DE69323465T2 - Sulfatase-ähnliches Protein aus Knochen und Verfahren zu dessen Herstellung - Google Patents

Sulfatase-ähnliches Protein aus Knochen und Verfahren zu dessen Herstellung

Info

Publication number
DE69323465T2
DE69323465T2 DE69323465T DE69323465T DE69323465T2 DE 69323465 T2 DE69323465 T2 DE 69323465T2 DE 69323465 T DE69323465 T DE 69323465T DE 69323465 T DE69323465 T DE 69323465T DE 69323465 T2 DE69323465 T2 DE 69323465T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
protein
dna
sequence
osf
bone
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
DE69323465T
Other languages
English (en)
Other versions
DE69323465D1 (de
Inventor
Egon Amann
Toshimi Ito
Yoko Otawara-Hamamoto
Sunao Takeshita
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sanofi Aventis France
Aventis Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Hoechst Marion Roussel
Hoechst Marion Roussel Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoechst Marion Roussel, Hoechst Marion Roussel Inc filed Critical Hoechst Marion Roussel
Application granted granted Critical
Publication of DE69323465D1 publication Critical patent/DE69323465D1/de
Publication of DE69323465T2 publication Critical patent/DE69323465T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues knochenverwandtes Protein. Die Erfindung betrifft ein neues Protein mit den Fähigkeiten, Knochen sowie Knorpelgewebe zu formen und aufrechtzuerhalten (eine neue Sulfatase, OSF-8); ein Verfahren zur Messung dessen Aktivität; ein Verfahren zum Nachweis eines Inhibitors oder Verstärkers seiner Aktivität; DNA, die das OSF-8 codiert und ein Verfahren zur Herstellung des Proteins durch eine genetische Manipulationstechnik unter Verwendung der DNA; und die Anwendung spezifischer Antikörper, umfassend das gereinigte Protein, das genetisch hergestellte Protein oder ein Teilpeptid davon, einen Immunoassay zur Diagnose metabolischer Knochenerkrankungen.
  • Metabolische Knochenerkrankungen umfassen Osteoporose, Paget's Disease, Osteomalazie, Hyperostose und Osteopetrose. Osteoporose insbesondere tritt häufig genug auf, um etwa mehr als die Hälfte der Frauen nach der Menopause und ältere Menschen zu befallen, und effektive Verfahren zu ihrer Diagnose und Behandlung sind in starkem Maße wünschenswert.
  • Metabolische Knochenerkrankungen sind mit einer gewissen Störung des Knochenmetabolismus auf der zellulären Ebene in Knochengewebe verbunden. Die Entdeckung, Isolierung und Identifikation von Faktoren, speziell im Zusammenhang mit dem Knochenmetabolismus, sind sehr effektiv zur Erhellung dieser Störung.
  • Eine Zellinie eines Osteblasten, der eine Hauptrolle bei der Osteogenese spielt, wurde zur Idenfizierung eines proteinartigen Faktors, der spezifisch von dieser Zellinie produziert wird, verwendet. Daher betrifft die vorliegende Erfindung ein neues Protein mit der Bezeichnung OSF-8, das im wesentlichen knochenspezifisch ist und das eine hohe Homologie mit verschiedenen bekannten Sulfatasen im Hinblick auf die Aminosäuresequenz besitzt.
  • OSF-8 kann aus der in der vorliegenden Beschreibung beschriebenen DNA-Sequenz durch eine übliche Technik zur Genmanipulation, die auf dem Fachgebiet bekannt ist, produziert werden.
  • Ferner kann das OSF-8 oder sein Fragment aus der in der Beschreibung beschriebenen Aminosäuresequenz nach einem chemischen Peptidsyntheseverfahren produziert werden. Ferner kann das Fragment der DNA-Sequenz des erfindungsgemäß beschriebenen OSF-8, das eine hohe Spezifität, insbesondere für andere Sulfatasen besitzt, mit einer Länge von 15 bis 50 Basen durch ein übliches chemisches Oligonucleotidsyntheseverfahren synthetisiert werden. Die fragmentarische Sequenz kann als DNA-Sonde zur Auffindung und Identifizierung von knochenabgeleiteten Zellen verwendet werden. Diese Identifikation von knochenabgeleiteten Zellen ist besonders nützlich, um den Ursprung eines metastasierenden oder wiederkehrenden Karzinoms zu fassen und führt so zu einer geeigneten Therapie für wiederkehrenden Krebs. Von den Teilpeptiden des OSF-8 ist das Peptid in dem Epitopteil, das von den Antikörpern erkannt werden kann, zur Herstellung eines OSF-8-spezifischen monoclonalen Antikörpers verwendbar. Der so erhaltenen monoclonale Antikörper ist von beachtlichem Wert zur Identifizierung von knochenabgeleiteten Zellen durch ein immunologisches Färbeverfahren für Zellgewebe.
  • Das folgende ist über die Beziehung zwischen Knochenmetabolismus und Enzymen aus einer Gruppe von Sulfatasen, zu denen OSF-8 gehört, bekannt.
