JP7015819B2 - 免疫活性化抗原結合分子 - Google Patents
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Description
〔1〕下記のドメイン:
(1)癌特異的抗原結合ドメイン、及び
(2)腫瘍壊死因子(TNF)スーパーファミリー結合ドメイン又は腫瘍壊死因子(TNF)受容体スーパーファミリー結合ドメイン
を含む、抗原結合分子。
〔2〕FcRn結合ドメインをさらに含む、〔1〕に記載の抗原結合分子。
〔3〕FcRn結合ドメインが、Fcγ受容体に対する結合活性が低下している、抗体のFc領域である、〔2〕に記載の抗原結合分子。
〔4〕TNFスーパーファミリー結合ドメイン又はTNF受容体スーパーファミリー結合ドメインがCD137結合ドメインである、〔1〕から〔3〕のいずれかに記載の抗原結合分子。
〔5〕二重特異性抗体である、〔1〕から〔4〕のいずれかに記載の抗原結合分子。
〔6〕〔1〕から〔5〕のいずれかに記載の抗原結合分子を有効成分として含む、医薬組成物。
〔7〕細胞傷害を誘導する組成物である、〔6〕に記載の医薬組成物。
〔8〕癌治療用の組成物である、〔6〕に記載の医薬組成物。
〔9〕〔1〕から〔5〕のいずれかに記載の第1の抗原結合分子と、下記のドメイン:
(1)癌特異的抗原結合ドメイン、及び
(2)T細胞受容体複合体結合ドメイン
を含む第2の抗原結合分子とを組み合わせてなる、医薬組成物。
〔10〕第2の抗原結合分子が、FcRn結合ドメインをさらに含む抗原結合分子である、〔9〕に記載の医薬組成物。
〔11〕FcRn結合ドメインが、Fcγ受容体に対する結合活性が低下している、抗体のFc領域である、〔10〕に記載の医薬組成物。
〔12〕T細胞受容体複合体結合ドメインがT細胞受容体結合ドメインである、〔9〕から〔11〕のいずれかに記載の医薬組成物。
〔13〕T細胞受容体複合体結合ドメインがCD3結合ドメインである、〔9〕から〔11〕のいずれかに記載の医薬組成物。
〔14〕第2の抗原結合分子が二重特異性抗体である、〔9〕から〔13〕のいずれかに記載の医薬組成物。
〔15〕第1の抗原結合分子と第2の抗原結合分子が配合されている、〔9〕から〔14〕のいずれかに記載の医薬組成物。
〔16〕第1の抗原結合分子と第2の抗原結合分子が併用される、〔9〕から〔14〕のいずれかに記載の医薬組成物。
〔17〕第1の抗原結合分子と第2の抗原結合分子とが同時に投与される、〔9〕から〔14〕のいずれかに記載の医薬組成物。
〔18〕第1の抗原結合分子と第2の抗原結合分子とが別々に投与される、〔9〕から〔14〕のいずれかに記載の医薬組成物。
〔19〕細胞傷害を誘導する組成物である、〔9〕から〔18〕のいずれかに記載の医薬組成物。
〔20〕癌治療用の組成物である、〔9〕から〔18〕のいずれかに記載の医薬組成物。
〔21〕下記のドメイン:
(1)癌特異的抗原結合ドメイン、及び
(2)腫瘍壊死因子(TNF)スーパーファミリー結合ドメイン又は腫瘍壊死因子(TNF)受容体スーパーファミリー結合ドメイン
を含む第1の抗原結合分子を有効成分として含む、
下記のドメイン:
(1)癌特異的抗原結合ドメイン、及び
(2)T細胞受容体複合体結合ドメイン
を含む第2の抗原結合分子と併用するための医薬組成物。
〔22〕細胞傷害を誘導する組成物である、〔21〕に記載の医薬組成物。
〔23〕癌治療用の組成物である、〔21〕に記載の医薬組成物。
〔24〕第1の抗原結合分子及び/又は第2の抗原結合分子が、FcRn結合ドメインをさらに含む抗原結合分子である、〔21〕から〔23〕のいずれかに記載の医薬組成物。
〔25〕FcRn結合ドメインが、Fcγ受容体に対する結合活性が低下している、抗体のFc領域である、〔24〕に記載の医薬組成物。
〔26〕TNFスーパーファミリー結合ドメイン又はTNF受容体スーパーファミリー結合ドメインが、CD137結合ドメイン、またはCD40結合ドメインである、〔21〕から〔25〕のいずれかに記載の医薬組成物。
〔27〕T細胞受容体複合体結合ドメインがT細胞受容体結合ドメインである、〔21〕から〔26〕のいずれかに記載の医薬組成物。
〔28〕T細胞受容体複合体結合ドメインがCD3結合ドメインである、〔21〕から〔26〕のいずれかに記載の医薬組成物。
〔29〕第1の抗原結合分子及び/又は第2の抗原結合分子が二重特異性抗体である、〔21〕から〔28〕のいずれかに記載の医薬組成物。
〔30〕第2の抗原結合分子と同時に投与される、〔21〕から〔29〕のいずれかに記載の医薬組成物。
〔31〕第2の抗原結合分子と別々に投与される、〔21〕から〔29〕のいずれかに記載の医薬組成物。
〔32〕下記のドメイン:
(1)癌特異的抗原結合ドメイン、及び
(2)T細胞受容体複合体結合ドメイン
を含む第2の抗原結合分子を有効成分として含む、
下記のドメイン:
(1)癌特異的抗原結合ドメイン、及び
(2)腫瘍壊死因子(TNF)スーパーファミリー結合ドメイン又は腫瘍壊死因子(TNF)受容体スーパーファミリー結合ドメイン
を含む第1の抗原結合分子と併用するための医薬組成物。
〔33〕細胞傷害を誘導する組成物である、〔32〕に記載の医薬組成物。
〔34〕癌治療用の組成物である、〔32〕に記載の医薬組成物。
〔35〕第1の抗原結合分子及び/又は第2の抗原結合分子が、FcRn結合ドメインをさらに含む抗原結合分子である、〔32〕から〔34〕のいずれかに記載の医薬組成物。
〔36〕FcRn結合ドメインが、Fcγ受容体に対する結合活性が低下している、抗体のFc領域である、〔35〕に記載の医薬組成物。
〔37〕T細胞受容体複合体結合ドメインがT細胞受容体結合ドメインである、〔32〕から〔36〕のいずれかに記載の医薬組成物。
〔38〕T細胞受容体複合体結合ドメインがCD3結合ドメインである、〔32〕から〔36〕のいずれかに記載の医薬組成物。
〔39〕TNFスーパーファミリー結合ドメイン又はTNF受容体スーパーファミリー結合ドメインが、CD137結合ドメイン、またはCD40結合ドメインである、〔32〕から〔38〕のいずれかに記載の医薬組成物。
〔40〕第1の抗原結合分子及び/又は第2の抗原結合分子が二重特異性抗体である、〔32〕から〔39〕のいずれかに記載の医薬組成物。
〔41〕第1の抗原結合分子と同時に投与される、〔32〕から〔40〕のいずれかに記載の医薬組成物。
〔42〕第1の抗原結合分子と別々に投与される、〔32〕から〔40〕のいずれかに記載の医薬組成物。
〔43〕前記〔1〕~〔5〕のいずれかに記載の抗原結合分子または前記〔6〕~〔42〕のいずれかに記載の医薬組成物を投与する工程を含む、細胞障害を誘導する、細胞増殖を抑制する、癌細胞又は癌細胞を含む腫瘍組織に対する免疫を活性化する、または癌を治療もしくは予防する方法。
〔44〕細胞障害の誘導、細胞増殖の抑制、癌細胞又は癌細胞を含む組織に対する免疫の活性化またはがんの治療もしくは予防において使用するための前記〔1〕~〔5〕のいずれかに記載の抗原結合分子または前記〔6〕~〔42〕のいずれかに記載の医薬組成物。
〔45〕前記〔6〕~〔42〕のいずれかに記載の医薬組成物の製造における、前記〔1〕~〔5〕のいずれかに記載の抗原結合分子の使用。
〔46〕前記〔1〕~〔5〕のいずれかに記載の抗原結合分子を使用する工程を含む、前記〔6〕~〔42〕のいずれかに記載の医薬組成物を製造する方法。
本発明における「抗原結合分子」とは、本発明の「結合ドメイン」を含む分子であれば特に限定されず、さらに、5アミノ酸程度以上の長さを有するペプチドやタンパク質が含まれていてもよい。生物由来のペプチドやタンパク質に限定されず、例えば、人工的に設計された配列からなるポリペプチドであってもよい。また、天然ポリペプチド、あるいは合成ポリペプチド、組換えポリペプチド等のいずれであってもよい。
(a)L234F、L235E、P331S、
(b)C226S、C229S、P238S、
(c)C226S、C229S、
(d)C226S、C229S、E233P、L234V、L235A
が施されているFc領域、又は、231位から238位のアミノ酸配列が欠失したFc領域を有する抗原結合分子も適宜使用され得る。
(e)H268Q、V309L、A330S、P331S
(f)V234A
(g)G237A
(h)V234A、G237A
(i)A235E、G237A
(j)V234A、A235E、G237A
が施されているFc領域を有する抗原結合分子も適宜使用され得る。
(k)F241A
(l)D265A
