JPH06121678A

JPH06121678A - 骨関連サルファターゼ様タンパク質およびその製造法

Info

Publication number: JPH06121678A
Application number: JP4324034A
Authority: JP
Inventors: Atsushi Takeshita; 淳竹下; Noriyoshi Ito; 紀美伊東; Yoko Hamamoto; 洋子濱本; Egon Aman; アマン・エゴン
Original assignee: Hoechst Japan Ltd
Current assignee: Sanofi Aventis KK
Priority date: 1992-08-28
Filing date: 1992-12-03
Publication date: 1994-05-06
Also published as: DE69323465T2; EP0590309B1; ES2130198T3; US5627050A; ATE176685T1; EP0590309A2; AU663215B2; CA2104995A1; EP0590309A3; AU4492193A; DK0590309T3; DE69323465D1

Abstract

(57)【要約】【構成】マウス、ヒトを含む哺乳動物の骨組織から得
られるＯＳＦ−８と名付けられた骨関連タンパク質およ
びその製造法。本タンパク質は新しい天然型哺乳類タン
パク質であり、サルファターゼに属するタンパク質であ
る。【効果】ＯＳＦ−８は、主に骨形成期において軟骨組
織から骨組織への変換時に軟骨基質を形成しているプロ
テオグリカンの糖類の硫酸基の分解を行なう。ＯＳＦ−
８は、骨代謝性疾患の治療剤として用いることができ、
また骨に対する臓器特異性が高いので、骨代謝性疾患の
診断剤としても用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新規な骨関連タンパク質
を提供する。本発明は、骨並びに軟骨組織形成並びに維
持能を有する新規なタンパク質（新規のサルファター
ゼ、ＯＳＦ−８）、その活性測定方法、その活性を阻害
あるいは昂進する物質の検出方法、ＯＳＦ−８をコード
するＤＮＡおよびその遺伝子工学的製法によるこのタン
パク質の製造方法、また、精製タンパク質並びに遺伝子
工学的製法によって作られたタンパク質あるいは部分ペ
プチドを用いて製造された特異抗体を利用した免疫学的
測定法による代謝性骨疾患の診断への応用に関する。

【０００２】

【発明の背景】骨代謝性疾患と総称される疾患の中に
は、骨粗鬆症(Osteoporosis)、ページェット病(Paget's
disease)、骨軟化症、過骨形成症、大理石病等が含ま
れ、このうち、特に骨粗鬆症は発生頻度が閉経後の女性
及び老齢人口の約半分を越える程に高く、その診断と有
効な治療法が強く望まれている。

【０００３】骨代謝性疾患とは、何らかの骨組織におけ
る、細胞レベルでの、骨に特異的な代謝の変調を伴うも
のであり、骨の代謝に特異的に関与する因子の発見、分
離そして同定は、この代謝の異常を明らかにするのに非
常に有効である。本発明者等は、これらの骨の代謝に特
異的な因子の発見のために鋭意研究し、ついに、本発明
を完成させるに至ったものである。

【０００４】より詳しくは、本発明者等は、特に、骨形
成において主要な働きをする骨芽細胞の細胞株を用い、
この細胞株により特異的に生成されるタンパク性因子を
同定したものである。さらに、本発明は、こうした研究
によって得られた、従来知られている種々のサルファタ
ーゼとアミノ酸配列上で強いホモロジーを有する実質的
に骨特異的なＯＳＦ−８と名付けられた新規なタンパク
質を提供する。

【０００５】本発明のＯＳＦ−８は、本明細書に記載さ
れたＤＮＡ配列から当業者において公知の通常の遺伝子
工学的手法によっても生産でき、また本明細書に記載の
アミノ酸配列から、化学的なペプチド合成法により、Ｏ
ＳＦ−８又はその断片を生産することができる。さら
に、本発明に記載されたＯＳＦ−８のＤＮＡ配列の特に
他のサルファターゼに対し、ＯＳＦ−８の特異性の高い
部分配列を通常のオリゴヌクレオチド化学合成法によ
り、１５〜５０塩基長で合成し、骨由来細胞を識別診断
するＤＮＡプローブとして使用することができる。この
ような骨由来細胞の識別は、特に、転移再発性癌の由来
を識別するために有用であり、適切な再発性癌の治療を
もたらす。さらにＯＳＦ−８の部分ペプチドのうち、抗
体の認識しうるエピトープ(epitope)部分のペプチド
は、ＯＳＦ−８に特異的なモノクローナル抗体を作成す
るために使用できる。こうして得られたモノクローナル
抗体は、免疫学的細胞組織染色法により骨由来細胞の同
定に有用である。

