JP2020075879A

JP2020075879A - 抗ｒｎｆ４３抗原結合分子及びその使用

Info

Publication number: JP2020075879A
Application number: JP2018209718A
Authority: JP
Inventors: 徳行高橋; Noriyuki Takahashi
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2018-11-07
Filing date: 2018-11-07
Publication date: 2020-05-21

Abstract

【課題】RNF43内の新規エピトープを標的とする抗原結合分子の提供、及び、RNF43発現細胞に近いT細胞を有することによって癌治療を可能にする多重特異性抗原結合分子の提供。【解決手段】本開示は、RNF43結合活性を有する第1の抗原結合ドメインを含む抗原結合分子を提供する。本開示はまた、RNF43結合活性を有する第1の抗原結合ドメインおよびT細胞受容体複合体結合活性を有する第2の抗原結合ドメインを含む多重特異性抗原結合分子を提供する。このような抗原結合分子の製造方法には、このような抗原結合分子を含む医薬組成物、抗原結合分子等の用途も提供される。【選択図】なし

Description

本開示は、RNF43結合活性を有する第1の抗原結合ドメインを含む抗原結合分子、RNF43結合活性を有する第1の抗原結合ドメインを含む多重特異性抗原結合分子に関する。T細胞受容体複合結合活性を有する第2の抗原結合ドメイン、その使用、およびそのような。

癌は世界的に死亡の主要な原因の一つです。一部の癌腫を除いて、腫瘍が見つかればしばしば作動不能である。従来のがん治療には、放射線療法、化学療法、免疫療法などがあります。これらの治療はしばしば十分に有効ではなく、最終的には癌の再発または転移が治療後に起こる。腫瘍特異性の欠如は、最大有効性を制限する要因の一つである。

ユビキチンE3リガーゼリングフィンガータンパク質43（RNF43）は、シングルパスタイプ1膜貫通タンパク質です。RNF43は、Wntシグナル伝達経路の負のフィードバックレギュレーターとして提案されています（NPL 1）。 RNF43は結腸直腸腫瘍で上方制御される遺伝子の1つであり、肝細胞癌ではmRNAレベルとタンパク質レベルの両方で頻繁に過剰発現するが、正常では顕著に発現しないという事実に基づいて、RNF43を癌遺伝子とみなしている報告もあります。組織（NPL 2）.RNF43のノックダウンが癌細胞株の増殖を阻害することも実証されています（NPL 2および3）。一方、他のいくつかの報告では、RNF43は、 RNF43のタンパク質レベルで膵臓癌や胃癌などの腫瘍組織でダウンレギュレートされ、RNF43の過剰発現は癌細胞株の増殖を抑制します（NPL 4および5）。また、RNF43は膵臓癌で頻繁に変異する遺伝子の1つであり、RNF43の発現低下はそのような変異の存在に関連し、これはRNF43の腫瘍抑制機能を示唆しています（非特許文献6）。その結果、がん治療の標的としてのRNF43はまだ評価されていません。

Nature. 2012 Aug 30;488(7413):665-9. Int J Oncol. 2004 Nov;25(5):1343-8 Mol Cancer Ther. 2013 Jan;12(1):94-103 Tumour Biol. 2016 Jan;37(1):627-31. Cell Physiol Biochem. 2015;36(5):1835-46. Mod Pathol. 2015 Feb;28(2):261-7.

本開示の目的は、RNF43内の新規エピトープ及びその製造方法を標的とする抗原結合分子を提供することである。本開示の別の目的は、RNF43発現細胞及びその製造方法に近いT細胞を有することにより癌治療を可能にする多重特異性抗原結合分子を提供することである。本開示のさらなる目的は、このような抗原結合分子およびそのような抗原結合分子を使用する方法を含む医薬組成物を提供することである。

本開示は、RNF43結合活性を有する第1の抗原結合ドメインを含む抗原結合分子を提供し、RNF43内の新しいエピトープに結合し、その使用を行う。本開示はまた、前述の第1の抗原結合ドメインを含む多重特異性抗原結合分子、およびT細胞受容体複合体結合活性を有する第2の抗原結合ドメインを提供する。さらに、本開示は、抗原結合分子を有効成分とすることにより、種々の癌腫、特にRNF43陽性腫瘍を治療できる医薬組成物を提供する。

具体的には、本開示は以下を提供する。
[1]RNF43結合活性を有する第1の抗原結合ドメインを含む抗原結合分子は、ここで第1の抗原結合ドメイン(a)から(c)から選択されたものを含む。
(a)配列番号2のアミノ酸配列を含むHVR-H1を含む抗体重鎖可変領域を含む抗体断片、配列番号3のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および配列番号4のアミノ酸配列を含むHVR-H3、配列番号6のアミノ酸配列を含むHVR-L1を含む抗体軽鎖可変領域と、配列番号7のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および配列番号8のアミノ酸配列を含むHVR-L3;
(b)(a)のいずれかの抗体断片とRNF43との結合を競合する抗体断片。そして
(c)(a)の抗体断片のいずれかがRNF43上で結合するのと同じエピトープに結合する抗体断片。
[2][1]の抗原結合分子は、ここでRNF43結合活性が真核細胞の表面上のRNF43に対する結合活性である。
[3][2]の抗原結合分子とは、真核細胞がトランスフェクタント細胞または癌細胞である。
[4][1]〜[3]のいずれかの抗原結合分子は、RNF43がヒトRNF43である。
[5][1]〜[4]のいずれかの抗原結合分子は、ここで抗原結合分子が細胞細胞傷害性を有する。
[6][5]の抗原結合分子は、前述する細胞傷害性が抗体依存性細胞傷害性(ADCC)、または補体依存性細胞傷害性(CDC)である。
[7]T細胞受容体複合結合活性を有する第2の抗原結合ドメインをさらに含む[1]〜[5]のいずれかの抗原結合分子。
[8][7]の抗原結合分子は、ここで抗原結合分子がT細胞依存性細胞傷害性を有する。
[9][7]または[8]の抗原結合分子は、前述する抗原結合分子が、その表面上のRNF43発現細胞に対する細胞細胞傷害性を有する。
[10][9]の抗原結合分子は、ここでRNF43発現細胞が癌細胞である。
[11][7]〜[10]のいずれかの抗原結合分子は、T細胞受容体の複合結合活性がT細胞受容体に対する結合活性を有する。
[12][7]〜[10]のいずれかの抗原結合分子は、T細胞受容体複合体結合活性がCD3イプシロン鎖に対する結合活性を有する。
[13] [1]〜[12]のいずれかの抗原結合分子は、第1の抗原結合ドメインが抗体重鎖可変領域および抗体軽鎖可変領域を含むドメインであり、第2の抗原結合ドメインはドメインである抗体重鎖可変領域および抗体軽鎖可変領域を含む。
[14] [1]〜[13]のいずれかの抗原結合分子は、第1の抗原結合ドメインが、抗体重鎖可変領域および抗体軽鎖可変領域を含むFab構造を含むドメインであり、第2の抗原結合ドメインは、抗体重鎖可変領域および抗体軽鎖可変領域を含むFab構造を含むドメインである。
[15] [13]または[14]の抗原結合分子は、前者の抗体重鎖可変領域および抗体軽鎖可変領域とマウスまたはウサギフレームワーク配列を含む。
[16] [13]または[14]の抗原結合分子は、前記抗体重鎖可変領域および抗体軽鎖可変領域がヒト化される。
[17][1]〜[16]のいずれかの抗原結合分子は、前述する抗原結合分子がFcドメインをさらに含む。
[18][17]の抗原結合分子は、前例において、Fcドメインが、SEQ ID NNのアミノ酸を構成するFcドメインから選択されるものである:9〜12(IgG1〜IgG4)である。
[19][17]の抗原結合分子は、前例において、Fcドメインにおいて、Fcガンマ受容体結合活性が低下している。
[20][19]の抗原結合分子は、前例において、FcドメインがIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4抗体のFcドメインと比較して減少したFcガンマ受容体結合活性を有する。

[21] [17]または[19]または[20]の抗原結合分子は、前例において、配列領域が配列番号を構成する任意のFc領域でアミノ酸変異を有するFc領域である:9〜12(IgG1〜IgG4)。
[22][21]の抗原結合分子は、前置Fc領域において、EUナンバリングによって指定される以下のアミノ酸位置から選択される少なくとも1つのアミノ酸の変異を有するFc領域である。
位置 220、位置 226、位置 229、位置 231、位置 232、位置 233、位置 234、位置 235、位置 236、位置 237、位置 238、位置 239、位置 240、位置 264、位置 265、位置 266、位置 267、位置 269、位置 269、位置270、位置 295、位置 296、位置 297、位置 298、位置 299、位置 300、位置 325、位置 327、位置 328、位置 329、位置 330、位置 331、および位置 332。
[23][1]〜[22]のいずれかの抗原結合分子は、前もって抗原結合分子がIgG抗体である。
[24][1]〜[23]のいずれかの抗原結合分子は、前記抗原結合分子が二重特異性抗体である。
[25] [1]〜[24]のいずれかの抗原結合分子は、ここで抗原結合分子がRNF43結合活性を有する第1の抗体可変断片を含む二重特異性抗体であり、CD3イプシロンを有する第2の抗体可変断片である。鎖結合活性は、Fcγ受容体結合活性を低下させたFc領域とする。
[26] [1]〜[25]のいずれかの抗原結合分子をコードする核酸。
[27][26]の核酸が導入されるベクター。
[28][26]または[27]のベクターの核酸を含む細胞。
[29][28]の細胞を培養することにより[1]〜[25]のいずれかの抗原結合分子を製造する方法。
[30] [29]の方法により産生される抗原結合分子。
[31] [1]〜[25]のいずれかの抗原結合分子と薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
[32] [1]〜[25]のいずれかの抗原結合分子を含む細胞細胞傷害性を誘導する際に使用する医薬組成物。
[33] 癌の治療または予防に使用する医薬組成物であり、[1]〜[25]のいずれかの抗原結合分子を含む。
[34][33]の医薬組成物は、前例えば癌が大腸癌または胃癌である。
[35] 癌を治療または予防する方法は、[1]〜[25]のいずれかの抗原結合分子が、その必要とする患者に投与される。
[36][35]の方法は、癌が大腸癌または胃癌である。
[37] 医薬として使用する[1]〜[25]のいずれかの抗原結合分子。
[38] 癌の治療に用いる[1]〜[25]のいずれかの抗原結合分子。
[39] 大腸癌または胃癌の治療に使用する[1]〜[25]のいずれかの抗原結合分子。
[40] 医薬品の製造における[1]〜[25]のいずれかの抗原結合分子の使用。
[41] 癌の治療のための医薬の製造における[1]〜[25]のいずれかの抗原結合分子の使用。
[42] 大腸癌または胃癌の治療のための医薬の製造における[1]〜[25]のいずれかの抗原結合分子の使用。
[43] [1]〜[25]のいずれか1の抗原結合分子と細胞傷害性薬剤を含む免疫コンジュゲート。
[44]RNF43を検出する方法は、[1]〜[25]のいずれかの抗原結合分子に試料を接触させることを含む。

本開示は、RNF43結合活性を有する第1の抗原結合ドメインを含む抗原結合ドメインを提供し、RNF43内の新しいエピトープに結合し、癌治療、予防および診断に使用することができる。本開示はまた、RNF43発現細胞に近いT細胞を有し、RNF43発現癌細胞に対してT細胞の細胞傷害性を用いることによって癌治療および予防を可能にする多重特異性抗原結合分子を開示する。抗原結合分子を製造する方法、およびこのような抗原結合分子を含む治療薬を細胞細胞傷害性を誘導するための有効成分として、癌治療の新しいアプローチとして開示されている。

TCGAからダウンロードしたデータを用いて構築された正常組織および腫瘍組織におけるヒトRNF43 mRNA発現プロファイルの箱ひげプロット図。 FACS分析により決定されるBa/F3 E12トランスフェクタントへの抗RNF43単一特異性抗体RNN0802の結合。癌細胞表面におけるRNF43の抗体結合能(ABC)。

本明細書に記載または参照される技術および手順は、一般によく理解され、一般的に、例えば、Sambrookらに記載されている広く利用されている方法論など、当業者によって従来の方法論を使用して採用される。分子クローニング:ラボマニュアル3D版(2001)コールドスプリングハーバー研究所プレス、コールドスプリングハーバー、N.Y.;分子生物学における現在のプロトコル(F.M.オースベル、他のeds.、(2003));酵素学のシリーズ方法(アカデミックプレス社):PCR 2:実用的なアプローチ(M.J.マクファーソン、B.D.ヘイムズとG.R.テイラー編)、ハーローとレーン、(1988)抗体、実験マニュアル、動物細胞培養(R.I.フレッシュニー編)。オリゴヌクレオチド合成 (M.J. ゲイト, エド, 1984);分子生物学、ヒューマナプレスの方法;細胞生物学:研究室ノート(J.E.セリス、1998年)アカデミックプレス;動物細胞培養(R.I.フレッシュニー), 作, 1987);細胞・組織培養入門(J.P.メイザーとP.E.ロバーツ、1998年)プレナムプレス;細胞・組織培養:実験手順(A.ドイル、J.B.グリフィス、D.G.ニューウェル編、1993-8) J.ワイリーと息子;実験免疫学ハンドブック(D.M.ウィアーとC.C.ブラックウェル、エド);哺乳類細胞の遺伝子導入ベクター (J.M. ミラーと M.P. Calos, 編, 1987);PCR: ポリメラーゼ連鎖反応, (Mullis et al., eds., 1994);免疫学における現在のプロトコル (J.E. コリガンら, eds., 1991);分子生物学における短いプロトコル(ワイリーと息子、1999);免疫生物学(C.A.ジェーンウェイとP.トラバース、1997);抗体 (P. フィンチ, 1997);抗体:実用的なアプローチ(D.キャッティ、エド、IRLプレス、1988-1989);モノクローナル抗体:実践的アプローチ(P.シェパードとC.ディーン、エド、オックスフォード大学出版局、2000年);抗体の使用:ラボマニュアル(E.ハーロウとD.レーン(コールドスプリングハーバー研究所プレス、1999)。抗体(M.ザネッティとJ.D.カプラ、論文、ハーウッドアカデミック出版社、1995);癌:腫瘍学の原理と実践(V.T.デヴィータら、編、J.B.リッピンコット社、1993年)。

抗原結合分子
"抗原結合分子"という用語は、本明細書で使用される場合、抗原結合ドメインを含む任意の分子を指し、さらに約5アミノ酸以上の長さを有するペプチドまたはタンパク質などの分子を指し得る。ペプチドおよびタンパク質は、生体由来のものに限定されず、例えば、人工的に設計された配列から産生されるポリペプチドであってもよい。それらはまた、天然に存在するポリペプチド、合成ポリペプチド、組換えポリペプチド、およびそのようなもののいずれであってもよい。用語「抗原結合分子」は、単一特異性抗原結合分子または多重特異性抗原結合分子のいずれかを指し得る。

本開示の抗原結合分子の一例は、複数の抗原結合ドメインを含む抗原結合分子である。特定の実施形態において、本開示の抗原結合分子は、異なる抗原結合特異性を有する2つの抗原結合ドメインを含む抗原結合分子である。特定の実施形態において、本開示の抗原結合分子は、異なる抗原結合特異性を有する2つの抗原結合ドメインを含む2つの抗原結合分子を含む、および抗体Fc領域に含まれるFcRn結合ドメイン。生体に投与されたタンパク質の血液半減期を延ばす方法として、目的のタンパク質に抗体のFcRn結合ドメインを添加し、FcRn媒介リサイクルの機能を利用する方法は、よく知られている。

抗原結合ドメイン
"抗原結合ドメイン"という用語は、本明細書で使用される場合、抗原の全体または一部に特異的に結合し、相補的である領域を含む抗体部分を指す。抗原の分子量が大きい場合、抗体は抗原の特定の部分にのみ結合できます。特定の部分は "エピトープ" と呼ばれます。抗原結合ドメインは、1つ以上の抗体可変ドメインから提供することができる。好ましくは、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域(VL)および抗体重鎖可変領域(VH)の両方を含む。このような好ましい抗原結合ドメインとしては、例えば、"単鎖Fv(scFv)"、"単鎖抗体"、"Fv"、"シングルチェーンFv2(scFv2)"、"Fab"、および"F(ab')2"が挙げられる。

本開示の抗原結合分子の抗原結合ドメインは、同じエピトープに結合し得る。エピトープは、配列番号18または26のアミノ酸配列を含むタンパク質中に存在することができる。あるいは、本開示のポリペプチド複合体の抗原結合ドメインは、異なるエピトープに個別に結合し得る。エピトープは、配列番号18または26のアミノ酸配列を含むタンパク質中に存在することができる。

本開示"の抗原結合分子の抗原結合ドメインは、RNF43-またはT細胞受容体複合体結合活性を有する" を有する。すなわち、RNF43とT細胞受容体複合体が目的の抗原であることが好ましい。本明細書で使用される場合、フレーズ"結合活性を有する"は、抗原結合ドメインの活性を指し、抗体、抗原結合分子、抗体断片、またはそのようなもの(以下、"抗原結合ドメインまたはそのような")で目的の抗原に結合する非特異的またはバックグラウンドバインドのレベルより高い特定のバインドのレベル。言い換えれば、このような抗原結合ドメインまたはそのような"は、目的の抗原に向かって特異的/有意な結合活性を有する"。特異性は、本明細書または当該分野で公知のように親和性または結合活性を検出するための任意の方法によって測定することができる。上記の特異的結合のレベルは、有人が有意であると認識されるほど高いとすることができる。例えば、熟練者が抗原結合ドメイン等と適切な結合アッセイに関与する抗原との間の有意または比較的強いシグナルまたは結合値を検出または観察できる場合、抗原結合といえる。ドメインなどは、目的の抗原に対して "特異的/有意な結合活性" を有する。または、"特異的/有意な結合活性を有する" は、"特異的/有意に結合" (目的の抗原に対して) として再び言い換えることができます。場合によっては、"バインディングアクティビティを持つ" という語句は、当該分野における特定の/有意な結合活性を有する"という語句と実質的に同じ意味を持つ。

RNF43
本明細書で使用される用語"RNF43"は、霊長類(例えばヒト)およびげっ歯類(例えば、マウスおよびラット)などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源からの任意の天然RNF43(薬指タンパク質43)を指す。この用語には、"全長" 未処理の RNF43 と、セル内での処理の結果として生じる RNF43 の任意の形式が含まれます。この用語はまた、RNF43の天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体またはアレル変異体を包含する。例示的なヒトRNF43のアミノ酸配列は、配列番号13に示されている。

RINGフィンガータンパク質43(RNF43;E3ユビキチンタンパク質リガーゼRNF43、またはRNF124とも呼ばれる)は、WNTシグナル伝達の重要なフィードバックレギュレータとして機能するシングルパス1型膜貫通タンパク質である。代表的なRNF43タンパク質オルソログは、ヒト(NP_060233、 SEQ ID 番号: 13)、チンパンジー(XP_001172611、SEQ ID番号:14)、アカゲザル(XP_001106574、SEQ ID番号:15)、ラット(NP_001129393、SEQ ID番号:16)、およびマウス(NP_76603、番号、番号、番号6)、およびマウス(NP_76603、番号、番号、番号)、: 17).ヒトにおいて、RNF43遺伝子は、染色体17上の約63.9kBpにわたる10個のエキソンからなるが、細胞遺伝学的位置17q22で構成されている。ヒトRNF43遺伝子座の転写は、スプライスされた4.6kBp成熟mRNA転写物(NM_017763)を生じ、783アミノ酸プレプロテインをコードする(NP_060233、配列番号13)。RNF43プレタンパク質の処理は、分泌シグナルペプチドを含む最初の23アミノ酸の除去を伴うことを予測される。成熟RNF43タンパク質は、細胞外ドメインに174個のアミノ酸(SEQ ID NO:13のアミノ酸24〜197)、21アミノ酸ヘリカル膜貫通ドメイン(アミノ酸198-218のSEQ ID NO:13)、および565アミノ酸シトプラズマドメイン(アミノ酸23)を含むと予測されています。19-783のSEQ ID NO:13)の一部は、タンパク質がその名前を由来する非定型RINGドメインジンクフィンガー(アミノ酸272〜313のSEQ ID NO:13)を含む。RINGドメインは、タンパク質間相互作用を媒介するジンクフィンガー構造の形成にリンクされた配列定義ドメインであり、タンパク質ユビキチル化プロセスに関与するタンパク質に一般的に見られます。

アフィニティ
「アフィニティ」は、分子の単一結合部位(例えば、抗原結合分子または抗体)とその結合パートナー(例えば、抗原)との間の非共有相互作用の合計の強さを指す。特に断りのない限り、本明細書で使用される場合、"結合親和性"は、結合対のメンバー間の1:1の相互作用を反映する本質的な結合親和性(例えば、抗原結合分子と抗原、または抗体および抗原)を指す。そのパートナーYに対する分子Xの親和性は、一般に解離定数(Kd)で表すことができる。親和性は、当該分野で公知の一般的な方法によって測定することができ、本明細書に記載されるものを含む。結合親和性を測定するための具体的な例示および例示的な実施形態は、以下に記載される。

アフィニティを決定する方法
特定の実施形態において、本明細書に提供される抗原結合分子または抗体の抗原結合ドメインは、1マイクロM以下の解離定数(Kd)を有し、120nM以下、100nM以下、80nM以下、70nM以下、50nM以下、40nM以下、30nM以下、20nM以下、10nM以下、2nM以下、1nM以下、0.1nM以下、0.01nM以下、又は0.001nM以下(例えば、10-8M以下、10-8M以下、10-8M〜10-9〜M-10-M10)。特定の実施形態において、RNF43に対する抗体/抗原結合分子の第1の抗原結合ドメインのKd値は、1〜40、1〜50、1-70、1-80、30-50、30-70、30-80、40-70、40-80、または60-80nMの範囲内にある。

一実施形態において、Kdは、放射性標識抗原結合アッセイ(RIA)によって測定される。一実施形態では、RIAは、目的の抗体とその抗原のFabバージョンで行われる。例えば、抗原に対するFabsの溶液結合親和性は、標識されていない抗原の滴定系列の存在下で最小限の濃度(125I)標識抗原でFabを平衡化し、次いで抗Fabで結合した抗原を捕捉することによって測定される抗体被覆プレート(例えば、陳ら、J.Mol. Biol. 293:865-881(1999)を参照)。アッセイの条件を確立するために、MICROTITER(登録商標)マルチウェルプレート(サーモサイエンティフィック)を50mM炭酸ナトリウム(pH 9.6)で捕捉する抗Fab抗体(カッペルラボ)の5マイクロg/mlで一晩コーティングし、その後ブロックします。2%(w/v)ウシ血清アルブミンを室温で2〜5時間(約23℃)。非吸着プレート(Nunc #269620)において、100pMまたは26 pM[125I]-抗原は、目的のFabの逐次希釈と混合される(例えば、抗VEGF抗体の評価と一致する、Fab-12、プレスタら、癌Res 57:4593-4599(1997))。関心のあるファブは、一晩でインキュベートされます。しかし、インキュベーションは平衡に達することを確実にするために、より長い期間(例えば、約65時間)継続し得る。その後、混合物を室温でインキュベーションするために捕捉プレートに移す(例えば、1時間)。次に溶液を除去し、プレートをPBS中の0.1%ポリソルベート20(登録商標)で8回洗浄した。プレートが乾燥したとき、シンチラントの150マイクロl/ウェル(MICROSCINT-20 TM;パッカード)を追加し、プレートはTOPCOUNTTMガンマカウンター(パッカード)に10分間カウントされます。最大結合の20%以下を与える各Fabの濃度は、競合結合アッセイで使用するために選択されます。

