JPH06122700A - 骨関連カドヘリン様タンパク質およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 マウス、ヒトを含む哺乳動物の骨組織から得
られるＯＳＦ−４を名付けられた骨関連タンパク質およ
びその製造法。本タンパク質は新しい天然型哺乳類タン
パク質であり、カドヘリンファミリーに属するタンパク
質である。 【効果】 ＯＳＦ−４は、骨誘導部位における骨形成の
過程において関与する接着分子または成長因子として作
用する。ＯＳＦ−４は、骨代謝性疾患の治療剤として用
いることができ、また骨に対する臓器特異性が高いの
で、骨代謝性疾患の診断剤としても用いることができ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規な骨関連タンパク
質を提供する。本発明のタンパク質はＯＳＦ−４と名付
けられたものであり、カドヘリン分子の仲間に属する新
規なタンパク質である。このＯＳＦ−４はマウスまたは
ヒトを含む哺乳動物の骨組織より得ることができる。本
発明で提供される骨関連タンパク質は、骨代謝性疾患の
診断及び治療に有用である。

【０００２】

【発明の背景】骨代謝性疾患と総称される疾患の中に
は、骨粗鬆症（Osteoporosis）、ページェット病（Page
t's disease)、骨軟化症、過骨形成症、大理石病等が含
まれ、このうち、特に骨粗鬆症は発生頻度が閉経後の女
性及び老齢人口の約半分を越える程に高く、その診断と
有効な治療法が強く望まれている。

【０００３】骨代謝性疾患とは、何らかの骨組織におけ
る、細胞レベルでの、骨に特異的な代謝の変調を伴うも
のであり、骨の代謝に特異的に関与する因子の発見、分
離そして同定は、この代謝の異常を明らかにするのに非
常に有効である。本発明者等は、これらの骨の代謝に特
異的な因子の発見のために鋭意研究し、ついに、本発明
を完成させるに至ったものである。

【０００４】より詳しくは、本発明者等は、特に、骨形
成において主要な働きをする骨芽細胞の細胞株を用い、
この細胞株により特異的に生成されるタンパク性因子を
同定したものである。さらに、本発明は、こうした研究
によって得られた、従来知られている種々のカドヘリン
型の細胞接着分子とアミノ酸配列上で強いホモロジーを
有する実質的に骨特異的なＯＳＦ−４と名付けられた新
規なタンパク質を提供する。

【０００５】本発明のＯＳＦ−４は、本明細書に記載さ
れたＤＮＡ配列から当業者において公知の通常の遺伝子
工学的手法によっても生産でき、また本明細書に記載の
アミノ酸配列から、化学的なペプチド合成法により、Ｏ
ＳＦ−４又はその断片を生産することができる。さら
に、本発明に記載されたＯＳＦ−４のＤＮＡ配列のうち
特に他のカドヘリン分子と比べてＯＳＦ−４に特徴的な
部分配列を通常のオリゴヌクレオチド化学合成法によ
り、１５〜５０塩基長で合成し、骨由来細胞を識別診断
するＤＮＡプローブとして使用することができる。この
ような骨由来細胞の識別は、特に、転移再発性癌の由来
を識別するために有用であり、適切な再発性癌の治療を
もたらす。さらにＯＳＦ−４の部分ペプチドのうち、抗
体の認識しうるエピトープ（epitope）部分のペプチド
は、ＯＳＦ−４に特異的なモノクローナル抗体を作成す
るために使用できる。こうして得られたモノクローナル
抗体は、免疫学的細胞組織染色法により骨由来細胞の同
定に有用である。また、ＯＳＦ−４はその細胞接着分子
との類似性から、骨折の治療にも有用である。

【０００６】

【従来の技術】本発明で提供されるＯＳＦ−４はカドヘ
リン様タンパク性因子であると考えられる。カドヘリン
は、細胞接着作用を有し、次のことが知られている。

【０００７】細胞群の区画化は動物体構築の最も基本的
な要素の一つである。この区画化は発生のごく初期から
始まり、各細胞の分化が進むにつれ、同種の細胞が秩序
正しく移動し再配置することにより形態形成や組織の構
築と維持が行われている。このような秩序正しい細胞の
移動をコントロールする要素の一つに、細胞の選択的接
着性がある。各細胞は隣接した細胞ないしは隣接した細
胞外基質を認識し、特定のものとのみ接着する性質を有
する。そして、細胞の分化に伴いこれらの接着特異性が
変化することにより、特定の場所から離れて、本来ある
べき場所へと移動し集合すると考えられている。これま
でに、数多くの細胞接着分子が同定されているが、全て
細胞タイプ特異性を示す。これらの分子を大別するとカ
ドヘリンファミリー、免疫グロブリンスーパーファミリ
ー接着分子、インテグリンスーパーファミリー、セレク
チン、およびこれらには属さないものの４つ以上のグル
ープに分けることができる(Hynes et al., (1992), Cel
l, vol.68, p.303〜322)。

【０００８】これらのなかでも、とりわけカドヘリンは
その解析が進んでおり、構造はもちろんのこと機能面に
おいても研究が進んでいる。カドヘリンは分子量約１２
０ｋＤの糖タンパク質であり、カルシウムイオンに依存
して働く細胞間接着分子である(Takeichi, (1991), Sci
ence, vol.251, p.1451〜1455)。これまでに１０種類近
くが同定されており、それぞれのタイプは結合特異性を
有し、同じ分子同士がホモフィリックに反応する。その
結果、同じタイプのカドヘリンを持つ細胞が選択的に結
合し合い、細胞間接着の特異性を決めるために必須の因
子であると考えられている。代表的なものに上皮由来の
Ｅ（Epitherial）カドヘリン、胎盤由来のＰ(Placenta)
カドヘリン、神経細胞由来のＮ（Neural）カドヘリン、
肝細胞由来のＬ−ＣＡＭ（liver cell adhesion molecu
le）などが挙げられる。その構造はどれもほぼ類似して
おり、約１１０アミノ酸の４、５回の繰り返しから成る
細胞外領域、細胞膜貫通領域と約１５０アミノ酸から成
る細胞内領域で構成されている。各カドヘリンのサブク
ラスにおいて、それぞれ全体で約５０％のホモロジーが
見られる。細胞外領域においてはアミノ末端に近い部位
でホモロジーが高く膜貫通領域に近づくにつれ徐々に低
くなり、細胞内領域において最も高いホモロジーが見ら
れる。近年、新しいカドヘリンが次々と報告されつつあ
る。たとえば、筋肉細胞由来のＭ（Muscle）カドヘリ
ン、脳細胞由来のＢ（Brain）カドヘリンや胎児脳由来
のＴ(Truncated)カドヘリン、さらに、デスモソームに
局在するデスモグレインなど、これら全ては同じ祖先を
持つ１つの遺伝子に由来するものでカドヘリンファミリ
ーを形成していると考えられている。

【０００９】カドヘリン分子の詳細な研究により、その
Ｎ末端領域にはカルシウムイオンと結合する部位と接着
特異性を決定する部位を有していることがわかってい
る。さらに、細胞内領域においては接着分子として機能
的にも重要であることのみならず、カテニンやアクチン
等の裏打ちタンパクと結合していることがわかってお
り、細胞内伝達に寄与していることが示唆されている。
一方、癌細胞の侵入と転移において、これらカドヘリン
の量的変化が認められ、腫瘍形成との関連でも興味がも
たれている。しかしながら、これら多くのカドヘリン分
子の報告があるにもかかわらず、骨細胞に特異性を持つ
カドヘリン分子の報告はない。

【００１０】骨のリモデリングは、骨を形成する骨芽細
胞(Osteoblast)と骨を吸収する破骨細胞(Osteoclast)の
バランスによって骨の形成・維持が担われている。骨芽
細胞は間葉系の細胞由来で筋細胞や脂肪細胞と起源を同
じくし、破骨細胞は造血幹細胞由来であり、好中球やマ
クロファージなどと同様な起源を持つ細胞であると考え
られている。細胞接着分子としては、破骨細胞がインテ
グリンファミリーに属するビトロネクチンレセプターを
発現していることが知られているのみであり、骨芽細胞
についてはその存在が示唆されているにすぎない。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、骨芽細胞に特異的に発現している新しいタイプの細
胞接着因子を見い出すことである。こうした新しい細胞
接着因子は、骨芽細胞の増殖、分化、移動や再配置に重
要な分子である。この物質は、種々の骨代謝性疾患の診
断、治療に用いることが期待できる。

【００１２】

【課題を解決するための手段】マウスＯＳＦ−４（ｍＯ
ＳＦ−４）のｃＤＮＡは、マウス骨芽細胞様細胞株ＭＣ
３Ｔ３−Ｅ１由来のｃＤＮＡからＰＣＲ（Polymerase C
hain Reaction）法とサブトラクション(Subtraction)法
を組み合わせた方法によりｃＤＮＡライブラリーを作成
し、ディファレンシャルスクリーニング（Differential
Screening）法によりクローン化された。つづいて、マ
ウスＯＳＦ−４ｃＤＮＡをプローブとして、ヒト骨肉種
細胞由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし
た。その結果、２種類のＯＳＦ−４が得られ、それぞ
れ、ｈＯＳＦ−４−１及びｈＯＳＦ−４−２ と名付け
られ、その塩基配列を決定した。ＯＳＦ−４の塩基配列
は、マウスとヒトの間で、非常に良く保存されている。
ｍＯＳＦ−４とｈＯＳＦ−４−１、及びｈＯＳＦ−４−
２とのアミノ酸配列との比較では、それぞれ９７.１
％、及び９６.４％のホモロジーを示している（図１〜
３）。これら種間での非常に高い保存性は、ＯＳＦ−４
が脊椎動物の骨の代謝に必須な働きを持っていることを
示唆している。ＯＳＦ−４は他の脊椎動物の骨抽出物か
らも分離精製できる。組換え遺伝子技術を用いて、他の
動物種のＯＳＦ−４を、それぞれの骨、培養骨細胞、及
び他の体組織から作成したｃＤＮＡライブラリー、また
はゲノム遺伝子ＤＮＡライブラリーから、本発明のｃＤ
ＮＡまたはそのＤＮＡ断片をプローブとして用いてクロ
ーニングすることが出来る。本発明で示されたｃＤＮＡ
の配列は現在利用できる種々のＤＮＡ及びアミノ酸配列
データベースによる検索で、新規であることが明らかに
された。

【００１３】ｍＯＳＦ−４のアミノ酸配列との比較で、
ｈＯＳＦ−４−１は全ての領域において非常に保存され
ている。一方、ｈＯＳＦ−４−２はＮ末端から６３１番
目のアミノ酸残基まではｈＯＳＦ−４−１と完全に一致
しているのに対し、細胞膜貫通領域の中において、１７
９塩基の挿入がある為にフレームシフトがおこり、６３
２番目のアミノ酸残基から６９３番目のＣ末端までの６
２アミノ酸残基は全く異なった構造をしている（図１〜
３）。従って、細胞膜貫通領域のＣ末端９アミノ酸残基
と細胞内領域はｈＯＳＦ−４−１とｈＯＳＦ−４−２で
は完全に異なっている。このようなＣ末端領域が欠失し
たカドヘリンはＴカドヘリンに相当するものであり、こ
のタイプのカドヘリンの存在はＯＳＦ−４の細胞接着の
制御に関与することを示唆している。