  • Histologische Beobachtungen zeigten, daß Knorpel zuerst während der Osteogenese der langen Knochen und beim Reparaturprozeß gebrochener Knochen gebildet wird. Bei dem Prozeß der Kalzifizierung der Knorpel wird eine Angiogenese beobachtet und eingewanderte Zellen, wie Osteoblasten und Osteoklasten, können die Knorpelgewebe in Knochengewebe umwandeln, obwohl Einzelheiten der Mechanismen auf Proteinebene unbekannt sind. Zusätzlich zu dem Vorliegen von Calciumphosphatabscheidung im Knochen ist ein ausgeprägter Konstitutionsunterschied des Matrixproteins zwischen dem Knochen und dem Knorpel bekannt. Mehr als 50% des Trockengewichts des Knorpels ist großes Proteoglycan und das beteiligte Collagen ist vom Typ II. Im Gegensatz dazu sind mehr als 90% des Knochens vom Typ I-Collagen. Das große Proteoglycan im Knorpel verschwindet bei der Knorpelossifizierung und nur kleines Proteoglycan und nichtcollagenartige Proteine sind vorhanden. So ist ein ausgeprägter Ersatz der Matrix während des Prozesses der Knorpelossifikation unvermeidbar. Eingewanderte Zellen, am wahrscheinlichsten Osteoblasten und Osteoklasten, spielen eine zentrale Rolle bei der Verdauung des Knorpels sowie bei der Konstruktion des Osteoids. Es wurde gezeigt, daß diese Osteoblasten sich von mesenchymalen Zellen differenzieren, was nahelegt, daß sie begleitend zur Angiogenese in das Gewebe vor der Ossifikation des Mesochondriums wandern können. Die Absorption des Knorpels benötigt nicht nur die Anwesenheit von Collagenase, die das Typ II- Collagen verdaut, das etwa 50% der Knorpelmatrixproteine ausmacht, sondern auch die Abspaltung der Zuckerketten mit Sulfatgruppen, die gehäuft im Knorpel vorhanden sind (z. B. Chondroitinsulfat, Keratansulfat), bewirkt. Bis jetzt gab es jedoch keine Berichte über Schwefelsäureesterhydrolasen (Sulfatasen), die in Knorpel und Knochengewebe inhärent vorhanden sind.
  • Andererseits ist die Beteiligung des Östrogens am Knochenmetabolismus gut bekannt. Osteoporose tritt bei vielen Frauen nach der Menopause auf, und die Verabreichung von Östrogen an diese Patientinnen kann den Verlust des Knochenmineralvolumens hemmen. Jedoch ist der konkrete Mechanismus der Östrogenwirkung auf das Knochengewebe unklar. Östrogen wird in Brustkrebszellen, die hochempfindlich gegenüber dieser Substanz sind, biosynthetisiert. Aromatase, die an der Umwandlung von Androgen in Östrogen beteiligt ist, und Sulfatase, die Östrogen aus Östronsulfat synthetisiert, ziehen Aufmerksamkeit als östrogensynthetisierende Enzyme an. In den jüngsten Jahren wurde berichtet, daß Osteoblasten eine Aromataseaktivität besitzen. Es ist in hohem Maße denkbar, daß die in der vorliegenden Beschreibung beschriebene Sulfatase zu der Östrogensynthese in Osteoblasten beiträgt. Während der Zeitspanne der normalen gonadalen Funktion ist eine solche Östrogensynthese in Osteoblasten physiologisch unbedeutend. Nach der Menopause kann die Hormonsynthese in peripheren Geweben, wie den Osteoblasten, wichtig werden, weil eine ausreichende Östrogenzufuhr aus den Gonaden nicht erhalten wird. Ein solcher Unterschied in der Fähigkeit, Östrogen in Osteoblasten zu synthetisieren, kann die Tatsache erklären, daß nicht alle Frauen nach der Menopause eine scharfe Abnahme des Knochenmineralvolumens zeigen. So kann die Aktivierung dieser Östrogensynthese in Osteoblasten Osteoporose nach der Menopause verhindern. Ferner kann der postmenopausale Test auf Sulfataseaktivität gegenüber Östrogensulfat in Osteoblasten eine Hochrisikogruppe für Osteoporose in einem frühen Stadium nachweisen. Jedoch wurde eine solche Sulfatase in den Osteoblasten nicht beschrieben.
  • Daher liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, einen neuen Proteintyp mit Sulfataseaktivität zu finden, die spezifisch in Osteoblasten exprimiert wird. Ein solches Protein baut die Sulfatgruppen der Zuckerketten von Proteoglycan ab, das die Knorpelmatrix bildet, während der Knorpel in Knochengewebe im Stadium der Osteogenese ersetzt wird. Das Protein soll auch die lokale Produktion von Östro gen, insbesondere in reifem Knochengewebe, erhöhen, wenn die Gonadenfunktion abgenommen hat.