(m)V264A
が施されているFc領域を有する抗原結合分子も適宜使用され得る。
(n)L235A、G237A、E318A
(o)L235E
(p)F234A、L235A
が施されているFc領域を有する抗原結合分子も適宜使用され得る。
[1] 重鎖可変領域として配列番号66に記載のアミノ酸配列、及び軽鎖可変領域として配列番号85に記載のアミノ酸配列を有する抗体;
[2] 重鎖可変領域として配列番号67に記載のアミノ酸配列、及び軽鎖可変領域として配列番号86に記載のアミノ酸配列を有する抗体;
[3] 重鎖可変領域として配列番号70に記載のアミノ酸配列、及び軽鎖可変領域として配列番号89に記載のアミノ酸配列を有する抗体;
[4] 重鎖可変領域として配列番号76に記載のアミノ酸配列、及び軽鎖可変領域として配列番号95に記載のアミノ酸配列を有する抗体;
[5] 重鎖可変領域として配列番号77に記載のアミノ酸配列、及び軽鎖可変領域として配列番号96に記載のアミノ酸配列を有する抗体;
[6] 重鎖可変領域として配列番号78に記載のアミノ酸配列、及び軽鎖可変領域として配列番号97に記載のアミノ酸配列を有する抗体;
[7] [1]~[6]いずれかに記載の抗体であって、重鎖定常領域として配列番号99に記載のアミノ酸配列、及び軽鎖定常領域として配列番号59に記載のアミノ酸配列又は配列番号60に記載のアミノ酸配列を有する抗体;
[8] [1]~[7]いずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体;
[9] [1]~[7]いずれかに記載の抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体。
さらには、CD137タンパク質中のDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGCの配列(配列番号108)を有する領域を認識する抗体を挙げることができる。
[i] ヒトCD137結合ドメインとして、配列番号122に記載のアミノ酸配列(重鎖可変領域)、及び配列番号123に記載のアミノ酸配列(軽鎖可変領域)を有する二重特異性抗体;
[ii] ヒトCD137結合ドメインとして、配列番号124に記載のアミノ酸配列(重鎖可変領域)、及び配列番号82に記載のアミノ酸配列(軽鎖可変領域)を有する二重特異性抗体;
[iii] ヒトCD137結合ドメインとして、配列番号125に記載のアミノ酸配列(重鎖可変領域)、及び配列番号84に記載のアミノ酸配列(軽鎖可変領域)を有する二重特異性抗体;
[iv] [i]~[iii]いずれかに記載の二重特異性抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体。
癌特異的抗原結合ドメインに含まれる重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、標的とする癌抗原に応じて、当業者が該癌抗原に結合する重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列を適宜選択することができる。
また、エピトープの空間コンホメーションを決定する方法としては、例えば、X線結晶学および二次元核磁気共鳴が含まれる(Methods in Molecular Biology, G.E. Morris監修, Vol. 66, Epitope Mapping Protocols(1996)を参照)。
さらに好ましくは、例えば、ヒトCD137タンパク質中のLQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAECの配列(配列番号111)を有する領域、又はLQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCの配列(配列番号106)を有する領域を認識する二重特異性抗体を挙げることができる。
癌特異的抗原結合ドメインに含まれる重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、標的とする癌抗原に応じて、当業者が該癌抗原に結合する重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列を適宜選択することができる。
抗体の抗原結合活性の測定には公知の手段を使用することができる(Antibodies A Laboratory Manual.Ed Harlow,David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory,1988)。例えば、ELISA(酵素結合免疫吸着検定法)、EIA(酵素免疫測定法)、RIA(放射免疫測定法)、FACS、ALPHAスクリーン(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)や表面プラズモン共鳴(SPR)現象を利用したBIACORE法あるいは蛍光免疫法などを用いることができる。更に、細胞に発現する抗原に対する抗体の結合活性を測定する手法としては、例えば、前記Antibodies A Laboratory Manual中の359-420ページに記載されている方法が挙げられる。
本明細書において、抗体とは、天然のものであるかまたは部分的もしくは完全合成により製造された免疫グロブリンをいう。抗体はそれが天然に存在する血漿や血清等の天然資源や抗体を産生するハイブリドーマ細胞の培養上清から単離され得るし、または遺伝子組換え等の手法を用いることによって部分的にもしくは完全に合成され得る。抗体の例としては免疫グロブリンのアイソタイプおよびそれらのアイソタイプのサブクラスが好適に挙げられる。ヒトの免疫グロブリンとして、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgMの9種類のクラス(アイソタイプ)が知られている。本発明の抗体には、これらのアイソタイプのうちIgG1、IgG2、IgG3、IgG4が含まれ得る。
-膜蛋白質の構造を維持して免疫刺激が与えられ得る
-免疫抗原を精製する必要が無い
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは通常の培養液中で継代培養され得る。また、該ハイブリドーマは液体窒素中で長期にわたって保存され得る。
-グアニジン超遠心法(Biochemistry (1979) 18 (24), 5294-5299)
-AGPC法(Anal. Biochem. (1987) 162 (1), 156-159)
(1)ハイブリドーマから得られたcDNAによってコードされるV領域を含む抗体を所望の抗原発現細胞に接触させる工程、
(2)該抗原発現細胞と抗体との結合を検出する工程、および
(3)該抗原発現細胞に結合する抗体を選択する工程。
(1)哺乳類細胞、:CHO、COS、ミエローマ、BHK(baby hamster kidney)、Hela、Veroなど
(2)両生類細胞:アフリカツメガエル卵母細胞など
(3)昆虫細胞:sf9、sf21、Tn5など
-酵母:サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces serevisiae)などのサッカロミセス(Saccharomyces)属、メタノール資化酵母(Pichia pastoris)などのPichia属
-糸状菌:アスペスギルス・ニガー(Aspergillus niger)などのアスペルギルス(Aspergillus)属
FACSCantoTM II
FACSAriaTM
FACSArrayTM
FACSVantageTM SE
FACSCaliburTM (いずれもBD Biosciences社の商品名)
EPICS ALTRA HyPerSort
Cytomics FC 500
EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC
Cell Lab Quanta / Cell Lab Quanta SC(いずれもBeckman Coulter社の商品名)
[VL]リンカー[VH]リンカー[VH]リンカー[VL]
[VH]リンカー[VL]リンカー[VL]リンカー[VH]
[VH]リンカー[VH]リンカー[VL]リンカー[VL]
[VL]リンカー[VL]リンカー[VH]リンカー[VH]