【００１４】ｍＯＳＦ−４のＥＣ１ドメイン中の１０１
番目から１１５番目までの親水性（hydrophilic）の１
５アミノ酸残基に相当するペプチドを化学合成し、ＫＬ
Ｈ(Keyhole limpet hemacyanin)と架橋し、ウサギの免
疫に使用した。得られた抗ｍＯＳＦ−４ペプチド抗血清
を新生児マウス全身切片中のＯＳＦ−４の免疫組織化学
的検出に用いた。ＯＳＦ−４は骨芽細胞、軟骨細胞等に
検出された。

【００１５】一般に、ＯＳＦ−４は、ヒト、ウシ、マウ
ス、または、その他の材料から、公知の生化学的技術に
より、直接骨組織または軟骨組織から抽出することが出
来る。また、ＯＳＦ−４をコードするＤＮＡは、脊椎動
物の骨組織から抽出したｍＲＮＡから作成されたｃＤＮ
Ａライブラリー、または、ゲノムＤＮＡライブラリーか
ら、本明細書中で開示されたヒトまたはマウスのｃＤＮ
Ａ配列の断片を標識してプローブとして用い、得ること
ができる。全長ｃＤＮＡクローンは上記の及び他の標準
的な分子生物学的な技術を組み合わせて得る事ができ
る。

【００１６】このように、ＯＳＦ−４は既知の代表的な
カドヘリン分子とホモロジーはあるが、これまでに報告
されているものとは異なり新しいサブクラスに属するカ
ドヘリン分子である。その構造は、細胞外領域において
５回の繰り返し構造、細胞膜貫通領域、及び、細胞内領
域から構成されている（図４）。ＯＳＦ−４と他のカド
ヘリンとの比較をすると、これまでの異なったカドヘリ
ン分子間のホモロジー様式と同様に、細胞外領域ではＮ
末端から膜貫通領域に近づくにつれてホモロジーは低く
なり、細胞内領域で最も高いホモロジーが認められた
（表１）。

【００１７】

【表１】 表１はマウスＯＳＦ−４と他のカドヘリン分子とのアミ
ノ酸比較表である。各領域ごとのアミノ酸での相同性を
計算し％で表した。領域の略語はＥＣ１〜ＥＣ５：５つ
の細胞外領域、ＴＭ：細胞膜貫通領域、ＣＰ：細胞内領
域、そしてＭＰは成熟タンパク質の全体での比較を示
す。また、ＮはＮカドヘリン、ＥはＥカドヘリン、Ｐは
Ｐカドヘリン、ＭはＭカドヘリンを示す。比較したカド
ヘリンのタイプにおいて、ＯＳＦ−４：ＮはＯＳＦ−４
とＮカドヘリン間でのアミノ酸配列の各領域ごとの比較
を示す。以下同じ。

【００１８】本発明により提供されるタンパク質は、骨
形成において重要な役割を担っている新しいサブクラス
のカドヘリンに属する糖タンパク質でＯＳＦ−４と名付
けたグループであり、より具体的には本明細書中に記載
されているヒト及びマウスのＯＳＦ−４である。ＯＳＦ
−４は骨形成の過程において骨芽細胞で発現し、細胞接
着分子及び形態形成関連物質として作用する。これらヒ
ト又はマウスのＯＳＦ−４は、塩基配列やアミノ酸配列
において類似した他の哺乳類由来のＯＳＦ−４タンパク
質を分離同定するために使用できる。

【００１９】本発明は、さらに、ＯＳＦ−４の類似体よ
りなるポリペプチド、即ち、ミュータント、融合タンパ
ク、及びＯＳＦ−４の一部を含む断片を提供する。マウ
ス骨芽細胞様細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１から分離したマウ
スＯＳＦ−４のｃＤＮＡは、２４アミノ酸残基からなる
シグナルペプチドを含む７９６個のアミノ酸からなるタ
ンパク質をコードしている。ヒト骨肉種細胞(Osteosarc
oma)ｃＤＮＡライブラリーより分離したヒトＯＳＦ−４
は２種類あり、その内の１つヒトＯＳＦ−４−１ のｃ
ＤＮＡは２４アミノ酸残基からなるシグナルペプチドを
含む７９６個のアミノ酸からなるタンパク質をコードし
ている。他の１つヒトＯＳＦ−４−２のｃＤＮＡは２４
アミノ酸残基からなるシグナルペプチドを含む６９３個
のアミノ酸からなるタンパク質をコードしている。本発
明は、また組換え遺伝子技術によるＯＳＦ−４の製造方
法を提供する。

【００２０】

【実施例】

〔実施例１〕 サブトラクション／ＰＣＲによるｃＤＮ
Ａライブラリーの作成 この実施例では骨芽細胞様細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１に特
異的なｃＤＮＡライブラリーの構築について記述する。
このｃＤＮＡライブラリーはサブトラクション法とＰＣ
Ｒ法を組み合わせることにより、マウス肝組織で発現し
ている遺伝子を差し引いたＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ｃＤＮＡラ
イブラリーであり、各ｃＤＮＡクローンは平均約３００
塩基の遺伝子断片を有し、さらに、本来含有量の少ない
遺伝子をも増幅されるという特徴を有している。

【００２１】全ての一般的な組換えＤＮＡ技術に関する
手順(protocol)は、特に他に断らなければ、サムブルッ
ク（Sambrook）らによる「Molecular Cloning manual」
(1989年、Cold Spring Harbor Laboratory社、米国、Co
ld Spring Harbor）に準じて行った。総ＲＮＡは、グア
ニジン法により、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞及びマウス肝組
織の、それぞれ、８×１０⁷個、約１ｇから抽出した。
ポリＡ⁺ＲＮＡは総ＲＮＡから市販の「オリゴｄＴラテ
ックスｍＲＮＡ精製キット」（宝酒造(株)）により精製
した。各１μｇポリＡ⁺ＲＮＡをテンプレートとし、ｃ
ＤＮＡ合成キット(Amersham社)を用いてｃＤＮＡを合成
した。ただし、オリゴｄＴプライマーの代わりにランダ
ムプライマーを用い、その量は通常使用量の１.５倍使
用した。これにより、ｃＤＮＡ鎖伸長反応を平均約３０
０塩基に制限した。上記のキットを用いて２本鎖平滑末
端にした後、下記の２種類の合成ＤＮＡリンカーをＴ４
ＤＮＡリガーゼ（宝酒造(株)）により、それぞれ、ＭＣ
３Ｔ３−Ｅ１ｃＤＮＡはＡＴＯＳ−１／２（配列表の配
列番号４及び５）と、肝臓ｃＤＮＡはＡＴＯＳ−４／５
（配列表の配列番号６及び７）と結合させた。

【００２２】 ATOS-1/2 ATOS-1 5′- CTCTTGCTTGAATTCGGACTA-3′ ATOS-2 3′-ACACGAGAACGAACTTAAGCCTGAT-5′ ATOS-4/5 ATOS-4 5′- CTCTTGCTTAAGCTTGGACTA-3′ ATOS-5 3′-ACACGAGAACGAATTCGAACCTGAT-5′

【００２３】次に、各反応産物をＰＣＲ（Polymerase C
hain Reaction）法により、プライマーとして、それぞ
れ、ＡＴＯＳ−１とＡＴＯＳ−４を用いてＤＮＡを増幅
した。増幅したＤＮＡ濃度測定は「ＤＮＡ濃度測定キッ
ト“DNA Dipstick"」(Invitrogen社）を用いて行った。
サブトラクション法はフォトビオチン（Photobiotin,Pi
rce社）を用いて行った。ＰＣＲ法により増幅した２０
μｇの肝臓ｃＤＮＡに２０ｎｇのフォトビオチンを加
え、サンランプを１０ｃｍ隔て１０分間照射することに
より、ＤＮＡをビオチンで標識した。この標識した肝臓
ｃＤＮＡ３.０μｇに、標識していないＭＣ３Ｔ３−Ｅ
１ｃＤＮＡ０.３μｇを加え、ハイブリダイゼーション
を行った。次いで、これにストレプトアビジン（Strept
avidin，宝酒造(株)）を反応し、フェノール抽出する事
により、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ｃＤＮＡから肝臓ｃＤＮＡと
共通のｃＤＮＡを除いた。サブトラクション法を再度繰
り返し行い、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ｃＤＮＡから肝臓ｃＤＮ
Ａと共通なものをできるだけ除いた。さらに、上記のＡ
ＴＯＳ−１を用いてＰＣＲ法によりＤＮＡを増幅し、Ｄ
ＮＡ濃度を測定した。このｃＤＮＡ１０ｎｇを制限酵素
ＥｃｏＲＩで消化した後、ＥｃｏＲＩで消化し末端を脱
燐酸化したファージベクターλｇｔ１０（λｇｔ１０／
ＥｃｏＲＩクローニングキット、Stratagene社）１μｇ
とＴ４リガーゼを用いて連結した。これを市販のインビ
トロパッケイジングキット（in vitro packaging kit)
「ギガパックゴールド(Gigapack-gold)」(Stratagene
社)によりλファージ粒子にパッケイジングした。この
組換え体ファージを、大腸菌Ｃ６００（日本予防衛生研
究所、日本癌研究資源バンクにＨＴ００３として保存さ
れている）に感染させ、軟寒天培地とともに寒天培地の
上にまきファージプラークを形成させ感染効率を測定し
たところ、１μｇのｃＤＮＡあたり３×１０⁶のファー
ジプラークが得られた。

【００２４】さらに、このｃＤＮＡライブラリーをディ
ファレンシャルスクリーニング（differential screeni
ng）法を用い、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１に特異性の高いクロー
ンを選択した。つまり、２.２５×１０⁴個のファージを
計１０枚のプレートにまき、それぞれ２枚（計２０枚）
のナイロンメンブレンフィルターに移した。これらの一
方を放射能でラベルしたＭＣ３Ｔ３−Ｅ１のｃＤＮＡ
と、また、他方を同様にラベルした肝臓のｃＤＮＡをプ
ローブとして、プラークハイブリダイゼーション法を行
った。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ｃＤＮＡプローブでシグナルが
認められ、しかも、肝臓のｃＤＮＡプローブでシグナル
の認められない２７３クローンをミニライブラリーと
し、以後の実験に用いた。

【００２５】〔実施例２〕 マウスＯＳＦ−４クローン
の単離 この実施例では、上記の実施例１で作成したミニライブ
ラリーから、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１に特異的なクローンとし
て、ＯＳＦ−４の部分的ｃＤＮＡ断片を同定し、さら
に、これを用いてＭＣ３Ｔ３−Ｅ１のｃＤＮＡライブラ
リーから完全長ｃＤＮＡをクローニングする方法につい
て記述している。

