JP2002514420A - 樹状細胞に対する抗体およびヒト樹状細胞集団およびその使用 - Google Patents

樹状細胞に対する抗体およびヒト樹状細胞集団およびその使用

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Abstract

(57)【要約】 ヒト樹状細胞（ＤＣ）の個別集団を特異的に認識する新規な抗体および該抗体を用いた該ＤＣの単離方法。さらに、上記抗体により認識される抗原およびエピトープ並びに該抗体をコードするポリヌクレオチド。さらに、該ポリヌクレオチドを含むベクター並びに該ベクターで形質転換した宿主細胞および該抗体の産生におけるその使用。さらに、上記抗体の結合部位のドメイン、または上記抗原またはエピトープおよび少なくとも一つのさらなる好ましくは機能性のドメインを含むポリペプチドおよびそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。さらに、該ポリヌクレオチドを含むベクター、該ポリヌクレオチドまたはベクターでトランスフェクションした宿主細胞および上記ポリペプチドの製造のためのその使用。さらに、上記ＤＣの単離または同定方法、並びに該方法によって得ることのできる、および／または上記抗体の認識によって特徴付けられる、および／または上記抗原またはエピトープを含むＤＣ。さらに、ある種の状態にあるＴ細胞を調製または同定する方法並びにＴ細胞により媒体された免疫応答の活性化を妨害する化合物を同定する方法。さらに、上記方法によって得られる上記抗体、抗原、エピトープ、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、樹状細胞またはＴ細胞または化合物を含むキットおよび組成物、好ましくは医薬および診断組成物が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明は、ヒト樹状細胞（ＤＣ）の個別集団を特異的に認識する新規な抗体お
よび該抗体を用いた該ＤＣの単離方法に関する。本発明はさらに、上記抗体によ
り認識される抗原およびエピトープ並びに該抗体をコードするポリヌクレオチド
に関する。さらに、本発明は、該ポリヌクレオチドを含むベクター並びに該ベク
ターで形質転換した宿主細胞および該抗体の産生におけるその使用に関する。本
発明はさらに、上記抗体の結合部位のドメイン、または上記抗原またはエピトー
プおよび少なくとも一つのさらなる好ましくは機能性のドメインを含むポリペプ
チドおよびそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。さ
らに、本発明は、該ポリヌクレオチドを含むベクター、該ポリヌクレオチドまた
はベクターでトランスフェクションした宿主細胞および上記ポリペプチドの製造
のためのその使用に関する。本発明はまた、上記ＤＣの単離または同定方法をも
含み、該方法によって得ることのできる、および／または上記抗体の認識によっ
て特徴付けられる、および／または上記抗原またはエピトープを含むＤＣに関す
る。
【０００２】 本発明はまた、ある種の状態にあるＴ細胞を調製または同定する方法並びにＴ
細胞により媒体された免疫応答の活性化を妨害する化合物を同定する方法を含む
。さらに、本発明は、上記方法によって得られる上記抗体、抗原、エピトープ、
ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、樹状細胞またはＴ細胞または化合
物を含むキットおよび組成物、好ましくは医薬および診断組成物に関する。本発
明のさらなる目的は、樹状細胞に暴露された抗原、抗原発現ＤＣを含む、または
上記抗原またはエピトープを含むワクチンである。さらに、上記樹状細胞は免疫
保護組成物の対象である。さらに、本発明は、好ましくは癌および感染疾患に対
して採用できる免疫療法用の医薬組成物を調製するための、上記方法によって得
られるＴ細胞、上記ＤＣ、抗体、ポリヌクレオチドおよびベクターの使用、およ
びワクチンおよび免疫療法剤を調製するための、または免疫療法用の新規な抗原
標的を同定するためのその使用に関する。
【０００３】 幾つかの文献を本願の明細書中に引用する。本明細書中に引用した各文献（製
造業者の仕様書、教示等を含む）は、参照のため本明細書中に組み込まれる。し
かしながら、引用した文献が実際に本発明の先行技術であることを認めるもので
はない。
【０００４】 （背景技術） 外来抗原に対する免疫応答は、３つの異なる相互作用する細胞型、いわゆるＴ
細胞、Ｂ細胞および抗原提示細胞（ＡＰＣ）により媒体される。胸腺由来リンパ
球（Ｔ細胞）は２つの機能的および表現型的に区別されるサブセットに分けるこ
とができる。ヘルパーＴ細胞はリンホカインを産生および分泌することにより抗
原刺激に応答し、リンホカインは免疫系において他の様々な細胞型を活性化する
。細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、抗原陽性の標的細胞、たとえばウイルス
感染細胞を直接殺傷すべく分化したものである。Ｂ細胞は細胞表面レセプターと
してかまたは分泌されたタンパク質としてのいずれかで抗体により抗原を認識し
、これら抗体は固相表面上または溶液中の抗原に直接結合する。対照的に、Ｔ細
胞は、小さな断片にプロセシングまたは分解されＡＰＣの表面などの固相上に提
示された抗原のみを認識する。さらに、抗原性断片は、主要組織適合複合体（Ｍ
ＨＣ）によってコードされたクラスＩまたはクラスII分子とともにＴ細胞に提示
される必要がある。ＣＤ４＋Ｔ細胞はＭＨＣクラスII生成物によって提示される
抗原を認識するのに対し、ＣＤ８＋Ｔ細胞はＭＨＣクラスＩタンパク質との関連
で抗原を認識する。
【０００５】 Ｔ細胞への抗原の提示はＡＰＣと呼ばれる分化した細胞集団によって行われる
。免疫応答の初期の事象に関与するものとして、ＡＰＣはＴ細胞およびＢ細胞の
両応答の開始に重要である。一般に、ＡＰＣはマクロファージ／単球、Ｂ細胞、
および骨髄由来樹状細胞（ＤＣ）を含む。最も重要なＡＰＣは樹状細胞である（
Sprentら、1987,Adv.Immunol.41:39-133）。これら細胞は、適当なＴ細胞がペプ
チド−ＭＨＣ複合体を認識することができ活性化されることができるように、外
来の抗原を嵌入させ、抗原を小さなペプチド断片にプロセシングし、これら断片
をＭＨＣ分子とともに細胞表面上に提示すべく分化している（GoldbergおよびRo
ck,1992,Nature 357:375-379）。ＡＰＣはＭＨＣによりコードされるクラスＩお
よびIIの両タンパク質を提示するので、ＡＰＣは免疫応答を開始するために抗原
断片をＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞の両者に提示することができる。
【０００６】 抗原特異的なレセプターによる抗原のＴ細胞への提示に加えて、ＡＰＣはＴ細
胞活性化のためのすべてのシグナルを提供する。そのようなシグナルには、様々
な細胞表面の接着分子およびコスティミュラトリー分子並びにサイトカインまた
は成長因子が含まれる。ナイーブな（naive）または初回抗原刺激を受けたこと
のないＴ細胞の活性化に必要な因子は、以前に初回抗原刺激を受けた記憶Ｔ細胞
の再活性化に必要な因子とは異なる。ＤＣとは対照的に、単球およびＢ細胞は機
能的にナイーブなまたは初回抗原刺激を受けたことのないＴ細胞を直接活性化す
ることができないので、これら細胞の抗原提示能は以前に感作したＴ細胞の再活
性化に限られると思われる。
【０００７】 「樹状細胞」なる語は、種々のリンパ系および非リンパ系組織に存在する形態
学的に類似の細胞の種々のグループをいう（Steinmann,1991,Ann.Rev.Immunol.
9:271-296）。これら細胞は、リンパ節や脾臓などのリンパ系器官のＤＣ、表皮
のランゲルハンス細胞、輸入（afferent）リンパ管中のベール（veiled）細胞お
よび循環血流中のＤＣを含む。表現型的にヒトＤＣは、高密度のＭＨＣクラスII
抗原、広範囲の接着分子の存在、およびＴ細胞、Ｂ細胞、単球およびおよびナチ
ュラルキラー細胞に特徴的な所定範囲の細胞系列（lineage）特異的な細胞表面
抗原（ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ５６）の不在もしくは低発
現によって特徴付けられる。この表現型の特徴にもかかわらず、これら抗原の大
多数が他の細胞型によっても発現されるためにＤＣの同定および精製は依然とし
て困難である。大抵の刊行された報告はマウス脾臓から単離したＤＣを利用して
おり、このＤＣが一次抗原特異的応答においてナイーブＴ細胞を活性化すること
ができる点で独特のＡＰＣであることを示している（Inabaら,1987,J.Exp.Med.1
66:182-194; Hengelら,1987,J.Immunol.139:4196-4202; Kastら,1988,J.Immunol
.140:3186-3193;Romaniら,1989,J.Exp.Med.169:1169-1178;Macatoniaら,1989,J.
Exp.Med.169:1255-1264;Inabaら,1990,J.Exp.Med.172:631-640）。それゆえ、ヒ
トＤＣもまた、そのような強力な抗原提示機能を果たし得る。
【０００８】 ヒト組織からＤＣを富ませるのに最も適したやり方は、その利用しやすからヒ
ト末梢血から単離することである。幾つかの研究が末梢血からのヒトＤＣの単離
を記載している（YoungおよびSteinmann,1990,J.Exp.Med.171:1315-1332;Freude
nthalおよびSteinmann,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:7698-7702;Macatonia
ら,1989,Immunol.67:285-289;MarkowiczおよびEngleman,1990,J.Clin.Invest.85
:955-961）。新鮮な血液ＤＣの単離のための現行のプロトコールは２つの異なる
成分からなる：第一は、ＤＣによっては発現されない細胞表面抗原に対する細胞
系列特異的なモノクローナル抗体を用いた他の細胞集団の連続的な涸渇によるＤ
Ｃの富化（enrichment）である。そのような抗体の例としては、Ｔ細胞に特異的
な抗ＣＤ３、抗ＣＤ４および抗ＣＤ８；Ｂ細胞に特異的な抗ＣＤ１９および抗Ｃ
Ｄ２０；単球に特異的な抗ＣＤ１４；およびナチュラルキラー細胞に特異的な抗
ＣＤ５６が挙げられる。第二は、ＤＣによりＭＨＣクラスII抗原として異なって
発現される細胞表面マーカーを用いることによる細胞系列マーカー陰性細胞画分
からＤＣを積極的に選択することである（O'Dohertyら,1994,Immunol.82:487-49
3;Thomasら,1993,J.Immunol.150:821-834;O'Dohertyら,1993,J.Exp.Med.178:106
7-1076）。
【０００９】 細胞は、抗体に結合したら、該一次抗体の定常領域に向けられた二次抗体をコ
ーティングした固相に吸着させることによって除去することができる。あるいは
、ビオチンに結合した抗体はアビジンまたはストレプトアビジンをコーティング
した表面により除去することができる。抗体をマグネチックビーズに結合させて
ある場合は、抗体結合細胞は磁場で分離することができる（HarlowおよびLane,
1988, "Antibody",コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー）。抗体選
択に加え、密度勾配遠心分離および赤血球ロゼット形成法を応用する。この手順
は時間を要し、限られた数の精製ＤＣしか得られない。さらに、単離したＤＣ画
分は、しばしば他の混入細胞集団のために不均質である。そのうえ、勾配（grad
ient）化合物およびその浸透作用は細胞の表現型および機能の変化を引き起こす
（McLellanら,1995,Eur.J.Immunol.25:2064-2068;Kabelら,1989,Immunology 179
:341-395）。
【００１０】 ＤＣを得るために広く用いられている他の方法は、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦ
−αまたはＩＬ−４による組み合わせインビトロ処理（少なくとも数日間保持し
なければならない）により誘発される、骨髄もしくは血液由来ＣＤ３４＋細胞ま
たはＣＤ１４＋単球の分化に基づく（Cauxら,1992,Nature 360:258-261;Bernhar
dら,1995,Cancer Res.55:1099-1104;Sallustoら,1994,J.Exp.Med.179:1109-1118
;Romaniら,1994,J.Exp.Med.180:83-93）。この手順の使用は、細胞の培養の間に
起こる表現型および機能の変化に限られる。さらに、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−
４による処理はＴ細胞の非特異的な刺激を促進する（Dillonら,1997,Scand.J.Im
munol.46:1-9）。
【００１１】 末梢血からのＤＣの直接的な単離は、循環血中のＤＣの頻度が低いことおよび
選択的なマーカーの欠如のために行き詰まっている。ヒトのＤＣ特異的な細胞系
列マーカーは同定されていない。これまでにＤＣに特異的であるとして報告され
ているわずかな数のマーカーは血液ＤＣを単離するのに適していない。Zhouら（
Zhouら,1995,J.Immunol.154: 3821-3835）によって記載されたＣＤ８３分子は、
インビトロ培養で優先的に誘発される活性化マーカーであるとされている。モノ
クローナル抗体 ＣＭＲＦ−４４は、新たに単離した血液ＤＣには発現されない
がＤＣを精製するのに通常用いられる物理的単離手順の間に誘発される初期活性
化抗原を認識する（Hockら,1994,Immunology 83:573-581）。ｐ５５抗原、アク
チン束化（bundling）タンパク質は細胞質に限られている（O'Dohertyら,1993,J
.Exp.Med.178:1067-1076）。それゆえ、ヒトＤＣによって選択的に発現される抗
原に対するモノクローナル抗体の必要性が依然として存在し、そのようなモノク
ローナル抗体は末梢血からＤＣを直接単離するのを容易にするであろう。これま
でのヒトＤＣ特異的な抗体を単離する試みは大部分不成功に終わっており、ＤＣ
と他の白血球との両者に共通する抗原を認識する抗体が得られているにすぎない
。 それゆえ、本発明の技術的課題は免疫応答を調節するための手段および方法を
提供することである。 この技術的課題の解決は、特許請求の範囲において特徴付けられる態様を提供
することによって達成される。
【００１２】 （発明の要約） 従って、本発明は、 （i）末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からの未熟および／または成熟樹状細胞（Ｄ
Ｃ）の特性を表示するＤＣ上のエピトープとは反応するが （ii）他のＰＢＭＣとは反応しない 抗体に関する。
【００１３】 通常、樹状細胞は異なる表現型および機能的特性を有する細胞の不均質な集団
を含むが、抗原を提示し、ナイーブなＴリンパ球を初回抗原刺激する顕著な能力
で際立っている1。細胞系列マーカー陽性細胞の涸渇とそれに引き続くＭＨＣク
ラスII発現細胞の単離などの従来の戦略は、主として成熟ＤＣおよび未熟ＤＣを
表す２つの主要なＤＣ集団を定めるに至っている2,3。さらに最近では、幾つか
の報告がＤＣを種々のカテゴリーに従ってリンパ系細胞または骨髄性の樹状細胞
に分けたり（Wuら,J.Exp.Med.184(1996),903-911; Galyら,Immunity 3(1995),45
9-473）、またはマウス脾臓中の微細解剖位置に基づいて辺縁系細胞および交互
嵌入合（interdigitating）細胞に分ける（Leenenら,J.Immunol.160(1998),2166
-2173）試みがなされている。
【００１４】 本発明の抗体は、ＨＬＡ−ＤＲlow、ＣＤ３３dim、ＣＤ４５ＲＡhigh、ＣＤ１
１ｃ-およびＣＤ６４-である未熟ＤＣの特性を提示するＤＣ、および表面マーカ
ー特性ＨＬＡ−ＤＲhigh、ＣＤ３３high、ＣＤ４５ＲＡlow、ＣＤ１１ｃ+および
ＣＤ６４+を有する実質的に成熟ＤＣに類似するＤＣを含む、これまでに同定さ
れていないＤＣの集団と特異的に反応する。本発明の抗体により認識されるＤＣ
は、好ましくは、未熟ＤＣと成熟ＤＣとの間の成熟化段階として、およびモノク
ローナル抗体Ｍ−ＤＣ８として示される本発明の新規な抗体と反応する能力によ
り定められる。従って、本発明のＤＣはまた、Ｍ−ＤＣ８+またはＭ−ＤＣ８+細
胞として言及されるであろう。上記新規なモノクローナル抗体Ｍ−ＤＣ８は、Ｍ
−ＤＣ８抗原を発現するJurkatＴ細胞リンパ腫サブクローンを特異的に選択する
のに用いた（付属の実施例１０参照）。該Jurkatサブクローンは、さらに本発明
の新規な抗体を産生するのに用いた。これらモノクローナル抗体は、モノクロー
ナル抗体Ｄ−ＤＣ８.１およびＤ−ＤＣ８.２を含む。これら抗体によって認識さ
れるＤＣもまたＭ−ＣＤ８+またはＭ−ＣＤ８+細胞と称されるであろう。
【００１５】 本明細書において「未熟ＤＣと成熟ＤＣとの間の成熟化段階を表すＤＣ集団」
とは、図８に模式的に表示するように、何人かの研究者2,3,20によってこれまで
に定められている２つの主要なＤＣのサブセットに重複するヒト血液ＤＣの集団
をいう。第一のサブセットの細胞はＨＬＡ−ＤＲlow、ＣＤ３３dim、ＣＤ４５Ｒ
Ａhigh、ＣＤ１１ｃ-およびＣＤ６４-であって未熟ＤＣを表し、一方、第二のサ
ブセットは表面マーカー特性ＨＬＡ−ＤＲhigh、ＣＤ３３high、ＣＤ４５ＲＡlo w 、ＣＤ１１ｃ+およびＣＤ６４+を有する成熟ＤＣを含む。これら細胞は、さら
に、一夜培養後にＣＤ８３を発現する20。確立された両ＤＣ集団とＭ−ＤＣ８+
細胞との主たる相違は、Ｍ−ＤＣ８およびＣＤ１６の発現および細胞質内ｐ５５
抗原の不在である。それゆえ、Ｍ−ＤＣ８+細胞は中間の発達段階を表すと推測
したくなる。
【００１６】 本発明の意味における「末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）」とは、１.０７７ｇ／
ｍｌの密度のFicollR−勾配で新たに採取した静脈血の遠心分離により単離した
有核の血球をいう。 本明細書において「他のＰＢＭＣと反応しない」とは、本発明の抗体がＭ−Ｄ
Ｃ８+細胞を除く上記ＰＢＭＣ（Ｂリンパ球、Ｔリンパ球およびＣＤ１４high+単
球など）と反応しないかまたは無視しうる程度に交叉反応することをいう。本発
明の抗体の交叉反応性は、１０％未満、さらに好ましくは５％未満、特に好まし
くは３％未満、またはさらには２％または１％未満である。
【００１７】 本発明は、極めてＤＣに富むヒト単核血球でマウスを免疫することにより得ら
れる（付属の実施例１に記載のようにして得られる）新規なモノクローナル抗体
（モノクローナル抗体Ｍ−ＤＣ８）が、ＨＬＡ−ＤＲを発現し共通の細胞系列特
異的なマーカーを欠如するＰＢＭＣを１〜２％含む白血球と特異的に反応すると
いう観察に基づいている。Ｍ−ＤＣ８+細胞の特徴的な光分散プロフィルは、リ
ンパ球と単球との間に位置する限定されたサイズおよび顆粒度（granularity）
の細胞集団を示していた。細胞培養の４８時間以内に単離したＭ−ＤＣ８+細胞
は細胞質突出（cytoplasmatic protrusions）の波動（undulating）を特徴とす
る成熟ＤＣの典型的な形態を獲得した1。食作用の乏しい細胞としてＤＣを記載
する以前の報告3とは対照的に、新たに単離したＭ−ＤＣ８+細胞はラテックス粒
子および抗体コーティング赤血球を貪欲に消化した。未熟ＤＣはエンドサイトー
シスおよびマクロピノサイトーシスにより大量の抗原を取り込むが4、本発明に
従って得られたＭ−ＤＣ８+細胞に対する知見は食作用が抗原取り込みのさらな
る重要な経路であることを示している。
【００１８】 ごく最近、FangerらはＤＣ上でのＦｃレセプターＣＤ６４およびＣＤ３２の発
現および食作用におけるその機能的な関与を記載している20。対照的に、Ｍ−Ｄ
Ｃ８+細胞はＣＤ６４を欠如しており、その代わりにＣＤ１６をＣＤ３２ととも
に発現する。それゆえ、Ｍ−ＤＣ８+細胞によるオプソニン処理赤血球の食作用
はＣＤ１６およびＣＤ３２の両者によって媒体されるのかもしれない。
【００１９】 本発明によれば、驚くべきことに新鮮なＭ−ＤＣ８+細胞は顕著な食作用活性
に加えて、効率的なアロ抗原依存性およびＴＴ依存性のＴ細胞増殖によって示さ
れるようにＴ細胞を活性化する際立った能力を示すことがわかった。さらに、Ｍ
−ＤＣ８+細胞は自己由来白血球反応においてＴ細胞を刺激するのみならず、Ｋ
ＬＨに対して一次Ｔ細胞応答を誘発したが、これはすべてＤＣに典型的と考えら
れる活性である1。一次Ｔ細胞応答が生じるためにはナイーブなＣＤ４５ＲＡ+Ｔ
細胞を富ませる必要があるとのこれまでの報告21,22とは対照的に、Ｍ−ＤＣ８+ 細胞は前以て富化することなくＫＬＨに対して未選択Ｔ細胞を初回抗原刺激する
ことができた。さらに、Ｍ−ＤＣ８+細胞はＭＨＣクラスＩに限定されたＴ細胞
応答を非常に効率的に刺激した。Ｍ−ＤＣ８+細胞は特定の抗原ペプチドで感作
した後に細胞傷害性ＣＤ８+Ｔ細胞クローンを単球と同じくらい効率的に活性化
したが、単球とは対照的にＣＤ４+Ｔ細胞ヘルパー細胞の完全な不在下に精製Ｃ
Ｄ８+Ｔ細胞のアロ抗原特異的な細胞傷害性エフェクター細胞への分化を誘発し
た（ＤＣに特徴的な活性とされているものである17,18）。さらに、メラノーマ
関連チロシナーゼペプチドを負荷した後にＭ−ＤＣ８+細胞はメラノーマ患者お
よび正常なドナーからのＴ細胞を刺激して、ＨＬＡに限定された仕方でメラノー
マ細胞に対する特異的な細胞障害作用を生成させた。
【００２０】 Ｍ−ＤＣ８+細胞は明らかにＣＤ１４+単球と区別される独特のパターンの細胞
表面分子を明らかにした。新たに単離したＭ−ＤＣ８+細胞は低表面レベルのＨ
ＬＡ−ＤＲ、ＣＤ３３、ＣＤ４５Ｒ０およびＣＤ１１ｂを発現したが、一方、Ｃ
Ｄ８６、ＣＤ４０およびＣＤ４の密度は単球のものと同様であった。一方、ＣＤ
４５ＲＡ、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｃおよびとりわけＣＤ１６の発現は単球よりも
明らかに高かった。
【００２１】 Ｍ−ＤＣ８+細胞は、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の存在下でＣＤ３４+前駆細
胞またはＣＤ１４+単球からインビトロで生成される14大部分のＤＣとは異なる
。Ｍ−ＤＣ８+細胞はインビトロでのサイトカインによる分化によって得られる
ＤＣと共通する多くの表面マーカーおよび機能的な特性を有する。しかしながら
、Ｍ−ＤＣ８抗原は、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦ−αでの刺激によってＣＤ３４ + 前駆細胞から得られるＤＣの２〜５％を含む小さなサブセットを例外として、
インビトロで生成されるＤＣでは検出されなかった。Ｍ−ＤＣ８+細胞の起源お
よびＭ−ＤＣ８マーカーの発現を誘発するシグナルは未だ解明されていない。
【００２２】 ＦｃγＲIII（ＣＤ１６）は、Ｍ−ＤＣ８+細胞とこれまでに定められているＤ
Ｃとの間で発現が異なることがわかった他の表面分子である。これまでのところ
、ＤＣによるＣＤ１６発現はマウスのランゲルハンス細胞でのみ記載されており
、免疫複合体の嵌入および抗原の提示を促進すると推定されている23。ヒトでは
ＣＤ１６発現は主として顆粒球、ＮＫ細胞、マクロファージ、および単球のサブ
セットに限られており24、ＤＣでは一般に発現されないと考えられている。対照
的に、Ｍ−ＤＣ８抗体で新たに単離されたＤＣはＣＤ１６を高濃度で発現した。
この明らかな不一致は、ＤＣ上でのＣＤ１６の短いインビトロ半減期によるもの
と思われる。というのはＣＤ１６はインビトロ培養で短時間で消失したからであ
る。一般に、ＦｃγレセプターはFicoll密度勾配遠心分離などの長期の細胞の取
扱いにより非常に速やかに下方制御（downregulated）されると思われる25。
【００２３】 本発明の好ましい態様において、該ＤＣはＨＬＡ−ＤＲ+であり、該ＰＢＭＣ
はＴ細胞およびＢ細胞および単球が涸渇している。好ましくは、該ＤＣはＣＤ６
４-、ＣＤ３３+、ＣＤ４５ＲＡ+、ＣＤ１１ｃ+およびｐ５５-およびとりわけＣ
Ｄ１６+であり、および／またはリンパ球と単球との間に位置する限定されたサ
イズおよび顆粒度を有する。
【００２４】 本発明の抗体は、たとえば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメ
ラ抗体、ヒト化抗体、２特異的抗体、合成抗体、Ｆａｂ、ＦｖまたはｓｃＦｖ断
片などの抗体断片、またはこれらのいずれかの化学的に修飾した誘導体であって
よい。モノクローナル抗体は、たとえば、KohlerおよびMilsteinによって最初に
