〕に記載の多重特異性抗原結合分子。
〔１９〕〔１〕〜〔１８〕のいずれかに記載の多重特異性抗原結合分子を含む、抗腫瘍免疫応答の誘導用組成物。
〔２０〕前記抗腫瘍免疫応答の誘導が細胞傷害性T細胞（Cytotoxic T Lymphocyte; CTL）の活性化である、〔１９〕に記載の組成物。
〔２１〕〔１〕〜〔１８〕のいずれかに記載の多重特異性抗原結合分子を含む、医薬組成物。
〔２２〕〔１〕〜〔１８〕のいずれかに記載の多重特異性抗原結合分子を含む、がんの治療または予防用組成物。
〔２３〕抗原提示細胞の活性化剤と同時または別々に併用するための、〔１〕〜〔１８〕のいずれかに記載の多重特異性抗原結合分子を含む組成物、又は、〔１９〕〜〔２２〕のいずれかに記載の組成物。

また本発明は、別の例示として、下記〔２４〕〜〔４１〕も提供する。
〔２４〕〔１〕〜〔１８〕のいずれかに記載の多重特異性抗原結合分子を用いて、抗原提示細胞を標的細胞に標的化する工程を含む、当該標的細胞に由来する抗原ペプチドを当該抗原提示細胞のMHCクラスIタンパクに提示させる方法。
〔２５〕〔１〕〜〔１８〕のいずれかに記載の多重特異性抗原結合分子を用いて、抗原提示細胞を標的細胞に標的化する工程を含む、当該標的細胞に由来する複数種の抗原ペプチドを当該抗原提示細胞に提示させる方法。
〔２６〕〔１〕〜〔１８〕のいずれかに記載の多重特異性抗原結合分子を用いて、抗原提示細胞をがん細胞に標的化する工程、および当該がん細胞に由来する抗原ペプチドを当該抗原提示細胞のMHCクラスIタンパクに提示させる工程を含む、がんに由来する抗原ペプチドをスクリーニングする方法。
〔２７〕前記がん細胞がヒトがん患者に由来する、〔２６〕に記載の方法。
〔２８〕〔２６〕または〔２７〕に記載のスクリーニング方法によって得られたペプチド。
〔２９〕〔２８〕に記載のペプチドを含むMHC/ペプチド複合体に対して、特異的な細胞傷害性T細胞を誘導するための、〔２８〕に記載のペプチドの使用。
〔３０〕〔１〕〜〔１８〕のいずれかに記載の多重特異性抗原結合分子のアミノ酸配列をコードする、単離された核酸。
〔３１〕〔３０〕に記載の核酸を含む、宿主細胞。
〔３２〕多重特異性抗原結合分子を製造する方法であって、多重特異性抗原結合分子が製造されるように〔３１〕に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、方法。
〔３３〕前記宿主細胞から前記多重特異性抗原結合分子を回収する工程をさらに含む、〔３２〕に記載の方法。
〔３４〕〔１〕〜〔１８〕のいずれかに記載の多重特異性抗原結合分子および薬学的に許容される担体を含む、薬学的製剤。
。
〔３５〕医薬品としての使用のための、〔１〕〜〔１８〕のいずれかに記載の多重特異性抗原結合分子。
〔３６〕がんの治療または予防における使用のための、〔１〕〜〔１８〕のいずれかに記載の多重特異性抗原結合分子。
〔３７〕細胞傷害性T細胞の活性化における使用のための、〔１〕〜〔１８〕に記載のいずれかに記載の多重特異性抗原結合分子。
〔３８〕がんの治療または予防のための医薬品の製造における、〔１〕〜〔１８〕のいずれかに記載の多重特異性抗原結合分子の使用。
〔３９〕細胞傷害性T細胞の活性化のための医薬品の製造における、〔１〕〜〔１８〕のいずれかに記載の多重特異性抗原結合分子の使用。
〔４０〕がんを治療または予防する方法であって、〔１〕〜〔１９〕のいずれかに記載の多重特異性抗原結合分子の有効量を該個体に投与する工程を含む、方法。
〔４１〕個体中で、細胞傷害性T細胞を活性化する方法であって、〔１〕〜〔１８〕のいずれかに記載の多重特異性抗原結合分子の有効量を該個体に投与する工程を含む、方法。

さらに本発明は、別の例示として、下記〔４２〕〜〔４５〕も提供する。
〔４２〕〔１〕〜〔１８〕のいずれかに記載の多重特異性抗原結合分子を有効成分として含む、抗腫瘍免疫応答誘導用の組成物（抗腫瘍免疫応答誘導用剤）、細胞傷害性T細胞活性化用の組成物（細胞傷害性T細胞活性化剤）、細胞障害誘導用の組成物（細胞障害誘導剤）、細胞増殖抑制用の組成物（細胞増殖抑制剤）、がん細胞もしくはがん細胞を含む腫瘍組織に対する免疫を活性化するための組成物（がん細胞もしくはがん細胞を含む腫瘍組織に対する免疫活性化剤）、がんを予防もしくは治療するための組成物（がんの予防もしくは治療剤）、がんを有する個体を治療するための組成物（がんを有する個体の治療剤）、またはがん細胞に由来する抗原ペプチドの抗原提示細胞のMHCクラスIタンパクへの提示の誘導用の組成物（がん細胞に由来する抗原ペプチドの抗原提示細胞のMHCクラスIタンパクへの提示の誘導剤）。
〔４３〕抗腫瘍免疫応答誘導用の組成物（抗腫瘍免疫応答誘導用剤）、細胞傷害性T細胞活性化用の組成物（細胞傷害性T細胞活性化剤）、細胞障害誘導用の組成物（細胞障害誘導剤）、細胞増殖抑制用の組成物（細胞増殖抑制剤）、がん細胞もしくはがん細胞を含む腫瘍組織に対する免疫を活性化するための組成物（がん細胞もしくはがん細胞を含む腫瘍組織に対する免疫活性化剤）、がんを予防もしくは治療するための組成物（がんの予防もしくは治療剤）、がんを有する個体を治療するための組成物（がんを有する個体の治療剤）、またはがん細胞に由来する抗原ペプチドの抗原提示細胞のMHCクラスIタンパクへの提示の誘導用の組成物（がん細胞に由来する抗原ペプチドの抗原提示細胞のMHCクラスIタンパクへの提示の誘導剤）を製造するための、〔１〕〜〔１８〕のいずれかに記載の多重特異性抗原結合分子の使用。
〔４４〕抗腫瘍免疫応答の誘導、細胞傷害性T細胞の活性化、細胞障害の誘導、細胞増殖の抑制、がん細胞もしくはがん細胞を含む腫瘍組織に対する免疫の活性化、がんの予防もしくは治療、がんを有する個体の治療、またはがん細胞に由来する抗原ペプチドの抗原提示細胞のMHCクラスIタンパクへの提示の誘導において使用するための、〔１〕〜〔１８〕のいずれかに記載の多重特異性抗原結合分子。
〔４５〕〔１〕〜〔１８〕のいずれかに記載の多重特異性抗原結合分子を投与する工程を含む、抗腫瘍免疫応答を誘導する方法、細胞傷害性T細胞を活性化する方法、細胞障害を誘導する方法、細胞増殖を抑制する方法、がん細胞もしくはがん細胞を含む腫瘍組織に対する免疫を活性化する方法、がんを予防もしくは治療する方法、がんを有する個体を治療する方法、またはがん細胞に由来する抗原ペプチドを抗原提示細胞のMHCクラスIタンパクに提示させる方法。

さらに本発明は、別の例示として、下記〔４６〕〜〔５３〕も提供する。
〔４６〕抗原提示細胞の活性化剤と併用することを特徴とする、〔４２〕に記載の組成物、〔４３〕に記載の使用、〔４４〕に記載の多重特異性抗原結合分子、または〔４５〕に記載の方法。
〔４７〕〔１〕〜〔１８〕のいずれかに記載の多重特異性抗原結合分子を含む、抗原提示細胞の活性化剤と併用するための医薬組成物。
〔４８〕抗原提示細胞の活性化剤を含む、〔１〕〜〔１８〕のいずれかに記載の多重特異性抗原結合分子と併用するための医薬組成物。
〔４９〕〔１〕〜〔１８〕のいずれかに記載の多重特異性抗原結合分子と抗原提示細胞の活性化剤とを含む、医薬組成物。
〔５０〕抗腫瘍免疫応答誘導用の組成物、細胞傷害性T細胞活性化用の組成物、細胞障害誘導用の組成物、細胞増殖抑制用の組成物、がん細胞もしくはがん細胞を含む腫瘍組織に対する免疫を活性化するための組成物、がんを予防もしくは治療するための組成物、がんを有する個体を治療するための組成物、またはがん細胞に由来する抗原ペプチドを抗原提示細胞のMHCクラスIタンパクに提示させるための組成物である、〔４７〕〜〔４９〕のいずれかに記載の医薬組成物。
〔５１〕〔１〕〜〔１８〕のいずれかに記載の多重特異性抗原結合分子と抗原提示細胞の活性化剤とを含む、キット。
〔５２〕前記抗原提示細胞の活性化剤が、インターフェロンα（IFNα）、ポリI:C（poly-I:C）またはT細胞活性化剤である、〔４７〕〜〔５０〕のいずれかに記載の医薬組成物または〔５１〕に記載のキット。
〔５３〕前記T細胞活性化剤が、T細胞とがん細胞を架橋することで細胞傷害活性を誘導する二重特異性抗体、またはT細胞を活性化する抗体もしくは薬剤である、〔５２〕に記載の医薬組成物またはキット。

一態様において、本発明の多重特異性抗原結合分子は、樹状細胞等の抗原提示細胞と標的細胞を架橋し、抗原提示細胞による標的細胞の貪食を促進することができる。
また一態様において、本発明の多重特異性抗原結合分子は、標的細胞に破砕操作を加えずそのまま抗原提示細胞に貪食させることで、標的細胞の細胞表面抗原のみならず、細胞内抗原も抗原提示細胞に提示されるので、結果として幅広いバリエーションの抗原を抗原提示細胞に提示することができる。

抗原提示細胞と標的細胞を架橋させる抗体の例を示す模式図である。図１（Ａ）は、二重特異性抗体によって抗原提示細胞と標的細胞を架橋し、標的細胞の貪食を促進させることを示している。図１（Ｂ）は、標的細胞を貪食した抗原提示細胞が様々な標的細胞由来抗原をMHCに提示し、標的細胞反応性エフェクター細胞を活性化することを示している。 抗原提示細胞による抗原提示効率を高める方法の例を示す模式図である。図２（Ａ）は、抗原提示細胞と標的細胞を架橋する二重特異性抗体と、抗原提示細胞の活性化因子とを併用する方法を示している。図２（Ｂ）は、抗原提示細胞と標的細胞を架橋する二重特異性抗体に抗原提示細胞の活性化因子をコンジュゲートする方法を示している。図２（Ｃ）は、抗原提示細胞と標的細胞を架橋する二重特異性抗体と、当該標的細胞に対する細胞傷害活性を誘導する抗体とを併用し、死細胞から放出される炎症性サイトカイン等が抗原提示細胞を活性化する方法を示している。図２（Ｄ）は、抗原提示細胞と標的細胞を架橋する二重特異性抗体に、エフェクター細胞を活性化する抗体フラグメントや薬剤をコンジュゲートし、死細胞から放出される炎症性サイトカイン等が抗原提示細胞を活性化する方法を示している。なお、図に示すコンジュゲート部位は一例であり、当該部位を限定するものではない。 樹状細胞におけるCLEC9A発現量をフローサイトメトリーにより評価した結果を示す図である。 CD103陽性または陰性の樹状細胞による標的がん細胞の貪食割合を示す図である。 CD103陽性または陰性の樹状細胞による標的がん細胞の貪食割合を示す図である。 実施例２で作製した二重特異性抗体およびpoly I:C（図６（Ａ））またはIFNα（図６（Ｂ））の存在下で標的細胞、樹状細胞、およびCD8⁺T細胞を共培養後、培養上清中のmIFNγ量を測定した結果を示す図である。 実施例２で作製した二重特異性抗体およびpoly I:Cを投与した腫瘍移植マウスにおける腫瘍径の経時変化を示す図である。 実施例２で作製した二重特異性抗体およびpoly I:Cの存在下で標的細胞と樹状細胞を共培養後、CD103陽性樹状細胞におけるCD40発現量をフローサイトメトリーにより評価した結果を示す図である。 実施例２で作製した二重特異性抗体および抗GPC3抗体と抗CD3抗体の二重特異性抗体（GPC3//CD3）の存在下で標的細胞、樹状細胞およびT細胞を共培養後、CD103陽性樹状細胞におけるCD40発現量をフローサイトメトリーにより評価した結果を示す図である。 CD103陽性または陰性の樹状細胞によるhEpCAMを発現した標的がん細胞の貪食割合を示す図である。 DEC205とGPC3に結合する二重特異性抗体およびpoly I:Cの存在下で標的細胞、樹状細胞、およびCD8⁺T細胞を共培養後、培養上清中のmIFNγ量を測定した結果を示す図である。 Clec9aとhEpCAMに結合する二重特異性抗体およびpoly I:Cの存在下で標的細胞、樹状細胞、およびCD8⁺T細胞を共培養後、培養上清中のmIFNγ量を測定した結果を示す図である。

