JP2020518584A - 細胞傷害誘導治療剤 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、RNF43レベルが高い腫瘍の解析に基づき、RNF43を標的化する効果的な治療法を提供することによって達成された。本発明の目的は、T細胞をRNF43発現細胞に近接させることによってがんの治療を可能にする多重特異性抗原結合分子を提供することである。本発明の目的は、RNF43発現がん細胞に対するT細胞の細胞傷害性を用いて、多重特異性抗原結合分子を製造する方法、およびそのような多重特異性抗原結合分子を有効成分として含む、細胞傷害を誘導するための治療剤を提供することである。本発明の別の目的は、細胞傷害を誘導するための上記治療剤を有効成分として含む、様々ながんを治療または予防するための薬学的組成物、および該薬学的組成物を用いる治療法を提供することである。
より具体的には、本発明は以下のものを提供する:
〔1〕RNF43結合活性を有する第1抗原結合ドメインとT細胞受容体複合体結合活性を有する第2抗原結合ドメインとを含む多重特異性抗原結合分子。
〔2〕細胞傷害性を有する、〔1〕に記載の多重特異性抗原結合分子。
〔3〕細胞傷害性がT細胞依存性の細胞傷害性である、〔1〕または〔2〕に記載の多重特異性抗原結合分子。
〔4〕RNF43をその表面上に発現する細胞に対する細胞傷害性を有する、〔2〕〜〔3〕のいずれかに記載の多重特異性抗原結合分子。
〔5〕RNF43発現細胞ががん細胞である、〔4〕に記載の多重特異性抗原結合分子。
〔6〕T細胞受容体複合体結合活性がT細胞受容体に対する結合活性である、〔1〕〜〔5〕のいずれかに記載の多重特異性抗原結合分子。
〔7〕T細胞受容体複合体結合活性がCD3ε鎖に対する結合活性である、〔1〕〜〔5〕のいずれかに記載の多重特異性抗原結合分子。
〔8〕RNF43結合活性がヒトRNF43に対する結合活性である、〔1〕〜〔7〕のいずれかに記載の多重特異性抗原結合分子。
〔9〕RNF43結合活性が、真核細胞の表面上のRNF43に対する結合活性である、〔1〕〜〔7〕のいずれかに記載の多重特異性抗原結合分子。
〔10〕RNF43結合活性が、真核細胞の表面上のヒトRNF43に対する結合活性である、〔1〕〜〔9〕のいずれかに記載の多重特異性抗原結合分子。
〔11〕第1抗原結合ドメインが、抗体の重鎖および軽鎖の可変領域を含むドメインであり、かつ/または第2抗原結合ドメインが、抗体の重鎖および軽鎖の可変領域を含むドメインである、〔1〕〜〔10〕のいずれかに記載の多重特異性抗原結合分子。
〔12〕第1抗原結合ドメインが、抗体可変断片を含むドメインであり、かつ/または第2抗原結合ドメインが、抗体可変断片を含むドメインである、〔1〕〜〔11〕のいずれかに記載の多重特異性抗原結合分子。
〔13〕第1抗原結合ドメインが、Fab構造を含むドメインであり、かつ/または第2抗原結合ドメインが、Fab構造を含むドメインである、〔1〕〜〔12〕のいずれかに記載の多重特異性抗原結合分子。
〔14〕第1抗原結合ドメインが、以下の抗体可変断片のうちのいずれか1つを含む、〔1〕〜〔13〕のいずれかに記載の多重特異性抗原結合分子:
(a) 配列番号:28のアミノ酸配列を含むHVR-H1、配列番号:48のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および配列番号:68のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含む抗体重鎖可変領域、ならびに配列番号:38のアミノ酸配列を含むHVR-L1、配列番号:58のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および配列番号:78のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む抗体軽鎖可変領域を含む、抗体可変断片;
(b) 配列番号:31のアミノ酸配列を含むHVR-H1、配列番号:51のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および配列番号:71のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含む抗体重鎖可変領域、ならびに配列番号:41のアミノ酸配列を含むHVR-L1、配列番号:61のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および配列番号:81のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む抗体軽鎖可変領域を含む、抗体可変断片;
(c) 配列番号:33のアミノ酸配列を含むHVR-H1、配列番号:53のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および配列番号:73のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含む抗体重鎖可変領域、ならびに配列番号:43のアミノ酸配列を含むHVR-L1、配列番号:63のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および配列番号:83のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む抗体軽鎖可変領域を含む、抗体可変断片;
(d) 配列番号:34のアミノ酸配列を含むHVR-H1、配列番号:54のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および配列番号:74のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含む抗体重鎖可変領域、ならびに配列番号:44のアミノ酸配列を含むHVR-L1、配列番号:64のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および配列番号:84のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む抗体軽鎖可変領域を含む、抗体可変断片;
(e) 配列番号:35のアミノ酸配列を含むHVR-H1、配列番号:55のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および配列番号:75のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含む抗体重鎖可変領域、ならびに配列番号:45のアミノ酸配列を含むHVR-L1、配列番号:65のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および配列番号:85のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む抗体軽鎖可変領域を含む、抗体可変断片;
(f) (a)〜(e)の抗体可変断片のうちのいずれか1つとヒトRNF43への結合に関して競合する抗体可変断片;ならびに
(g) (a)〜(e)の抗体可変断片のうちのいずれか1つがヒトRNF43上で結合するのと同じエピトープに結合する抗体可変断片。
〔15〕Fcγ受容体結合活性が低下したFc領域を含むドメインをさらに含む、〔1〕〜〔14〕のいずれかに記載の多重特異性抗原結合分子。
〔16〕多重特異性抗原結合分子のFc領域が、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4抗体のFcドメインと比較して低下したFcγ受容体結合活性を有する、〔15〕に記載の多重特異性抗原結合分子。
〔17〕Fc領域が、配列番号:122〜125(IgG1〜IgG4)のFc領域構成アミノ酸のうちのいずれかにおいてアミノ酸変異を有するFc領域である、〔15〕または〔16〕に記載の多重特異性抗原結合分子。
〔18〕Fc領域が、EUナンバリングによって指定される以下のアミノ酸位置:
220位、226位、229位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、264位、265位、266位、267位、269位、270位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、325位、327位、328位、329位、330位、331位、および332位