[VL]リンカー[VH]リンカー[VL]リンカー[VH]
Ser
Gly・Ser
Gly・Gly・Ser
Ser・Gly・Gly
Gly・Gly・Gly・Ser(配列番号:20)
Ser・Gly・Gly・Gly(配列番号:21)
Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(配列番号:22)
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly(配列番号:23)
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(配列番号:24)
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly(配列番号:25)
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(配列番号:26)
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly(配列番号:27)
(Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(配列番号:22))n
(Ser・Gly・Gly・Gly・Gly(配列番号:23))n
[nは1以上の整数である]等を挙げることができる。但し、ペプチドリンカーの長さや配列は目的に応じて当業者が適宜選択することができる。
(a)グルタミン酸(E)、アスパラギン酸(D)、
(b)リジン(K)、アルギニン(R)、ヒスチジン(H)。
(1)癌特異的抗原結合ドメイン、及び
(2)腫瘍壊死因子(TNF)スーパーファミリー結合ドメイン、又は、腫瘍壊死因子(TNF)受容体スーパーファミリー結合ドメイン
を含むものであればよく、その構造は限定されない。第1の抗原結合分子は、これら2つの結合ドメインを含むことにより、TNFスーパーファミリー又はTNF受容体スーパーファミリーに属する分子を発現する細胞であって、癌特異的抗原を発現する細胞又は当該細胞を含む腫瘍組織に含まれる細胞を特異的に活性化し、癌特異的抗原を発現する当該細胞又は当該細胞を含む腫瘍組織に対して優れた(特異的な)細胞傷害作用を誘導することが可能となる。本発明の癌特異的抗原結合ドメイン、TNFスーパーファミリー結合ドメイン及びTNF受容体スーパーファミリー結合ドメインは、それぞれ、上述の癌特異的抗原あるいは、TNFスーパーファミリー又はTNF受容体スーパーファミリーに属する抗原から適宜選択することができる。これらの結合ドメインは、ペプチド結合で直接連結することもできるし、リンカーを介して結合することもできる。
例えば、(1)癌特異的抗原結合ドメインとしてF(ab')2、(2)TNFスーパーファミリー結合ドメイン又はTNF受容体スーパーファミリー結合ドメインとしてF(ab')2を用い、(3)FcRn結合ドメインとして、Fcγ受容体に対する結合活性が低下しているFc領域を含むドメインを用いた場合に、(1)と(2)に記載された抗原結合ドメインと(3)に記載されたFc領域を含むドメインとをペプチド結合で直接連結したときは、連結されたポリペプチドは抗体の構造を形成する。そのような抗体を作製するためには前述のハイブリドーマの培養液から精製する他、当該抗体を構成するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを安定に保持している所望の宿主細胞の培養液から当該抗体を精製することもできる。
(1)癌特異的抗原結合ドメイン、及び
(2)T細胞受容体複合体結合ドメイン
を含むものであればよく、第1の抗原結合分子と同様にその構造は限定されず、第1の抗原結合分子と同様な方法で取得することが可能である。また、第2の抗原結合分子は、癌特異的抗原結合ドメインとT細胞受容体複合体結合ドメインを含んでいれば、その構造は第1の抗原結合分子と同一である必要もない。また、第1の抗原結合分子の癌特異的抗原結合ドメインが結合する癌特異的抗原と第2の抗原結合分子の癌特異的抗原結合ドメインが結合する癌特異的抗原とは、同一の抗原であっても異なる抗原であってもよいが、同一の癌特異的抗原であることが好ましい。癌特異的抗原が同一である場合、第1の抗原結合分子と第2の抗原結合分子が結合するエピトープは同一であっても異なるものであってもよい。これら第1の抗原結合分子と第2の抗原結合分子を組み合わせて用いることで、優れた細胞傷害活性を得ることができる。第2の抗原結合ドメインに含まれる癌特異的抗原結合ドメイン及びT細胞受容体複合体結合ドメインは、それぞれ、上述の癌特異的抗原あるいはT細胞受容体複合体に属する抗原から適宜選択することができる。
別の観点においては、本発明は、上述の第1の抗原結合分子を有効成分として含む医薬組成物を提供する。また、本発明は、当該抗原結合分子を有効成分として含有する、細胞傷害を誘導する医薬組成物(細胞傷害誘導治療剤)、細胞増殖抑制剤および抗癌剤に関する。本発明の医薬組成物は、癌治療剤または癌予防剤として用いることもできる。本発明の細胞傷害誘導治療剤、細胞増殖抑制剤および抗癌剤は、癌を罹患している対象または再発する可能性がある対象に投与されることが好ましい。
抗体の可変領域のH鎖およびL鎖の塩基配列をコードする全長の遺伝子の合成は、Assemble PCR等を用いて、当業者公知の方法で作製した。アミノ酸置換の導入はPCR等を用いて当業者公知の方法で行った。得られたプラスミド断片を動物細胞発現ベクターに挿入し、H鎖発現ベクターおよびL鎖発現ベクターを作製した。得られた発現ベクターの塩基配列は当業者公知の方法で決定した。作製したプラスミドをヒト胎児腎癌細胞由来HEK293H株(Invitrogen社)、またはFreeStyle293細胞(Invitrogen社)に一過性に導入し、抗体の発現を行った。得られた培養上清を回収した後、0.22μmフィルターMILLEX(R)-GV(Millipore)または0.45μmフィルターMILLEX(R)-GV(Millipore)を通して培養上清を得た。得られた培養上清から、rProtein A Sepharose Fast Flow(GEヘルスケア)またはProtein G Sepharose 4 Fast Flow(GEヘルスケア)を用いて当業者公知の方法で抗体を精製した。精製抗体濃度は、分光光度計を用いて280 nmでの吸光度を測定し、得られた値からPACE等の方法により算出された吸光係数を用いて抗体濃度を算出した(Protein Science 1995 ; 4 : 2411-2423)。
マウスFcγRの細胞外ドメインを以下の方法で調製した。まずFcγRの細胞外ドメインの遺伝子の合成を当業者公知の方法で実施した。その際、各FcγRの配列はNCBIに登録されている情報に基づき作製した。具体的には、mFcγRIについてはNCBI Reference Sequence: NP_034316.1、mFcγRIIについてはNCBI Reference Sequence: NP_034317.1、mFcγRIIIについてはNCBI Reference Sequence: NP_034318.2、mFcγRIVについてはNCBI Reference Sequence: NP_653142.2の配列に基づいて作製し、C末端にHisタグを付加した。得られた遺伝子断片を動物細胞発現ベクターに挿入し、発現ベクターを作製した。作製した発現ベクターをヒト胎児腎癌細胞由来FreeStyle293細胞(Invitrogen社)に一過性に導入し、目的タンパク質の発現を行った。得られた培養上清を回収した後、0.22μmフィルターを通して培養上清を得た。得られた培養上清は原則として次の4ステップで精製した。第1ステップはイオン交換カラムクロマトグラフィー、第2ステップはHisタグに対するアフィニティカラムクロマトグラフィー(HisTrap HP)、第3ステップはゲルろ過カラムクロマトグラフィー(Superdex200)、第4ステップは無菌ろ過を実施した。第1ステップのイオン交換カラムクロマトグラフィーについて、mFcγRIはQ Sepharose HP、mFcγRIIおよびmFcγRIVはSP Sepharose FF、mFcγRIIIはSP Sepharose HPを用いた。また第3ステップ以降で用いた溶媒はD-PBS(-)としたが、mFcγRIIIについては0.1M Arginineを含むD-PBS(-)とした。