  • Die cDNA eines Maus-OSF-8 (mOSF-8) wurde aus einer Maus-Osteoblastenzellinie MC3T3-E1-cDNA-Bank, die durch eine Kombination einer PCR (Polymerasekettenreaktion) und des Subtraktionsverfahrens und durch das differentielle Screening-Verfahren konstruiert wurde, isoliert. Eine Suche durch die gegenwärtig verfügbaren DNA- und Aminosäuresequenzdatenbanken zeigte, daß die erfindungsgemäß beschriebene cDNA-Sequenz neu ist. Die DNAs, die OSF-8 anderer Tiere codieren, können aus cDNA-Banken oder genomischen Banken, die aus ihren Knochen, gezüchteten Osteoblasten oder anderen Körpergeweben konstruiert wurden, durch rekombinante Gentechnik unter Verwendung der cDNA oder ihres DNA- Fragments als Sonde erhalten werden.
  • OSF-8 ist ferner ein Sulfatasemolekül, das mit bekannten repräsentativen Sulfatasemolekülen homolog ist, aber das einer neuen Subklasse, die sich von den bis jetzt beschriebenen unterscheidet, angehört.
  • D. h., daß das in der vorliegenden Beschreibung beschriebene Protein eine osteoblastenspezifische Sulfatase ist, die für normale Osteogenese unverzichtbar ist. Viele Krankheiten im Zusammenhang mit einem Sulfatasedefekt oder -mutation sind weithin als Induktoren von Deformation oder funktioneller Verschlechterung des Gewebes bekannt, weil die Sulfatasegruppen tragenden Zuckerketten im Gewebe nicht gespalten werden können, wodurch die Anhäufung nichtgespaltenen Materials in den Zellen verursacht wird. Es kann leicht spekuliert werden, daß der Mangel und die funktionelle Störung dieses Proteins eine der Ursachen kongenitaler Erkrankungen, wie der Osteogenesis imperfecta, sein können.
  • Diese kongenitalen Erkrankungen können durch Beobachtung der Abnormalität der DNA-Sequenz dieses Proteins diagnostiziert werden. Die Funktion der Osteoblasten kann auch durch Messen der Aktivität oder Konzentration dieses Proteins, das in Körperflüssigkeiten freigesetzt wurde, ermittelt werden. Diese Tatsachen zeigen, daß die Aktivität und Konzentration dieses Proteins als Marker für den Knochenmetabolismus verwendet werden können. Zusätzlich kann dieses Protein des Knorpels oder der Knochenmatrix auch Osteogenese fördern. Viele Knochen- und Knorpelmatrixproteine sind bekanntlich an der Osteogenese beteiligt. Es wird angenommen, daß von ihnen Wachstumsfaktoren, wie IGF-β, an das Proteoglycan der Matrizes binden und darin angehäuft werden. Die Zugabe von Sulfatasen könnte die Freisetzung dieser Wachstumsfaktoren aus den Matrizes fördern. In Zuständen, die mit einer exzessiven Knorpelresorption verbunden sind, wie der rheumatoiden Arthritis oder Osteoarthritis, könnte der Inhibitor dieses Proteins ein effektives therapeutisches Mittel sein.
  • Im allgemeinen kann der OSF-8 direkt aus Knochengewebe oder Knorpelgewebe einer menschlichen, Rinder-, murinen oder anderen Quelle nach einer bekannten biochemischen Technik extrahiert werden.
  • Die das OSF-8 codierende DNA kann durch Konstruieren einer cDNA-Bank oder einer genomischen Bank aus aus Vertebraten-Knochengewebe extrahierter mRNA und unter Verwendung einer Sonde, umfassend ein markiertes Fragment der Maus-DNA- Sequenz, die in der vorliegenden Beschreibung offenbart ist, erhalten werden. Ein Clon mit einer cDNA in voller Länge kann durch Kombination der vorstehend beschriebenen und anderer Standardtechniken der Molekularbiologie erhalten werden.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Polypeptide, die Analoga des OSF-8, d. h. Mutanten und Fusionsproteine, umfassen. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung des OSF-8 durch rekombinante DNA-Technik.
  • In der vorliegenden Anmeldung bedeutet der Ausdruck "Hybridisierung unter stringenten Bedingungen" Hybridisierungsbedingungen mit einer Salzkonzentration von 6xSSC (NaCl-Citratpuffer) bei 62 bis 68ºC.
    • Kurze Erklärung der Figuren
  • Die Fig. 1 zeigt ein Restriktionsenzymkarte der cDNA, die Maus-OSF-8 codiert. Die fetten Buchstaben bezeichnen die Region, die die Aminosäuren von OSF-8 codiert. Es gibt keine KpnI, PstI, SacI, SalI, SmaI, SphI und Xbal-Spaltstellen.
  • Die Tabelle 1 zeigt eine Anordnung der Aminosäuresequenzen des Maus-OSF-8 und anderer Sulfatasemoleküle. Gemeinsame Aminosäurereste sind in Form einer Konsensussequenz gezeigt.
  • Die Tabelle 2 zeigt eine Fortsetzung der Anordnung der Aminosäuresequenzen des Maus-OSF-8 und anderer Sulfatasemoleküle, die in Tabelle 1 gezeigt sind. Gemeinsame Aminosäurereste sind in Form einer Konsensussequenz gezeigt.