以下の定義は、本明細書において説明する本発明の理解を容易にするために提供される。

本発明の一局面として、抗原提示細胞上の第一の抗原に結合する第一の抗原結合ドメイン、および、標的細胞上の第二の抗原に結合する第二の抗原結合ドメインを含む、多重特異性抗原結合分子を提供する。一態様において、当該多重特異性抗原結合分子は、樹状細胞等の抗原提示細胞と標的細胞を架橋し、抗原提示細胞による標的細胞の貪食を促進することができる。一態様において、当該抗原提示細胞は、貪食により取り込んだ標的細胞に由来する複数種の抗原ペプチドをT細胞に対して提示することができる。その結果、例えば、標的細胞に由来する複数種の腫瘍抗原を標的とするCD8⁺エフェクターT細胞（細胞傷害性T細胞）の活性化を誘導することができる。したがって、一態様において、前記多重特異性抗原結合分子を用いることによって、特定の（典型的には１種類の）腫瘍抗原を標的とする従来のがん免疫療法と比較して効力の高いがん治療法を提供することができる。また、特定の態様において、前記多重特異性抗原結合分子を投与した対象において抗腫瘍効果が誘導される。

抗原結合分子
本明細書において、用語「抗原結合分子」は抗原結合ドメインを含む分子を表す最も広義な意味として使用されており、具体的には、それらが抗原に対する結合活性を示す限り、様々な分子型が含まれる。例えば、抗原結合ドメインがFcRn結合ドメインと結合した分子の例として、抗体が挙げられる。抗体には、単一のモノクローナル抗体（アゴニストおよびアンタゴニスト抗体を含む）、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体等が含まれ得る。また抗体の断片として使用される場合としては、抗原結合ドメインおよび抗原結合断片（例えば、Fab、F(ab’)2、scFvおよびFv）が好適に挙げられ得る。既存の安定なα/βバレルタンパク質構造等の立体構造がスキャフォールド（scaffold；土台）として用いられ、その一部分の構造のみが抗原結合ドメインの構築のためにライブラリ化されたスキャフォールド分子も、本発明の抗原結合分子に含まれ得る。
本明細書において、「抗原結合ドメイン」は目的とする抗原に結合するかぎりどのような構造のドメインも使用され得る。そのようなドメインの例として、例えば、抗体の重鎖および軽鎖の可変領域、生体内に存在する細胞膜タンパクであるAvimerに含まれる35アミノ酸程度のAドメインと呼ばれるモジュール（WO2004044011、WO2005040229）、細胞膜に発現する糖タンパク質であるフィブロネクチン（fibronectin）中のタンパク質に結合するドメインである10Fn3ドメインを含むAdnectin（WO2002032925）、ProteinAの58アミノ酸からなる3つのヘリックスの束（bundle）を構成するIgG結合ドメインをスキャフォールドとするAffibody（WO1995001937）、33アミノ酸残基を含むターンと2つの逆並行ヘリックスおよびループのサブユニットが繰り返し積み重なった構造を有するアンキリン反復（ankyrin repeat：AR）の分子表面に露出する領域であるDARPins（Designed Ankyrin Repeat proteins）（WO2002020565）、好中球ゲラチナーゼ結合リポカリン（neutrophil gelatinase-associated lipocalin（NGAL））等のリポカリン分子において高度に保存された8つの逆並行ストランドが中央方向にねじれたバレル構造の片側を支える4つのループ領域であるAnticalin等（WO2003029462）、ヤツメウナギ、ヌタウナギなど無顎類の獲得免疫システムとしてイムノグロブリンの構造を有さない可変性リンパ球受容体（variable lymphocyte receptor（VLR））のロイシン残基に富んだリピート（leucine-rich-repeat（LRR））モジュールが繰り返し積み重なった馬てい形の構造の内部の並行型シート構造のくぼんだ領域（WO2008016854）が好適に挙げられる。本発明の抗原結合ドメインの好適な例として、抗体の重鎖および軽鎖の可変領域を含む抗原結合ドメインが挙げられる。
本発明における「抗原結合分子」とは、本発明の「抗原結合ドメイン」を含む分子であれば特に限定されず、さらに、５アミノ酸程度以上の長さを有するペプチドやタンパク質が含まれていてもよい。生物由来のペプチドやタンパク質に限定されず、例えば、人工的に設計された配列からなるポリペプチドであってもよい。また、天然ポリペプチド、あるいは合成ポリペプチド、組換えポリペプチド等のいずれであってもよい。

本発明の抗原結合分子の好ましい例として、抗体のFc領域に含まれるFcRn結合ドメインを含む抗原結合分子を挙げることができる。生体内に投与されたタンパク質の血中半減期を延ばす方法として、目的タンパク質に抗体のFcRn結合ドメインを付加し、FcRnを介したリサイクリング機能を利用する方法が良く知られている。

本発明のFcRn結合ドメインとしては、特にFcγ受容体に対する結合活性が低下しているドメインであっても、あるいは向上しているものであってもいずれでもよい。ここで、Fcγ受容体（本明細書ではFcγレセプター、FcγRまたはFcgRと記載することがある）とは、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4のFc領域に結合し得る受容体をいい、実質的にFcγレセプター遺伝子にコードされるタンパク質のファミリーのいかなるメンバーをも意味する。ヒトでは、このファミリーには、アイソフォームFcγRIa、FcγRIbおよびFcγRIcを含むFcγRI（CD64）；アイソフォームFcγRIIa（アロタイプH131（H型）およびR131（R型）を含む）、FcγRIIb（FcγRIIb-1およびFcγRIIb-2を含む）およびFcγRIIcを含むFcγRII（CD32）；およびアイソフォームFcγRIIIa（アロタイプV158およびF158を含む）およびFcγRIIIb（アロタイプFcγRIIIb-NA1およびFcγRIIIb-NA2を含む）を含むFcγRIII（CD16）、並びにいかなる未発見のヒトFcγR類またはFcγRアイソフォームまたはアロタイプも含まれるが、これらに限定されるものではない。FcγRは、ヒト、マウス、ラット、ウサギおよびサル由来のものが含まれるが、これらに限定されず、いかなる生物由来でもよい。マウスFcγR類には、FcγRI（CD64）、FcγRII（CD32）、FcγRIII（CD16）およびFcγRIII-2（CD16-2）、並びにいかなる未発見のマウスFcγR類またはFcγRアイソフォームまたはアロタイプも含まれるが、これらに限定されない。こうしたFcγ受容体の好適な例としてはヒトFcγRI（CD64）、FcγRIIa（CD32）、FcγRIIb（CD32）、FcγRIIIa（CD16）及び／又はFcγRIIIb（CD16）が挙げられる。

Fcγ受容体に対する結合活性が低下しているかどうかは、FACS、ELISAフォーマット、ALPHAスクリーン(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)や表面プラズモン共鳴(SPR)現象を利用したBIACORE法等、周知の方法によって確認することができる(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010)。

本発明の多重特異性抗原結合分子に含まれる「抗原提示細胞上の第一の抗原に結合する第一の抗原結合ドメイン」および「標的細胞上の第二の抗原に結合する第二の抗原結合ドメイン」(以下、これらの結合ドメインをまとめて抗原結合ドメインという)は、それぞれの抗原である、抗原提示細胞上の第一の抗原、または、標的細胞上の第二の抗原に特異的に結合する領域を意味し、例えば、抗体の抗原結合領域を含む領域が結合ドメインとして挙げられる。なお、本発明の多重性抗原結合分子が結合する抗原提示細胞上の第一の抗原と、標的細胞上の第二の抗原とを選択する際には、これらが互いに異なる抗原となるよう選択される。抗原の分子量が大きい場合、抗体の抗原結合領域は抗原の特定部分にのみ結合することができる。当該特定部分はエピトープと呼ばれる。抗原結合ドメインは一または複数の抗体の可変ドメインより提供され得る。好ましい一実施形態において、抗原結合ドメインは抗体軽鎖可変領域（VL）と抗体重鎖可変領域（VH）とを含む。

本発明の「抗原結合分子」は、単一のポリペプチド鎖内に、本発明の「抗体の可変領域」を形成する重鎖および軽鎖の両方を含むが、定常領域を欠いている抗体断片であってもよい。そのような抗体断片としては、例えば、Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2；ダイアボディ；線状抗体；単鎖抗体分子（例えば、scFv（single chain Fv）、sc(Fv)₂、sc(Fab')₂）；シングルドメイン抗体（例えば、VHH、VH、VL）であってもよい。

「多重特異性」抗原結合分子は、それぞれ異なるエピトープを特異的に認識する２つ以上の可変領域を同一分子内に有する抗原結合分子をいう。本発明の多重特異性抗原結合分子の好ましい例として、それぞれ異なるエピトープを特異的に認識する２つの可変領域を同一分子内に有する抗原結合分子を挙げることができる。

本発明において「特異的に結合する」とは、特異的に結合する分子の一方の分子がその一または複数の結合する相手方の分子以外の分子に対しては何ら有意な結合を示さない状態で結合することをいう。また、抗原結合ドメインが、ある抗原中に含まれる複数のエピトープのうち特定のエピトープに対して特異的である場合にも用いられる。また、抗原結合ドメインが結合するエピトープが複数の異なる抗原に含まれる場合には、当該抗原結合ドメインを有する抗原結合分子は当該エピトープを含む様々な抗原と結合することができる。