精製したタンパク質については分光光度計を用いて280 nmでの吸光度を測定し、得られた値からPACE等の方法により算出された吸光係数を用いて精製タンパク質の濃度を算出した(Protein Science 1995 ; 4 : 2411-2423)。Biacore T100(GEヘルスケア)、Biacore T200(GEヘルスケア)、Biacore A100、Biacore 4000を用いて、各改変抗体と上記で調製したFcγレセプターとの相互作用解析を行った。ランニングバッファーにはHBS-EP+(GEヘルスケア)を用い、測定温度は25℃とした。Series S Sensor Chip CM5(GEヘルスケア)またはSeries S Sensor Chip CM4(GEヘルスケア)に、アミンカップリング法によりProtein L(ACTIGENまたはBioVision)を固定化したチップを用いた。これらのセンサーチップに目的の抗体をキャプチャーさせ、ランニングバッファーで希釈したmFcγRを相互作用させ、抗体に対する結合量を測定し、抗体間で比較した。ただし、mFcγRの結合量はキャプチャーした抗体の量に依存するため、各抗体のキャプチャー量でmFcγRの結合量を除した補正値で比較した。また、10 mM glycine-HCl、pH1.5を反応させることで、センサーチップにキャプチャーされた抗体を洗浄し、センサーチップを再生して繰り返し用いた。また、各改変抗体のFcγRに対するKD値を算出するための速度論的な解析は以下の方法にしたがって実施した。まず、上記のセンサーチップに目的の抗体をキャプチャーさせ、ランニングバッファーで希釈したmFcγRを相互作用させ、得られたセンサーグラムに対してBiacore Evaluation Softwareにより測定結果を1:1 Langmuir binding modelでglobal fittingさせることで結合速度定数ka(L/mol/s)、解離速度定数kd(1/s)を算出し、その値から解離定数KD(mol/L)を算出した。
実験動物はC57BL/6 雌性マウス(日本チャールス・リバー株式会社)、あるいはBalb/c雌性マウス(日本チャールス・リバー株式会社)を用い、動物飼育室で一定の条件(温度:20~26℃、明暗:12時間の明暗周期)で、飼料と飲水の自由摂取下で飼育した。マウス肺癌細胞株であるLLC(ATCC No. CRL-1642)の染色体に当業者公知の方法によりヒトGPC3遺伝子を組み込み、ヒトGPC3を高発現する細胞株LLC-GPC3を得た。ヒトGPC3発現レベル(2.3x105/cell)は、QIFIキット(Dako社)を用いて、製造元推奨の方法によって決定した。同様に、マウス大腸癌細胞株であるCT-26(ATCC No. CRL-2638)に対してもヒトGPC3遺伝子を組み込み、高発現株CT26-GPC3(発現レベル:3.1x105/cell)を得た。これら組換え細胞株はATCC推奨の培地にヒトGPC3遺伝子保持のためにジェネティシン(GIBCO)をLLC-GPC3に対しては400μg/ml、CT26-GPC3に対しては200μg/ml添加して培養した。培養後、これらの細胞を2.5g/Lトリプシン-1mM EDTA(nacalai tesque社)にて剥がした後に各実験に使用した。
1-1.抗マウスCD137マウス抗体の作製とmFcγRへの結合評価
抗体H鎖可変領域としてはWO2005/017148に開示されているマウスCD137に対する可変領域である1D8VH(配列番号:28)を、抗体H鎖定常領域としては天然型マウスIgG1のH鎖定常領域を有する1D8VH-mIgG1(配列番号:29)を、参考例1の方法に従って作製した。また、1D8VH-mIgG1に対し、WO2012/133782に記載されているFcγRへの結合を排除する改変であるEUナンバリング235番目のProをLysに置換する改変、およびEUナンバリング239番目のSerをLysに置換する改変を導入した1D8VH-mF18(配列番号:30)を作製した。さらに、mFcgRIIに対する結合を増強する改変(T230E、V231P、P232N、S238E、S239D、N324D)を1D8VH-mIgG1に対して導入した1D8VH-MB492(配列番号:31)を作製した。抗体L鎖可変領域としてはWO2005/017148に開示されている1D8VLを、L鎖定常領域としてはマウスκ鎖の定常領域をもつ1D8VL-mk0(配列番号:32)を用い、参考例1の方法に従って発現、精製することで、1D8VH-mIgG1/1D8VL-mk0、1D8VH-mF18/1D8VL-mk0、1D8VH-MB492/1D8VL-mk0を得た。これらの抗体は以後簡略化のために1D8-mIgG1、1D8-mF18、1D8-MB492と記載する。
ナイーブなC57BL/6雌性マウスから脾臓を採取し、FBS 10%を含むRPMI1640培地に0.5 μg/ml イオノマイシン及び10 ng/ml PHORBOL 12-MYRISTATE 13-ACETATE (PMA)を添加した培地で細胞を懸濁し、2×105 細胞/100μl/ウェルの密度で96-ウェルプレートへ播種した。そこへ抗マウスCD137抗体を3μg/mlの濃度で添加し、37℃、5% CO2の条件下で3日間培養した。培養後の上清を回収し、含まれるマウスIFN-γ濃度をELISAにより測定することで脾臓由来T細胞の活性化を評価した。ELISAはキット製造業者(PeproTech社)の指示に従い実施した。
2-1.癌抗原とCD137の二重特異性抗体による癌抗原依存的なアゴニスト抗体のコンセプト
実施例1の検討から、通常の抗CD137抗体によるアゴニスト活性は全身的に起こるため、抗腫瘍効果と正常組織での副作用(T細胞の活性化等)を分離することができないと考えられた。そこで、癌抗原とCD137の二重特異性抗体を用いることで、CD137を発現しているT細胞と癌抗原を発現している細胞(癌細胞等)が当該二重特異性抗体によって架橋されることにより、癌抗原が存在している癌組織においてのみ、抗CD137抗体によるアゴニスト活性が発揮されるのではないかと考えた(図3)。
ヒトIgG1、IgG2、IgG4の定常領域を有する3種類の抗ヒトGPC3/抗マウスCD137二重特異性抗体を作製した。これらの分子では、H鎖とL鎖の会合を制御し、効率良く二重特異性抗体を得るため、Schaeferらによって報告されているCrossMab技術を用いた(Schaefer, Proc. Natl. Acad. Sci., 2011, 108, 11187-11192)。すなわち、これらの分子はWO2012/073985に記載されているヒトGPC3に対するFabのVHドメインとVLドメインが置換された分子となっている。また、抗体H鎖定常領域には、ヘテロ会合を促進するために、Knobs-into-Holes技術を用いた。Knobs-into-Holes技術は、一方のH鎖のCH3領域に存在するアミノ酸側鎖をより大きい側鎖(Knob;突起)に置換し、もう一方のH鎖のCH3領域に存在するアミノ酸側鎖をより小さい側鎖(Hole;空隙)に置換することで突起が空隙内に配置されるようにしてH鎖のヘテロ二量化を促進し、目的のヘテロ二量化抗体を効率的に取得できる技術である(Burmeister, Nature, 1994, 372, 379-383)。以降、Knob改変が導入された定常領域をKn、Hole改変が導入された定常領域をHlと示す。また、FcγRに対する結合を減弱させる改変として、WO2011/108714に記載されている改変を用いた。具体的には、IgG1型、IgG4型に対しては、EUナンバリング234番目、235番目、297番目をAlaに置換する改変を導入した。また、IgG2型に対しては、234番目、237番目、297番目をAlaに置換する改変を導入した。抗体H鎖のC末端からはEUナンバリング446番目のGlyおよび447番目のLysを除去し、そこに対してさらに抗体発現後の精製を容易にするため、抗ヒトGPC3側のH鎖のC末端にヒスチジンタグを、抗マウスCD137側のH鎖のC末端にFLAGタグを付加した。以上の改変を導入した抗ヒトGPC3側H鎖として、GC33(2)H-G1dKnHS(配列番号:39)、GC33(2)H-G2dmKnHS(配列番号:40)、GC33(2)H-G4dKnHS(配列番号:41)を作製した。また、抗マウスCD137側のH鎖として、1D8VH-G1dHlFS(配列番号:42)、1D8VH-G2dmHlFS(配列番号:43)、1D8VH-G4dHlFS(配列番号:44)を作製した。