別の実施形態によれば、Kdは、BIACORE(登録商標)表面プラズモン共鳴アッセイを用いて測定される。例えば、BIACORE(登録商標)-2000またはBIACORE(登録商標)-3000(ビアコア社製、ピスカタウェイ、NJ)を用いたアッセイは、約10応答単位(RU)で固定化された抗原CM5チップを用いて25度Cで行われる。一実施形態では、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサチップ(CM5、BIACORE社製)は、サプライヤーの指示に従ってN-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩(EDC)およびN-ヒドロキシスクシクシンイミド(NHS)で活性化される。抗原を10mM酢酸ナトリウムで希釈し、pH4.8、5マイクロl/ml(〜0.2マイクロM)に5マイクロl/分の流量で注入し、結合タンパク質の約10応答単位(RU)を達成する。抗原の注射に続いて、1Mエタノールアミンを注入して未反応基を遮断する。動力学測定では、Fabの2倍の連続希釈(0.78 nM〜500 nM)をPBSに0.05%のポリソルベート20(TWEEN-20TM)の界面活性剤(PBST)を約25マイクロl/minの流量で25℃で注入します。(koff)は、アソシエーションと解離センサーグラムを同時に適合させることにより、単純な1対1のラングミュア結合モデル(BIACORE(登録商標)評価ソフトウェアバージョン3.2)を用いて計算される。平衡解離定数(Kd)は、比率koff/konとして計算されます。例えば、陳ら、J.モル・ビオル 293:865-881(1999)を参照してください。上記の表面プラズモン共鳴アッセイによってオンレートが106 M-1 s-1を超える場合、蛍光発光強度の増加または減少を測定する蛍光焼入れ技術(励起=295nm;発光=)を用いてオンレートを決定できます。PBSの20nM抗抗原抗体(Fab form)の25℃で340 nm、16 nmバンドパス)、pH 7.2、ストップフロー搭載分光光光度計(Aviv Instruments)または8000-cなどの分光器で測定される抗原の濃度の増加の存在下でシリーズSLM-AMINCOTM分光光度計(サーモスペクトロニック)攪拌キュベット付き。

抗体の抗原結合ドメインの親和性を測定する方法は上述し、当業者は、他の抗原結合ドメインに対する親和性測定を行うことができる。

結合活性
「結合活性」は、分子の1つ以上の結合部位(例えば、抗原結合分子または抗体)とその結合パートナー(例えば、抗原)との間の非共有相互作用の合計の強さを指す。特に断りのない限り、本明細書で使用される場合を除き、"結合活性"は、完全結合を指し、結合対のメンバー間の1:1の相互作用(例えば、抗原結合分子と抗原、または抗体および抗原)に限定されない。そのパートナーYに対する分子Xの結合活性は、一般に、見かけの解離定数(見かけ上のKD)で表すことができる。結合活性は、当該分野で公知の一般的な方法によって測定することができ、特に親和性の測定と同様の方法によって、抗体またはその断片の多価分子がアッセイに使用され得るにもかかわらず。

抗体
本明細書において"抗体"という用語は、最も広い意味で使用され、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、および抗体を含むがこれらに限定されない様々な抗体構造を包含する。フラグメントは、所望の抗原結合活性を示す限り、

抗体のクラス
抗体の"class"は、その重鎖が有する定常ドメインまたは定常領域の種類を指します。抗体には、IgA、IgD、IgE、IgG、IgMの5つの主要なクラスがあり、そのうちのいくつかはさらにサブクラス(アイソタイプ)に分けられる可能性があり、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびmuと呼ばれます。

フレームワーク
"フレームワーク" または "FR" は、超可変領域 (HVR) 残基以外の可変ドメイン残基を指します。可変ドメインの FR は、一般に FR1、FR2、FR3、FR4 の 4 つの FR ドメインで構成されます。したがって、HVR および FR シーケンスは、一般に VH(または VL)で次のシーケンスで表示されます: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。

人間のコンセンサスフレームワーク
"ヒトコンセンサスフレームワーク" は、ヒト免疫グロブリン VL または VH フレームワークシーケンスの選択で最も一般的に発生するアミノ酸残基を表すフレームワークです。一般に、ヒト免疫グロブリンVLまたはVH配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからである。一般に、配列のサブグループは、Kabatらのようにサブグループであり、免疫学的関心のタンパク質の配列、第5版、NIH出版物91-3242、ベセッサダMD(1991)、第1〜3巻である。一実施形態では、VLに対して、サブグループは、KabatらのようにサブグループκI、supraである。一実施形態では、VHについては、サブグループは、KabatらのようにサブグループIII、supraである。

HVR
本明細書で使用される用語 "超可変領域" または "HVR" は、配列の超可変である抗体変数ドメインの各領域 ("相補性決定領域"または "CDR") と構造的に定義されたループ (" を指します) を指します。超可変ループ")および/または抗原接触残基("抗原接触")を含む。一般に、抗体は6つのHVLを含む:VHの3つ(H1、H2、H3)、およびVL(L1、L2、L3)の3つ。ここに例示的なHDRは次のとおりです。
(a)アミノ酸残基で発生する超可変ループ 26-32 (L1),50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), 96-101 (H3) (ショティアとレスク, J. モルトビオル 196:901-977)
(b) アミノ酸残基で発生するCDR 24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)、および95-102(H3)(Kabatら、免疫学的関心のタンパク質の配列, 第5エド公衆衛生サービス, 国立衛生研究所, ベセッサダ, MD (1991));
(c)アミノ酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)、および93-101(H3)で発生する抗原接触(マッカラムら.J.モル262:732-745(199)。そして
(d)(a)、(b)、および/または(c)の組み合わせ、HVRアミノ酸残基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-5の組み合わせ 6 (L2)、26-35 (H1)、26-35b (H1)、49-65 (H2)、93-102 (H3)、および 94-102 (H3)。
特に断りのない限り、可変ドメイン内のHVR残基および他の残基(例えば、FR残基)は、Kabatら、supraに従って本明細書に番号が付けられます。

可変領域
"可変領域"または"可変ドメイン"という用語は、抗原に抗体を結合することに関与する抗体重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖および軽鎖(それぞれVHおよびVL)の可変ドメインは、一般に、4つの保存されたフレームワーク領域(DR)および3つの超可変領域(HVL)を含む各ドメインと同様の構造を有する。(例えば、Kindtらクビー免疫学、第6版、W.H.フリーマン社、91ページ(2007)参照)。単一のVHまたはVLドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、それぞれ相補的なVLまたはVHドメインのライブラリーをスクリーニングするために抗原を結合する抗体からVHまたはVLドメインを用いて単離され得る。例えば、ポルトラーノら、J.イムノールを参照してください。150:880-887 (1993);クラークソンら, 自然 352:624-628 (1991).

キメラ抗体
"キメラ"抗体という用語は、重鎖および/または軽鎖の一部が特定の元または種に由来する抗体を指し、重鎖および/または軽鎖の残りの部分は、異なる元または種から派生する。同様に、用語"キメラ抗体可変ドメイン"は、重いおよび/または軽鎖可変領域の一部が特定のソースまたは種から派生し、重鎖および/または軽鎖の残りの部分を指す抗体可変領域を指します。可変領域は、別のソースまたは種から派生します。

ヒト化抗体
"ヒト化"抗体は、ヒトDRからの非ヒトHDRおよびアミノ酸残基からのアミノ酸残基から含むキメラ抗体を指す。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、そして典型的には2つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、その中で、HDRのすべてまたは実質的に全てが非ヒト抗体のものに対応し、すべてまたは実質的にすべてを含む。これらの DR は、ヒト抗体のそれらに対応します。ヒト化抗体は、任意にヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。抗体の"ヒト化形態"とは、例えば、非ヒト抗体が、ヒト化を受けた抗体を指す。「ヒト化抗体可変領域」とは、ヒト化抗体の可変領域を指す。

ヒト抗体
「ヒト抗体」は、ヒトまたはヒト細胞によって産生される抗体のそれに相当するアミノ酸配列、またはヒト抗体レパートリーまたは他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト源に由来するアミノ酸配列を有する抗体配列である。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特異的に除外する。「ヒト抗体可変領域」とは、ヒト抗体の可変領域を指す。

所望の結合活性を有する抗体を産生する方法
所望の結合活性を有する抗体を産生する方法は、当業者に知られている。以下に、RINGフィンガープロテイン43に結合する抗体(抗RNF43抗体)を産生する方法を記載した例である(以下、RNF43ともいう)。T細胞受容体複合体等に結合する抗体は、以下に説明する例に従って製造することもできる。

抗RNF43抗体は、公知の方法を用いてポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として得ることができる。抗RNF43抗体は、好ましくは哺乳動物由来のモノクローナル抗体である。このような哺乳動物由来モノクローナル抗体としては、遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を担持する発現ベクターで形質転換されたハイブリドーマまたは宿主細胞によって産生される抗体が挙げられる。

モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、例えば以下に説明するように公知の技術を用いて製造することができる。具体的には、哺乳動物は感作抗原としてRNF43タンパク質を用いた従来の免疫方法により免疫される。得られた免疫細胞は、従来の細胞融合法により公知の親細胞と融合される。そして、抗RNF43抗体を産生するハイブリドーマは、従来のスクリーニング方法を用いてモノクローナル抗体産生細胞をスクリーニングすることによって選択することができる。

具体的には、モノクローナル抗体は、以下に述べたように調製される。まず、塩基配列がRefSeqアクセスNo.に開示されているRNF43遺伝子。NM_017763.5は、RefSeqアクセスNo.に示すRNF43タンパク質を製造するために発現させることができる。NP_060233.3(SEQ ID番号:13)は、抗体調製のための感作抗原として使用されます。あるいは、RNF43の細胞外ドメイン(ECD)をコードするヌクレオチドを発現して、そのアミノ酸配列が配列配列が配列番号18に記載されているRNF43 ECD含有タンパク質を産生することができる。すなわち、全長RNF43またはRNF43 ECDをコードする遺伝子配列が既知の発現ベクターに挿入され、適切な宿主細胞がこのベクターで形質転換される。所望のヒト全長RNF43またはRNF43 ECDタンパク質は、既知の方法によって宿主細胞またはその培養上清から精製される。あるいは、精製された天然RNF43タンパク質を感作抗原として用いることができる。

精製された全長RNF43またはRNF43 ECDタンパク質は、哺乳動物の免疫に使用するための感作抗原として使用することができる。全長RNF43またはRNF43 ECDの部分ペプチドは、感作抗原としても使用することができる。この場合、部分ペプチドは、ヒトRNF43アミノ酸配列からの化学合成によって得ることもできる。さらに、RNF43遺伝子の一部を発現ベクターに組み込んで発現させることによっても得ることができる。また、プロテアーゼを用いてRNF43タンパク質を分解して得ることもできるが、部分ペプチドとして用いるRNF43ペプチドの領域及び大きさは、特に限定されるものではない。好ましい領域として、配列番号1:13のアミノ酸配列における1〜197位のアミノ酸に対応するアミノ酸配列からの任意の配列が選択され得る。感作抗原として使用するペプチドを構成するアミノ酸の数は、少なくとも5種以上、または好ましくは、例えば、6個以上、または7種以上である。より具体的には、8〜50残基または好ましくは10〜30残基からなるペプチドを感作抗原として使用してもよい。

抗原を感作するために、あるいは、全長RNF43またはRNF43 ECDタンパク質の所望の部分ポリペプチドまたはペプチドを異なるポリペプチドと融合して調製した融合タンパク質を使用することができる。例えば、抗体Fcフラグメントおよびペプチドタグは、感作抗原として使用される融合タンパク質を産生するために好ましく用いられる。このような融合タンパク質の発現のためのベクターは、2つ以上の所望のポリペプチド断片をコードするフレーム遺伝子に融合し、上述したように発現ベクターに融合遺伝子を挿入することによって構築することができる。融合タンパク質の製造方法は、分子クローニング第2編集(Sambrook, Jら, 分子クローニング第2エド, 9.47-9.58 (1989) コールドスプリングハーバーラボプレス) に記載されています。感作抗原として使用するRNF43を調製する方法、およびRNF43を用いた免疫方法も後述する本明細書の実施例に記載されている。

感作抗原で免疫される哺乳動物に特に制限はない。しかしながら、細胞融合に用いる親細胞との相溶性を考慮して哺乳動物を選択することが好ましい。一般に、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、サルなどのげっ歯類が好ましく用いられる。

上記動物は、公知の方法により感作抗原で免疫される。一般に行われる免疫方法は、例えば、哺乳動物への感作抗原の腹腔内または皮下注射を含む。具体的には、感作抗原をPBS(リン酸緩衝生理食塩水)、生理食塩水等で適宜希釈する。必要に応じて、フロイントの完全なアジュバントのような従来のアジュバントが抗原と混合され、混合物が乳化される。次いで、感作抗原を4〜21日間隔で哺乳動物に数回投与する。適切な担体は、感作抗原を用いる免疫に用いてもよい。特に、感作抗原として低分子部分ペプチドを用いる場合、感作抗原ペプチドをアルブミンやキーホールリンペットヘモシアニンなどの担体タンパク質と結合して免疫することが望ましい場合がある。

あるいは、所望の抗体を産生するハイブリドーマは、以下に述べたようにDNA免疫を用いて調製することができる。DNA免疫は、動物における抗原タンパク質コード遺伝子の発現を可能にするために構築されたベクターDNAを投与した結果、免疫抗原を免疫抗原で発現させることにより免疫刺激を付与する免疫刺激法である。免疫する動物にタンパク質抗原を投与する従来の免疫方法と比較して、DNA免疫は優れていることが期待されます。
- 免疫刺激は、RNF43などの膜タンパク質の構造を保持しながら提供することができます。そして
- 予防接種のために抗原を精製する必要はありません。

DNA免疫を用いて本開示のモノクローナル抗体を調製するために、まず、RNF43タンパク質を発現するDNAを免疫する動物に投与する。RNF43コードDNAは、PCRなどの公知の方法により合成することができる。得られたDNAを適切な発現ベクターに挿入し、次いで、これを免疫する動物に投与する。好ましくは使用される発現ベクターとしては、例えば、pcDNA3.1などの市販の発現ベクターが挙げられる。ベクターは、従来の方法を用いて生物に投与することができる。例えば、DNA免疫は、遺伝子銃を用いて、免疫される動物の体内の細胞にベクター被覆金粒子の発現を導入することによって行われる。RNF43を認識した抗体は、WO 2003/104453に記載の方法によっても製造することができる。

上記のように哺乳動物を免疫した後、血清中のRNF43結合抗体の力子の増加が確認される。次いで、哺乳動物から免疫細胞を採取し、次いで細胞融合を行う。特に、脾細胞は免疫細胞として好ましく用いられる。

哺乳動物骨髄腫細胞は、上記免疫細胞と融合する細胞として用いられる。骨髄腫細胞は、好ましくはスクリーニングに適した選択マーカーを含む。選択マーカーは、特定の培養条件下で生存(または死)のために細胞に特性を与えます。ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損(以下、HGPRT欠乏症と略記)およびチミジンキナーゼ欠損症(以下、TK欠乏症と略記)は、選択マーカーとして知られている。HGPRTまたはTK欠乏症を有する細胞は、ヒポキサンチン-アミノプテリン-チミジン感受性を有する(以下、HAT感受性と略称)。HAT感受性細胞はHAT選択培地でDNAを合成できず、殺されます。しかし、細胞を正常細胞と融合すると、正常細胞のサルベージ経路を用いてDNA合成を継続できるため、HAT選択培地でも増殖することができます。

HGPRT欠損細胞およびTK欠損細胞は、それぞれ6-チオグアニン、8-アザグアニン(以下8AGと略称)、または5'-ブロモデオキシウリジンを含有する培地中から選択することができる。正常な細胞は、これらのピリミジン類似体をDNAに組み込むため、殺される。一方、これらの酵素に欠乏している細胞は、これらのピリミジン類似体を組み込むことができないので、選択培地中で生存することができる。さらに、ネオマイシン耐性遺伝子によって提供されるG418耐性と呼ばれる選択マーカーは、2-デオキシストレプトアミン系抗生物質(ゲンタマイシン類似体)に対する耐性を付与する。細胞融合に適した様々な種類の骨髄腫細胞が知られている。

例えば、以下の細胞を含む骨髄腫細胞が好ましく用いることができる。
P3(P3x63Ag8.653) (J. イムノメル.(1979) 123 (4), 1548-1550);
P3x63Ag8U.1 (微生物学と免疫学の現在のトピック (1978)81, 1-7);
NS-1 (C. Eur. J. イムノメル.(1976)6 (7), 511-519);
MPC-11 (セル (1976) 8 (3), 405-415);
SP2/0 (自然 (1978) 276 (5685), 269-270);
FO (J. イムノメル.方法 (1980) 35 (1-2), 1-21);
S194/5.XX0.BU.1 (J. エクスプメッド (1978) 148 (1), 313-323);
R210(自然(1979)277(5692)、131-133)など

免疫細胞と骨髄腫細胞との間の細胞融合は、本質的に公知の方法を用いて行われる、例えば、コーラーおよびミルシュタインらによる方法(方法Enzymol.(1981) 73: 3-46).
より具体的には、細胞融合は、例えば、細胞融合促進剤の存在下で従来の培養培地において行うことができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)およびセンダイウイルス(HVJ)が挙げられる。必要に応じて、ジメチルスルホキシドなどの補助物質も添加され、融合効率が向上します。

骨髄腫細胞に対する免疫細胞の比率は、自分自身の裁量で決定され得るが、好ましくは、例えば、1〜10個の免疫細胞ごとに1つの骨髄腫細胞が挙げられる。細胞融合に用いる培養培地としては、例えば、RPMI1640培地およびMEM培地などの骨髄腫細胞株の増殖に適した培地、およびこの種の細胞培養に用いられる他の従来の培養培地が挙げられる。また、胎児子牛血清(FCS)などの血清サプリメントを培養培地に添加してもよい。

細胞融合については、上記の免疫細胞と骨髄腫細胞の所定量が上記培養培地中に良好に混合される。次いで、PEG溶液(例えば、平均分子量は約1,000〜6,000)を約37℃に前温し、一般的に30%〜60%(w/v)の濃度でこれに添加する。これを穏やかに混合して所望の融合細胞(ハイブリドーマ)を生成する。そして、上述した適切な培養培地を細胞に徐々に添加し、これを繰り返し遠心分離して上清を除去する。これにより、ハイブリドーマ増殖に好ましくない細胞融合剤等を除去することができる。

このようにして得られるハイブリドーマは、従来の選択培地を用いた培養により選択することができ、例えば、HAT培地(ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含有する培養培地)を用いることができる。所望のハイブリドーマ以外の細胞(非融合細胞)は、上記HAT培地中で十分な期間培養を継続することにより死滅させることができる。通常、期間は数日から数週間です。次いで、所望の抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングし、従来の限定希釈法により単独でクローニングする。

このようにして得られたハイブリドーマは、細胞融合に用いられる骨髄腫が有する選択マーカーに基づく選択培地を用いて選択することができる。例えば、HGPRT-またはTK欠損細胞は、HAT培地(ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含む培養培地)を用いた培養により選択することができる。具体的には、HAT感受性骨髄腫細胞が細胞融合に使用される場合、正常細胞と正常に融合した細胞はHAT培地中で選択的に増殖することができる。所望のハイブリドーマ以外の細胞(非融合細胞)は、上記HAT培地中で十分な期間培養を継続することにより死滅させることができる。具体的には、所望のハイブリドーマは、一般的に数日間〜数週間の培養によって選択することができる。次いで、所望の抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングし、従来の限定希釈法により単独でクローニングする。

所望の抗体は、公知の抗原/抗体反応に基づくスクリーニング方法により選択し、合成的にクローン化することができる。例えば、RNF43結合モノクローナル抗体は、細胞表面に発現するRNF43に結合し得る。このようなモノクローナル抗体は、蛍光活性化細胞選別(FACS)によりスクリーニングすることができる。FACSは、レーザー光を用いて蛍光抗体と接触した細胞を解析し、個々の細胞から発せられる蛍光を測定することにより、細胞表面への抗体の結合を評価するシステムです。

FACSによる本開示のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングするために、RNF43発現細胞が最初に調製される。スクリーニングに好ましく用いられる細胞は、RNF43が強制的に発現される哺乳動物細胞である。対照として、細胞表面RNF43に結合する抗体の活性は、宿主細胞として非形質化哺乳動物細胞を用いて選択的に検出することができる。具体的には、抗RNF43モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、RNF43を発現させられた細胞に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択することによって単離することができるが、宿主細胞には選択しない。

あるいは、固定化されたRNF43発現細胞に結合する抗体の活性は、ELISAの原理に基づいて評価することができる。例えば、RNF43発現細胞は、ELISAプレートのウェルに固定化される。ハイブリドーマの培養上清は、ウェル内の固定化された細胞と接触し、固定化された細胞に結合する抗体が検出される。モノクローナル抗体がマウス由来の場合、細胞に結合した抗体は、抗マウス免疫グロブリン抗体を用いて検出することができる。抗原結合能を有する所望の抗体を産生するハイブリドーマは、上記のスクリーニングにより選択され、かつ限定希釈法等によりクローニングすることができる。

このように調製したモノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、従来の培養培地中に通着させ、液体窒素中に長期間保存することができる。

上記ハイブリドーマは、従来の方法により培養され、所望のモノクローナル抗体は、培養上清から調製することができる。あるいは、ハイブリドーマは、適合哺乳動物に投与され、成長し、そしてモノクローナル抗体は、腹水から調製される。前者の方法は、高純度の抗体を調製するのに適している。

上記ハイブリドーマ等の抗体産生細胞からクローニングされた抗体遺伝子によってコードされる抗体も好ましく用いることができる。クローン抗体遺伝子を適切なベクターに挿入し、これを宿主に導入して遺伝子によってコードされる抗体を発現する。抗体遺伝子を単分化し、遺伝子をベクターに挿入し、宿主細胞を形化させる方法は、例えばVandammeら(Eur. J. Biochem.(1990) 192(3), 767-775).組換え抗体を作出す方法は、以下に記載されるものとしても知られている。

好ましくは、本開示は、本開示の抗原結合分子をコードする核酸を提供する。本開示はまた、抗原結合分子をコードする核酸が導入されるベクター、すなわち、核酸を含むベクターを提供する。さらに、本開示は、核酸またはベクターを含む細胞を提供する。本開示はまた、細胞を培養して抗原結合分子を作製する方法も提供する。本開示は、この方法によって産生される抗原結合分子をさらに提供する。