  • Die Tabelle 3 zeigt eine Fortsetzung der Anordnung der Aminosäuresequenzen von Maus-OSF-8 und anderer Sulfatasemoleküle, die in Tabelle 2 gezeigt sind. Gemeinsame Aminosäurereste sind in Form einer Konsensussequenz gezeigt.
  • Es wird erwähnt, daß der Inhalt der japanischen Prioritätsanmeldungen Nr. 230030/92 und 324034/92 Teil der vorliegenden Anmeldung sind.
    • Beispiele
  • Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele näher erläutert:
    • Beispiel 1 Konstruktion einer cDNA-Bank durch Subtraktion und PCR
  • Die Konstruktion einer cDNA-Bank, die für die Osteoblastenzellinie MC3T3-E1 spezifisch ist, wird nachstehend beschrieben. Diese cDNA-Bank wird durch eine Kombination des Subtraktionsverfahrens und der PCR konstruiert, wobei das in Mauslebergewebe exprimierte Gen subtrahiert wird. Jeder cDNA-Clon besitzt Genfragmente mit einer durchschnittlichen Länge von etwa 300 Basen und ist dadurch gekennzeichnet, daß das Gen mit einem niedrigen Gehalt amplifiziert wurde.
  • Außer anders angeführt, entsprechen alle allgemeinen Protokolle der rekombinanten DNA Sambrook et al., "Molecular Cloning Manual" (1989), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, USA. Gesamt-RNAs wurden aus 8 · 10&sup7; MC3T3-E1- Zellen extrahiert und etwa 1 g Mauslebergewebe wurde nach dem Guanidinverfahren erhalten. polyA+RNAs wurden aus den Gesamt-RNAs mit dem im Handel erhältlichen Produkt "Oligo dT Latex mRNA Purification Kit" (Takara Shuzo) gereinigt. cDNAs wurden mit einem cDNA-Synthese-Kit (Amersham) unter Verwendung von 1 ug jeder polyA+RNA als Matrize synthetisiert. Jedoch wurde ein Zufalls-Primer anstelle eines Oligo-dT- Primers in einer Menge des 1,5fachen seiner üblicherweise verwendeten Menge verwendet, wobei die cDNA-Kettenverlängerung auf eine Durchschnittslänge von etwa 300 Basen beschränkt wurde. Nachdem die cDNAs doppelsträngig und glattendig unter Verwendung der vorstehenden Kits gemacht worden waren, wurden sie mit T4-DNA-Ligase (Takara Shuzo) an die folgenden zwei DNA-Linker, d. h. ATOS-1/2 (Sequenz ID Nos. 2 und 3 des Sequenzprotokolls) für die MC3T3-E1-cDNA und ATOS-4/5 (Sequenz ID Nos. 4 und 5 des Sequenzprotokolls) für die Leber-cDNA geknüpft:
  • ATOS-1/2:
  • ATOS-1 5'- CTCTTGCTTGAATTCGGACTA-3'
  • ATOS-2 3'-ACACGAGAACGAACTTAAGCCTGAT-5'
  • ATQS-4/5:
  • ATOS-4 5'- CTCTTGCTTAAGCTTGGACTA-3'
  • ATOS-5 3'-ACACGAGAACGAATTCGAACCTGAT-5'
  • Dann wurde jedes Reaktionsprodukt einer DNA-Amplifikation mit dem PCR (Polymerasekettenreaktionsverfahren) unter Verwendung von ATOS-1 bzw. ATOS-4 als Primer unterworfen. Die Konzentration der amplifizierten DNA wurde mit dem DNA-Test- Kit "DNA-Dipstick" (Invitrogen) bestimmt. Das Subtraktionsverfahren wurde unter Verwendung von Photobiotin (Pirce) durchgeführt. Photobiotin (20 ng) wurden zu 20 ug der PCR- amplifizierten Leber-cDNA zugegeben und Licht von einer Sonnenlampe, die 10 cm entfernt war, wurde auf die Leber-cDNA 10 min projiziert, um sie mit Biotin zu markieren. 3,0 ug der markierten Leber-cDNA wurden mit 0,3 ug nichtmarkierter MC3T3-E1-cDNA zur Hybridisierung versetzt. Dann wurde Streptavidin (Takara Shuzo) umgesetzt, und das Reaktionsgemisch wurde mit Phenol extrahiert, um mit der Leber-cDNA von der MC3T3-E1-cDNA gemeinsame cDNA zu entfernen. Das Subtraktionsverfahren wurde wiederholt, um möglichst viel der gemeinsamen cDNA von der MC3T3-E1-cDNA zu entfernen. Die DNA wurde mittels PCR unter Verwendung des vorstehend genannten ATOS-1 amplifiziert, und die DNA-Konzentration wurde gemessen. Diese cDNA (10 ng) wurde mit dem Restriktionsenzym EcoRI gespalten und dann mit T4-Ligase an 1 ug des Phagenvektors λ-gt10 (λ-gt10/EcoRI-Cloning-Kit, Stratagene) ligiert, der mit EcoRI gespalten wurde und an seinen Enden dephosphoryliert wurde. Die so erhaltene rekombinante DNA wurde in λ-Phagenteilchen durch die Verwendung des in vitro Verpackungs-Kits "Gigapack-gold" (Stratagene) verpackt. Die rekombinanten Phagen wurden in E. coli C600 (aufbewahrt als HT003 in der Japanese Cancer Research Resources Bank, National Institute of Health of Japan) infiziert, und die Organismen wurden auf ein Agarmedium zusammen mit einem Softagarmedium unter Bildung einer Phagenplatte aufgebracht. Die Effizienz der Infektion wurde zu 3 · 10&sup6; Phagenplaques/ug Vektor-DNA bestimmt.