ここで、IgG2型の定常領域を有するGC33(2)H-G2dmKnHSおよび1D8VH-G2dmHlFSは、CH1ドメインおよびヒンジ領域の前半部分のみIgG1型となっている。具体的には、天然型ヒトIgG2のCH1の配列と比較して、EUナンバリング131番目がSerに、133番目がLysに、137番目、138番目がGlyとなっており、ヒンジ領域は、219番目がSerとなっている。抗体L鎖としては、抗ヒトGPC3側としてGC33(2)L-k0(配列番号:45)を、抗マウスCD137側として1D8VL-k0(配列番号:46)を共通して用いた。これらの抗体を表3の組み合わせで発現し、目的の二重特異性抗体を得た。なお、これらの抗体の発現は1-1に従いFreeStyle293細胞 (Invitrogen社)で一過性発現させた。得られた培養上清をAnti FLAG M2カラム(Sigma社)に添加し、当該カラムを洗浄した後、0.1 mg/mL FLAGペプチド(Sigma社)による溶出を実施した。抗体を含む画分をHisTrap HPカラム(GE Healthcare社)に添加し、当該カラムを洗浄した後、イミダゾールの濃度勾配による溶出を実施した。抗体を含む画分を限外ろ過膜で濃縮した後、濃縮液をSuperdex 200カラム(GE Healthcare社)に添加し、その溶出液の単量体の抗体のみを回収することにより精製抗体を得た。
マウスT細胞株CTLL-2(ATCC Cat. No. TIB-214)を、FBS 10%を含むRPMI1640培地に0.5μg/ml イオノマイシン及び10ng/ml PMA を添加した培地で懸濁し、2×104 細胞/100μl/ウェルの密度で96-ウェルプレートへ播種した。そこへ、ヒトGPC3を発現するマウス肺癌細胞株LLC-GPC3(参考例3)を同じ培地にて懸濁し、2×104 細胞/100μl/ウェルの密度で96-ウェルプレートへ播種した。さらには、CTLL-2とLLC-GPC3をそれぞれ同細胞数含む懸濁液を調製し4×104 細胞/100μl/ウェルの密度で96-ウェルプレートへ播種した。そこへFcγRへの結合を極めて減弱させた抗ヒトGPC3/抗マウスCD137二重特異性ヒトIgG1型抗体(GPC3 ERY22-1D8)、或いは、抗ヒトGPC3単一特異性ヒトIgG型抗体(GC33(2)H2-G1dS及びGC33(2)L2-k0からなるGC33(2)-hG1S)を5μg/mlの濃度で添加し、37℃、5% CO2の条件下で24時間培養した。培養後の上清を回収し、含まれるマウスIFN-γ濃度をELISAにより測定することでCTLL-2の活性化を評価した。ELISAはキット製造業者(PeproTech社)の指示に従い実施した。
3-1.コンセプト
抗CD137アゴニスト抗体はT細胞を活性化することで抗腫瘍効果を発揮することが知られているが、一方で、抗CD137アゴニスト抗体は単剤ではその効果が低いことが知られている。そこで、抗癌抗原/抗CD137二重特異性抗体によるT細胞の活性化能力を増強し、より強い抗腫瘍効果を発揮するために、同じくT細胞を活性化する薬剤と併用することを検討した。抗癌抗原/抗CD3二重特異性抗体は、T細胞を癌抗原にリダイレクトし、T細胞によって癌細胞に対して細胞障害活性を発揮することが可能であるが、一方で、抗癌抗原/抗CD3二重特異性抗体も単剤では必ずしもその抗腫瘍効果は高くない。そこで、抗癌抗原/抗CD137二重特異性抗体と抗癌抗原/抗CD3二重特異性抗体を併用することによって、相乗的なT細胞活性化能力と抗腫瘍効果を発揮できないかを検討した。
抗ヒトGPC3/抗マウスCD137二重特異性抗体であるGPC3 ERY22-3-1D8、および抗ヒトGPC3/抗マウスCD3二重特異性抗体GPC3 ERY22-3-2C11を作製した。GPC3 ERY22-3-1D8は、実施例2-1で作製した二重特異性抗体GPC3 ERY22-1D8の定常領域に対して、より精製を簡便化するための当業者公知の改変を加えたものである。具体的には、抗ヒトGPC3側H鎖定常領域遺伝子GC33(2)H-G1dKnHSに対して精製を簡便化するための当業者公知の改変であるH435R改変を加えたGC33(2)H-G1dKnHSG3(配列番号:48)を作製した。またこれに伴い、抗マウスCD137側H鎖定常領域遺伝子1D8VH-G1dHlFSからFLAGタグを除去した1D8VH-G1dHlS(配列番号:47)を作製した。また、抗マウスCD3抗体のH鎖可変領域として2C11VH(配列番号:49)の配列を用い、2C11VH-G1dHlS(配列番号:50)を作製した。抗体L鎖としては、抗ヒトGPC3側としてGC33(2)L-k0、抗マウスCD137側として1D8VL-k0、抗マウスCD3側として2C11VL-k0(配列番号:51)を用い、これらの抗体を表4の組み合わせで発現し、目的の二重特異性抗体を得た。なお、これらの抗体の発現は参考例1に従いFreeStyle293細胞で一過性発現させた。得られた培養上清をMabSelect SuReカラム(GE Healthcare社)に添加し、当該カラムを洗浄した後、50 mM酢酸による溶出を実施した。抗体を含む画分をHisTrap HPカラム(GE Healthcare社)もしくはNi Sepharose FFカラム(GE Healthcare社)に添加し、当該カラムを洗浄した後、イミダゾールによる溶出を実施した。抗体を含む画分を限外ろ過膜で濃縮した後、濃縮液をSuperdex 200カラム(GE Healthcare社)に添加し、その溶出液の単量体の抗体のみを回収することにより精製抗体を得た。
ナイーブなC57BL/6雌性マウスから脾臓を採取し、FBS 10%を含むRPMI1640培地に10ng/ml マウスIL2を添加した培地で細胞を4×106 細胞/mlの密度で懸濁した。また、ヒトGPC3を発現するマウス大腸癌細胞株CT26-GPC3(参考例3)を同じ培地にて4×105細胞/mlの密度で懸濁した。両細胞懸濁液を等量ずつ混合し、100μl/ウェルで96-ウェルプレートへ播種した。ウェルの一部にはさらに0.5μg/ml イオノマイシン及び10 ng/ml PMAを添加した。そこへFcγRへの結合を極めて減弱させた抗ヒトGPC3/抗マウスCD137二重特異性抗体(GPC3 ERY22-1D8)およびFcγRへの結合を極めて減弱させた抗ヒトGPC3/抗マウスCD3二重特異性抗体(GPC3 ERY22-2C11:GPC3 ERY22-3-2C11からH435R改変を元に戻したもの)を3 μg/mlの濃度で添加し、37℃、5% CO2の条件下で24時間培養した。培養後の上清を回収し、含まれるマウスIFN-γ濃度をELISAにより測定することで脾臓細胞に含まれるT細胞の活性化を評価した。ELISAはキット製造業者(PeproTech社)の指示に従い実施した。
4-1.抗ヒトGPC3/抗マウスCD137二重特異性抗体と抗マウスCD137抗体との薬効比較
ヒトGPC3を発現する組換えマウス大腸癌細胞株CT26-GPC3(参考例3)をHanks' Balanced Salt Solution (HBSS)にて5 x 106 細胞/mLに調製し、BALB/cマウス(メス、7週齢、日本チャールス・リバー社)の腹部皮下へ200μL(1 x 106細胞)移植した。無作為に5匹ずつ5群に群分けした後、移植3日後、7日後、10日後、17日後に尾静脈注射により抗体を投与した。抗ヒトGPC3/マウスCD137二重特異性抗体(GPC3 ERY22-3-1D8)は溶媒(150 mM NaCl、20 mM His-HCl を含む水溶液(pH 6.0)を0.22 μm フィルターを通したもの)にて0.75 mg/mL、0.15 mg/mLに調製して10 mL/kgで投与した(各々7.5 mg/kg、1.5 mg/kg)。抗マウスCD137抗体(1D8-MB492)は溶媒にて1.5 mg/mL、0.3 mg/mLに調製して10 mL/kgで投与した(各々15 mg/kg、3 mg/kg)。腫瘍増殖抑制率(%)は以下の式から算出した腫瘍体積により評価した。
腫瘍体積(mm3)=長径(mm) x 短径(mm)x 短径(mm)/2
腫瘍増殖抑制率(%)=[1 - (T - T0)/(C - C0)] × 100
T: 各群の各測定日の平均腫瘍体積
T0:各群の初回投与日の平均腫瘍体積
C: コントロール群の各測定日の平均腫瘍体積