本発明の多重特異性抗原結合分子中の「抗原提示細胞上の第一の抗原に結合する第一の抗原結合ドメイン」に含まれる重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、標的とする「抗原提示細胞上の第一の抗原」に応じて、当業者が該抗原に結合する重鎖可変領域および軽鎖可変領域を適宜選択することができる。同様に、本発明の多重特異性抗原結合分子中の「標的細胞上の第二の抗原に結合する第二の抗原結合ドメイン」に含まれる重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、標的とする「標的細胞上の第二の抗原」に応じて、当業者が該抗原に結合する重鎖可変領域および軽鎖可変領域を適宜選択することができる。
本発明の多重特異性抗原結合分子中の「抗原提示細胞上の第一の抗原に結合する第一の抗原結合ドメイン」の例として、
（１）配列番号１４に示されるCDR1配列、配列番号１５に示されるCDR2配列、および配列番号１６に示されるCDR3配列を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号１８に示されるCDR1配列、配列番号１９に示されるCDR2配列、および配列番号２０に示されるCDR3配列を含む軽鎖可変領域；
（２）配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号２１に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；または
（３）配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖
を有するCLEC9A結合ドメイン、ならびに
（１’）配列番号３０に示されるCDR1配列、配列番号３１に示されるCDR2配列、および配列番号３２に示されるCDR3配列を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号３４に示されるCDR1配列、配列番号３５に示されるCDR2配列、および配列番号３６に示されるCDR3配列を含む軽鎖可変領域；
（２’）配列番号３３に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号３７に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；または
（３’）配列番号７に示されるアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖
を有するDEC205結合ドメインを挙げることができるが、これらに限定されない。
本発明の多重特異性抗原結合分子中の「標的細胞上の第二の抗原に結合する第二の抗原結合ドメイン」の例として、
（４）配列番号２２に示されるCDR1配列、配列番号２３に示されるCDR2配列、および配列番号２４に示されるCDR3配列を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号２６に示されるCDR1配列、配列番号２７に示されるCDR2配列、および配列番号２８に示されるCDR3配列を含む軽鎖可変領域；
（５）配列番号２５に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号２９に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；または
（６）配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖
を有するGPC3結合ドメイン、ならびに
（４’）配列番号２２に示されるCDR1配列、配列番号２３に示されるCDR2配列、および配列番号２４に示されるCDR3配列を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号２６に示されるCDR1配列、配列番号２７に示されるCDR2配列、および配列番号２８に示されるCDR3配列を含む軽鎖可変領域；
（５’）配列番号２５に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号２９に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；または
（６’）配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖
を有するEpCAM結合ドメインを挙げることができるが、これらに限定されない。

本明細書において記載される抗原結合分子における各種結合ドメインを作製するために用いられる抗体の可変領域は、通常、４つのフレームワーク領域（FR）にはさまれた３つの相補性決定領域（complementarity-determining region ; CDR）で構成されている。CDRは、実質的に、抗体の結合特異性を決定している領域である。CDRのアミノ酸配列は多様性に富む。一方FRを構成するアミノ酸配列は、異なる結合特異性を有する抗体の間でも、高い同一性を示すことが多い。そのため、一般に、CDRの移植によって、ある抗体の結合特異性を、他の抗体に移植することができるとされている。

本明細書において、「抗原提示細胞上の第一の抗原」は、好ましくは抗原提示細胞の細胞表面に特異的に発現する抗原であってもよく、例えば樹状細胞に特異的に発現する抗原であり、一態様においては、クロスプレゼンテーションを担う樹状細胞サブセットにおいて特異的に発現する抗原である。樹状細胞上の抗原としては、例えば、CD1a, CD1c, CD11b, CD11c, FcεR1, CD141, XCR1, IgE, CD14, CD163, CD123, BDCA-2, ChemR23, Clec9a, CD206, CD207, CD209があり（Front Immunol. 2014 Apr 1;5:131）、また、樹状細胞上の抗原のうち、Cタイプレクチン受容体に分類されるものとして、DEC205, Dectin-1, Dectin-2, Mincle, CD206, CD207 (Langerin), CD209 (DC-SIGN), Clec9a (DNGR1), Clec10a (CD301, MGL) , Clec12aが挙げられるが（J Leukoc Biol. 2017 Oct;102(4): 1017-1034）、樹状細胞上の抗原は必ずしもこれらに限定されるものではない。

本明細書において、「標的細胞上の第二の抗原」は、好ましくは標的細胞の表面に特異的に発現する抗原であってもよい。本明細書において、「標的細胞」は、抗原提示細胞に貪食され、クロスプレゼンテーションされる細胞であれば特に限定はなく、例示として、がん細胞、細菌、およびウィルスなどが感染した細胞が挙げられる。標的細胞上の抗原の非限定的な例としての「がん特異的抗原」は、がん細胞と健常細胞を区別することを可能とする、がん細胞が発現する抗原を意味し、例えば、細胞の悪性化に伴って発現する抗原、細胞が、がん化した際に細胞表面やタンパク質分子上に現れる異常な糖鎖が含まれる。具体的には、例えば、ALK受容体（プレイオトロフィン受容体）、プレイオトロフィン、KS 1/4膵臓癌抗原、卵巣癌抗原（CA125）、前立腺酸リン酸、前立腺特異的抗原（PSA）、メラノーマ関連抗原p97、メラノーマ抗原gp75、高分子量メラノーマ抗原（HMW-MAA）、前立腺特異的膜抗原、癌性胚抗原(CEA)、多型上皮ムチン抗原、ヒト乳脂肪球抗原、CEA、TAG-72、CO17-1A、GICA 19-9、CTA-1およびLEAなどの結腸直腸腫瘍関連抗原、バーキットリンパ腫抗原-38.13、CD19、ヒトBリンパ腫抗原-CD20、CD33、ガングリオシドGD2、ガングリオシドGD3、ガングリオシドGM2およびガングリオシドGM3などのメラノーマ特異的抗原、腫瘍特異的移植型細胞表面抗原（TSTA）、T抗原、DNA腫瘍ウイルスおよびRNA腫瘍ウイルスのエンベロープ抗原などのウイルスにより誘導される腫瘍抗原、結腸のCEA、5T4癌胎児トロホブラスト糖タンパク質および膀胱腫瘍癌胎児抗原などの癌胎児抗原α-フェトプロテイン、ヒト肺癌抗原L6およびL20などの分化抗原、線維肉腫の抗原、ヒト白血病T細胞抗原-Gp37、新生糖タンパク質、スフィンゴ脂質、EGFR（上皮増殖因子受容体）などの乳癌抗原、NY-BR-16、NY-BR-16およびHER2抗原（p185HER2）、多型上皮ムチン（PEM）、悪性ヒトリンパ球抗原-APO-1、胎児赤血球に認められるI抗原などの分化抗原、成人赤血球に認められる初期内胚葉I抗原、移植前の胚、胃癌に認められるI（Ma）、乳腺上皮に認められるM18、M39、骨髄細胞に認められるSSEA-1、VEP8、VEP9、Myl、VIM-D5、結腸直腸癌に認められるD156-22、TRA-1-85（血液群H）、精巣および卵巣癌に認められるSCP-1、結腸癌に認められるC14、肺癌に認められるF3、胃癌に認められるAH6、Yハプテン、胚性癌細胞に認められるLey、TL5（血液群A）、A431細胞に認められるEGF受容体、膵臓癌に認められるE1シリーズ（血液群B）、胚性癌細胞に認められるFC10.2、胃癌抗原、腺癌に認められるCO-514（血液群Lea）、腺癌に認められるNS-10、CO-43（血液群Leb）、A431細胞のEGF受容体に認められるG49、結腸癌に認められるMH2（血液群ALeb/Ley）、結腸癌に認められる19.9、胃癌ムチン、骨髄細胞に認められるT5A7、メラノーマに認められるR24、胚性癌細胞に認められる4.2、GD3、D1.1、OFA-1、GM2、OFA-2、GD2、およびM1:22:25:8ならびに4〜8細胞段階の胚に認められるSSEA-3およびSSEA-4、皮下T細胞リンパ腫抗原、MART-1抗原、シアリルTn(STn)抗原、結腸癌抗原NY-CO-45、肺癌抗原NY-LU-12変異体A、腺癌抗原ART1、腫瘍随伴性関連脳-精巣癌抗原(癌神経抗原MA2、腫瘍随伴性神経抗原)、神経癌腹部抗原2（NOVA2）、血液細胞癌抗原遺伝子520、腫瘍関連抗原CO-029、腫瘍関連抗原MAGE-C1（癌／精巣抗原CT7）、MAGE-B1（MAGE-XP抗原）、MAGE-B2（DAM6）、MAGE-2、MAGE-4a、MAGE-4bおよびMAGE-X2、癌-精巣抗原（NY-EOS-1）、YKL-40および上記ポリペプチドのいずれかの断片またはこれらに対して修飾された構造等（前記の修飾リン酸基や糖鎖等）、EpCAM、EREG、CA19-9、CA15-3、シリアルSSEA-1(SLX)、HER2、PSMA、CEA、CLEC12A等が挙げられる。本発明の多重特異性抗原結合分子に含まれる第二の抗原結合ドメインの結合対象となるがん特異的抗原としては、特に、細胞表面に発現するものが好ましく、そのようながん特異的抗原としては、例えば、GPC3、IL6R、CD19、CD20、EGFR、HER2、EpCAM、EREGがあげられる。

本発明の「抗原結合分子」の好ましい態様の１つとして、本発明の抗体の可変領域を含む、抗体を挙げることができる。

抗体
本明細書において、抗体とは、天然のものであるかまたは部分的もしくは完全合成により製造された免疫グロブリンをいう。抗体はそれが天然に存在する血漿や血清等の天然資源や抗体を産生するハイブリドーマ細胞の培養上清から単離され得るし、または遺伝子組換え等の手法を用いることによって部分的にもしくは完全に合成され得る。抗体の例としては免疫グロブリンのアイソタイプおよびそれらのアイソタイプのサブクラスが好適に挙げられる。ヒトの免疫グロブリンとして、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgMの9種類のクラス（アイソタイプ）が知られている。本発明の抗体には、これらのアイソタイプのうちIgG1、IgG2、IgG3、IgG4が含まれ得る。

所望の結合活性を有する抗体を作製する方法は当業者において公知であり、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体として取得され得る。本発明の抗体としては、哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好適に作製され得る。哺乳動物由来のモノクローナル抗体には、ハイブリドーマにより産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主細胞によって産生されるもの等が含まれる。

抗体としては、遺伝子組換え技術を用いて産生した組換え型抗体を用いることができる。組換え型抗体は、それをコードするDNAをハイブリドーマ、または抗体を産生する感作リンパ球等の抗体産生細胞からクローニングし、ベクターに組み込んで、これを宿主（宿主細胞）に導入し産生させることにより得ることができる。

二重特異性抗体はIgGタイプのものに限られないが、例えばIgGタイプ二重特異性抗体はIgG抗体を産生するハイブリドーマ二種を融合することによって生じるhybrid hybridoma(quadroma)によって分泌させることが出来る（Milstein C et al. Nature 1983, 305: 537-540）。また目的の二種のIgGを構成するL鎖およびH鎖の遺伝子、合計4種の遺伝子を細胞に導入することによって共発現させることによって分泌させることが出来る。

本発明の抗体は当業者に公知の方法により製造することができる。具体的には、目的とする抗体をコードするDNAを発現ベクターへ組み込む。その際、発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる。その際には、適当な宿主と発現ベクターの組み合わせを使用することができる。

これにより得られた本発明の抗体は、宿主細胞内または細胞外（培地など）から単離し、実質的に純粋で均一な抗体として精製することができる。抗体の分離、精製は、通常の抗体の精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせれば抗体を分離、精製することができる。

本発明の多重特異性抗原結合分子の好ましい態様の１つとして、多重特異性抗体を挙げることができる。本発明の多重特異性抗体としては、特に二重特異性抗体が好ましい。

多重特異性抗体の会合化には、抗体H鎖の第二の定常領域（CH2）又はH鎖の第三の定常領域（CH3）の界面に電荷的な反発を導入して目的としないH鎖同士の会合を抑制する技術を適用することができる（WO2006/106905）。

また、本発明の多重特異性抗体の会合化には更に他の公知技術を用いることもできる。抗体の一方のH鎖の可変領域に存在するアミノ酸側鎖をより大きい側鎖(knob; 突起)に置換し、もう一方のH鎖の相対する可変領域に存在するアミノ酸側鎖をより小さい側鎖(hole; 空隙)に置換することによって、突起が空隙に配置され得るようにすることで効率的にFc領域を有する異なるアミノ酸を有するポリペプチド同士の会合化を起こすことができる（WO1996/027011、Ridgway JB et al., Protein Engineering (1996) 9, 617-621、Merchant AM et al. Nature Biotechnology (1998) 16, 677-681、US20130336973）。