【００２６】実施例１で調製したＭＣ３Ｔ３−Ｅ１及び
肝臓の各総ＲＮＡを、それぞれ１μｇづつナイロンメン
ブレンフィルターにスポットし、このフィルターを２７
３個作成し、以下のハイブリダイゼーションに用いた。
一方、実施例１で作成した２７３個のファージクローン
の挿入部分のＤＮＡをＰＣＲ法を用いて増幅した。この
ＤＮＡをアガロースゲル電気泳動した後、主なバンドを
切り出し精製し、放射能ラベルしてプローブとして用い
た。オートラジオグラフィーの結果、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１
でシグナルが認められ、しかも肝臓でシグナルの認めら
れないクローンについてプラスミドベクターにリクロー
ニング（recloning）した。つまり、ＰＣＲ法により増
幅し精製した挿入部分のＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで
消化し、プラスミドベクターｐＵＣ１１８（宝酒造
(株)）のＥｃｏＲＩサイトにリクローニングした。これ
らのクローンについて市販の「ＤＮＡシーケンスキッ
ト」（宝酒造(株)）を用いユニバーサルプライマーにて
塩基配列を決定した。得られた塩基配列をＤＮＡ及びタ
ンパク質データベースを検索したところ、既存のカドヘ
リンとホモロジーを示すクローンが得られ、これをＤ４
５と命名し、これを用いて以後の完全長ｃＤＮＡのクロ
ーニングを行った。

【００２７】完全長ｃＤＮＡクローニングのために、実
施例１で精製したＭＣ３Ｔ３−Ｅ１のポリＡ⁺ＲＮＡ５
μｇから「ｃＤＮＡ合成キット」（cDNA systhsis syst
em plus, Amersham社）を用いて平滑末端２本鎖ｃＤＮ
Ａを合成した。これにＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩアダプター
（宝酒造(株)）をＴ４リガーゼを用いて連結した後、ア
ガロースゲル電気泳動し、約７００塩基対以上のフラク
ションを精製した。この断片をλｇｔ１０ファージベク
ター（Stratagene社）のＥｃｏＲＩサイトに連結し、実
施例１と同様にファージ粒子にパッケイジングした後、
大腸菌に感染させ感染効率を測定したところ、１μｇの
ベクターＤＮＡあたり、１.５×１０⁷であった。前述の
Ｄ４５を放射能ラベルしてプローブとして用い、このｃ
ＤＮＡライブラリー１.０×１０⁶個のファージクローン
をプラークハイブリダイゼーション法によりスクリーニ
ングした。その結果、１４個のポジティブシグナルが得
られ、その内、最も挿入断片の長いファージクローンの
ＮｏｔＩ断片をプラスミドベクターｐＧＥＭ１１Ｚｆ
(＋)(Stratagene社)のＮｏｔＩサイトにリクローニング
し、これをｐＫＯＴ１６４と命名した。

【００２８】〔実施例３〕 マウスのＯＳＦ−４のＤＮ
Ａ配列の決定 ｐＫＯＴ１６４、及びこのｃＤＮＡ断片を有するサブク
ローン（subclone）から「キロシークエンス用デレーシ
ョンキット」（宝酒造(株)）を用いて、それぞれ約３０
０塩基対おきに両方向からのデレーションミュータント
を作成した。それぞれのデレーションミュータントの塩
基配列の決定は、米国Applied Biosystems社製の自動Ｄ
ＮＡシークエンサー・モデル３７３Ａ（automatic DNA
sequencer）を用いて行った。この完全長ｃＤＮＡの塩
基配列と、塩基配列より翻訳したアミノ酸配列を配列表
の配列番号１に示した。このｃＤＮＡにコードされるタ
ンパク質をマウスＯＳＦ−４と名付けた。アミノ酸残基
の番号１は予想されるマウスＯＳＦ−４前駆体タンパク
質のＮ末端に相当する。また、このＤＮＡの制限酵素地
図を図５に示した。

【００２９】〔実施例４〕 マウスＯＳＦ−４の組織特
異的発現 マウスＯＳＦ−４の組織特異的発現をみるためにＲＮＡ
ドットブロッティング（RNA dot blotting）を行った。
マウス（日本クレアから購入）の胸腺、脾臓、脳、腎
臓、肝臓、肺、睾丸、及び心臓の総ＲＮＡをグアニジン
法で調製した。頭蓋冠由来の骨芽細胞を多く含む細胞
は、新生児マウスの頭蓋冠より調製し、これを培養して
得られた。さらに、この細胞から総ＲＮＡを前述と同様
な方法で抽出した。上記の組織、頭蓋冠培養細胞、ＭＣ
３Ｔ３−Ｅ１及びマウス線維芽細胞株ＮＩＨ３Ｔ３（AT
CC CRL 1658）、の各総ＲＮＡ１μｇをナイロンメンブ
レンフィルター（Biodyne, PALL社）にドットし、加熱
固定した後に、ハイブリダイゼーションに用いた。一
方、ｐＫＯＴ１６４をＮｏｔＩで消化し、アガロースゲ
ル電気泳動による分離精製を行った後、放射能でラベル
しプローブとして用いた。オートラジオグラフィーの結
果、頭蓋冠培養細胞とＭＣ３Ｔ３−Ｅ１に強いシグナル
が見られ、睾丸で弱いシグナルが見られた（図６）。

【００３０】〔実施例５〕 ヒトＯＳＦ−４をコードす
るｃＤＮＡのクローニング ｐＫＯＴ１６４のｃＤＮＡ領域を含むＮｏｔＩ断片を精
製し、これをプローブとして用い、１.３×１０⁵個のク
ローンから成るヒト骨肉腫ｃＤＮＡライブラリーをスク
リーニングした。その結果、２１個のポジティブシグナ
ルが得られた。そのうち、５クローンを分離し、挿入断
片の大きい２つのクローンについてプラスミドベクター
ｐＨＳＧ３９８にリクローニングした。この結果、得ら
れたプラスミドをｐＫＯＴ１６１、およびｐＫＯＴ１７
０と名付けた。

【００３１】〔実施例６〕 ヒトのＯＳＦ−４のＤＮＡ
配列の決定 上記の実施例５でクローン化されたｐＫＯＴ１６１、ｐ
ＫＯＴ１７０、及びそれらのサブクローンについても実
施例３に示した方法と同様にデレーションミュータント
を作成し、ｃＤＮＡの塩基配列を決定した。これらのｃ
ＤＮＡの塩基配列と予想されるアミノ酸配列を配列表の
配列番号２及び３に示した。これらのｃＤＮＡにコード
されるタンパク質をヒトＯＳＦ−４−１、ヒトＯＳＦ−
４−２と名付けた。各々アミノ酸残基の番号１は予想さ
れるＯＳＦ−４前駆体タンパク質のＮ末端に相当する。

【００３２】〔実施例７〕 抗ＯＳＦ−４抗血清の調製 マウスＯＳＦ−４の抗ペプチド抗体を作成するにあた
り、Ｍカドヘリンの実験報告例（Donalies et al.,(199
1) Proc. Natle. Acad. Sci. USA, vol.88, p.8024-802
8）に従い、これに相当するＥＣ１領域内の１５アミノ
酸残基をペプチド合成機（Applied Biosystems社、モデ
ル４３０Ａ）により、固相合成法で合成した。合成した
ペプチドはＯＳＦ−４．１（FVIDDKSGNIHATKT：配列表
の配列番号８）である。合成ペプチドはグルタルアルデ
ヒドをカップリング剤としてＫＬＨ(Keyhole limpet he
macyanin）担体と結合し、ウサギの免疫に使用した。得
られた抗血清は、新生児マウス全身切片中で、組織免疫
化学的に、ＯＳＦ−４の存在を検索したり、大腸菌、酵
母及び動物細胞でのＯＳＦ−４の発現を検出するのに使
用できた。

【００３３】〔実施例８〕 動物細胞でのＯＳＦ−４の
発現 本実施例ではマウスＯＳＦ−４の動物細胞での発現プラ
スミドベクターの作製と発現、及び機能解析について記
載する。配列表の配列番号１に示される塩基配列中には
ＯＳＦ−４をコードする領域の５′上流に他のオープン
リーディングフレームが存在する。このため、この配列
によるＯＳＦ−４の翻訳効率の低下が予想された。そこ
で、実施例３で作製したデレーションミュータントの中
からＯＳＦ−４のコーディング領域のみを含むクローン
を選びＯＳＦ−４発現ベクターの作製に用いた。このク
ローンから配列表の配列番号１の１９１番目のＧから２
７００番目のＡまでの断片を切り出し、５′上流にＸｈ
ｏＩとＢａｍＨＩサイトのリンカーを、３′下流にＸｈ
ｏＩサイトのリンカーを結合した。ついで、このＸｈｏ
Ｉ断片を動物細胞発現用プラスミドベクターｐＣＸＮ２
（Niwa et ai., (1991), Gene, 108, 193-200）のＸｈ
ｏＩサイトに挿入しクローニングした。得られたＯＳＦ
−４発現ベクターをｐＭＳＳ６０と命名した（図７）。

【００３４】カルシウム・リン酸共沈法を用いて、この
発現ベクターｐＭＳＳ６０をマウス表皮由来繊維芽細胞
株のＬ細胞に導入した。ついで、このｐＭＳＳ６０によ
り形質転換したＧ４１８耐性のコロニーを分離培養し１
２個のクローン化細胞株を得た。これらのクローン化細
胞株のそれぞれからＲＮＡを抽出した。これらのＲＮＡ
を用いてマウスＯＳＦ−４をプローブとしたＲＮＡドッ
トブロット法により、ＯＳＦ−４のｍＲＮＡ発現量の高
いクローン化細胞株３個を選択した。それぞれ、Ｃ１、
Ｃ７、Ｃ１１と名付けた。これらの細胞株を用いてウエ
スタンブロット法（Western blot analysis）により生
成された蛋白質を解析したところ、抗ＯＳＦ−４抗体に
反応する約１００キロダルトンのバンドが検出された。

【００３５】さらに、これらのクローン化細胞株を用い
て、カドヘリンの細胞接着性を調べるアグリゲーション
アッセイ法（Aggregation assay）によりＯＳＦ−４の
活性の解析を行った。アグリゲーションアッセイ法の詳
細は竹市らの方法(Takeichi,(1977), J.C.B., vol.75,
p.464-474）に従って行った。まず、各クローン化細胞
の単層細胞からＴＣ処理群とＴＥ処理群の２種類の細胞
懸濁液を調製した。

【００３６】ＴＣ処理群は以下の様に調製した。即ち、
単層細胞を１ｍＭ塩化カルシウムを含むＣＭＦ溶液（パ
ックのGa₂ ⁺，Mg₂ ⁺フリー生理食塩水：J, Exp. Med. vo
l.108, p.954-956, 1958）で３回洗った後に、０.０１
％トリプシンと０.１ｍＭ塩化カルシウムを含むＨＣＭ
Ｆ溶液（HEPES−緩衝生理食塩水：NaCl 8.0ｇ，KCl 0.4
ｇ，Na₂HPO₄・7H₂O 0.09ｇ，グルコース１ｇ，HEPES 2.
38ｇを水に溶解し、１NNaOH 4.8mlを加えpH 7.4とし、
最終的に１リットルの水溶液にする）中で３７℃、１５
分間処理しＴＣ処理群の細胞懸濁液を調製した。また、
ＴＥ処理群の細胞懸濁液は１ｍＭ ＥＤＴＡと０.０１％
トリプシンを含むＨＣＭＦ溶液中で３７℃、１５分間処
理する事以外は、ＴＣ処理群と同様の方法により調製し
た。