C0:コントロール群の初回投与日の平均腫瘍体積
抗体投与薬効試験の終了時に麻酔下全採血により安楽死処置を実施後、血漿を分離した。血漿を用いてアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST;JSCC Transferable法)、アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT;JSCC Transferable法)、総ビリルビン(TBIL;酵素法)を、自動分析装置TBA-120FR(東芝メディカルシステムズ株式会社)を用いて測定した。剖検時に肝臓を採取し、10%中性緩衝ホルマリン液にて固定し、常法に従いパラフィン包埋薄切組織標本(ヘマトキシリン・エオジン(HE))を作製し、光学顕微鏡で病理組織学的に観察した。統計解析は、対照群に対するノンパラメトリックDunnett型多重比較検定により行った。
ヒトGPC3を発現するマウス肺癌細胞株LLC-GPC3(参考例3)をHBSSにて5 x 106 細胞/mLに懸濁し、C57BL/6Nマウス(メス、6週齢、日本チャールス・リバー社)の腹部皮下へ200 μL(1 x 106細胞)移植した。移植10日後に腫瘍体積と体重データをもとに偏りの無い様に5匹ずつ5群に群分けし、移植10日後、14日後、17日後に尾静脈注射により抗体を投与した。抗ヒトGPC3/マウスCD137二重特異性抗体(GPC3 ERY22-3-1D8)は溶媒(150 mM NaCl、20 mM His-HCl を含む水溶液(pH 6.0)を0.22μm フィルターを通したもの)にて0.5 mg/mLに調製して10 mL/kgで投与した(5 mg/kg)。抗ヒトGPC3/マウスCD3二重特異性抗体(GPC3 ERY22-3-2C11)は溶媒にて0.45 mg/mLに調製して10 mL/kgで投与した(4.5 mg/kg)。さらに2種類の抗体を併用投与する群を設定した。腫瘍増殖抑制率(%)は以下の式から算出した腫瘍体積により評価した。
腫瘍体積(mm3)=長径(mm) x 短径(mm)x 短径(mm)/2
腫瘍増殖抑制率(%)=[1 - (T - T0)/(C - C0)] × 100
T: 各群の各測定日の平均腫瘍体積
T0:各群の初回投与日の平均腫瘍体積
C: コントロール群の各測定日の平均腫瘍体積
C0:コントロール群の初回投与日の平均腫瘍体積
なお、薬効試験終了時に4-2と同様の手法にて血漿中の肝機能パラメータ(AST、ALT、およびTBIL)の解析と肝臓組織切片のHE染色による病理組織学的解析を行ったが、いずれの投与群においても肝障害を示唆する変化は認められなかった。
6-1.ナイーブヒト抗体ファージディスプレイライブラリの作製
ヒトPBMCから作製したポリA RNAや、市販されているヒトポリA RNAなどを鋳型として当業者に公知な方法に従い、互いに異なるヒト抗体配列のFabドメインを提示する複数のファージからなるヒト抗体ファージディスプレイライブラリが構築された。
実施例6-1で構築されたナイーブヒト抗体ファージディスプレイライブラリから、抗原に対する結合活性を示す抗体のスクリーニングが行われた。すなわち、ビーズにキャプチャーされた抗原に対して結合活性を示す抗体を提示しているファージが集められた。抗原としてビオチン化ヒトCD137が用いられた。具体的には、磁気ビーズに固定化された抗原を用いたパンニングが実施された。磁気ビーズとして、NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)もしくはStreptavidin coated beads(Dynabeads M-280 Streptavidin)が用いられた。
当業者公知の方法により、10種類の重鎖germline配列, 7種類の軽鎖germline配列を用いた合成ヒト抗体ファージディスプレイライブラリーを構築した。用いたGermline配列は、ヒトB細胞レパートリーにおける出現頻度、可変領域ファミリーでの物理化学的性質を指標にし、VH1-2, VH1-69, VH3-23, VH3-66, VH3-72, VH4-59, VH4-61, VH4-b, VH5-51, VH6-1, Vκ1-39, Vκ2-28, Vκ3-20, Vλ1-40, Vλ1-44, Vλ2-14, Vλ3-21を選択した。ヒトB細胞の抗体のレパートリーを模した形で、合成抗体ライブラリーの抗原認識部位に多様性を持たせた。
実施例6-3で構築された合成ヒト抗体ファージディスプレイライブラリから、抗原に対する結合活性を示す抗体のスクリーニングが行われた。すなわち、ビーズにキャプチャーされた抗原に対して結合活性を示す抗体を提示しているファージが集められた。抗原としてビオチン化ヒトCD137が用いられた。
上述の実施例で示されたPanning法により得られた大腸菌のシングルコロニーから、常法(Method Mol. Biol. (2002) 178, 133-145)に倣い、ファージ含有培養上清が回収された。
実施例6-5で示されたファージELISAの結果、ヒトCD137に対して特異的な結合活性があると判断されたクローンから、特異的なプライマー対(ナイーブヒト抗体ライブラリ:配列番号55及び56、合成ヒト抗体ライブラリ:配列番号57及び56)を用いて増幅された遺伝子の塩基配列が解析された。解析の結果、ヒトCD137に対して結合活性を有する複数種の抗体の配列が存在していることが確認された。
実施例6-6で取得された、ビオチン標識ヒトCD137に対する結合活性を有すると判断されたクローンのうち、ナイーブヒト抗体ライブラリ由来の5クローン(R1~R5)、及び合成ヒト抗体ライブラリ由来の14クローン(R6~R19)の重鎖および軽鎖の可変領域配列を、重鎖抗体定常領域(ヒトIgG1の定常領域を改変した配列;配列番号:58)または軽鎖kappa定常領域配列(配列番号:59)もしくはlambda定常領域配列(配列番号:60)と連結し、動物発現用プラスミドへそれぞれ挿入した。各クローンの重鎖および軽鎖の可変領域配列を表6に示した。
7-1.断片化ヒトCD137-Fc融合タンパク質の調製および抗体の調製
取得された抗ヒトCD137抗体のエピトープを解析するために、TNFRSFに共通する構造およびJ Exp Med. 2014 Jun 30;211(7):1433-48を参考にCRDと呼ばれるCys-Cysで形成される構造でドメインわけした断片化ヒトCD137と抗体のFc領域との融合タンパク質を作製した(表7)。断片化ヒトCD137-Fc融合タンパク質は、表7に示されているアミノ酸配列を含むように、全長のヒトCD137-Fc融合タンパク質(配列番号100)をコードするポリヌクレオチドからPCR法によって各遺伝子断片を取得し、当業者公知の方法で動物細胞発現用のプラスミドベクターに組み込んだ。断片化ヒトCD137-Fc融合タンパク質は、参考例1に記載の方法で抗体と同様に精製された。さらに、ELISAのコントロール(Control)として、WO2005/035584A1に記載の抗ヒトCD137抗体(Bと略す)のH鎖定常領域を、ヒトIgG1のH鎖定常領域のC末端のGlyおよびLysを除去した定常領域に改変した抗体(H鎖配列番号101、L鎖配列番号102)と、WO2012/145183A3に記載の抗ヒトCD137抗体(Mと略す)の定常領域をヒトFcγRIIBへの結合を増強した定常領域に改変した抗体(H鎖配列番号103、L鎖配列番号104)とをそれぞれコードする遺伝子を動物細胞発現用プラスミドベクターに組み込み、参考例1に記載の方法で抗体を取得した。
実施例7-1で調製された断片化ヒトCD137-Fc融合タンパク質を用いて、前述の実施例6で得られた抗体(重鎖定常領域は配列番号99を用いた)がヒトCD137のどの部位に結合するかELISA法で結合評価を行った。例えば、ドメイン1に結合する抗体の場合、ドメイン1を含む断片化ヒトCD137-Fc融合タンパク質とは結合するが、ドメイン1を含まない断片化ヒトCD137-Fc融合タンパク質とは結合しないと予想される。