例えば、抗RNF43抗体の可変領域(V領域)をコードするcDNAは、抗RNF43抗体を発現するハイブリドーマ細胞から調製される。この目的のために、合計RNAは最初にハイブリドーマから抽出される。セルから mRNA を抽出するために使用されるメソッドには、次のようなものがあります。
-グアニジン超遠心分離法(生化学(1979)18(24)、5294-5299)、
- AGPCメソッド(肛門。バイオケム(1987) 162(1), 156-159)

抽出されたmRNAは、mRNA精製キット(GEヘルスケアバイオサイエンス)などを用いて精製することができる。あるいは、QuickPrep mRNA精製キット(GEヘルスケアバイオサイエンス)などの細胞から直接全mRNAを抽出するためのキットも市販されている。mRNAは、このようなキットを使用してハイブリドーマから調製することができる。抗体V領域をコードするcDNAは、逆転写酵素を用いて調製されたmRNAから合成することができる。cDNAは、AMV逆転写酵素第1鎖cDNA合成キット(聖華学社製)等を用いて合成することができる。さらに、SMART RACE cDNA増幅キット(クロンテック)とPCRベースの5'-RACE法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85(23), 8998-9002;核酸Res. (1989) 17(8), 2919-2932) cDNAの合成と増幅に適宜使用することができる。このようなcDNA合成プロセスにおいて、後述する適切な制限酵素部位を、cDNAの両端に導入してもよい。

目的のcDNA断片は、得られたPCR産物から精製され、次いでベクターDNAに連結される。このように組換えベクターが構築され、大腸菌等に導入される。コロニー選択後、所望の組換えベクターは、コロニー形成大腸菌から調製することができる。そして、組換えベクターが目的とするcDNAヌクレオチド配列を有するかどうかは、ジデオキシヌクレオチド鎖終結法などの公知の方法により試験される。

プライマーを用いて可変領域遺伝子を増幅する5'-RACE法は、可変領域をコードする遺伝子を分離するために便利に用いられる。まず、ハイブリドーマ細胞から抽出したRNAを鋳型として用いて、5'-RACE cDNAライブラリを構築します。SMART RACE cDNA増幅キットなどの市販キットを使用して、5'-RACE cDNAライブラリを合成します。

抗体遺伝子は、調製した5'-RACE cDNAライブラリーを鋳テンプレートとして用いてPCRによって増幅される。マウス抗体遺伝子を増幅するためのプライマーは、公知の抗体遺伝子配列に基づいて設計することができる。プライマーの塩基配列は、免疫グロブリンサブクラスによって異なる。従って、イソストリップマウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット(Roche診断)などの市販キットを用いて、サブクラスを事前に決定することが好ましい。

具体的には、例えば、γ1、γ2a、γ2b、およびγ3重鎖およびκおよびラムダ軽鎖をコードする遺伝子の増幅を可能にするプライマーを用いて、マウスIgGコード遺伝子を単離する。一般に、可変領域に近い定常領域部位にアニールするプライマーは、IgG可変領域遺伝子を増幅する3'側プライマーとして使用される。一方、5'RACE cDNAライブラリ構築キットに取り付けられたプライマーは、5'側プライマーとして使用されます。

このように増幅されたPCR産物は、重鎖と軽鎖の組み合わせからなる免疫グロブリンの形状を変えるために使用される。所望の抗体は、リシェイプされた免疫グロブリンのRNF43結合活性を指標として用いて選択することができる。例えば、RNF43に対する抗体を単離することを目的とする場合、RNF43に対する抗体の結合が特異的である方がより好ましい。RNF43結合抗体は、例えば以下のステップでスクリーニングすることができる。
(1)ハイブリドーマから単離されたcDNAによってコードされるV領域を含む抗体とRNF43発現細胞と接触;
(2)RNF43発現細胞への抗体の結合を検出する。そして
(3)RNF43発現細胞に結合する抗体を選択する。

RNF43発現細胞に対する抗体の結合を検出する方法が知られている。具体的には、RNF43発現細胞に対する抗体の結合は、FACSなどの上述の技術によって検出することができる。RNF43発現細胞の固定化されたサンプルは、抗体の結合活性を評価するために適宜使用される。

結合活性を指標として用いた好ましい抗体スクリーニング方法には、ファージベクターを用いたパンニング方法も含まれる。ファージベクターを用いたスクリーニング方法は、抗体遺伝子がポリクローナル抗体発現細胞集団から重鎖および軽鎖サブクラスライブラリーから単離される場合に有利である。重鎖および軽鎖可変領域をコードする遺伝子は、適切なリンカー配列によって連結して単鎖Fv(scFv)を形成することができる。その表面にscFvを提示するファージは、ファージベクターにscFvをコードする遺伝子を挿入することによって製造することができる。ファージは目的の抗原と接触する。そして、目的とする結合活性を有するscFvをコードするDNAを、抗原に結合したファージを採取することによって単離することができる。このプロセスは、所望の結合活性を有するscFvを濃縮するために必要に応じて繰り返すことができる。

目的の抗RNF43抗体のV領域をコードするcDNAを単離した後、cDNAは、cDNAの両端に導入された制限部位を認識する制限酵素で消化される。好ましい制限酵素は、抗体遺伝子の塩基配列中に生じる塩基配列を低周波で認識し、切断する。さらに、粘着性端を生じる酵素の制限部位は、正しい向きに単一コピー消化断片を挿入するベクターに導入することが好ましい。抗RNF43抗体のV領域をコードするcDNAは、上述したように消化され、これを適切な発現ベクターに挿入して抗体発現ベクターを構築する。この場合、抗体定常領域(C領域)をコードする遺伝子と上記V領域をコードする遺伝子がフレーム内で融合した場合、キメラ抗体が得られる。本明細書において、"キメラ抗体"は、定常領域の起源が可変領域の起源と異なっていることを意味する。従って、マウス/ヒト異性体抗体に加えて、ヒト/ヒト同種抗体は、本開示のキメラ抗体に含まれる。キメラ抗体発現ベクターは、上記のV領域遺伝子を既に定常領域を有する発現ベクターに挿入することによって構築することができる。具体的には、例えば、上記V領域遺伝子を励起する制限酵素の認識配列を、所望の抗体定常領域(C領域)をコードするDNAを担持する発現ベクターの5'側に適宜配置することができる。キメラ抗体発現ベクターは、制限酵素の同じ組み合わせで消化された2つの遺伝子をフレーム内に融合させることによって構築される。

抗RNF43モノクローナル抗体を産生するために、抗体遺伝子は発現調節領域の制御下で発現されるように発現ベクターに挿入される。抗体発現の発現調節領域には、例えば、エンハンサーおよびプロモーターが含まれる。さらに、発現した抗体が細胞の外部に分泌されるようにアミノ末端に適切なシグナル配列を結合してもよい。後述する実施例では、アミノ酸配列MGWSCIILFLVATATGVHS(配列番号27)を有するペプチドがシグナル配列として用いられる。一方、他の適切なシグナル配列が付着してもよい。発現したポリペプチドは、上記配列のカルボキシル末端で切断され、得られたポリペプチドは成熟ポリペプチドとして細胞の外側に分泌される。次いで、発現ベクターで適切な宿主細胞が形質転換され、抗RNF43抗体コードDNAを発現する組換え細胞が得られる。

抗体重鎖(H鎖)および軽鎖(L鎖)をコードするDNAは、抗体遺伝子を発現するために異なる発現ベクターに別々に挿入される。H鎖およびL鎖を有する抗体分子は、H鎖およびL鎖遺伝子がそれぞれ挿入されるベクターを用いて同じ宿主細胞を共トランスフェクトすることによって発現させることができる。あるいは、宿主細胞は、H鎖およびL鎖をコードするDNAが挿入される単一の発現ベクターで形質転換することができる(WO 94/11523を参照)。

適切な宿主に単離された抗体遺伝子を導入することにより、抗体調製のための様々な既知の宿主細胞/発現ベクターの組み合わせがある。これらの発現系の全ては、本開示の抗体可変領域を含むドメインの単離に適用可能である。宿主細胞として用いられる適切な真核細胞は、動物細胞、植物細胞、および真菌細胞を含む。具体的には、動物細胞としては、例えば、以下の細胞が挙げられる。
(1)哺乳動物細胞:CHO、COS、骨髄腫、ベビーハムスター腎臓(BHK)、HeLa、ベロ、またはそのようなもの;
(2)両生類細胞:ゼノプス卵母細胞、またはそのようなもの;そして
(3)昆虫細胞:sf9、sf21、Tn5、等。

また、植物細胞として、ニコチアナ・タバカム等のニコチアナ属由来の細胞を用いた抗体遺伝子発現系が知られている。カルス培養細胞は、植物細胞を形組化するために適宜用いることができる。

さらに、以下の細胞を真菌細胞として使用することができます。
酵母:サッカロミセス・セレビシエなどのサッカロミセス属、およびピキア・パストリシスなどのピキア属;そして
糸状菌:アスペルギルス・ニジェールなどのアスペルギルス属。

さらに、原核細胞を利用する抗体遺伝子発現系も知られている。例えば、細菌細胞を用いた場合、大腸菌細胞、枯草細胞、及びこのような好適に好適に本開示に利用することができる。目的の抗体遺伝子を担持する発現ベクターは、トランスフェクションによってこれらの細胞に導入される。トランスフェクトされた細胞はインビトロで培養され、所望の抗体は形質転換細胞の培養物から調製することができる。

上述した宿主細胞に加えて、トランスジェニック動物は組換え抗体を産生するためにも使用することができる。すなわち、抗体は、目的の抗体をコードする遺伝子が導入される動物から得ることができる。例えば、抗体遺伝子は、乳中で特異的に産生されるタンパク質をコードする遺伝子にフレーム内に挿入することにより融合遺伝子として構築することができる。ヤギβ-カゼイン等は、例えば、牛乳中に分泌されるタンパク質として用いることができる。抗体遺伝子で挿入された融合遺伝子を含むDNA断片をヤギ胚に注入し、この胚を雌ヤギに導入します。所望の抗体は、胚レシピエントヤギ(またはその子孫)から生まれたトランスジェニックヤギによって産生される乳から乳タンパク質と融合したタンパク質として得ることができる。また、トランスジェニックヤギによって産生される所望の抗体を含むミルクの体積を増加させるために、必要に応じてホルモンをトランスジェニックヤギに投与することができる(Ebert, K. M. et al., Bio/Technology (1994) 12 (7), 699-702)。

ヒト化抗体の製造方法
本明細書に記載される抗原結合分子がヒトに投与される場合、ヒトに対する異種抗原性を低下させるために人工的に改変された遺伝子組換え抗体に由来するドメインとして、適宜使用することができる抗体可変領域を含む抗原結合分子のドメイン。このような遺伝子組換え抗体としては、例えば、ヒト化抗体が挙げられる。これらの修飾抗体は、公知の方法により適宜産生される。さらに、一般に、ある抗体の結合特異性は、CDR移植によって別の抗体に導入することができる。

具体的には、マウス抗体等の非ヒト動物抗体のCDRをヒト抗体等に移植して調製したヒト化抗体が知られている。ヒト化抗体を得るための一般的な遺伝子工学的手法も知られている。具体的には、例えば、重なり延長PCRは、マウス抗体CDRをヒトFRに移植する方法として知られている。オーバーラップ延長PCRにおいて、移植されるマウス抗体CDRをコードするヌクレオチド配列を、ヒト抗体FRを合成するためのプライマーに添加され、プライマーは4つのFRのそれぞれについて調製される。一般に、マウスCDRをヒトFRに移植する場合、マウスFRに対して高い同一性を有するヒトFRを選択することは、CDR機能を維持するのに有利であると考えられる。すなわち、移植されるマウスCDRに隣接するFRのアミノ酸配列に高い同一性を有するアミノ酸配列を含むヒトFRを用いることが一般的に好ましい。

連結されるヌクレオチド配列は、フレーム内で互いに接続されるように設計されている。ヒトDRは、それぞれのプライマーを用いて個別に合成される。その結果、マウスCDRコードDNAが個々のFRコードDNAに付着した製品が得られる。各製品のマウスCDRをコードするヌクレオチド配列は、それらが互いに重なるように設計されている。次いで、ヒト抗体遺伝子を鋳生として合成した製品の重なり合うCDR領域をアニールに相補的な鎖合成反応を行う。ヒトDRは、この反応によってマウスCDR配列を介して連結される。

3つのCDRと4つのDRが最終的に連結される全長V領域遺伝子は、適切な制限酵素認識配列で添加される5'-または3'末端にアニールするプライマーを使用して増幅される。ヒト化抗体の発現ベクターは、上記のように得られたDNAと、ヒト抗体C領域をコードするDNAをフレーム内でリゲートするように発現ベクターに挿入することによって作製することができる。組換えベクターを宿主にトランスフェクトして組換え細胞を確立した後、組換え細胞を培養し、ヒト化抗体をコードするDNAを発現して細胞培養中にヒト化抗体を産生する(参照、欧州特許パブリケーション番号EP 239400および国際特許公報番号WO 1996/002576)。

上記のように産生されたヒト化抗体の抗原結合活性を定性的または定量的に測定および評価することにより、CDRが連結時に良好な抗原結合部位を形成することを可能にするヒト抗体DRを適宜選択することができるCDRを介して、DR中のアミノ酸残基は、必要に応じて置換され得るので、再形成されたヒト抗体のCDRが適切な抗原結合部位を形成するようにする。例えば、アミノ酸配列変異は、マウスCDRをヒトFRに移植するために使用されるPCR法を適用することによって、DRに導入することができる。より具体的には、部分的なヌクレオチド配列突然変異は、FR.ヌクレオチド配列突然変異にアニールがそのようなプライマーを用いて合成されたFRに導入されるプライマーに導入することができる。所望の特性を有する変異型FR配列は、上記の方法により抗原に結合するアミノ酸置換変異抗体の活性を測定および評価することによって選択することができる(Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53: 851-856)

ヒト抗体を産生する方法。
あるいは、所望のヒト抗体は、ヒト抗体遺伝子のレパートリー全体を有するトランスジェニック動物を免疫することによって得ることができる(WO 1993/012227;WO 1992/003918;WO 1994/002602;WO 1994/025585;WO 1996/034096;WO 1996/033735)DNA免疫による。

さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いてパンニングしてヒト抗体を調製する技術も知られている。例えば、ヒト抗体のV領域は、ファージディスプレイ法によりファージ表面上の単鎖抗体(scFv)として発現される。抗原に結合するscFvを発現するファージが選択できる。抗原に結合するヒト抗体V領域をコードするDNA配列は、選択されたファージの遺伝子を解析することによって決定することができる。抗原に結合するscFvのDNA配列が決定される。発現ベクターは、目的のヒト抗体のC領域配列とフレーム内のV領域配列を融合させ、これを適切な発現ベクターに挿入することによって調製される。発現ベクターは、上述したような発現に適した細胞に導入される。ヒト抗体は、細胞内でヒト抗体コード遺伝子を発現させることによって産生することができる。これらの方法は既に知られています (WO 1992/001047 を参照してください。WO 1992/020791;WO 1993/006213;WO 1993/011236;WO 1993/019172;WO 1995/001438;WO 1995/015388)。

ベクトル
本明細書で使用される用語"vector,"は、それが連結されている別の核酸を伝播し得る核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクターおよびそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。特定のベクターは、それらが作動的に連結されている核酸の発現を指示することができる。このようなベクトルは、ここでは "式ベクトルと呼ばれます。

宿主細胞
用語 "ホストセル,""ホスト細胞株,"および"宿主細胞培養"は同じ意味で使用され、そのような細胞の子孫を含む、除界性核酸が導入された細胞を指します。宿主細胞には"形質転換体"と"形質転換細胞"が含まれ、そこから生じる一次形質転換細胞と子孫が含まれます。子孫は、親細胞と核酸含有量が完全に同一でない場合がありますが、突然変異を含んでいてもよいです。もともと形質転換された細胞でスクリーニングまたは選択されたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異型子孫が本明細書に含まれる。

エピトープ
「エピトープ」は、抗原中の抗原決定基を意味し、本明細書に開示される抗原結合分子または抗体の抗原結合ドメインが結合する抗原部位を指す。したがって、例えば、エピトープはその構造に従って定義することができる。あるいは、エピトープは、エピトープを認識する抗原結合分子または抗体の抗原結合活性に従って定義され得る。抗原がペプチドまたはポリペプチドである場合、エピトープは、エピトープを形成するアミノ酸残基によって指定することができる。あるいは、エピトープが糖鎖である場合、エピトープは、その特定の糖鎖構造によって指定することができる。

線形エピトープは、一次アミノ酸配列が認識されるエピトープを含むエピトープである。このような線形エピトープは、典型的には、少なくとも3つ、最も一般的には少なくとも5つ、例えば、その特定の配列中に約8〜10または6〜20個のアミノ酸を含む。

線形エピトープとは対照的に、"立体構造エピトープ"は、エピトープを含む一次アミノ酸配列が認識されたエピトープの唯一の決定要因ではないエピトープです(例えば、立体構造の一次アミノ酸配列エピトープは必ずしもエピトープ定義抗体によって認識されるわけではない)。立体構造エピトープは、線形エピトープと比較してより多くのアミノ酸を含んでいてもよい。立体構造エピトープ認識抗原結合ドメインは、ペプチドまたはタンパク質の立体構造を認識する。例えば、タンパク質分子が三次元構造を形成すると、立体構造エピトープを形成するアミノ酸および/またはポリペプチド主鎖が整列し、そのエピトープが抗原結合ドメインによって認識可能になります。エピトープ立方体を決定する方法としては、例えば、X線結晶学、二次元核磁気共鳴、部位特異的スピンラベリング、および電子常磁性共鳴が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、分子生物学における方法におけるエピトープマッピングプロトコル(1996年)、Vol.66、モリス(ed.)を参照してください。

抗RNF43抗原結合ドメインを含む試験抗原結合分子または抗体によるエピトープ結合を評価する方法の例を以下に説明する。以下の実施例によれば、RNF43以外の抗原に対する抗原結合ドメインを含む試験抗原結合分子または抗体によるエピトープ結合を評価する方法も、適宜行うことができる。

例えば、抗RNF43抗原結合ドメインを含む試験抗原結合分子または抗体がRNF43分子中の線形エピトープを認識するかどうかは、例えば以下のように確認することができる。RNF43の細胞外ドメインを形成するアミノ酸配列を含む線形ペプチドが、上記目的で合成される。ペプチドは化学的に合成することができ、またはRNF43 cDNA中の細胞外ドメインに対応するアミノ酸配列をコードする領域をコードする領域を用いた遺伝子工学的手法によって得られる。次いで、抗RNF43抗原結合ドメインを含む試験抗原結合分子または抗体が、細胞外ドメインを形成するアミノ酸配列を含む線形ペプチドに対するその結合活性について評価される。例えば、固定化された直鎖ペプチドは、ペプチドに向かうポリペプチド複合体の結合活性を評価するためにELISAによって抗原として使用することができる。あるいは、直鎖ペプチドに対する結合活性は、直鎖ペプチドがRNF43発現細胞への抗原結合分子または抗体の結合を阻害するレベルに基づいて評価することができる。これらの試験は、直鎖状ペプチドに対する抗原結合分子または抗体の結合活性を実証することができる。

抗RNF43抗原結合ドメインを含む試験抗原結合分子または抗体が立体構造エピトープを認識するかどうかは、以下のように評価することができる。RNF43発現細胞は、上記の目的のために調製される。抗RNF43抗原結合ドメインを含む試験抗原結合分子または抗体は、接触時にRNF43発現細胞に強く結合する際に立体構造エピトープを認識すると判断できるが、固定化された細胞には実質的に結合しないRNF43の細胞外ドメインを形成するアミノ酸配列を含む線形ペプチド。本明細書において、"実質的に結合しない"は、結合活性が80%以下であることを意味し、一般に50%以下、好ましくは30%以下、特に好ましくはRNF43を発現する細胞に対する結合活性と比較して15%以下である。

RNF43発現細胞に対する抗RNF43抗原結合ドメインを含む試験抗原結合分子または抗体の結合活性をアッコードする方法としては、例えば、抗体に記載の方法:実験室マニュアル(Ed Harlow、デビッド・レーン、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラト(1988)359-420)具体的には、RNF43発現細胞を抗原として用いたELISAまたは蛍光活性化細胞選別(FACS)の原理に基づいて評価を行うことができる。

ELISA形式では、RNF43発現細胞に対する抗RNF43抗原結合ドメインを含む試験抗原結合分子または抗体の結合活性を、酵素によって生成されるシグナルのレベルを比較することによって定量的に評価することができる反応。具体的には、RNF43発現細胞が固定化されたELISAプレート上に試験ポリペプチド複合体を添加する。そして、細胞に結合した試験抗原結合分子または抗体は、試験抗原結合分子または抗体を認識する酵素標識抗体を用いて検出される。あるいは、FACSを使用する場合、試験抗原結合分子または抗体の希釈系列が調製され、RNF43発現細胞に対する抗体結合力を測定し、試験抗原結合分子の結合活性を比較するか、RNF43発現細胞に対する抗体。

バッファー等に懸濁した細胞の表面に発現する抗原に対する試験抗原結合分子または抗体の結合は、フローサイトメーターを用いて検出することができる。既知のフローサイトメーターには、たとえば、次のデバイスが含まれます。
ファックスカントTM II
FACSAriaTM
FACSArrayTM
FACSVantageTM SE
FACSCaliburTM(全てBDバイオサイエンスの商号)
EPICS ALTRA HyPerSort
CYtomics FC 500
EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC
セルラボクアンタ/セルラボクアンタSC(すべてベックマンコールターの商号です)

抗原に対する抗RNF43抗原結合ドメインを含む試験抗原結合分子または抗体の結合活性をアッサングする方法としては、例えば、以下の方法が挙げられる。まず、RNF43発現細胞を試験抗原結合分子または抗体と反応させ、次いで抗原結合分子または抗体を認識するFITC標識二次抗体で染色される。試験抗原結合分子または抗体は、所望の濃度で抗原結合分子または抗体を調製するのに適した緩衝液で適宜希釈される。例えば、抗原結合分子または抗体は、10マイクロg/ml〜10ng/mlの範囲内の濃度で使用することができる。次いで、蛍光強度および細胞数は、FACSCalibur(BD)を用いて決定される。CELL QUESTソフトウェア(BD)を用いた分析により得られる蛍光強度、すなわち幾何平均値は、細胞に結合した抗体の量を反映する。すなわち、試験抗原結合分子または抗体の結合活性は、結合した試験抗原結合分子または抗体の量によって表され、幾何平均値を測定することによって決定することができる。

抗RNF43抗原結合ドメインを含む試験抗原結合分子または抗体が別の抗原結合分子または抗体と共通のエピトープを共有するかどうかは、2つの抗原結合分子間の競合に基づいて評価することができるか、同じエピトープに対する抗体。抗原結合分子または抗体間の競合は、クロスブロッキングアッセイ等により検出することができる。例えば、競合ELISAアッセイは、好ましいクロスブロッキングアッセイである。