より選択される少なくとも1つのアミノ酸の変異を有するFc領域である、〔17〕に記載の多重特異性抗原結合分子。
〔19〕RNF43結合活性を有する第1抗体可変断片と、CD3ε鎖結合活性を有する第2抗体可変断片と、Fcγ受容体結合活性が低下したFc領域とを含む二重特異性抗体である、〔1〕〜〔18〕のいずれかに記載の多重特異性抗原結合分子。
〔20〕二重特異性抗体である、〔1〕〜〔19〕のいずれかに記載の多重特異性抗原結合分子。
〔21〕〔1〕〜〔20〕のいずれかに記載の多重特異性抗原結合分子をコードする核酸。
〔22〕〔21〕に記載の核酸が導入されたベクター。
〔23〕〔21〕に記載の核酸または〔22〕に記載のベクターを含む細胞。
〔24〕〔23〕に記載の細胞を培養することによって、〔1〕〜〔20〕のいずれかに記載の多重特異性抗原結合分子を製造する方法。
〔25〕〔24〕に記載の方法によって製造された多重特異性抗原結合分子。
〔26〕〔1〕〜〔20〕のいずれかに記載の多重特異性抗原結合分子を含む薬学的組成物。
〔27〕〔1〕〜〔20〕のいずれかに記載の多重特異性抗原結合分子を含む、細胞傷害の誘導における使用のための薬学的組成物。
〔28〕〔1〕〜〔20〕のいずれかに記載の多重特異性抗原結合分子を含む、がんの治療または予防における使用のための薬学的組成物。
〔29〕がんが結腸直腸がんまたは胃がんである、〔28〕に記載の薬学的組成物。
〔30〕〔1〕〜〔20〕のいずれかに記載の多重特異性抗原結合分子がそれを必要とする患者に投与される、がんを治療または予防する方法。
〔31〕がんが結腸直腸がんまたは胃がんである、〔30〕に記載の方法。
本明細書において記載または参照される技法および手順は、概して十分に理解されており、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3d edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.;Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., (2003));the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.):PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995))、Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual、およびAnimal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1987));Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984);Methods in Molecular Biology, Humana Press;Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press;Animal Cell Culture (R.I. Freshney), ed., 1987);Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press;Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons;Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.);Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987);PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994);Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991);Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999);Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997);Antibodies (P. Finch, 1997);Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989);Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000);Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999);The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995);ならびにCancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993) に記載される広く利用されている方法論などの従来の方法論を使用して当業者によって一般的に用いられるものである。
本明細書で用いられる用語「抗原結合分子」は、抗原結合ドメインを含む任意の分子のことをいい、さらに、約5アミノ酸またはそれ以上の長さを有するペプチドまたはタンパク質などの分子のことをいい得る。ペプチドおよびタンパク質は、生物由来のものに限定されず、例えば人工的に設計された配列から製造されたポリペプチドであってもよい。それらはまた、天然ポリペプチド、合成ポリペプチド、組換えポリペプチド等のいずれかであってもよい。
本明細書で用いられる用語「抗原結合ドメイン」は、抗原の全体または一部に特異的に結合しかつ相補的である領域を含む抗体の部分のことをいう。抗原の分子量が大きい場合、抗体は抗原の特定部分にのみ結合し得る。該特定部分は「エピトープ」と称される。抗原結合ドメインは、1つまたは複数の抗体可変ドメインより提供され得る。好ましくは、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域 (VL) および抗体重鎖可変領域 (VH) の両方を含む。そのような好ましい抗原結合ドメインには、例えば、「単鎖Fv (scFv)」、「単鎖抗体」、「Fv」、「単鎖Fv2 (scFv2)」、「Fab」、および「F(ab')2」が含まれる。
本明細書でいう用語「RNF43」は、別段示さない限り、霊長類(例えば、ヒト)およびげっ歯類(例えば、マウスおよびラット)などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物供給源からの任意の天然型RNF43(ringフィンガータンパク質43)のことをいう。この用語は、「全長」のプロセシングを受けていないRNF43も、細胞中でのプロセシングの結果生じるいかなる形態のRNF43も包含する。この用語はまた、自然に生じるRNF43の変異体、例えば、スプライス変異体や対立遺伝子変異体も包含する。例示的なヒトRNF43のアミノ酸配列を、配列番号:89に示した。
「アフィニティ」は、分子(例えば、抗原結合分子または抗体)の結合部位1個と、分子の結合パートナー(例えば、抗原)との間の、非共有結合的な相互作用の合計の強度のことをいう。別段示さない限り、本明細書で用いられる「結合アフィニティ」は、ある結合対のメンバー(例えば、抗原結合分子と抗原、または抗体と抗原)の間の1:1相互作用を反映する、固有の結合アフィニティのことをいう。分子XのそのパートナーYに対するアフィニティは、一般的に、解離定数 (Kd) により表すことができる。アフィニティは、本明細書に記載のものを含む、当該技術分野において知られた通常の方法によって測定され得る。結合アフィニティを測定するための具体的な実例となるおよび例示的な態様については、下で述べる。
特定の態様において、本明細書で提供される抗原結合分子または抗体の抗原結合ドメインは、その抗原に対して、≦1μM、≦120nM、≦100nM、≦80nM、≦70nM、≦50nM、≦40nM、≦30nM、≦20nM、≦10nM、≦2nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nMまたは≦0.001nM(例えば、10-8M以下、10-8M〜10-13M、10-9M〜10-13M)の解離定数 (Kd) を有する。特定の態様において、RNF43に対する、抗体/抗原結合分子の第1抗原結合ドメインのKd値は、1〜40、1〜50、1〜70、1〜80、30〜50、30〜70、30〜80、40〜70、40〜80、または60〜80nMの範囲内に入る。