記載された技術（Nature 256(1975), 495, およびGalfre, Meth.Enzymol.73(198
1),3）（マウスミエローマ細胞を免疫哺乳動物からの脾臓細胞に融合させること
を含む）によって当該技術分野で開発された改変を採用しながら調製することが
できる。モノクローナル抗体は、とりわけ、マウス、たとえばＢＡＬＢ／ｃマウ
スを付属の実施例１に記載するようにして得られるヒト単核血球で免疫すること
によって得ることができる。
【００２５】 抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体または合成抗体、並びにＦ
ａｂ、ＦｖまたはｓｃＦｖ断片などの抗体断片であってよい。さらに、上記ＤＣ
に対する抗体またはその断片は、たとえばHarlowおよびLane, "Antibodies, A L
aboratory Manual"、コールド・スプリング・ハーバー・プレス、コールド・ス
プリング・ハーバー、１９８８に記載されている方法により得ることができる。
これら抗体は、たとえば、本発明のＤＣの免疫沈降、免疫局在化（immunolocali
zation）または精製のため、並びにそのようなＤＣの存在のモニターのため、お
よび本発明によるＤＣと相互作用する化合物の同定のために用いることができる
。たとえば、BIAcoreシステムに用いられているような表面プラスモン共鳴（sur
face plasmon resonance）を用いて本発明の抗体により認識されるエピトープに
結合する抗体のファージ展示の効率を高めることができる（Schier, Human Anti
bodies Hybridomas 7(1996),97-105;Malmborg, J.Immunol.Methods 183(1995),7
-13）。
【００２６】 キメラ抗体の産生は、たとえばＷＯ８９／０９６２２に記載されている。ヒト
化抗体の製造方法は、たとえばＥＰ−Ａ１ ０ ２３９ ４００およびＷＯ９０／
０７８６１に記載されている。さらに、ヒト抗体は一般に利用しやすくなってい
る。なぜなら、ヒト抗体を発現するトランスジェニックマウス（異種抗体とも呼
ばれる）（Bruggermann, Immunol.Today 17(1996), 391-397）およびおよびコン
ビナトリアル抗体ライブラリーおよびファージ展示法を利用できることが、免疫
グロブリン重鎖および軽鎖の可変領域（ＶHおよびＶL）のインビトロ組み合わせ
およびその抗原結合特異性のインビトロ選択を可能にするからである（Winter,
Annu.Rev.Immunol.12(1994),433-455）。ファージ展示法を用いることにより、
１０7〜１０9の異なるＶL／ＶH−またはＶH／ＶL−ペアから一つの特異的結合種
のような稀な事象を容易に単離することができる；このことは、レパートリーク
ローニング（repertoire cloning）のための源として免疫宿主からのＢリンパ球
を用いることにより可変領域のレパートリーが特定の結合種について富化されて
いる場合にとりわけ当てはまる。
【００２７】 さらに、半合成または完全に合成したＶH−および／またはＶL−免疫グロブリ
ン鎖レパートリーを用いる方法が開発されている。たとえば、インビボでのＶ−
ＪまたはＶ−Ｄ−Ｊ組換えを真似て、再編成されていないヒトＶ遺伝子セグメン
トの殆ど完全なレパートリーをゲノムＤＮＡからクローニングし、機能的な可変
領域をインビトロで組換えるのに用いられている（Hoogenboom,J.Mol.Biol.227(
1992),381-388;Nissim,EMBO J.13(1994)692-698;Griffiths,EMBO J.13(1994),32
45-3260）。それゆえ、上記および付属の実施例に記載する抗体の誘導体はすべ
て、それが上記ＤＣに特異的な抗原（好ましくはＭ−ＤＣ８、Ｄ−ＤＣ８.１お
よび／またはＤ−ＤＣ８.２抗体によって認識される抗原）の少なくとも一つの
エピトープを認識する限り、本発明の範囲に包含される。上記に記載したように
、本発明の抗体は完全な抗体に加えて、たとえばＦｖ、ＦａｂおよびＦ(ａｂ)2
並びに一本鎖を含む種々の形態で存在してよい（たとえば、ＷＯ８８／０９３４
４参照）。
【００２８】 本発明の抗体または対応するその免疫グロブリン鎖は、当該技術分野で知られ
た通常の方法を用い、たとえばアミノ酸の欠失、挿入、置換、付加、および／ま
たは組換えおよび／または当該技術分野で知られた他の修飾法を単独もしくは組
み合わせて用いることによりさらに修飾することができる。免疫グロブリン鎖の
アミノ酸配列の基礎となるＤＮＡ配列にそのような修飾を導入する方法は当該技
術分野でよく知られている；たとえば、Sambrook, Molecular Cloning A Labora
tory Manual、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（１９８９）ニ
ューヨークを参照。
【００２９】 本発明の好ましい態様において、本発明の該２特異的抗体は、腫瘍細胞、ウイ
ルス感染細胞、Ｔ細胞、腫瘍関連タンパク質、微生物タンパク質、アレルゲン、
自己抗原またはサイトカインに特異的なエピトープを認識する。
【００３０】 本発明の好ましい態様において、該ＤＣはハイブリドーマ細胞株ＤＳＭ ＡＣ
Ｃ２２４１によって産生される抗体によって認識され、好ましくは該抗体はハイ
ブリドーマ細胞株ＤＳＭ ＡＣＣ２２４１によって産生される抗体Ｍ−ＤＣ８（
ＤＣ８）である。該ハイブリドーマ細胞は、ブダペスト条約に従い、カルチャー
コレクション・ドイチェ・ザムルング・フォン・ミクロオルガニスメン・ウント
・ツェルクルトゥーレン（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellku
lturen）ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）（ブラウンシュベイク、ドイツ）に１９９５年１
０月２６日に寄託してある。
【００３１】 上記および付属の実施例に記載するように、新規なモノクローナル抗体Ｍ−Ｄ
Ｃ８はヒトＤＣの独特の集団に対して極めて選択的なマーカーを提供するもので
あり、該集団は血液の白血球の０.５〜１％を占め、１工程の免疫磁気手順を用
いて血液から直接単離できる。Ｍ−ＤＣ８+細胞はＦｃγＲIII（ＣＤ１６）を発
現するのを特徴とし、極めて食作用が強く、また自己混合白血球反応、一次抗原
に対するＴ細胞の活性化、アロ抗原特異的な細胞障害性エフェクター細胞への精
製ＣＤ８+Ｔ細胞の分化の誘発、およびメラノーマ患者および正常な血液ドナー
からのＴ細胞のメラノーマ特異的細胞障害性細胞への分化の誘発によって証拠立
てられるように抗原をＴ細胞に提示する際立った能力を示す。それゆえ、モノク
ローナル抗体Ｍ−ＤＣ８は診断目的で循環ＤＣを決定するための、およびエクス
イボおよびインビボでの抗原特異的なＴ細胞初回抗原刺激のためのＤＣを調製す
るための価値ある手段である。
【００３２】 さらに、本発明の抗体は、該樹状細胞上のエピトープを認識、検出および／ま
たは反応する抗体であり、ハイブリドーマ細胞株ＤＳＭ ＡＣＣ または
ＤＳＭ ＡＣＣ によって産生される。これらハイブリドーマ細胞株は、
ブダペスト条約に従ってカルチャーコレクションＤＳＭＺ（ブラウンシュベイク
、ドイツ）に１９９９年５月５日に寄託してある。上記および付属の実施例に記
載するように、これら新規なモノクローナル抗体Ｄ−ＤＣ８.１およびＤ−ＤＣ
８.２は上記特定のＭ−ＤＣ８+細胞を認識するさらなる抗体を提供する。Ｍ−Ｄ
Ｃ８と同様、モノクローナル抗体Ｄ−ＤＣ８.１およびＤ−ＤＣ８.２はとりわけ
本発明の樹状細胞の免疫単離、免疫局在化および／または精製に用いることがで
きる。さらに、これらモノクローナル抗体はまた、本発明によるＤＣと相互作用
するまたは相互作用できる化合物を検出および同定するのにも有用である。
【００３３】 他の態様において、本発明は、たとえば免疫グロブリンの定常ドメインに連結
した、Ｍ−ＤＣ８またはＤ−ＤＣ８.１またはＤ−ＤＣ８.２抗体の可変重鎖およ
び軽鎖ドメインをコードするｃＤＮＡをヒトＢ細胞株中に形質導入することによ
り、ヒト化形態で本発明の抗体を産生しうるヒトＢ細胞株に関する。該ｃＤＮＡ
は当業者に知られた方法により得ることができ、とりわけSambrook（上掲）およ
びAusubel, "Current Protocols in Molecular Biology"、グリーン・パブリシ
ング・アソシエーツ・アンド・ウイリー・インターサイエンス、ニューヨーク（
１９８９）に記載されている。発現（またはシークエンシング）のための該ｃＤ
ＮＡのクローニングは、たとえばOrlandi, PNAS 86(1986),3833-3837に記載され
ているように、あるいは付属の実施例９（モノクローナル抗体Ｍ−ＤＣ８の可変
領域のクローニングを記載）で説明してあるように、標準プロトコールに従って
行うことができる。
【００３４】 さらに、本発明は、本発明の抗体を産生することのできる連続的で安定な抗体
産生細胞株に関する。該細胞株はハイブリドーマ細胞株、好ましくは受託番号Ｄ
ＳＭ ＡＣＣ２２４１、受託番号ＤＳＭ ＡＣＣ または受託番号ＤＳＭ
ＡＣＣ を有するハイブリドーマ細胞株であってよい。
【００３５】 さらに別の態様において、本発明は、本発明の抗体によって認識される抗原ま
たはそのエピトープに関する。該抗原またはエピトープはグリコシル化されてい
てよいし、グリコシル化されていなくてもよいし、または部分的に脱グリコシル
化されていてもよい。本明細書に記載し実施例で説明するように、本発明のＤＣ
は上記抗体によって認識される、Ｍ−ＤＣ８などの新規な抗原を特徴とする。予
備的な生化学データは、Ｍ−ＤＣ８抗原がタンパク質であること、より詳細には
タンパク質の炭水化物部分であることを示している。それゆえ、この抗原は、糖
脂質上およびとりわけ膜タンパク質上に存在する炭水化物構造を含む。この新規
なマーカーの主たる利点は、それが＞９７％純粋なＤＣを血液から極めて短時間
に迅速に単離する手段として機能することができることである。この迅速なＤＣ
単離法は、ウイルスまたは腫瘍抗原に対して免疫しようとする種々のエクスビボ
での試みに対してＤＣを使用することを極めて容易にする。本発明の抗原および
エピトープの同定および単離のため、たとえば種々のｃＤＮＡを胞嚢体中に注入
して充分な時間ｃＤＮＡ遺伝子産物の発現を起こさせ、ついでたとえば本発明の
抗体を用いることによって所望のｃＤＮＡ発現産物の存在を試験することにより
、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることができる。
【００３６】 別法として、大腸菌でのｃＤＮＡ発現ライブラリーを、本発明の抗体を用いて
本発明の少なくとも一つのエピトープを有するペプチドについて間接的にスクリ
ーニングすることができる（ChangおよびGottlieb, J.Neurosci.,8:2123,1988）
。そのような抗原の構造を明らかにした後、結合パートナーおよび／またはドメ
インを合理的にデザインすることが可能である。たとえば、構造モチーフのフォ
ールディングシミュレーションおよびコンピューターリデザインを適当なコンピ
ュータープログラムを用いて行うことができる（Olszewski, Proteins 25(1996)
,286-299;Hoffman, Comput.Appl.Biosci.11(1995),675-679）。さらに、コンピ
ューターは、詳細なタンパク質モデルのコンホメーションおよびエネルギー分析
に用いることができる（Monge, J.Mol.Biol.247(1995),955-1012;Renouf, Adv.E
xp.Med.Biol.376(1995),37-45）。
【００３７】 他の態様において、本発明は、本発明の上記抗体のいずれかの免疫グロブリン
鎖の少なくとも可変領域をコードするポリヌクレオチドに関する。該領域をコー
ドするポリヌクレオチドは、当該技術分野でよく知られ、とりわけOrlandi, PNA
S 86(1989),3833-3837またはSambrook（上掲）に記載されたクローニング法を含
む方法により得ることができる。免疫グロブリンの一つの形態は抗体の基本構造
単位を構成する。この形態は四量体であり、免疫グロブリン鎖の２つの同一のペ
アからなり、それぞれ一つの軽鎖および一つの重鎖を有する。各ペアにおいて、
軽鎖および重鎖可変領域またはドメインは一緒になって抗原への結合に関与し、
定常領域は抗体のエフェクター機能に関与する。免疫グロブリンは抗体に加えて
、たとえばＦｖ、Ｆａｂ、およびＦ(ａｂ')2並びに一本鎖抗体を含む種々の他の
形態（所望の活性を保持した完全長未満のものを含む）で存在する（たとえば、
Huston, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(1988,5879-5883およびBird, Science 242(
1988),423-426;上記をも参照）。
【００３８】 免疫グロブリンの軽鎖または重鎖可変ドメインは、３つの高度可変領域、いわ
ゆるＣＤＲにより中断された「フレームワーク」領域からなる。フレームワーク
領域およびＣＤＲの範囲は正確に定められている；たとえば、"Sequences of Pr
oteins of Immunological Interest", Kabat、米国保健社会福祉省（１９９０）
参照。異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は一つの種内で比較的
保存されている。ある抗体のフレームワーク領域（構成する軽鎖および重鎖の組
み合わさったフレームワーク領域である）は、ＣＤＲを位置付け、配置する役割
をする。ＣＤＲは主として抗原のエピトープへの結合に関与する。キメラ抗体は
、その軽鎖および重鎖遺伝子を異なる種に属する免疫グロブリンの可変および定
常領域遺伝子から典型的には遺伝子操作により構築した抗体である。たとえば、
マウスモノクローナル抗体からの遺伝子の可変セグメントをヒト定常セグメント
に結合させることができる。
【００３９】 それゆえ、本発明の抗体は、本発明の抗体の重鎖および軽鎖免疫グロブリン鎖
をコードする組換えＤＮＡセグメントを単独または組み合わせて発現させること
により製造することができる。該ポリヌクレオチドは、たとえば、ＤＮＡ、ｃＤ
ＮＡ、ＲＮＡまたは合成して製造したＤＮＡまたはＲＮＡまたはこれらポリヌク
レオチドのいずれかを単独または組み合わせて含む組換えにより製造したキメラ
核酸分子であってよい。好ましくは、該ポリヌクレオチドはベクターの一部であ
ってよい。そのようなベクターは、適当な宿主細胞中でおよび適当な条件下で該
ベクターの選択を可能にするマーカー遺伝子などのさらなる遺伝子を含んでいて
よい。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、原核細胞または真核細胞中で
の発現を可能にする発現制御配列に作動可能に連結されている。該ポリヌクレオ
チドの発現は、ポリヌクレオチドの翻訳可能なｍＲＮＡへの転写を含む。真核生
物、好ましくは哺乳動物細胞中での発現を確実にする制御配列は当業者によく知
られている。これら制御配列には、通常、転写の開始を確実にする制御配列およ
び任意に転写の終結および転写の安定化を確実にするポリＡシグナルが含まれる
。さらなる制御配列としては、転写および／または翻訳エンハンサー、および／
または天然に付随するまたは異種のプロモーター領域が挙げられる。この観点か
ら、当業者は、軽鎖および／または重鎖の少なくとも可変ドメインをコードする
ポリヌクレオチドが免疫グロブリンの両方の鎖または一方のみの鎖の可変ドメイ
ンをコードしていてよいことを容易に認識するであろう。同様に、該ポリヌクレ
オチドは、同じプロモーターの制御下にあってもよいし、または発現のために別
々に制御されていてもよい。
【００４０】 原核宿主細胞中での発現を可能にする制御配列としては、たとえば、大腸菌で
のＰL、ｌａｃ、ｔｒｐまたはｔａｃプロモーターが挙げられ、真核宿主細胞で
の発現を可能にする制御配列の例は酵母でのＡＯＸ１またはＧＡＬ１プロモータ
ー、または哺乳動物および他の動物細胞でのＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロ
モーター、ＲＳＶプロモーター（ラウス肉腫ウイルス）、ＣＭＶエンハンサー、
ＳＶ４０エンハンサーまたはグロビンイントロンである。そのような制御配列は
、転写の開始に関与する配列に加えて、ＳＶ４０ポリＡ部位またはｔｋポリＡ部
位などの転写終結シグナルをも該ポリヌクレオチドの下流に含んでいてよい。こ
の関連で、オカヤマ−バーグｃＤＮＡ発現ベクターｐｃＤＶ１（Pharmacia）、
ｐＣＤＭ８、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１、ｐｃＤＮＡ３（In-vitrogen）、
ｐＳＰＯＲＴ１（GIBCO BRL）などの適当な発現ベクターが当該技術分野で知ら
れている。
【００４１】 好ましくは発現制御配列は真核宿主細胞を形質転換またはトランスフェクショ
ンできるベクター中の真核プロモーター系であろうが、原核宿主のための制御配
列もまた用いることができる。ベクターが適当な宿主中に導入されたら、該宿主
を該ヌクレオチド配列の高レベル発現に適した条件下で保持し、ついで所望によ
り、免疫グロブリン軽鎖、重鎖、軽／重鎖二量体または完全な抗体、結合性断片
または他の免疫グロブリン形態の回収および精製を行う；Beychok, Cells of Im
munoglobulin Synthesis、アカデミック・プレス、ニューヨーク（１９７９）を
参照。
【００４２】 上記のように、本発明のポリヌクレオチドは単独またはベクターの一部として
、たとえば、悪性変換ＤＣに関連する疾患またはＤＣ関連白血病の遺伝子療法ま
たは診断のため、本発明の抗体を細胞中で発現させるのに用いることができる。
上記抗体のいずれか一つをコードするＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチドまたは
ベクターを細胞中に導入すると、該細胞は所望の抗体を産生する。遺伝子療法は
エクスビボまたはインビボ技術により治療用遺伝子を細胞中に導入することに基
づくものであるが、遺伝子伝達の最も重要な応用の一つである。インビトロまた
はインビボ遺伝子療法に適したベクター、方法または遺伝子送達系は文献に記載
されており、当業者によく知られている；たとえば、Giordano, Nature Medicin
e 2(1996),534-539;Schaper, Circ.Res.79(1996),911-919;Anderson, Science 2
56(1992),808-813;Isner, Lancet 348(1996),370-374;Muhlhauser, Circ.Res.77
(1995),1077-1086;Wang, Nature Medicine 2(1996),714-716;ＷＯ９４／２９４
６９；ＷＯ９７／００９５７、Onodua, Blood 91(1998),30-36;Verzeletti, Hum
. Gene Ther.9(1998),2244-2251;Verma, Nature 389(1997),239-242;米国特許第
５,５８０,８５９号；米国特許第５,５８９,４６６号；米国特許第４,３９４,４
４８号またはSchaper, Current Opinion in Biotechnology 7(1996),635-640、
およびその中の引用文献を参照。
【００４３】 本発明のポリヌクレオチドおよびベクターは、細胞中への直接導入またはリポ
ソームまたはウイルスベクター（たとえば、アデノウイルス、レトロウイルス）
を介した導入のためにデザインすることができる。好ましくは、該細胞は、生殖
細胞、胚細胞、または卵細胞またはそれらに由来する細胞であり、最も好ましく
は該細胞は幹細胞である。この態様は、たとえば一つの特異性が腫瘍抗原に対す
るものであり、これによって腫瘍細胞や可溶性腫瘍抗原などのその一部の嵌入、
プロセシングおよび提示を容易にするものなどの、本発明の２特異的抗体に特に
適している。
【００４４】 さらに、本発明は、本発明の抗体の鎖の可変ドメインをコードするポリヌクレ
オチドを、任意に本発明の抗体の他の鎖の可変ドメインをコードする本発明のポ
リヌクレオチドとともに含むベクター、とりわけ遺伝子操作において通常用いら
れるプラスミド、コスミド、ウイルスおよびバクテリオファージに関する。好ま
しくは、該ベクターは、発現ベクターおよび／または遺伝子伝達またはターゲテ
ィングベクターである。レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ関連ウイ
ルス、ヘルペスウイルス、またはウシ乳頭腫ウイルスなどのウイルスに由来する
発現ベクターを、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを標的細胞集団に送
達するのに用いることができる。組換えウイルスベクターを構築するために当業
者によく知られた方法を用いることができる；たとえば、Sambrook, Molecular
Cloning A Laboratory Manual、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ
ー（１９８９）ニューヨークおよびAusubel, Current Protocols in Molecular
Biology、グリーン・パブリシング・アソシエーツ・アンド・ウイリー・インタ
ーサイエンス、ニューヨーク（１９８９）を参照。
【００４５】 別法として、標的細胞への送達のために本発明のポリヌクレオチドおよびベク
ターをリポソーム中に再構築することができる。本発明のポリヌクレオチド（た
とえば、免疫グロブリンの重鎖および／または軽鎖可変ドメインをコードする配
列および発現制御配列）を含むベクターをよく知られた方法（細胞宿主の種類に
より変わってよい）により宿主細胞中に移すことができる。たとえば、塩化カル
シウムトランスフェクションを一般に原核細胞に用いることができ、一方、リン
酸カルシウム処理またはエレクトロポレーションを他の細胞宿主に用いることが
できる；たとえば、Sambrook（上掲）を参照。発現されたら、本発明の全抗体、
その二量体、個々の軽鎖および重鎖、または他の免疫グロブリン形態を、硫酸ア
ンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気
泳動などを含む標準法に従って精製できる；たとえば、Scopes, "Proteins Puri
fication", Springer-Verlag、ニューヨーク（１９８２）を参照。医薬に使用す
るには少なくとも約９０〜９５％の均質性の実質的に純粋な免疫グロブリンが好
ましく、９８〜９９％またはそれ以上の均質性が最も好ましい。精製されたら、
ついで、所望により部分的にまたは均質になるまで、ポリヌクレオチドを治療に
（体外的な使用を含む）またはアッセイ手順を開発または行うのに用いることが
できる。
【００４６】 本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターで形質転換した宿
主細胞に関する。該宿主細胞は原核細胞であっても真核細胞であってもよい。宿
主細胞中に存在する本発明のポリヌクレオチドまたはベクターは、宿主細胞のゲ
ノム中に組み込むかまたは染色体外に保持してよい。
【００４７】 宿主細胞はいかなる原核細胞または真核細胞であってもよい。「原核」なる語
は、本発明の抗体または対応免疫グロブリン鎖の発現のためにＤＮＡまたはＲＮ
Ａ分子で形質転換またはトランスフェクションできるすべての細菌を意味する。
原核宿主は、たとえば、大腸菌、S. typhimurium、Serratia marcescens、Bacil
lus subtilisなどのグラム陰性菌およびグラム陽性菌を含む。「真核」なる語は
、これらに限られるものではないが、昆虫、真菌、植物、動物またはヒト細胞を
含むことを意味する。好ましい真菌細胞は、たとえば、Saccharomyces属のもの
、とりわけ種S. cerevisiaeである。本発明の抗体をコードするポリヌクレオチ
ドは、当業者に一般に知られた方法を用いて宿主に形質転換またはトランスフェ
クションするのに用いることができる。特に好ましいのは、真核細胞または原核
細胞の形質転換またはトランスフェクションの目的のために、それぞれ本発明の
ＤＣを認識する抗体のコード配列を含むプラスミドまたはベクターの使用である
。
【００４８】 融合され作動可能に連結した遺伝子を調製し、該遺伝子をたとえば哺乳動物細
胞および細菌で発現する方法は当該技術分野でよく知られている（Sambrookら、
Molecular Cloning: A Laboratory Manual、コールド・スプリング・ハーバー・
ラボラトリー、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、１９８９）。