【０００６】

【従来の技術】本発明で提供されるＯＳＦ−８が属する
サルファターゼグループに属する酵素群と骨代謝との関
連について以下のことが知られている。

【０００７】長骨の成長期並びに骨折治癒過程における
骨形成においてはまず軟骨が形成され、軟骨組織への血
管の侵入に伴って軟骨組織は吸収され、骨組織に置き変
わることが組織学的な観察によって明らかにされている
が、詳細な蛋白質レベルでの機序は不明である。軟骨と
骨の差異はリン酸カルシウムの沈着の有無が著明である
が、それに加えて基質タンパク質の組成が著しく異なる
ことが知られている。すなわち、軟骨においては乾燥軟
骨重量の５０％以上を大型のプロテオグリカンが占め、
さらにコラーゲンとしてはＩＩ型であるのに対し、骨の
有機基質の９０％以上はＩ型コラーゲンであり、軟骨に
大量に存在した大型プロテオグリカンは姿を消し小型の
プロテオグリカンやいわゆる非コラーゲン性タンパク質
が小量存在するに過ぎない。従って軟骨から骨に置き変
わる過程においては大幅な基質の改築が不可欠であり、
おそらくは骨形成を担っている骨芽細胞が軟骨組織の消
化並びに骨有機基質の構築に大役をはたしていることは
疑いない。これらの骨芽細胞は間葉系細胞から分化する
ことが明らかにされており、軟骨基質の骨化に先だって
おこる組織への血管侵入に伴って移動してきたものと考
えられる。軟骨組織が吸収されるには軟骨基質タンパク
質の約５０％を占めるコラーゲン（タイプＩＩ）を消化
するコラゲナーゼなどに加えて軟骨組織に幅広く存在す
る硫酸基を持つ糖鎖（コンドロイチン硫酸、ケラタン硫
酸など）の消化が必須であるが、今日にいたるまで、軟
骨・骨組織に特有の硫酸エステル結合切断酵素（サルフ
ァターゼ）は報告されていない。

【０００８】一方、エストロジェンが骨代謝に関わって
いることは良く知られた事実であり、閉経後の女性に骨
粗鬆症が多発し、エストロジェンを投与することで骨塩
量の低下を抑制できることが知られている。しかしなが
ら、骨組織におけるエストロジェンの作用機序は明かで
はない。エストロジェンに感受性の高い乳ガン細胞では
エストロジェンの生合成が行われており、アンドロジェ
ンからエストロジェンへの転換に関与するアロマターゼ
とエストロンサルフェートからエストロジェンを合成す
るサルファターゼがエストロジェン合成酵素として注目
されている。近年、骨芽細胞にアロマターゼ活性が報告
されており、本研究で示されたサルファターゼが骨芽細
胞においてエストロジェン合成に寄与している可能性が
高いと考えられる。性腺の機能が正常に営まれている間
はこうした局所の骨芽細胞でのエストロジェン合成は生
理的に重要な意味を持たないが、閉経後は十分量のエス
トロジェンの供給が性腺から得られないために骨芽細胞
などの末梢組織でのホルモン合成が重要になってくると
考えられる。閉経後の全ての女性に急激な骨塩減少が観
察されるわけではないのはこうした骨芽細胞でのエスト
ロジェン合成能の差が反映したものかも知れない。従っ
てこの骨芽細胞におけるエストロジェン合成を活性化す
ることで閉経後の骨粗鬆症を予防する事が可能であろ
う。また、この骨芽細胞でのエストロンサルフェートに
対するサルファターゼ活性を閉経後に測定すれば早期に
骨粗鬆症のハイリスク(high risk)グループをスクリー
ニングできる可能性があるが、未だ、骨芽細胞において
はこのようなサルファターゼは報告されていない。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、骨芽細胞に特異的に発現している新しいタイプのサ
ルファターゼ活性を有するタンパク質を見いだすことで
ある。このようなタンパク質は、主に骨形成期において
軟骨組織から骨組織への変換時に軟骨基質を形成してい
るプロテオグリカンの糖鎖の硫酸基の分解を行う。ま
た、成熟骨組織で特に、性腺機能の減弱した場合に局所
でのエストロジェン合成を高めることが期待される。

【００１０】

【課題を解決するための手段】マウスＯＳＦ−８(ｍＯ
ＳＦ−８)のｃＤＮＡは、マウス骨芽細胞様細胞株ＭＣ
３Ｔ３−Ｅ１由来のｃＤＮＡからＰＣＲ(Polymerase Ch
ain Reaction)法とサブトラクションディファレンシャ
ルスクリーニング(Differential Screening)法によりク
ローン化された。組換え遺伝子操作により他の動物腫の
ＯＳＦ−８をそれぞれの骨、培養骨芽細胞、及び他の体
組織から作成したｃＤＮＡライブラリー、または、ゲノ
ム遺伝子ＤＮＡライブラリーから、本発明のｃＤＮＡま
たはそのＤＮＡ断片をプローブとして用いてクローニン
グする事ができる。本発明で示されたｃＤＮＡの配列は
現在利用できる種々のＤＮＡ及びアミノ酸配列データー
ベースによる検索で、新規であることが明らかにされ
た。

【００１１】又、ＯＳＦ−８は既知の代表的なサルファ
ターゼ分子とホモロジーはあるが、これまでに報告され
ているものとは異なる新しいサブクラスに属するサルフ
ァターゼ分子である。