本明細書で用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、所望の抗原結合活性を示す限りは、これらに限定されるものではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)および抗体断片を含む、種々の抗体構造を包含する。
抗体の「クラス」は、抗体の重鎖に備わる定常ドメインまたは定常領域のタイプのことをいう。抗体には5つの主要なクラスがある:IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMである。そして、このうちいくつかはさらにサブクラス(アイソタイプ)に分けられてもよい。例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2である。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインを、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ぶ。
「フレームワーク」または「FR」は、超可変領域 (HVR) 残基以外の、可変ドメイン残基のことをいう。可変ドメインのFRは、通常4つのFRドメイン:FR1、FR2、FR3、およびFR4からなる。それに応じて、HVRおよびFRの配列は、通常次の順序でVH(またはVL)に現れる:FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンVLまたはVHフレームワーク配列の選択群において最も共通して生じるアミノ酸残基を示すフレームワークである。通常、ヒト免疫グロブリンVLまたはVH配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからである。通常、配列のサブグループは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3におけるサブグループである。一態様において、VLについて、サブグループは上記のKabatらによるサブグループκIである。一態様において、VHについて、サブグループは上記のKabatらによるサブグループIIIである。
本明細書で用いられる用語「超可変領域」または「HVR」は、配列において超可変であり(「相補性決定領域」または「CDR」(complementarity determining region))、および/または構造的に定まったループ(「超可変ループ」)を形成し、および/または抗原接触残基(「抗原接触」)を含む、抗体の可変ドメインの各領域のことをいう。通常、抗体は6つのHVRを含む:VHに3つ(H1、H2、H3)、およびVLに3つ(L1、L2、L3)である。本明細書での例示的なHVRは、以下のものを含む:
(a) アミノ酸残基26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (H2)、および96-101 (H3)のところで生じる超可変ループ (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987));
(b) アミノ酸残基24-34 (L1)、50-56 (L2)、89-97 (L3)、31-35b (H1)、50-65 (H2)、 および95-102 (H3)のところで生じるCDR (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));
(c) アミノ酸残基27c-36 (L1)、46-55 (L2)、89-96 (L3)、30-35b (H1)、47-58 (H2)、および93-101 (H3) のところで生じる抗原接触 (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996));ならびに、
(d) HVRアミノ酸残基46-56 (L2)、47-56 (L2)、48-56 (L2)、49-56 (L2)、26-35 (H1)、26-35b (H1)、49-65 (H2)、93-102 (H3)、および94-102 (H3)を含む、(a)、(b)、および/または(c)の組合せ。
別段示さない限り、HVR残基および可変ドメイン中の他の残基(例えば、FR残基)は、本明細書では上記のKabatらにしたがって番号付けされる。
用語「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗体を抗原へと結合させることに関与する、抗体の重鎖または軽鎖のドメインのことをいう。天然型抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン(それぞれVHおよびVL)は、通常、各ドメインが4つの保存されたフレームワーク領域 (FR) および3つの超可変領域 (HVR) を含む、類似の構造を有する。(例えば、Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007) 参照。)1つのVHまたはVLドメインで、抗原結合特異性を与えるに充分であろう。さらに、ある特定の抗原に結合する抗体は、当該抗原に結合する抗体からのVHまたはVLドメインを使ってそれぞれVLまたはVHドメインの相補的ライブラリをスクリーニングして、単離されてもよい。例えばPortolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991) 参照。
用語「キメラ」抗体は、重鎖および/または軽鎖の一部分が特定の供給源または種に由来する一方で、重鎖および/または軽鎖の残りの部分が異なった供給源または種に由来する抗体のことをいう。同様に、用語「キメラ抗体可変ドメイン」は、重鎖および/または軽鎖可変領域の一部分が特定の供給源または種に由来する一方で、重鎖および/または軽鎖可変領域の残りの部分が異なった供給源または種に由来する抗体可変領域のことをいう。
「ヒト化」抗体は、非ヒトHVRからのアミノ酸残基およびヒトFRからのアミノ酸残基を含む、キメラ抗体のことをいう。ある態様では、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、当該可変領域においては、すべてのもしくは実質的にすべてのHVR(例えばCDR)は非ヒト抗体のものに対応し、かつ、すべてのもしくは実質的にすべてのFRはヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を含んでもよい。抗体(例えば、非ヒト抗体)の「ヒト化された形態」は、ヒト化を経た抗体のことをいう。「ヒト化抗体可変領域」は、ヒト化抗体の可変領域のことをいう。
「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞によって産生された抗体またはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体コード配列を用いる非ヒト供給源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を備える抗体である。このヒト抗体の定義は、非ヒトの抗原結合残基を含むヒト化抗体を、明確に除外するものである。「ヒト抗体可変領域」は、ヒト抗体の可変領域のことをいう。
所望の結合活性を有する抗体を製造する方法は、当業者に公知である。以下は、RINGフィンガータンパク質43(以後、RNF43とも称される)に結合する抗体(抗RNF43抗体)を製造する方法を記載した例である。T細胞受容体複合体などに結合する抗体も、以下に記載される例に従って製造することができる。
−RNF43のような膜タンパク質の構造を維持しながら免疫刺激が与えられ得る;および
−免疫化のための抗原を精製する必要が無い。
より具体的には、例えば、細胞融合促進剤の存在下で従来の培地中で、細胞融合が行われ得る。融合促進剤には、例えばポリエチレングリコール(PEG)およびセンダイウイルス(HVJ)が含まれる。必要に応じて、融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助物質も添加される。
−グアニジン超遠心法(Biochemistry (1979) 18(24), 5294-5299)、および
−AGPC法(Anal. Biochem. (1987) 162(1), 156-159)