  • Die so erhaltene cDNA-Bank wurde einem Differential- Screening unterworfen, um Clone mit einer hohen Spezifität für MC3T3-E1 auszuwählen. Genauer, 2,25 · 10&sup4; Phagen wurden auf insgesamt 10 Platten aufgebracht, und die so erhaltenen Plaques auf jeder Platte wurden auf zwei Nylonmembranfilter (insgesamt 20 Filter) überführt. Diese Reihen von Plaques wurden einer Plaquehybridisierung unter Verwendung radioaktiv markierter MC3T3-E1-cDNA als Sonde für die eine Reihe und raktioaktiv markierter Leber-cDNA für die andere Reihe unterworfen. In 273 Clonen wurde eine Expression mit der MC3T3-E1-cDNA-Sonde, aber nicht mit der Leber-cDNA-Sonde beobachtet. Diese Clone wurden als Minibank in den anschließenden Experimenten verwendet.
    • Beispiel 2 Isolierung des Maus-OSF-8-Clons
  • Es werden Methoden zur Identifizierung eines cDNA-Fragments von OSF-8 als MC3T3-E1-spezifischer Clon von der in Beispiel 1 konstruierten Minibank und zur Clonierung der cDNA in voller Länge aus der cDNA-Bank von MC3T3-E1 unter Verwendung dieses Fragments beschrieben.
  • Die Gesamt-RNAs aus MC3T3-E1 und Leber, die in Beispiel 1 hergestellt wurden, wurden in einer Menge von jeweils 1 ug auf Nylonmembranfilter aufgetropft. 273 der Filter wurden hergestellt und zur Hybridisierung, die später beschrieben wird, verwendet. Getrennt davon wurde die DNA der Insertionen der 273 Phagen-Clone, die in Beispiel 1 hergestellt worden waren, mit PCR amplifiziert. Diese DNA wurde mittels Agarosegel-Elektrophorese untersucht, und die Hauptbanden wurde ausgeschnitten, gereinigt und zur Verwendung als Sonde radioaktiv markiert. Ein Clon der Expression mit MC3T3-E1- cDNA, aber keine Expression mit Leber-cDNA nach Autoradiographie zeigte, wurde in einen Plasmidvektor recloniert. Genauer, die DNA der durch PCR amplifizierten und anschließend gereinigten Insertionen wurde mit dem Restriktionsenzym EcoRI gespalten und in die EcoRI-Spaltstelle des Plasmidvektors pUC118 (Takara Shuzo) recloniert. Die DNA-Sequenz des so erhaltenen Clons wurde mit dem im Handel erhältlichen "DNA Sequence Kit" (Takara Shuzo) unter Verwendung eines Universal-Primers bestimmt. Eine Suche durch DNA und Proteindatenbanken zeigte, daß die DNA-Sequenz einen mit der existierenden Sulfatase homologen Clon darstellte. Dieser Clon wurde als pMCLS63 bezeichnet und für die anschließende Clonierung der cDNA in voller Länge verwendet.
  • Zur Clonierung der cDNA in voller Länge wurde eine glattendige, doppelsträngige cDNA mit dem cDNA-Synthese-Kit "cDNA Synthesis System Plus" (Amersham) unter Verwendung von 5 ug der polyA+RNA von MC3T3-E1, die in Beispiel 1 gereinigt wurde, synthetisiert. Die so erhaltene cDNA wurde in einen EcoRI/NotI-Adaptor (Takara Shuzo) unter Verwendung von T4- Ligase ligiert, und das Produkt wurde mittels Agarosegel- Elektroporese untersucht, um ein Fragment, das mehr als etwa 700 Basenpaare lang ist, zu reinigen. Dieses Fragment wurde an die EcoRI-Spaltstelle des λ-gt10-Phagenvektors (Stratagene) angefügt und in Phagenpartikel wie in Beispiel 1 verpackt. Mit den Packungen wurde E. coli wie in Beispiel 1 infiziert, und die Effizienz der Infektion wurde zu 1,5 · 10&sup7; Phagenplaques/ug Vektor-DNA bestimmt. Das vorstehend genannte Plasmid pMCLS63 wurde zur Verwendung als Sonde radioaktiv markiert und 1,0 · 10&sup6; Phagen-Clone der cDNA-Bank wurden durch Plaquehybridisierung abgesucht. Acht positive Hybridisierungssignale wurden erhalten, wonach das NotI- Fragment des Phagen-Clons mit der längsten Insertion in die NotI-Spaltstelle des Plasmidvektors pGEM11Zf(+) (Stratagene) recloniert wurde. Der so erhaltene Clon wurde als pKOT162 bezeichnet.