これに加えて、本発明の多重特異性抗体の形成には更に他の公知技術を用いることもできる。抗体の一方のH鎖のCH3の一部をその部分に対応するIgA由来の配列にし、もう一方のH鎖のCH3の相補的な部分にその部分に対応するIgA由来の配列を導入したstrand-exchange engineered domain CH3を用いることで、異なる配列を有するポリペプチドの会合化をCH3の相補的な会合化によって効率的に引き起こすことができる (Protein Engineering Design & Selection, 23; 195-202, 2010)。この公知技術を使っても効率的に目的の多重特異性抗体の形成させることができる。

また、効率的に目的の多重特異性抗体を形成させることができない場合であっても、産生された抗体の中から目的の多重特異性抗体を分離、精製することによっても、本発明の多重特異性抗体を得ることが可能である。例えば、2種類のH鎖の可変領域にアミノ酸置換を導入し等電点の差を付与することで、2種類のホモ体と目的のヘテロ抗体をイオン交換クロマトグラフィーで精製可能にする方法が報告されている（WO2007114325）。また、ヘテロ体を精製する方法として、これまでに、プロテインAに結合するマウスIgG2aのH鎖とプロテインAに結合しないラットIgG2bのH鎖からなるヘテロ二量化抗体をプロテインAを用いて精製する方法が報告されている(WO98050431、WO95033844)。更に、IgGとProteinAの結合部位であるEUナンバリング435番目および436番目のアミノ酸残基を、Tyr、HisなどのProteinAへの結合力の異なるアミノ酸に置換したH鎖を用いることで、各H鎖とProtein Aとの相互作用を変化させ、Protein Aカラムを用いることで、ヘテロ二量化抗体のみを効率的に精製することもできる。

また、異なる複数のH鎖に結合能を与え得る共通のL鎖を取得し、多重特異性抗体の共通L鎖として用いてもよい。このような共通L鎖と異なる複数のH鎖遺伝子を細胞に導入することによってIgGを発現させることで効率の良い多重特異性IgGの発現が可能となる（Nature Biotechnology (1998) 16, 677-681）。共通H鎖を選択する際に、任意の異なるH鎖に対応し高い結合能を示す共通Ｌ鎖を選択する方法も利用することができる（WO2004/065611）。

これらの技術を複数、例えば2個以上組合せて用いることもできる。また、これらの技術は、会合させたい２つのH鎖に適宜別々に適用させることもできる。なお、本発明の抗原結合分子は、上記改変が加えられたものをベースにして、同一のアミノ酸配列を有する抗原結合分子を別途作製したものであってもよい。

本発明の多重特異性抗原結合分子は、抗原提示細胞上の第一の抗原に結合する第一の抗原結合ドメインと、標的細胞上の第二の抗原に結合する第二の抗原結合ドメインとを含むことから、本発明の多重特異性抗原結合分子を介して抗原提示細胞と標的細胞が架橋される。具体的には、本発明の多重特異性抗原結合分子が、抗原提示細胞上の抗原と、標的細胞上のがん抗原に同時に結合することにより、抗原提示細胞を標的細胞に接近させる（抗原提示細胞を標的細胞に動員する、引き寄せる、標的化する等と表現することもできる）。その結果、抗原提示細胞による標的細胞の貪食作用（Phagocytosis）が誘導されうる。貪食作用（Phagocytosis）の検出/測定方法としては、標識した細胞を樹状細胞に貪食させ、その標識をフローサイトメトリーで検出/測定する、顕微鏡などでイメージング検出/測定する、あるいはレポーターアッセイで検出/測定する方法等がある。
「破砕されていない」細胞とは、細胞が細片（debris）になっていないことを指す。細胞が細片になる例として、がん細胞の細胞死が挙げられる。細胞死は、その形態学的特徴および生化学的特徴などからネクローシスとアポトーシスに大別される。アポトーシスを起こした細胞は縮小し、アポトーシス小体と呼ばれる細胞断片を形成した後、生体内で食細胞によって貪食除去される。一方で、ネクローシスは細胞が膨張し、最終的に細胞内容物が細胞外に漏出することで周辺細胞に炎症を惹起する。アポトーシスおよびネクローシスは、いずれもがん細胞が抗がん剤や放射線治療によって、がん細胞が消失するメカニズムとされている（YAKUGAKU ZASSHI 137(11) 1315―1321 (2017)）。
細胞を破砕する一般的な方法としては、超音波処理、界面活性剤の使用、浸透圧ショック法、ホモジナイザーによる粉砕、ガラスビーズによる粉砕などが知られている（上記方法は、例えば下記ウエブサイトに例示されている：https://www.gelifesciences.co.jp/technologies/protein_preparation/lysis.html）。
好ましい一態様として、貪食させる標的細胞は破砕されていない、細胞として数をカウントすることができる細胞を、抗原提示細胞に貪食させることが望ましい。破砕されていない標的細胞をそのまま抗原提示細胞に貪食させることで、標的細胞が有する抗原は、その細胞表面抗原のみならず、その細胞内抗原に至るまで、幅広いバリエーションの抗原が抗原提示細胞に提示させることができる。
抗原提示細胞内に取り込まれた標的細胞に由来する複数種の抗原がプロセシングされ、生成された抗原ペプチドが抗原提示細胞により提示される。（epitope spreading）。これらの抗原ペプチドは、MHCクラスII分子との複合体として提示されてCD4⁺ T細胞を活性化する他、MHCクラスI分子との複合体として提示（クロスプレゼンテーション）されてCD8⁺ T細胞を活性化することができる。抗原提示細胞のMHC分子に提示された標的細胞由来の抗原ペプチドを検出/同定/測定する方法としては、任意のペプチド抗原-MHC複合体反応性TCRを有するT細胞を抗原提示細胞が活性化出来るかを評価する方法（例えば、本明細書の実施例の項に記載のOT-Iマウス（OVA反応性T細胞を持つ）を用いた系）、任意の抗原ペプチド-MHC複合体を特異的に認識する抗体を用いてFACSで検出/測定する方法、MHCに提示されている抗原ペプチドをMSで直接検出/測定する方法等がある。T細胞活性化の検出/測定方法としては、活性化した際に放出されるサイトカインをELISAやFACSで検出/測定する方法、活性化マーカーをFACSで検出/測定する方法、細胞数の増加を検出/測定する方法等がある。
こうして活性化されたT細胞は、抗原提示細胞により提示された抗原ペプチドに特異的なT細胞である。本発明の多重特異性抗原結合分子を用いることにより、標的細胞に由来する複数種の抗原ペプチドが抗原提示細胞において提示されることから、複数種のがん抗原ペプチドを標的とするT細胞の活性化が誘導され得る。当該複数種のがん抗原ペプチドには、標的細胞上の第二の抗原とは異なる抗原に由来するものも含まれる。
このような機能を担う抗原提示細胞の好適な例として、樹状細胞を挙げることができる。

樹状細胞は、自然免疫と獲得免疫の双方において、抗腫瘍免疫に重要な役割を担うことが知られている（Nature Reviews Cancer 4, 11-22 (January 2004)）。自然免疫（Innate immunity）では、樹状細胞は、アポトーシスを起こしたがん細胞を貪食して取り込み、分解する役割を担う（貪食作用：Phagocytosis）。獲得免疫（Adaptive immunity）では、樹状細胞は、細胞内に取り込んだがん細胞に由来する抗原ペプチドを主要組織適合抗原（MHC）上に提示し、それぞれに特異的に結合するT細胞受容体（TCR）を有するナイーブT細胞を活性化し、活性化したナイーブT細胞は細胞傷害性T細胞（CTL）やヘルパーT細胞等に分化して抗腫瘍免疫応答を引き起こす。（Nature Reviews Immunology volume 1, pages 126-134 (2001)）。抗腫瘍免疫応答とは、癌細胞に対する自然免疫と獲得免疫からなる免疫応答であるが、特に細胞傷害性T細胞は抗腫瘍免疫応答の中心を担っていると考えられている。

クロスプレゼンテーションとは、他の細胞に由来する抗原を取り込んでプロセシングしたペプチド（抗原ペプチド）をMHCクラスIタンパク質との複合体としてCD8⁺ 細胞傷害性T細胞に対して提示することをいう。クロスプレゼンテーションの測定方法としては、抗原提示細胞上の抗原ペプチドMHCIをフローサイトメトリーやマスサイトメトリーで認識する方法や、任意の抗原ペプチドMHCI反応性CD8⁺細胞傷害性T細胞とその抗原を提示した抗原提示細胞を共培養することにより、CD8⁺T細胞の活性化を測定する方法等がある。CD8⁺T細胞の活性化測定方法としては、活性化した際に放出されるIFNgやグランザイムB、パーフォリン等をELISA法、ELISpotアッセイ、フローサイトメトリー等で測定する方法や、T細胞上の活性化マーカー（CD25,CD69等、Clin Chim Acta. 2012 Sep 8;413(17-18):1338-49）をフローサイトメトリーで測定する方法、T細胞の増殖能変化を測定する方法等がある。クロスプレゼンテーションと当該T細胞を活性化させる（クロスプライミング）する役割は、樹状細胞の特定のサブセットが担うことが知られている。クロスプレゼンテーションを担う樹状細胞のマーカーとしては、CLEC9A（C-type lectin 9A）、DEC205（dendritic and epithelial cells, 205 kDa）、CD207（Cluster of Differentiation 207）、XCR1（XC-chemokine receptor 1）、TLR3（Toll-like receptor 3）等が知られている（Nat Rev Immunol. 2011, 11(9), 575-83）。
クロスプレゼンテーションを担う樹状細胞サブセットの細胞表面に発現するCLEC9Aは、壊死細胞上に露出したF-アクチンに結合し、ITAM（Immunoreceptor tyrosine-based activation motif）を有する細胞内ドメインとSykとの相互作用を通して細胞内シグナル伝達経路を活性化し、樹状細胞によるクロスプレゼンテーションを促進することが知られている（Nat Rev Immunol. 2010 Jun;10(6):387-402）。クロスプレゼンテーションを担う樹状細胞サブセットにおいてはDEC205等の発現も知られているが、DEC205よりもCLEC9Aの方が高い特異性で当該サブセットにおいて発現することが報告されている（Blood,2012, vol.119: pp.2284-2292）。