(1)ハイブリドーマから単離されたcDNAによってコードされるV領域を含む抗体をRNF43発現細胞に接触させる工程、
(2)RNF43発現細胞と抗体との結合を検出する工程、および
(3)RNF43発現細胞に結合する抗体を選択する工程。
(1)哺乳動物細胞:CHO、COS、ミエローマ、仔ハムスター腎細胞(BHK)、HeLa、Veroなど;
(2)両生類細胞:アフリカツメガエル卵母細胞など;および
(3)昆虫細胞:sf9、sf21、Tn5など。
酵母:サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)などのサッカロミセス(Saccharomyces)属、およびピキア・パストリス(Pichia pastoris)などのピキア(Pichia)属;および
糸状菌:アスペスギルス・ニガー(Aspergillus niger)などのアスペルギルス(Aspergillus)属。
本明細書において記載される抗原結合分子がヒトに投与される場合、当該抗原結合分子の抗体可変領域を含むドメインとして、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体由来のドメインが適宜使用され得る。そのような遺伝子組換え型抗体には、例えば、ヒト化抗体が含まれる。これらの改変抗体は、公知の方法により適宜製造される。さらに、一般に、CDRの移植によって、ある抗体の結合特異性を他の抗体に導入することができる。
または、DNA免疫により、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物(WO1993/012227、WO1992/003918、WO1994/002602、WO1994/025585、WO1996/034096、WO1996/033735参照)を免疫化することによって、所望のヒト抗体が取得され得る。
本明細書で用いられる用語「ベクター」は、それが連結されたもう1つの核酸を増やすことができる、核酸分子のことをいう。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、および、それが導入された宿主細胞のゲノム中に組み入れられるベクターを含む。あるベクターは、自身が動作的に連結された核酸の、発現をもたらすことができる。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」とも称される。
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」、および「宿主細胞培養物」は、相互に交換可能に用いられ、外来核酸を導入された細胞(そのような細胞の子孫を含む)のことをいう。宿主細胞は「形質転換体」および「形質転換細胞」を含み、これには初代の形質転換細胞および継代数によらずその細胞に由来する子孫を含む。子孫は、親細胞と核酸の内容において完全に同一でなくてもよく、変異を含んでいてもよい。オリジナルの形質転換細胞がスクリーニングされたまたは選択された際に用いられたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異体子孫も、本明細書では含まれる。
「エピトープ」は、抗原中の抗原決定基を意味し、本明細書において開示される抗原結合分子または抗体の抗原結合ドメインが結合する抗原上の部位のことをいう。よって、例えば、エピトープは、その構造によって定義され得る。あるいは、当該エピトープを認識する抗原結合分子または抗体の抗原結合活性によって当該エピトープが定義され得る。抗原がペプチドまたはポリペプチドである場合には、エピトープを形成するアミノ酸残基によってエピトープを特定することも可能である。あるいは、エピトープが糖鎖である場合には、特定の糖鎖構造によってエピトープを特定することも可能である。
FACSCanto(商標)II
FACSAria(商標)
FACSArray(商標)
FACSVantage(商標)SE
FACSCalibur(商標)(いずれもBD Biosciencesの商品名)
EPICS ALTRA HyPerSort
Cytomics FC 500
EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC
Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC(いずれもBeckman Coulterの商品名)
結合阻害 (%) は、以下の式を用いて算出される:
ビニングは、20%結合阻害のカットオフ値を用いて決定され得る。抗体間の結合阻害が20%未満である場合、それらは異なるビンに分類される。言い換えると、被験抗体Ab1が、参照抗体として別の抗体Ab2を用いた場合に、20%を超える結合阻害を示し、かつAb2を被験抗体として用い、Ab1を参照抗体として用いた場合に、抗体Ab2もまた20%を超える結合阻害を示すのであれば、抗体Ab1およびAb2は同じビンに分類される。同じビン内の抗体は互いに競合し、それらは同じ(または少なくとも接近して位置する)エピトープに結合するということができる。
「特異的」とは、1つまたは複数の結合パートナーに特異的に結合する分子が、該パートナー以外の分子に対して何ら有意な結合を示さないことを意味する。さらに、「特異的」とはまた、抗原結合ドメインが、抗原中に含まれる複数のエピトープのうちの特定のエピトープに特異的である場合にも用いられる。抗原結合ドメインが結合するエピトープが複数の異なる抗原中に含まれる場合、該抗原結合ドメインを含む抗原結合分子は、該エピトープを有する様々な抗原に結合し得る。
用語「単一特異性抗原結合分子」は、1種類の抗原にのみ特異的に結合する抗原結合分子を指すために用いられる。単一特異性抗原結合分子の好ましい例は、単一種類の抗原結合ドメインを含む抗原結合分子である。単一特異性抗原結合分子は、単一の抗原結合ドメインまたは同じ種類の複数の抗原結合ドメインを含み得る。単一特異性抗原結合分子の好ましい例は単一特異性抗体である。単一特異性抗原結合分子がIgG型の単一特異性抗体である場合、該単一特異性抗体は、同じ抗原結合特異性を有する2つの抗体可変断片を含む。
「抗体断片」は、完全抗体が結合する抗原に結合する当該完全抗体の一部分を含む、当該完全抗体以外の分子のことをいう。抗体断片の例は、これらに限定されるものではないが、Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2;ダイアボディ;線状抗体;単鎖抗体分子(例えば、scFv);および、抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
本明細書において、用語「可変断片(Fv)」は、抗体の軽鎖可変領域(VL)と抗体の重鎖可変領域(VH)とのペアから構成される抗体由来の抗原結合ドメインの最小単位のことをいう。1988年にSkerraとPluckthunは、細菌のシグナル配列の下流に抗体遺伝子を挿入し大腸菌中で当該遺伝子の発現を誘導することによって、均一でかつ活性な抗体が大腸菌のペリプラズム画分から調製され得ることを見出した(Science (1988) 240 (4855), 1038-1041)。ペリプラズム画分から調製されたFvにおいては、抗原に結合するような様式でVHとVLが会合している。
本明細書において、用語「scFv」、「単鎖抗体」、および「sc(Fv)2」はいずれも、重鎖および軽鎖に由来する可変領域を含むが、定常領域を含まない、単一ポリペプチド鎖の抗体断片のことをいう。一般に、単鎖抗体は、抗原結合を可能にすると思われる所望の構造の形成を可能にする、VHドメインとVLドメインの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。単鎖抗体は、「The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore, eds., Springer-Verlag, New York, 269-315 (1994)」においてPluckthunによって詳細に考察されている。同様に、国際公開公報WO1988/001649、米国特許第4,946,778号および同第5,260,203号を参照のこと。特定の態様において、単鎖抗体は、二重特異性でありかつ/またはヒト化され得る。
[VL]-リンカー-[VH]-リンカー-[VH]-リンカー-[VL]
[VH]-リンカー-[VL]-リンカー-[VL]-リンカー-[VH]