    • Beispiel 3 DNA-Sequenz von Maus-OSF-8
  • Deletionsmutanten des pKOT162 und eines Subclons, der dessen cDNA-Fragment enthielt, wurden mit "the Deletion Kit for Kilo Sequence" (Takara Shuzo) durch Spalten in Intervallen von 300 Basenpaaren jeweils in entgegengesetzter Richtung hergestellt. Die DNA-Sequenz jeder Deletionsmutante wurde mit dem automatischen DNA-Sequenziergerät 373A (Applied Biosystems, USA) bestimmt. Die gesamte DNA-Sequenz der cDNA und eine Aminosäuresequenz, die von dieser DNA-Sequenz übersetzt wurde, sind in Sequenz ID No. 1 des Sequenzprotokolls gezeigt. Das von dieser cDNA codierte Protein wurde als OSF-8 bezeichnet. Nr. 1 der Aminosäurereste entspricht dem N-Terminus des vorhergesagten OSF-8-Vorläuferproteins. Die Restriktionskarte dieser cDNA ist in Fig. 1 gezeigt, und die Homologie der Aminosäuresequenz zwischen dem Maus-OSF-8 und anderen Sulfatasen ist in den Tabellen 1 bis 3 gezeigt.
    • Beispiel 4 Gewebsspezifische Expression von Maus- OSF-8
  • RNA-Dot-Blotting wurde durchgeführt, um die gewebsspezifische Expression von Maus-OSF-8 zu untersuchen. Die Gesamt-RNAs der Thymusdrüse, der Milz, des Gehirns, der Nieren, der Leber, der Lungen, der Hoden und des Herzes von Mäusen (bezogen von Nippon Clea) wurden nach dem Guanidinverfahren hergestellt. Osteoblastenreiche Schädelzellen wurden aus einer Kultur von Schädelzellen neugeborener Mäuse erhalten. Die Gesamt-RNA wurde aus diesen Zellen, wie vorstehend beschrieben, extrahiert. 1 ug der Gesamt-RNA aus jedem der vorstehend genannten Gewebe, den gezüchteten Schädelzellen und MC3T3-E1 wurde auf Nylonmembranfilter (Biodyne, PALL) getropft, durch Erhitzen fixiert und zur Hybridisierung verwendet. Getrennt davon wurde das Plasmid pKOT162 mit NotI gespalten und durch Agarosegel-Elektrophorese gereinigt. Dann wurde das Isolat radioaktiv markiert und als Sonde verwendet. Die Autoradiographie zeigte eine hohe Expression für die gezüchteten Schädelzellen und MC3T3-E1 an.
  • Das erfindungsgemäß bereitgestellt OSF-8 kann als Mittel zur Behandlung metabolischer Knochenerkrankungen verwendet werden und wegen seiner hohen Organspezifität für Knochen kann es auch als diagnostisches Mittel für metabolische Knochenerkrankungen verwendet werden. Tabelle 1 Tabelle 2 Tabelle 3
    • Sequenzprotokoll
  • (1) Allgemeine Angaben:
  • (i) Anmelder:
  • (A) Name: Hoechst Japan Limited
  • (B) Straße: New Hoechst Building 10-16, Akasaka 8-chome
  • (C) Ort: Minatu-Ku, Tokyo
  • (E) Land: 107 Japan
  • (F) Postleitzahl (ZIP): -
  • (G) Telefon: (03) 3479-5137
  • (H) Telefax: (03) 3479-7859
  • (ii) Bezeichnung der Erfindung: Knochenverwandtes sulfataseartiges Protein und Verfahren zu dessen Herstellung
  • (iii) Anzahl der Sequenzen: 5
  • (iv) Computerlesbare Fassung:
  • (A) Datenträger: Floppy disk
  • (B) Computer: IBM PC compatible
  • (C) Betriebssystem: PC-DOS/MS-DOS
  • (D) Software: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (EPO)
    • (2) Angaben zu SEQ ID NO: 1:
  • (i) Sequenzkennzeichen:
  • (A) Länge: 2373 Basenpaare
  • (B) Art: Nucleinsäure
  • (C) Strangform: Doppelstrang
  • (D) Topologie: linear
  • (ii) Art des Moleküls: cDNA
  • (iv) Ursprüngliche Herkunft:
  • (A) Organismus: Mus musculus
  • (B) Stamm: Osteoblastenzellinie MC3T3E1
  • (ix) Merkmal:
  • (A) Name/Schlüssel: Intron