また、本発明の多重特異性抗原結合分子は、抗原提示細胞の活性化剤と併用されるか、または、抗原提示細胞の活性化剤とコンジュゲートされた形態で使用されることで、本発明の多重特異性抗原結合分子を介する抗原提示細胞および標的細胞の架橋により誘導される抗原提示細胞による標的細胞の貪食作用を強化することができ、ひいては当該標的細胞に対する細胞傷害活性の誘導を高めることができる。
本発明の多重特異性抗原結合分子と抗原提示細胞の活性化剤とのコンジュゲートは、様々な二官能性タンパク質連結剤を用いて作製され得る。例えばN-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート (SPDP)、スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート (SMCC)、イミノチオラン (IT)、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、アジプイミド酸ジメチルHCl）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス-アジド化合物（例えば、ビス（p-アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス-ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス-(p-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン2,6-ジイソシアネート）、およびビス活性フッ素化合物（例えば、1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン）である。リンカーは、細胞内での抗原提示細胞の活性化剤の放出を促進する「切断可能なリンカー」であり得る。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー、またはジスルフィド含有リンカー（Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992)が使用され得る。
本発明のコンジュゲートは、市販（例えば、Thermo Fisher Scientific Inc.）されているBMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、スルホ-EMCS、スルホ-GMBS、スルホ-KMUS、スルホ-MBS、スルホ-SIAB、スルホ-SMCC、およびスルホ-SMPB、ならびにSVSB（スクシンイミジル-(4-ビニルスルホン)ベンゾエート）を含むがこれらに限定されない架橋試薬を用いて調製されるコンジュゲートを考慮するが、これらに限定されない。
抗原提示細胞の活性化剤としては、抗原提示細胞を直接活性化する薬剤（図２Ａ、Ｂ）を用いることができる他、抗原提示細胞以外の免疫細胞を活性化する薬剤（図２Ｃ、Ｄ）を用いることもでき、後者を用いた場合、それによって活性化されたエフェクター細胞等の免疫細胞や傷害を受けた死細胞から放出される炎症性サイトカイン等によって抗原提示細胞を間接的に活性化することができる。これらの活性化剤の例としては、インターフェロンα（IFNα）、ポリI:C（poly-I:C）またはT細胞活性化剤等が挙げられる。
一態様として、これら活性化剤を添加することで、添加しない場合に比べて、破砕されていない標的細胞をそのまま効率よく抗原提示細胞に貪食させることができる。破砕されていない標的細胞が抗原提示細胞に提示されると、標的細胞が有する抗原はその細胞表面抗原のみならず、その細胞内抗原に至るまで、幅広いバリエーションとして抗原提示細胞に提示させることができる。その結果として、抗原提示細胞をより効果的に活性化させることができる。
また、樹状細胞を活性化させるアジュバントとして、死菌マイコバクテリアおよびLPS（Lipopolysaccharide）、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム（分子細胞免疫学、第7版、エルゼビア・ジャパン、2014年）が、そして、IFNα、IFNγ、TNFα、IL-1β、IL-6、LL37-DNA complex（N Engl J Med 2009; 361:496-509）が知られている。また、TLR（Toll-like receptor）、NLR（nucleotide-binding oligomerization domain-like (NOD-like) receptor）、RLR（RIG-I-like receptor）、およびCタイプレクチン受容体のそれぞれに対するアゴニストも、樹状細胞の活性化剤となることが知られている（Front Immunol. 2014; 5: 255）
抗原提示細胞を直接活性化する薬剤を本発明の多重特異性抗原結合分子にコンジュゲートすることによって、本発明の多重特異性抗原結合分子が結合する抗原提示細胞を特異的に活性化させることができる（図２Ｂ）。当該薬剤は、例えば、本発明の多重特異性抗原結合分子が有するFc領域またはFab領域にコンジュゲートされてもよい。
本発明の多重特異性抗原結合分子が結合するがん特異的抗原を発現する細胞において特異的に発現される抗原に対する結合部位と、T細胞表面抗原（例えばCD3）に対する結合部位とを有する抗原結合分子をT細胞活性化剤として本発明の多重特異性抗原結合分子と併用した場合、本発明の多重特異性抗原結合分子が結合するがん細胞が、当該T細胞活性化剤によって当該がん細胞の近傍に動員されたT細胞による傷害作用を受けて炎症性サイトカイン等を放出し、本発明の多重特異性抗原結合分子が結合する抗原提示細胞を特異的に活性化させることができる（図２Ｃ）。そのようなT細胞活性化剤としては、例えばWO2012073985に記載されているようなT細胞とがん細胞を架橋することで当該がん細胞に対する細胞傷害活性を誘導する二重特異性抗体が挙げられる。
また、エフェクター細胞（細胞傷害性T細胞）を活性化する抗体フラグメントや薬剤をT細胞活性化剤として本発明の多重特異性抗原結合分子にコンジュゲートすることによって、本発明の多重特異性抗原結合分子が結合するがん細胞が、当該抗原結合分子によって当該がん細胞の近傍に動員されたエフェクター細胞による傷害作用を受けて炎症性サイトカイン等を放出し、本発明の多重特異性抗原結合分子が結合する抗原提示細胞を特異的に活性化させることができる（図２Ｄ）。当該T細胞活性化剤は、例えば、本発明の多重特異性抗原結合分子が有するFc領域またはFab領域にコンジュゲートされてもよい。

本発明は、本発明の多重特異性抗原結合分子を対象（患者、被験者、個体、等）に投与する工程を含む、抗腫瘍免疫応答を誘導する方法、細胞傷害性T細胞を活性化する方法、細胞障害を誘導する方法、細胞増殖を抑制する方法、標的細胞又は標的細胞を含む腫瘍組織に対する免疫を活性化する方法、がんを予防もしくは治療する方法、がんを有する個体を治療する方法、および標的細胞に由来する抗原ペプチドを抗原提示細胞のMHCクラスIタンパクに提示させる方法にも関する。対象としては、ヒト、またはマウス、ラット、サル、ウサギ、およびイヌなどの非ヒト動物が挙げられる。

また、本発明は、本発明の抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドに関する。本発明のポリヌクレオチドは、任意の発現ベクターに組み込むことができる。発現ベクターで適当な宿主を形質転換し、抗原結合分子の発現細胞とすることができる。抗原結合分子の発現細胞を培養し、培養上清から発現産物を回収すれば、当該ポリヌクレオチドによってコードされる抗原結合分子を取得することができる。即ち本発明は、本発明の抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、当該ベクターを保持する細胞、および当該細胞を培養し培養上清から抗原結合分子を回収することを含む、抗原結合分子の製造方法に関する。

医薬組成物
別の観点においては、本発明は、本発明の多重特異性抗原結合分子を有効成分として含む医薬組成物（薬学的製剤）を提供する。また、本発明は、当該抗原結合分子を有効成分として含有する、抗腫瘍免疫応答の誘導用組成物、細胞傷害性T細胞の活性化を誘導する医薬組成物（細胞傷害性T細胞活性化剤）、細胞傷害を誘導する医薬組成物（細胞傷害誘導治療剤）、細胞増殖抑制剤および抗がん剤に関する。本発明の医薬組成物は、がん治療剤またはがん予防剤（がんの治療用組成物またはがんの予防用組成物）として用いることもできる。本発明の抗腫瘍免疫応答の誘導用組成物、細胞傷害性T細胞活性化剤、細胞傷害誘導治療剤、細胞増殖抑制剤および抗がん剤は、がんを罹患している対象または再発する可能性がある対象に投与されることが好ましい。本発明の組成物との関連において、抗腫瘍免疫応答の誘導は、好ましくは細胞傷害性T細胞（Cytotoxic T Lymphocyte; CTL）の活性化であってもよい。

また、本発明において、本発明の多重特異性抗原結合分子を有効成分として含む、抗腫瘍免疫応答の誘導用組成物、細胞傷害性T細胞活性化剤、細胞傷害誘導治療剤、細胞増殖抑制剤または抗がん剤は、当該抗原結合分子を対象に投与する工程を含む、抗腫瘍免疫応答を誘導する方法、細胞傷害性T細胞を活性化する方法、細胞障害を誘導する方法、細胞増殖を抑制する方法、がん細胞又はがん細胞を含む腫瘍組織に対する免疫を活性化する方法、またはがんを予防もしくは治療する方法と表現することができ、あるいは、抗腫瘍免疫応答の誘導用組成物、細胞傷害性T細胞の活性化を誘導する医薬組成物、細胞傷害を誘導するための医薬組成物、細胞増殖抑制剤および抗がん剤の製造における当該抗原結合分子の使用と表現することもでき、あるいは、抗腫瘍免疫応答の誘導、細胞傷害性T細胞活性化の誘導、細胞障害の誘導、細胞増殖の抑制、がん細胞又はがん細胞を含む腫瘍組織に対する免疫の活性化またはがんの治療もしくは予防において使用するための当該抗原結合分子と表現することもできる。上記組成物または薬学的製剤には、薬学的に許容される担体および任意で追加治療剤が含まれてもよい。また、上記方法には、任意で追加治療剤を投与する工程が含まれてもよい。

本発明において、「抗原結合分子を有効成分として含む」とは、当該抗原結合分子を主要な活性成分として含むという意味であり、当該抗原結合分子の含有率を制限するものではない。

更に本発明における医薬組成物、あるいは抗腫瘍免疫応答の誘導用組成物、細胞傷害を誘導するための医薬組成物、細胞増殖抑制剤および抗がん剤(以下、医薬組成物等)は、抗原提示細胞の活性化剤と組み合わせて用いることができる。本発明の多重特異性抗原結合分子を含む医薬組成物等に抗原提示細胞の活性化剤を組み合わせて用いることにより、抗原提示細胞による標的細胞の貪食作用を強化することができ、ひいては標的細胞に対する細胞傷害作用を強化することができる。抗原提示細胞の活性化剤としては、例えば、インターフェロンα（IFNα）、ポリI:C（poly-I:C）またはT細胞活性化剤等が挙げられる。ここで、「抗原提示細胞の活性化剤を組み合わせて用いる」とは、抗原提示細胞の活性化剤が、本発明の多重特異性抗原結合分子を含む医薬組成物等中に一緒に配合されていてもよいし、本発明の多重特異性抗原結合分子を含む医薬組成物等とは異なる医薬組成物等中に抗原提示細胞の活性化剤が含まれていてもよい。その剤型も同一のものであってもよいし、異なるものであってもよい。また、本発明の多重特異性抗原結合分子と抗原提示細胞の活性化剤が異なる医薬組成物等中に含まれる場合には、これらの医薬組成物等は、対象に対して、同時に投与されてもよいし、別々に投与されてもよい。さらにこれらの医薬組成物等をキットとして提供してもよい。

また、本発明の多重特異性抗原結合分子又は本発明の多重特異性抗原結合分子を有効成分として含む医薬組成物は、抗原提示細胞の活性化剤又は抗原提示細胞の活性化剤を有効成分として含む医薬組成物等と併用することで、抗原提示細胞による標的細胞の貪食作用を強化する、その細胞傷害活性の誘導を高める、或いは、細胞傷害活性を強化するための医薬組成物として用いることができる。また、抗原提示細胞の活性化剤又は抗原提示細胞の活性化剤を有効成分として含む医薬組成物は、本発明の多重特異性抗原結合分子又は本発明の多重特異性抗原結合分子を有効成分として含む医薬組成物等と併用することで、抗原提示細胞による標的細胞の貪食作用を強化する、その細胞傷害活性の誘導を高める、或いは、細胞傷害活性を強化するための医薬組成物として用いることができる。

ここで、「併用」には、本発明の多重特異性抗原結合分子を有効成分として含む医薬組成物等と抗原提示細胞の活性化剤を有効成分として含む医薬組成物等とが、対象に対して、同時に投与されることも含まれるし、別々に投与されることも含まれる。また、その剤型は同一のものであってもよいし、異なるものであってもよい。さらに、これらの医薬組成物等をキットとして提供するものであってもよい。

また、本発明は、上記の本発明の多重特異性抗原結合分子又は当該結合分子を有効成分として含む医薬組成物等と、抗原提示細胞の活性化剤又は抗原提示細胞の活性化剤を有効成分として含む医薬組成物等を併用することによって生じる効果を利用することにより、抗原提示細胞の活性化剤又は抗原提示細胞の活性化剤を有効成分として含む医薬組成物等によって、本発明の多重特異性抗原結合分子又は本発明の多重特異性抗原結合分子を有効成分として含む医薬組成物等の細胞傷害活性又は抗腫瘍効果を強化する方法を提供する。

本発明の医薬組成物、あるいは抗腫瘍免疫応答の誘導用組成物、細胞増殖抑制剤および抗癌剤は、経口、非経口投与のいずれかによって患者に投与することができる。好ましくは非経口投与であってもよい。係る投与方法としては具体的には、注射投与、経鼻投与、経肺投与、経皮投与などが挙げられる。注射投与としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などが挙げられる。例えば注射投与によって本発明の医薬組成物、あるいは抗腫瘍免疫応答の誘導用組成物、細胞傷害誘導治療剤、細胞増殖抑制剤および抗癌剤が全身または局部的に投与できる。また、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。投与量としては、例えば、一回の投与につき体重1 kgあたり0.0001 mgから1000 mgの範囲で投与量を選択できる。あるいは、例えば、患者あたり0.001 mg/bodyから100000 mg/bodyの範囲で投与量を選択し得る。しかしながら、本発明の医薬組成物はこれらの投与量に制限されるものではない。