【００１２】即ち、本研究に示されたタンパク質は骨芽
細胞に特異的なサルファターゼであり正常な骨形成に必
須のものである。多くのサルファターゼ欠損あるいは遺
伝子変異疾患では組織の硫酸基を持つ糖鎖の消化を行え
ず未消化物が細胞内に蓄積することが原因で組織の変
形、機能低下を引き起こすことが広く知られている。本
タンパク質の欠損や機能の異常が骨形成不全症などの先
天性疾患の原因の一つであることは容易に推察される。

【００１３】本タンパク質の遺伝子配列の異常を観察す
ることでこれらの先天性疾患の診断が可能である。ま
た、体液中に遊離してきた本タンパク質の活性あるいは
含有量を測定することで骨芽細胞の機能を知ることがで
きる。このことは、本タンパク質の活性・含有量測定が
骨代謝のマーカーとして利用できることを示している。
また、本タンパク質を軟骨や骨基質に添加することで骨
形成を促進させる可能性がある。すなわち、骨形成には
多くの骨並びに軟骨基質タンパク質が関与する事が知ら
れており、これらのうちＴＧＦ−βなどの成長因子は基
質のプロテオグリカンに結合して蓄積していると考えら
れている。サルファターゼの添加によってこれらの成長
因子の基質からの遊離を促進できるであろう。一方、関
節リウマチや変形性関節症のように過度に軟骨の吸収が
引き起こされているような場合には本タンパク質の阻害
剤が有効な治療薬となりうる。

【００１４】一般に、ＯＳＦ−８はヒト、ウシ、マウス
またはその他の材料から公知の生化学的技術により直接
骨組織または軟骨組織から抽出精製することができる。
また、ＯＳＦ−８をコードするＤＮＡは、脊椎動物の骨
組織から抽出したｍＲＮＡから作成されたｃＤＮＡライ
ブラリー、または、ゲノムＤＮＡライブラリーから、本
明細書中で開示されたマウスのｃＤＮＡ配列の断片を標
識してプローブとして用いて得ることができる。全長ｃ
ＤＮＡクローンは上記の及び他の標準的な分子生物学的
な技術を組み合わせて得ることができる。

【００１５】本発明は、さらに、ＯＳＦ−８の類似体よ
り成るポリペプチド、即ち、ミュータント、融合蛋白、
及びＯＳＦ−８の一部を含む断片を提供する。本発明は
また組換え遺伝子操作によるＯＳＦ−８の製造方法を提
供する。

【００１６】本発明をより具体的に説明するため、以下
に実施例を示す。

【００１７】

【実施例】

〔実施例１〕サブトラクション／ＰＣＲｃＤＮＡライ
ブラリーの作成この実施例では骨芽細胞様細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１に特
異的なｃＤＮＡライブラリーの構築に付いて記述する。
このｃＤＮＡライブラリーはサブトラクション法とＰＣ
Ｒ法を組み合わせることにより、マウス肝組織で発現し
ている遺伝子を差し引いたＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ｃＤＮＡ
ライブラリーであり、各ｃＤＮＡクローンは平均約３０
０塩基の遺伝子断片を有し、さらに、本来含有量の少な
い遺伝子をも増幅されるという特徴を有している。

【００１８】全ての一般的な組換えＤＮＡ技術に関する
手順(protocol)は、特に他に断らなければ、サムブルッ
ク(Sambrook)等による［Molecular Cloning Manual］(1
989年、Cold Spring Harbor Laboratory社、米国、Cold
Spring Harbor)に準じて行った。総ＲＮＡは、グアニ
ジン法により、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞及びマウス肝組織
の、それぞれ、８×１０⁷個、約１ｇから抽出した。ポ
リＡ⁺ＲＮＡは総ＲＮＡから市販の「オリゴｄＴラテッ
クスｍＲＮＡ精製キット」（宝酒造(株)）により精製し
た。各１μｇポリＡ⁺ＲＮＡをテンプレートとし、ｃＤ
ＮＡ合成キット(Amersham社)を用いてｃＤＮＡを合成し
た。ただし、オリゴｄＴプライマーの代わりにランダム
プライマーを用い、その量は通常使用量の１.５倍使用
した。これにより、ｃＤＮＡ鎖伸長反応を平均約３００
塩基に制限した。上記のキットを用いて２本鎖平滑末端
にした後、下記の２種類の合成ＤＮＡリンカーをＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼ（宝酒造(株)）により、それぞれ、ＭＣ３
Ｔ３−Ｅ１ｃＤＮＡはＡＴＯＳ−１／２（配列表の配
列番号２及び３）を、肝臓ｃＤＮＡはＡＴＯＳ−４／５
（配列表の配列番号４及び５）を結合した。

【００１９】ATOS-1/2 ATOS-1 5′- CTCTTGCTTGAATTCGGACTA-3′ ATOS-2 3′-ACACGAGAACGAACTTAAGCCTGAT-5′ ATOS-4/5 ATOS-4 5′- CTCTTGCTTAAGCTTGGACTA-3′ ATOS-5 3′-ACACGAGAACGAATTCGAACCTGAT-5′