その中に記載された遺伝子構築物および方法を用いて本発明の抗体を真核または
原核宿主で発現するのに用いることができる。一般に、挿入したポリヌクレオチ
ドの効率的な転写を容易にするプロモーター配列を含む発現ベクターを宿主と関
連して用いる。発現ベクターは一般に、複製起点、プロモーターおよびターミネ
ーター、並びに形質転換細胞の表現型選択を付与する特定の遺伝子を含む。形質
転換宿主は当該技術分野で知られた方法に従って発酵槽で増殖させ、培養して最
適の細胞増殖を達成することができる。ついで、本発明の抗体またはその対応免
疫グロブリン鎖を増殖培地、細胞溶解液または細胞膜フラクションから単離する
ことができる。たとえば微生物により発現された本発明の抗体または免疫グロブ
リン鎖の単離および精製は、たとえば分取クロマトグラフィー分離、およびたと
えば本発明の抗体の定常領域に対するモノクローナル抗体またはポリクローナル
抗体の使用を含む免疫学的分離などの通常の手段によるものであってよい。
【００４９】 それゆえ、他の態様において、本発明は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からの
未熟および成熟樹状細胞（ＤＣ）のＤＣ集団のＤＣを認識することができる抗体
またはその機能的断片または誘導体の製造方法であって、 （ａ）本発明の細胞を培養し、ついで （ｂ）該抗体、またはその機能的断片または免疫グロブリン鎖を該細胞または培
地から単離する ことを含む方法に関する。
【００５０】 本発明はまた、細胞を本発明のポリヌクレオチドまたはベクターで遺伝子操作
することを含む、本発明の抗体またはその対応免疫グロブリン鎖を発現しうる細
胞の製造方法にも関する。好ましくは、かくして発現された免疫グロブリン鎖は
トランスフェクションした細胞の細胞表面上に提示される。この態様並びに本明
細書で言及する幾つかの他の態様は、上記に記載したようなファージ展示法に適
用することができる。本発明の方法により得られた細胞は、たとえば本発明の抗
体とその抗原との相互作用を試験するのに用いることができる。上記方法により
得られた細胞はまた、以下に記載するスクリーニング法にも用いることができる
。さらに、本発明のポリヌクレオチド、ベクターまたは細胞を含むトランスジェ
ニック動物、好ましくは哺乳動物は、本発明の抗体の大スケールでの製造に用い
ることができる。
【００５１】 さらに、本発明は、本発明のポリヌクレオチドによりコードされる、または上
記方法により得られる、または上記方法により製造される細胞からの本発明の抗
体またはその断片または誘導体または免疫グロブリン鎖に関する。本発明の抗体
は、一般にモノクローナル抗体に基づく療法を受けることのできる実質的にあら
ゆる疾患を治療するのに個々に用途を見出すであろう。とりわけ、該免疫グロブ
リンは、受動免疫または補体媒体溶解などによる望まない細胞または抗原の除去
に用いることができ、すべて多くの先行抗体に付随する実質的な免疫反応（たと
えば、アナフィラキシーショック）を伴うことなく行える。
【００５２】 本発明の抗体に関して治療に適した典型的な疾患状態としては、心臓、肺、腎
臓、肝臓などの臓器移植を受けた患者での移植片対宿主病および移植拒絶反応が
挙げられる。他の疾患としては、１型糖尿病、多発性硬化症、慢性関節リウマチ
、全身性エリテマトーデス、および重症筋無力症などの自己免疫疾患が挙げられ
る。本発明の抗体の誘導体は当業者に知られた方法、とりわけペプチドミメチッ
ク（peptidomimetics）により製造できる。ペプチドミメチックコンビナトリア
ルライブラリーの生成および使用方法は、たとえば、Ostresh, Methods in Enzy
mology 267(1996),220-234およびDorner, Bioorg.Med.Chem.4(1996),709-715に
記載されている。さらに、Ｍ−ＤＣ８抗原などの抗原の三次元および／または結
晶学的構造は、ペプチドミメチック抗体誘導体のデザインに用いることができる
（Rose, Biochemistry 35(1995),12933-12944;Rutenber, Bioorg.Med.Chem.4(19
96),1545-1558）。
【００５３】 この文脈において、本発明による抗体を当該技術分野で知られた常法によりさ
らに修飾できることも理解される。本発明による抗体を提供することにより、そ
の結合活性に関連する部分を決定することも可能である。このことにより、結合
活性にとって重要な本発明の抗体からのアミノ酸配列と、他の機能性のアミノ酸
配列、たとえば核局在シグナル、トランス活性化ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン
、ホルモン結合ドメイン、タンパク質タグ（ＧＳＴ、ＧＦＰ、ｈ−ｍｙｃペプチ
ド、Ｆｌａｇ、ＨＡペプチド）（異種タンパク質に由来するものであってよい）
とを含むキメラタンパク質の構築が可能となる。
【００５４】 本発明の抗体、抗原およびエピトープは、たとえば、膵臓の島（β）細胞など
のホルモン産生細胞、胸腺細胞、ミエリン鞘を含む中枢神経系の神経膠細胞、滑
液細胞または滑液組織、ブドウ膜の細胞または組織、または血管壁の細胞または
組織のタンパク質または糖タンパク質に対する自己免疫応答を有する患者の治療
に用いることができる。そのような治療は、たとえば、本発明の抗体、抗原また
はエピトープを投与することにより行うことができる。そのような投与は、非標
識および標識抗体または抗原を利用できる。たとえば、非標識の抗原またはエピ
トープを有利に利用するに際しては、たとえば免疫応答を刺激するには小さすぎ
るが自己免疫応答の継続に結合または阻止するには充分に大きな断片である抗原
の形態であってよい。たとえば、本発明の抗原を酵素消化してエピトープサイズ
のペプチド（典型的に長さが５〜１２アミノ酸）にし、それによって自己免疫疾
患の患者の体液中、またはＤＣの表面上に存在するＦａｂ部分に結合することが
できる。
【００５５】 別のやり方として、本発明の抗体、抗原およびエピトープを治療剤に結合させ
て投与することができる。これら治療剤は、本発明の抗体または抗原に直接また
は間接的に結合させることができる。間接的な結合の一つの例は、スペーサー残
基の使用である。これらスペーサー残基は、今度は不溶性または可溶性であって
よく（Dienerら、Science,231:148,1986）、標的部位で抗原から薬剤を放出でき
るように選択することができる。免疫療法のために本発明の抗体、抗原およびエ
ピトープに結合させることのできる治療剤の例は、医薬、放射性同位元素、レク
チン、および毒素である。本発明の抗体、抗原およびエピトープに結合させるこ
とのできる医薬としては、マイトマイシンＣ、ダウノルビシン、およびビンブラ
スチンなどの古典的に医薬として言及されている化合物が挙げられる。
【００５６】 たとえば、免疫療法のために放射性同位元素を結合した本発明の抗体、抗原ま
たはエピトープを使用するに際しては、白血球の分布並びに安定性および放射電
磁波などの要素に依存してある種の同位元素が他の同位元素よりも好ましい。自
己免疫応答に応じて、ある種のエミッターが他のエミッターよりも好ましい。一
般に、α粒子およびβ粒子を放射する放射性同位元素が免疫療法には好ましい。
好ましいのは、212Ｂｉなどの短飛程で高エネルギーのαエミッターである。治
療目的で本発明の抗体、抗原またはエピトープに結合することのできる放射性同
位元素の例は、125Ｉ、131Ｉ、90Ｙ、67Ｃｕ、212Ｂｉ、212Ａｔ、211Ｐｂ、47
Ｓｃ、109Ｐｄおよび188Ｒｅである。
【００５７】 レクチンは、特定の糖残基に結合する、通常、植物材料から単離されるタンパ
ク質である。多くのレクチンはまた、細胞を凝集させ、リンパ球を刺激すること
ができる。しかしながら、リシンは免疫療法に用いられる毒性のレクチンである
。このことは、毒性に関与するリシンのα鎖を抗体分子に結合させることによっ
て毒性作用の部位特異的な送達を可能とすることによって行う。
【００５８】 毒素は、植物、動物または微生物によって産生される有毒物質であり、充分な
投与量ではしばしば致死性である。ジフテリア毒素はCorynebacterium diphther
iaによって産生される物質であり、治療に用いることができる。この毒素はαお
よびβサブユニットからなり、各サブユニットは適当な条件下で分離することが
できる。毒性のＡ成分は、抗体または抗原に結合させて、それぞれＤＣまたは該
抗原のレセプターを発現するＴ細胞への部位特異的な送達に用いることができる
。
【００５９】 本発明の抗体、抗原またはエピトープに結合させることのできる上記に記載し
たような他の治療剤並びにエクスビボおよびインビボ治療プロトコールは、当業
者には知られており、または容易に確かめることができる。適当な場合はいつで
も、当業者はタンパク質物質自体の代わりに上記抗体、抗原またはエピトープの
いずれか一つをコードするポリヌクレオチドまたは対応ベクターを用いることが
できる。さらに、本発明による方法に従って得られ任意に修飾した樹状細胞およ
び／またはＴ細胞を上記態様に従って用いることができる。
【００６０】 上記に従って、本発明はさらに、 （ａ）本発明の抗体の結合部位のドメインまたは本発明の抗原またはエピトープ
；および （ｂ）少なくとも一つの他のドメインであって、共有結合または非共有結合によ
り結合したもの を含むポリペプチドに関する。
【００６１】 本発明のポリペプチドに含まれる該結合部位ドメインは、本発明の抗体の少な
くとも一つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。当業者であれば、抗体の各可変
ドメイン（重鎖ＶHおよび軽鎖ＶL）が、４つの比較的保存されたフレームワーク
領域すなわち「ＦＲ」によってフランキングされた３つの高度可変領域（しばし
ば相補性決定領域あるいは「ＣＤＲ」と呼ばれる）を含むことを理解しているで
あろう。本発明の抗体の可変領域に含まれるＣＤＲは、たとえば、Kabat, "Sequ
ences of Proteins of Immunological Interest"（米国保健社会福祉省、第３版
、１９８３、第４版、１９８７、第５版、１９９０）に従って決定できる。当業
者であれば、所望の特異性および生物学的機能を有する他のポリペプチドまたは
抗体を構築するために本発明の抗体の結合部位ドメインまたは本発明の抗原また
はエピトープを用いることができることを容易に理解するであろう。それゆえ、
本発明は、本発明の結合部位ドメインまたは抗原またはエピトープを含むポリペ
プチドおよび抗体にも関する。当業者であれば、上記結合部位またはＣＤＲを用
い、当該技術分野で知られた方法、たとえばＥＰ−Ａ１ ０ ４５１ ２１６、Ｅ
Ｐ−Ａ１ ０ ５４９ ５８１およびＷＯ８８／０９３４４などに記載された方法
に従って抗体を構築できることが容易に理解されるであろう。
【００６２】 組換え２官能性抗体構築物などの多価ポリペプチドは、とりわけ医学分野にお
いて、たとえば癌や自己免疫疾患の新たな治療法の開発において、または細胞シ
グナル伝達経路の分析および調節のための興味のもてる手段として、ますます重
要な治療学的および科学的役割を果たしつつある。たとえば、Ｔ細胞上のＣＤ３
活性化抗原を腫瘍細胞上の腫瘍関連抗原と架橋させることにより、２特異的な一
本鎖抗体は両細胞を一緒に引き合わせ、細胞−細胞接触の間に腫瘍細胞を有効に
溶解させることができる（Mack, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92(1995)7021-7025
）。対応するアプローチが他の標的細胞（たとえば、ウイルス感染細胞）に対し
ておよび他のエフェクター細胞集団（たとえば、ＮＫ細胞および単核食細胞）の
補充（recruitment）のために開発されており、または開発されつつある。
【００６３】 ターゲティング機構として抗体断片を含む２官能性の融合タンパク質を用い、
選択した細胞集団上の所定の表面分子に多数の異なるレセプターおよびリガンド
を特異的に結合させることができる。細胞の機能または細胞の活性化または分化
の状態を調節するために、同じ細胞上の表面分子を２特異的抗体により架橋でき
ることは特に興味深い。この種のアプローチが可能な応用は、多くの自己免疫疾
患において病原的な役割を果たしている自己攻撃性のＢまたはＴリンパ球にアネ
ルギーを誘発することである。広範な科学的および治療学的な関連性に関しては
、機能性の抗原結合部位を含む組換えポリペプチドを製造するための有効かつ再
現可能な方法が特に重要である；そのような方法は、細菌および哺乳動物細胞で
発現させることにより、たとえば機能的に活性な２特異的抗体構築物を生成する
。
【００６４】 該組換え２官能性一本鎖タンパク質は、通常、異なるｓｃＦｖ−抗体断片によ
って構築されており、各断片はそれぞれ一つの免疫グロブリン可変重鎖（ＶH）
および一つの可変軽鎖（ＶL）抗原結合ドメインからなる。別の態様では、その
ようなタンパク質は、そのような抗体断片と一つの非免疫グロブリン部分とを含
んでいてよい。すべての機能性のドメインは単一のポリペプチド鎖上に位置して
おり、可撓性のグリシン−セリン−または他の適当なペプチドリンカーにより連
結されている。２官能性ポリペプチド鎖は、対応のＤＮＡ配列（任意のタンパク
質−タグ、好ましくはポリヒスチジン−タグをさらにコードすることによってた
とえばニッケル−キレート−カラムを用いて組換えタンパク質の容易な精製を可
能にするものであってよい）で哺乳動物細胞またはより好ましくはないが他の宿
主細胞をトランスフェクションすることにより機能性のタンパク質として製造す
ることができる。ＣＨＯ細胞において機能的に発現された２特異的一本鎖抗体の
例で示されているように、ｓｃＦｖ−抗体断片は原則として２官能性一本鎖構築
物のＮ末端部分かまたはＣ末端部分のいずれかとして抗原に結合することができ
る（Mack, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92(1995)7021-7025）。
【００６５】 本発明の好ましい態様において、該少なくとも一つのさらなるドメインは、生
物学的活性に適したコンホメーションを有するエフェクタータンパク質、イオン
を封鎖しうるアミノ酸配列、および固相支持体または前以て選択した抗原に選択
的に結合できるアミノ酸配列よりなる群から選ばれたポリペプチドを含む。
【００６６】 好ましくは、該エフェクタータンパク質は、酵素、毒素、レセプター、結合部
位、生合成抗体結合部位、成長因子、細胞分化因子、リンホカイン、サイトカイ
ン、ホルモン、遠隔的に（remotely）検出しうる残基、抗代謝産物または抗原で
ある。該抗原は、たとえば、腫瘍抗原、ウイルス抗原、微生物抗原、アレルゲン
、自己抗原、ウイルス、微生物、ポリペプチド、ペプチドまたは複数の腫瘍細胞
であってよい。
【００６７】 さらに、イオンを封鎖しうる該配列は、好ましくはカルモジュリン、メタロチ
オネイン、その断片、またはグルタミン酸、アスパラギン酸、リジンおよびアル
ギニンの少なくとも一つに富むアミノ酸配列から選ばれる。 さらに、固相支持体に選択的に結合しうる該ポリペプチド配列は、正または負
に荷電したアミノ酸配列、システイン含有アミノ酸配列、アビジン、ストレプト
アビジン、またはStaphylococcusタンパク質Ａの断片であってよい。
【００６８】 上記エフェクタータンパク質およびアミノ酸配列は、プロ形（それ自体活性で
あっても活性でなくてもよく、たとえばある種の細胞環境に入ったときに除かれ
てよい）で存在してよい。 本発明の最も好ましい態様において、該レセプターは、Ｔ細胞活性化に重要な
コスティミュラトリー表面分子であるか、またはエピトープ結合部位もしくはホ
ルモン結合部位を含む。 本発明のさらに最も好ましい態様において、該コスティミュラトリー表面分子
はＣＤ８０（Ｂ７−１）またはＣＤ８６（Ｂ７−２）である。
【００６９】 有利には、ＶHドメインおよび／またはＶLドメインを含む該ドメインは、該ド
メイン間に配置した可撓性のリンカーにより、好ましくはポリペプチドリンカー
により連結されており、その際、該ポリペプチドリンカーは、該ポリペプチドが
水溶液中に配置されたときに結合に適したコンホメーションを担う場合に該ドメ
インの一方のＣ末端と該ドメインの他方のＮ末端との間の距離を隔てるに充分な
長さの複数の親水性ペプチド結合アミノ酸を含む。
【００７０】 さらに他の態様において、本発明は発現に際して上記抗原、エピトープまたは
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。該ポリヌクレオチドは、
該ポリペプチドの適正な転写および翻訳を確実にするために当該技術分野で知ら
れた適当な発現制御配列に融合していてよい。さらに、該ポリヌクレオチドはベ
クター中に含まれていてよく、該ベクターはさらに選択マーカーを含んでいてよ
い（上記参照）。
【００７１】 さらに他の態様において、本発明は上記ポリヌクレオチドまたはベクターを含
む細胞に関する。好ましくは、該細胞は、該ポリペプチドの治療用の使用を考慮
する場合には哺乳動物細胞である。もちろん、酵母および細菌細胞もまた、とり
わけ生成する抗原、エピトープまたはポリペプチドを診断手段として用いる場合
に用いることができる（上記参照）。 他の態様において、本発明は、上記抗原またはポリペプチドの製造方法であっ
て、本発明の細胞を該抗原またはポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、
ついで該抗原またはポリペプチドを該細胞または培養液から単離することを含む
方法に関する（上記参照）。
【００７２】 それゆえ、本発明は、本発明のＤＣのエピトープまたは抗原に対するアフィニ
ティーおよび特異性を有する結合部位を含む、または該抗原またはエピトープを
含むポリペプチドの組換え製造を可能にする。上記から明らかなように、本発明
は、治療および診断アプローチにおけるあらゆる使用のためにそのような結合部
位または抗原またはエピトープを含むポリペプチドの大きなファミリーを提供す
る。当業者には、該結合部位ドメインおよび抗原またはエピトープは、たとえば
薬剤ターゲティングおよび造影応用のために上記他の残基にさらに結合できるこ
とが明らかであろう。そのような結合は、該ポリペプチドの発現後に付着部位に
対して化学的に行うことができるし、あるいは結合生成物をＤＮＡレベルで本発
明のポリペプチド中に操作して入れることもできる。
【００７３】 ついで、該ＤＮＡを適当な宿主系で発現させ、発現したタンパク質を所望なら
回収および復元させる。上記に記載したように、結合部位ドメインは抗体、好ま
しくは本発明のモノクローナル抗体の可変領域からのものであるのが好ましい。
この観点において、ハイブリドーマ法は、免疫応答を生じる本質的にあらゆる所
望の物質に対する抗体を分泌する細胞株を産生することを可能にする。ついで、
免疫グロブリンの軽鎖および重鎖をコードするＲＮＡを該ハイブリドーマの細胞
質から得ることができる。ｍＲＮＡの５'末端部分は、本発明の方法に使用する
ｃＤＮＡを調製するのに用いることができる。ついで、本発明のポリペプチドを
コードするＤＮＡを細胞中、好ましくは哺乳動物細胞中で発現することができる
。
【００７４】 宿主細胞によっては適正なコンホメーションを達成するために復元法が必要で
ある。必要なら、通常のカセット突然変異誘発または本明細書に記載するような
他のタンパク質工学法を用い、最適の結合を探るべく点置換をＤＮＡ中で行うこ
とができる。本発明のポリペプチドの製造は、生物学的に活性なタンパク質、た
とえば酵素、毒素、成長因子、細胞分化因子、レセプター、抗代謝産物、ホルモ
ンまたは種々のサイトカインまたはリンホカインのアミノ酸配列（または対応Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡ配列）に関する知見に依存する。そのような配列は、文献に報
告されているかまたはコンピューター化したデータバンクから利用できる。
【００７５】 たとえば、本発明のポリペプチドは、本発明の抗体、好ましくはＭ−ＤＣ８の
一本鎖Ｆｖ断片とヒトコスティミュラトリータンパク質ＣＤ８０（Ｂ７−１）の
細胞外部分とがペプチドリンカーによって連結されたものとして構築することが
できる。ＣＤ８０コスティミュラトリータンパク質はＩｇスーパーファミリーに
属する。該タンパク質は２６２のアミノ酸からなる非常にグリコシル化されたタ
ンパク質である。一層詳細な記載は、Freeman G.J.ら, J.Immunol.143,(1989)27
14-2722によって刊行されている。安定な発現は、Kaufmann R.J. (1990)Methods
Enzymol.185,537-566によって記載されているように、たとえばＤＨＦＲ欠失Ｃ
ＨＯ細胞で行うことができる。ついで、Ｎｉ−ＮＴＡ−カラムを用いることによ
り、Ｃ末端に付着したＨｉｓ−タグを介して該タンパク質を精製することができ
る（Mackら, Proc,Natl.Acad.Sci.U.S.A.92(1995)7021-7025）。結合特性を分析
するため、種々のＥＬＩＳＡアッセイを行うことができる。たとえば、１７−１
Ａ抗原への結合の分析は、記載に従って得られる（Mackら, Proc,Natl.Acad.Sci
.U.S.A.92(1995)7021-7025）可溶性の１７−１Ａ抗原を用い、ＧＡ７３３−２と
しても知られる１７−１Ａ抗原の最初の２６４アミノ酸をコードするＤＮＡをＣ
ＨＯ細胞中で安定に発現させることによって行うことができる（Szala, Proc.Na
tl.Acad.Sci.U.S.A.87(1990)3542-3546）。
【００７６】 他の態様において、本発明は、上記ＤＣを末梢血から単離または同定する方法
であって、工程： （ａ）末梢血のサンプルを本発明の抗体と接触させ； （ｂ）抗体／ＤＣ複合体の存在を検出し；および／または （ｃ）該抗体またはその機能性の断片に結合したＤＣを回収する を含む方法に関する。
【００７７】 ＤＣは、最も効率的な抗原提示細胞として、その成熟の異なる段階を反映して
いると思われる、表現型および機能面でのかなりの異質性を明らかにしている1, 2,3 。最近に提唱されたモデルによれば、初期のＤＣは脊椎動物の種々の部位で
殆どいたるところで見出され、その細胞質膜上のＭＨＣ分子による提示のために
外来抗原を効率的に取り込み、プロセシングしている4,5。その後、抗原の取り
込みが完了すると、ＤＣはさらに分化を受けて異なるパターンの表面分子を発現
し、移動性となる。この段階でＭＨＣおよびコスティミュラトリー分子の発現が
非常に増加すると、ＤＣはナイーブなＴリンパ球を初回抗原刺激しうるのみなら
ずＴｈ１またはＴｈ２型に対するサイトカイン発現のプログラムをも指令できる 6,7 。ＤＣがＴリンパ球を初回抗原刺激できる際立った能力は、免疫調節戦略の
開発にとってＤＣを特に魅力的なものにしている。とりわけ、所定の腫瘍ペプチ
ドまたはウイルス抗原に対する細胞溶解Ｔ細胞を治療用にエクスビボで初回抗原
刺激するためにＤＣを用いることが提唱されている8。
【００７８】 同様に、ＤＣは自己免疫疾患またはアトピー性疾患を攻略するためにＴ細胞を
再プログラムする手段としても機能する。本発明以前のそのような治療戦略の開
発における主たる障害は、血中のＤＣの頻度が極めて低いことであった。これま
でに報告されているわずかなＤＣ特異的マーカーは、血液ＤＣを単離するのに適
していない。ＣＤ８３はインビトロ培養においてのみ誘発され、アクチン束化タ
ンパク質ｐ５５は細胞質に限られている10。現在の単離プロトコールは、細胞系
列特異的なモノクローナル抗体を用いた細胞集団の連続的な涸渇を密度勾配遠心
分離または識別付着（differential adherence）と組み合わせたものによってい
る2,3,11。現在のところ、最も広く用いられている依然として煩雑な富化方法は
、ＣＤ３４+細胞をインビトロ培養してそのような（稀な）先祖細胞から幾日も
かけてＤＣを発生および分化させることである12,13,14。
【００７９】 Ｍ−ＤＣ８モノクローナル抗体によって例示されるような本発明による新規な
抗体の提供は、今や、特徴的な表面表現型と典型的な機能的活性を有するヒトＤ
Ｃの新規で独特の集団を精製することを可能にするものである。並外れた均質性
を示すこのＤＣ集団は際立っており、精製ＣＤ８ Ｔ細胞のアロ抗原特異的な細
胞溶解性細胞への分化を促進する。
【００８０】 単離したＤＣ（Ｍ−ＤＣ８+細胞とも呼ばれる）は循環ＤＣの実質画分を含み
、未熟ＤＣの表現型および機能特性を示す。培養するとＭ−ＤＣ８+細胞は、Ｔ
細胞を刺激する際立った能力によって示されるように成熟ＤＣへと分化する。そ
れゆえ、本発明の抗体はヒトＤＣの検出および直接的な単離に適した手段として
機能しうる。単離したＭ−ＤＣ８+細胞の種々の用途が本明細書に記載した本発
明により包含され、それには、これらに限られるものではないが、ＡＰＣとして
のＭ−ＤＣ８+細胞の使用、適合性の（adoptive）細胞免疫療法に使用するため
の抗原特異的なＴ細胞のインビトロでの活性化および拡張、抗原パルス（antige