【００３７】ついで、それぞれの処理群の細胞懸濁液を
ＣＭＦ溶液で２回洗った後に、各細胞懸濁液をさらに二
分し、それぞれ１ｍＭ塩化カルシウムを含むものと含ま
ないＨＣＭＦ溶液に再懸濁し、細胞濃度が３ｍｌ当たり
１×１０⁶個になるように細胞懸濁液を調製した。これ
らの各細胞懸濁液を１５ｍｌコニカルチユーブに移し、
３７℃で毎分８０回転、１時間攪拌する事により細胞の
アグリゲーションを行わせた。攪拌前の細胞数（N₀）と
１時間攪拌後の細胞の塊の数（N₁）をコールターカウン
ターにより測定し、その割合（N₁／N₀）を求めた。その
結果、以下の表２に示すようにＯＳＦ−４を発現してい
るクローン化細胞株でのみカドヘリンと同様のカルシウ
ム依存性の細胞接着性を示した。カドヘリン分子はカル
シウム存在下ではトリプシンの分解を受けない事が知ら
れている。従って、ＥＤＴＡで処理したトリプシンの分
解を受けたものは細胞接着性を示さなかった。

【００３８】

【表２】 ＊ １時間後に細胞塊の数が少ないほど細胞同士が凝集
している事を示している。その数が１の時は細胞接着性
がない。 ** mockはベクターのみを導入したＬ細胞を示す。

【００３９】

【発明の効果】本発明により提供されるＯＳＦ−４は、
骨代謝性疾患の治療剤として用いることができ、また、
骨に対する臓器特異性が高いので骨代謝性疾患の診断剤
として用いることできる。

【００４０】

【配列表】 配列番号：1 配列の長さ：3581 配列の型：核酸 鎖の数：二重鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源： 生物名：マウス (Mus musculus) 株名：骨芽細胞株 MC3T3E1 配列の特徴： 配列 GAATTCGCGG CCGCCTTTGA AGACATTCAG TTCTGTTATT TATTGAATGA CCAATCAGAT 60 GGGTGGAGCA TGTTATAGGA ATTGGCAGCA GGTATCCAAT GGGTGAAGAA GAAGCTGACT 120 GCGGAGGTGA CCAACCCTGG CGTGATGTCC TCAGTGAGTG AAGATATTCC ATTCCAGAGG 180 AGGTCTACTT GACACATCTG GGAGGCCGCC ATCCGAAAGA AAGCCACTCT GTTGGTGTAG 240 GGAGTGACAG CTGCATTCTC CTGTGCCTAC TGCATAACCA AAA ATG AAG GAG AAC 295 Met Lys Glu Asn 1 TAC TGT TTA CAA GCT GCC CTG GTG TGC CTG AGC ATG CTA TAC CAC AGC 343 Tyr Cys Leu Gln Ala Ala Leu Val Cys Leu Ser Met Leu Tyr His Ser 5 10 15 20 CAG GCG TTT GCT CTG GAG CGA CGA AGC CAC CTG CAT CCC TCT TTC CAT 391 Gln Ala Phe Ala Leu Glu Arg Arg Ser His Leu His Pro Ser Phe His 25 30 35 GGA CAC CAT GAG AAG GGC AAG GAG GGG CAG GTG CTG CAA CGC TCC AAG 439 Gly His His Glu Lys Gly Lys Glu Gly Gln Val Leu Gln Arg Ser Lys 40 45 50 AGA GGC TGG GTC TGG AAC CAA TTC TTT GTG ATA GAA GAG TAC ACC GGG 487 Arg Gly Trp Val Trp Asn Gln Phe Phe Val Ile Glu Glu Tyr Thr Gly 55 60 65 CCT GAC CCT GTG CTG GTG GGC AGG CTT CAT TCT GAC ATT GAC TCC GGT 535 Pro Asp Pro Val Leu Val Gly Arg Leu His Ser Asp Ile Asp Ser Gly 70 75 80 GAT GGG AAC ATT AAA TAC ATT CTC TCA GGT GAA GGA GCG GGA ACC ATT 583 Asp Gly Asn Ile Lys Tyr Ile Leu Ser Gly Glu Gly Ala Gly Thr Ile 85 90 95 100 TTT GTG ATT GAT GAC AAA TCA GGG AAC ATT CAT GCC ACC AAG ACA TTG 631 Phe Val Ile Asp Asp Lys Ser Gly Asn Ile His Ala Thr Lys Thr Leu 105 110 115 GAC CGA GAG GAG AGA GCC CAG TAC ACA CTG ATG GCT CAG GCG GTG GAC 679 Asp Arg Glu Glu Arg Ala Gln Tyr Thr Leu Met Ala Gln Ala Val Asp 120 125 130 AGG GAC ACC AAC AGA CCA CTG GAG CCA CCT TCA GAA TTC ATT GTT AAG 727 Arg Asp Thr Asn Arg Pro Leu Glu Pro Pro Ser Glu Phe Ile Val Lys 135 140 145 GTC CAG GAC ATT AAT GAC AAC CCT CCA GAG TTT CTG CAT GAA ATC TAT 775 Val Gln Asp Ile Asn Asp Asn Pro Pro Glu Phe Leu His Glu Ile Tyr 150 155 160 CAT GCC AAT GTG CCT GAG AGG TCC AAT GTG GGA ACA TCA GTT ATC CAA 823 His Ala Asn Val Pro Glu Arg Ser Asn Val Gly Thr Ser Val Ile Gln 165 170 175 180 GTG ACA GCC TCT GAT GCA GAT GAT CCC ACC TAT GGA AAT AGT GCC AAG 871 Val Thr Ala Ser Asp Ala Asp Asp Pro Thr Tyr Gly Asn Ser Ala Lys 185 190 195 TTA GTG TAT AGC ATC CTT GAA GGA CAA CCC TAT TTC TCG GTG GAG GCC 919 Leu Val Tyr Ser Ile Leu Glu Gly Gln Pro Tyr Phe Ser Val Glu Ala 200 205 210 CAA ACA GGT ATC ATC AGG ACA GCC CTT CCC AAT ATG GAC AGA GAA GCC 967 Gln Thr Gly Ile Ile Arg Thr Ala Leu Pro Asn Met Asp Arg Glu Ala 215 220 225 AAG GAG GAG TAC CAC GTG GTG ATC CAG GCC AAG GAC ATG GGT GGA CAC 1015 Lys Glu Glu Tyr His Val Val Ile Gln Ala Lys Asp Met Gly Gly His 230 235 240 ATG GGT GGA CTC TCA GGG ACA ACC AAA GTG ACG ATC ACT CTG ACT GAT 1063 Met Gly Gly Leu Ser Gly Thr Thr Lys Val Thr Ile Thr Leu Thr Asp 245 250 255 260 GTC AAC GAC AAC CCA CCA AAG TTT CCA CAG AGC GTG TAC CAG ATG TCT 1111 Val Asn Asp Asn Pro Pro Lys Phe Pro Gln Ser Val Tyr Gln Met Ser 265 270 275 GTA TCA GAA GCA GCT GTC CCG GGG GAG GAA GTA GGA AGG GTG AAG GCT 1159 Val Ser Glu Ala Ala Val Pro Gly Glu Glu Val Gly Arg Val Lys Ala 280 285 290 AAA GAC CCA GAC ATT GGA GAA AAT GGC TTA GTC ACA TAC AAT ATC GTT 1207 Lys Asp Pro Asp Ile Gly Glu Asn Gly Leu Val Thr Tyr Asn Ile Val 295 300 305 GAT GGA GAC GGC ATA GAA CTG TTT GAA ATT ACA ACA GAC TAT GAA ACA 1255 Asp Gly Asp Gly Ile Glu Leu Phe Glu Ile Thr Thr Asp Tyr Glu Thr 310 315 320 CAG GAT GGT GTG GTG AAG CTG AAA AAG CCT GTA GAT TTT GAA ACC AAA 1303 Gln Asp Gly Val Val Lys Leu Lys Lys Pro Val Asp Phe Glu Thr Lys 325 330 335 340 AGA GCT TAT AGC TTG AAG ATA GAG GCC GCC AAT GTT CAC ATT GAT CCG 1351 Arg Ala Tyr Ser Leu Lys Ile Glu Ala Ala Asn Val His Ile Asp Pro 345 350 355 AAG TTC ATC AGC AAT GGA CCT TTC AAG GAC ACT GTG ACC GTC AAG ATT 1399 Lys Phe Ile Ser Asn Gly Pro Phe Lys Asp Thr Val Thr Val Lys Ile 360 365 370 TCA GTA GAA GAT GCC GAT GAG CCT CCC ATG TTC TTG GCC CCA AGT TAT 1447 Ser Val Glu Asp Ala Asp Glu Pro Pro Met Phe Leu Ala Pro Ser Tyr 375 380 385 ATC CAT GAA GTT CAA GAA AAT GCA GCT GCT GGC ACT GTG GTT GGG AGA 1495 Ile His Glu Val Gln Glu Asn Ala Ala Ala Gly Thr Val