本発明の医薬組成物は、常法に従って製剤化することができ（例えば、Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, U.S.A）、医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。例えば界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられる。更にこれらに制限されず、その他常用の担体を適宜使用できる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を担体として挙げることができる。

別の局面において、本発明は、本発明の多重特異性抗原結合分子を用いて、抗原提示細胞を標的細胞に標的化する工程を含む、当該標的細胞に由来する抗原ペプチドを当該抗原提示細胞のMHCクラスIタンパクに提示させる方法を提供する。
他の局面において、本発明は、本発明の多重特異性抗原結合分子を用いて、抗原提示細胞を標的細胞に標的化する工程、および当該標的細胞に由来する抗原ペプチドを当該抗原提示細胞のMHCクラスIタンパクに提示させる工程を含む、がんに由来する抗原ペプチドをスクリーニングする方法を提供する。また他の局面において、本発明は、本発明の多重特異性抗原結合分子を用いて、抗原提示細胞を標的細胞に標的化する工程、および当該抗原提示細胞のMHCクラスIタンパクに提示された当該標的細胞に由来する抗原ペプチドを検出する工程を含み、検出された抗原ペプチドを同定する工程を含んでいてもよい、標的細胞に由来する抗原ペプチドをスクリーニングする方法を提供する。当該スクリーニング方法によって得られたペプチドを使用することによって、当該ペプチドを含むMHC/ペプチド複合体に特異的な細胞傷害性T細胞を誘導することができる。
抗原提示細胞のMHCクラスIタンパクに提示された標的細胞に由来する抗原ペプチドを検出する方法としては、任意のペプチド抗原-MHC複合体反応性TCRを有するT細胞を抗原提示細胞が活性化出来るかを評価する方法（例えば、本明細書の実施例の項に記載のOT-Iマウス（OVA反応性T細胞を持つ）を用いた系）、任意の抗原ペプチド-MHC複合体を特異的に認識する抗体を用いてFACSで検出/測定する方法、MHCに提示されている抗原ペプチドをMSで直接検出/測定する方法等がある。T細胞活性化の検出/測定方法としては、活性化した際に放出されるサイトカインをELISAやFACSで検出/測定する方法、活性化マーカーをFACSで検出/測定する方法、細胞数の増加を検出/測定する方法等がある。
検出された抗原ペプチドを同定する方法としては、例えばヒト抗原提示細胞に提示された抗原ペプチドを同定する方法の一例として、以下の方法等が挙げられる。なお、以下の方法例に記載されている抗HLA-DRビーズの代わりに抗マウスMHC抗体ビーズを用いて同様の実験を行うことにより、マウス抗原提示細胞に提示された抗原ペプチドを同定することもできる。
（１）抗HLA-DRビーズの生成
1. 抗HLA-DR抗体G46-6(BD Biosciences,Cat.:555809)を、CNBr-activated Sepharose beads(GE Healthcare，Cat.:17-0430-01)に終濃度1mg/mLで固層化し、抗HLA-DR抗体固層化ビーズとする。
2. 抗HLA-DR抗体固層化ビーズについては0.02%アジ化ナトリウム(Wako，Cat.:190-14901)を含むPBS(Wako，Cat.:041-20211)中で保管する。

（２）HLA-DR-ペプチド複合体のナノスケール精製
1. Tris(SIGMA，Cat.:T1503-1KG)20mM, MgCl₂ (MERCK，Cat.:1.05833.0250)5mMを加え、HCl(MERCK，Cat.:1.00316.1000)を用いてpH7.8に調製した超純水(Wako，Cat.:210-01303)溶液に、10% TritonX-100(Roche Diag,Cat.:11332481001)を1/10倍、protease inhibitor mix (11.6mg/mL PMSF(nakalai,Cat.:27327-94)、1.7mg/mL pepstatin A(SIGMA,Cat.:P4265-25MG)、1.7mg/mL chymostatin(Roche Diag,Cat.:11004638001)、0.8mg/mL leupeptin(SIGMA,Cat.:L9783-25MG)、及び133mg/mLアジ化ナトリウム(Wako,Cat.:190-14901)のmixture)を17/5000倍となるよう加え、Lysis Bufferを調製する。
2. 抗原提示細胞（例えば樹状細胞）のペレットにLysis Bufferを氷冷条件下で10倍量加え、Thermomixer Confort(Eppendorf)にて1100rpm、1時間、4℃で振とうし、ライセートを取得する。
3. 14000rpm、10分、4℃でスピンダウンし、ライセートを細胞片や細胞核と分離する。
4. 抗HLA-DR抗体固層化ビーズをライセート100μLに対して5-10μL加え、水平振とう機（horizontal shaker）で1100rpm、4℃、一晩振とうし、ライセート中のHLA-DR-ペプチド複合体を抗HLA-DR抗体固層化ビーズに結合させた。
5. 抗HLA-DR抗体固層化ビーズに結合したHLA-DR-ペプチド複合体を3000rpm、1分、4℃でスピンダウンした後、Lysis buffer 500μLで1回、さらに0.1% Zwittergent 3-12(Calbiochem,Cat.:693015)を含むPBS 500μLで2回洗浄する。

（３）HLA-DR-関連ペプチドの溶出
1. HLA-DR抗体固層化ビーズに結合したHLA-DR-ペプチド複合体を400μLの超純水に懸濁し、Ultrafree-MC filter(Durapore PVDF, 0.22um)(Millipore)に移し、14000rpm、10秒、4℃でスピンダウンする。
2. チューブ底に落とした超純水を除去し、400μLの超純水をフィルタ上に加え14000rpm、10-30秒、4℃でスピンダウンする洗浄操作を10回繰り返し実施する。
3. 0.1% trifluoracetic acid(Thermo Fisher Scientific，Cat.:28904)を含む超純水60uLを加え、37℃、30分インキュベートし、HLA-DR-ペプチド複合体よりペプチド混合物を溶出させた後、14000rpm、3分、18℃でスピンダウンし、vacuum centrifuge 5305C(Eppendorf)により溶出したペプチド混合物を乾燥する。

（４）イオントラップMS/MS質量分析によるペプチドの配列解析
1. 乾燥したペプチド混合物を2% acetonitrile(Wako,Cat.:018-19853)、0.5% acetic acid(MERCK,Cat.:1.00066.0250)、1% formic acid(MERCK，Cat.:1.11670.1000)を含む超純水15μLに再溶解し、そのうち5μLをMSに接続したnano-LC Ultimate 3000 RSLCnano system(Dionex)に注入する。LC分析条件としては、EP1715343A1に記載の条件、又はこれに類似する当業者に公知の条件で、逆相材料及びイオン交換材料を組み合わせたカラム、あるいは逆相材料単独のカラムを用い、適切な緩衝液を用いて行うことができる。HPLCカラムをナノ-LC エレクトロスプレーイオン化源を設置したOrbitrap Elite(Thermo)に連結し、製造元のプロトコルに従い、full scan精密質量分析及びMS-MSによる質量分析を実施する。
2. ペプチドの配列解析をSEQUESTアルゴリズムにより実施する。

また、本発明は、あるがん特異的抗原を発現する細胞を、当該がん特異的抗原に結合する本発明の多重特異性抗原結合分子、或いは、本発明の多重特異性抗原結合分子及び抗原提示細胞の活性化剤と接触させることにより、当該がん特異的抗原の発現細胞又は当該がん特異的抗原の発現細胞を含む腫瘍組織に傷害を引き起こす方法、当該細胞又は当該腫瘍組織の増殖を抑制する方法を提供する。当該がん特異的抗原に結合する本発明の抗原結合分子が結合する細胞は、当該がん特異的抗原が発現している細胞であれば特に限定されない。本発明における好ましい当該がん抗原の発現細胞は、具体的には、卵巣癌、前立腺癌、乳癌、子宮癌、肝癌、肺癌、膵臓癌、胃癌、膀胱癌及び大腸癌細胞等が好適に挙げられる。

本発明において「接触」は、例えば、がん特異的抗原の発現細胞を体内に移植した非ヒト動物や、内在的に当該がん特異的抗原を発現するがん細胞を有する動物に、当該がん抗原に結合する本発明の多重特異性抗原結合分子を投与することによって行われる。投与方法は経口、非経口投与のいずれかによって実施できる。特に好ましい一態様においては非経口投与による投与方法であり、係る投与方法としては具体的には、注射投与、経鼻投与、経肺投与、経皮投与などが挙げられる。注射投与としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などが挙げられる。例えば注射投与によって本発明の医薬組成物、あるいは抗腫瘍免疫応答の誘導用組成物、細胞傷害を誘導するための医薬組成物、細胞増殖阻害剤および抗がん剤を全身または局部的に投与できる。また、被験動物の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。水溶液として投与される場合にあっては純粋に本発明の抗原結合分子のみを含有する水溶液であってもよいし、例えば界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等を含む溶液であってもよい。投与量としては、例えば、一回の投与につき体重1 kgあたり0.0001 mgから1000 mgの範囲で投与量を選択できる。あるいは、例えば、患者あたり0.001から100000 mg/bodyの範囲で投与量を選択できる。しかしながら、本発明の抗原結合分子投与量はこれらの投与量に制限されるものではない。

本発明の多重特異性抗原結合分子の接触によって当該抗原結合分子を構成するがん特異的抗原結合ドメインが結合するがん特異的抗原を発現する細胞に引き起こされた細胞傷害を評価又は測定する方法として、以下の方法が好適に使用される。インビトロで該細胞傷害活性を評価又は測定する方法としては、細胞傷害性T細胞活性などの測定法を挙げることができる。本発明の抗原結合分子がT細胞性傷害活性を有するか否かを、公知の方法により測定することができる（例えば、Current protocols in Immunology, Chapter 7. Immunologic studies in humans, Editor, John E, Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc.,(1993)等）。活性の測定に際しては、本発明とはその抗原結合ドメインが結合する抗原が異なる抗原であって試験に使用する細胞が発現していない抗原に結合する抗原結合分子を対照として、本発明の抗原結合分子と同様に使用し、本発明の抗原結合分子が、対照として使用された抗原結合分子よりも強い細胞傷害活性を示すことにより、活性を判定し得る。

また、生体内で細胞傷害活性を評価又は測定するために、例えば本発明の多重特異性抗原結合分子を構成するがん特異的抗原結合ドメインが結合する抗原を発現する細胞を、非ヒト被験動物の皮内又は皮下に移植後、当日又は翌日から毎日又は数日間隔で被験抗原結合分子を静脈又は腹腔内に投与する。腫瘍の大きさを経日的に測定することにより、当該腫瘍の大きさの変化の差異を細胞傷害活性と規定し得る。インビトロでの評価と同様に対照となる抗原結合分子を投与し、本発明の抗原結合分子の投与群における腫瘍の大きさが対照抗原結合分子の投与群における腫瘍の大きさよりも有意に小さいことにより、本発明の抗原結合分子が細胞傷害活性を有すると判定し得る。

本発明の多重特異性抗原結合分子の接触による、当該抗原結合分子を構成するがん特異的抗原結合ドメインが結合する抗原を発現する細胞の増殖に対する抑制効果を評価又は測定する方法としては、アイソトープラベルしたthymidineの細胞へ取込み測定やMTT法が好適に用いられる。また、生体内で細胞増殖抑制活性を評価又は測定する方法として、上記記載の生体内において細胞傷害活性を評価又は測定する方法と同じ方法を好適に用いることができる。

また、本発明は、本発明の抗原結合分子または本発明の製造方法により製造された抗原結合分子を含む、本発明の方法に用いるためのキットを提供する。該キットには、その他、薬学的に許容される担体、媒体、使用方法を記載した指示書等をパッケージしておくことができる。