n-pulsed）ＤＣのワクチンとしてのインビボ投与、およびワクチン開発のための
抗原性エピトープの同定が含まれる。それゆえ、Ｍ−ＤＣ８+細胞は感染性疾患
および癌に対する免疫療法に使用するため、並びに自己免疫疾患の治療のための
理想的な候補である。この観点から、本発明の抗体は、ＤＣ細胞と標的細胞上の
抗原とに向けられた２特異的抗体を生成することにより、ＤＣへの標的細胞のイ
ンビボ補充に用いることができる。
【００８１】 それゆえ、本発明はまた、本発明の抗体により認識され、および／または本発
明の抗原またはエピトープを含むまたは上記方法により得ることのできる、上記
樹状細胞にも関する。本発明の方法に従って単離したヒト樹状細胞は、たとえば
、Ｔ細胞を刺激するため、および抗原特異的なＴ細胞媒体免疫応答の誘発のため
に抗原を提示するために用いることができる。本明細書に記載するヒト樹状細胞
の単離集団はまた広範囲の応用に用いることができ、それにはこれらに限られる
ものではないが、癌および感染疾患に対する適合性の免疫療法に使用するための
抗原特異的なＴ細胞の活性化および拡張が含まれる。さらに、本発明のヒト樹状
細胞は抗原でパルスすることができ、それゆえワクチンおよび／または免疫療法
剤としておよび免疫療法のための新規な抗原標的の同定のために用いることがで
きる。
【００８２】 本発明のＤＣは、たとえば組換え核酸分子を発現するためにさらに修飾できる
ことも当業者には明らかである。たとえば、本発明のＤＣをサイトカインまたは
シグナル伝達分子の遺伝子でトランスフェクションして免疫応答をインビトロま
たはインビボで調節させることができる。たとえば、分泌されたＩＬ−１２がＴ
細胞刺激のミクロな環境に存在する場合にはＴ細胞のＴｈ１型のＴヘルパー細胞
への分化が指令され、一方、ＩＬ−４はＴ細胞をＴｈ２型のＴヘルパー細胞にプ
ログラムする（Seder & Paul, Ann.Rev.Immunol.12(1994),635-673）。かかる修
飾は当該技術分野で知られた方法に従って行うことができる（上掲文献参照）。
組換えＤＮＡで細胞をトランスフェクションする標準法は分子生物学の当業者に
よく知られている（たとえば、上記ＷＯ９４／２９４６９参照）。さらに、遺伝
子療法は、本発明の組換えＤＮＡ分子またはベクターを患者に直接投与するかま
たはＤＣのような細胞を該ポリヌクレオチドまたはベクターでエクスビボでトラ
ンスフェクションし、トランスフェクションした細胞を患者に注入することによ
り行うことができる。
【００８３】 さらに、生殖細胞中への遺伝子伝達を行う研究は生殖生物学でも最も進展の著
しい分野の一つである。遺伝子療法は治療用遺伝子を細胞中へエクスビボまたは
インビボ法により導入することに基づくものであるが、遺伝子伝達の最も重要な
応用の一つである。インビトロまたはインビボ遺伝子療法に適したベクターおよ
び方法は、上記に記載したように文献に記載されており、当業者にも知られてい
る。ポリヌクレオチドおよびベクターは、細胞中への直接的な導入のため、ある
いは該組換えＤＮＡ分子を含むリポソームまたはウイルスベクター（たとえば、
アデノウイルス、レトロウイルス）を介した導入のためにデザインすることがで
きる。該細胞は、好ましくは生殖細胞、胚細胞、幹細胞または卵細胞またはそれ
らに由来する細胞である。本発明による医薬組成物はまた、ＤＣにより媒体され
るものとしてこれまでに未知の疾患の治療にも用いることができる。胚細胞は、
たとえばNagy, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)8424-8428に記載されているよ
うに胚幹細胞であってよい。
【００８４】 導入したポリヌクレオチドおよびベクターは該細胞中に導入した後に遺伝子産
物を発現し、好ましくは該細胞の生涯を通じてこの状態に留まることが理解され
なければならない。たとえば、適当な制御配列の制御下にポリヌクレオチドを発
現する細胞株は、当業者によく知られた方法により操作することができる。ウイ
ルス由来の複製起点を含む発現ベクターを用いるよりも、宿主細胞は本発明のポ
リヌクレオチドまたはベクターおよび選択マーカーで同じかまたは別々のベクタ
ー上にて形質転換することができる。外来ＤＮＡの導入後、操作した細胞を１〜
２日間、富化培地で増殖させ、ついで選択培地に切り替える。組換えプラスミド
中の選択マーカーは該選択に対して耐性を付与し、その染色体中にプラスミドが
安定に組み込まれた細胞の選択を可能にし、増殖してフォーカスを生成し、これ
を今度はクローニングし、細胞株へ拡張することができる。そのように操作した
細胞はまた、以下に記載するスクリーニング法において特に有用である。
【００８５】 多くの選択系を採用することができ、それには、それぞれｔｋ細胞、ｈｇｐｒ
ｔ細胞またはａｐｒｔ細胞でのヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wigler, Ce
ll 11(1977),223）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラ
ーゼ（Szybalska, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48(1962),2026）、およびアデニン
ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowy, Cell 22(1980),817）が含まれるが
これらに限られるものではない。また、ｄｈｆｒ（メトトレキセートに対する耐
性を付与する）に対する（Wigler, Proc.Natl.Acad.Sic.USA 77(1980),3567;O'H
are, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78(1981),1527）、ｇｐｔ（ミコフェノール酸に
対する耐性を付与する）に対する（Mulligan, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78(1981
),2072）、ｎｅｏ（アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与する）に対
する（Colberre-Garapin, J.Mol.Biol.150(1981),1）、ｈｙｇｒｏ（ハイグロマ
イシンに対する耐性を付与する）に対する（Santerre, Gene 30(1984),147）、
またはｐｕｒｏｍｙｃｉｎに対する（pat、ピューロマイシンＮ−アセチルトラ
ンスフェラーゼ）選択に基づいて抗代謝産物耐性を用いることができる。さらな
る選択遺伝子も記載されており、たとえば、ｔｒｐＢ（細胞がトリプトファンの
代わりにインドールを利用することを可能にする）；ｈｉｓＤ（細胞がヒスチジ
ンの代わりにヒスチノールを利用することを可能にする）（Hartman, Proc.Natl
.Acad.Sci.USA 85(1988),8047）；およびＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラー
ゼ）（オルニチンデカルボキシラーゼインヒビター、２−(ジフルオロメチル)−
ＤＬ−オルニチン、ＤＦＭＯに対する耐性を付与する）（McConlogue, 1987, In
: Current Communications in Molecular Biology、コールド・スプリング・ハ
ーバー・ラボラトリー編）が挙げられる。
【００８６】 Ｍ−ＤＣ８+細胞は未熟ＤＣに類似しているにもかかわらず、極めて強力にＴ
細胞を刺激する。この活性は、Ｍ−ＤＣ８+細胞がインビトロで培養された後に
その細胞表面上でのＭＨＣクラスII発現が増大しコスティミュラトリー分子の提
示が上昇したことを反映している。同種Ｔ細胞と一緒に培養するとＭ−ＤＣ８+
細胞上のこれら分子を特に強力に上方制御する（upregulate）と思われる。Ｔ細
胞を活性化するためにＤＣを用いる種々の方法が記載されている（たとえば、Ｗ
Ｏ９４／０２１５６を参照）。
【００８７】 それゆえ、さらなる態様において、本発明は、Ｔ細胞を本発明の樹状細胞（抗
原に暴露されているかまたは抗原を発現して該抗原に応答してＴ細胞が増殖また
は細胞障害性となるように活性化する）とともに培養することを含む、活性化さ
れた抗原特異的ヒトＴ細胞をインビトロで製造する方法に関する。Ｔ細胞の刺激
のために抗原性分子をＤＣにより提示させるのに用いることのできる種々の方法
が存在する。これら方法は当業者には知られている。ある個人のＭＨＣクラスＩ
またはクラスII遺伝子のアレル組成がわかっている場合、外来の抗原性ペプチド
を公知のアルゴリズムに従って選択し、該単離したペプチドとともにＤＣをイン
キュベートすることによりＤＣ表面のＭＨＣ分子に直接結合させることができる
。別法として、ＤＣを完全な抗原性タンパク質分子に暴露することができる。 これら分子はエンドサイトーシスされ、エンドソーム内で酵素開裂され、ＭＨＣ
クラスII分子の結合グローブ（grove）中に結合され、ついでこれら分子との複
合体としてＣＤ４+Ｔ細胞への提示のために細胞膜へ輸送される。エンドサイト
ーシスを受けたタンパク質の一部はサイトソル画分に達し、そこでプロテアソー
ム装置により開裂される（「クロスプライミング（cross priming）」）。
【００８８】 生成したペプチドは、ＴＡＰ分子により小胞体の内腔に輸送され、そこで発生
中のＭＨＣクラスＩ分子と結合され、その後、細胞障害性ＣＤ８+Ｔ細胞または
その先駆細胞へ提示すべく細胞表面に輸送される。外来タンパク質に由来する抗
原性ペプチドは、該タンパク質が発現ベクター中のコード遺伝子の形質導入後に
ＤＣ内で合成される場合にはＤＣ上のＭＨＣクラスＩ分子によって効率的に提示
され得る（上掲文献をも参照）。それゆえ、そのようにインビトロで教育された
および／または初回抗原刺激を受けたＴ細胞は、たとえば免疫に障害を受けた患
者でのＣＭＶについて記載されているような重篤なウイルス感染症に打ち勝つた
め（Walterら, New Engl.J.Med.333(1995),1038-1044）、あるいは腫瘍転移の免
疫拒絶を誘発するために（Nestleら, Nature Med.4(1998),328-332）、臨床試験
で用いることができる。それゆえ、本発明によるＤＣの迅速かつ容易な獲得は、
癌を含む種々の適応症のために適合できる免疫療法戦略をさらに開発することを
可能にする。
【００８９】 さらに、本発明は、Ｔ細胞により認識されうる抗原の同定方法であって、 （ａ）該抗原に暴露された本発明の樹状細胞とともにＴ細胞を培養し、ついで （ｂ）Ｔ細胞の増殖、Ｔ細胞の細胞障害活性またはＴ細胞のリンホカイン産生を
測定する ことを含む方法に関する。
【００９０】 好ましくは、上記方法におけるＴ細胞はＣＤ４+またはＣＤ８+細胞である。た
とえば、ＣＤ４+Ｔ細胞により認識される抗原を同定するには、ＤＣを問題の抗
原性タンパク質とともに、または異なる抗原性タンパク質の混合物とともに、ま
たは問題の抗原性タンパク質のアミノ酸配列に従ってまたはペプチドライブラリ
ーから得たペプチドにより合成した１５〜２５アミノ酸長の重複ペプチドととも
にインキュベートする。Ｔ細胞応答の決定を３、５または７日後に、［3Ｈ］チ
ミジンの取り込みを測定することにより、またはインターフェロンγなどのサイ
トカインの分泌をＥＬＩＳＡによりアッセイすることにより、または蛍光染色で
標識した特定のモノクローナル抗体で染色した後に細胞内サイトカインをＦＡＣ
Ｓ分析により評価することにより行う。
【００９１】 ＣＤ８+Ｔ細胞により認識される抗原を同定するには、ＤＣを発現ベクター中
の抗原性タンパク質またはその断片をコードする遺伝子でトランスフェクション
するか、または９〜１０アミノ酸長の重複ペプチドとともにまたはペプチドライ
ブラリーの形態で生成したペプチドとともにインキュベートする。ＣＤ８+Ｔ細
胞応答の決定は、腫瘍壊死因子αやインターフェロンγなどのサイトカインの分
泌を測定することにより行うことができる。細胞障害活性の評価は、その表面上
にＭＨＣクラスＩ分子に結合した各抗原性ペプチドを発現する51Ｃｒ−標識標的
細胞の溶解によって行うことができる。
【００９２】 さらに他の態様において、本発明は、Ｔ細胞を活性化するまたはコスティミュ
レートする化合物の同定方法であって、 （ａ）本発明の樹状細胞およびＴ細胞を、Ｔ細胞活性化に応答して検出可能なシ
グナルを生成しうる成分の存在下、スクリーニングしようとする化合物とともに
該化合物と該細胞との相互作用を可能とする条件下にて培養し、ついで （ｂ）Ｔ細胞の活性化により生成したシグナルの存在を検出する ことを含む方法に関する。
【００９３】 他の態様において、本発明は、Ｔ細胞活性化または刺激を抑制する化合物を同
定する方法であって、 （ａ）Ｔ細胞および本発明の樹状細胞を、Ｔ細胞アクチベーターによる該Ｔ細胞
の活性化に応答して検出可能なシグナルを生成しうる成分の存在下、スクリーニ
ングしようとする化合物とともに該Ｔ細胞の活性化を可能とする条件下にて接触
させ、ついで （ｂ）該アクチベーターとＴ細胞との相互作用により生成したシグナルの存在ま
たは不在を検出する ことを含む方法に関する。 Ｔ細胞によって生成したシグナルの検出は、上記または付属の実施例に記載す
るような当該技術分野で知られた方法（上記方法に容易に適合させることができ
る）に従って行うことができる。好ましくは、本発明の方法において、該樹状細
胞は培地でインキュベートすることにより抗原に暴露される。
【００９４】 本発明の方法における「化合物」は、単一の物質かまたは複数の物質（同じで
あっても同じでなくてもよい）を含む。さらに、該化合物は、当該技術分野で知
られたものであってよいが、Ｔ細胞活性化を抑制しうることはこれまで知られて
いないかまたはＴ細胞コスティミュラトリー因子として有用であることは知られ
ていなかったものであってよい。複数の化合物は、たとえば、培地に加えるかま
たは細胞中に注入することができる。
【００９５】 化合物を含むサンプルが本発明の方法で同定されたら、問題の化合物を含むも
のとして同定された最初のサンプルから該化合物を単離することができるし、ま
たはたとえばサンプルが複数の異なる化合物からなる場合にサンプル毎の異なる
物質の数が減少するように最初のサンプルをさらに分割し、これら最初のサンプ
ルの分割物について本発明の方法を繰り返すことができる。ついで、該サンプル
または化合物が、たとえば本明細書、付属の実施例または文献に記載した方法に
より所望の特性を示すか否かを決定することができる。サンプルの複雑さに依存
して、上記工程は、好ましくは本発明の方法によって同定したサンプルが限られ
た数の物質または唯一の物質を含むようになるまで、数回行うことができる。好
ましくは、該サンプルは、類似の化学的および／または物理的特性を有する物質
を含み、最も好ましくは該物質は同一である。
【００９６】 本発明の方法は、たとえば従来技術に記載された他の細胞ベースのアッセイに
従って、または付属の実施例に記載した方法を改変することにより、当業者によ
り容易に実行し、デザインすることができる。さらに、当業者であれば、本発明
の方法を行うために、たとえばインターロイキンまたは酵素など（ある種の化合
物を前駆体に変換し、該前駆体が今度はＴ細胞活性化を抑制する）のどのような
さらなる化合物および／または細胞を必要に応じて用いてよいかを容易に認識す
るであろう。本発明の化合物のそのような適合は充分に当業者の範囲内であり、
不当な実験なしに行うことができる。
【００９７】 本発明の方法の好ましい態様において、該化合物または抗原は、腫瘍抗原、ウ
イルス抗原、微生物抗原、アレルゲン、自己抗原、ウイルス、微生物、ポリペプ
チド、ペプチドまたは複数の腫瘍細胞である。 本発明に従って使用できる化合物および抗原としては、ペプチド、タンパク質
、核酸、抗体、小さな有機化合物、リガンド、ペプチドミメチック、ＰＮＡなど
が挙げられる。該化合物はまた、公知のＴ細胞アクチベーターまたはインヒビタ
ーの機能的な誘導体またはアナログであってよい。化学的な誘導体およびアナロ
グの製造方法は当業者にはよく知られており、たとえば、Beilstein, Handbook
of Organic Chemistry, Springer編、New York Inc.（米国、１００１０ニュー
ヨーク、ニューヨーク、フィフス・アベニュー、１７５番）およびOrganic Synt
hesis、ウィリー、ニューヨーク、米国に記載されている。
【００９８】 さらに、該誘導体およびアナログは、当該技術分野で知られた方法に従ってま
たはたとえば付属の実施例に記載されているようにして、その作用を試験するこ
とができる。さらに、Ｔ細胞活性化の適当なアクチベーターまたはインヒビター
のペプチドミメチックおよび／またはコンピューターによるデザインを、たとえ
ば本明細書に記載した方法に従って用いることができる。本発明の推定インヒビ
ターおよび抗原の相互作用部位の同定のため、相補的な構造モチーフのコンピュ
ーター支援サーチによって適当なコンピュータープログラムを用いることができ
る（Fassina, Immunomethods 5(1994),114-120）。タンパク質およびペプチドの
コンピューター支援デザインに適したさらなるコンピューターシステムは、従来
技術、たとえば、Berry, Biochem.Soc.Trans.22(1994),1033-1036;Wodak, Ann.N
.Y.Acad.Sic.501(1987),1-13;Pabo, Biochemistry 25(1986),5987-5991に記載さ
れている。
【００９９】 上記コンピューター分析で得られた結果は、本発明の方法、たとえば、知られ
たＴ細胞アクチベーターまたはインヒビターを最適化する方法と組み合わせて用
いることができる。適当なペプチドミメチックの同定はまた、たとえば本明細書
や付属の実施例に記載した方法に従い、連続的な化学修飾および得られた化合物
の試験を行うことによるペプチドミメチックコンビナトリアルライブラリーの合
成によって行うことができる。ペプチドミメチックコンビナトリアルライブラリ
ーの生成および使用方法は、従来技術、たとえばOstresh, Methods in Enzymolo
gy 267(1996),220-234およびDorner, Bioorg.Med.Chem.4(1996),709-715に記載
されている。さらに、ＤＣ／Ｔ細胞相互作用のインヒビターまたはアクチベータ
ーの三次元および／または結晶学的構造を、Ｔ細胞活性化のペプチドミメチック
インヒビターまたはアクチベーターのデザインのために、たとえば本発明の抗体
または抗原と組み合わせて用いることができる（Rose, Biochemistry 35(1996),
12933-12944;Rutenber, Bioorg.Med.Chem.4(1996),1545-1558）。
【０１００】 要約すると、本発明は、ＤＣおよびＴ細胞により媒体された免疫応答を調節し
うる化合物の同定方法を提供する。Ｔ細胞媒体応答を活性化することがわかった
化合物は、癌の治療、たとえば乳、前立腺、消化管、腎臓、肺、皮膚および／ま
たは他の部位などの上皮癌の治療、および細胞増殖疾患などの関連疾患の治療に
用いることができる。さらに、ウイルス疾患を特異的に抑制および／または保護
し、それによってウイルス感染またはウイルスの拡散を防ぐことも可能である。
Ｔ細胞活性化または刺激のサプレッサーとして同定された化合物は、移植拒絶を
回避するために臓器移植に用いることができる（上記参照）。
【０１０１】 従って、本発明の方法によって同定されまたは得られた化合物は、診断的な応
用において、とりわけ治療的な応用において非常に有用であることが期待される
。それゆえ、さらなる態様において本発明は、本発明の上記方法の工程（ｂ）に
おいて同定した化合物を製薬学的に許容しうる形態に調合することを含む医薬組
成物の製造方法に関する。
【０１０２】 本発明の方法に従って同定した治療的に有用な化合物は、特定の化合物に適し
た方法、たとえば経口、非経口、経皮、経粘膜（transmucosally）で、または該
化合物の作用を付与することが望まれる部位の近くに外科または移植により（た
とえば、該化合物は固形または半固形の生物学的に適合性で吸収性のマトリック
スの形態で）、患者に投与することができる。治療用の投与量は、当業者により
適当なものに決定される（上記参照）。
【０１０３】 さらに、本発明は、本発明の抗体、上記抗原またはエピトープ、上記ポリペプ
チド、本発明のポリヌクレオチド、ベクターまたは樹状細胞、本発明の方法によ
って得られるＴ細胞または上記方法によって得られる化合物を含むキットおよび
組成物に関する。好ましくは、該組成物は医薬組成物である。
【０１０４】 本発明の医薬組成物はさらに製薬学的に許容しうる担体を含んでいてよい。適
当な製薬学的担体の例は当該技術分野でよく知られており、リン酸緩衝食塩水、
水、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、種々のタイプの湿潤化剤、滅菌溶
液等がまれる。そのような担体を含む組成物はよく知られた従来法により調合す
ることができる。これら医薬組成物は、適当な投与量で患者に投与することがで
きる。適当な組成物の投与は、種々の経路により、たとえば静脈内、腹腔内、皮
下、筋肉内、局所または皮内投与により行うことができる。投与計画は、担当医
および他の臨床因子により決定されるであろう。医学の分野でよく知られている
ように、ある１人の患者に対する投与量は患者のサイズ、体表面積、年齢、投与
すべき特定の化合物、性別、投与時間および経路、一般的な健康状態、および現
在投与している他の薬剤を含む多くの因子に依存する。一般に、医薬組成物の規
則的な投与としての投与計画では、１日当たり１μｇ〜１０ｍｇ単位の範囲でな
ければならない。投与計画が連続な注入である場合は、それぞれ１分当たり、体
重１ｋｇ当たりで１μｇ〜１０ｍｇ単位の範囲でなければならない。進行は定期
的な評定によりモニターできる。投与量は変わるであろうが、ＤＮＡの静脈内投
与のための好ましい投与量は約１０6〜１０12コピーのＤＮＡ分子である。
【０１０５】 本発明の組成物は局所的にまたは全身的に投与することができる。投与は一般
には非経口的、たとえば静脈内であろう；ＤＮＡはまた、たとえば内部または外
部の標的部位へのバイオリスティックデリバリー（biolistic delivery）により
または動脈中の部位へのカテーテルにより、標的部位へ直接投与することもでき
る。非経口投与用の調製物としては、滅菌水溶液または滅菌非水溶液、懸濁液、
およびエマルジョンが挙げられる。非水溶媒の例は、プロピレングリコール、ポ
リエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、オレイン酸エチルなどの注射
可能な有機エステルである。水性担体としては、水、アルコール／水溶液、エマ
ルジョンまたは懸濁液（食塩水および緩衝媒体を含む）が挙げられる。非経口ビ
ヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロー
スおよび塩化ナトリウム、乳酸含有（lactated）リンゲル、または固定油が挙げ
られる。静脈内ビヒクルとしては、液体および栄養補給剤、電解質補給剤（リン
ゲルデキストロースに基づくものなど）などが挙げられる。たとえば、抗菌剤、
抗酸化剤、キレート化剤、および不活性ガスなどの保存剤および他の添加物も配
合できる。
【０１０６】 本発明の種々のポリヌクレオチドおよびベクターは、標準ベクターおよび／ま
たは遺伝子送達システムを用いて単独かまたは組み合わせにて、任意に適当な化
合物、たとえば腫瘍、アレルギー、または自己免疫疾患に特異的な（自己）抗原
とともに、および／または製薬学的に許容しうる担体または賦形剤とともに投与
することが本発明により認識される。投与後、該ポリヌクレオチドまたはベクタ
ーは患者のゲノム中に安定に組み込まれる。一方、ある種の細胞または組織、好
ましくはＤＣに特異的で該細胞中に持続するウイルスベクターを用いてもよい。
適当な医薬担体および賦形剤は当該技術分野でよく知られている。本発明に従っ
て調製した医薬組成物は、様々な種類の疾患（免疫不全またはウイルス感染また
は癌に関連する）の予防、治療または遅延のために用いることができる。さらに
、該医薬組成物はワクチンであってもよい。
【０１０７】 ワクチンは、とりわけ、１またはそれ以上の抗体、該抗体の断片、該抗体の誘
導体、本発明のポリヌクレオチドまたは抗原から調製できる。 たとえば、本発明のポリヌクレオチドは遺伝子ワクチンのためまたはＤＮＡワ
クチンとして用いることができる。遺伝子／ＤＮＡワクチンの投与経路は当該技
術分野でよく知られており、ＤＮＡワクチン接種はアロ免疫、抗腫瘍抗体または
抗イディオタイプ免疫応答を誘発するのに首尾良く用いられている（Tighe M.ら
、Immunology Today 19(1998),89-97）。さらに、核酸分子／ＤＮＡの接種は、
様々な様式の疾患を防御することがわかっている（Fynan, Proc.Natl.Acad.Sci.