具体的には、クロスブロッキングアッセイにおいて、マイクロタイタープレートのウェルに固定化されたRNF43タンパク質を、候補な競合する抗原結合分子または抗体の有無において予インし、次いで、抗原結合分子を試験または抗体がこれに添加される。ウェル内のRNF43タンパク質に結合した試験抗原結合分子または抗体の量は、同じエピトープへの結合を競合する候補競合する抗原結合分子または抗体の結合能と間接的に相関する。すなわち、同じエピトープに対する競合する抗原結合分子または抗体の親和性が大きいほど、RNF43タンパク質被覆ウェルに対する試験抗原結合分子または抗体の結合活性が低くなる。

RNF43タンパク質を介してウェルに結合した試験抗原結合分子または抗体の量は、抗原結合分子または抗体を事前に標識することによって容易に決定することができる。例えば、ビオチン標識抗原結合分子または抗体は、アビジン/ペルオキシダーゼコンジュゲートおよび適切な基質を用いて測定される。特に、ペルオキシダーゼなどの酵素標識を用いたクロスブロッキングアッセイは"競合ELISAアッセイ"と呼ばれています。抗原結合分子または抗体は、検出または測定を可能にする他の標識物質と標識することもできる。具体的には、放射性標識、蛍光標識、などが知られている。

あるいは、オクテット(Pall ForteBio)を用いたリアルタイム結合アッセイによって行われる競合エピトープ結合アッセイは、別の好ましいクロスブロッキングアッセイである。
例えばビオチン化RNF43-Fcが調製され、ストレプトアビジンバイオセンサーチップ(Pall ForteBio)上に捕捉される。第1の抗体の25マイクロg/mlまたは50マイクロg/mlが調製され、第2の抗体と第1の抗体の両方を含む第2の溶液と、第1の抗体の濃度と同じ濃度にある。第1の溶液中の抗体も、調製される。捕捉された抗原の先端は、抗原と第1の抗体との結合がほぼ飽和するまで、300秒〜600秒間、第1溶液でインキュベートされる。このインキュベーション中の応答の変化は、遊離抗原に対する第1の抗体の結合の指標として測定される(ΔR1free)。次いで、チップを300秒〜600秒間第2溶液でインキュベートし、第1の抗体結合抗原と第2の抗体との間のさらなる結合が飽和するまで続く。このインキュベーション中の応答の変化は、第1の抗体結合抗原(ΔR2comp)に対する第2の抗体の結合の指標として測定される。
第2の溶液の同じ濃度で第2の抗体を含む第3の溶液は、第1の抗体なしで、また調製される。ビオチン化RNF43-Fc捕捉ストレプトアビジンバイオセンサチップは、抗原と第2抗体との結合が飽和するまで、300秒〜600秒間第3溶液でインキュベートされる。このインキュベーション中の応答の変化は、遊離抗原に対する第2の抗体の結合の指標として測定される(ΔR2free)。
結果は、データ分析HTソフトウェア(Pall ForteBio、バージョン10.0.1.7)またはマイクロソフトエクセルによって分析されます。第1の抗体による第2の抗体の阻害率は、以下のように計算され:

阻害率(%) =ΔR_2comp /ΔR_2free×100

候補競合体抗原結合分子または抗体が、抗RNF43抗原結合ドメインを含む試験抗原結合分子または抗体による結合を少なくとも20%、または20〜50%、または少なくとも50%の結合活性と比較して遮断できる場合競合他社の抗原結合分子または抗体がない場合に行われる対照実験は、試験抗原結合分子または抗体が、競合他社の抗原結合分子によって結合した同じエピトープに実質的に結合するか、または抗体は、同じエピトープへの結合を競う。阻害率の計算では、すべての結合応答は、ストレプトアビジンバイオセンサーチップ上の抗原捕捉レベルによって正規化することができる。

抗RNF43抗原結合ドメインを含む試験抗原結合分子または抗体によって結合したエピトープの構造が既に同定されている場合、抗原結合分子または抗体の試験および制御が共通のエピトープを共有するかどうかは、エピトープを形成するペプチドにアミノ酸変異を導入して調製したペプチドに対する2つの抗原結合分子または抗体の結合活性を比較することによって評価する。

あるいは、抗RNF43抗体などの各抗原結合分子のエピトープを同定するために、エピトープビニングは以下のように行うことができる。可変領域のDNAはPCRによって増幅され、ウサギの重鎖および軽鎖定常領域をコードするDNAと再結合される。クローン抗体は細胞内で発現され、培養上清から精製される。抗体はビオチン化され、次いで遊離ビオチンが透析によって除去される。

各抗体への結合に対するEC50濃度は、例えば、Fc領域(RNF43-Fc)を有するRNF43 ECD、ビオチン化抗体を用いたELISAアッセイによって決定される。例えば、プレートをRNF43-Fcでコーティングし、ビオチン化抗体を添加してインキュベートする。洗浄後、例えば、StAv-HRP(PIERCE)を添加し、インキュベートする。洗浄後、例えば、ABTSペルオキシダーゼ基質(セラケアライフサイエンス)を添加し、信号強度を測定する。RNF43-Fcに対する抗RNF43単一特異性抗体の結合に対するEC50濃度は、例えば、非線形回帰4パラメータ適合を用いて計算される。405 nm/570 nmでの正規化吸光度は、抗RNF43抗体のEC50濃度を適用した際に測定し、AOとして表記する。抗RNF43単一特異性抗体間の結合競合を評価するために、ELISAアッセイも同様に行われ得る。例えば、プレートをRNF43-Fcで被覆し、それぞれのEC50の10倍濃度で第1抗体(試験抗体)の非ビオチン化形態でインキュベートする。洗浄を行わずに、第2の抗体(参照抗体)のビオチニル化形態をEC50濃度で添加し、インキュベートする。洗浄後、ペルオキシダーゼ基板を添加し、信号強度を測定する。405 nm/570 nmでの正規化吸光度はAとして表記されます。
結合阻害binding inhibition (%)は、次の式を使用して計算されま:

ビニングは、20%の結合阻害のカットオフ値を用いて決定され得る。抗体間の結合阻害が20%未満の場合、それらは異なるビンにグループ化される。言い換えれば、試験抗体Ab1が別の抗体Ab2を基準抗体として使用する場合に20%以上の結合阻害を示し、かつ抗体Ab2もAb2が試験抗体として使用され、Ab1が基準アリとして使用される場合に20%以上の結合阻害を示すibody、抗体Ab1およびAb2は、同じビンにグループ化される。同じビン内の抗体は互いに競合し、それらが同じ(または少なくとも密接に位置する)エピトープに結合すると言えます。

上記結合活性を測定するために、例えば、変異が導入される線形ペプチドに対する抗原結合分子または抗体を試験および制御する結合活性を、上記ELISA形式で比較する。ELISA法に加えて、カラムに結合した変異ペプチドに対する結合活性は、カラム内の抗原結合分子または抗体を流し、次いで抗原結合分子または抗体を溶出して定量することによって決定することができる溶出液で。変異ペプチドをカラムに吸着させる方法は、例えば、GST融合ペプチドの形態で、公知である。

あるいは、同定されたエピトープが立体構造エピトープである場合、抗原結合分子または抗体が共通のエピトープを共有する試験および制御のいずれであるかを、以下の方法で評価することができる。まず、エピトープに導入された変異を有するRNF43発現細胞およびRNF43を発現する細胞が調製される。試験および制御抗原結合分子または抗体は、PBSなどの適切な緩衝液中にこれらの細胞を懸濁させることによって調製された細胞懸濁液に添加される。次いで、細胞懸濁液を緩衝液で適宜洗浄し、それに抗原結合分子または抗体を制御して試験および制御するFITC標識抗体を加える。標識抗体で染色された蛍光強度および細胞数は、FACSCalibur(BD)を用いて決定される。試験および制御抗原結合分子または抗体は、適切な緩衝液を用いて適宜希釈され、所望の濃度で使用される。例えば、それらは10マイクロg/ml〜10ng/mlの範囲内の濃度で使用され得る。CELL QUESTソフトウェア(BD)を用いた分析により決定される蛍光強度、すなわち幾何平均値は、細胞に結合した標識抗体の量を反映する。すなわち、結合した標識抗体の量で表される抗原結合分子または抗体の試験および制御抗原結合分子または結合活性は、幾何平均値を測定することによって決定することができる。

上記の方法では、抗原結合分子または抗体が"変異型RNF43"を発現する細胞に実質的に結合しないか否かは、例えば以下の方法により評価することができる。まず、変異型RNF43を発現する細胞に結合した抗原結合分子または抗体を、標識抗体で染色して試験および制御する。そして、細胞の蛍光強度が決定される。FACSCaliburをフローサイトメトリーによる蛍光検出に使用する場合、CELL QUESTソフトウェアを使用して決定された蛍光強度を分析することができます。抗原結合分子または抗体の有無における幾何平均値から、比較値(デルタジオ平均)を以下の式に従って算出し、蛍光強度の増加率を決定することができる。抗原結合分子または抗体による結合の結果。

デルタジオ平均 =ジオ平均(抗原結合分子または抗体の存在下で)/ジオ平均(抗原結合分子または抗体がない場合)

上記分析により決定された幾何平均比較値(変異型RNF43分子のデルタ地理平均値)は、変異型RNF43を発現する細胞に結合した試験抗原結合分子または抗体の量を反映し、デルタと比較されるRNF43発現細胞に結合した試験抗原結合分子または抗体の量を反映する地理平均比較値。この場合、変異型RNF43を発現するRNF43発現細胞および細胞に対するデルタジオ平均比較値を決定するために用いられる試験抗原結合分子または抗体の濃度は、特に等しく調整されるか実質的に等しい。RNF43でエピトープを認識することが確認された抗原結合分子または抗体は、対照抗原結合分子または抗体として使用される。

変異型RNF43を発現する細胞に対する試験抗原結合分子または抗体のデルタジオ平均比較値が、RNF43発現細胞に対する試験抗原結合分子または抗体のデルタジオ平均比較値よりも少なくとも80%小さい場合、好ましくは50%、より好ましくは30%、特に好ましくは15%であり、次いで試験抗原結合分子または抗体"は、変異型RNF43を発現する細胞に実質的に結合しない。地理平均(幾何平均)値を決定するための式は、CELL QUESTソフトウェアユーザーズガイド(BDバイオサイエンス)に記載されています。比較結果が比較値が実質的に同等であることを示す場合、抗原結合分子または抗体の試験および制御のエピトープは、同じであると判断することができる。

特異性
"Specific" は、1 つ以上の結合パートナーに特異的に結合する分子が、パートナー以外の分子に有意な結合を示さないことを意味します。さらに、"specific" は、抗原結合ドメインが抗原に含まれる複数のエピトープの特定のエピトープに特異的である場合にも使用されます。抗原結合ドメインに結合したエピトープが複数の異なる抗原に含まれる場合、抗原結合ドメインを含む抗原結合分子は、エピトープを有する種々の抗原に結合することができる。

単一特異性抗原結合分子
"単一特異性抗原結合分子" という用語は、1 種類の抗原にのみ特異的に結合する抗原結合分子を指すために使用されます。単一特異性抗原結合分子の好ましい例は、単一タイプの抗原結合ドメインを含む抗原結合分子である。単一特異性抗原結合分子は、単一の抗原結合ドメインまたは同じタイプの複数の抗原結合ドメインを含むことができる。単一特異性抗原結合分子の好ましい例は、単一特異性抗体である。単一特異性抗原結合分子がIgG型の単一特異性抗体である場合、単一特異性抗体は、同じ抗原結合特異性を有する2つの抗体可変断片を含む。

抗体断片
「抗体断片」とは、無傷の抗体が結合する抗原と結合する無傷の抗体の一部を含む無傷の抗体以外の分子を指します。抗体断片の例としては、Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2が挙げられるがこれらに限定されない。ダイアボディ;線形抗体;単鎖抗体分子 (例えば scFv);および抗体断片から形成される多重特異性抗体。

用語 "全長抗体,""""および"全抗体"は、ネイティブ抗体構造に実質的に類似した構造を有する抗体、またはFc領域を含む重鎖を有する抗体を指すために、本明細書において同義的に使用される。本明細書で定義されます。

可変フラグメント (Fv)
本明細書において、用語"可変フラグメント(Fv)"は、抗体光鎖可変領域(VL)および抗体重鎖可変領域(VH)の対から構成される抗体由来抗原結合ドメインの最小単位を指す。1988年、スケラとプラクトゥンは、細菌シグナル配列の下流に抗体遺伝子を挿入し、大腸菌(Science(Science)240(1988)240(科学)における遺伝子の発現を誘導することにより、大腸菌周辺画分から均質で活性な抗体を調製できることを発見した(4855), 1038-1041).周辺画分から調製されたFvでは、VHは抗原に結合するようにVLと関連する。

scFv、単鎖抗体、およびsc(Fv)2
本明細書において、用語"scFv"、"単鎖抗体"、および"sc(Fv)2"は、いずれも重鎖および軽鎖に由来する可変領域を含む単一のポリペプチド鎖の抗体断片を指すが、定常領域を指さない。一般に、単鎖抗体はまた、VHドメインとVLドメイン間のポリペプチドリンカーを含み、抗原結合を可能にすると考えられている所望の構造の形成を可能にする。単鎖抗体は、"モノクローナル抗体の薬理学,Vol.113,ローゼンバーグとムーア,eds.,シュプリンガー・ヴェルラグ,ニューヨーク,269-315(1994)"でプルックトゥンによって詳細に議論されています。国際特許公開WO 1988/001649も参照してください。米国特許第4,946,778号および5,260,203号。特定の実施形態において、単鎖抗体は、二重特異性および/またはヒト化され得る。

scFvは、VHおよびVL形成Fvがペプチドリンカーによって一緒に連結される抗原結合ドメインである(Proc. Natl. Acad. Sci. Sci. S.S.A. 85(16), 5879-5883)。VHおよびVLは、ペプチドリンカーによって近接して保持することができる。

sc(Fv)2は、2つのVLと2つのVHの4つの可変領域がペプチドリンカーなどのリンカーによって連結され、単一鎖(J Immunol.)を形成する単鎖抗体である。方法 (1999) 231(1-2), 177-189).2つのVHおよび2つのVLは、異なるモノクローナル抗体に由来し得る。このようなsc(Fv)2は、好ましくは、例えば、免疫学雑誌(1994)152(11)、5368-5374に開示されているように、単一の抗原に存在する2つのエピトープを認識する二重特異性sc(Fv)2を含む。sc(Fv)2は、当業者に知られている方法によって製造することができる。例えば、sc(Fv)2は、ペプチドリンカー等のリンカーによってscFvを連結することにより製造することができる。

本明細書では、sc(Fv)2を形成する抗原結合ドメインの形態は、2つのVH単位と2つのVL単位がVH、VL、VH、およびVL([VH]リンカー-[VH]-リンカー-[VL])のN末端から始まる順序で配置された抗体を含むポリペプチド。2つのVH単位および2つのVL単位の順序は上記の形態に限定されず、それらは任意の順序で配置することができる。フォームの例を以下に示します。
[VL]リンカー-[VH]リンカー-[VH]リンカー-[VL]
[VH]-リンカー-[VL]リンカー-[VL]リンカー-[VH]
[VH]-リンカー-[VH]リンカー-[VL]リンカー-[VL]
[VL]リンカー-[VL]リンカー-[VH]リンカー-[VH]
[VL]リンカー-[VH]リンカー-[VL]リンカー-[VH]

sc(Fv)2の分子形態も2006/132352に詳細に記載されている。これらの説明によれば、当業者は、本明細書に開示されるポリペプチド複合体を製造するために所望のsc(Fv)2を適宜調製することができる。

さらに、本開示の抗原結合分子または抗体は、PEGなどの担体ポリマーまたは抗癌剤などの有機化合物と共役してもよい。あるいは、糖鎖付加配列は、好ましくは、糖鎖が所望の効果を生み出すような抗原結合分子または抗体に挿入される。

抗体の可変領域を連結するために使用されるリンカーは、遺伝子工学、合成リンカー、および例えば、タンパク質工学、9(3)、299-305、1996に開示されたリンカーによって導入され得る任意のペプチドリンカーを含む。しかしながら、ペプチドリンカーは、本開示において好ましい。ペプチドリンカーの長さは特に限定されず、目的に応じて当業者によって好適に選択することができる。長さは、5アミノ酸以上が好ましく(特に限定されないが、上限は一般に30アミノ酸以下、好ましくは20アミノ酸以下)、特に好ましくは15アミノ酸である。sc(Fv)2に3つのペプチドリンカーが含まれている場合、その長さは全て同一であっても異なっていてもよい。

例えば、このようなペプチドリンカーは次のとおりです。
論文集
グリー・サー
グリー・グリー・サー
サー・グリー・グリー
グリー・グリー・サー (SEQ ID 番号: 28)
サー・グリー・グリー (SEQ ID番号: 29)
グリー・グリー・グリー・サー (SEQ ID 番号: 30)
サー・グリー・グリー・グリー (SEQ ID 番号: 31)
グリー・グリー・グリー・グリー・サー (SEQ ID番号: 32)
サー・グリー・グリー・グリー(SEQ ID番号:33)
グリー・グリー・グリー・グリー・サー (SEQ ID番号: 34)
サー・グリー・グリー・グリー・グリー (SEQ ID番号: 35)
(グリー・グリー・グリー・サー(SEQ ID番号:30)n
(サー・グリー・グリー・グリー(SEQ ID番号:31)n
ここで、n は 1 以上の整数です。ペプチドリンカーの長さまたは配列は、目的に応じて当業者によって適宜選択することができる。

合成リンカー(化学架橋剤)は、ペプチドを架橋するために日常的に使用され、例は次のとおりです。
N-ヒドロキシコハク酸イミド(NHS)
亜酸化ジクシニミドジル(DSS)
ビス(スルホスシクニミジル)サブセリン酸(BS3)、
ジチオビス(プロピオン酸コハシミジル)(DSP)
ジチオビス(スルホスチニミジルプロピオン酸)(DTSSP)
エチレングリコールビス(コハシウク酸コハク酸(EGS)、
エチレングリコールビス(スルホスシクシジルコハク酸)(スルホEGS)
二ジクシニミジルタル酸(DST)、ジスルホスシクニミジルタル酸(スルホ-DST)、
ビス[2-(コハジミドキシカルボニルオキシ)エチル]スルホン(BSOCOES)、および
ビス[2-(スルホシチニミドオキシルキシオキシルキシ)エチル]スルホン(スルホ-BSOCOES)。
これらの架橋剤は市販されている。

一般に、3つのリンカーは、4つの抗体可変領域を連結する必要がある。使用するリンカーは、同じ型または異なる型である場合があります。

ファブ、F(ab')2、ファブ'
"Fab" は、単一の軽鎖と、単一の重鎖からの CH1 ドメインと可変領域で構成されます。Fab分子の重鎖は、別の重鎖分子とのジスルフィド結合を形成することはできません。

"F(ab')2" または "Fab" は、ペプシンやパパインなどのプロテアーゼで免疫グロブリン(モノクローナル抗体)を処理することによって産生され、存在するジスルフィド結合の近くで免疫グロブリン(モノクローナル抗体)を消化することによって生成される抗体断片を指します。2つのH鎖のそれぞれの蝶番領域の間。例えば、パパインは2つのH鎖の間に存在するジスルフィド結合の上流にIgGを切断し、2つの相同抗体断片を生成し、そのL鎖がVL(L鎖可変領域)およびCL(L鎖定常領域)を含むVH(H鎖可変領域)とCHガンマ1(H鎖定常領域におけるガンマ1領域)を含むH鎖断片に、C末端領域におけるジスルフィド結合を介して連結される。これら2つの相同抗体断片のそれぞれはFab'と呼ばれています。

"F(ab')2" は、2 つの重鎖間にジスルフィド結合が形成されるように、CH1 ドメインの定常領域と CH2 ドメインの一部を含む 2 つの軽鎖と 2 つの重鎖で構成されます。本明細書に開示されるF(ab')2は、好ましくは以下のように製造することができる。所望の抗原結合ドメインを含むモノクローナル抗体全体またはそのようなものは、ペプシンなどのプロテアーゼで部分的に消化される。FcフラグメントはプロテインAカラムへの吸着によって除去されます。プロテアーゼとしては、特に限定されないが、pH等の適切なセットアップ酵素反応条件下でF(ab')2を作製する選択的な方法で抗体全体を切断できるものであれば、このようなプロテアーゼとしては、例えば、ペプシンおよびフィシンが挙げられる。

Fc地域
本明細書において用語"Fc領域"または"Fcドメイン"は、定常領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖のC末端領域を定義するために使用される。この用語には、ネイティブシーケンス Fc 領域およびバリアント Fc 領域が含まれます。一実施形態では、ヒトIgG重鎖Fc領域は、Cys226、またはPro230から、重鎖のカルボキシル末端に延びる。しかしながら、Fc領域のC末端リジン(Lys447)またはグリシンリジン(残基446〜447)が存在する場合もあれば、存在しない場合がある。本明細書で特に指定されない限り、Fc領域または定常領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、EUの番号付けシステムに従い、EU指数とも呼ばれ、Kabatら、免疫学的関心のタンパク質の配列、第5エドに記載されている。保健サービス, 国立衛生研究所, ベセッサダ, MD, 1991.

Fc受容体
用語 "Fc 受容体" または "FcR" は、抗体の Fc 領域に結合する受容体を指します。いくつかの実施形態では、FcRは、天然のヒトFcRである。いくつかの実施形態では、FcRは、IgG抗体(ガンマ受容体)に結合し、FcガンマRI、FcガンマRII、およびFcガンマRIIIサブクラスの受容体を含むものであり、アレル変異体およびそれらの受容体の代替的なスプライシング形態を含む。FcガンマRII受容体は、FcガンマRIIA("活性化受容体")およびFcガンマRIIB("阻害受容体")を含み、その細胞質ドメインにおいて主に異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化受容体Fc γ RIIAは、その細胞質ドメインにおける免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ(ITAM)を含む。阻害受容体Fc γ RIIBは、その細胞質ドメインにおける免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ(ITIM)を含む。(例えば、大トロン、アヌ。レヴレ・イムノール15:203-234 (1997)).FcR は、例えば、ラヴェッチとキネット、アンヌで見直されます。免疫第9:457-92 (1991);カペルら, 免疫方法 4:25-34 (1994);そしてデ・ハースら、J.ラボ・クリン126:330-41 (1995).将来識別されるものも含め、その他の FcR は、本明細書で "FcR" という用語に含まれています。

用語 "Fc受容体" または "FcR" はまた、胎児への母体 IgGs の転送を担当する新生児受容体、FcRn (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) とキムら, J. Immunol. 24:249 (1994)) とホームオスタスタの規制を含む免疫グロブリン。FcRnへの結合を測定する方法は公知である(例えば、ゲティおよびワード、免疫を参照してください。今日 18(12):592-598 (1997);ゲティら, 自然バイオテクノロジー, 15(7):637-640 (1997);ヒントンら, J. バイオルケム 279(8):6213-6216 (2004);WO 2004/92219 (ヒントンら).