Val Gly Arg 390 395 400 GTA CAT GCC AAA GAC CCA GAT GCT GCC AAC AGC CCA ATA AGG TAT TCA 1543 Val His Ala Lys Asp Pro Asp Ala Ala Asn Ser Pro Ile Arg Tyr Ser 405 410 415 420 ATT GAT CGT CAT ACT GAC CTC GAC AGG TTT TTC ACG ATT AAT CCA GAA 1591 Ile Asp Arg His Thr Asp Leu Asp Arg Phe Phe Thr Ile Asn Pro Glu 425 430 435 GAT GGT TTT ATT AAA ACT ACG AAA CCT CTA GAT AGG GAA GAA ACT GCC 1639 Asp Gly Phe Ile Lys Thr Thr Lys Pro Leu Asp Arg Glu Glu Thr Ala 440 445 450 TGG CTC AAC ATC TCT GTC TTC GCA GCA GAA ATT CAC AAC AGA CAT CAG 1687 Trp Leu Asn Ile Ser Val Phe Ala Ala Glu Ile His Asn Arg His Gln 455 460 465 GAA ACC AAA GTC CCA GTG GCC ATC AGG GTC CTG GAT GTC AAT GAC AAT 1735 Glu Thr Lys Val Pro Val Ala Ile Arg Val Leu Asp Val Asn Asp Asn 470 475 480 GCT CCT AAG TTT GCT GCC CCT TAT GAA GGT TTT ATC TGT GAG AGC GAT 1783 Ala Pro Lys Phe Ala Ala Pro Tyr Glu Gly Phe Ile Cys Glu Ser Asp 485 490 495 500 CAC CCC AAG GCA CTC TCC AAC CAG CCA ATA GTT ACA GTT AGT GCA GAT 1831 His Pro Lys Ala Leu Ser Asn Gln Pro Ile Val Thr Val Ser Ala Asp 505 510 515 GAC CAG GAC GAC ACA GCC AAT GGA CCA AGA TTT ATC TTC AGC CTA CCC 1879 Asp Gln Asp Asp Thr Ala Asn Gly Pro Arg Phe Ile Phe Ser Leu Pro 520 525 530 CCT GAA ATC ATG CAC AAC CCA AAC TTC ACA GTA AGA GAC AAC AGA GAT 1927 Pro Glu Ile Met His Asn Pro Asn Phe Thr Val Arg Asp Asn Arg Asp 535 540 545 AAC ACT GCA GGA GTA TAT GCC CGA CGT GGA GGG TTC AGT CGG CAG AAG 1975 Asn Thr Ala Gly Val Tyr Ala Arg Arg Gly Gly Phe Ser Arg Gln Lys 550 555 560 CAG GAC TTC TAC CTC CTG CCC ATT GTG ATC AGT GAT GGT GGC ATT CCA 2023 Gln Asp Phe Tyr Leu Leu Pro Ile Val Ile Ser Asp Gly Gly Ile Pro 565 570 575 580 CCT ATG AGT AGC ACC AAT ACC CTC ACT ATC AAA GTC TGT GGC TGT GAT 2071 Pro Met Ser Ser Thr Asn Thr Leu Thr Ile Lys Val Cys Gly Cys Asp 585 590 595 GTG AAT GGG GCA CTG TTG TCC TGT AAC GCT GAA GCC TAC ATC CTG AAT 2119 Val Asn Gly Ala Leu Leu Ser Cys Asn Ala Glu Ala Tyr Ile Leu Asn 600 605 610 GCC GGT CTG AGC ACT GGG GCA CTG ATC GCC ATC CTT GCC TGC ATC GTC 2167 Ala Gly Leu Ser Thr Gly Ala Leu Ile Ala Ile Leu Ala Cys Ile Val 615 620 625 ATT CTT CTG GTC ATC GTT GTG CTG TTT GTT ACC CTG AGG AGG CAA AAG 2215 Ile Leu Leu Val Ile Val Val Leu Phe Val Thr Leu Arg Arg Gln Lys 630 635 640 AAA GAA CCA CTC ATT GTA TTT GAA GAG GAG GAT GTC CGT GAG AAC ATC 2263 Lys Glu Pro Leu Ile Val Phe Glu Glu Glu Asp Val Arg Glu Asn Ile 645 650 655 660 ATA ACC TAT GAT GAT GAA GGG GGT GGT GAG GAA GAC ACT GAA GCC TTC 2311 Ile Thr Tyr Asp Asp Glu Gly Gly Gly Glu Glu Asp Thr Glu Ala Phe 665 670 675 GAC ATA GCC ACC CTG CAG AAT CCT GAC GGC ATC AAT GGA TTT ATC CCT 2359 Asp Ile Ala Thr Leu Gln Asn Pro Asp Gly Ile Asn Gly Phe Ile Pro 680 685 690 CGC AAA GAT ATC AAA CCT GAG TAT CAG TAT ATG CCT AGA CCT GGG CTG 2407 Arg Lys Asp Ile Lys Pro Glu Tyr Gln Tyr Met Pro Arg Pro Gly Leu 695 700 705 CGA CCA GCA CCC AAC AGT GTG GAT GTG GAC GAC TTC ATC AAC ACA AGA 2455 Arg Pro Ala Pro Asn Ser Val Asp Val Asp Asp Phe Ile Asn Thr Arg 710 715 720 ATA CAG GAG GCA GAT AAT GAT CCC ACA GCC CCT CCC TAT GAC TCC ATC 2503 Ile Gln Glu Ala Asp Asn Asp Pro Thr Ala Pro Pro Tyr Asp Ser Ile 725 730 735 740 CAA ATC TAT GGT TAT GAG GGC CGG GGT TCC GTG GCT GGG TCC CTG AGC 2551 Gln Ile Tyr Gly Tyr Glu Gly Arg Gly Ser Val Ala Gly Ser Leu Ser 745 750 755 TCC TTG GAG TCT GCC ACG ACA GAC TCA GAC CTG GAC TAC GAC TAT CTA 2599 Ser Leu Glu Ser Ala Thr Thr Asp Ser Asp Leu Asp Tyr Asp Tyr Leu 760 765 770 CAG AAC TGG GGA CCT CGT TTT AAG AAA CTG GCA GAC TTG TAT GGC TCC 2647 Gln Asn Trp Gly Pro Arg Phe Lys Lys Leu Ala Asp Leu Tyr Gly Ser 775 780 785 AAA GAC ACT TTT GAT GAT GAC TCT TAACAATAAT GTTACAAATT TGGCCTTAAG 2701 Lys Asp Thr Phe Asp Asp Asp Ser 790 795 AACTGTGTCT GGCATTCTCA AGAATCTAGA AGATGTGTAA ACAGGTATTT TTTTAAATCA 2761 AGGAAAGGCT CATTTAAAAC AAGCAGAGTT TTACAGAGAG GAAACATTTA ATAAAACTGC 2821 AAGGACATCA AAGTGGAAAA TACTGTGAAG TACCTTTTCC CACTTAAAAA GCAAATATTG 2881 AAGTTGTTTA TCAACTTCAG TAGAAAAAAA AAAACCACTT GGCACACAAA ATATTTAAAT 2941 GAAGGAGAAG TCCACGGTGA ACTTACAATG AAGGGAAATC GTCTATGTGT TAAGAACATC 3001 TAAGTCTCTC TTATTTTATT TTTTAATTTG TCAAAGAAGC TTCCACAAAA TTAGAAAGGA 3061 CAACAGTTCT GAGCTGAAAT TTCGCCTTAA ACTATGGACA CTCTATCTGT AGTGCGTTTT 3121 TAAACTTTGA ATATATAATA TCCAGCCAGC TTAAACCCAT ACAATGTATG TACAATACAA 3181 TGTACAATTA TGTCTCTTGA GCATCAATCT TGTTACTGCT GATTCTTGTA AATCTTTTTG 3241 CTTCTACTTT CATCCTAAAC TAATACGTGC CAGATATAAC TGTCTTGTTT CAGTGAGGAG 3301 CACCCTATTT CTATGTCATT TTTAATGTAT CTATTTGTAC AATTTTAAAG TTCTTATTTT 3361 AGTATACATA CAAATATCAG TATTCTGACA TGTACGAAAA TGTTACAGCA TCACACTTAT 3421 ATTTTATGAA CATTGTACTG TTGCTTTAAT ATGAGCTTCA ATATAAGAAG CAACCTTTGA 3481 AATAAAAAAA AGATTCTTTT TTAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 3541 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAGCGG CCGCGAATTC 3581