また、本発明は、本発明の方法に使用するための、本発明の抗原結合分子または本発明の製造方法により製造された抗原結合分子に関する。

本明細書に記載の１又は複数の態様を任意に組み合わせたものも、当業者の技術常識に基づいて技術的に矛盾しない限り、本発明に含まれることが当業者には当然に理解される。

なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。

以下において、本開示を、実施例を参照してより詳細に説明する。しかしながら、本開示は、いろいろな態様により具現化することができ、ここに記載される実施例に限定されるものとして解釈されてはならない。

〔実施例１〕
（１）抗原提示細胞に標的細胞抗原を提示させるコンセプト
既存の抗原提示細胞を標的とした種々の治療法には以下のような課題がある。
１．体外で培養した抗原提示細胞を移入する治療法の場合、生体内で存在する抗原提示細胞と同等の機能を持つ細胞を体外で培養することが極めて困難である。また培養に設備や時間等のコストがかかる。
２．抗原ペプチドやmRNA等を投与する治療法の場合、免疫する抗原の解析・調製が必要となる。
この課題を解決するためには以下の条件を満たす事が重要であると考えた。
１．生体内に存在する自然な状態の抗原提示細胞を標的とする。
２．抗原提示細胞による標的細胞の貪食、抗原提示を促進する。
上記条件を満たす医薬組成物として抗原提示細胞と標的細胞を架橋させる分子を考案した。

（２）抗原提示細胞と標的細胞を架橋させる抗体の例
図１では抗原提示細胞と標的細胞を架橋させる抗体の例を示している。抗原提示細胞上の抗原と標的細胞上の抗原を認識する二重特異性抗体を用いて抗原提示細胞と標的細胞を架橋し、抗原提示細胞による標的細胞の貪食を促進する。標的細胞を貪食した抗原提示細胞は標的細胞内抗原も含めた様々な抗原をMHCに提示し、標的細胞反応性免疫応答を惹起することが出来る。

（３）抗原提示効率を高める方法の例
例えば樹状細胞においては未成熟な樹状細胞よりも成熟な樹状細胞の方が抗原提示能は高いとされている（Front Immunol. 2013 Apr 3;4:82.）。抗原提示細胞の活性化方法は、抗原提示細胞を直接活性化する方法と、抗原提示細胞以外の免疫細胞を活性化し、その活性化細胞や傷害を受けた死細胞から放出される炎症性サイトカイン等によって間接的に活性化する方法が知られている。そこで、抗原提示細胞と標的細胞を架橋させる二重特異性抗体を、抗原提示細胞を活性化する因子と併用することで、（１）に示した抗原提示効率を高めることができると考えた（図２（A））。また、抗原提示細胞と標的細胞を架橋させる二重特異性抗体を、抗原提示細胞を直接活性化する分子とコンジュゲートした抗体（図２（B））によっても、抗原提示効率を高めることが可能だと考えた。さらに、例えばWO2012073985に記載されているようなT細胞とがん細胞を架橋することで細胞傷害活性を誘導する二重特異性抗体との併用（図２（C））、または細胞傷害性T細胞を活性化する抗体や薬剤のコンジュゲート（図２（D））によって、傷害を受けた死細胞から放出される炎症性サイトカイン等によって間接的に抗原提示細胞を活性化し、（１）に示した抗原提示効率を高めることが出来ると考えた。

〔実施例２〕二重特異性抗体の作製
CLEC9Aは、取り込んだ抗原をMHC-Iへ提示する機能を有するCross presenting DC特異的な抗原であり、GPC3はある種のがん細胞の細胞膜上に発現することが知られている（Trends Immunol. 2013 Aug; 34(8): 361-370.、European Journal of Cancer Volume 47, Issue 3, February 2011, Pages 333-338）。これらの抗原を用いて樹状細胞とがん細胞を架橋することで、樹状細胞によるがん細胞の貪食、および、がん細胞の保持する抗原の樹状細胞による提示を促進できることが考えられた。そこで本発明者らは、抗CLEC9A抗体と抗GPC3抗体から構成される二重特異性抗体を作製した。公知の抗CLEC9A抗体である10B4 (重鎖：10B4H-mF18mP4dGK (配列番号：１)、軽鎖：10B4L-mk1 (配列番号：２))、および、抗GPC3抗体であるGCH065(重鎖：GCH065-mF18mN4dGK (配列番号：3)、軽鎖：L0011-k0a (配列番号：4)) の発現ベクターを当業者公知の方法で調製し、Expi293 (Thermo Fisher Scientific ) 細胞を用いてこれらの抗体を発現した。また、ネガティブコントロール抗体（重鎖： NCHn（配列番号：5）、軽鎖：NCL（配列番号：6））を用いた。培養上清からの抗体の精製、および、二重特異性抗体の調製は当業者公知の方法にておこなった。以下、抗CLEC9A抗体と抗GPC3抗体の二重特異性抗体を10B4//GCH065、抗CLEC9A抗体とネガティブコントロール抗体の二重特異性抗体を10B4//NCと表記する。

〔実施例３〕標的細胞貪食効率評価
実施例２で作製した抗体を用いて、樹状細胞とがん細胞を架橋させることにより、樹状細胞によるがん細胞の取り込みが促進されるかを評価した。標的とするがん細胞は、ヒトGPC3（hGPC3）とオボアルブミン（OVA）を発現するLL/2（LLC1）（CRL-1642、ATCC）トランスフェクタント細胞（以下LLC1/hGPC3/OVA）を使用した。また、評価に用いる樹状細胞は、C57BL/6NCrlマウス（雌、6〜8週齢、チャールスリバー）の骨髄から既報（Blood 2014 124:3081-3091）の方法で誘導したBMDC (Bone marrow dendritic cell)を使用した。誘導したBMDCにおいて抗原発現を表１のフローサイトメトリー用蛍光標識抗体を用いて当業者公知の方法で染色を行い、Fortessa (BD Biosciences) を用いてCLEC9A発現量を評価した結果を図３に示す。図３に示すように、CD103陽性樹状細胞はCLEC9A陽性、CD103陰性樹状細胞集団はCLEC9A陰性であった。

上記の細胞を用いて標的細胞貪食効率を評価した。まず、標的細胞であるLLC1/hGPC3/OVAをPKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling (PKH26GL, SIGMA)を用いて標識した。次に標識細胞を液体窒素で凍結した後に、37℃で融解する操作を2回行った。
低吸着平底 96well plate (Cat:3474, Corning)に上記の操作を施した標的細胞を2.0×10⁴ cells/well、各抗体を1 μg/well、BMDCを2.0×10⁴ cells/wellとなるように加え、1時間反応させた。反応は5%炭酸ガス、37℃条件下で行われた。1時間の反応後、表２のフローサイトメトリー用蛍光標識抗体を用いて当業者公知の方法で染色を行い、Fortessa (BD Biosciences) を用いて測定した。CLEC9A陽性樹状細胞（CD103陽性樹状細胞）集団とCLEC9A陰性樹状細胞（CD103陰性樹状細胞）集団のそれぞれ何%が標識細胞を貪食したかを評価した。その結果を図４に示す。10B4//GCH065はネガティブコントロール抗体である10B4//NCと比較してCLEC9A陽性樹状細胞の標的細胞貪食割合を増加させた。一方でCLEC9A陰性樹状細胞の標的細胞割合には影響を与えなかった。
同様に、実施例２に記載の方法に従って調製したCD103陽性樹状細胞上の別抗原であるDEC205に結合する公知の抗体NLDC145 (重鎖：NLDC145VH-mF18mP4dGK (配列番号：７)、軽鎖：NLDC145VL-mk1 (配列番号：８))と標的細胞抗原GPC3を認識するGCH065(重鎖：GCH065-mF18mN4dGK (配列番号：3)、軽鎖：L0011-k0a (配列番号：4))の二重特異性抗体NLDC145//GCH065においても、ネガティブコントロール抗体（重鎖NCHp（配列番号：９）、軽鎖NCL（（配列番号：６））と抗GPC3抗体GCH065（重鎖GCH065-mF18mN4dGK（配列番号：３）、軽鎖L0011-k0a（配列番号：４））の二重特異性抗体NC//GCH065と比較して貪食割合が促進した。試験条件は、標的細胞LLC1/hGPC3/OVA 5.0×10⁴ cells/well、BMDC 2.0×10⁴ cells/well、30分間の反応時間で実施した。その結果を図5に示す。
以上より、標的抗原と樹状細胞抗原を認識する二重特異性抗体によって、樹状細胞による標的細胞の貪食を誘導できることが示された。

〔実施例４〕抗原提示効率評価
実施例２で作製した二重特異性抗体を用いて細胞を貪食した抗原提示細胞が標的細胞の内在性抗原を提示して免疫細胞を活性化出来るかを評価した。免疫細胞としては、OVAペプチド（257-264）-MHC class I複合体を認識するCD8⁺T細胞を有するOT-Iマウス（Stock No: 003831、The Jackson Laboratory）の脾臓からCD8a⁺T Isolation kit (Cat: 130-104-075, Miltenyi Biotec)により分離したCD8⁺T細胞を使用した。
低吸着平底 96well plate (Cat:3474, Corning)に標的細胞であるLLC1/hGPC3/OVAを5.0x10⁴ cells/well、各抗体を1 μg/well、CD8⁺T細胞を1.0×10⁵ cells/well、BMDCを1.0x10⁵ cells/well、poly I:C （Cat:P1530, SIGMA）またはIFNα（Cat:752806, Biolegend）をそれぞれ20 μg/wellまたは10000 U/well加え、48時間反応させた。反応は5%炭酸ガス、37℃条件下で行われた。反応終了後に上清を回収し、上清中のmouse IFNγ（mIFNγ）量をMouse IFN-gamma DuoSetELISA（R&D、Cat:DY485）を用いて測定した。図６（A）、図６（B）に示すように、10B4//GCH065抗体により、樹状細胞の標的細胞内抗原の提示能が促進されている事が確認された。これらの結果は、標的抗原と樹状細胞抗原を認識する二重特異性抗体によって、樹状細胞に標的細胞を貪食させることで、標的細胞内の抗原をpMHC-Iに提示させるcross presentationを誘導できることを示している。

〔実施例５〕二重特異性抗体による抗腫瘍効果
皮下移植モデルマウスを用いて、実施例２に記載の方法に従って調製した抗CLEC9A抗体10B4（重鎖10B4H-mF18mP4dGK（配列番号：１）、軽鎖10B4L-mk1（配列番号：２））と抗GPC3抗体GCH065（重鎖GCH065-mF18mN4dGK（配列番号：３）、軽鎖L0011-k0a（配列番号：４））の二重特異性抗体10B4//GCH065、及びネガティブコントロール抗体（重鎖NCHｐ（配列番号：９）、軽鎖NCL（配列番号：６））と抗GPC3抗体GCH065（重鎖GCH065-mF18mN4dGK（配列番号：３）、軽鎖L0011-k0a（配列番号：４））の二重特異性抗体NC//GCH065を用いて、抗腫瘍効果を誘導出来得るかを評価した。まず、標的細胞であるLLC1/hGPC3/OVAを2×10⁶ cellsずつC57BL/6NCrlマウス（雌、8週齢、チャールスリバー）に移植した。移植後7日目に腫瘍径と体重を測定し、結果を基にランダマイズを実施して2群（6匹/群）に分けた。その後、ランダマイズされた各群において下記のように移植後8日目と11日目に薬剤を投与した。
群１ NC//GCH065 5mg/kg＋poly I:C 50μg
群２ 10B4//GCH065 5mg/kg＋poly I:C 50μg
各抗体は静脈投与、poly I:C（tlrl-pic、InvivoGen）は腫瘍内投与を行った。腫瘍径は週2回測定した。腫瘍径変化のグラフを図７に示す。図７に示すように標的抗原と樹状細胞抗原を認識する二重特異性抗体によって抗腫瘍効果が誘導されることが確認された。