断片化ヒトCD137-Fc融合タンパク質を、pH9.6に調製されている炭酸ナトリウム水溶液に2μg/mLとなるように希釈した。希釈された断片化ヒトCD137-Fc融合タンパク質は、50μLずつNunc MaxiSorp flat-bottom 96 well plate(Nunc)の各ウェルに添加された。4℃で1晩以上静置した後、室温に1時間静置することで、プレートを室温と同じ温度になるようにした。断片化ヒトCD137-Fc融合タンパク質を含む溶液を転倒除去し、各ウェルをWash buffer(0.1% Tween20を含むTBS、TaKaRa)300μLで3回洗浄した。続いて、Blocking Buffer(2% BSAを含むTBS)を各ウェルに150μLずつ加えて、1時間以上静置した。Blocking Bufferを転倒除去し、Wash Bufferで各ウェルを前の工程と同様に3回洗浄した後、あらかじめTBSで10μg/mLもしくは5μg/mLに希釈した抗体溶液を各ウェルに50μLずつ添加した。室温で1時間600rpm程度の速さで、固相化されている抗原と抗体を結合させた。抗体溶液を転倒除去後、Wash Bufferで各ウェルを前の工程と同様に3回洗浄した。0.1% Tween20を含むTBSで1000倍に希釈された2次抗体を各ウェルに100μLずつ添加した。なお二次抗体は、Kappa鎖をもつ抗体の場合は、BIOSOURCE社ANTIBODY ALKALINE PHOSPHATASECONJUGATE HUMAN IMMUNO GLOBULIN ABSORBED Goat Anti-Human Kappa Alkaline Phosphateを用い、Lambda鎖を持つ抗体の場合は、BETHYL LABORATORIES.INC, Human Lambda Light Chain Antibody;Goat anti-Human Lambda Light Chain Antibody Alkaline Phosphatase Conjugatedを用いた。室温で静置し1時間反応させた後、抗体溶液を転倒除去し、Wash Bufferで各ウェルを前の工程と同様に3回洗浄した。KPL社のBlue Phos Microwellキットを用いて、発色を行った。KPL社のAP stop solutionを用いて発色反応を停止させた後、吸光光度計で620nmの吸光度を測定した。その結果を図14に示す。図14に示されるように、各抗体は、それぞれ断片化ヒトCD137-Fc融合タンパク質に対して異なる発色値を示し、ヒトCD137-Fcのうち異なる部分と結合していることが示された。さらに、取得された抗体は既存の抗体BやMとは異なることが示された。
市販PBMC(AllCells社)から、Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 (Gibco, 11132D)を用いてT細胞を拡大培養した。10% FBS、60U/ml ヒトIL2、0.5μg/ml イオノマイシン、10 ng/ml PMA、並びにペニシリン及びストレプトマイシンを所定濃度含むRPMI1640培地に、ヒトT細胞を4×105 細胞/mlの密度で懸濁した。また、ヒトB細胞リンパ腫株 Rajiを同じ培地にて4×105細胞/mlの密度で懸濁した。両細胞懸濁液を等量ずつ混合し、100μl/ウェルで96-ウェルプレートへ播種した。そこへ実施例6で得られたヒトCD137結合抗体(R1 ~R19;実施例7に記したELISAと同じ抗体を用いた)を5 μg/mlの濃度で添加し、37℃、5% CO2の条件下で3日間培養した。培養後の培養上清を回収し、含まれるヒトIFN-γ濃度をELISAにより測定することでヒトT細胞の活性化を評価した。ELISAはキット製造業者(PeproTech社)の指示に従い実施した。
ヒトIgG1の定常領域を有する抗ヒトGPC3/抗マウスCD40二重特異性抗体GPC3 FAE-FGK45は以下の手順で作製した。抗マウスCD40側には、重鎖可変領域としてFGK45VH6(配列番号120)、軽鎖可変領域としてFGK45VL4(配列番号121)を用いた。このとき、重鎖定常領域および軽鎖定常領域には、F760nG3P17(配列番号119)、k0(配列番号118)をそれぞれ用いた。抗ヒトGPC3側の抗体としては、重鎖可変領域H0000(配列番号115)および軽鎖可変領域GL4(配列番号116)を共通して用いた。このとき、定常領域は、Fcγ受容体への結合を低減し、2つの重鎖がヘテロ会合化するように改変を加えた重鎖定常領域F760nN17(配列番号117)、軽鎖定常領域k0(配列番号118)を使用した。これらの抗体を、以下の方法を用いて発現させた。FreeStyle 293 Expression Medium培地(Invitrogen)に1.33 x 106細胞/mLの細胞密度で懸濁し、播種したヒト胎児腎細胞由来FreeStyle 293-F株(Invitrogen)に対して、調製されたプラスミドをリポフェクション法により導入した。CO2インキュベーター(37℃、8%CO2、90 rpm)で4日間培養した培養上清から、rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)またはProtein G Sepharose 4 Fast Flow(GE HEALTHCARE)を用いて当業者公知の方法で抗体を精製した。分光光度計を用いて、精製した抗体溶液の280 nmでの吸光度を測定した。得られた測定値からPACE法により算出した吸光係数を用いて、精製した抗体の濃度を算出した(Protein Science (1995) 4, 2411-2423)。精製したそれぞれのホモ体を表8の組み合わせで混合し、当業者公知の手法(WO2015/046467)を用いて目的の二重特異性抗体を作製した。
ナイーブなBalb/c雌性マウスから脾臓を採取し、FBS 10%、0.5μg/ml イオノマイシン、及び10 ng/ml PMAを含むRPMI1640培地に10ng/ml マウスIL2を添加した培地で細胞を4×106 細胞/mlの密度で懸濁した。また、ヒトGPC3を発現するマウス大腸癌細胞株CT26-GPC3(参考例3)を同じ培地にて4×105細胞/mlの密度で懸濁した。両細胞懸濁液を等量ずつ混合し、100μl/ウェルで96-ウェルプレートへ播種した。そこへFcγRへの結合を極めて減弱させた抗ヒトGPC3/抗マウスCD40二重特異性抗体(GPC3 ERY22-FGK45)を3μg/mlおよびFcγRへの結合を極めて減弱させた抗ヒトGPC3/抗マウスCD3二重特異性抗体(GPC3 ERY22-2C11)を1 μg/mlの濃度で添加し、37℃、5% CO2の条件下で72時間培養した。培養後の上清を回収し、含まれるマウスIFN-γ濃度をELISAにより測定することで脾臓細胞に含まれるT細胞の活性化を評価した。ELISAはキット製造業者(PeproTech社)の指示に従い実施した。
11-1.抗ヒトGPC3/抗ヒトCD137二重特異性抗体の作製
ヒトIgG1の定常領域を有する抗ヒトGPC3/抗ヒトCD137二重特異性抗体は以下の手順で作製した。実施例7でヒトCD137との結合が確認された配列(R3とR5)から、重鎖CDR3のアミノ酸がランダムに変わるように設計されたプライマーを用いて改変した。可変領域配列を表9に示す。このとき、R3およびR5から改変した場合、重鎖定常領域および軽鎖定常領域には、実施例9で構築されているF760nG3P17配列のC末端にGly-Lys("GK"とも記載される)を付加した配列、lambda定常領域配列(配列番号:60)をそれぞれ用いた。抗ヒトGPC3側の抗体としては、重鎖可変領域H0000(配列番号115)および軽鎖可変領域GL4(配列番号116)を共通して用いた。このとき、定常領域は、Fcγ受容体への結合を低減し、2つの重鎖がヘテロ会合化するように改変を加えた重鎖定常領域F760nN17(配列番号117)、軽鎖定常領域k0(配列番号118)を使用した。これらの抗体を、以下の方法を用いて発現させた。FreeStyle 293 Expression Medium培地(Invitrogen)に1.33 x 106細胞/mLの細胞密度で懸濁し、播種したヒト胎児腎細胞由来FreeStyle 293-F株(Invitrogen)に対して、調製されたプラスミドをリポフェクション法により導入した。CO2インキュベーター(37℃、8%CO2、90 rpm)で4日間培養した培養上清から、rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)またはProtein G Sepharose 4 Fast Flow(GE HEALTHCARE)を用いて当業者公知の方法で抗体を精製した。分光光度計を用いて、精製した抗体溶液の280 nmでの吸光度を測定した。得られた測定値からPACE法により算出した吸光係数を用いて、精製した抗体の濃度を算出した(Protein Science (1995) 4, 2411-2423)。なお抗ヒトCD137抗体(R3とR5由来)についてはE1%=14として計算した。表9に示したように実施例9と同様に精製した抗ヒトGPC抗体とヒトCD137抗体それぞれのホモ体を混合し、当業者公知の手法(WO2015/046467)を用いて目的の二重特異性抗体を作製した。