U.S.A.90(1993),11478-11482;Boyer,Nat.Med.3(1997),526-532;Webster, Vaccin
e 12(1994),1495-1498;Montgomeryら, DNA Cell Biol.12(1993),777-783;Barry,
Nature 311(1995),632-635;XuおよびLiew, Immunology 84(1995),173-176;Zhou
g, Eur.J.Immunol.26(1996),2749-2757;Luke, J.Inf.Dis.175(1997),91-97;Mor,
Biochem.Pharmacology 55(1998),1151-1153;Donelly, Annu.Rev.Immun.15(1997
),617-648;MacGregor, J.Infect.Dis.178(1998),92-100）。
【０１０８】 ワクチンとしての医薬組成物に用いる本発明の抗体、該抗体の断片または誘導
体またはポリヌクレオチドは、たとえば中性または塩の形態で調合できる。製薬
学的に許容しうる塩、たとえば酸付加塩その他は当該技術分野で知られている。
ワクチンは、とりわけウイルスなどの病原体の感染の治療および／または予防の
ために用いることができ、調合方法に適合した剤型で、および予防または治療処
置に薬理学的に有効な量で投与される。
【０１０９】 ワクチンとして使用されるタンパク質、タンパク質断片および／またはタンパ
ク質誘導体は当該技術分野でよく知られている（たとえば、Cryz, "Immunothera
py and Vaccines", VCH Weinheim(1991);Paul (1989)、上掲文献を参照）。さら
に、細菌病原体の細胞内酵素さえも、免疫保護を付与する抗原性物質として作用
しうることが示されている（Michetti, Gastroenterology 107(1994),1002;Radc
liff, Infec.Immun.65(1997),4668;Lowrie, Springer Semin.Immunopathol.19(1
997),161）。
【０１１０】 ワクチン接種プロトコールは、能動免疫または受動免疫を含み、能動免疫は防
御免疫応答を誘発させるために本発明の抗体（および／またはその誘導体または
断片）を用いて抗原を宿主／患者に投与することを必要とする。ワクチン接種お
よびワクチンの原理は当業者に知られている（たとえば、Paul, "Fundamental I
mmunology"、ラベン・プレス、ニューヨーク（１９８９）またはMorein, "Conce
pts in Vaccine Development"、S.H.E. Kaufmann編、Walter de Gruyter、ベル
リン、ニューヨーク（１９９６）、２４３〜２６４を参照）。典型的に、ワクチ
ンは、液体溶液としてかまたは懸濁液のいずれかとして、注射剤として調製され
る；注射前の液状の溶液または懸濁液のための固形形態もまた調製できる。調製
物を乳化することもできるし、またはタンパク質をリポソーム中にカプセル納入
（encapsulated）することもできる。
【０１１１】 活性な免疫成分は、しばしば、該活性成分と適合性の薬理学的に許容しうる賦
形剤と混合される。適当な賦形剤としては、これらに限られるものではないが、
水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどが挙げられる；こ
れら賦形剤を種々の量で組み合わせて用いることもできる。ワクチンはまた、湿
潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤、および／または該ワクチンの効力を増大させるアジ
ュバントなどの補助物質を少量含んでいてよい。たとえば、そのようなアジュバ
ントとしては、２％スクワレン／Tween-80Rエマルジョン中の水酸化アルミニウ
ム、リン酸アルミニウムまたは水酸化リンアルミニウム（aluminumphosphohydro
xide）（「Gen H-B-VaxR」「DPT-Impfstoff Behring」として使用する）などの
アルミニウム構成物（compositions）、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニ
ル−Ｄ−イソグルタミン（thr-DMP）、Ｎ−アセチル−ノルアドレナリンムラミ
ル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（CGP 11687、「nor-MDP」ともいう）、
Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−
２−（１'２'−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシファオスフォ
リルオキシ）エチルアミン（CGP 19835A、「MTP-PE」ともいう）、ＭＦ５９およ
びＲＩＢＩ（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）が挙げられる。さらなるアジュバントと
しては、とりわけＣｐＧ含有モチーフなどのＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドが
挙げられる（CpG-oligonucleotides; Krieg, Nature 374(1995),546-549;Pisets
ky, An.Internal.Med.126(1997),169-171）。
【０１１２】 ワクチンは、通常、静脈内または筋肉内注射により投与する。他の様式の投与
に適したさらなる調合物としては、坐剤およびある場合には経口調合物が挙げら
れる。坐剤については、伝統的な結合剤および担体として、ポリアルキレングリ
コールまたはトリグリセリドが挙げられるが、これらに限られるものではない。
経口調合物は、たとえば、製薬グレードのマンニトール、乳糖、デンプン、ステ
アリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム
などのような通常用いられるものを含む。これら組成物は、液剤、懸濁剤、錠剤
、丸剤、カプセル剤、徐放製剤または散剤の形態であってよく、約１０％〜約９
５％の活性成分、好ましくは約２５％〜約７０％の活性成分を含む。
【０１１３】 ワクチンは、投与剤型に適合した仕方で、および予防および／または治療に有
効な量で投与されるであろう。投与すべき量は、一般に投与量当たり約５μｇ〜
約２５０μｇの抗原の範囲であり、投与すべき患者、患者の免疫系が抗体を合成
する能力、意図する保護の程度に依存する。投与に必要な活性成分の正確な量は
実施者の判断に委ねられてよいし、各患者ごとに特有であってよい。ワクチンは
単回または多回投与スケジュールで与えられてよい。多回投与は、第一のワクチ
ン接種を１〜１０の別個の投与とそれに続いて免疫応答を維持および／または強
化するのに必要な所定の時間間隔で（たとえば、第二の投与のために１〜４ヶ月
にて）さらなる投与を行い、さらに患者が必要とすれば数ヶ月後に引き続く投与
を行うものである。投与計画はまた、少なくともその一部は、患者の必要性によ
って決定され、実施者の判断に委ねられるであろう。
【０１１４】 本発明の範囲にはまた、細胞または細胞断片ベースのワクチンも包含される。
たとえば、樹状細胞（ＤＣ）ベースのワクチンを、Ｍ−ＤＣ８+細胞を選択し、
腫瘍またはウイルス感染細胞に特異的な抗原でエクスビボパルスすることにより
製造することができる。本発明の抗体を用いて単離できるＤＣは、とりわけ腫瘍
ワクチン接種または抗ウイルスワクチン接種のための抗原担体として用いる。Ｄ
Ｃの抗原積載（loading）は当該技術分野でよく知られており、最小のＭＨＣク
ラスＩ制限ペプチドからタンパク質に至る（Mayordomo, Nature Med.1(1995),12
97-1302;Hsu, Nature Med.2(1996),52-58;Paglia, J.Exp.Med.183(1996),317-32
2;Pardoll, Nature Medicine Vaccine Suppl.4(5)(1998),525-531において概説
）。さらに、抗原は、全腫瘍細胞とのＤＣの融合により（Gong, Nature Med.(19
96),558-561）、または複製欠損組換えウイルスベクターを用いて（Specht, J.E
xp.Med.186(1997),1213-1221;Song, J.Exp.Med.186(1997),1247-1256）、提示／
積載できる。
【０１１５】 さらに、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを含むトランスジェニック
非ヒト動物も本発明の範囲に含まれる。そのようなトランスジェニック非ヒト動
物は当該技術分野でよく知られた方法に従って製造することができ、本発明の抗
体、抗原およびポリペプチドの生物学的活性および／またはＤＣ媒体免疫応答の
対応インヒビターおよびアクチベーターを研究するうえで有用である。
【０１１６】 それゆえ、本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを生殖細
胞、胚細胞、幹細胞または卵またはそれに由来する細胞中に導入することを含む
、トランスジェニック動物、好ましくはトランスジェニックマウスの製造方法に
関する。本発明の方法に使用する非ヒト動物は、トランスジェニックしていない
健常な動物であってよく、またはウイルス疾患や癌、またはＤＣもしくはＴ細胞
媒体自己免疫疾患を有していてよい。トランスジェニック胚の製造およびそのス
クリーニングは、たとえば、A.L. Joyner編、Gene Targeting, A Practical App
roach(1993)、オックスフォード・ユニバーシティー・プレスに記載されている
ようにして行うことができる。胚の胚膜のＤＮＡは、適当なプローブを使用した
サザーンブロットを用いて分析できる。
【０１１７】 本発明はまた、本発明のまたは本発明の方法により得ることのできるポリヌク
レオチドまたはベクターを含むトランスジェニックマウス、ラット、ハムスター
、イヌ、サル、ウサギまたはブタなどのトランスジェニック非ヒト動物であって
、好ましくは該ポリヌクレオチドまたはベクターが該非ヒト動物のゲノム中に安
定に組み込まれており、好ましくは該ポリヌクレオチドまたはベクターの存在が
本発明の抗体、抗原またはポリペプチドの発現へと導くトランスジェニック非ヒ
ト動物に関する。一方、本発明の抗原をもはや発現することができないノックア
ウト非ヒト動物を生成することができる。 他の態様において、本発明は、上記本発明の抗体、抗原またはエピトープ、ポ
リペプチド、ポリヌクレオチドまたはベクターのいずれか一つを含む診断組成物
に関する。
【０１１８】 本発明の抗原は、とりわけイムノアッセイに使用するのに適しており、該抗原
は液相にてまたは固相支持担体に結合させて用いることができる。さらに、これ
らアッセイに用いる抗原は種々の仕方で検出可能に標識することができる。本発
明の抗原を用いることのできるイムノアッセイの例は、直接または間接のいずれ
かの形態の競合および非競合イムノアッセイである。そのようなイムノアッセイ
の例は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、サンドイッチ（イムノアッセイ）お
よびウエスタンブロッティングアッセイである。本発明の抗原またはエピトープ
に結合した抗体の検出は、生理学的サンプル上での免疫組織化学的アッセイを含
む、フォアウォード、リバースまたは同時の様式で行うイムノアッセイを用いて
行うことができる。本発明の抗原およびポリペプチドは多くの異なる担体に結合
させることができ、本発明のＤＣと特異的に反応する抗体の存在を検出するのに
用いることができる。よく知られた担体の例は、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩
化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、デキストラン、
ナイロン、アミロース、天然および改変セルロース、ポリアクリルアミド、アガ
ロース、およびマグネタイトである。担体の性質は、本発明の目的により可溶性
かまたは不溶性のいずれかであってよい。
【０１１９】 当業者に知られた多くの異なる標識および標識方法が存在する。本発明に用い
ることのできる標識のタイプの例としては、酵素、放射性同位元素、コロイド状
金属、蛍光化合物、化学ルミネセンス化合物、および生物ルミネセンス化合物な
どが挙げられる（上記参照）。
【０１２０】 本発明のアッセイに使用するための材料は、キットの調製に理想的に適してい
る。そのようなキットは、バイアル、チューブなどの１またはそれ以上の容器手
段を密に収容すべく区画化した担体手段であって、各容器手段が本発明の方法に
使用する別個の要素の一つを含むようにしたものを含んでいてよい。たとえば、
容器手段の一つは担体に結合した本発明の抗原を含んでいてよい。第二の容器は
可溶性で検出可能に標識した第二の抗体を凍結乾燥形態かまたは溶液中にて含ん
でいてよい。さらに、容器手段は複数の容器を含んでいてよく、それら容器の各
々が本発明の抗原を様々な前以て決定した量で含んでいてよい。ついで、これら
後者の容器は標準曲線を作成するのに使用でき、該標準曲線に本発明の抗原に対
する抗体を未知量で含むサンプルから得られた結果を内挿することができる。
【０１２１】 さらに他の態様において、本発明は、抗原に暴露された樹状細胞または抗原を
発現するＤＣまたは上記抗原またはエピトープを含むワクチンに関する。単離し
たＤＣはインビトロで調製して、以下に記載するようにＣＤ４+かまたはＣＤ８+ Ｔ細胞のいずれかを刺激するための抗原性ペプチドを提示することができる。つ
いで、これらＤＣを皮内、皮下、筋肉内、またはとりわけ抗腫瘍ワクチン接種の
場合には腫瘍増殖の領域または腫瘍増殖のリンパ管またはリンパ節排出領域に注
入する。抗原提示ＤＣの注入は、種々の間隔をあけて数回繰り返す（Nestle, Na
ture Med.4(1998)328-332）。
【０１２２】 他の態様において、本発明は、本発明の樹状細胞およびある種の疾患に罹りや
すいヒトまたは動物において該疾患に対する防御免疫応答を生成しうる上記抗原
の少なくとも一つを含む免疫賦活組成物に関する。ワクチン接種に使用するＤＣ
の免疫原性は、たとえば分泌サイトカインまたはケモカインまたは膜分子をコー
ドするｃＤＮＡをＤＣ中に形質導入することにより、Ｔｈ１かまたはＴｈ２指令
免疫応答のいずれかをプログラムするように増強し特異的に改変することができ
る。Ｔｈ１指令免疫応答をプログラムするには、抗原提示ＤＣをＩＬ−１２をコ
ードするｃＤＮＡで形質導入し、Ｔｈ２指令免疫応答をプログラムするには、抗
原提示ＤＣをＩＬ−４を分泌するように改変する。
【０１２３】 本発明はまた、上記方法により得られたＴ細胞を適合性の免疫療法のための医
薬組成物を調製するために使用すること、および抗原に暴露された本発明の樹状
細胞をヒトまたは動物においてＴ細胞を活性化するための医薬組成物に使用する
ことに関する。たとえば、Ｔリンパ球をＴ細胞に対して抗原性ペプチドを提示す
るように調製した本発明の自己由来ＤＣとともにインビトロで数日間一緒に培養
して、Ｔ細胞の抗原特異的な活性化を誘発させる。抗原は腫瘍抗原またはアレル
ゲンまたは自己抗原であってよい。活性化Ｔ細胞の増殖は、ＩＬ−２などのサイ
トカインを加えることによって支持できる。Ｔ細胞の抗原特異的な刺激は数回繰
り返す。ついで、Ｔ細胞を大抵は注入によりドナーに適合して移す。
【０１２４】 本発明のさらなる目的は、標的細胞に該樹状細胞を補充するための医薬組成物
の調製のために上記２特異的抗体を使用することである。好ましくは、該標的細
胞は腫瘍細胞またはウイルス感染細胞または微生物が感染した細胞である（上記
参照）。
【０１２５】 本発明の抗体、抗原およびエピトープ投与の投与量範囲は、自己免疫応答の徴
候または細胞破壊が改善されるような所望の効果が得られるに充分大きなもので
ある。投与量は、所望でない交叉反応やアナフィラキシー反応などの副作用を引
き起こすほど大きなものであってはならない。一般に、投与量は、患者の年齢、
健康状態、性別、および疾患の程度によって変わるであろうが、当業者により決
定することができる。投与量は、矛盾する適応症（couterindications）の場合
には個々の医師によって調節することができる。
【０１２６】 さらに、本発明は、免疫応答をインビトロでまたはインビボで調節またはプロ
グラムするためにサイトカインまたはシグナル伝達分子の遺伝子をトランスフェ
クションすることにより樹状細胞を改変する方法を含む。そのようなサイトカイ
ンおよび分子の例については上記を参照のこと。
【０１２７】 さらに、本発明は、Ｔ細胞の抗原特異的活性化を促進、調節または抑制する作
用を有するＤＣにより合成される分子を同定する方法であって、 （ａ）本発明のＤＣによって培養上清中に分泌された分子をたとえば通常の生化
学的方法によって分離し、ついで富化したまたは単離した該分子を抗原特異的Ｔ
細胞活性化についてＤＣを欠く細胞培養系で試験し、ついで／または （ｂ）本発明のＤＣにおける遺伝子発現を差し引きクローニングまたは識別表示
（differential display）ＲＴ−ＰＣＲにより単球などの他の抗原提示細胞での
遺伝子発現と比較する ことを含む方法に関する。
【０１２８】 さらに、本発明は、インビトロでＤＣを増殖させる方法であって、 （ａ）本発明のＤＣを、ＤＣの増殖を支持する特定のサイトカイン混合物（cock
tail）中で培養し、ついで／または （ｂ）ＳＶ４０ラージＴ抗原をコードする遺伝子などの形質転換遺伝子を形質導
入することにより該ＤＣを不死化する ことを含む方法を包含する。 たとえば、全ＲＮＡを、たとえばRNAzol B法（Tel-Test, Inc.）を用いて本発
明のＤＣおよび他の抗原提示細胞から単離し、識別表示を当該技術分野に記載さ
れているようにして行うことができる（たとえば、Kojima, J.Biol.Chem.271(19
96),12327-12332を参照）。
【０１２９】 これらおよび他の態様が本発明の記載および実施例により開示および包含され
る。本発明に従って用いることのできる方法、使用および化合物のいずれか一つ
に関するさらなる文献は、たとえば電子装置を用いて公共の図書館およびデータ
ベースから検索することができる。たとえば、公共データベースの「Medline」
を利用できるが、これはたとえばhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline
.htmlにてインターネット上で入手できる。http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, htt
p://www.infobiogen.fr/, http://www.fmi.ch/biology/research tools.html, h
ttp://www.tigr.org/などの他のデータベースおよびアドレスも当業者には知ら
れており、たとえばhttp://www.lycos.comを用いて得ることができる。バイオテ
クノロジーにおける特許情報の概観および過去に遡る（retrospective）調査お
よび現在の了解（awareness）に有用な特許情報の関連する源のサーベイはBerks
, TIBTECH 12(1994),352-364で得られる。
【０１３０】 本発明の医薬組成物、使用および方法は、自己免疫疾患、アレルギー疾患など
の過敏性疾患、免疫不全症に関連することが、または免疫系の応答が関与するウ
イルス性疾患または癌または他の感染性疾患に依存することがわかっているある
いはこれまでのところわかっていない全ての種類の疾患の治療に有利に用いるこ
とができる。本発明の医薬組成物、使用および方法はヒトに用いるのが望ましい
が、動物の治療もまた本発明の方法および使用に包含される。
【０１３１】 以下の実施例により本発明を説明する。実施例１ ：Ｍ−ＤＣ８+白血球の単離および特徴付け ヘパリン処理した全血およびバフィーコート調製物を、血液ドナーのインフォ
ームドコンセントを得てＴＵドレスデン、医学部、輸血課から得た。血球を２ｍ
Ｍ Ｌ−グルタミン、１％非必須アミノ酸（Biochrom AG、ベルリン、ＦＲＧ）、
１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ともに
Gibco、エッゲンシュタイン、ＦＲＧより入手）および１０％加熱不活化プール
ヒト血清を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（完全培地（ＣＭ）と称する）中で培
養した。全白血球のＦＡＣＳ分析のため、赤血球を溶解液（Becton Dickinson &
Co.、ハイデルベルグ、ＦＲＧ）で製造業者の指示に従って溶解させた。末梢血
単核球（ＰＢＭＣ）をフィコール−ハイパック（Pharmacia、フライブルグ、Ｆ
ＲＧ）密度遠心分離により調製した。
【０１３２】 ＣｒＣｌ3法27を本質的に記載に従って用い、精製ＣＤ２（Ｍ−Ｔ９１０）、
ＣＤ３７（Ｍ−Ｂ３７２）またはＣＤ１４（Ｍ−Ｍ４２）モノクローナル抗体（
本発明者らの研究所に由来し、"IVth Int. Workshop on Human Leukocyte Diffe
rentiation Antigens"26で群集させた（clustered））をコーティングしたウシ
赤血球（ＢＲＢＣ）を用いた直接モノクローナル抗体ロゼット法（ＤＡＲＴ）に
より、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球および単球をＰＢＭＣから除去した。各モノクロ
ーナル抗体をコーティングしたＢＲＢＣを用いた２回目のロゼット法により９９