  • (B) Lage: 1..149
  • (ix) Merkmal:
  • (A) Name/Schlüssel: CDS
  • (B) Lage: 150..1817
  • (ix) Merkmal:
  • (B) Lage: 1818..2373 (xi) Sequenzbeschreibung SEQ ID NO: 1:
    • (2) Angaben zu SEQ ID NO: 2:
  • (i) Sequenzkennzeichen:
  • (A) Länge: 21 Basenpaare
  • (B) Art: Nucleinsäure
  • (C) Strangform: Einzelstrang
  • (D) Topologie: linear
  • (ii) Art des Moleküls: DNA (genomisch)
  • (ix) Merkmal:
  • (A) Name/Schlüssel: Intron
  • (B) Lage: 1..21
    • (xi) Sequenzbeschreibung SEQ ID NO: 2:
  • CTCTTGCTTG AATTCGGACT A 21
    • (2) Angaben zu SEQ ID NO: 3:
  • (i) Sequenzkennzeichen:
  • (A) Länge: 25 Basenpaare
  • (B) Art: Nucleinsäure
  • (C) Strangform: Einzelstrang
  • (D) Topologie: linear
  • (ii) Art des Moleküls: DNA (genomisch)
  • (ix) Merkmal:
  • (A) Name/Schlüssel: Intron
  • (B) Lage: 1..25
    • (xi) Sequenzbeschreibung SEQ ID NO: 3:
  • TAGTCCGAAT TCAAGCAAGA GCACA 25
    • (2) Angaben zu SEQ ID NO: 4:
  • (i) Sequenzkennzeichen:
  • (A) Länge: 21 Basenpaare
  • (B) Art: Nucleinsäure
  • (C) Strangform: Einzelstrang
  • (D) Topologie: linear
  • (ii) Art des Moleküls: DNA (genomisch)
  • (ix) Merkmal:
  • (A) Name/Schlüssel: Intron
  • (B) Lage: 1..21
    • (xi) Sequenzbeschreibung SEQ ID NO: 3:
  • CTCTTGCTTA AGCTTGGACT A 21
    • (2) Angaben zu SEQ ID NO: 5:
  • (i) Sequenzkennzeichen:
  • (A) Länge: 25 Basenpaare
  • (B) Art: Nucleinsäure
  • (C) Strangform: Einzelstrang
  • (D) Topologie: linear
  • (ii) Art des Moleküls: DNA (genomisch)
  • (ix) Merkmal:
  • (A) Name/Schlüssel: Intron
  • (B) Lage: 1..25
    • (xi) Sequenzbeschreibung SEQ ID NO: 3:
  • TAGTCCAAGC TTAAGCAAGA GCACA 25

Claims (12)

1. Protein, umfassend ein Maus-OSF-8 mit der Aminosäuresequenz von Rest 19 bis Rest 556 der Seguenz ID No. 1 des Sequenzprotokolls oder ein Analogon des Maus-OSF-8.
2. Protein, umfassend das OSF-8-Vorläuferprotein mit einer Aminosäuresequenz von Rest 1 bis zu Rest 556 einschließlich eines Signalpeptids von dem 1. bis zu dem 18. Rest der Sequenz ID No. 1 des Sequenzprotokolls oder ein Analogon des Vorläuferproteins.
3. DNA oder RNA, die das Protein nach Anspruch 1 oder 2 codiert.
4. DNA oder RNA, die unter stringenten Bedingungen mit der DNA oder RNA nach Anspruch 3 hybridisiert.
5. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Säuger- OSF-8-Proteins nach Anspruch 1 oder eines Analogons davon oder Fragments davon, umfassend die Stufen:
(a) Erhalt einer Population von Wirtszellen, die eine heterologe DNA aus den folgenden DNA-Sequenzen:
(i) eine Sequenz, die in den Zellen so funktionieren kann, daß sie die Transkription und Translation kontrolliert, und
(ii) eine DNA-Sequenz nach den Ansprüchen 3 bis 4 in stromabwärtiger Verknüpfung mit der kontrollierenden Sequenz, die das rekombinante Protein codiert, enthält, und
(b) Züchten der Zellpopulation unter Bedingungen, die die Produktion des rekombinanten Proteins erlauben.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Kontrollsequenz weiter eine DNA, die ein Signalpeptid zur extrazellulären Sekretion des rekombinanten Proteins codiert, enthält, so daß die DNA unmittelbar stromaufwärts der DNA-Sequenz, die das rekombinante Protein codiert, positioniert ist.
7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszelle Escherichia coli oder Hefe oder Säugerzellen ist.