ヒトFcRn高親和性結合ポリペプチドの生体内および血漿中のヒトFcRnへの結合は、例えば、ヒトFcRnを発現するトランスジェニックマウスまたはトランスフェクトヒト細胞株において、または変異型Fc領域を有するポリペプチドが有する霊長類においてアッセイされ得る投与。WO 2000/42072(Presta)は、FcRへの結合を増加または減少させた抗体変異体を記述する。また、例えば、シールズらJ.バイオルケム9(2):6591-6604(2001)も参照してください。

Fcガンマ受容体
Fc γ受容体は、モノクローナルIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4抗体のFcドメインに結合し得る受容体を指し、およびFcガンマ受容体遺伝子によって実質的にコードされるタンパク質のファミリーに属するすべてのメンバーを含む。ヒトでは、ファミリーはアイソフォームFcガンマRIa、FcガンマRIbおよびFcガンマRIcを含むFcガンマRI(CD64)を含む。アイソフォームFcガンマRIIA(アロタイプH131およびR131を含む)、FcガンマRIIb(FcガンマRIIb-1およびFcガンマRIIb-2を含む)、およびFcガンマRIIcを含むFcガンマRII(CD32;アイソフォームFcガンマRIIIa(アロタイプV158およびF158を含む)およびFcガンマRIIIb(アロタイプFcガンマRIIIb-NA1およびFcガンマRIIIb-NA2を含む)を含むFcガンマRIII(CD16)。すべての未確認ヒトFcガンマ受容体、Fcガンマ受容体アイソフォーム、およびその同種。しかしながら、Fcγ受容体は、これらの例に限定されるものではない。これに限定されることなく、Fc γ受容体は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、およびサルに由来するものを含む。Fcガンマ受容体は、任意の生物に由来し得る。マウスFcガンマ受容体は、これらに限定されずに、FcガンマRI(CD64)、FcガンマRI(CD32)、FcガンマRIII(CD16)、およびFcガンマRIII-2(CD16-2)、ならびに全ての未確認マウスFcガンマ受容体、Fcガンマ受容体アイソフォーム、およびアロタイプを含む。このような好ましいFcガンマ受容体としては、例えば、ヒトFcガンマRI(CD64)、FcガンマRIIA(CD32)、FcガンマRIIB(CD32)、FcガンマRIIIA(CD16)、および/またはFcガンマRIIIB(CD16)が挙げられる。FcガンマRIのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号に示されています: 36 (NM_000566.3) と 37 (NP_000557.1),FcガンマRIIAのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号に示されています: 38 (BC020823.1) と 39 (AAH20823.1),FcガンマRIIBのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号に示されています: 40 (BC146678.1) と 41 (AAI46679.1),FcガンマRIIIAのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号NOに示されています: 42 (BC033678.1) と 43 (AAH33678.1),Fc γ RIIIBのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号:44(BC128562.1)および45(AAI28563.1)に示され、(RefSeqのアクセス数はそれぞれ括弧内に示されている)。Fcガンマ受容体がモノクローナルIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4抗体のFcドメインに結合活性を有するかどうかは、ALPHAスクリーン(増幅発光近接均質アッセイ)、表面プラズモン共鳴(SPR)ベースのBIACORE法、およびその他(上記のFACSおよびELISAフォーマットに加えて、米国(2006年)103(11)、4005-4010。

一方、"Fcリガンド"または"エフェクターリガンド"は、分子を指し、好ましくは抗体Fcドメインに結合するポリペプチドであり、Fc/Fcリガンド複合体を形成する。分子は、任意の生物に由来し得る。FcリガンドとFcへの結合は、好ましくは1つ以上のエフェクター機能を誘導する。このようなFcリガンドとしては、これらに限定されないが、Fc受容体、Fcγ受容体、Fcα受容体、Fcβ受容体、FcRn、C1q、およびC3、マンナン結合レクチン、マンノース受容体、ブドウ球菌タンパク質A、ブドウ球菌タンパク質G、およびウイルスFcガンマ受容体が挙げられる。Fcリガンドには、Fc受容体ホモログ(FcRH)(Davis et al., (2002) 免疫学的レビュー190,123-136)も含まれ、これはFcガンマ受容体に相同なFc受容体のファミリーである。Fcリガンドには、Fcに結合する未確認分子も含まれる。

Fcガンマ受容体結合活性
Fcガンマ受容体のいずれかに対するFcドメインの結合活性の障害は、FcガンマRI、FcガンマRIA、FcガンマRIIB、FcガンマRIIIA、および/またはFcガンマRIIIB、および/またはFcガンマRIIIBは、上記のFACSおよびELISAフォーマットならびにALPHAスクリーン(増幅ルミネッセンス)を使用して評価することができる近接均質アッセイ)および表面プラズモン共鳴(SPR)ベースのBIACORE法(Proc. Natl. Acad. Sci. Usa (2006) 103(11), 4005-4010)。

ALPHAスクリーンは、ドナーとアクセプタビーズの2種類のビーズを使用して、以下に説明する原理に基づいてALPHA技術によって実行されます。発光シグナルは、ドナービーズに結合した分子がアクセプタビーズに結合した分子と生物学的に相互作用する場合、および2つのビーズが近接している場合にのみ検出されます。レーザービームで励起され、ドナービーズの光感化剤は、ビーズの周りの酸素を励起された一体型酸素に変換します。一重み付けされた酸素がドナービーズの周りに拡散し、近接位置にあるアクセプタビーズに到達すると、アクセプタビーズ内の化学発光反応が誘導される。この反応は最終的に発光をもたらす。ドナービーズに結合した分子がアクセプタビーズに連結された分子と相互作用しない場合、ドナービーズによって産生される単一の酸素はアクセプタビーズに到達せず、化学発光反応は起こらない。

例えば、ビオチン標識抗原結合分子または抗体は、ドナービーズおよびグルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)タグ付きFcγ受容体に固定化され、アクセプタビーズに固定化される。競合変異型Fcドメインを含む抗原結合分子または抗体がない場合、Fcガンマ受容体は、野生型Fcドメインを含む抗原結合分子または抗体と相互作用し、その結果、520〜620nmのシグナルを誘導する。非タグ付け変異型Fcドメインを有する抗原結合分子または抗体は、Fcガンマ受容体との相互作用のために野生型Fcドメインを含む抗原結合分子または抗体と競合する。相対結合親和性は、競合の結果として蛍光の減少を定量することによって決定することができる。スルフォ-NHS-ビオチン等を用いた抗体等の抗原結合分子または抗体をビオチン化する方法が知られている。Fcガンマ受容体にGSTタグを追加するための適切な方法は、FcガンマレプターとGSTフレーム内をコードするポリペプチドを融合し、遺伝子を運ぶベクターで導入された細胞を用いて融合遺伝子を発現し、次いで、グルタチオンカラム。誘導信号は、例えばGRAPHPAD PRISM(GraphPad;サンディエゴ)。

その相互作用を観察するための物質の1つは、センサーチップの金薄層にリガンドとして固定化される。金の薄い層とガラスの界面で全反射が起こるようにセンサーチップの背面に光を当てると、ある部位(SPR信号)で反射光の強度が部分的に低下します。その相互作用を観察するための他の物質は、センサーチップの表面に検体として注入される。固定化リガンド分子の質量は、検体がリガンドに結合すると増加する。これにより、センサチップの表面上の溶媒の屈折率が変化します。屈折指数の変化は、SPR信号の位置シフトを引き起こします(逆に、解離は信号を元の位置に戻します)。Biacoreシステムでは、上述したシフト量(すなわち、センサチップ表面の質量の変化)が縦軸にプロットされ、従って時間の経過とともに質量の変化が測定データ(センサーグラム)として示される。運動学的パラメータ(会合速度定数(ka)と解離速度定数(kd))は、センサーグラムの曲線から決定され、親和性(Kd)はこれら2つの定数間の比率から決定される。阻害アッセイは、ビアコア法において好ましく用いられる。このような阻害アッセイの例は、米国(2006)103(11)、4005-4010に記載されているナトル・アカド・サイ・アメリカの第一語に記載されている。

減少したFcガンマ受容体結合活性を有するFc領域
本明細書において、"減少したFcガンマ受容体結合活性"は、例えば、上述の分析方法に基づいて、試験抗原結合分子または抗体の競合活性が50%以下、好ましくは45%以下、40%以下、35%以下、30%以下、20%以下、または15%以下、特に好ましくは10%以下、9%以下、8%以下、7%以下、6%以下、5%以下、4%以下、3%以下、2%以下、または1%以下の対照抗原結合分子または抗体の競合活性よりも1%以下である。

モノクローナルIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4抗体のFcドメインを含む抗原結合分子または抗体は、対照抗原結合分子または抗体として適宜使用することができる。Fc ドメイン構造は、SEQ ID ON: 9 (A は RefSeq 加盟番号 AAC82527.1 の N 終端に追加されます)、10 (A は RefSeq 加盟番号 AAB59393.1 の N 終端に追加されます)、11 (A は RefSeq アクセスの N 末端に追加されます。、および 12 (A は RefSeq 加盟番号 AAB59394.1 の N 終端に追加されます)。さらに、特定のアイソタイプの抗体のFcドメイン変異体を含む抗原結合分子または抗体が被験物質として使用される場合、その変異体がFcγ受容体結合活性に及ぼす影響を、同じアイソタイプのFcドメインを含む抗原結合分子または抗体を制御する。上述したように、Fcγ受容体結合活性が低下していると判断されたFcドメイン変異体を含む抗原結合分子または抗体が適宜調製される。

このような公知の変異体としては、例えば、アミノ酸231A-238S(EU番号)の欠失を有する変異体(WO 2009/011941)、ならびに変異体C226S、C229S、P238S、(C220S)(J.リウマトール(2007)34、111;を含む。C226SおよびC229S(ハム。アンチボッド。ハイブリドーマ (1990) 1(1), 47-54);C226S、C229S、E233P、L234V、およびL235A(血液(2007)109、1185-1192)。

具体的には、好ましい抗原結合分子または抗体は、以下のアミノ酸位置から選択される少なくとも1つのアミノ酸の変異(置換など)を有するFcドメインを含むものを含むもの:220、226、229、231、232、233、234、235、236、 237、238、239、 240、264、265、266、267、269、270、295、296、297、298、299、300、325、327、328、329、330、331、または332(EUナンバリング)、アイソタイプのFcドメインを形成するアミノ酸Fcドメインが由来する抗体のアイソタイプとしては、特に限定されないが、モノクローナルIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4抗体に由来する適切なFcドメインを用いることができる。IgG1抗体に由来するFcドメインを用いることが好ましい。

好ましい抗原結合分子または抗体は、例えば、以下に示す置換のいずれかを有するFcドメインを含むもの、その位置がEUナンパリングに従って指定される(各番号はアミノの位置を表す)EUの番号付けにおける酸残基;数より前の1文字のアミノ酸記号は置換前のアミノ酸残基を表し、その数の後の1文字のアミノ酸記号は置換後のアミノ酸残基を表す)Fcドメインを形成するアミノ酸IgG1抗体の:
(a) L234F, L235E, P331S;
(b) C226S,C229S,P238S;
(c) C226S, C229S;または
(d) C226S, C229S, E233P, L234V, L235A;
231〜238位でアミノ酸配列の欠失を有するFcドメインを有するものと同様に。

さらに、好ましい抗原結合分子または抗体はまた、以下に示す置換のいずれかを有するFcドメインを含むものも含み、その位置は、Fcドメインを形成するアミノ酸におけるEUナンパに従って指定される。IgG2抗体:
(e) H268Q、V309L、A330S、および P331S;
(f) V234A;
(g) G237A;
(h) V234A および G237A;
(i) A235E および G237A;または
(j) V234A、A235E、および G237A。各数値は、EUナンパにおけるアミノ酸残基の位置を表します。数の前の1文字のアミノ酸記号は置換前のアミノ酸残基を表し、その後の1文字のアミノ酸記号は置換後のアミノ酸残基を表す。

さらに、好ましい抗原結合分子または抗体はまた、以下に示す置換のいずれかを有するFcドメインを含むものも含み、その位置は、Fcドメインを形成するアミノ酸におけるEUナンパに従って指定される。IgG3抗体:
(k) F241A;
(l) D265A;または
(m) V264A.各数値は、EUナンパにおけるアミノ酸残基の位置を表します。数の前の1文字のアミノ酸記号は置換前のアミノ酸残基を表し、その後の1文字のアミノ酸記号は置換後のアミノ酸残基を表す。

さらに、好ましい抗原結合分子または抗体はまた、以下に示す置換のいずれかを有するFcドメインを含むものも含み、その位置は、Fcドメインを形成するアミノ酸におけるEUナンパに従って指定される。IgG4抗体:
(n) L235A、G237A、および E318A;
(o) L235E;または
(p) F234A および L235A.各数値は、EUナンパにおけるアミノ酸残基の位置を表します。数の前の1文字のアミノ酸記号は置換前のアミノ酸残基を表し、その後の1文字のアミノ酸記号は置換後のアミノ酸残基を表す。

他の好ましい抗原結合分子または抗体としては、例えば、IgG1抗体のFcドメインを形成するアミノ酸中の任意のアミノ酸が233、234、235、236、237、327、330、または331(EUナンディング)であるFcドメインを含むものが含まれます。対応するIgG2またはIgG4におけるEUナンパにおける対応する位置のアミノ酸で置換される。

好ましい抗原結合分子または抗体はまた、例えば、IgG1抗体のFcドメインを形成するアミノ酸中の1つ以上のアミノ酸が234、235、および297(EUナンディング)であるFcドメインを含むものが含まれる。他のアミノ酸で置換する。置換後のアミノ酸の種類は特に限定されない。しかしながら、位置234、235、および297の位置にある1つ以上のアミノ酸がアラニンで置換されるFcドメインを含む抗原結合分子または抗体が特に好ましい。

好ましい抗原結合分子または抗体はまた、例えば、IgG1抗体のFcドメインを形成するアミノ酸中の265位のアミノ酸(EUナンパ)が別のアミノ酸で置換されるFcドメインを含むものも含む。置換後のアミノ酸の種類は特に限定されない。しかしながら、265位のアミノ酸がアラニンで置換されるFcドメインを含む抗原結合分子または抗体が特に好ましい。

RNF43結合活性を有する抗原結合ドメイン
本明細書で使用される"RNF43結合活性を有する抗原結合ドメイン"または"抗RNF43抗原結合ドメイン"は、上記のRNF43タンパク質に特異的に結合する抗原結合ドメイン、または全体または一部を指す。RNF43タンパク質の部分ペプチド。

特定の実施形態において、RNF43結合活性を有する抗原結合ドメインは、抗体軽鎖および重鎖可変領域(VLおよびVH)を含むドメインである。抗体軽鎖および重鎖可変領域を含むそのようなドメインの適切な例には、"単鎖Fv(scFv)"、"単鎖抗体"、"Fv"、"シングルチェーンFv2(scFv2)"、"Fab"、"F(ab')2"などがあります。特定の実施形態において、RNF43結合活性を有する抗原結合ドメインは、抗体Fab構造断片を含むドメインである。抗体Fab構造を含むドメインは、1つまたは複数の抗体の可変ドメインから提供され得る。

特定の実施形態において、RNF43結合活性を有する抗原結合ドメインは、抗RNF43抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態において、RNF43結合活性を有する抗原結合ドメインは、Fab構造を含むドメインである。

好ましくは、抗RNF43抗体は、配列番号1のアミノ酸配列(H鎖可変領域)を含むH鎖と、配列番号5のアミノ酸配列(L鎖可変領域)を含むL鎖をそれぞれ含む。

いくつかの実施形態では、RNF43結合活性を有する抗原結合ドメインは、RNF43の細胞外ドメインに特異的に結合する(SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:13のアミノ酸24〜194)。いくつかの実施形態では、RNF43結合活性を有する抗原結合ドメインは、RNF43の細胞外ドメイン内のエピトープに特異的に結合する(配列番号:18、配列番号24-194の配列番号:13)。いくつかの実施形態では、RNF43結合活性を有する抗原結合ドメインは、真核細胞の表面に発現されるRNF43タンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、RNF43結合活性を有する抗原結合ドメインは、癌細胞の表面に発現されるRNF43タンパク質に結合する。

特定の実施形態において、RNF43結合活性を有する抗原結合ドメインは、以下の表1に示す抗体断片を含む。

具体的な実施形態において、RNF43結合活性を有する抗原結合ドメインは、表1に示す抗体断片のいずれか1とヒトRNF43との結合を競合する抗体断片を含むドメインである。特定の実施形態において、RNF43結合活性を有する抗原結合ドメインは、表1に示す抗体断片のいずれかとしてヒトRNF43内の同じエピトープに結合する抗体断片を含むドメインである。

あるいは、RNF43結合活性を有する抗原結合ドメインは、上記抗体断片のいずれか1つとヒトRNF43との結合を競合する抗体断片を含む。あるいは、RNF43結合活性を有する抗原結合ドメインは、上記抗体断片のいずれかがヒトRNF43上に結合するのと同じエピトープに結合する抗体断片を含む。

T細胞受容体複合結合活性を有する抗原結合ドメイン
本明細書で使用される「T細胞受容体複合体結合活性を有する抗原結合ドメイン」または"抗T細胞受容体複合体抗原結合ドメイン"という語句は、その全体または一部に特異的に結合する抗原結合ドメインを指す。T細胞受容体複合体の部分ペプチド。T細胞受容体複合体は、T細胞受容体自体、またはT細胞受容体と共にT細胞受容体複合体を構成するアダプター分子であってもよい。CD3はアダプター分子として適している。

特定の実施形態において、T細胞受容体複合結合活性を有する抗原結合ドメインは、抗体軽鎖および重鎖可変領域(VLおよびVH)を含むドメインである。抗体軽鎖および重鎖可変領域を含むそのようなドメインの適切な例には、"単鎖Fv(scFv)"、"単鎖抗体"、"Fv"、"シングルチェーンFv2(scFv2)"、"Fab"、"F(ab')2"などがあります。特定の実施形態において、T細胞受容体複合体結合活性を有する抗原結合ドメインは、抗体断片を含むドメインである。抗体断片を含むドメインは、1つまたは複数の抗体の可変ドメインから提供され得る。

特定の実施形態において、T細胞受容体複合体結合活性を有する抗原結合ドメインは、抗T細胞受容体複合体抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態において、T細胞受容体複合体結合活性を有する抗原結合ドメインは、Fab構造を含むドメインである。

T細胞受容体結合活性を有する抗原結合ドメイン
本明細書で使用される"T細胞受容体結合活性を有する抗原結合ドメイン"または"抗T細胞受容体抗原結合ドメイン"は、Tの部分ペプチドの全体または一部に特異的に結合する抗原結合ドメインを指す細胞受容体。抗原結合ドメインが結合するT細胞受容体の部分は、T細胞受容体の可変領域またはT細胞受容体の定常領域であり得る。しかしながら、定常領域に存在するエピトープが好ましい。定常領域配列の例としては、RefSeqアゲリオンNo.のT細胞受容体α鎖が挙げられる。CAA26636.1(SEQ ID番号:19)は、RefSeqアフィリオンNo.のT細胞受容体β鎖である。C25777(SEQ ID番号:20)は、RefSeqアフィリオンNo.のT細胞受容体γ1鎖である。A26659(SEQ ID番号:21)は、RefSeqアフィリオンNo.のT細胞受容体γ2鎖である。AAB63312.1(SEQ ID 番号:22)、およびRefSeqアクセス番号のT細胞受容体デルタ鎖。AAA61033.1 (SEQ ID 番号: 23)。

特定の実施形態において、T細胞受容体結合活性を有する抗原結合ドメインは、抗体軽鎖および重鎖可変領域(VLおよびVH)を含むドメインである。抗体軽鎖および重鎖可変領域を含むそのようなドメインの適切な例には、"単鎖Fv(scFv)"、"単鎖抗体"、"Fv"、"シングルチェーンFv2(scFv2)"、"Fab"、"F(ab')2"などがあります。特定の実施形態において、T細胞受容体結合活性を有する抗原結合ドメインは、抗体断片を含むドメインである。抗体断片を含むドメインは、1つまたは複数の抗体の可変ドメインから提供され得る。

特定の実施形態において、T細胞受容体結合活性を有する抗原結合ドメインは、抗T細胞受容体抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態において、T細胞受容体結合活性を有する抗原結合ドメインは、Fab構造を含むドメインである。

CD3結合活性を有する抗原結合ドメイン
本明細書で使用される"CD3結合活性を有する抗原結合ドメイン"または"抗CD3抗原結合ドメイン"という語句は、CD3の部分的なペプチドの全体または一部に特異的に結合する抗原結合ドメインを指す。CD3結合活性を有する抗原結合ドメインは、ヒトCD3を構成するガンマ鎖、デルタ鎖、またはイプシロン鎖鎖配列にエピトープが存在する限り、任意のエピトープ結合ドメインであってもよい。CD3を構成するガンマ鎖、デルタ鎖、またはイプシロン鎖の構造に関しては、これらのポリヌクレオチド配列はRefSeqアフィリオンNに開示されている。NM_000073.2、NM_000732.4 および NM_000733.3、およびポリペプチド配列は、SEQ ID NO: 24 (NP_000064.1)、25 (NP_000723.1)、および 26 (NP_000724.1) に示されています。

特定の実施形態において、CD3結合活性を有する抗原結合ドメインは、抗体軽鎖および重鎖可変領域(VLおよびVH)を含むドメインである。抗体軽鎖および重鎖可変領域を含むそのようなドメインの適切な例には、"単鎖Fv(scFv)"、"単鎖抗体"、"Fv"、"シングルチェーンFv2(scFv2)"、"Fab"、"F(ab')2"などがあります。特定の実施形態において、CD3結合活性を有する抗原結合ドメインは、抗体断片を含むドメインである。抗体断片を含むドメインは、1つまたは複数の抗体の可変ドメインから提供され得る。

特定の実施形態において、CD3結合活性を有する抗原結合ドメインは、抗CD3抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態において、CD3結合活性を有する抗原結合ドメインは、Fab構造を含むドメインである。

本開示のCD3結合活性を有する抗原結合ドメインは、エピトープがヒトCD3を形成するガンマ鎖、デルタ鎖、またはイプシロン鎖配列内に位置する限り、任意のエピトープに結合し得る。本開示において、CD3結合活性を有する好ましい抗原結合ドメインは、CD3抗体軽鎖可変領域(VL)およびCD3抗体重鎖可変領域(VH)を含むものを含み、細胞外のエピトープに結合するヒトCD3複合体のイプシロン鎖のドメイン。CD3結合活性を有する好ましい抗原結合ドメインとしては、CD3抗体軽鎖可変領域(VL)およびCD3抗体重鎖可変領域(VH)を含むものが挙げられる(Natl. Acad. Sci. Usa (1980) 77, 4914-4917)またはNCBIアヘンの軽鎖可変領域(VL)を有する抗体などの種々の公知のCD3抗体。AAB24132およびNCBIアジオン番号の重鎖可変領域(VH)。AAB24133 (Int. J. がんサプル 7, 45-50 (1992)).さらに、CD3結合活性を有するそのような適切な抗原結合ドメインは、所望の特性を有するCD3抗体に由来するものを含み、これは所望の動物をγ鎖、デルタ鎖、またはイプシロン鎖で免疫することによって得られる上述した方法によりヒトCD3を形成する。CD3結合活性を有する抗原結合ドメインが誘導される適切な抗CD3抗体としては、上記のようにヒト抗体および抗体が適宜ヒト化される。