市販PBMC(AllCells社)から、Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 (Gibco, 11132D)を用いてT細胞を拡大培養した。10% FBS、60 U/ml ヒトIL2、0.5 μg/ml イオノマイシン、10 ng/ml PMA、及びペニシリンストレプトマイシンを所定濃度含むRPMI1640培地に、ヒトT細胞を4×105 cells/mlの密度で懸濁した。また、ヒトGPC3を発現するマウス大腸癌細胞株CT26-GPC3(参考例3)を同じ培地にて4×105 cells/mlの密度で懸濁した。両細胞懸濁液を等量ずつ混合し、100 μl/ウェルで96-ウェルプレートへ播種した。そこへ、コントロールヒトIgG (Allexis, 804-133-C100:図18中のCtrl hIgG1)または前項11-1で調製されたGPC3 FAE-BMS(FcγRへの結合を極めて減弱させた抗ヒトGPC3/抗ヒトCD137二重特異性抗体)を10 μg/mlの濃度で添加し、37℃、5% CO2の条件下で3日間培養した。培養後の上清を回収し、含まれるヒトIFN-γ濃度をELISAにより測定することでT細胞の活性化を評価した。ELISAはキット製造業者(PeproTech社)の指示に従い実施した。
ヒトCD137はB細胞株HDML-2にも発現しており、CD137のアゴニスト活性はHDML-2を用いても測定できる。20% FBS及びペニシリンストレプトマイシンを所定濃度含むRPMI1640培地に、ヒトB細胞癌細胞株HDLM-2を8×105 cells/mlの密度で懸濁した。また、ヒトGPC3を発現するマウス大腸癌細胞株CT26-GPC3(参考例3)を同じ培地にて4×105 cells/mlの密度で懸濁した。両細胞懸濁液を等量ずつ混合し、100 μl/ウェルで96-ウェルプレートへ播種した。そこへ、コントロールヒトIgG (Allexis, 804-133-C100:図19中のCtrl hIgG1)または前項11-1で調製されたFcγRへの結合を極めて減弱させた抗ヒトGPC3/抗ヒトCD137二重特異性抗体を10 μg/mlの濃度で添加し、37℃、5% CO2の条件下で3日間培養した。培養後の上清を回収し、含まれるヒトIL-6濃度をELISAにより測定することでB細胞の活性化を評価した。ELISAはキット製造業者(PeproTech社)の指示に従い実施した。
実施例11-2と11-3より、ヒトCD137もマウスCD137で行った実施例2から5に示した結果と同様に、二重特異性抗体でアゴニスト活性を有することが示され、マウスCD137と同様の効果が期待できると考えられる。
Claims (31)
- 下記のドメイン:
(1)癌特異的抗原結合Fabドメイン、及び
(2)CD137結合FabドメインまたはCD40結合Fabドメイン
を含む、抗原結合分子であって、FcRn結合ドメインをさらに含み、該FcRn結合ドメインは、FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa及びFcγRIIIbに対する結合活性が低下している、抗体のFc領域である、抗原結合分子。 - CD40結合Fabドメインを含まず、CD137結合Fabドメインを含む、請求項1に記載の抗原結合分子。
- 抗体である、請求項1または2に記載の抗原結合分子。
- 請求項1から3のいずれかに記載の抗原結合分子を有効成分として含む、医薬組成物。
- 細胞傷害を誘導する組成物である、請求項4に記載の医薬組成物。
- 癌治療用の組成物である、請求項4に記載の医薬組成物。
- 請求項1から3のいずれかに記載の第1の抗原結合分子と、下記のドメイン:
(1)癌特異的抗原結合ドメイン、及び
(2)CD3結合ドメイン
を含む第2の抗原結合分子が配合されている、医薬組成物。 - 第2の抗原結合分子が、FcRn結合ドメインをさらに含む抗原結合分子である、請求項7に記載の医薬組成物。
- FcRn結合ドメインが、Fcγ受容体に対する結合活性が低下している、抗体のFc領域である、請求項8に記載の医薬組成物。
- 第2の抗原結合分子が抗体である、請求項7から9のいずれかに記載の医薬組成物。
- 第2の抗原結合分子が多重特異性抗体である、請求項7から10のいずれかに記載の医薬組成物。
- 細胞傷害を誘導する組成物である、請求項7から11のいずれかに記載の医薬組成物。
- 癌治療用の組成物である、請求項7から11のいずれかに記載の医薬組成物。
- 下記のドメイン:
(1)癌特異的抗原結合Fabドメイン、及び
(2)CD137結合FabドメインまたはCD40結合Fabドメイン
を含む第1の抗原結合分子であって、第1の抗原結合分子はFcRn結合ドメインをさらに含み、該FcRn結合ドメインは、FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa及びFcγRIIIbに対する結合活性が低下している、抗体のFc領域である、抗原結合分子を有効成分として含む、
下記のドメイン:
(1)癌特異的抗原結合ドメイン、及び
(2)CD3結合ドメイン
を含む第2の抗原結合分子と併用するための医薬組成物。 - 細胞傷害を誘導する組成物である、請求項14に記載の医薬組成物。
- 癌治療用の組成物である、請求項14に記載の医薬組成物。
- 第2の抗原結合分子が、FcRn結合ドメインをさらに含む抗原結合分子である、請求項14から16のいずれかに記載の医薬組成物。
- 第2の抗原結合分子に含まれるFcRn結合ドメインが、Fcγ受容体に対する結合活性が低下している、抗体のFc領域である、請求項17に記載の医薬組成物。
- 第1の抗原結合分子が、CD40結合Fabドメインを含まず、CD137結合Fabドメインを含む、請求項14から18のいずれかに記載の医薬組成物。
- 第1の抗原結合分子及び/又は第2の抗原結合分子が抗体である、請求項14から19のいずれかに記載の医薬組成物。
- 第2の抗原結合分子と同時に投与される、請求項14から20のいずれかに記載の医薬組成物。
- 第2の抗原結合分子と別々に投与される、請求項14から20のいずれかに記載の医薬組成物。
- 下記のドメイン:
(1)癌特異的抗原結合ドメイン、及び
(2)CD3結合ドメイン
を含む第2の抗原結合分子を有効成分として含む、
下記のドメイン:
(1)癌特異的抗原結合ドメイン、及び
(2)CD137結合FabドメインまたはCD40結合Fabドメイン
を含む第1の抗原結合分子であって、第1の抗原結合分子はFcRn結合ドメインをさらに含み、該FcRn結合ドメインは、FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa及びFcγRIIIbに対する結合活性が低下している、抗体のFc領域である、抗原結合分子と併用するための医薬組成物。 - 細胞傷害を誘導する組成物である、請求項23に記載の医薬組成物。
- 癌治療用の組成物である、請求項23に記載の医薬組成物。
- 第2の抗原結合分子が、FcRn結合ドメインをさらに含む抗原結合分子である、請求項23から25のいずれかに記載の医薬組成物。
- 第2の抗原結合分子に含まれるFcRn結合ドメインが、Fcγ受容体に対する結合活性が低下している、抗体のFc領域である、請求項26に記載の医薬組成物。
- 第1の抗原結合分子は、CD40結合Fabドメインを含まず、CD137結合Fabドメインを含む、請求項23から27のいずれかに記載の医薬組成物。
- 第1の抗原結合分子及び/又は第2の抗原結合分子が抗体である、請求項23から28のいずれかに記載の医薬組成物。
- 第1の抗原結合分子と同時に投与される、請求項23から29のいずれかに記載の医薬組成物。
- 第1の抗原結合分子と別々に投与される、請求項23から29のいずれかに記載の医薬組成物。
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