[VH]-リンカー-[VH]-リンカー-[VL]-リンカー-[VL]
[VL]-リンカー-[VL]-リンカー-[VH]-リンカー-[VH]
[VL]-リンカー-[VH]-リンカー-[VL]-リンカー-[VH]
Ser
Gly Ser
Gly Gly Ser
Ser Gly Gly
Gly Gly Gly Ser(配列番号:104)
Ser Gly Gly Gly(配列番号:105)
Gly Gly Gly Gly Ser(配列番号:106)
Ser Gly Gly Gly Gly(配列番号:107)
Gly Gly Gly Gly Gly Ser(配列番号:108)
Ser Gly Gly Gly Gly Gly(配列番号:109)
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser(配列番号:110)
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly(配列番号:111)
(Gly Gly Gly Gly Ser(配列番号:106))n
(Ser Gly Gly Gly Gly(配列番号:107))n
ここでnは1以上の整数である。ペプチドリンカーの長さや配列は目的に応じて当業者が適宜選択することができる。
「Fab」は、1本の軽鎖、ならびに1本の重鎖のCH1ドメインおよび可変領域からなる。Fab分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成できない。
本明細書で用語「Fc領域」または「Fcドメイン」は、少なくとも定常領域の一部分を含む免疫グロブリン重鎖のC末端領域を定義するために用いられる。この用語は、天然型配列のFc領域および変異体Fc領域を含む。一態様において、ヒトIgG重鎖Fc領域はCys226から、またはPro230から、重鎖のカルボキシル末端まで延びる。ただし、Fc領域のC末端のリジン (Lys447) またはグリシン‐リジン(Gly446-Lys447)は、存在していてもしていなくてもよい。本明細書では別段特定しない限り、Fc領域または定常領域中のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD 1991 に記載の、EUナンバリングシステム(EUインデックスとも呼ばれる)にしたがう。
用語「Fc受容体」または「FcR」は、抗体のFc領域に結合する受容体のことをいう。いくつかの態様において、FcRは、天然型ヒトFcRである。いくつかの態様において、FcRは、IgG抗体に結合するもの(ガンマ受容体)であり、FcγRI、FcγRII、およびFcγRIIIサブクラスの受容体を、これらの受容体の対立遺伝子変異体および選択的スプライシングによる形態を含めて、含む。FcγRII受容体は、FcγRIIA(「活性化受容体」)およびFcγRIIB(「阻害受容体」)を含み、これらは主としてその細胞質ドメインにおいて相違する類似のアミノ酸配列を有する。活性化受容体FcγRIIAは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシン活性化モチーフ (immunoreceptor tyrosine-based activation motif: ITAM) を含む。阻害受容体FcγRIIBは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシン阻害モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif: ITIM)を含む。(例えば、Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997) を参照のこと。)FcRは、例えば、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991);Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994);およびde Haas et al., J. Lab. Clin. Med 126:330-41 (1995)において総説されている。将来同定されるものを含む他のFcRも、本明細書の用語「FcR」に包含される。
Fcγ受容体とは、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4モノクローナル抗体のFcドメインに結合し得る受容体のことをいい、これにはFcγ受容体遺伝子によって実質的にコードされるタンパク質のファミリーに属するすべてのメンバーが含まれる。ヒトにおいて、このファミリーには、アイソフォームFcγRIa、FcγRIb、およびFcγRIcを含むFcγRI (CD64);アイソフォームFcγRIIa(アロタイプH131およびR131を含む)、FcγRIIb(FcγRIIb-1およびFcγRIIb-2を含む)、およびFcγRIIcを含むFcγRII (CD32);ならびにアイソフォームFcγRIIIa(アロタイプV158およびF158を含む)およびFcγRIIIb(アロタイプFcγRIIIb-NA1およびFcγRIIIb-NA2を含む)を含むFcγRIII (CD16);ならびに未同定のヒトFcγ受容体、Fcγ受容体アイソフォーム、およびそれらのアロタイプのすべてが含まれる。しかしながら、Fcγ受容体はこれらの例に限定されない。これらに限定されるわけではないが、Fcγ受容体には、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、およびサルに由来するものが含まれる。Fcγ受容体は任意の生物に由来してよい。マウスFcγ受容体には、これらに限定されないが、FcγRI (CD64)、FcγRII (CD32)、FcγRIII (CD16)、およびFcγRIII-2 (CD16-2)、ならびに未同定のマウスFcγ受容体、Fcγ受容体アイソフォーム、およびそれらのアロタイプのすべてが含まれる。そのような好ましいFcγ受容体には、例えば、ヒトFcγRI (CD64)、FcγRIIA (CD32)、FcγRIIB (CD32)、FcγRIIIA (CD16)、および/またはFcγRIIIB (CD16) が含まれる。FcγRIのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号:112 (NM_000566.3) および113 (NP_000557.1) に示され;FcγRIIAのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号:114 (BC020823.1) および115 (AAH20823.1) に示され;FcγRIIBのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号:116 (BC146678.1) および117 (AAI46679.1) に示され;FcγRIIIAのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号:118 (BC033678.1) および119 (AAH33678.1) に示され;ならびにFcγRIIIBのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号:120 (BC128562.1) および121 (AAI28563.1) に示される(RefSeq登録番号はそれぞれのカッコ内に示される)。Fcγ受容体がIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4モノクローナル抗体のFcドメインに対する結合活性を有するかどうかは、上記のFACSおよびELISAフォーマットに加えて、ALPHAスクリーン(増幅発光近接ホモジニアスアッセイ)、表面プラズモン共鳴 (SPR) ベースのBIACORE法、およびその他によって評価することができる (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010)。
FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA、および/またはFcγRIIIBのいずれかのFcγ受容体に対するFcドメインの結合活性が損なわれていることは、上記のFACSおよびELISAフォーマット、ならびにALPHAスクリーン(増幅発光近接ホモジニアスアッセイ)および表面プラズモン共鳴 (SPR) ベースのBIACORE法を用いることによって評価することができる (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010)。