CD3結合活性を有する抗原結合ドメインは、抗CD3抗体の可変領域から生成することができる。ヒトCD3イプシロンの異なるエピトープに結合するいくつかの抗体は、例えば抗体OKT3(例えばカン、P.ら、サイエンス206(1979)347-349を参照)サルメロン, A. ら, J 免疫 147 (1991) 3047-3052;US9226962B2)、抗体UCHT1(例えばキャラード、R.E.ら、クリンExp免疫43(1981)497-505を参照してください。Arnett et al. PNAS 2004)または抗体SP34(ヒトシノモルガスCD3クロス反応性;例えばペッサーノ、S.et al.、EMBO J 4(1985)337-344、コンラッドM.L.、および、サイトメトリーA 71(2007)925-933を参照)WO2015181098A1はまた、ヒトおよびサイトロルグスT細胞に特異的に結合するヒトシノモルグスクロス反応性抗体を開示し、ヒトT細胞を活性化し、抗体OKT3と同じエピトープに結合せず、抗体UCHT1および/または抗体SP34を開示する。

多重特異性抗原結合分子
「多重特異性抗原結合分子」とは、複数の抗原に特異的に結合する抗原結合分子を指します。好ましい実施形態では、本開示の多重特異性抗原結合分子は、2つ以上の抗原結合ドメインを含み、異なる抗原結合ドメインは、異なる抗原に特異的に結合する。

抗体は血漿中で非常に安定で副作用が少ないため、医薬品として注目されています。複数の治療用抗体の中で、いくつかのタイプの抗体は、抗腫瘍応答を発揮するためにエフェクター細胞を必要とする。抗体依存性細胞傷害性(ADCC)は、NK細胞およびマクロファージに存在するFc受容体に対する抗体のFc領域の結合を介して抗体結合細胞に対してエフェクター細胞によって示される細胞傷害性である。現在までに、ADCCに抗腫瘍効果を発揮させる複数の治療用抗体が、がん治療用医薬品として開発されている(Clin Cancer Res. 2010 Jan 1;16(1):11-20)。

いくつかの実施形態では、本開示の多重特異性抗原結合分子は、T細胞リクルート抗体(TR抗体)である。1980年代からT細胞をエフェクター細胞としてリクルートして細胞毒性を採用するT細胞リクルート抗体(TR抗体)が知られており(Nature. 1985 Apr 18-24;314(6012):628-31;Int Jがん.1988 4月 15;41(4):609-15;Proc Natl Acad Sci U S A. 1986 Mar;83(5):1453-7)TR抗体は、T細胞上のT細胞受容体複合体、特にCD3イプシロン鎖、および癌細胞上の抗原を形成するサブユニットのいずれかに認識し、結合する二重特異性抗体である。

いくつかの実施形態では、本開示の多重特異性抗原結合分子は、二重特異性T細胞エンゲージメント(BiTE)、TR抗体の一種である。"二重特異性T細胞エンゲージャー(BiTE)"は、最近、強力な抗腫瘍活性を示すことが判明しています(プロク・ナトル・アカッド・サイU A. 1995 7月18日; 92(15):7021-5;ドラッグディスコフ今日。2005 9月 15;10(18):1237-44).CD19に対するBiTE分子であるブリナツモマブは、2014年にFDAの承認を最初に受けました。Blinatumomabは、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性(ADCC)および補体依存性細胞傷害性を誘導するリツキシマブと比較して、インビトロでCD19/CD20陽性癌細胞に対してはるかに強い細胞傷害活性を示すことが証明されている(CDC) (Int J がん 2002年8月20日;100(6):690-7)。

本開示の多重特異性抗原結合分子は、RNF43結合活性を有する第1の抗原結合ドメイン、およびT細胞受容体複合体結合活性を有する第2の抗原結合ドメインを含む。上記の"RNF43結合活性を有する抗原結合ドメイン"およびT細胞受容体複合結合活性を有する抗原結合ドメインから選択されるRNF43結合活性を有する抗原結合ドメインの組み合わせ上記の"T細胞受容体複合結合活性を有する抗原結合ドメイン"から"CD3結合活性を有する抗原結合ドメイン"に記載されたものから選択される。

例えば、第1の抗原結合ドメインは、抗体重鎖および軽鎖可変領域を含むドメインであり、および/または第2の抗原結合ドメインは、抗体重鎖および軽鎖可変領域を含むドメインである。あるいは、第1の抗原結合ドメインは、抗体断片を含むドメインであり、および/または第2の抗原結合ドメインは、抗体断片を含むドメインである。あるいは、第1の抗原結合ドメインは、Fab構造を含むドメインであり、および/または第2の抗原結合ドメインは、Fab構造を含むドメインである。

特定の実施形態において、本開示は、抗体断片を含む第1の抗原結合ドメインを含む多重特異性抗原結合分子を提供し、RNF43結合活性を有し、第2の抗原結合ドメインと抗体断片を含み、T細胞受容体複合結合活性を有する。特定の実施形態において、本開示は、RNF43結合活性を有する第1の抗原結合ドメイン、T細胞受容体複合体結合活性を有する第2の抗原結合ドメイン、および減少したFcガンマ受容体結合活性を有するFc領域を含むドメイン。Fc領域は、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4抗体のFcドメインと比較して、Fcガンマ受容体結合活性を低下させてもよい。実施形態において、Fc領域は、配列番号NAの任意のFc領域構成アミノ酸においてアミノ酸変異を有するFc領域である:9〜12(IgG1〜IgG4)。

特定の実施形態において、本開示は、ヒトRNF43結合活性を有する第1の抗体断片、およびCD3結合活性を有する第2の抗体断片を含む二重特異性抗体を提供する。特定の実施形態において、本開示は、ヒトRNF43結合活性を有する第1の抗体断片、CD3結合活性を有する第2の抗体断片、および減少したFcガンマを有するFc領域を含む二重特異性抗体を提供する受容体結合活性。特定の実施形態において、本開示は、ヒトRNF43結合活性を有する第1の抗体断片、CD3エプリソン鎖結合活性を有する第2の抗体断片、および減少したFc領域を含む二重特異性抗体を提供する。Fcギャマン受容体結合活性は、天然に存在するIgG Fc領域と比較して。

本開示の"多重特異性抗原結合分子"の好ましい実施形態の例としては、多重特異性抗体が挙げられる。Fcガンマ受容体結合活性を低下させたFc領域を多重特異性抗体Fc領域として用いる場合、多重特異性抗体に由来するFc領域を適宜用いてもよい。二重特異性抗体は、本開示の多重特異性抗体として特に好ましい。この場合、二重特異性抗体は、2つの異なる特異性を有する抗体である。IgG型二重特異性抗体は、IgG抗体を産生する2種類のハイブリドーマを融合して産生されるハイブリッドハイブリドーマ(quadroma)から分泌することができる(Milstein et al., Nature (1983) 305, 537-540)。

さらに、IgG型二重特異性抗体は、目的とする2種類のIgGsを構成するL鎖とH鎖の遺伝子、すなわち合計4つの遺伝子を細胞内に導入し、それらを共発現させることによって分泌される。しかしながら、これらの方法によって製造できるIgGのH鎖とL鎖の組み合わせの数は理論的には10個の組み合わせである。従って、10種類のIgGsからH鎖とL鎖の所望の組み合わせを含むIgGを精製することは困難である。さらに、理論的には、所望の組み合わせを有するIgGの分泌量が著しく減少するため、大規模培養が必要となり、生産コストがさらに増加します。

従って、所望の組み合わせを有するH鎖とL鎖とH鎖との間の会合を促進する技術は、本開示の多重特異性抗原結合分子に適用することができる。
例えば、第2の定常領域または抗体H鎖の第3の定常領域(CH2またはCH3)の界面に静電反発を導入することにより望ましくないH鎖会合を抑制する技術を多重特異性抗体に適用することができる関連付け (WO2006/106905)。

CH2またはCH3の界面に静電反発を導入して意図しないH鎖会合を抑制する技術において、H鎖の他の定常領域の界面で接触するアミノ酸残基の例としては、領域が挙げられる。CH3領域のEU番号位置356、439、357、370、399、および409の残基に対応する。

より具体的には、例としては、2種類のH鎖CH3領域を含む抗体が挙げ、第1のH鎖CH3領域における1〜3対のアミノ酸残基を、(1)〜(3)に示すアミノ酸残基の対から選択し、同じものを運ぶ。電荷の種類:(1)EU番号位置356および439のH鎖CH3領域で含まれるアミノ酸残基;(2)EUの番号付け位置357および370のH鎖CH3領域で構成されるアミノ酸残基;(3)EUの番号位置399および409におけるH鎖CH3領域で含まれるアミノ酸残基。

さらに、抗体は、上述した第1のH鎖CH3領域とは異なる第2のH鎖CH3領域におけるアミノ酸残基の対が、(1)〜(3)の前述のアミノ酸残基の対から選択される抗体であってもよい。、ここで、上記の第1のH鎖CH3領域において同じタイプの電荷を担う(1)〜(3)の(1)〜(3)のアミノ酸残基の当量に対応するアミノ酸残基の1〜3対は、対応するアミノから反対の電荷を運ぶ上述した第1のH鎖CH3領域における酸残基。

上記の(1)〜(3)に示す各アミノ酸残基は、関連時に互いに近づく。当業者は、(1)〜(3)の上記のアミノ酸残基に対応する位置を、市販のソフトウェアを用いた相同モデリング等により所望のH鎖CH3領域またはH鎖定常領域で見つけ出すことができる。これらの位置の残基は、適宜修飾を施すことができる。

上述した抗体において、"荷電アミノ酸残基"は、好ましくは、例えば、以下のいずれかの基に含まれるアミノ酸残基から選択される。
(a)グルタミン酸(E)およびアスパラギン酸(D);そして
(b)リジン(K)、アルギニン(R)、ヒスチジン(H)。

上記抗体において、"同じ電荷を担う"という語句は、例えば、上記のグループ(a)及び(b)のいずれかに含まれるアミノ酸残基の2つ以上のアミノ酸残基の全てが選択されることを意味する。「逆電荷を運ぶ」という語句は、例えば、2つ以上のアミノ酸残基の中から少なくとも1つのアミノ酸残基が、上記のグループ(a)および(b)のいずれかに含まれるアミノ酸残基から選択された場合、残りを意味する。アミノ酸残基は、他の基に含まれるアミノ酸残基から選択される。

好ましい実施形態では、上述した抗体は、ジスルフィド結合によって架橋された第1のH鎖CH3領域および第2のH鎖CH3領域を有し得る。

本開示において、修飾を施したアミノ酸残基は、抗体可変領域または抗体定常領域の上記アミノ酸残基に限定されない。当業者は、市販のソフトウェアを用いて相同性モデリング等により変異ポリペプチドまたはヘテロマルチマー内の界面を形成するアミノ酸残基を同定することができる。これらの位置のアミノ酸残基と、その後、関連を調節するように修飾を施すことができる。

他の公知の技術は、本開示の多重特異性抗体の会合にも使用することができる。異なるアミノ酸を含むFc領域含有ポリペプチドは、抗体のH鎖Fc領域の1つに存在するアミノ酸側鎖をより大きな側鎖(ノブ)に置換し、置換することにより、互いに効率的に関連付けることができる。穴内のノブの配置を可能にするために、より小さな側鎖(穴)を有する他のH鎖の対応するFc領域に存在するアミノ酸側鎖(WO1996/027011;リッジウェイ JB et al., タンパク質工学 (1996) 9, 617-621;マーチャント A. M. et al. 自然バイオテクノロジー (1998) 16, 677-681;および US20130336973)。

加えて、他の公知の技術は、本開示の多重特異性抗体の形成にも使用することができる。異なる配列を有するポリペプチドの会合は、抗体のH鎖CH3の一部を対応するIgA由来に変更することによって産生される鎖交換工学ドメインCH3を用いたCH3の相補的会合によって効率的に誘導され得る他のH鎖CH3の相補的な部分に対応するIgA由来の配列を導入する(タンパク質工学設計および選択、23;195-202、2010)。この公知の技術は、目的の多重特異性抗体を効率的に形成するためにも使用することができる。

また、WO 2011/028952、WO2014/018572、およびナットバイオテクノルに記載されているように、抗体CH1とCLとVHとVLの会合を用いた抗体産生技術。2014年2月;32(2):191-8;WO2008/119353およびWO2011/131746に記載されているように、別個に調製されたモノクローナル抗体を組み合わせて使用して二重特異性抗体を製造するための技術(Fab Arm Exchange)。WO2012/058768およびWO2013/063702に記載されている抗体重鎖CH3間の関連を調節するための技術;WO2012/023053に記載されているように、2種類の軽鎖と1種類の重鎖からなる二重特異性抗体を製造するための技術;クリストフら(ネイチャーバイオテクノロジー Vol. 31, p 753-758)2013));このような多重特異性抗体の形成に用いてもよい。

あるいは、目的とする多重特異性抗体を効率的に形成できない場合であっても、本開示の多重特異性抗体は、産生された抗体から目的とする多重特異性抗体を分離精製することによって得ることができる。例えば、アミノ酸置換を変数に導入することにより等電点の差を付与することによりイオン交換クロマトグラフィーによる目的の2種類のホモマー形態とヘテーロメリック抗体の精製を可能にする方法2種類のH鎖の領域が報告されている(WO2007114325)。現在までに、ヘテロメリック抗体を精製する方法として、プロテインAに結合しないマウスIgG2a H鎖と、プロテインAに結合しないラットIgG2b H鎖を含むヘテロジマー抗体を精製する方法が報告されている(WO98050431およびWO95033844)。さらに、ヘテロ二量体抗体は、IGG-Protein A結合部位であるEUナンバリング位置435および436でアミノ酸残基の置換を含むH鎖を用いて、単独で効率的に精製することができ、Tyr、His、またはアミノ酸であるすなわち異なるタンパク質A親和性を生み出すか、または異なるタンパク質A親和性を有するH鎖を使用して、各H鎖とプロテインAとの相互作用を変化させ、次いでプロテインAカラムを使用する。

あるいは、複数の異なるH鎖に対する結合能を提供し得る一般的なL鎖を得ることができ、多重特異性抗体の共通L鎖として使用することができる。多重特異性IgGの効率的な発現は、このような共通のL鎖および複数の異なるH鎖の遺伝子を細胞に導入してIgGを発現させることによって達成することができる(Nature Biotechnology(1998)16,677-681)。異なるH鎖のいずれかに対する強い結合能を示す共通L鎖を選択する方法も、共通H鎖を選択する際に使用することができる(WO 2004/065611)。

さらに、Fc領域C末端不均一性が向上したFc領域を、本開示のFc領域として適宜用いることができる。より具体的には、本開示は、IgG1、IgG2に由来するFc領域を構成する2つのポリペプチドのアミノ酸配列からEU番号供与によって指定された位置446およびリジンを447位でグリシンを削除することによって産生されるFc領域を提供する。IgG3、または IgG4 です。

複数、2種以上など、これらの技術を組み合わせて用いることができる。さらに、これらの技術は、関連する2つのH鎖に適宜かつ別々に適用することができる。さらに、これらの技術は、Fcガンマ受容体への結合活性を低下させた上記Fc領域と組み合わせて使用することができる。さらに、本開示の抗原結合分子は、同じアミノ酸配列を有するように別々に産生される分子であってもよく、上述した改変を施した抗原結合分子に基づいてもよい。

好ましくは、本開示の抗原結合分子は、RNF43結合活性を有する第1の抗原結合ドメイン、およびT細胞受容体複合体結合活性を有する第2の抗原結合ドメインを含んでもよい。実施形態において、T細胞受容体複合体結合活性は、T細胞受容体に対する結合活性である。別の実施形態では、T細胞受容体複合体結合活性は、CD3イプシロン鎖に対する結合活性である。実施形態では、RNF43結合活性は、ヒトRNF43に対する結合活性である。さらなる実施形態では、RNF43結合活性は、真核細胞の表面上のRNF43に対する結合活性である。実施形態では、RNF43結合活性は、真核細胞の表面上のヒトRNF43に対する結合活性である。

本開示の多重特異性抗原結合分子は、強い抗腫瘍活性を有し、細胞細胞傷害性を誘導し、RNF43発現細胞を標的および損傷することができ、したがって、種々の癌の治療および予防を可能にする。さらに、ある実施形態では、本開示のFc領域を構成する多重特異性抗原結合分子は、血液中の長い半減期を有するとともに、癌抗原非依存性の誘導を生じない優れた安全性特性を有するサイトカイン嵐など。これにより、非常に安全で便利な望ましい治療が可能になり、患者の身体的負担を軽減します。

三官能性抗体は、癌抗原に依存しない方法で同時にNK細胞やマクロファージなどの細胞とT細胞との両方に結合し、その結果、細胞上に発現する受容体が架橋され、様々なサイトカインの発現が誘導される。癌抗原に依存しない方法。三官能性抗体の全身投与は、サイトカイン発現の誘導の結果としてサイトカイン嵐様副作用を引き起こすと考えられている。

BiTEはFcガンマ受容体結合部位を持たないため、Nk細胞やマクロファージなどのT細胞やマクロファージに発現する受容体を癌抗原依存的に架橋することはありません。従って、BiTEは癌抗原非依存性サイトカイン誘導を引き起こさないことが実証されている。一方、BiTEはFc領域を持たない改変低分子抗体分子であるため、患者への投与後の血液半減期が、従来治療用として用いられているIgG型抗体よりも短いという欠点がある。抗体。

抗体依存性細胞傷害性(ADCC)
「抗体依存性細胞傷害性」または「ADCC」は、特定の細胞傷害性細胞(例えばNK細胞、好中球、マクロファージ)に存在するFc受容体(FcR)に結合したIgを分泌した細胞傷害性の形態を指し、これらの細胞傷害性エフェクターを可能にする細胞は抗原を有する標的細胞に特異的に結合し、その後サイトトキシンで標的細胞を殺す。 ADCCを媒媒使用するための一次細胞としては、NK細胞は、FcガンマRIIIのみを発現し、一方、単球はFcガンマRI、FcガンマRII、およびFcガンマRIIIを発現する。造血細胞上のFcR発現は、ラヴェッチ及びキネットの464ページの表3に要約されている。免疫第9:457-92 (1991) 目的の分子のADCC活性を評価するために、米国特許第5,500,362号または5,821,337号または米国特許第6,737,056号(プレスタ)に記載されているようなインビトロADCCアッセイを行うことができる。アッセイなどの有用なエフェクター細胞としては、PBMCおよびNK細胞が挙げられる。あるいは、あるいは追加的に、目的の分子のADCC活性は、生体内で、例えば、Clynes et al. PNAS(USA)95:652-656(1998)に開示されるような動物モデルにおいて評価され得る。

補体依存性細胞毒性
「補体依存性細胞傷害性」または「CDC」は、補体の存在下での標的細胞の上昇をいう。古典的な補体経路の活性化は、補体系(C1q)の第1成分を抗体(適切なサブクラスの)に結合させることによって開始され、それらはそのコグネイト抗原に結合する。補体活性化を評価するために、CDCアッセイ、例えば、ガッツァーノ・サントロらに記載されているように、J.イムノール。方法202:163(1996)は、行われ得る。改変されたFc領域アミノ酸配列(変異型Fc領域を有するポリペプチド)およびC1q結合能の増加または減少を有するポリペプチド変異体が記載されており、例えば、米国特許第6,194,551 B1およびWO 1999/51642に記載されている。また、例えば、イドゥソギーらJ.イムノールも参照してください。164: 4178-4184 (2000).

細胞増殖および腫瘍増殖の阻害のためのインビトロおよびインビボアッセイ
特定の実施形態において、本発明の抗原結合分子は、インビトロで細胞増殖または増殖を阻害する能力について試験される。細胞増殖または増殖の阻害のためのアッセイは、当該分野においてよく知られている。細胞増殖のための特定のアッセイは、本明細書に記載される「細胞殺傷」アッセイによって例示され、細胞生存率を測定する。そのようなアッセイは、プロメガ(マディソン、WI)から市販されているCellTiter-GloTM発光細胞生存率アッセイです。そのアッセイは、代謝活性細胞の指標であるATP存在の定量に基づいて培養中の生存細胞の数を決定する。クラウチら (1993) J. 免疫を参照してください。メタ。160:81-88, 米国パット.第6602677。アッセイは96または384ウェルのフォーマットで行われる可能性があり、自動ハイスループットスクリーニング(HTS)に適しています。クリーら(1995)抗癌薬 6:398-404 を参照してください。アッセイ手順は、培養細胞に単一の試薬(CellTiter-Glo(登録商標)試薬)を直接添加することを含む。これは、細胞溶解およびルシフェラーゼ反応によって生成される発光シグナルの生成をもたらす。発光信号は、存在するATPの量に比例し、培養中に存在する生存細胞の数に正比例する。データは、ルミノメーターまたはCCDカメラ撮像装置によって記録することができる。発光出力は相対光単位(RLU)として表されます。

細胞増殖のためのもう一つのアッセイは、ミトコンドリアレダクターゼによるフォルマザンに対する臭化3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムの酸化を測定する比色アッセイである。. CellTiter-GloTMアッセイと同様に、このアッセイは、細胞培養中に存在する代謝活性細胞の数を示す。例えば、モスマン(1983)J.イムノールを参照してください。メタ。65:55-63, そして張ら (2005) がん Res. 65:3877-3882.