〔実施例６〕抗原提示細胞の活性化例
実施例１（３）に示したように抗原提示細胞を活性化する事によって、抗原提示効率を高めることが出来ると考えられる。その方法としては抗原提示細胞を直接活性化する方法と、抗原提示細胞以外の免疫細胞を活性化し、その活性化細胞や傷害を受けた死細胞から放出される炎症性サイトカイン等によって間接的に活性化する方法がある。その例を図８、９に示した。

図８では、低吸着平底 96well plate (Cat:3474, Corning)に標的細胞であるLLC1/GPC3/OVAを7.5×10³ cells/well、BMDCを7.5×10⁴ cells/well播種した後にpoly I:C（Cat:P1530, SIGMA）を20μg/well加えて、48時間反応させた。反応は5%炭酸ガス、37℃条件下で行われた。48時間の反応後、表３のフローサイトメトリー用蛍光標識抗体を用いて当業者公知の方法で染色を行い、Fortessa (BD Biosciences) を用いてCD103陽性細胞集団のCD40発現量を測定した。図８に示すようにpoly I:Cの添加によって共刺激分子であるCD40発現量が増大した。

図９では、低吸着平底 96well plate (Cat:3474, Corning)に標的細胞であるLLC1/GPC3/OVAを7.5×10³ cells/well、BMDCを7.5×10⁴ cells/well、T細胞を7.5×10⁴ cells/well播種した後に、実施例２に記載の方法で調製した既知の抗GPC3抗体H0000-mF18mN4/GL4-mk1（重鎖H0000-mF18mN4（配列番号：１０）、軽鎖GL4-mk1（配列番号１１））と抗CD3抗体2C11VH-mF18mP4/2C11VL-mk1（重鎖2C11VH-mF18mP4（配列番号：１２）、軽鎖2C11VL-mk1（配列番号１３））の二重特異性抗体であるGPC3//CD3抗体を0.2μg加えて、48時間反応させた。T細胞は、C57BL/6NCrl（チャールスリバー）の脾臓細胞からPan T Cell アイソレーションキットII（Cat:130-095-130、Miltenyi Biotec）を用いて分離した。反応は5%炭酸ガス、37℃条件下で行われた。GPC3//CD3抗体によって標的細胞とT細胞が架橋され、T細胞が活性化する（Science Translational Medicine 04 Oct 2017: Vol. 9, Issue 410, eaal4291）。48時間の反応後、表３のフローサイトメトリー用蛍光標識抗体を用いて当業者公知の方法で染色を行い、Fortessa (BD Biosciences) を用いてCD103陽性細胞集団のCD40発現量を測定した。図９に示すようにGPC3//CD3抗体によって活性化したT細胞との共培養により、樹状細胞上のCD40発現量が増大し、樹状細胞を活性化できることが示された。

〔実施例７〕hEpCAM陽性標的細胞貪食効率評価
実施例３と同様の系を用いてhEpCAM陽性標的細胞貪食効率を評価した。標的細胞としては、ヒトEpCAM（hEpCAM）を発現するcolon 38 （MC38）（（公財）がん研究会）トランスフェクタント細胞（以下MC38/hEpCAM）を使用した。なお、WO2010142990A1に記載されている公知の抗hEpCAM抗体の重鎖及び軽鎖可変領域を用いた。
まず標的細胞であるMC38/hEpCAMをPKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling (PKH26GL, SIGMA)を用いて標識した。次に標識細胞を液体窒素で凍結した後に、37℃で融解する操作を2回行った。
低吸着平底 96well plate (Cat:3474, Corning)に上記の操作を施した標的細胞を5.0×10⁴ cells/well、各抗体を1 μg/well、BMDCを5.0×10⁴ cells/wellとなるように加え、200 μl/wellで1時間反応させた。反応は5%炭酸ガス、37℃条件下で行われた。1時間の反応後、表２のフローサイトメトリー用蛍光標識抗体を用いて当業者公知の方法で染色を行い、Fortessa (BD Biosciences) を用いて測定した。CLEC9A陽性樹状細胞（CD103陽性樹状細胞）集団とCLEC9A陰性樹状細胞（CD103陰性樹状細胞）集団のそれぞれ何%が標識細胞を貪食したかを評価した。その結果を図１０に示す。実施例２に記載の方法で調製した抗CLEC9A抗体10B4（重鎖10B4H-mF18mP4dGK（配列番号：１）、軽鎖10B4L-mk1（配列番号：２））と抗hEpCAM結合抗体3171（重鎖3171H-mF18mN4dGK（配列番号：５４）、軽鎖3171L-KT0（配列番号：５５））の二重特異性抗体10B4//3171は、ネガティブコントロール抗体である10B4//NCと比較してCLEC9A陽性樹状細胞の標的細胞貪食割合を増加させた。一方でCLEC9A陰性樹状細胞の標的細胞割合には影響を与えなかった。

〔実施例８〕抗原提示効率評価（NLDC145//GCH065）
実施例２に記載の方法で作製した、DEC205に結合する公知の抗体NLDC145 (重鎖：NLDC145VH-mF18mP4dGK (配列番号：７)、軽鎖：NLDC145VL-mk1 (配列番号：８))と標的細胞抗原GPC3を認識するGCH065(重鎖：GCH065-mF18mN4dGK (配列番号：3)、軽鎖：L0011-k0a (配列番号：4))の二重特異性抗体NLDC145//GCH065を用いて、細胞を貪食した抗原提示細胞が標的細胞の内在性抗原を提示して免疫細胞を活性化出来るかを評価した。免疫細胞としては、実施例４と同様にOT-Iマウス（Stock No: 003831、The Jackson Laboratory）の脾臓からCD8a+T Isolation kit (Cat: 130-104-075, Miltenyi Biotec)により分離したCD8⁺T細胞を使用した。標的細胞としては、4回凍結融解を行ったLLC1/hGPC3/OVAを用いた。
低吸着平底 96well plate (Cat:3474, Corning)に標的細胞であるLLC1/hGPC3/OVAを5.0x10⁴ cells/well、各抗体を1 μg/well、CD8⁺T細胞を1.0×10⁵ cells/well、BMDCを1.0x10⁵ cells/well、poly I:C （Cat:P1530, SIGMA）4μg/well加え、200 μl/wellで48時間反応させた。反応は5%炭酸ガス、37℃条件下で行われた。反応終了後に上清を回収し、上清中のmouse IFNγ（mIFNγ）量をMouse IFN-gamma DuoSetELISA（R&D、Cat:DY485）を用いて測定した。図１１に示すように、NLDC145//GCH065はネガティブコントロール抗体であるNC//GCH065と比較してmIFNγの産生を促し、樹状細胞の標的細胞内抗原の提示を促進している事が確認された。従って、NLDC145//GCH065は樹状細胞による標的細胞の貪食を促進し、抗原提示を促進することが示された。

〔実施例９〕抗原提示効率評価（hEpCAM）
実施例２に記載の方法で調製した、CLEC9A抗体10B4（重鎖10B4H-mF18mP4dGK（配列番号：１）、軽鎖10B4L-mk1（配列番号：２））と抗hEpCAM結合抗体3171（重鎖3171H-mF18mN4dGK（配列番号：５４）、軽鎖3171L-KT0（配列番号：５５））の二重特異性抗体10B4//3171を用いて、細胞を貪食した抗原提示細胞が標的細胞の内在性抗原を提示して免疫細胞を活性化出来るかを評価した。免疫細胞としては、実施例４と同様にOT-Iマウス（Stock No: 003831、The Jackson Laboratory）の脾臓からCD8a+T Isolation kit (Cat: 130-104-075, Miltenyi Biotec)により分離したCD8⁺T細胞を使用した。標的細胞としては、MC38/hEpCAMにMyc-OVAプラスミドをFuGENE (Cat:E2321A、promega)を用いて導入し一過性にOVAを発現させた後に、4回凍結融解を行ったMC38/hEpCAM/OVAを用いた。
低吸着平底 96well plate (Cat:3474, Corning)に標的細胞であるMC38/hEpCAM/OVAを1.0x10⁴ cells/well、各抗体を1 μg/well、CD8⁺T細胞を1.0×10⁵ cells/well、BMDCを1.0x10⁵ cells/well、poly I:C （Cat:P1530, SIGMA）を4 μg/well加え、200 μl/wellで48時間反応させた。反応は5%炭酸ガス、37℃条件下で行われた。反応終了後に上清を回収し、上清中のmouse IFNγ（mIFNγ）量をMouse IFN-gamma DuoSetELISA（R&D、Cat:DY485）を用いて測定した。図１２に示すように、10B4//3171が樹状細胞の標的細胞内抗原の提示を促進している事が確認された。従って、10B4//3171は樹状細胞による標的細胞の貪食を促進し、抗原提示を促進することが示された。

本発明の多重特異性抗原結合分子は、樹状細胞等の抗原提示細胞と標的細胞を架橋し、抗原提示細胞による標的細胞の貪食を促進し、貪食により取り込んだ標的細胞に由来する複数種の腫瘍抗原をT細胞に対して提示することができる。したがって、本発明の多重特異性抗原結合分子は、貪食により取り込んだ標的細胞に由来する複数種の腫瘍抗原を標的とするCD8⁺ 細胞傷害性T細胞の活性化を誘導することができ、単一の腫瘍抗原を標的とする従来のがん免疫療法と比較して有用ながん治療手段である。

Claims (15)

1. 抗原提示細胞上の第一の抗原に結合する第一の抗原結合ドメイン、および、標的細胞上の第二の抗原に結合する第二の抗原結合ドメインを含む、多重特異性抗原結合分子。
2. 前記標的細胞ががん細胞である、請求項１に記載の多重特異性抗原結合分子。
3. 前記抗原提示細胞および前記標的細胞を前記多重特異性抗原結合分子を介して架橋することで前記抗原提示細胞による前記標的細胞の貪食作用（Phagocytosis）を誘導し得る、請求項１または２に記載の多重特異性抗原結合分子。
4. 前記標的細胞が、破砕されていない標的細胞である、請求項３に記載の多重特異性抗原結合分子。
5. 前記抗原提示細胞内に取り込まれた前記標的細胞に由来する複数種の抗原ペプチドが前記抗原提示細胞に提示される、請求項１〜４のいずれかに記載の多重特異性抗原結合分子。
6. 前記抗原提示細胞のMHCクラスIタンパク質に提示される前記標的細胞に由来する抗原ペプチドが、前記標的細胞上の第二の抗原とは異なる抗原に由来するまたは前記標的細胞上の第二の抗原に由来する、請求項１〜５のいずれかに記載の多重特異性抗原結合分子。
7. 前記抗原提示細胞上の第一の抗原が、樹状細胞表面上の抗原であり、樹状細胞クロスプレゼンテーションを誘導し得る抗原である、請求項１〜６のいずれかに記載の多重特異性抗原結合分子。
8. 前記抗原提示細胞表面上の抗原が、Cタイプレクチン受容体またはインテグリン受容体である、請求項１〜７のいずれかに記載の多重特異性抗原結合分子。
9. 前記抗原提示細胞上の第一の抗原が、CLEC9A、DEC205およびCD207からなる群から選択される抗原である、請求項１〜８のいずれかに記載の多重特異性抗原結合分子。
10. 前記標的細胞上の第二の抗原が、がん抗原である、請求項１〜９のいずれかに記載の多重特異性抗原結合分子。
11. 前記がん抗原が、GPC3、IL6R、およびEpCAMからなる群から選択される抗原である、請求項１０に記載の多重特異性抗原結合分子。
12. 前記抗原結合分子が抗体である、請求項１〜１１のいずれかに記載の多重特異性抗原結合分子。
13. 請求項１〜１２のいずれかに記載の多重特異性抗原結合分子を含む、抗腫瘍免疫応答の誘導用組成物。
14. 前記抗腫瘍免疫応答の誘導が細胞傷害性T細胞（Cytotoxic T Lymphocyte; CTL）の活性化である、請求項１３に記載の組成物。
15. 請求項１〜１２のいずれかに記載の多重特異性抗原結合分子を含む、医薬組成物。

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