JP2002532685A - 活性化ビトロネクチンレセプターαVβ3をターゲティングするために有用な方法および組成物 - Google Patents
活性化ビトロネクチンレセプターαVβ3をターゲティングするために有用な方法および組成物Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、活性化αVβ3インテグリンに選択的に結合できるリガンドを提供する。多価アデノウイルスペントンベース由来の一つのαVインテグリン結合ドメインを含む新規1価リガンド模倣物(WOW-1 Fab)を提供する。更に、本発明は、活性化αVβ3インテグリンと優勢に反応する抗体のような活性化αVβ3特異的リガンドの特定の組成物を記載する。本発明はまた、組織中のαVβ3インテグリンの診断的検出のために、および活性化αVβ3インテグリンを含む組織への治療剤の標的送達のために、活性化αVβ3特異的リガンドを使用した方法も記載する。
Description
【0001】 (技術分野) 本発明は、活性化ビトロネクチンレセプターαVβ3に結合するリガンドに関
する。本発明はまた活性化αVβ3の診断的検出のために、ならびに活性化αVβ 3 におよび活性化αVβ3を含む組織に治療剤を標的送達させるために、これら
のリガンドを使用する方法に関する。
する。本発明はまた活性化αVβ3の診断的検出のために、ならびに活性化αVβ 3 におよび活性化αVβ3を含む組織に治療剤を標的送達させるために、これら
のリガンドを使用する方法に関する。
【0002】 (発明の背景) ビトロネクチンレセプターαVβ3として既知のインテグリンは、十分特徴付
けされ、内皮細胞、破骨細胞および動脈平滑筋細胞の増殖を含む種々の生物学的
過程に役割を担う。更に、血管形成、動脈再狭窄、骨リモデリング、骨粗鬆症お
よび腫瘍進行の生物学的過程に関与する。更に、当分野では、インテグリンが、
多くの発育的、生理学的および病理学的過程の間の細胞接着およびシグナル伝達
を介在することが知られている。しかし、生物学的過程におけるαVβ3の活性
化の役割は、現在十分に理解されていない。β3インテグリンファミリーは、し
ばしばフィブロネクチンレセプターとも呼ばれるαIIbβ3、およびαVβ3であ
るビトロネクチンレセプターを含む。αIIbβ3は、巨大核細胞および血小板に
限定され、フィブリノーゲンおよびフォンウィルブランド因子を含む、Arg−Gly
−Asp(RGD)−含有接着リガンドとの相互作用を介した血小板凝集に必要である。
ビトロネクチンレセプター(αVβ3インテグリン)は、より広範囲に、増殖中の
内皮細胞、動脈平滑筋細胞、破骨細胞、血小板および白血球のある集団および腫
瘍細胞に発現される。αVβ3のための同種リガンドのリストは、αIIbβ3のも
のと重複するが、オステオポンチン、マトリックスメタロプロテイナーゼ−2お
よびアデノウイルスペントンベースのような、フィブロネクチンレセプターαII b β3と相互作用しない他のものも含む。
けされ、内皮細胞、破骨細胞および動脈平滑筋細胞の増殖を含む種々の生物学的
過程に役割を担う。更に、血管形成、動脈再狭窄、骨リモデリング、骨粗鬆症お
よび腫瘍進行の生物学的過程に関与する。更に、当分野では、インテグリンが、
多くの発育的、生理学的および病理学的過程の間の細胞接着およびシグナル伝達
を介在することが知られている。しかし、生物学的過程におけるαVβ3の活性