％以上の涸渇が得られた。アミノエチルイソチウロニウム（isothiuronium）ブ
ロマイド（ＡＥＴ、Sigma、ダイゼンホーフェン、ＦＲＧ）で処理したヒツジ赤
血球でロゼットし、ついで記載に従って27フィコール密度遠心分離により＞９８
％純度のＴリンパ球をＰＢＭＣから得た。この集団から＞９８％純度のＣＤ８+
Ｔ細胞を、ＣＤ４モノクローナル抗体Ｍ−Ｔ３１０をコーティングしたＢＲＢＣ
とのロゼットとしてＣＤ４+細胞の涸渇により調製した28。
【０１３３】 Ｔ細胞、Ｂ細胞および単球を涸渇させたＨＬＡ−ＤＲ+ＰＢＭＣ上でのスクリ
ーニングにより、６×１０3を超えるハイブリドーマ上清からＭ−ＤＣ８を選択
した。赤血球の溶解後、Ｍ−ＤＣ８モノクローナル抗体は全白血球集団の０.５
〜１％を標識した（図１Ａ）。１０μｇ／ｍｌの抗体を含むＭ−ＤＣ８ハイブリ
ドーマの非希釈上澄み液とともにＰＢＭＣを４℃で１５分間インキュベートする
ことによりＭ−ＤＣ８+細胞を得た。ＰＢＳで洗浄後、常磁性のマイクロビーズ
（Miltenyi Biotec、ベルギッシュ−グラッドバッハ、ＦＲＧ）に結合させた１
０μｌのラット抗マウスＩｇＭで細胞を４℃にてさらに１５分間標識した。洗浄
後、細胞の凝集を防ぐために細胞を充分に再浮遊させ、ＶＳ＋分離カラム（Milt
enyi）上で貯蔵した。必要なら、高度に富化した細胞をＲＳ＋分離カラム（Milt
enyi）を用いた２回目のマグネチックセルソーティングによりさらに精製した。
１％ヒト血清を含む脱気し氷冷したＰＢＳを操作（running）および溶出緩衝液
として用いた。
【０１３４】 抗ＣＤ１４コーティング常磁性マイクロビーズ（Miltenyi）とのインキュベー
ションによる最初のマグネチックセルソーティングの後、純粋な単球を調製した
。ＶＳ＋分離カラムを用いたマグネチックセルソーティングの後、ＣＤ１４+の
＞９５％純度の集団を得た。サイズおよび顆粒度に関しては、Ｍ−ＤＣ８+細胞
は光散乱表示においてリンパ球と単球との間に位置する別個の集団を示していた
（図１Ｂ、１Ｃ）。以下の細胞系列特異的モノクローナル抗体ＣＤ２、ＣＤ１９
、ＣＤ１４およびＣＤ５６の各々とともにＭ−ＤＣ８モノクローナル抗体を用い
た２色免疫蛍光分析により、Ｍ−ＤＣ８+細胞はＴ細胞、Ｂ細胞、単球またはＮ
Ｋ細胞からそれぞれ排除することができた（図２Ａ〜２Ｄ）。２色蛍光分析のた
め、細胞を非希釈Ｍ−ＤＣ８ハイブリドーマ上清とともにインキュベートし、つ
いでＰＥ−またはＦＩＴＣコンジュゲートヤギＦ(ａｂ')2抗マウスＩｇＭ（Coul
ter-Immunotec、ハンブルグ、ＦＲＧ）とともにインキュベートした。
【０１３５】 二次抗体の非複合結合部位を１／１０希釈の正常マウス血清で飽和した後、以
下の蛍光染色コンジュゲートモノクローナル抗体を供給者の推奨する濃度にて適
用した：ＣＤ２（Ｔ９−１０、ＩｇＧ１、ＦＩＴＣ）、ＣＤ４（１３Ｂ８.２、
ＩｇＧ１、ＰＥ）、ＣＤ１１ｂ（ＺＬＰＭ１９Ｃ、ＩｇＧ１、ＰＥ）、ＣＤ１４
（Ｔ＋Ｋ４、ＩｇＧ２ａ、ＦＩＴＣ）、ＣＤ１８（ＭＨＭ２３、ＩｇＧ１、ＦＩ
ＴＣ）（すべてDako、ハンブルグ、ＦＲＧから購入）；ＣＤ１ａ（Ｍ−Ｔ１０２
、ＩｇＧ２ｂ、ＰＥ）、ＣＤ１１ａ（Ｇ４３−２５Ｂ、ＩｇＧ１、ＦＩＴＣ）、
ＣＤ１１ｃ（Ｂ−ＬＹ６、ＩｇＧ１、ＰＥ）、ＣＤ３２（ＦＬ１８.２６、Ｉｇ
Ｇ２ｂ、ＦＩＴＣ）、ＣＤ３３（ＷＭ５３、ＩｇＧ１、ＰＥ）、ＣＤ４０（５Ｃ
３、ＩｇＧ１、ＦＩＴＣ）、ＣＤ５４（ＨＡ５８、ＩｇＧ１、ＰＥ）、ＣＤ５６
（Ｂ１５９、ＩｇＧ１、ＰＥ−Ｃｙ５）、ＣＤ８０（ＢＢ１、ＩｇＭ、ＦＩＴＣ
）、ＣＤ８６（ＩＴ２.２、ＩｇＧ２ｂ、ＦＩＴＣ）（ＦＵＮ１、ＩｇＧ１、Ｆ
ＩＴＣ）、ＣＤ１０６（５１−１０Ｃ９、ＩｇＧ１、ＦＩＴＣ）、ＨＬＡ−ＤＰ
（ＨＩ４３、ＩｇＧ１、ＦＩＴＣ）、ＨＬＡ−ＤＱ（Ｔ＋１６９、ＩｇＧ２ａ、
ＦＩＴＣ）、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ（Ｇ４６−２.６、ＩｇＧ１、ＦＩＴＣ）（す
べてPharmingen、ハンブルグ、ＦＲＧより入手）；ＣＤ３（ＵＣＨＴ１、ＩｇＧ
１、ＰＥ−Ｃｙ５）、ＣＤ１３（ＷＭ１５、ＩｇＧ１、ＦＩＴＣ）、ＣＤ１６（
３Ｇ８、ＩｇＧ１、ＦＩＴＣ）、ＣＤ１９（Ｊ４.１１９、ＩｇＧ１、ＰＥ）、
ＣＤ３４（ＱＢＥＮＰ１０、ＩｇＧ１、ＦＩＴＣ）、ＣＤ４５ＲＯ（ＵＣＨＬ１
、ＩｇＧ２ａ、ＰＥ）、ＣＤ４５ＲＡ（ＡＬＢ１１、ＩｇＧ１、ＦＩＴＣ）、Ｃ
Ｄ５０（ＨＰ２／１９、ＩｇＧ２ａ、ＰＥ）、ＣＤ５８（ＡｌＣＤ５８、ＩｇＧ
２ａ、ＰＥ）、ＣＤ６４（２２、ＩｇＧ１、ＦＩＴＣ）、抗ＨＬＡ−ＤＲ（Ｂ８
.１２.２、ＩｇＧ２ｂ、ＰＥ）（すべてCoulter-Immunotech、ハンブルグ、ＦＲ
Ｇから購入）。
【０１３６】 ２つの非標識モノクローナル抗体Ｍ−ＤＣ８およびＣＤ８３（ＨＢ−１５ａお
よびＨＢ−１５ｂ、Vth Workshop on Human Leukocyte Differentiation Antige
nsに際して入手）を用いた２色免疫蛍光染色を以下のようにして行った：細胞を
まずＣＤ８３モノクローナル抗体とともにインキュベートし、ついでＦＩＴＣコ
ンジュゲートヤギＦ(ａｂ')2抗マウスＩｇ（Dako、ハンブルグ、ＦＲＧ）ととも
にインキュベートした。１／１０希釈の正常マウス血清で反応停止した（quench
ing）後、細胞をＭ−ＤＣ８モノクローナル抗体および第二抗体としてのＰＥコ
ンジュゲートヤギＦ(ａｂ')2抗マウスＩｇＭ（Coulter-Immunotec）で染色した
。
【０１３７】 モノクローナル抗体Ｍ−ＤＣ８およびｐ５５（E. Langhoff博士の好意により
提供された）を用いた２色染色のため、ＰＢＭＣをまず上記のようにＭ−ＤＣ８
について表面染色し、ついで氷冷４％パラホルムアルデヒド（Merck、ダルムシ
ュタット、ＦＲＧ）で固定し、０.１％サポニン（Sigma、ダイゼンホーフェン、
ＦＲＧ）で透過性にし、モノクローナル抗体ｐ５５で染色し、ついでＦＩＴＣコ
ンジュゲートラット抗マウスＩｇＧ１で処理した。各インキュベーションの後に
細胞を細胞洗浄液（Becton-Dickinson & Co.、ハイデルベルグ、ＦＲＧ）で２回
洗浄した。染色した細胞を溶解IIプログラムを用いてＦＡＣＳｃａｎ（Becton D
ickinson）で分析した。ヒト血液ＤＣの２つのマーカーであるＣＤ８３およびｐ
５５は同一のＤＣサブセットを定めるので9,10、Ｍ−ＤＣ８が重複した細胞集団
を特徴付けるか否かを知ることに興味がもたれた。未分離のＰＢＭＣをｐ５５お
よびＭ−ＤＣ８について同時に染色すると、これら２つのマーカーにより２つの
異なる細胞集団が定められた（図２Ｅ）。ＣＤ８３発現を誘発させるため、ＰＢ
ＭＣをＴ細胞およびＢ細胞について涸渇させ、４８時間培養した。これら細胞を
ＣＤ８３およびＭ−ＤＣ８モノクローナル抗体で染色すると２つの異なる細胞サ
ブセットが明らかとなった（図２Ｆ）。それゆえ、Ｍ−ＤＣ８は、公知の細胞系
統およびＤＣマーカーによって同定されるものとは異なる独特の白血球集団を定
める。
【０１３８】 表１は、新たに単離し培養したＭ−ＤＣ８+細胞とＣＤ１４+単球とを比較して
広範な表面マーカーについて分析した結果を示す。新鮮なＭ−ＤＣ８+細胞は、
ＨＬＡクラスII抗原（ＨＬＡ−ＤＲ、−ＤＰ、−ＤＱ）、β２−インテグリンＣ
Ｄ１１ａ，ｂ，ｃ／ＣＤ１８およびβ１−インテグリン鎖ＣＤ２９などの接着分
子、ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）およびＩＣＡＭ−３（ＣＤ５０）などの細胞接着
分子、ＬＦＡ−３（ＣＤ５８）およびＦｃγレセプターＣＤ３２（ＦｃγＲII）
およびＣＤ１６（ＦｃγＲIII）を示した。さらに、Ｍ−ＤＣ８+細胞はミエロイ
ド（myeloid）マーカーＣＤ１３およびＣＤ３３について陽性であり、ＣＤ４を
適度の密度で発現した。表皮ＤＣのマーカーであるＣＤ１ａ15並びに胸腺ＤＣに
よって発現されるＣＤ１０６（ＶＣＡＭ−１）16は、新鮮なＭ−ＤＣ８+細胞で
は検出されなかった。
【０１３９】 Ｍ−ＤＣ８+細胞は、ＭＨＣクラスIIおよび接着分子1,9に加えてＢ−７.１（
ＣＤ８０）、Ｂ−７.２（ＣＤ８６）およびＣＤ４０などの抗原提示細胞の古典
的な特徴を発現した。ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ４０およびＣＤ８６は新たに単離した
Ｍ−ＤＣ８+細胞では低レベルでしか発現されなかったが、これら分子はインビ
トロで３６時間培養した後には上方制御された（upregulated）。この時点で、
コスティミュラトリー分子Ｂ−７.１（ＣＤ８０）も低密度でのみではあるが検
出されるようになった。新たに単離し培養したＭ−ＤＣ８+細胞の表面マーカー
を表１にまとめて示す；下記参照。比較のため、新たに調製したＣＤ１４+単球
の表現型をも示す。
【０１４０】表１ ：ＣＤ１４+単球と比較した新たに単離および培養したＭ−ＤＣ８+細胞の表
面表現型
【表１】
【０１４１】 Ｍ−ＤＣ８+細胞およびＣＤ１４+単球をイムノマグネチック法によりＰＢＭＣ
から単離した。単離直後かまたはＣＭ中で３６時間培養した後、細胞を免疫蛍光
染色およびＦＡＣＳ分析に供した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）レベルを−として与
え、４ログスケール（four log scale）での第一の１０のＭＦＩを示し、これは
同位元素の対照レベルに対応する；＋、＋＋および＋＋＋は、それぞれ第二、第
三および第四の１０のＭＦＩを示す。符号のないものは決定しなかったことを意
味する。これらデータは、少なくとも５つの個々の実験を示す。
【０１４２】 Ｍ−ＤＣ８+細胞をＣＤ１４+単球から識別する最も顕著な特徴は、Ｍ−ＤＣ８ + 細胞での高密度のＣＤ１６（ＦｃγＲIII）、およびＣＤ６４（ＦｃγＲI）発
現の欠如であった。興味深いことに、ＣＤ１６は３６時間のインビトロ培養の間
にＭ−ＤＣ８+細胞の表面から消失した。さらに、Ｍ−ＤＣ８+細胞は単球に比べ
てＣＤ４５Ｒ０を一貫して低レベルにて発現したのに対し、ＣＤ１１ａおよびＣ
Ｄ１１ｃおよびＣＤ４５分子のＲＡイソ型はＭ−ＤＣ８+細胞ではかなり高かっ
た。
【０１４３】実施例２ ：Ｍ−ＤＣ８+細胞の形態学的および機能的特徴付け Ｍ−ＤＣ８抗体は、マグネチックセルソーティングを用いた１工程法によりＤ
ＣをＰＢＭＣから単離するのに特に有効であることがわかった。この方法を用い
、生存能力のあるＭ−ＤＣ８+細胞を６０〜９０％の収率および＞９７％の純度
で再現可能に単離することができた（図２Ｇ、２Ｈ）。これら細胞はサイトスピ
ン（cytospins）上で丸い中位のサイズの白血球として現れ（図３Ａ）、培養の
間にサイズは大きくなり、樹状の細胞質突出を示した（図３Ｂ）。新たに単離し
た細胞は、１μのラテックスビーズおよび抗体コーティングＳＲＢＣを貪欲に食
作用により取り込んだ（図３Ｃおよび３Ｄ）。
【０１４４】 新たに単離した単球およびＭ−ＤＣ８+細胞を、抗ＳＲＢＣ血清１：１００（S
igma、ダイゼンホーフェン、ＦＲＧ）でオプソニン処理したヒツジ赤血球（ＳＲ
ＢＣ）かまたは１もしくは５μの直径のラテックスビーズ（Sigma）とともに３
７℃、５％ＣＯ2にてインキュベートした。３０分後、嵌入しなかったＳＲＢＣ
を低浸透圧溶解（蒸留水で５秒後、等容量の１.８％ＮａＣｌを添加）により溶
解した。ＳＲＢＣの嵌入は、May Grunvald Giemsa染色後にサイトスピン上で評
価した。嵌入したラテックスビーズの視覚化を共焦点レーザースキャニング顕微
鏡（Lieca TCS 4D、レイカ、ハンブルグ、ＦＧＲ）により行った。
【０１４５】実施例３ ：同種および自己ＭＬＲ Ｍ−ＤＣ８+細胞が抗原特異的なＴ細胞活性化を誘発する能力を評価するため
、種々のＴ細胞刺激アッセイを行った。比較のため、単球を常に平行してアッセ
イした。１×１０5の精製Ｔリンパ球を、９６ウエルの丸底マイクロタイタープ
レート（Corning、ニューヨーク、ニューヨーク、米国）中の０.２ｍｌのＣＭ中
で段階的な（graded）数のＡＰＣとともに培養した。破傷風毒素（ＴＴ、Behrin
gwerke、マールブルグ、ＦＲＧ）またはキーホールリンペットヘモシアニン（Ｋ
ＬＨ、Boehringer-Mannheim、マンハイム、ＦＲＧ）を抗原としてそれぞれ５μ
ｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌの濃度にて添加した。
【０１４６】 Ｔ細胞の増殖を、５日後に3Ｈ−チミジン（比活性７９.１Ｃｉ／ミリモル、濃
度１.０ｍＣｉ／ｍｌ、DuPont、バート・ホンブルグ、ＦＲＧ）（回収の１２〜
１５時間前に２μＣｉ／ウエルの濃度で添加）の取り込みにより決定した。クロ
ーニングしたメラノーマ特異的細胞障害性Ｔ細胞を抗原性ペプチドを外部より負
荷したＡＰＣにより活性化させる実験においては、ＨＬＡ−Ａ０２０１ドナーか
らのＡＰＣ調製物を、１％ヒト血清を補充したＲＰＭＩ１６４０培地中、３７℃
にて１００μｇ／ｍｌのチロシナーゼペプチドＹＭＤＧＴＭＳＱＶとともに一夜
インキュベートした。充分に洗浄した後、１０4のペプチドパルスＡＰＣを２５
Ｕ／ｍｌのｒｈＩＬ−２（Genzyme、ミュンヘン、ＦＲＧ）の存在下、丸底マイ
クロタイタープレート（Corning）中の２００μｌのＣＭ中、Ｔ細胞クローンＩ
ＶＳＢ（T. Wolfel博士、ユニバーシティー・オブ・マインツ、ＦＲＧの好意に
より提供された）の１０4細胞とともに培養した。
【０１４７】 細胞障害性のＣＤ８+Ｔ細胞クローンは、ＨＬＡ−Ａ０２０１分子と複合体を
形成した上記チロシナーゼペプチドを特異的に認識した（１９）。４０時間後に
放出されたＴＮＦ−αをＥＬＩＳＡにより（R & D Systems、ミネアポリス、米
国）上澄み液中で決定した。図４Ａから明らかなように、精製した細胞は１×１
０5のＴ細胞を種々の数の同種ＡＰＣとともに培養したときに同種ＭＬＲを有効
に誘発した。Ｍ−ＤＣ８+細胞は同時に試験した単球に比べて少なくとも５倍有
効であることがわかった。自己ＭＬＲの誘発はＤＣの特徴的な性質であると考え
られるので1、単離したＭ−ＤＣ８+細胞を自己Ｔ細胞とともに培養した。図４Ｂ
が示すように、自己Ｔ細胞は用量依存的な仕方で刺激された。しかしながら、絶
対的な値は自己ＭＬＲでは同種ＭＬＲに比べてはるかに低かった。同じ条件下で
アッセイしたときに、ＣＤ１４+単球は下限に近いＴ細胞反応性しか示さなかっ
た。
【０１４８】実施例４ ：想起（recall）抗原およびネオ抗原（neoantigen）に対するＴ細胞の
活性化 図４Ｃは、Ｍ−ＤＣ８+細胞が破傷風毒素（ＴＴ）ワクチン接種したドナーか
ら得たＴ細胞に対してＴＴを非常に有効に提示したことを示している。１×１０ 5 のＴ細胞中で既に６００のＭ−ＤＣ８+細胞が破傷風特異的なＴ細胞活性化を誘
発することができた。同時に試験したときに、単球では約２５００の単球が同じ
レベルのＴ細胞増殖を得るのに必要であった。ＣＤ１４+単球とは対照的に、Ｍ
−ＤＣ８+細胞はキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に対してインビ
トロで顕著な一次Ｔ細胞応答を誘発した（図４Ｄ）。
【０１４９】実施例５ ：細胞障害性Ｔ細胞クローンの活性化 ＣＤ４+Ｔリンパ球を活性化する能力に加え、ＤＣはクラスＩ提示内生ペプチ
ドによりＣＤ８+Ｔリンパ球を刺激するうえでも枢要である17,18。Ｍ−ＤＣ８+
細胞がＣＤ８+Ｔ細胞にＭＨＣクラスＩ結合ペプチドを提示する能力は、まず黒
色腫患者に由来しＨＬＡ−Ａ０２０１分子上のチロシナーゼ由来ペプチドを認識
する細胞障害性Ｔ細胞クローン（ＩＶＳＢ）で示された19。刺激のため、Ｍ−Ｄ
Ｃ８+細胞およびＨＬＡ−Ａ０２０１陽性血液ドナーからの単球を、クローニン
グＴ細胞を添加する前に該ペプチドとともに一夜プレインキュベートした。４８
時間後、分泌されたＴＮＦ−αを測定することにより細胞障害性クローンの応答
を決定した。図５に示すように、Ｍ−ＤＣ８+細胞はペプチドパルスした単球と
同じくらい有効にクローニングＴリンパ球に対して該ペプチドを提示した。
【０１５０】実施例６ ：アロ抗原特異的な細胞障害性ＣＤ８+Ｔ細胞の誘発 Ｍ−ＤＣ８+細胞がＣＤ８+細胞障害性Ｔ細胞をインビトロで初回抗原刺激する
能力を決定するため、Ｍ−ＤＣ８+細胞を未分離の同種Ｔ細胞かまたは精製同種
ＣＤ８+Ｔリンパ球とともに培養した。ＣＤ８+Ｔリンパ球の抗原特異的な初回抗
原刺激は、51Ｃｒ標識した同種ＰＨＡ芽球細胞（blasts）の溶解により評価した
。精製Ｔ細胞または単離したＣＤ８+Ｔ細胞（１×１０6）をスティミュレーター
細胞としての５×１０4の同種Ｍ−ＤＣ８+細胞または単球とともに２４ウエルCo
starプレート（Costar、ハイデルベルグ、ＦＲＧ）中の全容量２ｍｌのＣＭ中に
て培養した。７日後、細胞を回収し、洗浄し、ついでスティミュレーターの51Ｃ
ｒ標識したＰＨＡ芽球細胞に対する細胞障害活性、およびリスポンダー由来の51 Ｃｒ標識したＰＨＡ芽球細胞に対する細胞障害活性について試験した。培養の最
後の２４時間の間にｒｈＩＬ−２（Genzyme）を２５Ｕ／ｍｌの濃度で加えた。
ＰＨＡ芽球細胞を生成するため、１×１０6のＰＢＭＣを２ｍｌのＣＭ中の１μ
ｌ／ｍｌのＰＨＡ（Gibco）で３日間刺激した。
【０１５１】 ついで、細胞を２５Ｕ／ｍｌのｈｒＩＬ−２（Genzyme）の存在下でさらに１
日間培養した。洗浄後、１×１０6の細胞を１００μｌのＦＣＳ中に再浮遊させ
、１００μＣｉの51Ｃｒ（クロム酸ナトリウム、比活性４４０ｍＣｉ／ｍｇ、Du
Pont）を３７℃にて１時間かけて加えた。アロ抗原刺激したＴリンパ球の細胞障
害活性を、マイクロタイタープレート中の２００μｌのＣＭ中で種々の数のエフ
ェクター細胞を５×１０3の51Ｃｒ標識ＰＨＡ芽球細胞とともに３７℃で４時間
インキュベートすることにより決定した。細胞をスピンダウンし（spun down）
、ガンマシンチレーションカウンター（Packard、ドライアイヒ、ＦＲＧ）で放
射能を決定するために１００μｌの上澄み液を取り出した。標識細胞からの最大
の放出を３回の凍結および解凍の後に決定した。
【０１５２】 比細胞障害活性は式： 比溶解（パーセント）＝１００×[(試験放出(ｃｐｍ)−自然放出(ｃｐｍ))／(最
大放出(ｃｐｍ)−自然放出(ｃｐｍ))] に従って計算した。図６Ａは、Ｍ−ＤＣ８+細胞および単球が未分離のＴリンパ
球とともに培養したときに同じ効率でアロ抗原特異的な細胞障害性Ｔ細胞を誘発
することを示している。しかしながら、Ｍ−ＤＣ８+細胞は、精製した同種ＣＤ
８+Ｔリンパ球とともに培養したときに単球に比べてアロ特異的な細胞障害性エ
フェクター細胞を活性化するうえではるかに有効であった（図６Ｂ）。
【０１５３】実施例７ ：腫瘍特異的な細胞障害性Ｔ細胞の誘発 Ｍ−ＤＣ８+細胞が腫瘍由来ペプチドに対して細胞障害性Ｔ細胞を初回抗原刺
激する能力を試験するため、健康なドナーおよびＨＬＡ−Ａ*０２０１抗原を発
現する黒色腫患者のＰＢＭＣを、このＨＬＡクラスＩ分子に結合することが知ら
れているチロシナーゼ由来ペプチドＹＭＤＧＴＭＳＱＶを積載した自己Ｍ−ＤＣ
８+細胞で４回連続して刺激することにより活性化した。誘発したＴ細胞の特異
性の決定は、ＨＬＡ−Ａ*０２０１抗原を発現するペプチド積載Ｔ２細胞の溶解
およびチロシナーゼ発現メラノーマ細胞との接触後のＴＮＦ−αの放出の両者に
より行った。
【０１５４】 新たに単離したＭ−ＤＣ８+細胞を血清不含培地中、３７℃にて４時間、５０
μｇ／ｍｌのチロシナーゼ由来ペプチドＹＭＤＧＴＭＳＱＶおよび３μｇ／ｍｌ
のヒトβ２−ミクログロブリン（Sigma）を負荷した。洗浄後、２×１０5のペプ
チド積載Ｍ−ＤＣ８+細胞を２４ウエル組織培養プレートのウエル当たり２ｍｌ
のＣＭ中、２×１０6の自己ＰＢＭＣとともに培養した。３日後、培地に２５Ｕ
／ｍｌのｒｈＩＬ−２（Genzyme、ミュンヘン、ＦＲＧ）を補充した。１週間後
、リスポンダー細胞を回収し、洗浄し、１×１０6細胞／ウエルにて分配し、つ
いでチロシナーゼペプチドを積載した１×１０5の新たに調製したＭ−ＤＣ８+細
胞で再刺激した。再刺激を２週間および３週間後に繰り返した。
【０１５５】 １週間後、ペプチドを積載し51Ｃｒ標識したＴ２標的細胞の溶解かまたはチロ
シナーゼ発現メラノーマ細胞との接触後のＴＮＦ−αの放出の決定のいずれかに
より細胞障害活性を試験した。Ｔ２細胞（ＡＴＣＣ、ロックビル、メリーランド
より入手）を１００μｇ／ｍｌのチロシナーゼ由来ペプチドとともに一夜インキ
ュベートし、洗浄し、１×１０6の細胞を１００μＣｉの51Ｃｒで３７℃にて１
時間標識した。洗浄後、細胞を丸底マイクロタイタープレートのウエル当たり５
×１０3にて植え付け、種々の濃度の細胞障害性エフェクター細胞とともに４時
間インキュベートした。比溶解を上記のようにして決定した。ＴＮＦ−α放出試
験については、１×１０4のペプチド刺激細胞を２５Ｕ／ｍｌのｒｈＩＬ−２の
存在下、２００μｌのＣＭ中、３７℃にて２×１０4の培養メラノーマ細胞とと
もにインキュベートした。２４時間後、放出されたＴＮＦ−αをＥＬＩＳＡ（R
& D Systems、ヴィーズバーデン、ＦＲＧ）により上澄み液中で決定した。
【０１５６】 図７は、健康なドナーおよび黒色腫患者からのＰＢＭＣで得られた代表的な実
験のデータを示す。両ドナーからのＰＢＭＣはペプチド特異的な細胞障害活性を
誘発することができた。ペプチド認識の特異性は、チロシナーゼペプチドを添加
しないＴ２標的細胞も制限ＨＬＡ−Ａ*０２０１アレルを欠如する突然変異メラ
ノーマ細胞株ＳＫ２９−Ｍｅｌ１.２２のいずれも生成した細胞障害性エフェク
ター細胞を活性化することができなかった対照実験により得られた。細胞障害活
性が真実、ＣＤ８+Ｔ細胞によって引き起こされたことは、ＣＤ８+Ｔ細胞の選択
的なイムノマグネチック除去によって細胞障害活性が完全に排除されたことによ
り示された。
【０１５７】実施例８ ：抗体Ｍ−ＤＣ８の可変領域（ＶLおよびＶH）のクローニング モノクローナル抗体Ｍ−ＤＣ８の可変領域ＶLおよびＶHを、Orlandiら（Proc.