【００２０】次に、各反応産物をＰＣＲ(Polymerase Ch
ain Reaction)法により、プライマーとして、それぞ
れ、ＡＴＯＳ−１とＡＴＯＳ−４を用いてＤＮＡを増幅
した。増幅したＤＮＡ濃度は「ＤＮＡ濃度測定キット
“DNA Dipstick”」(Invitrogen社)を用いて行った。サ
ブトラクション法はフォトビオチン(Photobiotin, Pirc
e社)を用いて行った。ＰＣＲ法により増幅した２０μｇ
の肝臓ｃＤＮＡに２０ｎｇのフォトビオチンを加え、サ
ンランプを１０ｃｍ隔て１０分間照射することにより、
ＤＮＡをビオチンで標識した。この標識した肝臓ｃＤＮ
Ａ３.０μｇに、標識していないＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ｃＤ
ＮＡ０.３μｇを加え、ハイブリダイゼーションを行っ
た。ついで、これにストレプトアビジン(Streptavidi
n，宝酒造(株))を反応し、フェノール抽出することによ
り、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ｃＤＮＡから肝臓ｃＤＮＡと共
通のｃＤＮＡを除いた。サブトラクション法を繰り返し
行い、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ｃＤＮＡから肝臓ｃＤＮＡと
共通なものをできるだけ除いた。さらに、上記のＡＴＯ
Ｓ−１を用いてＰＣＲ法によりＤＮＡを増幅し、ＤＮＡ
濃度を測定した。このｃＤＮＡ１０ｎｇを制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩで消化した後、ＥｃｏＲＩで消化し末端を脱燐
酸化したファージベクターλｇｔ１０（λｇｔ１０／Ｅ
ｃｏＲＩクローニングキット、Stratagene社）１μｇと
Ｔ４リガーゼを用いて連結した。これを市販のインビト
ロパッケイジングキット(in vitro packaging kit)「ギ
ガパックゴールド(Gigapack-gold)］(Stratagene社)に
よりλファージ粒子にパッケイジングした。この組換え
体ファージを、大腸菌Ｃ６００（日本予防衛生研究所、
日本癌研究資源バンクにＨＴ００３として保存されてい
る）に感染させ、軟寒天培地とともに寒天培地の上にま
きファージプラークを形成させ感染効率を測定したとこ
ろ、１μｇのｃＤＮＡ当たり３×１０⁶のファージプラ
ークが得られた。

【００２１】さらに、このｃＤＮＡライブラリーをディ
ファレンシャルスクリーニング(differential screenin
g)法を用い、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１に特異性の高いクローン
を選択した。つまり、２.２５×１０⁴個のファージを計
１０枚のプレートにまき、それぞれ２枚（計２０枚）の
ナイロンメンブレンフィルターに移した。これらの一方
を放射能でラベルしたＭＣ３Ｔ３−Ｅ１のｃＤＮＡ
と、また、他方を同様にラベルした肝臓のｃＤＮＡをプ
ローブとして、プラークハイブリダイゼーション法を行
った。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ｃＤＮＡプローブでシグナル
が認められ、しかも、肝臓のｃＤＮＡプローブでシグナ
ルの認められない２７３クローンをミニライブラリーと
し、以後の実験に用いた。

【００２２】〔実施例２〕マウスＯＳＦ−８クローン
の単離この実施例では、上記の実施例１で作成したミニライブ
ラリーから、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１に特異的なクローンとし
て、ＯＳＦ−８の部分的ｃＤＮＡ断片を同定し、さら
に、これを用いてＭＣ３Ｔ３−Ｅ１のｃＤＮＡライブラ
リーから完全長のｃＤＮＡをクローニングする方法に付
いて記述している。

【００２３】実施例１で調製したＭＣ３Ｔ３−Ｅ１及び
肝臓の各総ＲＮＡを、それぞれ１μｇづつナイロンメン
ブレンフィルターにスポットし、このフィルターを２７
３個作成し、以下のハイブリダイゼーションに用いた。
一方、実施例１で作成した２７３個のファージクローン
の挿入部分のＤＮＡをＰＣＲ法を用いて増幅した。この
ＤＮＡをアガロースゲル電気泳動した後、主なバンドを
切り出し精製し、放射能ラベルしてプローブとして用い
た。オートラジオグラフィーの結果、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１
でシグナルが認められ、しかも肝臓でシグナルの認めら
れないクローンに付いてプラスミドベクターにリクロー
ニング(recloning)した。つまり、ＰＣＲ法により増幅
し精製した挿入部分のＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで消
化し、プラスミドベクターｐＵＣ１１８（宝酒造(株)）
のＥｃｏＲＩサイトにリクローニングした。これらのク
ローンについて市販の「ＤＮＡシーケンスキット」（宝
酒造(株)）を用いユニバーサルプライマーにて塩基配列
を決定した。得られた塩基配列をＤＮＡ及びタンパク質
データーベースを検索したところ、既存のサルファター
ゼとホモロジーを示すクローンが得られ、これをｐＭＣ
ＬＳ６３と命名し、これを用いて以後の完全長ｃＤＮＡ
のクローニングを行った。