本明細書において、「Fcγ受容体結合活性が低下している」とは、例えば、上記の解析方法に基づいて、被験抗原結合分子または抗体の競合活性が、対照抗原結合分子または抗体の競合活性の50%以下、好ましくは45%以下、40%以下、35%以下、30%以下、20%以下、または15%以下、および特に好ましくは10%以下、9%以下、8%以下、7%以下、6%以下、5%以下、4%以下、3%以下、2%以下、または1%以下であることを意味する。
(a) L234F、L235E、P331S;
(b) C226S、C229S、P238S;
(c) C226S、C229S;または
(d) C226S、C229S、E233P、L234V、L235A;
ならびに、231〜238位のアミノ酸配列が欠失しているFcドメインを有するものが含まれる。
(e) H268Q、V309L、A330S、およびP331S;
(f) V234A;
(g) G237A;
(h) V234AおよびG237A;
(i) A235EおよびG237A;または
(j) V234A、A235E、およびG237A。各数字はEUナンバリングでのアミノ酸残基の位置を表し;かつ数字の前の一文字アミノ酸記号は置換前のアミノ酸残基を表し、数字の後の一文字アミノ酸記号は置換後のアミノ酸残基を表す。
(k) F241A;
(l) D265A;または
(m) V264A。各数字はEUナンバリングでのアミノ酸残基の位置を表し;かつ数字の前の一文字アミノ酸記号は置換前のアミノ酸残基を表し、数字の後の一文字アミノ酸記号は置換後のアミノ酸残基を表す。
(n) L235A、G237A、およびE318A;
(o) L235E;または
(p) F234AおよびL235A。各数字はEUナンバリングでのアミノ酸残基の位置を表し;かつ数字の前の一文字アミノ酸記号は置換前のアミノ酸残基を表し、数字の後の一文字アミノ酸記号は置換後のアミノ酸残基を表す。
本明細書で用いられる語句「RNF43結合活性を有する抗原結合ドメイン」または「抗RNF43抗原結合ドメイン」は、上記のRNF43タンパク質、またはRNF43タンパク質の部分ペプチドの全体もしくは一部に特異的に結合する抗原結合ドメインのことをいう。
本明細書で用いられる語句「T細胞受容体複合体結合活性を有する抗原結合ドメイン」または「抗T細胞受容体複合体抗原結合ドメイン」は、T細胞受容体複合体の部分ペプチドの全体または一部に特異的に結合する抗原結合ドメインのことをいう。T細胞受容体複合体は、T細胞受容体自体であってもよいし、またはT細胞受容体と共にT細胞受容体複合体を構成するアダプター分子であってもよい。CD3はアダプター分子として適している。
本明細書で用いられる語句「T細胞受容体結合活性を有する抗原結合ドメイン」または「抗T細胞受容体抗原結合ドメイン」は、T細胞受容体の部分ペプチドの全体または一部に特異的に結合する抗原結合ドメインのことをいう。該抗原結合ドメインが結合するT細胞受容体の部分は、T細胞受容体の可変領域またはT細胞受容体の定常領域であってよい;しかしながら、定常領域に存在するエピトープが好ましい。定常領域配列の例には、RefSeq登録番号CAA26636.1のT細胞受容体α鎖 (配列番号:95)、RefSeq登録番号C25777のT細胞受容体β鎖 (配列番号:96)、RefSeq登録番号A26659のT細胞受容体γ1鎖 (配列番号:97)、RefSeq登録番号AAB63312.1のT細胞受容体γ2鎖 (配列番号:98)、およびRefSeq登録番号AAA61033.1のT細胞受容体δ鎖 (配列番号:99) が含まれる。
本明細書で用いられる語句「CD3結合活性を有する抗原結合ドメイン」または「抗CD3抗原結合ドメイン」は、CD3の部分ペプチドの全体または一部に特異的に結合する抗原結合ドメインのことをいう。CD3結合活性を有する抗原結合ドメインは、エピトープが、ヒトCD3を構成するγ鎖、δ鎖、またはε鎖配列に存在する限り、任意のエピトープ結合ドメインであってよい。CD3を構成するγ鎖、δ鎖、またはε鎖の構造に関して、それらのポリヌクレオチド配列は、RefSeq登録番号NM_000073.2、NM_000732.4、およびNM_000733.3に開示されており、ならびにそれらのポリペプチド配列は、配列番号:100 (NP_000064.1)、101 (NP_000723.1)、および102 (NP_000724.1) に示されており、この場合RefSeq登録番号はカッコ内に示される。
「多重特異性抗原結合分子」とは、2種類以上の抗原に特異的に結合する抗原結合分子のことをいう。好ましい態様において、本発明の多重特異性抗原結合分子は、2つまたはそれ以上の抗原結合ドメインを含み、異なる抗原結合ドメインは異なる抗原に特異的に結合する。
例えば、多重特異性抗体の会合化には、抗体H鎖の第2の定常領域または第3の定常領域(CH2またはCH3)の界面に静電気的反発を導入することにより望ましくないH鎖会合を抑制する技術を適用することができる(WO2006/106905)。
(a) グルタミン酸(E)およびアスパラギン酸(D)、ならびに
(b) リジン(K)、アルギニン(R)、およびヒスチジン(H)。
用語「がん」および「がん性」は、調節されない細胞成長/増殖によって典型的に特徴づけられる哺乳動物における生理学的状態のことをいうまたは説明するものである。がんの例は、がん腫、リンパ腫(例えば、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫)、芽細胞腫、肉腫、および白血病を含むが、これらに限定されない。そのようながんのより詳細な例は、扁平上皮細胞がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺の腺がん、肺の扁平上皮がん、腹膜のがん、肝細胞がん、消化管がん、膵がん、神経膠腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝がん、膀胱がん、ヘパトーマ、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜または子宮がん、唾液腺がん、腎がん、肝がん、前立腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝細胞がん、白血病および他のリンパ球増殖性障害、ならびに様々なタイプの頭頸部がんを含む。
用語「腫瘍」は、悪性か良性かによらず、すべての新生物性細胞成長および増殖ならびにすべての前がん性およびがん性細胞および組織のことをいう。用語「がん」、「がん性」、「細胞増殖性障害」、「増殖性障害」および「腫瘍」は、本明細書でいう場合、相互に排他的でない。
用語「結腸直腸腫瘍」または「結腸直腸がん」は、例えば腺がん、および、リンパ腫および扁平上皮細胞がんなどのより一般的でない形態を含む、結腸(盲腸から直腸までの大腸)および直腸を含む大腸の任意の腫瘍またはがんのことをいう。
用語「胃腫瘍(gastric tumor)」または「胃がん(gastric cancer)」または「胃腫瘍(stomach tumor)」または「胃がん(stomach cancer)」は、胃の任意の腫瘍またはがん(例えば腺がん(例えば、びまん型および腸型)ならびにリンパ腫、平滑筋肉腫、および扁平上皮細胞がんなどのより一般的でない形態を含む)のことをいう。
用語「薬学的製剤」は、その中に含まれた有効成分の生物学的活性が効果を発揮し得るような形態にある調製物であって、かつ製剤が投与される被験体に許容できない程度に毒性のある追加の要素を含んでいない、調製物のことをいう。
「薬学的に許容される担体」は、被験体に対して無毒な、薬学的製剤中の有効成分以外の成分のことをいう。薬学的に許容される担体は、これらに限定されるものではないが、緩衝液、賦形剤、安定化剤、または保存剤を含む。
本明細書で用いられる「治療」(および、その文法上の派生語、例えば「治療する」、「治療すること」など)は、治療される個体の自然経過を改変することを企図した臨床的介入を意味し、予防のためにも、臨床的病態の経過の間にも実施され得る。治療の望ましい効果は、これらに限定されるものではないが、疾患の発生または再発の防止、症状の軽減、疾患による任意の直接的または間接的な病理的影響の減弱、転移の防止、疾患の進行速度の低減、疾患状態の回復または緩和、および寛解または改善された予後を含む。いくつかの態様において、本発明の抗体は、疾患の発症を遅らせる、または疾患の進行を遅くするために用いられる。