Natl.Acad.Sci.USA 86(1989),3833-3837）の記載に従い、対応ハイブリドーマ細
胞株（ＤＳＭ ＡＣＣ２２４）の全ＲＮＡからクローニングした。ＶLおよびＶH
のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を図９および図１０に示す。
【０１５８】実施例９ ：Ｍ−ＤＣ８陽性樹状細胞（Ｍ−ＤＣ８+細胞）と従来のＣＤ１４陽性
樹状細胞（ＤＣ）との比較 免疫単離法を用い、モノクローナル抗体Ｍ−ＤＣ８（受託番号：ＤＳＭ ＡＣ
Ｃ２２４１にて寄託してある）を用いて単離したＤＣを、抗ＣＤ１４モノクロー
ナル抗体を用いて単離した単球由来ＤＣと、エンドサイトーシス能および抗原提
示細胞に特徴的な表面マーカーの発現に関して比較した。
【０１５９】 Ｍ−ＤＣ８陽性細胞を、バフィーコート（５〜８×１０8ＰＢＭＣ）当たりハ
イブリドーマ細胞株Ｍ−ＤＣ８（ＤＳＭ ＡＣＣ２２４１）からの３０μｌの上
澄み液を用いてヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離した。すべての実験に
おいて、同じ健康なドナーから得たサンプルを用いた。ラット抗マウスＩｇＭを
コーティングしたマグネチックビーズ（ともにMiltenyi l.ベルギッシュ・グラ
ードバッハ、ドイツ）[Werden die "beads" mit diesen IgM beladen order wer
den sie so gekauft? Wurde ein sog. "sandwich bead" hergestellt?]により細
胞を回収した。
【０１６０】 新たに単離したＭ−ＤＣ８陽性細胞を、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１％非必須
アミノ酸、１％ピルビン酸、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン（すべてGibco）、
５０μＭ ２−メルカプトエタノール（Merck）、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ；
HyClone Laboratories）、５０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ（Leucomax; Novartis
）および１０００Ｕ／ｍｌのヒト組換えＩＬ−４（Basel Institute for Immuno
logy）を補充したＲＰＭＩ培地中で３×１０5／ｍｌにて７日間培養した。従来
のＤＣは、マグネチックマイクロビーズに結合させた抗ＣＤ１４抗体（Miltenyi
l.ベルギッシュ・グラードバッハ、ドイツ）を用い、本質的に記載に従って（S
allusto, J.Exp.Med.179(1994),1109-1118）ヒト末梢血単核細胞から単離した。
ＣＤ１４+細胞（〜９９％純度）をＭ−ＤＣ８陽性細胞について上記で記載した
のと同様にして培養した。Salmonella abortus equi（Sigma）からの１μｇ／ｍ
ｌのリポ多糖（ＬＰＳ）を４０時間かけて添加することによりＤＣ成熟を誘発さ
せた。
【０１６１】 ＤＣは抗原捕捉のために２つの特別の機構：マンノースレセプター系およびマ
クロピノサイトーシスを有する（Sallustoら、J.Exp.Med.182(1995),389-400）
。これら系は、ＤＣがＭＨＣクラスII区画中に巨大分子を取り込み、濃縮するこ
とを可能にする。マクロファージとは対照的に、ＤＣは非常に高くかつ構成的な
（constitutive）レベルのマクロピノサイトーシスを示す。他のすべての細胞型
では表面分子は選択的な分子フィルターとして機能する被覆壁孔（pits）を介し
て嵌入されるが、ＤＣではすべての表面分子は主としてマクロピノサイトーシス
（非選択的なプロセスである）を介して嵌入される。
【０１６２】 培養したＭ−ＤＣ８+細胞と従来のＤＣとのエンドサイトーシス能を、２つの
古典的なマーカー：ルシフェールイエローＣＨ（ＬＹ；カリウム塩；Molecular
Probes Inc.、オイゲネ、ＯＲ）およびリジン固定（fixable）ＦＩＴＣ−デキス
トラン（ＦＩＴＣ−ＤＸ；Molecular Probes Inc.）を用いて調べた。両マーカ
ーは、ＦＡＣＳ分析により単一細胞レベルでの取り込みの定量を可能にする。細
胞を２５ｍＭ ＨＥＰＥＳで３７℃にて緩衝した１０％ＦＣＳ培地中に再浮遊さ
せた。ＦＩＴＣ−ＤＸまたはＬＹを最終濃度１ｍｇ／ｍｌにて３０分間かけて添
加した。細胞を１％ＦＣＳおよび０.０１％ＮａＮ3を含有する冷ＰＢＳで４回洗
浄し、死んだ細胞を排除するためにプロピジウムヨーダイド（propidium iodide
）を用いてＦＡＣＳｃａｎ（Becton Dickinson）で分析した。バックグラウンド
（０℃でパルスした細胞）を差し引いた。Ｍ−ＤＣ８+細胞は従来のＤＣに比べ
て流動相の取り込み活性が２倍であったが（図１１、左のパネル）、マンノース
レセプターを介したＦＩＴＣ−ＤＸの取り込みは匹敵するレベルであった（図１
１、右のパネル）。
【０１６３】 Ｍ−ＤＣ８陽性細胞および従来のＤＣ上での抗原提示細胞に特徴的な細胞表面
マーカーの発現をＦＡＣＳにより分析した。マウスモノクローナル抗体を用い、
ついでＦＩＴＣ−またはＰＥ−コンジュゲートしアフィニティー精製したイソ型
特異的ヤギ抗マウス抗体（Southern Biotechnology Associates、バーミンガム
、ＡＬ）を添加して、細胞表面染色を行った。以下のモノクローナル抗体を用い
た：Ｗ６／３２（ＩｇＧ２ａ、抗ＨＬＡクラスI；Basel Inst. of Immunologyよ
り入手）；ＨＢ５５（ＩｇＧ２ａ、抗ＨＬＡクラスII；Basel Inst. of Immunol
ogyより入手）；ＩＴ２.２（ＩｇＧ２ｂ、抗Ｂ７.２；Pharmingenより入手）お
よびＭ−ＤＣ８ ＩｇＭモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株か
らの上澄み液。
【０１６４】 図１２に示すように、新たに単離したＭ−ＤＣ８陽性細胞は、新たに単離した
従来のＣＤ１４陽性ＤＣ先駆細胞に匹敵するレベルのＨＬＡクラスIおよびクラ
スIIおよびコスティミュラトリー分子Ｂ７.２の発現を示した。唯一の違いは、
従来のＤＣ先駆細胞からはＭ−ＤＣ８抗原が存在しないことであった。ＧＭ−Ｃ
ＳＦおよびＩＬ−４の存在下で７日間培養した後、Ｍ−ＤＣ８陽性細胞は有意に
上昇したレベルのＨＬＡクラスIおよびクラスII分子並びにＢ７.２の表面発現を
示した（図１３、Ａ、上側のパネル）。従来のＤＣもまたこれら４つの分子の発
現の増大を示したが、Ｍ−ＤＣ８陽性細胞で観察されたレベルには達しなかった
（図１３、Ａ、下側のパネル）。
【０１６５】 ＬＰＳで４０時間刺激すると、ＨＬＡクラスIおよびII発現のさらなる増大が
Ｍ−ＤＣ８陽性細胞および従来のＤＣの両者で認められた（図１３、Ｂ）。再び
、ＤＣ８陽性細胞はより高いレベルのＨＬＡ発現に達した。最も劇的であったの
は、ＬＰＳに応答したＢ７.２表面発現の増大であった。以上をまとめると、こ
れらのデータは、Ｍ−ＤＣ８陽性ＤＣが従来の単球由来ＤＣに匹敵するマンノー
スレセプターを介したエンドサイトーシス能および従来のＤＣよりも優れたミク
ロピノサイトーシス能を有することを示している。同様に、Ｍ−ＤＣ８陽性ＤＣ
は、非刺激およびＬＰＳ誘発の両条件下で従来のＤＣを上回る抗原提示分子およ
びＴ細胞コスティミュラトリー分子の表面発現レベルを有する。これらデータは
、モノクローナル抗体ｍＤＣ８が、ヒト血液から免疫応答の誘発のための抗原の
取り込みおよび提示の非常に高い能力を有する細胞集団を単離することができる
ことを示している。
【０１６６】実施例１０ ：Ｍ−ＤＣ８抗原を発現するJurkat Ｔ細胞リンパ腫サブクローンの
確立 Jurkatは、もともとヒトＴ細胞リンパ腫に由来する細胞株である。図１４に示
すように、これら細胞は通常、Ｍ−ＤＣ８によって認識される抗原を発現しない
（上側のパネル、左上の四分円）。しかしながら、極めて少数の細胞（＜１％）
がＭ−ＤＣ８と反応するのが認められた（左上側の四分円中の２つのＭ−ＤＣ８
陽性細胞を参照）。これら細胞をＭ−ＤＣ８モノクローナル抗体を用いた複数回
のセルソーティングおよび引き続く増殖により単離した。最終的に、Ｍ−ＤＣ８
抗原を高レベルで安定に発現するJurkatＴリンパ腫細胞のサブクローンを確立す
ることができた（図１４、左下側のパネル）。同様に、Ｍ−ＤＣ８陽性細胞を除
去することにより、Ｍ−ＤＣ８発現細胞を本質的に欠如しているJurkatサブクロ
ーンが確立された（図１４、右下側のパネル）。これら２つのJurkatサブクロー
ンを用い、Ｍ−ＤＣ８抗原並びに該Ｍ−ＤＣ８抗原を認識する他のモノクローナ
ル抗体を特徴付けた（以下の実施例１２を参照）。
【０１６７】実施例１１ ：モノクローナル抗体Ｍ−ＤＣ８によって認識される抗原の特徴 Ｍ−ＤＣ８モノクローナル抗体によって認識される抗原は、膜タンパク質のポ
リペプチド構造かまたは炭水化物残基のいずれかである。炭水化物構造は、膜タ
ンパク質の細胞外ドメインかまたは脂質二重層に組み込まれた成分である糖脂質
のいずれか、またはその両者に結合していることが考えられる。この問題を調べ
るため、Ｍ−ＤＣ８ ＩｇＭの結合について脂質を分析した。これら脂質を細胞
膜（Ｍ−ＤＣ８陰性かまたはＭ−ＤＣ８陽性のいずれかである上記Jurkatサブク
ローンから単離した）から抽出した。
【０１６８】 Jurkat細胞（３〜５×１０9）を遠心分離により回収し、ＰＢＳ中で３回洗浄
し、１５ｍｌの１：２クロロホルム／メタノール中で５分間超音波処理した。２
０００×ｇで１０分間遠心分離した後、上澄み液を回収し、細胞ペレットを１５
ｍｌのクロロホルム／メタノールで２回再抽出した。プールした抽出物を真空乾
燥させ、５０ｍｌのＫＣｌ ０.８８％中に再懸濁した。懸濁液を２.８×１０ｃ
ｍ Ｃ１８カラム（Bakerbond）に負荷した。５０ｍｌのＫＣｌ溶液で洗浄し、２
００ｍｌの蒸留水で脱塩（de-sulfing）した後、脂質を２５０ｍｌのエタノール
で溶出した。真空乾燥した溶出液を５ｍｌのクロロホルム／メタノール中に溶解
した。１ｍｌの水を加え、攪拌した後、下層を１ｍｌの水で再抽出し、コンバイ
ンした上層（膜脂質を含有する）を真空下で還元し（reduced）凍結乾燥した。
【０１６９】 脂質抽出物の１％アリコートを２.５×１０ｃｍ ＨＰＬＣプレート（Merck Si
60）上に負荷し、溶媒としてクロロホルム／メタノール／水（１２０：７０：
１７（容量））を０.０２％塩化カルシウムとともに用いて３５分間展開した。
ウエスタンブロッティングと同様にして、記載に従い（Bethkeら、J.Immunol.Me
thods 89:111-116,1986）クロマトグラムをＭ−ＤＣ８抗体と反応させた。結合
したＭ−ＤＣ８ ＩｇＭをアルカリホスファターゼ（ＡＰ）コンジュゲートヤギ
抗マウスＩｇＭ（μ鎖）（Caltag）により検出した。Ｍ−ＤＣ８は、Ｍ−ＤＣ８
陽性のJurkatサブクローンでのみ得られた２つの区別される脂質バンドと反応し
た（図１５、第一のレーン）。これら２つのバンドは、Ｍ−ＤＣ８陰性のJurkat
Ｔリンパ腫細胞から抽出された脂質を含んでいなかった。これら細胞では非常に
マイナーな別個に移動するバンドのみが検出された（図１５、第二のレーン）。
脂質の脂肪酸残基は通常、免疫原性を呈しないので、これら２つの脂質種とのＭ
−ＤＣ８の免疫反応性はその炭水化物残基によるものと思われた。
【０１７０】 Ｍ−ＤＣ８ ＩｇＭによって認識される炭水化物残基がポリペプチド上にも存
在するか否かを調べるため、組み込まれた膜タンパク質を記載に従って（Pasqua
lら、Electroporesis 18:2573-2581,1997）Ｍ−ＤＣ８陽性およびＭ−ＤＣ８陰
性のJurkat細胞から調製した。調製した膜タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し
、ついでモノクローナル抗体Ｍ−ＤＣ８を用いてウエスタンブロッティングを行
った。結合したＩｇＭの検出はＡＰ−コンジュゲートヤギ抗マウス抗μ抗体（Bi
osource）により行った。Ｍ−ＤＣ８はウエスタンブロッティングにおいて幾つ
かのポリペプチドのバンドを認識した（図１６、レーン１）。このことは、Ｍ−
ＤＣ８抗原がＭ−ＤＣ８陽性のJurkat細胞の種々の組み込まれた膜タンパク質上
にも存在し得ることを示している。そのようなシグナルは、Ｍ−ＤＣ８陰性のJu
rkat Ｔ細胞では得られなかった（図１６、レーン２）。
【０１７１】 Ｍ−ＤＣ８と免疫反応性であったバンドの一つは、抗Ｐ−セレクチン糖タンパ
ク質リガンド１（ＰＳＧＬ−１）抗体（Pharmingen）を用い、ウエスタンブロッ
ティングによりＰＳＧＬ−１として同定された。ＰＳＧＬ−１は多くのリンパ球
細胞型で認められるポリペプチドであり（Yangら、Thromb.Haemost.81:1-7,1999
）、Ｍ−ＤＣ８陽性およびＭ−ＤＣ８陰性のJurkat細胞上に同様の量で存在して
いた（図１６、レーン３およびレーン４）。Ｍ−ＤＣ８陽性ＰＳＧＬ−１と同一
のシグナルは、ヒトＰＢＭＣからＭ−ＤＣ８により単離した樹状細胞からの膜タ
ンパク質をウエスタンブロッティングにより分析したときに得られた（図１６、
レーン５）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでのＰＳＧＬ−１バンドのぼやけた形状は、その
知られた高炭水化物含量のためである。
【０１７２】 以上をまとめると、これらデータは、Ｍ−ＤＣ８抗原がＭ−ＤＣ８陽性Jurkat
サブクローンおよびヒトＭ−ＤＣ８陽性樹状細胞の糖脂質および組み込まれた膜
タンパク質上に存在する炭水化物構造であることを示している。樹状細胞および
Ｍ−ＤＣ８陽性Jurkat細胞上のＭ−ＤＣ８炭水化物抗原に対する一つの主要な担
体タンパク質はＰＳＧＬ−１として同定された。
【０１７３】実施例１２ ：新規な樹状細胞特異的モノクローナル抗体の生成 Ｄ−ＤＣ８.１およびＤ−ＤＣ８.２と称する新規なモノクローナル抗体を、Ｍ
−ＤＣ８陽性JurkatＴリンパ腫サブクローンからの膜調製物か（Ｄ−ＤＣ８.１
について）または完全なＭ−ＤＣ８陽性Jurkat細胞を用いて（Ｄ−ＤＣ８.２に
ついて）Balb/c × Ｃ５７Ｂ１ Ｆ１マウスを免疫することにより生成した。細
胞質膜の調製を、標準法を用い（Pasqualら、Electrophoresis 18:2573-2581,19
97）、細胞の低浸透圧溶解、ついで細胞の機械的破砕、連続的な遠心分離および
膜の洗浄および炭酸ナトリウムで処理することによる周縁膜タンパク質の除去に
より行った。マウスに１５０μｇの等価量の膜タンパク質（Ｄ−ＤＣ８.１につ
いて）または１〜２×１０7細胞（Ｄ−ＤＣ８.２について）を３〜４週間の間隔
で５回の腹腔内注射により注入した。最後の注射の３日後に脾臓細胞を調製し、
Ｍ−ＤＣ８について記載したようにＸ６３Ａｇ８.６５３と融合させた。得られ
た抗体はともにＩｇＭクラスのものであった。
【０１７４】 これら２つのモノクローナル抗体Ｄ−ＤＣ８.１およびＤ−ＤＣ８.２がＭ−Ｄ
Ｃ８と同じ樹状細胞の集団を認識するか否かを調べるため、ヒトＰＢＭＣの二重
免疫蛍光染色の後にヒトＰＢＭＣをＦＡＣＳにより分析した。示したすべての実
験には同じ健康なドナーを用いた。図１７に関し、ヒトＰＢＭＣを、細胞表面マ
ーカーＣＤ１４（左のパネル）、ＨＬＡ−ＤＲ（中央のパネル）またはＣＤ１６
（右のパネル）（すべてPharmingenから得た）を認識する抗体とともにモノクロ
ーナル抗体Ｍ−ＤＣ８（上の列）、Ｄ−ＤＣ８.１（中央の列）またはＤ−ＤＣ
８.２（下の列）で二重染色した。ＩｇＭモノクローナル抗体の検出は、ヤギ抗
マウスフィコエリトリン（ＰＥ）標識抗μ二次抗体（Immunotech）により行った
。
【０１７５】 図１７においてＦＡＣＳスキャンの右上の四分円に認められるように、Ｄ−Ｄ
Ｃ８.１およびＤ−ＤＣ８.２はともにモノクローナル抗体Ｍ−ＤＣ８によって認
識されたのと極めて類似の量のＰＢＭＣを認識した。これら細胞は、ＨＬＡ−Ｄ
Ｒ（図１７、中央のパネル）およびＣＤ１６（右のパネル）の発現は高いが、Ｃ
Ｄ１４（左のパネル）の発現は低いという点で共通であった。このことは、Ｄ−
ＤＣ８.１およびＤ−ＤＣ８.２がともに頻度並びにＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１６およ
びＣＤ１４の細胞表面発現に関して、Ｍ−ＤＣ８によって認識されるものと極め
て類似の特徴を有するＰＢＭＣの別個のサブセットを認識したことを示している
。３つの抗体はすべて、本明細書においてＭ−ＤＣ８樹状細胞として言及するＤ
Ｃのクラスを認識すると思われる。
【０１７６】 モノクローナル抗体Ｄ−ＤＣ８.１およびＤ−ＤＣ８.２がともにＭ−ＤＣ８抗
原を認識することを実証するため、これら抗体をＭ−ＤＣ８陰性およびＭ−ＤＣ
８陽性Jurkatサブクローンへの結合について試験した。両抗体はＭ−ＤＣ８陰性
のJurkat細胞には有意に結合しなかったが（図１８、左のパネル、左上の四分円
）、Ｍ−ＤＣ８陽性のJurkat細胞にはともに強く反応した（右のパネル）。 要約すると、これら結果は、Ｍ−ＤＣ８抗原（新規なクラスの樹状細胞に特徴
的である）は少なくとも２つの他のモノクローナル抗体Ｄ−ＤＣ８.１およびＤ
−ＤＣ８.２によって認識され得ることを示している。
【０１７７】参照文献
【表２】
【０１７８】
【表３】
【０１７９】
【表４】
【０１８０】
【表５】
【０１８１】
【表６】
【０１８２】
【表７】
【０１８３】
【表８】
【０１８４】
【表９】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 Ｍ−ＤＣ８+細胞の頻度、サイズおよび顆粒度。赤血球の溶解お
よびモノクローナル抗体Ｍ−ＤＣ８とそれに続くフィコエリトリンコンジュゲー
ト抗Ｉｇ抗体による染色後のヒト末梢血血球のフローサイトメトリー分析（Ａ）
。各四分円中の数字は細胞のパーセントを示す。ゲートを開いた（gated）Ｍ−
ＤＣ８+細胞の散乱プロフィルを（Ｂ）に示す。比較のため、（Ｃ）はゲートを
開いていない（ungated）白血球の散乱プロフィルを示す。
【図２】 Ｍ−ＤＣ８+細胞上の細胞系列特異的なおよびＤＣに関連する表
面マーカーの発現およびＭ−ＤＣ８+細胞のイムノマグネチック単離の効率の分
析。Ｍ−ＤＣ８+細胞の二重免疫蛍光染色を、ＰＢＭＣ（Ａ、ＥおよびＧ）、Ｔ
細胞涸渇ＰＢＭＣ（Ｂ−Ｄ）、Ｔ細胞およびＢ細胞涸渇ＰＢＭＣ（Ｆ）または精
製Ｍ−ＤＣ８+細胞（Ｈ）上で行った。細胞内ｐ５５抗原の検出のため（Ｅ）、
未分離のＰＢＭＣをＭ−ＤＣ８抗原に対して染色し、パラホルムアルデヒドで固
定し、サポニンで透過性にし、ついでｐ５５特異的モノクローナル抗体で標識し
た。ＣＤ８３抗原はＴ細胞およびＢ細胞涸渇ＰＢＭＣ上で示され、Ｍ−ＤＣ８モ
ノクローナル抗体およびＣＤ８３モノクローナル抗体で同時に染色しながら４８
時間培養した（Ｆ）。マグネチックセルソーティングによるＰＢＭＣからのＭ−
ＤＣ８+細胞の単離前後のＭ−ＤＣ８+細胞およびＨＬＡ−ＤＲ+細胞の頻度を（
Ｇ）および（Ｈ）に示す。結果は２０人（Ａ−Ｄ、ＧおよびＨ）および５人（Ｅ
およびＦ）の異なるドナーを表すものである。各四分円中の数字は細胞のパーセ
ントを示す。
【図３】 Ｍ−ＤＣ８+細胞の形態および食作用活性。上側のパネルでは、
単離直後（Ａ）およびインビトロで４８時間培養後（Ｂ）の精製Ｍ−ＤＣ８+細
胞のサイトスピンを示す。下側のパネルはラテックスビーズを食作用した後（Ｃ
）または抗体コーティングＳＲＢＣを食作用した後（Ｄ）のＭ−ＤＣ８+細胞を
示す。光学顕微鏡のため、細胞をMay-Gruenwald/Giemsa染色した（Ａ、Ｂおよび
Ｄ、倍率×１００）。（Ｃ）では細胞をゼラチンに包埋した後、共焦レーザース
キャニング顕微鏡に供した。
【図４】 Ｍ−ＤＣ８+細胞によるＴ細胞の刺激。精製Ｔ細胞（１×１０5）
を外来可溶性抗原の存在下（Ｃ、Ｄ）または不在下（Ａ、Ｂ）で段階的な数のＭ
−ＤＣ８+細胞（黒丸）かまたはＣＤ１４+単球（白丸）とともに培養した。（Ａ
）、同種ＡＰＣ；（Ｂ）、自己由来ＡＰＣ；（Ｃ）、ＴＴ（５μｇ／ｍｌ）の存
在下での自己由来ＡＰＣ；（Ｄ）ＫＨＬ（１μｇ／ｍｌ）の存在下での自己由来
ＡＰＣ。５日後（Ａ、Ｃ）または７日後（Ｂ、Ｄ）にＴ細胞の増殖を3Ｈ−チミ
ジン取り込みにより決定した。（Ｃ）および（Ｄ）において可溶性抗原の不在下
でのＴ細胞増殖の値を全ｃｐｍから差し引いた。図示した値は３つのサンプルの
平均値を表す。ＳＥＭは＜１５％であった。（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）に示す
結果は６つの独立した実験を表し、（Ｄ）は３つの異なる実験を表す。
【図５】 ペプチドを積載したＭ−ＤＣ８+細胞およびＣＤ１４+単球による
ＣＴＬクローンの刺激。Ｍ−ＤＣ８+細胞およびＣＤ１４+単球をチロシナーゼ由
来ペプチド（１００μｇ／ｍｌ）で一夜パルスし、ついでチロシナーゼ特異的な
クローニングＣＴＬとともにさらに４０時間培養した。Ｔ細胞の活性化を、３つ
の培養の上澄み液に分泌されたＴＮＦ−αを決定することによりアッセイした。
縦列は３つの個々の値の平均であり、足し算で表してある。
【図６】 アロ抗原特異的細胞障害性Ｔエフェクター細胞の誘発。未分離の
Ｔリンパ球（Ａ）および精製ＣＤ８+Ｔリンパ球（Ｂ）を同種Ｍ−ＤＣ８+細胞（
黒丸）またはＣＤ１４+単球（白丸）とともに７日間培養した。Ｔリンパ球を４
時間クロム放出試験において51Ｃｒ標識スティミュレータータイプＰＨＡ芽球細
胞に対して試験した。
【図７】 チロシナーゼ由来ペプチドに特異的な細胞障害性エフェクター細
胞の誘発。健康なドナーおよび黒色腫患者からのＰＢＭＣを、精製自己由来Ｍ−
ＤＣ８+細胞により提示されるチロシナーゼ由来ノナマー（９量体）ペプチドに
対して４回の連続的な刺激により活性化した。（Ａ）エフェクター／標的細胞比
４０：１でのペプチドを積載した51Ｃｒ標識Ｔ２細胞の特異的溶解。（Ｂ）チ
ロシナーゼを欠くまたは発現する黒色腫細胞と接触した後にエフェクター細胞に
より放出されるＴＮＦ−α（Ｅ／Ｔ比 １：２）。棒は３つの決定の平均値を示
し、ＳＥＭは＜１５％であった。
【図８】 表面マーカー発現に基づいて特徴付けた種々のヒト血液ＤＣサブ
セットの概要。
【図９】 モノクローナル抗体ＤＣ８の可変領域の重鎖（ＶＨ）をコードす
るｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１）およびそれから導かれる１文字コ
ードでのアミノ酸配列（配列番号２）。番号は、示したトリプレットの３'末端
のヌクレオチド配列位置を指している。配列の５'末端および３'末端を示してあ
る。
【図１０】 モノクローナル抗体ＤＣ８の可変領域の軽鎖（ＶＬ）をコード
するｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号３）およびそれから導かれる１文字
コードでのアミノ酸配列（配列番号４）。番号は、示したトリプレットの３'末
端のヌクレオチド配列位置を指している。配列の５'末端および３'末端を示して
ある。
【図１１】 ｍＤＣ８陽性細胞（黒い棒）と従来のＤＣ（斜線を付した棒）