【００２４】完全長ｃＤＮＡクローニングの為に、実施
例１で精製したＭＣ３Ｔ３−Ｅ１のポリＡ^＋ＲＮＡ５
μｇから「ｃＤＮＡ合成キット」(cDNA synthesis syst
em plus, Amersham社)を用いて平滑末端２本鎖ｃＤＮＡ
を合成した。これにＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩアダプター
（宝酒造(株)）をＴ４リガーゼを用いて連結した後、ア
ガロースゲル電気泳動し、約７００塩基対以上のフラク
ションを精製した。この断片をλｇｔ１０ファージベク
ター(Stratagene社)のＥｃｏＲＩサイトに連結し、実施
例１と同様にファージ粒子にパッケイジングした後、大
腸菌に感染させ感染効率を測定したところ、１μｇのベ
クターＤＮＡあたりに１.５×１０⁷であった。前述のｐ
ＭＣＬＳ６３を放射能ラベルしてプローブとして用い、
このｃＤＮＡライブラリー１.０×１０⁶個のファージク
ローンをプラークハイブリダイゼーション法によりスク
リーニングした。その結果、８個の陽性シグナルが得ら
れそのうち最も挿入断片の長いファージクローンのＮｏ
ｔＩ断片をプラスミドベクターｐＧＥＭ１１Ｚｆ(＋)(S
tratagene社)のＮｏｔＩサイトにリクローニングし、こ
れをｐＫＯＴ１６２と命名した。

【００２５】〔実施例３〕マウスＯＳＦ−８のＤＮＡ
配列ｐＫＯＴ１６２、及びこのｃＤＮＡ断片を有するサブク
ローン(subclone)から「キロシークエンス用デレーショ
ンキット」（宝酒造(株)）を用いて、それぞれ約３００
塩基対おきに両方向からのデレーションミュータントを
作成した。それぞれのデレーションミュータントの塩基
配列の決定は、米国Applied Biosystems社製の自動ＤＮ
Ａシークエンサー・モデル３７３Ａ(automatic DNA seq
uencer)を用いて行った。この完全長ｃＤＮＡの塩基配
列と、塩基配列から翻訳したアミノ酸配列を配列表の配
列番号１に示した。このｃＤＮＡにコードされるタンパ
ク質をＯＳＦ−８と名付けた。アミノ酸残基の番号１は
予想されるＯＳＦ−８前駆体タンパク質のＮ末端に相当
する。又、このｃＤＮＡの制限酵素地図を図１に、マウ
スＯＳＦ−８を他のサルファターゼとのアミノ酸配列の
相同性を図２〜４に示した。

【００２６】〔実施例４〕マウスＯＳＦ−８の組織特
異的発現マウスＯＳＦ−８の組織特異的発現を観察するためにＲ
ＮＡドットブロティング(RNA dot blotting)を行った。
マウス(日本クレアから購入)の胸腺、脾臓、脳、腎臓、
肝臓、肺、睾丸、及び心臓の総ＲＮＡをグアニジン法で
調製した。頭蓋冠由来の骨芽細胞を多く含む細胞は新生
児マウスの頭蓋冠から調製し、これを培養して得た。さ
らに、この細胞から総ＲＮＡを前述と同様な方法で抽出
した。上記の組織、頭蓋冠由来培養細胞、及びＭＣ３Ｔ
３−Ｅ１の各総ＲＮＡ１μｇをナイロンメンブレンフ
ィルター(Biodyne, PALL社)にドットし加熱固定後ハイ
ブリダイゼーションに用いた。一方、ｐＫＯＴ１６２を
ＮｏｔＩで消化してアガロースゲル電気泳動を行って精
製し放射能でラベルし、プローブとして用いた。オート
ラジオグラフィーの結果、頭蓋冠由来培養細胞とＭＣ３
Ｔ３−Ｅ１に強いシグナルが観察された。

【００２７】

【発明の効果】本発明により提供されるＯＳＦ−８は、
骨代謝性疾患の治療剤として用いることができ、また骨
に対する臓器特異性が高いので、骨代謝性疾患の診断剤
としても用いることができる。