【００４１】配列番号：2 配列の長さ：3712 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源： 生物名：ヒト (Homo sapiens) 細胞の種類：原発生骨腫瘍 配列の特徴： 配列 GAATTCGGAG ATCTACAGGC GAGGAGAGAT GCCGCGGGGG CCGCTCGCAG CCGCCGCTGA 60 CTTGTGAATG GGACCGGGAC TGGGGCCGGG ACTGACACCG CAGCGCTTGC CCTGCGCCAG 120 GGACTGGCGG CTCGGAGGTT GCGTCCACCC TCAAGGGCCC CAGAAATCAC TGTGTTTTCA 180 GCTCAGCGGC CCTGTGACAT TCCTTCGTGT TGTCATTTGT TGAGTGACCA ATCAGATGGG 240 TGGAGTGTGT TACAGAAATT GGCAGCAAGT ATCCAATGGG TGAAGAAGAA GCTAACTGGG 300 GACGTGGGCA GCCCTGACGT GATGAGCTCA ACCAGCAGAG ACATTCCATC CCAAGAGAGG 360 TCTGCGTGAC GCGTCCGGGA GGCCACCCTC AGCAAGACCA CCGTACAGTT GGTGGAAGGG 420 GTGACAGCTG CATTCTCCTG TGCCTACCAC GTAACCAAAA ATG AAG GAG AAC TAC 475 Met Lys Glu Asn Tyr 1 5 TGT TTA CAA GCC GCC CTG GTG TGC CTG GGC ATG CTG TGC CAC AGC CAT 523 Cys Leu Gln Ala Ala Leu Val Cys Leu Gly Met Leu Cys His Ser His 10 15 20 GCC TTT GCC CCA GAG CGG CGG GGG CAC CTG CGG CCC TCC TTC CAT GGG 571 Ala Phe Ala Pro Glu Arg Arg Gly His Leu Arg Pro Ser Phe His Gly 25 30 35 CAC CAT GAG AAG GGC AAG GAG GGG CAG GTG CTA CAG CGC TCC AAG CGT 619 His His Glu Lys Gly Lys Glu Gly Gln Val Leu Gln Arg Ser Lys Arg 40 45 50 GGC TGG GTC TGG AAC CAG TTC TTC GTG ATA GAG GAG TAC ACC GGG CCT 667 Gly Trp Val Trp Asn Gln Phe Phe Val Ile Glu Glu Tyr Thr Gly Pro 55 60 65 GAC CCC GTG CTT GTG GGC AGG CTT CAT TCA GAT ATT GAC TCT GGT GAT 715 Asp Pro Val Leu Val Gly Arg Leu His Ser Asp Ile Asp Ser Gly Asp 70 75 80 85 GGG AAC ATT AAA TAC ATT CTC TCA GGG GAA GGA GCT GGA ACC ATT TTT 763 Gly Asn Ile Lys Tyr Ile Leu Ser Gly Glu Gly Ala Gly Thr Ile Phe 90 95 100 GTG ATT GAT GAC AAA TCA GGG AAC ATT CAT GCC ACC AAG ACG TTG GAT 811 Val Ile Asp Asp Lys Ser Gly Asn Ile His Ala Thr Lys Thr Leu Asp 105 110 115 CGA GAA GAG AGA GCC CAG TAC ACG TTG ATG GCT CAG GCG GTG GAC AGG 859 Arg Glu Glu Arg Ala Gln Tyr Thr Leu Met Ala Gln Ala Val Asp Arg 120 125 130 GAC ACC AAT CGG CCA CTG GAG CCA CCG TCG GAA TTC ATT GTC AAG GTC 907 Asp Thr Asn Arg Pro Leu Glu Pro Pro Ser Glu Phe Ile Val Lys Val 135 140 145 CAG GAC ATT AAT GAC AAC CCT CCG GAG TTC CTG CAC GAG ACC TAT CAT 955 Gln Asp Ile Asn Asp Asn Pro Pro Glu Phe Leu His Glu Thr Tyr His 150 155 160 165 GCC AAC GTG CCT GAG AGG TCC AAT GTG GGA ACG TCA GTA ATC CAG GTG 1003 Ala Asn Val Pro Glu Arg Ser Asn Val Gly Thr Ser Val Ile Gln Val 170 175 180 ACA GCT TCA GAT GCA GAT GAC CCC ACT TAT GGA AAT AGC GCC AAG TTA 1051 Thr Ala Ser Asp Ala Asp Asp Pro Thr Tyr Gly Asn Ser Ala Lys Leu 185 190 195 GTG TAC AGT ATC CTC GAA GGA CAA CCC TAT TTT TCG GTG GAA GCA CAG 1099 Val Tyr Ser Ile Leu Glu Gly Gln Pro Tyr Phe Ser Val Glu Ala Gln 200 205 210 ACA GGT ATC ATC AGA ACA GCC CTA CCC AAC ATG GAC AGG GAG GCC AAG 1147 Thr Gly Ile Ile Arg Thr Ala Leu Pro Asn Met Asp Arg Glu Ala Lys 215 220 225 GAG GAG TAC CAC GTG GTG ATC CAG GCC AAG GAC ATG GGT GGA CAT ATG 1195 Glu Glu Tyr His Val Val Ile Gln Ala Lys Asp Met Gly Gly His Met 230 235 240 245 GGC GGA CTC TCA GGG ACA ACC AAA GTG ACG ATC ACA CTG ACC GAT GTC 1243 Gly Gly Leu Ser Gly Thr Thr Lys Val Thr Ile Thr Leu Thr Asp Val 250 255 260 AAT GAC AAC CCA CCA AAG TTT CCG CAG AGC GTA TAC CAG ATA TCT GTG 1291 Asn Asp Asn Pro Pro Lys Phe Pro Gln Ser Val Tyr Gln Ile Ser Val 265 270 275 TCA GAA GCA GCC GTC CCT GGG GAG GAA GTA GGA AGA GTG AAA GCT AAA 1339 Ser Glu Ala Ala Val Pro Gly Glu Glu Val Gly Arg Val Lys Ala Lys 280 285 290 GAT CCA GAC ATT GGA GAA AAT GGC TTA GTC ACA TAC AAT ATT GTT GAT 1387 Asp Pro Asp Ile Gly Glu Asn Gly Leu Val Thr Tyr Asn Ile Val Asp 295 300 305 GGA GAT GGT ATG GAA TCG TTT GAA ATC ACA ACG GAC TAT GAA ACA CAG 1435 Gly Asp Gly Met Glu Ser Phe Glu Ile Thr Thr Asp Tyr Glu Thr Gln 310 315 320 325 GAG GGG GTG ATA AAG CTG AAA AAG CCT GTA GAT TTT GAA ACC AAA AGA 1483 Glu Gly Val Ile Lys Leu Lys Lys Pro Val Asp Phe Glu Thr Lys Arg 330 335 340 GCC TAT AGC TTG AAG GTA GAG GCA GCC AAC GTG CAC ATC GAC CCG AAG 1531 Ala Tyr Ser Leu Lys Val Glu Ala Ala Asn Val His Ile Asp Pro Lys 345 350 355 TTT ATC AGC AAT GGC CCT TTC AAG GAC ACT GTG ACC GTC AAG ATC GCA 1579 Phe Ile Ser Asn Gly Pro Phe Lys Asp Thr Val Thr Val Lys Ile Ala 360 365 370 GTA GAA GAT GCT GAT GAG CCC CCT ATG TTC TTG GCC CCA AGT TAC ATC 1627 Val Glu Asp Ala Asp Glu Pro Pro Met Phe Leu Ala Pro Ser Tyr Ile 375 380 385 CAC GAA GTC CAA GAA AAT GCA GCT GCT GGC ACC GTG GTT GGG AGA GTG 1675 His Glu Val Gln Glu Asn Ala Ala Ala Gly Thr Val Val Gly Arg Val 390 395 400 405 CAT GCC AAA GAC CCT GAT GCT GCC AAC AGC CCG ATA AGG TAT TCC ATC 1723 His Ala Lys Asp Pro Asp Ala Ala Asn Ser Pro Ile Arg Tyr Ser Ile 410 415 420 GAT CGT CAC ACT GAC CTC GAC AGA TTT TTC ACT ATT AAT CCA GAG GAT 1771 Asp Arg His Thr Asp Leu Asp Arg Phe Phe Thr Ile Asn Pro Glu Asp 425 430 435 GGT TTT ATT AAA ACT ACA AAA CCT CTG GAT AGA GAG GAA ACA GCC TGG 1819 Gly Phe Ile Lys Thr Thr Lys Pro Leu Asp Arg Glu Glu Thr Ala Trp 440 445 450 CTC AAC ATC ACT GTC TTT GCA GCA GAA ATC CAC AAT CGG CAT CAG GAA 1867 Leu Asn Ile Thr Val Phe Ala Ala Glu Ile His Asn Arg His Gln Glu 455 460 465 GCC AAA GTC CCA GTG GCC ATT AGG GTC CTT GAT GTC AAC GAT AAT GCT 1915 Ala Lys Val Pro Val Ala Ile Arg Val Leu Asp Val Asn Asp Asn Ala 470 475 480 485 CCC AAG TTT GCT GCC CCT TAT GAA GGT TTC ATC TGT GAG AGT GAT CAG 1963 Pro Lys Phe Ala Ala Pro Tyr Glu Gly Phe Ile Cys Glu Ser Asp Gln 490 495 500 ACC AAG CCA CTT TCC AAC CAG CCA ATT GTT ACA ATT AGT GCA GAT GAC 2011 Thr Lys Pro Leu Ser Asn Gln Pro Ile Val Thr Ile Ser Ala Asp Asp 505 510 515 AAG GAT GAC ACG GCC AAT GGA CCA AGA TTT ATC TTC AGC CTA CCC CCT 2059 Lys Asp Asp Thr Ala Asn Gly Pro Arg Phe Ile Phe Ser Leu Pro Pro 520 525 530 GAA ATC ATT CAC AAT CCA AAT TTC ACA GTC AGA GAC AAC CGA GAT AAC 2107 Glu Ile Ile His Asn Pro Asn Phe Thr Val Arg Asp Asn Arg Asp Asn 535 540 545 ACA GCA GGC GTG TAC GCC CGG CGT GGA GGG TTC AGT CGG CAG AAG CAG 2155 Thr Ala Gly Val Tyr Ala Arg Arg Gly Gly Phe Ser Arg Gln Lys Gln 550 555 560 565 GAC TTG TAC CTT CTG CCC ATA GTG ATC AGC GAT GGC GGC ATC CCG CCC 2203 Asp Leu Tyr Leu Leu Pro Ile Val Ile Ser Asp Gly Gly Ile Pro Pro 570 575 580 ATG AGT AGC ACC AAC ACC CTC ACC ATC AAA GTC TGC GGG TGC GAC GTG 2251 Met Ser Ser Thr Asn Thr Leu Thr Ile Lys Val Cys Gly Cys Asp Val 585 590 595 AAC GGG GCA CTG CTC TCC TGC AAC GCA GAG GCC TAC ATT CTG AAC GCC 2299 Asn Gly Ala Leu Leu Ser Cys Asn Ala Glu Ala Tyr Ile Leu Asn Ala 600 605 610 GGC CTG AGC ACA GGC GCC CTG ATC GCC ATC CTC GCC TGC ATC GTC ATT 2347 Gly Leu Ser Thr Gly Ala Leu Ile Ala Ile Leu Ala Cys Ile Val Ile 615 620 625 CTC CTG GTC ATT GTA GTA TTG TTT GTG ACC CTG AGA AGG CAA AAG AAA 2395 Leu Leu Val Ile Val Val Leu Phe Val Thr Leu Arg Arg Gln Lys Lys 630 635 640 645 GAA CCA CTC ATT GTC TTT GAG GAA GAA GAT GTC CGT GAG AAC ATC ATT 2443 Glu Pro Leu Ile Val Phe Glu Glu Glu Asp Val Arg Glu Asn Ile Ile 650 655 660 ACT TAT GAT GAT GAA GGG GGT GGG GAA GAA GAC ACA GAA GCC TTT GAT 2491 Thr Tyr Asp Asp Glu Gly Gly Gly Glu Glu Asp Thr Glu Ala Phe Asp 665 670 675 ATT GCC ACC CTC CAG AAT CCT GAT GGT ATC AAT GGA TTT ATC CCC CGC 2539 Ile Ala Thr Leu Gln Asn Pro Asp Gly Ile Asn Gly Phe Ile Pro Arg 680 685 690 AAA GAC ATC AAA CCT GAG TAT CAG TAC ATG CCT AGA CCT GGG CTC CGG 2587 Lys Asp Ile Lys Pro Glu Tyr Gln Tyr Met Pro Arg Pro Gly Leu Arg 695 700 705 CCA GCG CCC AAC AGC GTG GAT GTC GAT GAC TTC ATC AAC ACG AGA ATA 2635 Pro Ala Pro Asn Ser Val Asp Val Asp Asp Phe Ile Asn Thr Arg Ile 710 715 720 725 CAG GAG GCA GAC AAT GAC CCC ACG GCT CCT CCT TAT GAC TCC ATT CAA 2683 Gln Glu Ala Asp Asn Asp Pro Thr Ala Pro Pro Tyr Asp Ser Ile Gln 730 735 740 ATC TAC GGT TAT GAA GGC AGG GGC TCA GTG GCC GGG TCC CTG AGC TCC 2731 Ile Tyr Gly Tyr Glu Gly Arg Gly Ser Val Ala Gly Ser Leu Ser Ser 745 750 755 CTA GAG TCG GCC ACC ACA GAT TCA GAC TTG GAC TAT GAT TAT CTA CAG 2779 Leu Glu Ser Ala Thr Thr Asp Ser Asp Leu Asp Tyr Asp Tyr Leu Gln 760 765 770 AAC TGG GGA CCT CGT TTT AAG AAA CTA GCA GAT TTG TAT GGT TCC AAA 2827 Asn Trp Gly Pro Arg Phe Lys Lys Leu Ala Asp Leu Tyr Gly Ser Lys 775 780 785 GAC ACT TTT GAT GAC GAT TCT TAA CAATAACGAT ACAAATTTGG CCTTAAGAAC 2881 Asp Thr Phe Asp Asp Asp Ser 790 795 TGTGTCTGGC GTTCTCAAGA ATCTAGAAGA TGTGTAAACA GGTATTTTTT TAAATCAAGG 2941 AAAGGCTCAT TTAAAACAGG CAAAGTTTTA CAGAGAGGAT ACATTTAATA AAACTGCGAG 3001 GACATCAAAG TGGTAAATAC TGTGAAATAC CTTTTCTCAC AAAAAGGCAA ATATTGAAGT 3061 TGTTTATCAA CTTCGCTAGA AAAAAAAAAC ACTTGGCATA CAAAATATTT AAGTGAAGGA 3121 GAAGTCTAAC GCTGAACTGA CAATGAAGGG AAATTGTTTA TGTGTTATGA ACATCCAAGT 3181 CTTTCTTCTT TTTTAAGTTG TCAAAGAAGC TTCCACAAAA TTAGAAAGGA CAACAGTTCT 3241 GAGCTGTAAT TTCGCCTTAA ACTCTGGACA CTCTATATGT AGTGCATTTT TAAACTTGAA 3301 ATATATAATA TTCAGCCAGC TTAAACCCAT ACAATGTATG TACAATACAA TGTACAATTA 3361 TGTCTCTTGA GCATCAATCT TGTTACTGCT GATTCTTGTA AATCTTTTTG CTTCTACTTT 3421 CATCTTAAAC TAATACGTGC CAGATATAAC TGTCTTGTTT CAGTGAGAGA CGCCCTATTT 3481 CTATGTCATT TTTAATGTAT CTATTTGTAC AATTTTAAAG TTCTTATTTT AGTATACATA 3541 TAAATATCAG TATTCTGACA TGTAAGAAAA TGTTACGGCA TCACACTTAT ATTTTATGAA 3601 CATTGTACTG TTGCTTTAAT ATGAGCTTCA ATATAAGAAG CAATCTTTGA AATAAAAAAA 3661 GATTTTTTTT TAAAAAAAAG GAGATCTACA GGCCTGTAGA TCTCCGAATT C 3712