本発明の薬学的組成物、本発明の、細胞傷害を誘導するための治療剤、細胞成長抑制剤、または抗がん剤は、必要に応じて、異なる種類の多重特異性抗原結合分子と共に製剤化することができる。例えば、本発明の複数の多重特異性抗原結合分子のカクテルによって、ある抗原を発現する細胞に対する細胞傷害作用を強化することができる。
図1は、TCGA研究ネットワーク:http://cancergenome.nih.gov/によって作成されたデータに基づくRNF43 mRNA発現プロファイルを示す。TCGAからダウンロードしたデータを用いて解析した正常組織および腫瘍組織におけるヒトRNF43 mRNA発現プロファイルが、箱ひげ図として示されている。データは、最小値、最大値、および3つの四分位点からなる。箱は四分位範囲を示す。箱の中の線は中央値を示す。箱の外側に伸びている線および点は、最小値および最大値を示す。結果から、RNF43のmRNA発現が、複数のがん型において、特に消化管腫瘍組織において上方制御されることが示される。
そのC末端にFlagタグを伴ったヒトRNF43 ECDのアミノ酸1〜190を含む合成ポリペプチド (配列番号:1) を、FreeStyle293F細胞株 (Thermo Fisher) を用いて一過性に発現させた。該合成ポリペプチドを発現している馴化培地を、抗Flag M2アフィニティ樹脂 (Sigma) が充填されたカラムに適用し、Flagペプチド (Sigma) を用いて溶出した。該合成ポリペプチドを含む画分を収集し、続いて、1×D-PBSで平衡化されたSuperdex 200ゲル濾過カラム (GE healthcare) に供した。次いで、該合成ポリペプチドを含む画分をプールし、セ氏-80度 (℃) で貯蔵した。
そのC末端にFc領域が融合されたヒトRNF43 ECD(RNF43-Fcと命名した、配列番号:128)を、FreeStyle293F細胞株 (Thermo Fisher) を用いて一過性に発現させた。RNF43-Fcを発現している馴化培地を、HiTrap MabSelect SuReカラム (GE healthcare) を用いて精製した。RNF43-Fcを含む画分を収集し、続いて、1×D-PBSで平衡化されたSuperdex 200ゲル濾過カラム (GE healthcare) に供した。次いで、RNF43-Fcを含む画分をプールし、-80℃で貯蔵した。
C末端FLAGタグを伴った切断型ヒトRNF43からなる配列番号:2に記載されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを、pCXND3発現ベクターに挿入した (WO/2008/156083)。
抗RNF43単一特異性抗体を、以下のように調製し、選択し、アッセイした。
実施例5.1 抗体の膜RNF43への結合解析
図2aおよび2bは、FACS解析によって決定された、抗RNF43抗体のBa/F3 E12トランスフェクタントおよびNUGC-4がん細胞株への結合を示す。
pH 7.4でのヒトRNF43に対する抗RNF43単一特異性抗体のアフィニティを、Biacore T200機器 (GE Healthcare) を用いて25℃で決定した。アミンカップリングキット (GE Healthcare) を用いて、抗ヒトFc (GE Healthcare) をCM4センサーチップのすべてのフローセル上に固定化した。抗体および分析物はすべて、20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05% Tween 20、0.005% NaN3を含有するpH7.4のACES中で調製した。各抗体を抗ヒトFcによってセンサー表面上に捕捉した。抗体捕捉レベルは、312共鳴単位 (RU) を目指した。組換えヒトRNF43を、4倍段階希釈によって調製した200 nM、50 nM、および12.5 nMで注入し、続いて解離させた。センサー表面は、各サイクルごとに3M MgCl2で再生した。Biacore T200 Evaluationソフトウェア、バージョン2.0 (GE Healthcare) を用いてデータを処理し、1対1結合モデルにフィッティングさせることにより、結合アフィニティを決定した。
実施例6.1 がん細胞表面上のRNF43の絶対的定量化
培養がん細胞株(SW48、LS1034、およびLS513はATCCから購入し;PC-10はIBLから購入し、NUGC4はHSRRBから購入した)の細胞表面上のRNF43の抗体結合能 (ABC) を、フローサイトメトリーを用いてQIFIKIT (DAKO) によって評価した。
実施例6.2.1 ヒト末梢血単核細胞(PBMC溶液)の調製
初代ヒトPBMC溶液は、健常ボランティアから新たに単離するか、または示されている場合には凍結形態で購入した (STEMCELL)。
表2に記載される抗RNF43単一特異性抗体および抗CD3抗体(配列番号:25および26)を用いて、他所で公表された従来法を使用して抗RNF43/CD3二重特異性抗体を作製した。抗RNF43/CD3二重特異性抗体中のRNF43結合アームのCDR配列を表4に示す。
Aは、抗体を添加していない(標的細胞およびヒトPBMCのみを含む)ウェルにおける平均Cell Index値を表し、Bは標的ウェルの平均Cell Index値を表す。実験は3つ組で行った。
上記の抗体のうちのいくつかを、担がんモデルを用いてそれらのインビボ有効性について評価した。
8.1 ウサギ定常領域を有する抗RNF43単一特異性抗体の調製
実施例4において調製したプラスミドを、PCRによる可変領域の増幅のための鋳型として使用し、ウサギ重鎖定常領域 (配列番号:126) およびウサギ軽鎖定常領域 (配列番号:127) をコードするDNAと組み換えた。クローニングされた抗体をFreeStyle(商標)293-F細胞 (Invitrogen) において発現させ、培養上清から精製した。
50マイクログラム (μg) の精製抗体を2μgのNHS-PEG2-ビオチン (PIERCE) に対して氷上で2時間インキュベートすることにより、抗体のビオチン化を行った。次いで、PBS中でEasy Sepチャンバー (TOMY) を用いて、透析により遊離ビオチンを除去した。
最初に、RNF43-Fc(実施例2に記載)に対する各抗RNF43単一特異性抗体の結合のEC50濃度を、ビオチン化抗体を用いてELISAアッセイにより決定した。簡潔に説明すると、5μg/mLまたは1μg/mLのRNF43-Fcを、Maxisorpプレート (NUNC) 上に4℃で一晩コーティングした。次いでコーティングプレートをPBS-Tで洗浄し、続いてBlocking One溶液 (Nacalai Tesque) で室温にて2時間ブロックした。次いで、段階希釈したビオチン化抗RNF43単一特異性抗体を添加し、室温で1時間インキュベートした。PBS-Tで洗浄した後、StAv-HRP (PIERCE) を添加し、室温で1時間インキュベートした。PBS-Tで洗浄した後、ABTSペルオキシダーゼ基質 (SeraCare Life Sciences) を添加し、Multiskan(商標)GOマイクロプレート分光光度計を用いてシグナル強度を測定した。RNF43-Fcに対する抗RNF43単一特異性抗体の結合のEC50濃度を、非線形回帰4パラメータフィットを用いて算出した。抗RNF43抗体のEC50濃度を当てはめた場合に測定された、405nm/570nmにおける正規化吸光度をAOとして表す。
抗RNF43単一特異性抗体間の結合競合を評価するために、同様の設定によるELISAアッセイを行った。RNF43-Fcを最初にMaxisorpプレートに一晩コーティングした。コーティングプレートをBlocking One溶液でブロックし、続いてその各EC50の10倍濃度の非ビオチン化型の第1抗体(被験抗体)と共に15分間インキュベートした。洗浄せずに、ビオチン化型の第2抗体(参照抗体)をそのEC50濃度で添加し、室温で1時間インキュベートした。PBS-Tで洗浄した後、ABTSペルオキシダーゼ基質を添加し、Multiskan(商標)GOマイクロプレート分光光度計を用いてシグナル強度を測定した。405nm/570nmにおける正規化吸光度をAとして表す。
以下の式を用いて、結合阻害 (%) を算出した:
図6は、抗RNF43単一特異性抗体間の結合阻害を示す。ビニングは、20%結合阻害のカットオフ値を用いて決定したが、これは、抗体間の結合阻害が20%未満である抗体が、異なるビンに分類されたことを意味する。言い換えると、被験抗体Ab1が、参照抗体として別の抗体Ab2を用いた場合に、20%を超える結合阻害を示し、かつAb2を被験抗体として用い、Ab1を参照抗体として用いた場合に、抗体Ab2もまた20%を超える結合阻害を示すのであれば、抗体Ab1およびAb2は同じビンに分類される。抗体は以下のように4つのビンに分類された:RNN0207iiはビンA;RNN0187jjおよびRNN0192nnはビンB;RNN0193jjはビンC;RNN0242nnおよびRNN0246jjはビンD。
本発明は、強力な抗腫瘍活性、およびがん抗原に非依存的なサイトカインストーム等を誘導しないという優れた安全性特性、および長い血中半減期を有する、新規な多重特異性抗原結合分子を提供する。本発明の抗原結合分子を有効成分として含む細胞傷害誘導剤は、RNF43発現細胞、およびこれらの細胞を含有する腫瘍組織を標的化し、細胞損傷を誘導し得る。本発明の多重特異性抗原結合分子を患者に投与することにより、安全性のレベルが高いばかりでなく、身体的負担が軽減されかつ利便性が高い、望ましい治療が可能になる。
Claims (15)
- RNF43結合活性を有する第1抗原結合ドメインとT細胞受容体複合体結合活性を有する第2抗原結合ドメインとを含む多重特異性抗原結合分子。
- 細胞傷害性を有する、請求項1に記載の多重特異性抗原結合分子。
- 細胞傷害性がT細胞依存性の細胞傷害性である、請求項1または2に記載の多重特異性抗原結合分子。
- T細胞受容体複合体結合活性がT細胞受容体に対する結合活性である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合分子。
- T細胞受容体複合体結合活性がCD3ε鎖に対する結合活性である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合分子。
- ヒトRNF43結合活性が、真核細胞の表面上のヒトRNF43に対する結合活性である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合分子。
- 第1抗原結合ドメインが、抗体可変断片を含むドメインであり、かつ/または第2抗原結合ドメインが、抗体可変断片を含むドメインである、請求項1〜6のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合分子。
- 第1抗原結合ドメインが、Fab構造を含むドメインであり、かつ/または第2抗原結合ドメインが、Fab構造を含むドメインである、請求項1〜7のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合分子。
- 第1抗原結合ドメインが、以下の抗体可変断片のうちのいずれか1つを含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合分子:
(a) 配列番号:28のアミノ酸配列を含むHVR-H1、配列番号:48のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および配列番号:68のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含む抗体重鎖可変領域、ならびに配列番号:38のアミノ酸配列を含むHVR-L1、配列番号:58のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および配列番号:78のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む抗体軽鎖可変領域を含む、抗体可変断片;
(b) 配列番号:31のアミノ酸配列を含むHVR-H1、配列番号:51のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および配列番号:71のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含む抗体重鎖可変領域、ならびに配列番号:41のアミノ酸配列を含むHVR-L1、配列番号:61のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および配列番号:81のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む抗体軽鎖可変領域を含む、抗体可変断片;
(c) 配列番号:33のアミノ酸配列を含むHVR-H1、配列番号:53のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および配列番号:73のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含む抗体重鎖可変領域、ならびに配列番号:43のアミノ酸配列を含むHVR-L1、配列番号:63のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および配列番号:83のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む抗体軽鎖可変領域を含む、抗体可変断片;
(d) 配列番号:34のアミノ酸配列を含むHVR-H1、配列番号:54のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および配列番号:74のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含む抗体重鎖可変領域、ならびに配列番号:44のアミノ酸配列を含むHVR-L1、配列番号:64のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および配列番号:84のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む抗体軽鎖可変領域を含む、抗体可変断片;
(e) 配列番号:35のアミノ酸配列を含むHVR-H1、配列番号:55のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および配列番号:75のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含む抗体重鎖可変領域、ならびに配列番号:45のアミノ酸配列を含むHVR-L1、配列番号:65のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および配列番号:85のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む抗体軽鎖可変領域を含む、抗体可変断片;
(f) (a)〜(e)の抗体可変断片のうちのいずれか1つとヒトRNF43への結合に関して競合する抗体可変断片;ならびに
(g) (a)〜(e)の抗体可変断片のうちのいずれか1つがヒトRNF43上で結合するのと同じエピトープに結合する抗体可変断片。 - Fcγ受容体結合活性が低下したFc領域を含むドメインをさらに含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合分子。
- RNF43結合活性を有する第1抗体可変断片と、CD3ε鎖結合活性を有する第2抗体可変断片と、Fcγ受容体結合活性が低下したFc領域とを含む二重特異性抗体である、請求項1〜10のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合分子。
- 請求項1〜11のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合分子を含む薬学的組成物。
- 請求項1〜11のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合分子を含む、細胞傷害の誘導における使用のための薬学的組成物。
- 請求項1〜11のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合分子を含む、がんの治療または予防における使用のための薬学的組成物。
- がんが結腸直腸がんまたは胃がんである、請求項14に記載の薬学的組成物。
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