【００２８】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：2373 配列の型：核酸鎖の数：二重鎖トポロジー：直線状配列の種類：cDNA to mRNA 起源：生物名:マウス (Mus musculus) 株名：骨芽細胞株 MC3T3E1 配列の特徴：配列 GAATTCGCGG CCGCAGTTTC TAGGTGCCGC TCATATTTAC TTCTGTATTT GTAAGCCAAA 60 CTTCTAGTCT TGTCCCTAGA GTCCGGCCCC TGCTCATGAC TGGAGAGCAG GCTACAGGAG 120 CCCCGCTCAG CAGCCGCTTC TGAACGGCC ATG CCC GCG ATG CTG TTG CTG TTG 173 Met Pro Ala Met Leu Leu Leu Leu 1 5 GTG TCG GTG GTC GCA GCG TTA GCA CTC GCA GCA CCG GCC CCC AGA ACA 221 Val Ser Val Val Ala Ala Leu Ala Leu Ala Ala Pro Ala Pro Arg Thr 10 15 20 CAG AAG AAA AGG ATG CAA GTG AAC CAG GCG CCC AAC GTG GTG CTG GTC 269 Gln Lys Lys Arg Met Gln Val Asn Gln Ala Pro Asn Val Val Leu Val 25 30 35 40 GCC AGT GAC TCC TTC GAT GGA AGA CTA ACA TTT CAA CCA GGA AGT CAG 317 Ala Ser Asp Ser Phe Asp Gly Arg Leu Thr Phe Gln Pro Gly Ser Gln 45 50 55 GTA GTA AAA CTT CCC TTC ATT AAC TTC ATG AGA GCA CAT GGC ACC ACC 365 Val Val Lys Leu Pro Phe Ile Asn Phe Met Arg Ala His Gly Thr Thr 60 65 70 TTC CTA AAT GCC TAC ACT AAT TCA CCC ATC TGC TGT CCA TCA CGT GCA 413 Phe Leu Asn Ala Tyr Thr Asn Ser Pro Ile Cys Cys Pro Ser Arg Ala 75 80 85 GCA ATG TGG AGT GGC CTC TTC ACT CAC TTG ACA GAA TCT TGG AAT AAT 461 Ala Met Trp Ser Gly Leu Phe Thr His Leu Thr Glu Ser Trp Asn Asn 90 95 100 TTT AAG GGT CTG GAT CCA AAT TAT ACG ACA TGG ATG GAC ATC ATG GAG 509 Phe Lys Gly Leu Asp Pro Asn Tyr Thr Thr Trp Met Asp Ile Met Glu 105 110 115 120 AAG CAT GGC TAT CAG ACA CAG AAA TTT GGA AAA GTG GAC TAT ACT TCA 557 Lys His Gly Tyr Gln Thr Gln Lys Phe Gly Lys Val Asp Tyr Thr Ser 125 130 135 GGA CAT CAT TCC ATT AGT AAC CGT GTG GAA GCA TGG ACA AGA GAT GTT 605 Gly His His Ser Ile Ser Asn Arg Val Glu Ala Trp Thr Arg Asp Val 140 145 150 GCA TTC TTG CTC CGA CAA GAA GGC AGA CCC ATA ATT AAT CTT ATC CCT 653 Ala Phe Leu Leu Arg Gln Glu Gly Arg Pro Ile Ile Asn Leu Ile Pro 155 160 165 GAT AAG AAT AGA AGG AGA GTG ATG ACC AAG GAC TGG CAG AAT ACA GAC 701 Asp Lys Asn Arg Arg Arg Val Met Thr Lys Asp Trp Gln Asn Thr Asp 170 175 180 AAA GCA ATC GAA TGG CTA AGA CAG GTT AAC TAC ACC AAG CCA TTT GTC 749 Lys Ala Ile Glu Trp Leu Arg Gln Val Asn Tyr Thr Lys Pro Phe Val 185 190 195 200 CTT TAC TTG GGA TTG AAT TTG CCA CAC CCT TAC CCT TCA CCA TCT TCA 797 Leu Tyr Leu Gly Leu Asn Leu Pro His Pro Tyr Pro Ser Pro Ser Ser 205 210 215 GGA GAA AAC TTT GGC TCT TCT ACG TTT CAC ACT TCC CTT TAC TGG CTT 845 Gly Glu Asn Phe Gly Ser Ser Thr Phe His Thr Ser Leu Tyr Trp Leu 220 225 230 GAA AAG GTA GCT TAT GAT GCA ATC AAA ATC CCA AAG TGG CTG ACT TTG 893 Glu Lys Val Ala Tyr Asp Ala Ile Lys Ile Pro Lys Trp Leu Thr Leu 235 240 245 TCA CAA ATG CAC CCT GTG GAT TTT TGC TCC TCC TAT ACA AAA AAC TGC 941 Ser Gln Met His Pro Val Asp Phe Cys Ser Ser Tyr Thr Lys Asn Cys 250 255 260 ACT GGG AAA TTT ACT GAA AAT GAA ATT AAG AAC ATT AGA GCA TTT TAT 989 Thr Gly Lys Phe Thr Glu Asn Glu Ile Lys Asn Ile Arg Ala Phe Tyr 265 270 275 280 TAT GCT ATG TGT GCT GAG ACA GAT GCC ATG CTA GGT GAA ATT ATT TTG 1037 Tyr Ala Met Cys Ala Glu Thr Asp Ala Met Leu Gly Glu Ile Ile Leu 285 290 295 GCT CTT CAC AAG TTA