【００４２】配列番号：3 配列の長さ：3914 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源： 生物名：ヒト (Homo sapiens) 細胞の種類：原発生骨腫瘍 配列の特徴： 配列 GAATTCGGAG ATCTACAGGC CCGCGACGCT CCCCTCAGCT GGCGGCGGCC GCGGAGAGAT 60 GCCGCGGGGG CCGCTCGCAG CCGCCGCTGA CTTGTGAATG GGACCGGGAC TGGGGCCGGG 120 ACTGACACCG CAGCGCTTGC CCTGCGCCAG GGACTGGCGG CTCGGAGGTT GCGTCCACCC 180 TCAAGGGCCC CAGAAATCAC TGTGTTTTCA GCTCAGCGGC CCTGTGACAT TCCTTCGTGT 240 TGTCATTTGT TGAGTGACCA ATCAGATGGG TGGAGTGTGT TACAGAAATT GGCAGCAAGT 300 ATCCAATGGG TGAAGAAGAA GCTAACTGGG GACGTGGGCA GCCCTGACGT GATGAGCTCA 360 ACCAGCAGAG ACATTCCATC CCAAGAGAGG TCTGCGTGAC GCGTCCGGGA GGCCACCCTC 420 AGCAAGACCA CCGTACAGTT GGTGGAAGGG GTGACAGCTG CATTCTCCTG TGCCTACCAC 480 GTAACCAAAA ATG AAG GAG AAC TAC TGT TTA CAA GCC GCC CTG GTG TGC 529 Met Lys Glu Asn Tyr Cys Leu Gln Ala Ala Leu Val Cys 1 5 10 CTG GGC ATG CTG TGC CAC AGC CAT GCC TTT GCC CCA GAG CGG CGG GGG 577 Leu Gly Met Leu Cys His Ser His Ala Phe Ala Pro Glu Arg Arg Gly 15 20 25 CAC CTG CGG CCC TCC TTC CAT GGG CAC CAT GAG AAG GGC AAG GAG GGG 625 His Leu Arg Pro Ser Phe His Gly His His Glu Lys Gly Lys Glu Gly 30 35 40 45 CAG GTG CTA CAG CGC TCC AAG CGT GGC TGG GTC TGG AAC CAG TTC TTC 673 Gln Val Leu Gln Arg Ser Lys Arg Gly Trp Val Trp Asn Gln Phe Phe 50 55 60 GTG ATA GAG GAG TAC ACC GGG CCT GAC CCC GTG CTT GTG GGC AGG CTT 721 Val Ile Glu Glu Tyr Thr Gly Pro Asp Pro Val Leu Val Gly Arg Leu 65 70 75 CAT TCA GAT ATT GAC TCT GGT GAT GGG AAC ATT AAA TAC ATT CTC TCA 769 His Ser Asp Ile Asp Ser Gly Asp Gly Asn Ile Lys Tyr Ile Leu Ser 80 85 90 GGG GAA GGA GCT GGA ACC ATT TTT GTG ATT GAT GAC AAA TCA GGG AAC 817 Gly Glu Gly Ala Gly Thr Ile Phe Val Ile Asp Asp Lys Ser Gly Asn 95 100 105 ATT CAT GCC ACC AAG ACG TTG GAT CGA GAA GAG AGA GCC CAG TAC ACG 865 Ile His Ala Thr Lys Thr Leu Asp Arg Glu Glu Arg Ala Gln Tyr Thr 110 115 120 125 TTG ATG GCT CAG GCG GTG GAC AGG GAC ACC AAT CGG CCA CTG GAG CCA 913 Leu Met Ala Gln Ala Val Asp Arg Asp Thr Asn Arg Pro Leu Glu Pro 130 135 140 CCG TCG GAA TTC ATT GTC AAG GTC CAG GAC ATT AAT GAC AAC CCT CCG 961 Pro Ser Glu Phe Ile Val Lys Val Gln Asp Ile Asn Asp Asn Pro Pro 145 150 155 GAG TTC CTG CAC GAG ACC TAT CAT GCC AAC GTG CCT GAG AGG TCC AAT 1009 Glu Phe Leu His Glu Thr Tyr His Ala Asn Val Pro Glu Arg Ser Asn 160 165 170 GTG GGA ACG TCA GTA ATC CAG GTG ACA GCT TCA GAT GCA GAT GAC CCC 1057 Val Gly Thr Ser Val Ile Gln Val Thr Ala Ser Asp Ala Asp Asp Pro 175 180 185 ACT TAT GGA AAT AGC GCC AAG TTA GTG TAC AGT ATC CTC GAA GGA CAA 1105 Thr Tyr Gly Asn Ser Ala Lys Leu Val Tyr Ser Ile Leu Glu Gly Gln 190 195 200 205 CCC TAT TTT TCG GTG GAA GCA CAG ACA GGT ATC ATC AGA ACA GCC CTA 1153 Pro Tyr Phe Ser Val Glu Ala Gln Thr Gly Ile Ile Arg Thr Ala Leu 210 215 220 CCC AAC ATG GAC AGG GAG GCC AAG GAG GAG TAC CAC GTG GTG ATC CAG 1201 Pro Asn Met Asp Arg Glu Ala Lys Glu Glu Tyr His Val Val Ile Gln 225 230 235 GCC AAG GAC ATG GGT GGA CAT ATG GGC GGA CTC TCA GGG ACA ACC AAA 1249 Ala Lys Asp Met Gly Gly His Met Gly Gly Leu Ser Gly Thr Thr Lys 240 245 250 GTG ACG ATC ACA CTG ACC GAT GTC AAT GAC AAC CCA CCA AAG TTT CCG 1297 Val Thr Ile Thr Leu Thr Asp Val Asn Asp Asn Pro Pro Lys Phe Pro 255 260 265 CAG AGC GTA TAC CAG ATA TCT GTG TCA GAA GCA GCC GTC CCT GGG GAG 1345 Gln Ser Val Tyr Gln Ile Ser Val Ser Glu Ala Ala Val Pro Gly Glu 270 275 280 285 GAA GTA GGA AGA GTG AAA GCT AAA GAT CCA GAC ATT GGA GAA AAT GGC 1393 Glu Val Gly Arg Val Lys Ala Lys Asp Pro Asp Ile Gly Glu Asn Gly 290 295 300 TTA GTC ACA TAC AAT ATT GTT GAT GGA GAT GGT ATG GAA TCG TTT GAA 1441 Leu Val Thr Tyr Asn Ile Val Asp Gly Asp Gly Met Glu Ser Phe Glu 305 310 315 ATC ACA ACG GAC TAT GAA ACA CAG GAG GGG GTG ATA AAG CTG AAA AAG 1489 Ile Thr Thr Asp Tyr Glu Thr Gln Glu Gly Val Ile Lys Leu Lys Lys 320 325 330 CCT GTA GAT TTT GAA ACC AAA AGA GCC TAT AGC TTG AAG GTA GAG GCA 1537 Pro Val Asp Phe Glu Thr Lys Arg Ala Tyr Ser Leu Lys Val Glu Ala 335 340 345 GCC AAC GTG CAC ATC GAC CCG AAG TTT ATC AGC AAT GGC CCT TTC AAG 1585 Ala Asn Val His Ile Asp Pro Lys Phe Ile Ser Asn Gly Pro Phe Lys 350 355 360 365 GAC ACT GTG ACC GTC AAG ATC GCA GTA GAA GAT GCT GAT GAG CCC CCT 1633 Asp Thr Val Thr Val Lys Ile Ala Val Glu Asp Ala Asp Glu Pro Pro 370 375 380 ATG TTC TTG GCC CCA AGT TAC ATC CAC GAA GTC CAA GAA AAT GCA GCT 1681 Met Phe Leu Ala Pro Ser Tyr Ile His Glu Val Gln Glu Asn Ala Ala 385 390 395 GCT GGC ACC GTG GTT GGG AGA GTG CAT GCC AAA GAC CCT GAT GCT GCC 1729 Ala Gly Thr Val Val Gly Arg Val His Ala Lys Asp Pro Asp Ala Ala 400 405 410 AAC AGC CCG ATA AGG TAT TCC ATC GAT CGT CAC ACT GAC CTC GAC AGA 1777 Asn Ser Pro Ile Arg Tyr Ser Ile Asp Arg His Thr Asp Leu Asp Arg 415 420 425 TTT TTC ACT ATT AAT CCA GAG GAT GGT TTT ATT AAA ACT ACA AAA CCT 1825 Phe Phe Thr Ile Asn Pro Glu Asp Gly Phe Ile Lys Thr Thr Lys Pro 430 435 440 445 CTG GAT AGA GAG GAA ACA GCC TGG CTC AAC ATC ACT GTC TTT GCA GCA 1873 Leu Asp Arg Glu Glu Thr Ala Trp Leu Asn Ile Thr Val Phe Ala Ala 450 455 460 GAA ATC CAC AAT CGG CAT CAG GAA GCC AAA GTC CCA GTG GCC ATT AGG 1921 Glu Ile His Asn Arg His Gln Glu Ala Lys Val Pro Val Ala Ile Arg 465 470 475 GTC CTT GAT GTC AAC GAT AAT GCT CCC AAG TTT GCT GCC CCT TAT GAA 1969 Val Leu Asp Val Asn Asp Asn Ala Pro Lys Phe Ala Ala Pro Tyr Glu 480 485 490 GGT TTC ATC TGT GAG AGT GAT CAG ACC AAG CCA CTT TCC AAC CAG CCA 2017 Gly Phe Ile Cys Glu Ser Asp Gln Thr Lys Pro Leu Ser Asn Gln Pro 495 500 505 ATT GTT ACA ATT AGT GCA GAT GAC AAG GAT GAC ACG GCC AAT GGA CCA 2065 Ile Val Thr Ile Ser Ala Asp Asp Lys Asp Asp Thr Ala Asn Gly Pro 510 515 520 525 AGA TTT ATC TTC AGC CTA CCC CCT GAA ATC ATT CAC AAT CCA AAT TTC 2113 Arg Phe Ile Phe Ser Leu Pro Pro Glu Ile Ile His Asn Pro Asn Phe 530 535 540 ACA GTC AGA GAC AAC CGA GAT AAC ACA GCA GGC GTG TAC GCC CGG CGT 2161 Thr Val Arg Asp Asn Arg Asp Asn Thr Ala Gly Val Tyr Ala Arg Arg 545 550 555 GGA GGG TTC AGT CGG CAG AAG CAG GAC TTG TAC CTT CTG CCC ATA GTG 2209 Gly Gly Phe Ser Arg Gln Lys Gln Asp Leu Tyr Leu Leu Pro Ile Val 560 565 570 ATC AGC GAT GGC GGC ATC CCG CCC ATG AGT AGC ACC AAC ACC CTC ACC 2257 Ile Ser Asp Gly Gly Ile Pro Pro Met Ser Ser Thr Asn Thr Leu Thr 575 580 585 ATC AAA GTC TGC GGG TGC GAC GTG AAC GGG GCA CTG CTC TCC TGC AAC 2305 Ile Lys Val Cys Gly Cys Asp Val Asn Gly Ala Leu Leu Ser Cys Asn 590 595 600 605 GCA GAG GCC TAC ATT CTG AAC GCC GGC CTG AGC ACA GGC GCC CTG ATC 2353 Ala Glu Ala Tyr Ile Leu Asn Ala Gly Leu Ser Thr Gly Ala Leu Ile 610 615 620 GCC ATC CTC GCC TGC ATC GTC ATT CTC CTG GGT TGC CCA AGC TTA ATG 2401 Ala Ile Leu Ala Cys Ile Val Ile Leu Leu Gly Cys Pro Ser Leu Met 625 630 635 GAA CCC CCC TCT CCC AGG GAA GAC ATG AGA TTG CTT TAT CTG GGC TTC 2449 Glu Pro Pro Ser Pro Arg Glu Asp Met Arg Leu Leu Tyr Leu Gly Phe 640 645 650 CAG CTG ATG CTA TTT TCC TAT GTT AAA GTA AAC AGA AGA TTT TGT CTT 2497 Gln Leu Met Leu Phe Ser Tyr Val Lys Val Asn Arg Arg Phe Cys Leu 655 660 665 CTG GGG GTC TTT ATA AAA CTT CCT TTC CTC TAT GTG GTG GCT ACA GAG 2545 Leu Gly Val Phe Ile Lys Leu Pro Phe Leu Tyr Val Val Ala Thr Glu 670 675 680 685 AGT CCA ACC ACA CTT ACG TCA TTG TAGTATTGTT TGTGACCCTG AGAAGGCAAA 2599 Ser Pro Thr Thr Leu Thr Ser Leu 690 AGAAAGAACC ACTCATTGTC TTTGAGGAAG AAGATGTCCG TGAGAACATC ATTACTTATG 2659 ATGATGAAGG GGGTGGGGAA GAAGACACAG AAGCCTTTGA TATTGCCACC CTCCAGAATC 2719 CTGATGGTAT CAATGGATTT ATCCCCCGCA AAGACATCAA ACCTGAGTAT CAGTACATGC 2779 CTAGACCTGG GCTCCGGCCA GCGCCCAACA GCGTGGATGT CGATGACTTC ATCAACACGA 2839 GAATACAGGA GGCAGACAAT GACCCCACGG CTCCTCCTTA TGACTCCATT CAAATCTACG 2899 GTTATGAAGG CAGGGGCTCA GTGGCCGGGT CCCTGAGCTC CCTAGAGTCG GCCACCACAG 2959 ATTCAGACTT GGACTATGAT TATCTACAGA ACTGGGGACC TCGTTTTAAG AAACTAGCAG 3019 ATTTGTATGG TTCCAAAGAC ACTTTTGATG ACGATTCTTA ACAATAACGA TACAAATTTG 3079 GCCTTAAGAA CTGTGTCTGG CGTTCTCAAG AATCTAGAAG ATGTGTAAAC AGGTATTTTT 3139 TTAAATCAAG GAAAGGCTCA TTTAAAACAG GCAAAGTTTT ACAGAGAGGA TACATTTAAT 3199 AAAACTGCGA GGACATCAAA GTGGTAAATA CTGTGAAATA CCTTTTCTCA CAAAAAGGCA 3259 AATATTGAAG TTGTTTATCA ACTTCGCTAG AAAAAAAAAA CACTTGGCAT ACAAAATATT 3319 TAAGTGAAGG AGAAGTCTAA CGCTGAACTG ACAATGAAGG GAAATTGTTT ATGTGTTATG 3379 AACATCCAAG TCTTTCTTCT TTTTTAAGTT GTCAAAGAAG CTTCCACAAA ATTAGAAAGG 3439 ACAACAGTTC TGAGCTGTAA TTTCGCCTTA AACTCTGGAC ACTCTATATG TAGTGCATTT 3499 TTAAACTTGA AATATATAAT ATTCAGCCAG CTTAAACCCA TACAATGTAT GTACAATACA 3559 ATGTACAATT ATGTCTCTTG AGCATCAATC TTGTTACTGC TGATTCTTGT AAATCTTTTT 3619 GCTTCTACTT TCATCTTAAA CTAATACGTG CCAGATATAA CTGTCTTGTT TCAGTGAGAG 3679 ACGCCCTATT TCTATGTCAT TTTTAATGTA TCTATTTGTA CAATTTTAAA GTTCTTATTT 3739 TAGTATACAT ATAAATATCA GTATTCTGAC ATGTAAGAAA ATGTTACGGC ATCACACTTA 3799 TATTTTATGA ACATTGTACT GTTGCTTTAA TATGAGCTTC AATATAAGAA GCAATCTTTG 3859 AAATAAAAAA AGATTTTTTT TTCGGAGATC TACAGGCCTG TAGATCTCCG AATTC 3914