とのエンドサイトーシス能の比較。マイクロピノサイトーシスを、ルシフェール
イエローを用いたＦＡＣＳ（ＬＹ取り込み；左のパネル）およびＦＩＴＣコンジ
ュゲートデキストランによるマンノースレセプターにより媒体された取り込み（
ＦＩＴＣ−ＤＸ；右のパネル）により測定した。ＦＡＣＳ分析からの結果を定量
化し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表した。
【図１２】 新たに単離したｍＤＣ８陽性細胞（上側のパネル）と従来のＤ
Ｃの前駆細胞（ＣＤ１４由来；下側のパネル）の間の細胞表面分子発現能の比較
。ＦＡＣＳ分析からのヒストグラムプロットを示す。第一のヒストグラムは二次
抗体単独で得られた。ｙ軸は細胞数を示す；ｘ軸は蛍光強度を示し、細胞表面発
現レベルの測定値である。表面抗原の名称の下の数字は、計算した平均蛍光強度
を与えている。
【図１３】 培養したｍＤＣ８陽性細胞（上側のパネル）と従来のＤＣの前
駆細胞（ＣＤ１４由来；下側のパネル）の間の細胞表面分子発現能の比較。Ａ．
ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４のみの存在下で７日間培養した細胞；Ｂ．第５日目
のＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４培養を１μｇ／ｍｌのＬＰＳで４０時間刺激した細胞
。ＦＡＣＳ分析からのヒストグラムプロットを示す。第一のヒストグラムは二次
抗体単独で得られた。ｙ軸は細胞数を示す；ｘ軸は蛍光強度を示し、細胞表面発
現レベルの測定値である。表面抗原の名称の下の数字は、計算した平均蛍光強度
を与えている。
【図１４】 モノクローナル抗体Ｍ−ＤＣ８によって認識される抗原を発現
するまたは発現しないJurkat Ｔリンパ種細胞サブクローンの確立。Jurkat Ｔ細
胞をＭ−ＤＣ８ ＩｇＭでの染色およびＰＥコンジュゲート抗ＩｇＭ抗体での検
出後のＦＡＣＳにより分析した（ｙ軸）。通常のJurkat Ｔ細胞（上側のパネル
）は極めてわずかしかＭ−ＤＣ８陽性細胞を有しない（左上側の四分円）。これ
ら細胞を単離し、多くの回数の選択を行って増殖させ、Ｍ−ＤＣ８を高度に発現
するサブクローンとした（左下側のパネル）。実質的にＭ−ＤＣ８陽性細胞を示
さないJurkat細胞のサブクローン（右下側のパネル）を、Ｍ−ＤＣ８抗体で修飾
したマグネチックビーズを用いてＭ−ＤＣ８陽性細胞を涸渇させることにより単
離した。
【図１５】 Ｍ−ＤＣ８抗原を発現するJurkatから抽出した糖脂質へのモノ
クローナル抗体Ｍ−ＤＣ８の結合。脂質は、Ｍ−ＤＣ８抗原を高度に発現するか
（レーン１）または該抗原を発現しない（レーン２）Jurkatサブクローンから抽
出した。脂質を薄層クロマトグラフィーにより分離し、クロマトグラムをＭ−Ｄ
Ｃ８ＩｇＭでプローブし、二次抗ＩｇＭ抗体により検出した。脂質によるウエス
タンブロッティングを示す。Ｍ−ＤＣ８ ＩｇＭと免疫応答反応する２つの脂質
の位置を矢印により示す。白丸はＭ−ＤＣ８陰性細胞からのマイナーなバンドを
記録したものである。
【図１６】 モノクローナル抗体Ｍ−ＤＣ８と免疫反応する膜タンパク質の
特徴付け。組み込まれた（integral）膜タンパク質を、Ｍ−ＤＣ８陽性Jurkat細
胞（レーン１および３）、Ｍ−ＤＣ８陰性Jurkat細胞（レーン２および４）およ
びヒトＰＢＭＣから単離したＭ−ＤＣ８陽性樹状細胞（レーン５）から調製した
。ウエスタンブロッティングを示す。レーン１、２および５についてはフィルタ
ーをＭ−ＤＣ８ ＩｇＭでプローブし、二次抗ＩｇＭ抗体により検出した。レー
ン３および４については糖タンパク質ＰＳＧＬ−１を認識する抗体を使用した。
ＰＳＧＬ−１の位置（右）および３つのＭ−ＤＣ８陽性タンパク質の位置（左）
を矢印で示す。２００および１１６ｋＤａの２つの分子量標準の位置を右側に示
す。
【図１７】 モノクローナル抗体Ｄ−ＤＣ８.１およびＤ−ＤＣ８.２により
認識されるＰＢＭＣの特徴付け。同じドナーからのヒトＰＢＭＣを、ＣＤ１４、
ＨＬＡ−ＤＲまたはＣＤ１６に対する抗体および所定の３つのモノクローナル抗
体で二重標識し、ＦＡＣＳにより分析した。二重に陽性の細胞は右上の四分円に
認められる。
【図１８】 Ｍ−ＤＣ８抗原を発現するJurkatサブクローンへのモノクロー
ナル抗体Ｄ−ＤＣ８.１およびＤ−ＤＣ８.２の結合。Ｍ−ＤＣ８抗原を発現する
Jurkatサブクローン（Ｍ−ＤＣ８+）およびＭ−ＤＣ８抗原を発現しないJurkat
サブクローン（Ｍ−ＤＣ８-）をＤ−ＤＣ８.１およびＤ−ＤＣ８.２への結合に
ついて試験した。ＦＡＣＳ分析を示す。モノクローナル抗体ＩｇＭをＰＥコンジ
ュゲート抗ＩｇＭ抗体により検出した（Ｙ軸）。該モノクローナル抗体に結合す
る細胞を左上の四分円に示す。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年７月１７日（２０００．７．１７）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【請求項５４】 インビトロでＤＣを増殖させる方法であって、 （ａ）請求項３１に記載のＤＣを、ＤＣの増殖を支持する特定のサイトカイン混
合物中で培養し、ついで／または （ｂ）形質転換遺伝子を形質導入することにより該ＤＣを不死化する ことを含む方法。
【手続補正書】
【提出日】平成１３年５月３０日（２００１．５．３０）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３２】 さらに、本発明の抗体は、該樹状細胞上のエピトープを認識、検出および／ま
たは反応する抗体であり、ハイブリドーマ細胞株ＤＳＭ ＡＣＣ２３９９または
ＤＳＭ ＡＣＣ２３９８によって産生される。これらハイブリドーマ細胞株は、
ブダペスト条約に従ってカルチャーコレクションＤＳＭＺ（ブラウンシュベイク
、ドイツ）に１９９９年５月５日に寄託してある。上記および付属の実施例に記
載するように、これら新規なモノクローナル抗体Ｄ−ＤＣ８.１およびＤ−ＤＣ
８.２は上記特定のＭ−ＤＣ８＋細胞を認識するさらなる抗体を提供する。Ｍ−
ＤＣ８と同様、モノクローナル抗体Ｄ−ＤＣ８.１およびＤ−ＤＣ８.２はとりわ
け本発明の樹状細胞の免疫単離、免疫局在化および／または精製に用いることが
できる。さらに、これらモノクローナル抗体はまた、本発明によるＤＣと相互作
用するまたは相互作用できる化合物を検出および同定するのにも有用である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３４】 さらに、本発明は、本発明の抗体を産生することのできる連続的で安定な抗体
産生細胞株に関する。該細胞株はハイブリドーマ細胞株、好ましくは受託番号Ｄ
ＳＭ ＡＣＣ２２４１、受託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２３９９または受託番号ＤＳＭ
ＡＣＣ２３９８を有するハイブリドーマ細胞株であってよい。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８３
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１８３】
【表８】
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８４
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１８４】
【表９】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｐ 31/00 Ａ６１Ｐ 31/00 35/00 35/00 Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ０７Ｋ 14/705 16/18 16/18 16/46 16/46 19/00 19/00 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｃ１２Ｑ 1/68 33/577 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/68 33/577 (Ｃ１２Ｐ 21/08 33/68 Ｃ１２Ｒ 1:91） //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＣ Ｃ１２Ｒ 1:91） 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ

Claims (54)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 （i）末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からの未熟および／また
    は成熟樹状細胞（ＤＣ）の特性を表示するＤＣ上のエピトープとは反応するが （ii）他のＰＢＭＣとは反応しない 抗体。
  2. 【請求項２】 該ＤＣが未熟ＤＣと成熟ＤＣとの間の成熟化段階のＤＣ集団
    である、請求項１に記載の抗体。
  3. 【請求項３】 該ＤＣがＨＬＡ−ＤＲ+である、請求項１または２に記載の
    抗体。
  4. 【請求項４】 該ＤＣがＣＤ６４-、ＣＤ３３+、ＣＤ４５ＲＡ+、ＣＤ１１
    ｃ+およびｐ５５-および主としてＣＤ１６+である、請求項１ないし３のいずれ
    かに記載の抗体。
  5. 【請求項５】 該ＤＣがリンパ球と単球との間に位置する限定されたサイズ
    および顆粒度を有する、請求項１ないし４のいずれかに記載の抗体。
  6. 【請求項６】 モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒ
    ト化抗体、２特異的抗体、合成抗体、抗体断片、またはこれらのいずれかの化学
    的に修飾した誘導体である、請求項１ないし５のいずれかに記載の抗体。
  7. 【請求項７】 腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、Ｔ細胞、腫瘍関連タンパク質
    または微生物タンパク質に特異的なエピトープを認識する、請求項６に記載の２
    特異的抗体。
  8. 【請求項８】 該ＤＣがハイブリドーマ細胞株ＤＳＭ ＡＣＣ２２４１によ
    って、ハイブリドーマ細胞株ＤＳＭ ＡＣＣ によって、またはハイブリ
    ドーマ細胞株ＤＳＭ ＡＣＣ によって産生される抗体によって認識され
    る、請求項１ないし７のいずれかに記載の抗体。
  9. 【請求項９】 ハイブリドーマ細胞株ＤＳＭ ＡＣＣ２２４１、ＤＳＭ ＡＣ
    Ｃ またはＤＳＭ ＡＣＣ によって産生される、請求項１ないし
    ８のいずれかに記載の抗体。
  10. 【請求項１０】 請求項１ないし１０のいずれかに記載の抗体を産生するこ
    とができる、連続的で安定な抗体産生細胞株。
  11. 【請求項１１】 ハイブリドーマ細胞株、好ましくは受託番号ＤＳＭ ＡＣ
    Ｃ２２４１、ＤＳＭ ＡＣＣ またはＤＳＭ ＡＣＣ を有するハイ
    ブリドーマ細胞株である、請求項１０に記載の細胞株。
  12. 【請求項１２】 請求項１ないし９のいずれかに記載の抗体により認識され
    る抗原またはそのエピトープ。
  13. 【請求項１３】 請求項１ないし９のいずれかに記載の抗体の免疫グロブリ
    ン鎖の少なくとも可変領域をコードするポリヌクレオチド。
  14. 【請求項１４】 任意に該抗体の他の免疫グロブリン鎖の可変領域をコード
    する請求項１３に記載のポリヌクレオチドとともに、請求項１３に記載のポリヌ
    クレオチドを含むベクター。
  15. 【請求項１５】 請求項１３に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１４に
    記載のベクターを含む宿主細胞。
  16. 【請求項１６】 末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からの未熟および成熟樹状細
    胞（ＤＣ）を認識することができる抗体またはその機能的断片または誘導体の製
    造方法であって、 （ａ）請求項１０、１１または１５のいずれかに記載の細胞を培養し、ついで （ｂ）該抗体、またはその機能的断片または免疫グロブリン鎖を培地から単離す
    る ことを含む方法。
  17. 【請求項１７】 請求項１３に記載のポリヌクレオチドによりコードされる
    かまたは請求項１６に記載の方法により得ることのできる、抗体、その断片また
    は誘導体または免疫グロブリン鎖。
  18. 【請求項１８】 （ａ）請求項１ないし９および１７のいずれかに記載の抗
    体の結合部位のドメインまたは請求項１２に記載の抗原またはエピトープ；およ
    び （ｂ）少なくとも一つのさらなるドメイン を含むポリペプチド。
  19. 【請求項１９】 該ドメインが共有結合または非共有結合により連結されて
    いる、請求項１８に記載のポリペプチド。
  20. 【請求項２０】 該少なくとも一つのさらなるドメインが、生物学的活性に
    適したコンホメーションを有するか、イオンを封鎖し得るか、または固相支持体
    もしくは前以て選択した抗原決定基に選択的に結合できるエフェクター分子を含
    む、請求項１８または１９に記載のポリペプチド。
  21. 【請求項２１】 該エフェクター分子が、酵素、毒素、レセプター、結合部
    位、生合成抗体結合部位、成長因子、細胞分化因子、リンホカイン、サイトカイ
    ン、ホルモン、遠隔的に検出しうる残基、または抗代謝産物である、請求項２０
    に記載のポリペプチド。
  22. 【請求項２２】 イオンを封鎖しうる該分子が、カルモジュリン、メタロチ
    オネイン、その断片、またはグルタミン酸、アスパラギン酸、リジンおよびアル
    ギニンの少なくとも一つに富むアミノ酸配列である、請求項２０に記載のポリペ
    プチド。
  23. 【請求項２３】 固相支持体に選択的に結合しうる該分子が、正または負に
    荷電したアミノ酸配列、システイン含有アミノ酸配列、ストレプトアビジン、St
    aphylococcusタンパク質Ａの断片、ＧＳＴ、ＨｉｓタグまたはＬｅｘＡである、
    請求項２０に記載のポリペプチド。
  24. 【請求項２４】 該レセプターが、Ｔ細胞活性化に重要なコスティミュラト
    リー表面分子であるか、またはエピトープ結合部位もしくはホルモン結合部位を
    含む、請求項２１に記載のポリペプチド。
  25. 【請求項２５】 該コスティミュラトリー表面分子がＣＤ８０（Ｂ７−１）
    またはＣＤ８６（Ｂ７−２）である、請求項２４に記載のポリペプチド。
  26. 【請求項２６】 発現により請求項１２に記載の抗原またはエピトープまた
    は請求項１８ないし２５のいずれかに記載のポリペプチドをコードする、ポリヌ
    クレオチド。
  27. 【請求項２７】 請求項２６に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  28. 【請求項２８】 請求項２６に記載のポリヌクレオチドまたは請求項２７に
    記載のベクターでトランスフェクションした細胞。
  29. 【請求項２９】 請求項１２に記載の抗原またはエピトープまたは請求項１
    ８ないし２５のいずれかに記載のポリペプチドまたはその断片の製造方法であっ
    て、請求項２８に記載の細胞を培養し、ついで培養液からポリペプチドを単離す
    ることを含む方法。
  30. 【請求項３０】 請求項１ないし４のいずれかに記載のＤＣを末梢血から単
    離または同定する方法であって、工程： （ａ）末梢血のサンプルを請求項１ないし９のいずれかに記載の抗体と接触させ
    ； （ｂ）抗体／ＤＣ複合体の存在を検出し；ついで／または （ｃ）該抗体またはその機能性の断片に結合した樹状細胞を回収する を含む方法。
  31. 【請求項３１】 請求項１ないし４のいずれかに定められ、請求項１ないし
    ９のいずれかに記載の抗体によって認識され、請求項１２に記載の抗原またはエ
    ピトープを含み、または請求項３０に記載の方法によって得ることのできる樹状
    細胞。
  32. 【請求項３２】 組換え核酸分子を発現するように改変された、請求項３１
    に記載の樹状細胞。
  33. 【請求項３３】 活性化された抗原特異的ヒトＴ細胞をインビトロで製造す
    る方法であって、Ｔ細胞を請求項３１または３２に記載の樹状細胞（抗原に暴露
    されているかまたは抗原を発現して該抗原に応答してＴ細胞が増殖または細胞障
    害性となるように活性化する）とともに培養することを含む方法。
  34. 【請求項３４】 Ｔ細胞により認識されうる抗原の同定方法であって、 （ａ）該抗原に暴露された請求項３１または３２に記載の樹状細胞とともにＴ細
    胞を培養し、ついで （ｂ）Ｔ細胞の増殖、Ｔ細胞の細胞障害活性またはＴ細胞のリンホカイン産生を
    測定する ことを含む方法。
  35. 【請求項３５】 該Ｔ細胞がＣＤ４+またはＣＤ８+細胞である請求項３３ま
    たは３４に記載の方法。
  36. 【請求項３６】 Ｔ細胞を活性化するまたはコスティミュレートする化合物
    の同定方法であって、 （ａ）請求項３１または３２に記載の樹状細胞およびＴ細胞を、Ｔ細胞活性化に
    応答して検出可能なシグナルを生成しうる成分の存在下、スクリーニングしよう
    とする化合物とともに該化合物と該細胞との相互作用を可能とする条件下にて培
    養し、ついで （ｂ）Ｔ細胞の活性化により生成したシグナルの存在を検出する ことを含む方法。
  37. 【請求項３７】 Ｔ細胞活性化または刺激を抑制する化合物を同定する方法
    であって、 （ａ）Ｔ細胞および請求項３１または３２に記載の樹状細胞を、Ｔ細胞アクチベ
    ーターによる該Ｔ細胞の活性化に応答して検出可能なシグナルを生成しうる成分
    の存在下、スクリーニングしようとする化合物とともに該Ｔ細胞の活性化を可能
    とする条件下にて接触させ、ついで （ｂ）該アクチベーターとＴ細胞との相互作用により生成したシグナルの存在ま
    たは不在を検出する ことを含む方法。
  38. 【請求項３８】 該樹状細胞が培地中でインキュベーションすることにより
    抗原に暴露される、請求項３３ないし３７のいずれかに記載の方法。
  39. 【請求項３９】 該抗原が、腫瘍抗原、ウイルス抗原、微生物抗原、アレル
    ゲン、自己抗原、ウイルス、微生物、ポリペプチド、ペプチドまたは複数の腫瘍
    細胞である、請求項３３ないし３８のいずれかに記載の方法または請求項２１に
    記載のポリペプチド。
  40. 【請求項４０】 請求項３４ないし３９のいずれかに記載の方法の工程、お
    よび工程（ｂ）で同定した化合物を製薬学的に許容しうる形態に調合することを
    含む、医薬組成物の製造方法。
  41. 【請求項４１】 請求項１ないし９および１７のいずれかに記載の抗体、請
    求項１２に記載の抗原またはエピトープ、請求項１８ないし２５のいずれかに記
    載のポリペプチド、請求項１３または２６に記載のポリヌクレオチド、請求項１
    ４または２７に記載のベクター、請求項３１または３２に記載の樹状細胞、請求
    項３３または３５に記載の方法によって得られるＴ細胞または請求項３８ないし
    ４０のいずれかに記載の方法によって得られる化合物を含むキット。
  42. 【請求項４２】 請求項１ないし９および１７のいずれかに記載の抗体、請
    求項１２に記載の抗原またはエピトープ、請求項１８ないし２５のいずれかに記
    載のポリペプチド、請求項１３または２６に記載のポリヌクレオチド、請求項１
    ４または２７に記載のベクター、請求項３１または３２に記載の樹状細胞、請求
    項３３または３５に記載の方法によって得られるＴ細胞または請求項４０に記載
    の方法によって得られる化合物を含む組成物。
  43. 【請求項４３】 さらに製薬学的に許容しうる担体を任意に含む医薬組成物
    である請求項４２に記載の組成物。
  44. 【請求項４４】 請求項１３または２６に記載のポリヌクレオチド、請求項
    １４または２７に記載のベクター、請求項３１または３２に記載の樹状細胞、請
    求項３３または３５に記載の方法によって得られるＴ細胞または請求項１５また
    は２８に記載の細胞を含む非ヒトトランスジェニック動物。
  45. 【請求項４５】 請求項１ないし９および１７のいずれかに記載の抗体、請
    求項１２に記載の抗原またはエピトープ、請求項１８ないし２５のいずれかに記
    載のポリペプチド、請求項１３または２６に記載のポリヌクレオチド、請求項１
    ４または２４に記載のベクターまたは請求項１５または２８に記載の細胞および
    任意に検出に適した手段を含む診断用組成物。
  46. 【請求項４６】 請求項３３に記載の抗原に暴露された樹状細胞または抗原
    発現ＤＣまたは請求項１２に記載の抗原またはエピトープを含むワクチン。
  47. 【請求項４７】 請求項３１または３２に記載の樹状細胞、および疾患に罹
    りやすいヒトまたは動物においてそのような疾患に対して防御的な免疫応答を生
    成しうる請求項３９に記載の少なくとも一つの抗原を含む免疫賦活用組成物。
  48. 【請求項４８】 適合性の免疫療法用医薬組成物を調製するための請求項３
    ３、３５、３８または３９に記載の方法により得られるＴ細胞の使用。
  49. 【請求項４９】 ヒトまたは動物におけるＴ細胞活性化用医薬組成物を調製
    するための、抗原に暴露された請求項３１または３２に記載の樹状細胞の使用。
  50. 【請求項５０】 該樹状細胞への標的細胞補充用医薬組成物を調製するため
    の請求項５または６に記載の２特異的抗体の使用。
  51. 【請求項５１】 標的細胞が腫瘍細胞またはウイルス感染細胞または微生物
    に感染した細胞である、請求項５０に記載の使用。
  52. 【請求項５２】 サイトカインまたはシグナル伝達分子の遺伝子をトランス
    フェクションして免疫応答をインビトロまたはインビボで変調させることによる
    樹状細胞の改変。
  53. 【請求項５３】 Ｔ細胞の抗原特異的活性化を促進、変調または抑制する作
    用を有するＤＣにより合成される分子を同定する方法であって、 （ａ）請求項３１に記載のＤＣによって培養上清中に分泌された分子を分離し、
    ついで富化したまたは単離した該分子を抗原特異的なＴ細胞活性化についてＤＣ
    を欠く細胞培養系で試験し、ついで／または （ｂ）請求項３１に記載のＤＣにおける遺伝子発現を他の抗原提示細胞での遺伝
    子発現と比較する ことを含む方法。
  54. 【請求項５４】 インビトロでＤＣを増殖させる方法であって、 （ａ）請求項３１に記載のＤＣを、ＤＣの増殖を支持する特定のサイトカイン混
    合物中で培養し、ついで／または （ｂ）形質転換遺伝子を形質導入することにより該ＤＣを不死化する ことを含む方法。
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