化の役割は、現在十分に理解されていない。β3インテグリンファミリーは、し
ばしばフィブロネクチンレセプターとも呼ばれるαIIbβ3、およびαVβ3であ
るビトロネクチンレセプターを含む。αIIbβ3は、巨大核細胞および血小板に
限定され、フィブリノーゲンおよびフォンウィルブランド因子を含む、Arg−Gly
−Asp(RGD)−含有接着リガンドとの相互作用を介した血小板凝集に必要である。
ビトロネクチンレセプター(αVβ3インテグリン)は、より広範囲に、増殖中の
内皮細胞、動脈平滑筋細胞、破骨細胞、血小板および白血球のある集団および腫
瘍細胞に発現される。αVβ3のための同種リガンドのリストは、αIIbβ3のも
のと重複するが、オステオポンチン、マトリックスメタロプロテイナーゼ−2お
よびアデノウイルスペントンベースのような、フィブロネクチンレセプターαII b β3と相互作用しない他のものも含む。
【0003】 インテグリンの一つの基本的機能はリガンド結合であり、これは、多くの場合
、広範囲に“インテグリン活性化”、“インサイドアウトシグナル伝達”または
“親和性/親和力調整”と呼ばれる過程により急速に調整される。インテグリン
活性化は、少なくとも二つの事象を含む:1)αβヘテロダイマーの形態変化を
介したレセプター親和性の調整;および2)側面拡散の簡便化および/またはヘ
テロダイマーの密集を介したレセプター親和力の調整。αIIbβ3活性化の実験
は、可溶性リガンド、最も著明には、RG/YD地域をH−CDR3(重鎖の相補性決定領
域3番)に含むPAC1と呼ばれる多価、リガンド模倣抗体、およびその一価Fabフラ
グメントの使用により容易になっている(Shattil, S. J. Kashiwagi, H., and P
ampori, N. (1998) Blood 91, 2645-2657: Abrams, C., Deng, J., Steiner, B.
, and Shattil, S. J. (1994) J. Biol. Chem. 269, 18781-18788)。αVβ3の
インサイドアウトシグナル伝達、および特に親和性調整の重要性はあまり確かで
はない。αVβ3のリガンド結合機能は、通常、細胞接着アッセイにより評価さ
れ、これらは、ある細胞の活性化が、αVβ3介在接着を導くことを明らかに示
している。しかし、接着アッセイは、全体的応答に対する親和性または親和力の
厳密な寄与を不明瞭とし得る、細胞形の変化を含むリガンド結合後事象により強
く影響を受け得る。
、広範囲に“インテグリン活性化”、“インサイドアウトシグナル伝達”または
“親和性/親和力調整”と呼ばれる過程により急速に調整される。インテグリン
活性化は、少なくとも二つの事象を含む:1)αβヘテロダイマーの形態変化を
介したレセプター親和性の調整;および2)側面拡散の簡便化および/またはヘ
テロダイマーの密集を介したレセプター親和力の調整。αIIbβ3活性化の実験
は、可溶性リガンド、最も著明には、RG/YD地域をH−CDR3(重鎖の相補性決定領
域3番)に含むPAC1と呼ばれる多価、リガンド模倣抗体、およびその一価Fabフラ
グメントの使用により容易になっている(Shattil, S. J. Kashiwagi, H., and P
ampori, N. (1998) Blood 91, 2645-2657: Abrams, C., Deng, J., Steiner, B.