一態様において、本開示の抗原結合分子は、インビトロで細胞死を誘導する能力について試験される。細胞死の誘導のためのアッセイは、当該分野においてよく知られている。いくつかの実施形態では、例えば、アッセイ測定、例えば、ヨウ化プロピジウム(PI)の取り込みによって示される膜完全性の喪失、トリパンブルー(ムーアら(1995)サイトテクノロジー、17:1〜11)、または7AADを参照) 例示的なPI取り込みアッセイでは、細胞はダルベッコの修飾イーグル培地(D-MEM)で培養される:ハムのF-12(50:50)は、10%の熱不活性化FBS(ハイクローン)および2 mM L-グルタミンを添加した。したがって、アッセイは、補体および免疫エフェクター細胞の存在しない状態で行われる。細胞は100 x 20 mmの皿の1皿あたり3 x 106の密度で播種され、一晩取付けることを許される。培地を除去し、抗原結合分子または免疫コンジュゲートの種々の濃度を含む新鮮な培地または培地に単独で置換される。細胞は3日間インキュベートされる。治療後、単層をPBSで洗浄し、トリプシン化によって剥離する。その後、細胞を4℃で5分間1200rpmで遠心分離し、ペレットを3mlのコールドCa2+結合バッファー(10 mMヘペス、pH 7.4、140 mM NaCl、2.5 mM CaCl2)に再懸濁し、35 mmストレーナー-キャップ12 x 75 mmチューブ(チューブあたり1ml)に引用した。、治療群あたり3本のチューブ)を細胞塊の除去用に。チューブはPI(10マイクロg/ml)を受け取ります。サンプルは、FACSCANTMフローサイトメーターとFACSCONVERTTMセルクエストソフトウェア(ベクトンディキンソン)を使用して分析されます。 PI取り込みによって決定される細胞死の統計的に有意なレベルを誘導する抗原結合分子が同定される。

一態様において、本開示の抗原結合分子は、インビトロでアポトーシス(プログラムされた細胞死)を誘導する能力について試験される。アポトーシスを誘導する抗原結合分子または免疫コンジュゲートに対する例示的なアッセイは、アネキシン結合アッセイである。例示的なアネキシン結合アッセイでは、細胞は前項で説明したように皿に培養され、播種される。培地を除去し、抗原結合分子または免疫コンジュゲートの0.001〜10マイクロg/mlを含有する新鮮な培地または培地に置き換えられる。3日間のインキュベーション期間の後、単層をPBSで洗浄し、トリプシン化によって剥離する。その後、細胞は遠心分離され、Ca2+結合緩衝液に再懸濁され、前項で説明したようにチューブに引用される。チューブは、その後、標識アネキシン(例えばアネキシンV-FITC)(1マイクロg/ml)を受け取る。サンプルは、FACSCANTMフローサイトメーターとFACSCONVERTTMセルクエストソフトウェア(BDバイオサイエンス)を使用して分析されます。コントロールに対して統計的に有意なレベルのアネキシン結合を誘導する抗原結合分子が同定される。アポトーシスを誘導する抗原結合分子または免疫コンジュゲートに対するもう一つの例示的なアッセイは、ゲノムDNAのインターヌクレオソーム分解を検出するためのヒストンDNA ELISA比色アッセイである。このようなアッセイは、例えば、細胞死検出ELISAキット(ロシュ、パロアルト、CA)を用いて行うことができる。

上記のインビトロアッセイのいずれにおいても使用する細胞は、RNF43を自然に発現する細胞または細胞株、またはRNF43を発現するように設計された細胞または細胞株を含む。このような細胞は、同じ組織起源の正常細胞に対してRNF43を過剰発現する腫瘍細胞を含む。このような細胞はまた、RNF43を通常発現しないがRNF43をコードする核酸でトランスフェクトされた細胞株(腫瘍細胞株を含む)を含む。上記のインビトロアッセイのいずれにおいても使用するために本明細書に提供される例示的な細胞株は、SW48、LS1034、NUGC4およびBa/F3 E12を含む。

一態様において、本開示の抗原結合分子は、生体内での細胞増殖または増殖を阻害する能力について試験される。特定の実施形態において、本開示の抗原結合分子は、生体内での腫瘍増殖を阻害する能力について試験される。異種移植片モデルなどの生体内モデルシステムは、このような試験に使用することができる。例示的な異種移植片系では、ヒト腫瘍細胞は、適宜免疫不全の非ヒト動物、例えば、アチミック「ヌード」マウスに導入される。本開示の抗原結合分子は、動物に投与される。腫瘍増殖を阻害または減少させる抗原結合分子の能力が測定される。上記異種移植系の特定の実施形態において、ヒト腫瘍細胞は、ヒト患者由来の腫瘍細胞である。このような異種移植片モデルは、オンコテストGmbH(ドイツ・フリーベルク)から市販されている。特定の実施形態において、ヒト腫瘍細胞は、SW48、LS1034、またはNUGC4などのヒト腫瘍細胞株からの細胞である。特定の実施形態において、ヒト腫瘍細胞は、皮下注射または乳腺脂肪パッドなどの適切な部位への移植によって、適切に免疫不全の非ヒト動物に導入される。

イムノコンジュゲート
本明細書開示の抗原結合分子を含む免疫コンジュゲートは、化学療法剤または薬物などの1つ以上の細胞傷害性薬剤に共役し、増殖抑制剤、毒素(例えば、タンパク質毒素、酵素活性細菌、真菌、植物、または動物起源、またはその断片)、または放射性同位体の毒素も提供される。

一実施形態において、免疫コンジュゲートは、抗体が1つ以上の薬物に共役する抗体薬物コンジュゲート(ADC)であり、マイタンシノイドを含むがこれらに限定されない(米国特許第5,208,020号、5,416,064号および欧州特許EP 0 425 235 B1を参照)。モノメチルウリスタチン薬物部分DEおよびDF(MMAEおよびMMAF)のようなオーリスタチン(米国特許第5,635,483および5,780,588、および7,498,298を参照)。ドラスタチン;カリケアミシンまたはその誘導体(米国特許第5,712,374号、5,714,586号、5,739,116号、5,767,285件、5,770,701社、5,770,710,5,773,001号、5,87777777号を参照)ヒンマンら, がん Res. 53:3336-3342 (1993);そしてLode et al., がん Res. 58:2925-2928 (1998));ダウノマイシンやドキソルビシンなどのアントラクライクリン(Kratzら、現在のMed. Chem. 13:477-523 (2006) を参照)ジェフリーら, バイオオーガニック&メッドケム手紙 16:358-362 (2006);トルゴフら、バイオコンジケム 16:717-721 (2005);Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Usa 97:829-834 (2000);ドゥボウチクら、バイオオーグ。& メッドケムレター 12:1529-1532 (2002);キングら, J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002);米国特許第6,630,579号);メトトレキサート;ビンデジン;ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、オルタタキセルなどのタキサン;トリコテセン;CC1065を参照してください。

別の実施形態では、免疫コンジュゲートは、酵素活性毒素またはその断片に結合した本開示の抗原結合分子を含むが、ジフテリアA鎖に限定されないが、非結合活性断片ジフテリア毒素、エキソトキシンA鎖(緑膿菌由来)、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデッシンA鎖、αサルシン、アロイトフォルジタンパク質、ダイアンタンパク質、フィトラッカアメリカーナタンパク質(PAPI、PAPII、PAP-S)、ママルディカ・カランティ阻害剤としては、クルシン、クロチン、サポナリア・オフィシナリス阻害剤、ジェロニン、ミトゲルリン、レタソシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテセンスが含まれる。

別の実施形態では、免疫コンジュゲートは、放射性原子に共役して放射性原子に結合した本開示の抗原結合分子を含み、放射性コンジュゲートを形成する。ラジオコンジュゲートの製造には様々な放射性同位体が用意されています。例としては、211At、131I、125I、90Y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32P、212PbおよびLuの放射性同位体が挙げられる。ラジオコンジュゲートを検出に使用する場合、例えばTc-99mまたは123Iのシンチグラフィー研究用の放射性原子、または核磁気共鳴(NMR)イメージング用のスピンラベル(磁気共鳴画像、MRIとも呼ばれる)、ヨウ素-123など再び、ヨウ素-131、インジウム-111、フッ素-19、炭素-13、窒素-15、酸素-17、ガドリニウム、マンガンまたは鉄。

本開示および細胞傷害性薬剤の抗原結合分子のコンジュゲートは、N-コハク酸ミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオン酸(SPDP)、コハク酸ミジル-4-(N-マレミドメチル)などの様々な二官能性タンパク質結合剤を使用して作製され得る。シクロヘキサン-1-カルボキシレート(SMCC)、イミノチオラン(IT)、イミドースターの二官能誘導体(ジメチルアジピミデートHClなど)、活性エステル(ジシチニミジル亜硫酸塩など)、アルデヒド(グルタルアルデヒドなど)、ビスアジド化合物(ビス(ビスなど)p-アジドベンゾイル)ヘキサネジアミン)、ビスジアゾニウム誘導体(ビス(p-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミンなど)、ジイソシアネート(トルエン2,6-ジイソシアネートなど)、ビス活性フッ素化合物(1,5-ジフルオロ-2,4-ジフルオロゲンなど)が挙げられる。例えば、リシン免疫毒は、ビテッタら、サイエンス238:1098(1987)に記載されているように調製することができる。炭素-14標識1-イソチオシアトベンジル-3-メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸(MX-DTPA)は、抗体に放射性核種を結合するための例示的なキレート剤である。 WO94/11026を参照してください。リンカーは、細胞内の細胞傷害性薬物の放出を促進する「クリーバ可能リンカー」であってもよい。例えば、酸不安定リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光ラビレスリンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィド含有リンカー(Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992);米国特許第5,208,020号)を用いてもよい。

本明細書では、イムヌオコンジュゲートまたはADCは明示的に熟考するが、BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、スルフォEMCSを含むがこれらに限定されないクロスリンカー試薬で調製されたそのようなコンジュゲートに限定されない。市販されているスルホ-GMBS、スルホMBS、スルホMBS、スルホ-シアB、スルホ-SMCC、スルホ-SMPB、およびSVSB(コハクシニミジル-(4-ビニルスルホン)安息香酸塩)は市販されている(例えば、ピアースバイオテクノロジー社製、ロック、イル、米国から)

T細胞依存性細胞傷害性(TDCC)
好ましくは、本開示の抗原結合分子は、細胞細胞傷害性("細胞傷害性とも呼ばれる)を有し得る。実施形態において、細胞細胞傷害性は、T細胞依存性細胞傷害性(TDCC)である。別の実施形態では、細胞傷害性は、その表面にRNF43を発現する細胞に対する細胞傷害性である。RNF43発現細胞は癌細胞であってもよい。

好ましい態様において、本開示の抗体(または抗原結合分子)は、細胞傷害性(または細胞細胞傷害性)を有し、または好ましくは癌細胞などのRNF43発現細胞に対するT細胞依存性細胞傷害性(TDCC)を有する。RNF43は、このような細胞の表面に発現してもよい。本開示の抗体(または抗原結合分子)の細胞傷害性またはTDCCは、当該分野で公知の任意の適切な方法によって評価することができる。例えば、実施例6.2.2で説明する方法である。TDCCの測定に使用できます。この場合、細胞傷害活性は、本開示の抗体(または抗原結合分子)による細胞増殖抑制の速度によって評価される。細胞増殖は、xCELLigenceリアルタイムセルアナライザなどの適切な分析装置を用いて測定される。癌細胞は標的細胞として使用され、適切な細胞濃度(例えば、約104細胞/ウェル)でマルチウェルプレート上に播種される。翌日、適切な濃度で調製した試験抗体(例えば、0.01〜10nM)をプレートに添加する。反応の15分後、T細胞(PBMCなど)を含む溶液を、10の比率などの適切なエフェクター(PBMC)/標的(癌細胞)比でそこに添加する。反応は炭酸ガスで行う。T細胞の添加後、細胞増殖抑制率(CGI)(%)CGIレート(%)=(A-B)×100/(A-1)、Aは抗体(または抗原結合分子)を持たないウェルの平均細胞指数値を表し、すなわち、標的細胞とT細胞のみを含み、Bは平均細胞指数値を表す。抗体(または抗原結合分子)と井戸。計算に用いられる細胞インデックス値は、正規化された値、すなわち、抗体添加の直前の時点における細胞インデックス値が1として定義される。抗体(または抗原結合分子)のCGI率が高い場合、すなわち、有意に肯定的な値を有し、抗体(または抗原結合分子)がTDCC活性を有し、本開示においてより好ましいといえる。

がん
用語"cancer"および"癌"は、典型的には、無秩序な細胞増殖/増殖によって特徴付される哺乳動物の生理学的状態を指すまたは記述する。癌の例としては、限定されないが、癌、リンパ腫(例えば、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫)、芽腫、肉腫、および白血病が挙げられる。このような癌のより具体的な例としては、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹蓋癌、肝細胞癌、消化管癌、膵臓癌,グリオーマ,子宮頸癌,卵巣癌,肝臓癌,膀胱癌,肝腫,乳癌,大腸癌,大腸癌,子宮内膜癌,唾液腺癌,腎臓癌,肝臓癌,前立腺癌,外部癌、甲状腺癌、肝癌、白血病および他のリンパ増殖性障害、および頭頸部癌の様々なタイプ。

腫瘍
用語"腫瘍"は、悪性または良性、およびすべての前癌および癌性細胞および組織であるかどうか、すべての腫瘍性細胞の増殖および増殖を指す。用語 "がん,"""細胞増殖性障害," "増殖性障害"と"腫瘍" という用語は、本明細書で参照されるように相互に排他的ではありません。

大腸腫瘍
用語"大腸腫瘍"または"大腸癌"は、結腸(直腸から直腸への大腸)および直腸を含む大腸の任意の腫瘍または癌を指し、例えば、腺癌およびあまり流行しない形態を含む。リンパ腫および扁平上皮癌。

胃腫瘍
"胃腫瘍"、または "胃癌"、または"胃腫瘍"、または"胃癌"という用語は、例えば、腺癌(びまん性型および腸型など)を含む胃の腫瘍または癌を指し、リンパ腫のようなあまり流行していない形態、平筋肉腫、扁平上皮癌。

医薬製剤
用語"医薬製剤"は、その中に含まれる有効成分の生物学的活性を有効にし、許容できない毒性を有する追加成分を含み、そのような形態の調製物を指す。製剤が投与される対象となる。

薬学的に許容される担体
"薬学的に許容される担体"は、被験者に対して無毒である有効成分以外の医薬製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体は、これらに限定されないが、緩衝液、賦形剤、安定剤、または防腐剤を含む。

治療
本明細書で使用される場合、"治療"(および"treat"や"治療"のような文法的なバリエーション)は、治療される個人の自然な経過を変えようとする臨床介入を指し、予防または間に行うことができる臨床病理学の経過。治療の望ましい効果は、限定されないが、疾患の発生または再発を防止し、症状の緩和、疾患の直接的または間接的な病理学的結果の減少、転移の予防、減少を含む。疾患の進行率、疾患状態の改善または緩和、および寛解または予後の改善。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、疾患の発症を遅らせたり、疾患の進行を遅らせたりするために使用される。

一態様において、開示は、部分的には、RNF43結合活性を有する第1の抗原結合ドメインを含む抗原結合分子に基づき、その使用を行う。本発明の抗原結合分子および抗体は、例えば、腫瘍、特に大腸腫瘍および胃腫瘍の診断または治療に有用である。

医薬組成物
本開示の医薬組成物は、細胞細胞傷害性を誘導する治療薬、細胞増殖抑制剤、または本開示の抗癌剤を、異なるタイプの抗原結合で製剤化してもよい。必要に応じて分子。例えば、抗原を発現する細胞に対する細胞傷害作用は、本開示の複数の抗原結合分子のカクテルによって増強され得る。

必要に応じて、本開示の抗原結合分子をマイクロカプセル(ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチン、ポリ[メチルメタクリレートから作られたマイクロカプセル]等)に封入し、コロイド状薬物の成分に作製することができる送達システム(リポソーム、アルブミン微小球、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、ナノカプセル)(例えば、「レミントンの薬学第16版」、オスロ編(1980)を参照)。また、持続放出剤として薬剤を調製する方法が知られており、これらを本開示の抗原結合分子に適用することができる(J. Biomed.母校。Re. (1981) 15, 267-277;ケムテック(1982) 12, 98-105;米国特許第3773719号;欧州特許出願(EP)第1号EP58481 および EP133988;生体高分子 (1983) 22, 547-556).

医薬組成物は、細胞増殖抑制剤、または本開示の抗癌剤、患者に経口的または非経口的に投与され得る。ペアレンタル投与が好ましい。具体的には、このような投与方法としては、注射、鼻投与、経肺投与、および経皮投与が含まれる。注射としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、および皮下注射が含まれる。例えば、医薬組成物は、細胞細胞傷害性を誘導するための治療薬、細胞増殖抑制剤、または本開示の抗癌剤を注射によって局所的または全身的に投与することができる。さらに、患者の年齢および症状に応じて適切な投与方法を選択することができる。投与用量は、例えば、投与毎に体重の0.0001mgから1kg当たり1,000mgの範囲から選択することができる。あるいは、用量は、例えば、患者当たり0.001mg/bodyの範囲から100,000mg/体まで選択することができる。しかしながら、本開示の医薬組成物の用量は、これらの用量に限定されない。

本開示の医薬組成物は、従来の方法(例えば、レミントンの薬学、最新版、マーク出版社、イーストン、米国)に従って処方することができ、また、薬学的に含んでいてもよい受け入れ可能なキャリアおよび添加剤。例としては、これらに限定されないが、界面活性剤、賦形剤、着色剤、香味剤、防腐剤、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張剤、結合剤、崩壊剤、潤滑剤、流動性促進剤、およびコリジェントが挙げられる。、および他の一般的に使用されるキャリアが好適に使用することができる。担体の具体例としては、光無水ケイ酸、ラクトース、結晶セルロース、マンニトール、澱粉、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノ酢酸、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖トリグリセリド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、サッカロース、カルボキシメチルセルロース、トウモロコシ澱粉、無機塩などが挙げられる。

好ましくは、本開示の医薬組成物は、本発明の抗原結合分子を含む。実施形態において、組成物は、細胞細胞傷害性を誘導するために使用するための医薬組成物である。別の実施形態では、組成物は、癌の治療または予防に使用するための医薬組成物である。好ましくは、癌は大腸癌または胃癌である。本開示の医薬組成物は、癌の治療または予防に用いることができる。従って、本開示は癌を治療または予防するための方法を提供し、本開示の抗原結合分子が、その必要とする患者に投与されるものである。

本開示はまた、RNF43を発現する細胞を損傷する方法、またはRNF43に結合する本開示の抗原結合分子とRNF43を発現する細胞と接触させることによって細胞増殖を抑制するための方法も提供する。RNF43に結合するモノクローナル抗体は、本開示の抗原結合分子として上述しており、これは細胞細胞傷害性を誘導する治療薬に含まれる、細胞増殖抑制剤、及び抗癌剤である開示の提示。本開示の抗原結合分子が結合する細胞は、RNF43を発現する限り、特に限定されない。具体的には、本開示において、好ましい癌抗原発現細胞としては、卵巣癌細胞、前立腺癌細胞、乳癌細胞、子宮癌細胞、肝臓癌細胞、肺癌細胞、膵臓癌細胞、胃癌細胞、尿膀胱癌細胞、および大腸癌細胞。

本開示において、"contact" は、例えば、インビトロで培養されたRNF43を発現する細胞の培養媒体に本開示の抗原結合分子を添加することによって行うことができる。この場合、添加する抗原結合分子は、凍結乾燥等により調製した溶液や固体などの適切な形態で用いることができる。本開示の抗原結合分子を水溶液として添加する場合、溶液は、抗原結合分子を単独で含む純粋な水溶液であってもよいし、例えば、上述の界面活性剤を含む溶液であってもよい。賦形剤、着色剤、香味剤、防腐剤、安定剤、緩衝剤、サスペンド剤、アイソトネード剤、バインダー、崩壊剤、潤滑剤、流動性促進剤、およびコリジェント。添加濃度は特に限定されない。しかしながら、培養培地中の最終濃度は、好ましくは1pg/ml〜1g/mlの範囲であり、より好ましくは1ng/ml〜1mg/mlであり、さらに好ましくは1マイクロg/ml〜1mg/mlである。

本開示の別の実施形態では、"contact" は、生体内でRNF43発現細胞を移植した非ヒト動物、またはRNF43を内因的に発現する癌細胞を有する動物に投与することによって行うこともできる。投与方法は、経口または非経口であってもよい。非経口投与が特に好ましい。具体的には、非経口投与方法は、注射、鼻投与、肺投与、および経皮投与を含む。注射としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、および皮下注射が含まれる。例えば、医薬組成物は、細胞細胞傷害性を誘導するための治療薬、細胞増殖抑制剤、または本開示の抗癌剤を注射によって局所的または全身的に投与することができる。さらに、動物対象の年齢および症状に応じて適切な投与方法を選択することができる。抗原結合分子を水溶液として投与する場合、溶液は、抗原結合分子単独または溶液を含む純粋な水溶液であってもよく、例えば、上述の界面活性剤、賦形剤、着色剤,香味剤,防腐剤,安定剤,緩衝剤,サスペンド剤,アイソトネー化剤,結合剤,崩壊剤,潤滑剤,流動性促進剤,およびコリジェントが挙げられる。投与用量は、例えば、投与毎に体重のkg当たり0.0001〜1,000mgの範囲から選択することができる。あるいは、用量は、例えば、各患者に対して0.001〜100,000mg/bodyの範囲から選択することができる。しかしながら、本開示の抗原結合分子の用量は、これらの例に限定されない。

以下に説明する方法は、抗原結合ドメインが形成するRNF43発現細胞と本開示の抗原結合分子と接触させることによって生じる細胞細胞傷害性を評価または決定する方法として好ましく用いられる。本開示の抗原結合分子は結合する。
細胞傷害活性がT細胞依存性である場合には、インビトロで細胞傷害活性を評価または決定する方法としては、細胞傷害性T細胞等の活性を決定する方法が挙げられる。本開示の多重特異性抗原結合分子がT細胞媒介細胞傷害性を誘導する活性を有するかどうかは、公知の方法によって決定することができる(例えば、免疫学における現在のプロトコル、第7章参照)。ヒトにおける免疫学的研究, 編集者, ジョン・E, コリガンら, ジョン・ワイリー・アンド・サンズ, (1993).細胞傷害性アッセイにおいて、抗原結合ドメインがRNF43とは異なる抗原に結合し、細胞内で発現していない多重特異性抗原結合分子が対照多重特異性抗原結合分子として使用される。対照多重特異性抗原結合分子は、同様にアッセイされる。そして、この開示の多重特異性抗原結合分子が対照多重特異性抗原結合分子よりも強い細胞傷害活性を示すかどうかを試験することによって活性を評価する。

一方、インビボ細胞傷害活性は、例えば以下の手順によって評価または決定される。本開示の多重特異性抗原結合分子を形成する抗原結合ドメインが結合する抗原を発現する細胞は、非ヒト動物被験者に皮内または皮下に移植される。次いで、移植の日またはその後から、試験多重特異性抗原結合分子が毎日または数日間隔で静脈または腹腔に投与される。腫瘍の大きさは時間の経過とともに測定される。腫瘍サイズの変化の違いは、細胞傷害活性として定義することができる。in vitroアッセイと同様に、対照多重特異性抗原結合分子が投与される。本開示の多重特異性抗原結合分子は、腫瘍サイズがグループよりも本開示の多重特異性抗原結合分子で投与された群において小さい場合に細胞傷害活性を有すると判断することができる対照多重特異性抗原結合分子を用いた。

細胞への同位体標識チミジン取り込みのMTT法および測定は、好ましくは、抗原を発現する細胞の増殖を抑制するために本開示の抗原結合分子との接触の効果を評価または決定するために使用される。抗原結合分子を形成する抗原結合ドメインが結合する。一方、生体内細胞傷害活性を評価または決定するために上述したのと同じ方法を、生体内での細胞増殖を抑制する活性を評価または決定するために好ましく用いることができる。

本開示はまた、本開示の方法で使用するためのキットを提供し、本開示の抗原結合分子または本開示の方法によって産生される抗原結合分子を含む。キットは、薬学的に許容される追加のキャリアまたは媒体、またはキットの使用方法を説明する取扱説明書などと一緒に梱包することができます。