GAT CTT CTT CAG AAA ACT ATT GTT ATA TAT ACC 1085 Ala Leu His Lys Leu Asp Leu Leu Gln Lys Thr Ile Val Ile Tyr Thr 300 305 310 TCA GAC CAT GGA GAG ATG GCT ATG GAA CAC CGC CAG TTT TAT AAA ATG 1133 Ser Asp His Gly Glu Met Ala Met Glu His Arg Gln Phe Tyr Lys Met 315 320 325 AGT ATG TAT GAA GCT AGT GTC CAT GTT CCT CTT CTG ATG ATG GGA CCA 1181 Ser Met Tyr Glu Ala Ser Val His Val Pro Leu Leu Met Met Gly Pro 330 335 340 GGA ATT AAG GCC AAC CTA CAA GTA CCA AGT GTT GTT TCT CTT GTG GAT 1229 Gly Ile Lys Ala Asn Leu Gln Val Pro Ser Val Val Ser Leu Val Asp 345 350 355 360 ATC TAC CCT ACT ATG CTT GAC ATT GCT GGG ATT GCT CTG CCT CCA AAT 1277 Ile Tyr Pro Thr Met Leu Asp Ile Ala Gly Ile Ala Leu Pro Pro Asn 365 370 375 CTG AGT GGA TAC TCC TTG TTG ACG CTG TTG TCA AAT GCA TCT GCA AAT 1325 Leu Ser Gly Tyr Ser Leu Leu Thr Leu Leu Ser Asn Ala Ser Ala Asn 380 385 390 GAA CAG GCA TTC AAA TTC CAC CGT CCA CCT TGG ATT CTG AGT GAA TTC 1373 Glu Gln Ala Phe Lys Phe His Arg Pro Pro Trp Ile Leu Ser Glu Phe 395 400 405 CAT GGA TGC AAT GCA AAT GCT TCT ACC TAC ATG CTA CGA ACT GGC CAG 1421 His Gly Cys Asn Ala Asn Ala Ser Thr Tyr Met Leu Arg Thr Gly Gln 410 415 420 TGG AAG TAC ATA GCC TAC GCT GAT GGT GCT TCC GTG CAG CCT CAG CTC 1469 Trp Lys Tyr Ile Ala Tyr Ala Asp Gly Ala Ser Val Gln Pro Gln Leu 425 430 435 440 TTC GAT CTT TCC TTG GAT CCG GAT GAG CTA ACA AAC ATT GCT ACA GAA 1517 Phe Asp Leu Ser Leu Asp Pro Asp Glu Leu Thr Asn Ile Ala Thr Glu 445 450 455 TTT CCA GAA ATT ACT TAT TCT TTG GAC CAG AAG CTT CGT TCT ATT GTA 1565 Phe Pro Glu Ile Thr Tyr Ser Leu Asp Gln Lys Leu Arg Ser Ile Val 460 465 470 AAC TAC CCT AAA GTG TCT GCT TCT GTC CAT CAG TAC AAT AAA GAA CAG 1613 Asn Tyr Pro Lys Val Ser Ala Ser Val His Gln Tyr Asn Lys Glu Gln 475 480 485 TTT ATC ATG TGG AAG CAA AGC GTA GGG CAA AAT TAC TCA AAC GTT ATA 1661 Phe Ile Met Trp Lys Gln Ser Val Gly Gln Asn Tyr Ser Asn Val Ile 490 495 500 GCA CAC CTC AGA TGG CAT CAA GAT TGG CAG AGA GAT CCA AGG AAG TAT 1709 Ala His Leu Arg Trp His Gln Asp Trp Gln Arg Asp Pro Arg Lys Tyr 505 510 515 520 GAA AAT GCA ATC CAA CAT TGG CTC ACA GCC CAC TCC AGT CCA CTG GCT 1757 Glu Asn Ala Ile Gln His Trp Leu Thr Ala His Ser Ser Pro Leu Ala 525 530 535 AGC AGC CCA ACC CAG TCC ACC AGT GGC TCA CAG CCC ACT CTT CCC CAG 1805 Ser Ser Pro Thr Gln Ser Thr Ser Gly Ser Gln Pro Thr Leu Pro Gln 540 545 550 TCC ACC AGT GGC TAGCAGCCTA CTCCAGTGAC CAGTGACTCA TAGCCCACTC 1857 Ser Thr Ser Gly 555 TTCTCCAGTC CACCAGTGGT TAGCATCCCA CTTCAATCCA CCAGTAGCTC ACAGCCTACT 1917 CTTCTCCAGT AGCAGTAGAC AATAATAAAA CTTTCTCAAG CTATATGTGA ATATGTTGGT 1977 ACATACTAAA CTGAATCAGC CTTAACAATT ATTAAAATTA CTTATTTTCA AAATATGTAC 2037 TATATATTAC TTGCCAATGA ATACAGAATT CATATTTTCA AAACTAGTTA TACTAAGACC 2097 TTATTGTTGC AGACCTCTGA CAGTTTAACG TCAGAAGTAT TTAAAGAATA GAAGCAAGCA 2157 TTCTTACTGT TTCCCTGGAT AATACAGAAT ATGAAATATT TTAACAACTA TCAGTTGTTA 2217 TTTATGAATC ATGATGTCTC GTGACTGACT AGTTTTTTGG TAAAACTCTT TGGAAGTATT 2277 TGATGTGTTA GAACTATTTA ATGGGACATA GACTCTGAAT ATAGTTGATT TTACTTTCTG 2337 TTGTTTAAAA AAAAAAAAAA AAGCGGCCGC GAATTC 2373