8. Diagnostisches Mittel für metabolische Knochenerkrankungen, enthaltend die DNA oder RNA nach Anspruch 3 oder 4.
9. Diagnostisches Mittel für metabolische Knochenerkrankungen, enthaltend das Protein nach Anspruch 1.
10. Polyclonaler oder monoclonaler Antikörper gegen das Protein nach Anspruch 1.
11. Diagnostisches Mittel gegen metabolische Knochenerkrankungen, enthaltend den Antikörper nach Anspruch 10.
12. Therapeutisches Mittel für metabolische Knochenerkrankungen, enthaltend das Protein nach Anspruch 1.
DE69323465T 1992-08-28 1993-08-25 Sulfatase-ähnliches Protein aus Knochen und Verfahren zu dessen Herstellung Expired - Fee Related DE69323465T2 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP23003092 1992-08-28
JP4324034A JPH06121678A (ja) 1992-08-28 1992-12-03 骨関連サルファターゼ様タンパク質およびその製造法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE69323465D1 DE69323465D1 (de) 1999-03-25
DE69323465T2 true DE69323465T2 (de) 1999-08-19

Family

ID=26529110

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE69323465T Expired - Fee Related DE69323465T2 (de) 1992-08-28 1993-08-25 Sulfatase-ähnliches Protein aus Knochen und Verfahren zu dessen Herstellung

Country Status (9)

Country Link
US (1) US5627050A (de)
EP (1) EP0590309B1 (de)
JP (1) JPH06121678A (de)
AT (1) ATE176685T1 (de)
AU (1) AU663215B2 (de)
CA (1) CA2104995A1 (de)
DE (1) DE69323465T2 (de)
DK (1) DK0590309T3 (de)
ES (1) ES2130198T3 (de)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3472587B2 (ja) * 1992-08-28 2003-12-02 アベンティス ファーマ株式会社 骨関連カルボキシペプチダーゼ様タンパク質およびその製造法
US20020137890A1 (en) * 1997-03-31 2002-09-26 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20030195162A1 (en) * 1999-09-17 2003-10-16 Cohn Daniel H. Genetic marker for spondyloepimetaphyseal dysplasia
WO2003057869A1 (en) * 2002-01-14 2003-07-17 Bayer Healthcare Ag Regulation of human sulfatase

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2041280A1 (en) * 1990-05-10 1991-11-11 Yosuke Sawada Arylsulfatase
JP3472587B2 (ja) * 1992-08-28 2003-12-02 アベンティス ファーマ株式会社 骨関連カルボキシペプチダーゼ様タンパク質およびその製造法
JP3560252B2 (ja) * 1992-08-28 2004-09-02 アベンティス ファーマ株式会社 骨関連カドヘリン様タンパク質およびその製造法

Also Published As

Publication number Publication date
EP0590309B1 (de) 1999-02-10
ES2130198T3 (es) 1999-07-01
US5627050A (en) 1997-05-06
ATE176685T1 (de) 1999-02-15
EP0590309A2 (de) 1994-04-06
JPH06121678A (ja) 1994-05-06
AU663215B2 (en) 1995-09-28
CA2104995A1 (en) 1994-03-01
EP0590309A3 (de) 1995-02-15
AU4492193A (en) 1994-03-03
DK0590309T3 (da) 1999-09-20
DE69323465D1 (de) 1999-03-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69534196T2 (de) Hu-B1.219, EIN NEUARTIGER HÄMATOPOIETINREZEPTOR
KR910002692B1 (ko) 수정 호르몬의 제조방법
Pennica et al. Human cardiotrophin-1: protein and gene structure, biological and binding activities, and chromosomal localization
DE3752360T2 (de) Menschliche DNS zum Nachweis von Retinoblastoma
DE68929043T2 (de) Für androgen-rezeptor-protein kodierende dna
DE69427588T2 (de) HUMANE PROTEIN-TYROSINPHOSPHATASE DECODIERENDE cDNA
DE69332462T2 (de) Protease und verwandte DNS-Verbindungen
DE69736983T2 (de) G-beta-gamma regulierte phosphatidylinositil-3' kinase
DE69329037T2 (de) Delta ähnliches gen welches in neuroendokrinen tumoren exprimiert wird
DE69319012T2 (de) Protein mit Knochenbildungs-Eigenschaften und Verfahren zu seiner Herstellung
DE69328527T2 (de) Carboxypeptidase-ähnliches Protein aus Knochen und Verfahren zur dessen Herstellung
US5578708A (en) Bone-associated transcription control factor-like protein
JPH11510054A (ja) モルフォゲンアナログを同定するための方法および組成物
DE69323465T2 (de) Sulfatase-ähnliches Protein aus Knochen und Verfahren zu dessen Herstellung
Bloomquist et al. RESP18, a novel endocrine secretory protein transcript, and four other transcripts are regulated in parallel with pro-opiomelanocortin in melanotropes.
DE69736076T2 (de) Enzyme mit s-adenosyl-l-homocystein-hydrolase-ähnlicher aktivität.
Wurtz et al. A new protein expressed in bone marrow cells and osteoblasts with implication in osteoblast recruitment
DE69331086T2 (de) Protein des Cadherin-Typs aus Knochen und Verfahren zur Herstellung
DE69233155T2 (de) Insulinartigen wachstumsfaktor bindendes protein
DE69530261T3 (de) Durch Zelldichte stimulierte Protein-Tyrosin-Phosphatasen
DE60225562T2 (de) Paget knochenkrankheit
WO1996003043A1 (en) Human brain specific kinase
DE69731682T2 (de) TAB1 Protein und dafür kodierende DNA
EP0620851B1 (de) Neuroblastom-assoziiertes regulator-gen
WO2000017232A2 (de) Regulatorisches protein aus humanen keratinozyten

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition
8339 Ceased/non-payment of the annual fee