診断と検出のための方法と組成
特定の実施形態において、本明細書に提供される抗原結合分子のいずれも、生体試料中のRNF43の存在を検出するのに有用である。本明細書で使用される用語「検出」は、定量的または定性的検出を包含する。特定の実施形態において、生体試料は、癌組織、特に大腸癌組織または胃癌組織などの細胞または組織を含む。

一実施形態では、診断または検出の方法で使用するための本開示の抗原結合分子が提供される。さらなる態様において、生体試料中のRNF43の存在を検出する方法が提供される。特定の実施形態において、この方法は、本開示の抗原結合分子の結合に許容される条件下で本明細書に記載される本開示の抗原結合分子と生物学的試料を接触させることを含む。RNF43は、本開示の抗原結合分子とRNF43との間に複合体が形成されているかどうかを検出する。このような方法は、インビトロまたはインビボ法であってもよい。一実施形態では、本開示の抗原結合分子は、本開示の抗原結合分子を用いた治療に適格な被検対象を選択するために使用され、例えばRNF43が患者の選択のためのバイオマーカーである場合に使用される。

本開示の抗原結合分子を用いて診断され得る例示的障害としては、癌、特に大腸癌または胃癌が挙げられる。

特定の実施形態において、本開示の標識抗原結合分子が提供される。ラベルには、直接検出されるラベルまたは部分(蛍光、発色団、電子密度、化学発光、放射性標識など)、ならびに間接的に検出される酵素やリガンドなどの部分が含まれますが、例えば、酵素反応または分子相互作用を介して。例示的なラベルは、これらに限定されないが、放射性同位元素32P、14C、125I、3H、131I、希土類キヤメまたはフルオレセインおよびその誘導体などのフルオロフォア、ロダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルセリフェラーゼ、例えば、ホタル、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ(米国特許第4,737,456号)、ルシフェリン、2,3-ジヒドロフタラジジンゾン、ワサビペルオキシダーゼ(HRP)、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾジメ、スカシミド、オキシゼ、ガラクトースオキシダーゼ、およびグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、ウリカゼおよびキサンチンオキシダーゼなどのヘテロ環状オキシダーゼ、HRP、ラクトペルオキシダーゼ、またはマイクロペルオキシダーゼなどの色素前駆体を酸化するために過酸化水素を採用する酵素と結合したもの、ビオチン/アビジン、スピンラベル、バクテリオファージ標識、安定フリーラジカル等が挙げられる。

加えて、本開示は、本開示の方法で使用するための本開示の方法によって産生される本開示または抗原結合分子の抗原結合分子に関する。

本明細書に引用されるすべての文書は、参照により本明細書に組み込まれる。

本発明の方法及び組成物の例を以下に示す。上記で提供される一般的な説明を考えると、種々の他の実施形態が実施され得ることがわかった。

実施例1. 腫瘍/正常組織におけるRNF43の発現
図1は、TCGA研究ネットワーク:http://cancergenome.nih.gov/によって生成されたデータに基づくRNF43 mRNA発現プロファイルを示す。TCGAからダウンロードしたデータを用いて分析した正常組織および腫瘍組織におけるヒトRNF43 mRNA発現プロファイルを箱ひげプロットとして示す。データは、最小値、最大値、および 3 つの四分位数で構成されます。ボックスには四分位範囲が表示されます。ボックス内の線は中央値を示します。ボックスの外側に伸びる線と点は、最小値と最大値を示します。その結果、RNF43のmRNA発現が、特に消化管腫瘍組織において複数の癌タイプにおいてアップレギュレーションされることを示した。

実施例2. ヒトRNF43細胞外ドメイン(ECD)の発現と精製
C末端にフラグタグを付けたヒトRNF43 ECDのアミノ酸1〜190を含む合成ポリペプチド(SEQ ID NO:46)をFreeStyle293F細胞株(サーモフィッシャー)を用いて一過性に発現させた。合成されたポリペプチドを発現する条件付き媒体を、抗フラグM2親和性樹脂(シグマ)を詰めたカラムに塗布し、フラグペプチド(シグマ)で溶出した。合成されたポリペプチドを含む画分を回収し、その後、1x D-PBSで平衡化したSuperdex 200ゲル濾過カラム(GEヘルスケア)を行った。合成されたポリペプチドを含む画分をプールし、-80℃(C)で保存した。
C末端に融合したFc領域(RNF43-Fc、SEQ ID NO:47)に融合したヒトRNF43ECDは、FreeStyle293F細胞株(サーモフィッシャー)を用いて一過性に発現した。RNF43-Fcを発現する条件付き媒体は、HiTrap MabSelect SuReカラム(GEヘルスケア)を用いて精製した。RNF43-Fcを含む画分を回収し、その後、1x D-PBSを平衡化したSuperdex 200ゲル濾過カラム(GEヘルスケア)を行った。その後、RNF43-Fcを含む画分をプールし、-80℃で保存した。

実施例3. 切り捨てられたヒトRNF43を発現するBa/F3細胞株の確立RNF43
C末端FLAGタグを有する切り捨てられたヒトRNF43からなる配列番号48に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを、pCXND3発現ベクター(WO/2008/156083)に挿入した。

線形化されたヒトRNF43-pCXND3の400ngをエレクトロポレーションによりマウスIL-3依存型プロB細胞由来細胞株Ba/F3に導入した(LONZA、4D-NucleofectorX)。

導入後、遺伝性を添加し、細胞を培養し、遺伝性に耐性のある細胞株を得た。トランスフェクトされた細胞株を希釈を制限して96ウェルプレートにめっきし、膨張した。確立された細胞株は、Ba/F3 E12(切り捨てられたヒトRNF43)と命名された。

実施例4: 抗RNF43単一特異性抗体の生成とスクリーニング
抗RNF43単一特異性抗体を調製し、選択し、以下のようにアッセイした。

3匹のNZWウサギを、製造業者の指示に従って、ヘリオス遺伝子ガンシステム(バイオ・ラッド)によってRNF43-pCXND3プラスミドコーティング金粒子(合計40発あたり1マイクロg DNA)で免疫した(Yuxin Chen et al. J. Virol)。(2013) 87(18):10232).さらに、皮内エレクトロポレーション(脚と肩の合計4部位に対するサイトあたり100マイクロgDNA)と筋肉内エレクトロポレーション(2本足で合計4部位につき200マイクロgDNA)とRNF43-pCXND3プラスミドの組み合わせも行った。シクシア・ワンらワクチン (2008) 26:2100-2110;S.J.カプテインら J. ファーマコールトキソール。方法 (2008) 58:27-31;B.M. Mediら(2005) 294:53-63.免疫(ヘリオス遺伝子銃系と皮内エレクトロポレーションおよび筋肉内エレクトロポレーションと共に)を週6回繰り返し、続いて血液および脾臓の採取を行った。B細胞選択では、抗原結合B細胞を採取し、抗原結合のないIgG陽性B細胞を対照として採取した。ビオチン化ヒトRNF43 ECDを調製し、抗原陽性B細胞染色に使用した。B細胞を細胞選別器を用いて選別し、次いでWO2016098356A1に記載の手順に従ってめっき培養した。培養後、さらなる分析のためにB細胞培養上清を回収し、B細胞ペレットを凍結保存した。

ヒトRNF43 ECDへの特異的結合は、B細胞培養上清を用いてELISAによって評価された。
細胞表面に発現するヒトRNF43に特異的な結合の特性評価は、選択されたB細胞上清を用いたフローサイトメトリーにより行った。RNF43を発現するBa/F3細胞(Ba/F3 E12、実施例3で確立)をこのアッセイに用いた。

48 B細胞株は、Ba/F3 E12細胞株に結合するRNF43特異的結合剤として選択され、RNN0794-0841として指定された。選択された48ラインのRNAは、ZR-96クイックRNAキットを使用して凍結保存された細胞ペレットから精製された(ZYMO RESEARCH, Cat No.R1053)。選択されたラインにおける抗体コード重鎖可変領域を逆転写PCRによって増幅し、BS03aをコードするDNAと再結合した重鎖定常領域(配列番号49)。DNAコード抗体をコードする軽鎖可変領域も逆転写PCRによって増幅され、hk0MC軽鎖定常領域をコードするDNAと再結合した(配列番号:50)。クローン抗体をFreeStyleTM 293-F細胞(Invitrogen)で発現し、培養上清から精製した。さらに評価するために1つのクローン(RNN0802)を選択した。RNN0802 の VH、VL、HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2、および HVR-L3 のシーケンス ID 番号を表 2 に示します。

実施例5. 膜性RNF43に対する抗RNF43単一特異性抗体の結合解析
Ba/F3 E12トランスフェクタントへの単一特異的RNN0802の結合は、フローサイトメトリー分析によって決定された。

単一特異的RNN0802(二価IgG)を、氷上で30分間2.5マイクロg/mlの最終抗体濃度でE12細胞株でインキュベートし、FACS緩衝液(HEPES-BSA)で洗浄した。ヤギF(ab')2抗ヒトIgG、マウス広告PE(サザンバイオテック、Cat. 2043-09)を30分間氷上に添加してインキュベートし、続いてFACS緩衝液で洗浄した。データ取得はBD LSRForテッサ(ベクトン・ディキンソン)で行い、続いてFlowJoソフトウェア(ツリースター)を用いた分析を行いました。

図2は、実施例4で産生される単一特異的RNN0802が、目的の抗原であるRNF43に結合することを示す。平均蛍光強度(MFI)が得られ、ケイホールリンペットヘモシアニン(KLH)抗体をアイソタイプ制御として用いた。データは MFI 値として表されます。

実施例6. 抗RNF43/CD3二重特異性抗体の機能評価
実施例6.1. 抗RNF43/CD3二重特異性抗体の生成
表2に記載の抗RNF43単一特異性抗体および抗CD3抗体(SEQ ID NO:51および52)は、他の場所に公開された従来の方法を用いて抗RNF43/CD3二重特異性抗体を生成するために使用される。抗RNF43/CD3二重特異性抗体におけるRNF43結合アームのCDR配列を表3に示す。

二重特異性抗体には、Fcガンマ受容体に対する減衰親和性を有するサイレントFcが含まれている。

実施例6.2抗RNF43/CD3二重特異性抗体におけるRNF43結合アームのRNF43結合アームのRNF43結合アームの親和性測定
pH 7.4におけるヒトRNF43に対する抗RNF43/CD3二重特異性抗体におけるRNF43結合アームの親和性は、ビアコアT200機器(GEヘルスケア)を用いて25℃で決定される。アンチヒトFc(GEヘルスケア)は、アミンカップリングキット(GEヘルスケア)を使用してCM4センサーチップのすべてのフローセルに固定化されます。抗体およびアナライトは、20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05% Tween 20、0.005% NaN3を含むpH 7.4でACESで調製される。各抗体は、抗ヒトFcによってセンサ表面に捕捉され、抗体捕捉レベルは312共鳴ユニット(RU)を目的とする。組換えヒトRNF43は、4倍のシリアル希釈によって調製された200nM、50nM、および12.5 nMで注入され、続いて解離する。センサー表面は3M MgCl2で各サイクルを再生します。

実施例6.3癌細胞表面におけるRNF43の絶対定量
培養癌細胞株(SW48、LS1034、LS513)の細胞表面におけるRNF43の抗体結合能(ABC)はATCCから購入した。PC-10はIBLから購入し、NUGC4はHSRRBから購入した)、フローサイトメトリーを用いてQIFIKIT(DAKO)によって評価した。

癌細胞(1x105〜5x105細胞)を0.5%BSA補助セルウォッシュ(BDバイオサイエンス)(以下FACS/PBS)で洗浄した。二価抗RNF43抗体(VH SEQ ID番号:53、VL SEQ ID番号:54、マウスFc SEQ ID NoO:55および56)または対照抗体を50マイクロL溶液中に20マイクロg/mLの最終濃度で添加した。彼らは30〜60分間4度で立たせた。細胞をFACS/PBSで洗浄した後、FITC標識ヤギ抗マウスIgG抗体をFACS/PBSで50倍希釈し、細胞に添加した。彼らは30〜60分間4度で立たせた。細胞をFACS/PBSで洗浄し、フローサイトメトリーにより分析した。

癌細胞表面上のRNF43のABCをQIFI KITを用いて算出した(図3)。

実施例6.4抗RNF43/CD3二重特異性抗体の機能特性評価
実施例6.4.1ヒト末梢血単眼細胞の調製(PBMC溶液)
一次ヒトPBMC溶液は、健康なボランティアから新たに分離されるか、または示された冷凍形態(STEMCELL)で購入される。

新鮮なPBMC溶液の場合、1,000単位/mLヘパリン溶液(注射用ノボヘパリン、5,000単位、ノボノルディスク)の100マイクロLをプリロードしたシリンジを使用して、各健康なボランティア(個々の成人)から50mLの末梢血が採取されます。この末梢血はPBS(-)で2倍に希釈され、4つのアリコートに分割され、リンパ球分離のためにロイコセップチューブに添加される(Cat.フィコル・パックプラスの15 mLを搭載し、事前に遠心分離を施したNo.227290、グライナーバイオワン)。この分離管は遠心分離され(室温で10分間2,150rpmで)、単核細胞分率を集める。モモ核細胞画分の細胞は、10%FBS(SIGMA)を含むダルベッコの修飾イーグル培地で一度洗浄され、10%FBS/D-MEMを用いて4 x 106細胞/mLの細胞密度を有するように調製される。この細胞懸濁液は、以下の実験においてヒトPBMC溶液として用いられる。

凍結したPBMCの場合、凍結した細胞を解凍するために37℃の水浴に凍結した。次いで、細胞を標的細胞を培養するための9mLの媒体を含む15mLのハヤブサチューブに分配する。その後、細胞懸濁液を室温で5分間1,200rpmで遠心分離を行う。上清は穏やかに吸引され、新鮮な温められた媒体が再懸濁のために加えられる。細胞懸濁液は、以下の実験においてヒトPBMC溶液として用いられる。

実施例6.4.2抗RNF43/CD3二重特異性抗体のT細胞依存性細胞傷害性の測定
細胞傷害活性は、xCELLigenceリアルタイム細胞アナライザ(Roche診断)を用いた細胞増殖抑制の速度によって評価される。NUGC-4ヒト癌細胞株は標的細胞として使用される。対象細胞を皿から切り離し、細胞を1x104細胞/ウェルに調整することにより、100マイクロL/ウェルのアリコート中のEプレート96(Roche診断)にめっきされ、xCELLigenceリアルタイムセルアナライザを使用して細胞増殖の測定を開始します。24時間後、プレートを除去し、各濃度(0.016、0.08、0.4、2または10nM)で調製した各抗体の50マイクロLをプレートに添加する。室温で15分間反応した後、実施例6.4.1で調製した新鮮なヒトPBMC溶液の50マイクロLをエフェクタ(PBMC)/ターゲット(NUGC-4)比10(すなわち、1x105細胞/ウェル)で添加し、xCELLigenceを用いて細胞増殖の測定を再開する。リアルタイムセルアナライザ。反応は、PBMCの添加後72時間で5%二酸化炭素ガスの条件下で行われ、細胞増殖抑制率(CGI)(%)は、以下の式を使用して決定されます。計算に用いたxCELLigenceリアルタイムセルアナライザから得られたセルインデックス値は、抗体添加直前の時点におけるセルインデックス値が1として定義される正規化値である。

細胞増殖抑制率(%) = (A-B) x 100/ (A-1)
Aは抗体を添加しないウェル内の平均細胞インデックス値(標的細胞とヒトPBMCのみを含む)を表し、Bは標的ウェルの平均細胞インデックス値を表します。試験は三重で行われる。

実施例7. インビボ薬効の評価
上述の抗体は、腫瘍耐性モデルを用いて生体内有効性について評価される。

インビボ薬効の評価は、抗ヒトRNF43/CD3二重特異性抗体を用いて行われる。細胞株をNOD scidマウスに移植し、腫瘍形成が確認されたNOD scidマウスは、ヒトPBMCのインビトロ培養により増殖したT細胞の移植を受ける。マウス(T細胞注入モデルと呼ばれる)は、抗ヒトRNF43/CD3二重特異性抗体の投与によって治療される。

より具体的には、SCC152(ATCC)移植T細胞注入モデルを用いた抗ヒトRNF43/CD3二重特異性抗体の薬効試験において、以下の試験が行われる。T細胞は、購入したPBMCおよびT細胞活性化/拡張キット/ヒト(MACSミルテニイバイオテック)を用いて広範囲に培養される。ヒト癌細胞株SCC152(1x107細胞)をMatrigelTM基底膜マトリックス(BD)と混合し、NODサイッドマウス(CLEAジャパン、メス、6W〜8W)の鼠径皮下領域に移植した。移植の日は 0 日目と定義されます。移植前日(0日目)に、抗アジア-GM1抗体(ワコピュアケミカルズ)をマウスに0.2mg/マウスで腹腔内投与する。移植後17日目に、マウスは体重および腫瘍サイズに応じてグループに分離され、抗アジア-GM1抗体は0.2mg/マウスでマウスに再び腹腔内投与される。翌日、前述の膨張培養により得られたT細胞を3x107細胞/マウスで腹腔内に移植する。T細胞移植の4時間後、抗ヒトRNF43/CD3二重特異性抗体は、10mg/kgのコーデート静脈を介して静脈内投与される。抗ヒトRNF43/CD3二重特異性抗体は一度だけ投与される。

抗腫瘍活性は、溶媒投与対照群と比較して抗ヒトRNF43/CD3二重特異性抗体投与群において観察される。

SW48(ATCC)移植T細胞注入モデル上の抗ヒトRNF43/CD3二重特異性抗体の薬効試験は、同様の方法によって行われる。抗ヒトRNF43/CD3二重特異性抗体は、それぞれ7日および14日に10mg/kgおよび7mg/kgでコーデート静脈を介して2回静脈内投与される。

実施例8. エピトープビニング解析(Epitope binning analysis)
競合エピトープビニング実験は、オクテット(Pall ForteBio)を用いたリアルタイム結合アッセイによって行われる。ビオチン化RNF43-Fcを調製し、ストレプトアビジンバイオセンサーチップ(Pall ForteBio)に捕捉する。第1の抗体の25マイクロg/mlまたは50マイクロg/mlが調製され、第2の抗体と第1の抗体の両方を含む第2の溶液と、第1の抗体の濃度と同じ濃度にある。第1の溶液中の抗体も、調製される。捕捉された抗原の先端は、抗原と第1の抗体との結合がほぼ飽和するまで、300秒〜600秒間、第1溶液でインキュベートされる。このインキュベーション中の応答の変化は、遊離抗原に対する第1の抗体の結合の指標として測定される(ΔR1free)。次いで、チップを300秒〜600秒間第2溶液でインキュベートし、第1の抗体結合抗原と第2の抗体との間のさらなる結合が飽和するまで続く。このインキュベーション中の応答の変化は、第1の抗体結合抗原に対する第2抗体の結合の指標として測定される(ΔR_2comp).

第2の溶液の同じ濃度で第2の抗体を含む第3の溶液は、第1の抗体なしで、また調製される。ビオチン化RNF43-Fc捕捉ストレプトアビジンバイオセンサチップは、抗原と第2抗体との結合が飽和するまで、300秒〜600秒間第3溶液でインキュベートされる。このインキュベーション中の応答の変化は、遊離抗原に対する第2の抗体の結合の指標として測定される(ΔR2free)。

結果は、データ分析HTソフトウェア(Pall ForteBio、バージョン10.0.1.7)またはマイクロソフトエクセルによって分析されます。第1の抗体による第2の抗体の阻害率は、以下のように計算される。
阻害率(%) =ΔR2comp /ΔR2free×100

第1の抗体と第2の抗体との間の競合は、それらの間の阻害率に基づいて決定される。第1の抗体が第2の抗体を30%以上阻害し、第2の抗体が第1の抗体を30%以上阻害する場合、第1の抗体と第2の抗体は互いに競合すると考えられる。互いに競合する抗体は、同じビンにグループ化されます。阻害率の計算では、すべての結合応答は、ストレプトアビジンバイオセンサーチップ上の抗原捕捉レベルによって正規化される。

前述の発明は、理解の明確化を目的とした説明や例を用いていくつかの詳細に説明されているが、その説明および例は、発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。本明細書に引用されるすべての特許および科学文献の開示は、参照によってその全体に明示的に組み込まれる。

本開示は、ヒトRNF43内の新しいエピトープに結合する新規な抗原結合分子を提供し、癌治療、予防および診断に使用することができる。本開示はまた、RNF43発現細胞に近いT細胞を有し、RNF43発現癌細胞に対してT細胞の細胞傷害性を用いることによって癌の治療および予防に使用できる多重特異性抗原結合分子を提供する。

Claims

RNF43結合活性を有する第1の抗原結合ドメインを含む抗原結合分子は、ここで第1の抗原結合ドメイン(a)から(c)まで選択されたものを以下から含む。
(a)配列番号2のアミノ酸配列を含むHVR-H1を含む抗体重鎖可変領域を含む抗体断片、配列番号3のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および配列番号4のアミノ酸配列を含むHVR-H3、配列番号6のアミノ酸配列を含むHVR-L1を含む抗体軽鎖可変領域と、配列番号7のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および配列番号8のアミノ酸配列を含むHVR-L3;
(b)(a)のいずれかの抗体断片とRNF43との結合を競合する抗体断片。そして
(c)(a)の抗体断片のいずれかがRNF43上で結合するのと同じエピトープに結合する抗体断片。
請求項1の抗原結合分子は、ここでRNF43結合活性が真核細胞の表面上のRNF43に対する結合活性を有する。
請求項1または2の抗原結合分子は、前に抗原結合分子が細胞細胞傷害性を有する。
請求項3の抗原結合分子は、前述する細胞傷害性が抗体依存性細胞傷害性(ADCC)、または補体依存性細胞傷害性(CDC)である。
請求項1〜4のいずれかの抗原結合分子は、T細胞受容体複合結合活性を有する第2の抗原結合ドメインをさらに含む。
請求項5の抗原結合分子は、前例において、抗原結合分子がT細胞依存性細胞傷害性を有する。
請求項5の抗原結合分子は、前例において、抗原結合分子がT細胞依存性細胞傷害性を有する。
請求項5または6の抗原結合分子は、ここでT細胞受容体複合体結合活性がT細胞受容体に対する結合活性を有する。
請求項5または6の抗原結合分子は、ここでT細胞受容体複合体結合活性がCD3イプシロン鎖に対する結合活性を有する。
請求項1〜8のいずれかの抗原結合分子は、前述する抗原結合分子がFcドメインをさらに含む。
請求項1〜9のいずれかの抗原結合分子は、前例において、FcドメインがIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4抗体のFcドメインと比較してFcガンマ受容体結合活性を低下させた。
請求項1〜10のいずれの抗原結合分子は、前記抗原結合分子が二重特異性抗体である。
請求項1〜11のいずれも抗原結合分子と薬学的に許容される担体の抗原結合分子を含む医薬組成物。
RNF43を検出する方法は、請求項1〜11のいずれかの抗原結合分子に試料を接触させることを含む。