【００２９】配列番号：２配列の長さ：21 配列の型：核酸鎖の数：一重鎖トポロジー：直線状配列の種類：他の核酸起源：なし生物名：なし株名：なし配列の特徴：リンカーDNA。配列番号3と相補的配列。
名称「ATOS-1」配列 CTCTTGCTTG AATTCGGACT A 21

【００３０】配列番号：３配列の長さ：25 配列の型：核酸鎖の数：一重鎖トポロジー：直線状配列の種類：他の核酸起源：なし生物名：なし株名：なし配列の特徴：リンカーDNA。配列番号2と相補的配列。名
称「ATOS-2」配列 TAGTCCGAAT TCAAGCAAGA GCACA 25

【００３１】配列番号：４配列の長さ：21 配列の型：核酸鎖の数：一重鎖トポロジー：直線状配列の種類：他の核酸起源：なし生物名：なし株名：なし配列の特徴：リンカーDNA。配列番号5と相補的配列。
名称「ATOS-4」配列 CTCTTGCTTA AGCTTGGACT A 21

【００３２】配列番号：５配列の長さ：25 配列の型：核酸鎖の数：一重鎖トポロジー：直線状配列の種類：他の核酸起源：なし生物名：なし株名：なし配列の特徴：リンカーDNA。配列番号4と相補的配列。名
称「ATOS-5」配列 TAGTCCAAGC TTAAGCAAGA GCACA 25

【図面の簡単な説明】

【図１】マウスＯＳＦ−８をコードするｃＤＮＡの制限
酵素地図である。太字はＯＳＦ−８のアミノ酸をコード
する領域を示す。但し、ＫｐｎＩ、ＰｓｔＩ、Ｓａｃ
Ｉ、ＳａｌＩ、ＳｍａＩ、ＳｐｈＩとＸｂａＩサイトは
存在しない。

【図２】マウスＯＳＦ−８と他のサルファターゼとのア
ミノ酸配列の比較表(Alignment)である。

【図３】図２のマウスＯＳＦ−８と他のサルファターゼ
とのアミノ酸配列の比較表の続きを示す。

【図４】図３のマウスＯＳＦ−８と他のサルファターゼ
とのアミノ酸配列の比較表の続きを示す。

【手続補正書】

【提出日】平成５年６月４日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図面の簡単な説明

【補正方法】変更

【補正内容】

【図面の簡単な説明】

【図２】マウスＯＳＦ−８と他のサルファターゼとのア
ミノ酸配列の比較図表（Alignment）である。

【図３】図２のマウスＯＳＦ−８と他のサルファターゼ
とのアミノ酸配列の比較図表の続きを示す。

【図４】図３のマウスＯＳＦ−８と他のサルファターゼ
とのアミノ酸配列の比較図表の続きを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ 9284−4ＣＮ 9284−4Ｃ 49/00 Ａ 7252−4ＣＣ１２Ｎ 15/55 ＺＮＡＣ１２Ｐ 21/08 8214−4ＢＧ０１Ｎ 33/53 Ｂ 8310−2Ｊ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列表の配列番号１において、１９番か
ら５５６番目までのアミノ酸配列を有するマウスＯＳＦ
−８、またはこれのアナログ、またはこれの断片よりな
るタンパク質。
【請求項２】配列表の配列番号１において、１番から
１８番目までのシグナルペプチドを含む、１番から５５
６番目までのアミノ酸配列を有するＯＳＦ−８前駆体タ
ンパク質、またはこれのアナログ、またはこれの断片よ
りなるタンパク質。
【請求項３】請求項１または２のタンパク質をコード
するＤＮＡまたはＲＮＡ。
【請求項４】哺乳動物のＯＳＦ−８、またはそのアナ
ログ、または断片である組換えタンパク質を産生させる
方法であって、以下の手順を含む方法： (a) 以下のＤＮＡ配列より構成される異種のＤＮＡを
含む細胞集団を得ること。 (ｉ) 当該細胞で機能しうる転写と翻訳をコントロール
する配列。 (ii) 上記のコントロール配列の下に結合した当該組換
えタンパク質をコードするＤＮＡ配列。 (b) 当該細胞集団を当該組換えタンパク質が産生され
る条件下で培養すること。
【請求項５】請求項４のコントロール配列がさらに、
当該組換えタンパク質を細胞外に分泌させるためのシグ
ナルペプチドをコードするＤＮＡを、当該組換えタンパ
ク質をコードするＤＮＡ配列のすぐ上流に位置するよう
に、含むことを特徴とする産生方法。
【請求項６】細胞集団が大腸菌または酵母または哺乳
動物細胞である請求項４または５の産生方法。
【請求項７】請求項３のＤＮＡまたはＲＮＡの全体ま
たはその断片を含む骨代謝性疾患の診断剤。
【請求項８】請求項１のタンパク質を含む骨代謝性疾
患の診断剤。
【請求項９】請求項１のタンパク質に対するポリクロ
ーナル抗体及びモノクローナル抗体。
【請求項１０】請求項９の抗体を含む骨代謝性疾患の
診断剤。
【請求項１１】請求項１のタンパク質を含む骨代謝性
疾患の治療剤。