【００４３】配列番号：4 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一重鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 起源：なし 生物名：なし 株名：なし 配列の特徴：リンカーDNA。 配列番号5と相補的配列。
名称「ATOS-1」 配列 CTCTTGCTTG AATTCGGACT A 21

【００４４】配列番号：5 配列の長さ：25 配列の型：核酸 鎖の数：一重鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 起源：なし 生物名：なし 株名：なし 配列の特徴：リンカーDNA。配列番号4と相補的配列。名
称「ATOS-2」 配列 TAGTCCGAAT TCAAGCAAGA GCACA 25

【００４５】配列番号：6 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一重鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 起源：なし 生物名：なし 株名：なし 配列の特徴：リンカーDNA。 配列番号7と相補的配列。
名称「ATOS-4」 配列 CTCTTGCTTA AGCTTGGACT A 21

【００４６】配列番号：7 配列の長さ：25 配列の型：核酸 鎖の数：一重鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 起源：なし 生物名：なし 株名：なし 配列の特徴：リンカーDNA。配列番号6と相補的配列。名
称「ATOS-5」 配列 TAGTCCAAGC TTAAGCAAGA GCACA 25

【００４７】配列番号：8 配列の長さ：15 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：ペプチド 起源： 生物名：マウス 配列の特徴：OSF-4-1 （抗原ペプチド） 存在位置：マウスOSF-4の断片で101番目から115番目ま
で。 配列 Phe Val Ile Asp Asp Lys Ser Gly Asn Ile His Ala Thr Lys Thr 5 10 15

【図面の簡単な説明】

【図１】マウスＯＳＦ−４とヒトＯＳＦ−４−１とヒト
ＯＳＦ−４−２の各々のアミノ酸配列の比較図(alignme
nt)である。マウスとヒトのＯＳＦ−４の間で全て共通
なアミノ酸残基はコンセンサスとして示した。

【図２】図１のマウスＯＳＦ−４とヒトＯＳＦ−４−１
とヒトＯＳＦ−４−２の各々のアミノ酸配列の比較図の
続きを示す。マウスとヒトのＯＳＦ−４の間で全て共通
なアミノ酸残基はコンセンサスとして示した。

【図３】図２のマウスＯＳＦ−４とヒトＯＳＦ−４−１
とヒトＯＳＦ−４−２の各々のアミノ酸配列の比較図の
続きを示す。マウスとヒトのＯＳＦ−４の間で全て共通
なアミノ酸残基はコンセンサスとして示した。

【図４】マウスＯＳＦ−４前駆体タンパク質の構造の模
式図である。ＯＳＦ−４前駆体タンパク質は８つの領域
に分けることができ、シグナル領域（斜線部）、５つの
細胞外領域(ＥＣ１、ＥＣ２、ＥＣ３、ＥＣ４、及びＥ
Ｃ５)、細胞膜貫通領域(ＴＭ)、及び細胞内領域(ＣＰ)
である。

【図５】マウスＯＳＦ−４をコードするｃＤＮＡの制限
酵素地図である。太字はＯＳＦ−４のアミノ酸をコード
する領域を示す。ＫｐｎＩとＳａｌＩサイトは存在しな
い。

【図６】マウスＯＳＦ−４の組織特異的発現を示す図で
ある。ＲＮＡを種々の組織や細胞株から精製し、ＲＮＡ
ドットブロット法により解析したものであり、オートラ
ジオグラフィーの結果を示す。

【図７】発現ベクターｐＭＳＳ６０の模式図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｎ 9284−4Ｃ 49/00 Ａ 7252−4Ｃ Ｃ０７Ｋ 15/14 8517−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 15/12 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ 21/08 8214−4Ｂ (72)発明者 辻村 敦 京都府向日市物集女町御所海道５番地 コ ーポ春日105号 (72)発明者 アマン・エゴン 東京都世田谷区駒沢５丁目１番13号

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号１において、２５番か
   ら７９６番目までのアミノ酸配列を有するｍＯＳＦ−
   ４、配列番号２において、２５番から７９６番目までの
   アミノ酸配列を有するｈＯＳＦ−４−１、配列番号３に
   おいて、２５番から６９３番目までのアミノ酸配列を有
   するｈＯＳＦ−４−２、またはこれらのアナログ、また
   はこれらの断片よりなるタンパク質。
2. 【請求項２】 配列表の配列番号１において、１番から
   ２４番目までのシグナルペプチドを含む、１番から７９
   ６番目までのアミノ酸配列を有するｍＯＳＦ−４前駆体
   タンパク質、配列表の配列番号２において、１番から２
   ４番目までのシグナルペプチドを含む、１番から７９６
   番目までのアミノ酸配列を有するｈＯＳＦ−４−１前駆
   体タンパク質、配列表の配列番号３において、１番から
   ２４番目までのシグナルペプチドを含む、１番から６９
   ３番目までのアミノ酸配列を有するｈＯＳＦ−４−２前
   駆体タンパク質、またはこれらのアナログ、またはこれ
   らの断片よりなるタンパク質。
3. 【請求項３】 請求項１または２のタンパク質をコード
   するＤＮＡまたはＲＮＡ。
4. 【請求項４】 哺乳動物のＯＳＦ−４、またはそのアナ
   ログ、または断片である組換えタンパク質を産生させる
   方法であって、以下の手順を含む方法： (a) 以下のＤＮＡ配列より構成される異種のＤＮＡを
   含む細胞集団を得ること。 (ｉ) 当該細胞で機能しうる転写と翻訳をコントロール
   する配列。 (ii) 上記のコントロール配列の下に結合した当該組換
   えタンパク質をコードするＤＮＡ配列。 (b) 当該細胞集団を当該組換えタンパク質が産生され
   る条件下で培養すること。
5. 【請求項５】 請求項４のコントロール配列がさらに、
   当該組換えタンパク質を細胞外に分泌させるためのシグ
   ナルペプチドをコードするＤＮＡを、当該組換えタンパ
   ク質をコードするＤＮＡ配列のすぐ上流に位置するよう
   に、含むことを特徴とする産生方法。
6. 【請求項６】 細胞集団が大腸菌または酵母または哺乳
   動物細胞である請求項４または５の産生方法。
7. 【請求項７】 請求項３のＤＮＡまたはＲＮＡの全体ま
   たはその断片を含む骨代謝性疾患の診断剤。
8. 【請求項８】 請求項１のタンパク質を含む骨代謝性疾
   患の診断剤。
9. 【請求項９】 請求項１のタンパク質に対するポリクロ
   ーナル抗体及びモノクローナル抗体。
10. 【請求項１０】 請求項９の抗体を含む骨代謝性疾患の
    診断剤。
11. 【請求項１１】 請求項１のタンパク質を含む骨代謝性
    疾患の治療剤。