, and Shattil, S. J. (1994) J. Biol. Chem. 269, 18781-18788)。αVβ3の
インサイドアウトシグナル伝達、および特に親和性調整の重要性はあまり確かで
はない。αVβ3のリガンド結合機能は、通常、細胞接着アッセイにより評価さ
れ、これらは、ある細胞の活性化が、αVβ3介在接着を導くことを明らかに示
している。しかし、接着アッセイは、全体的応答に対する親和性または親和力の
厳密な寄与を不明瞭とし得る、細胞形の変化を含むリガンド結合後事象により強
く影響を受け得る。
【0004】 要約として、当分野では、αVβ3インテグリンが血管細胞における、細胞接
着、移動および増殖からアデノウイルスの取りこみまでにわたる、異なる応答を
介在することが知られている。しかし、αVβ3がレセプター形態(親和性)、レ
セプター拡散/密集(親和力)またはレセプター後事象の変化により調節されてい
る範囲は未知である。
着、移動および増殖からアデノウイルスの取りこみまでにわたる、異なる応答を
介在することが知られている。しかし、αVβ3がレセプター形態(親和性)、レ
セプター拡散/密集(親和力)またはレセプター後事象の変化により調節されてい
る範囲は未知である。
【0005】 (発明の要約) 本発明は、活性化αVβ3インテグリンに選択的に結合できるリガンドを提供
する。新規1価リガンド模倣物(WOW-1 Fab)を、PAC1 FABのH−CDR3を、単一α V インテグリン結合ドメインから、多価アデノウイルスペントンベースに変える
ことにより作った。WOW-1 Fabおよびアデノウイルスペントンベースタンパク質
は、αVβ3インテグリンの親和性調整の役割を決定するために使用した。WOW-1
Fabおよびペントンベースは、レセプターと細胞の結合アッセイで、活性化αV β3に選択的に結合するが、αIIbβ3インテグリンには結合しなかった。した
がって、本発明は、優勢に活性化αVβ3インテグリンと免疫反応する抗体のよ
うな、活性化αVβ3特異的リガンドの特定の組成物を記載する。更に、本発明
は、組織中の活性化αVβ3の診断的検出のための、および治療剤の活性化αVβ 3 含有組織への標的送達のための、活性化αVβ3特異的リガンドを使用する方
法を記載する。
する。新規1価リガンド模倣物(WOW-1 Fab)を、PAC1 FABのH−CDR3を、単一α V インテグリン結合ドメインから、多価アデノウイルスペントンベースに変える
ことにより作った。WOW-1 Fabおよびアデノウイルスペントンベースタンパク質
は、αVβ3インテグリンの親和性調整の役割を決定するために使用した。WOW-1
Fabおよびペントンベースは、レセプターと細胞の結合アッセイで、活性化αV β3に選択的に結合するが、αIIbβ3インテグリンには結合しなかった。した
がって、本発明は、優勢に活性化αVβ3インテグリンと免疫反応する抗体のよ
うな、活性化αVβ3特異的リガンドの特定の組成物を記載する。更に、本発明
は、組織中の活性化αVβ3の診断的検出のための、および治療剤の活性化αVβ 3 含有組織への標的送達のための、活性化αVβ3特異的リガンドを使用する方
法を記載する。
【0006】 (図面の簡単な説明) 図1:可溶性Alexa−ペントンベースおよびWOW-1 Fabの、αVβ3を発現する細
胞への結合。 パネルAにおいて、実験法に記載のように、αVβ3細胞または親CHO細胞を、
αVβ3(LM609)、αIIbβ3(D57)またはαVβ3(P1F6)に特異的な一次抗体とイ
ンキュベートし、抗体結合をFITC−標識2次抗体で検出した。2次抗体で染色さ
れた細胞のみをネガティブコントロールとして使用した。比較のために、親CHO
細胞に結合する抗体も実験した。パネルBにおいて、αVβ3−CHO細胞を、75n
M Alexa−ペントンベース(aPB)または106nm WOW-1 Fabと30分、室温で、
活性化αVβ3のための1:50希釈のAP5腹水の、または特異的リガンド結合阻
害のための5mM EDTAの非存在下または存在下でインキュベートした。aPBとWOW
-1 Fabの結合を、実験法に記載のようなフローサイトメトリーで測定した。デ
ータは、EDTAにより阻害されるものとして定義される特異的リガンド結合を示し
、3つの独立した実験の平均±SEMとして示す。同様の結果が、αVβ3を、AP5
腹水の代わりに他の活性化抗体(LIBS6)の精製Fabフラグメントで刺激した場合に
得られた。アスタリスクは、リガンド結合が、AP5の非存在下よりも存在下で有
意に大きいことを示す(p<0.01)。
胞への結合。 パネルAにおいて、実験法に記載のように、αVβ3細胞または親CHO細胞を、
αVβ3(LM609)、αIIbβ3(D57)またはαVβ3(P1F6)に特異的な一次抗体とイ
ンキュベートし、抗体結合をFITC−標識2次抗体で検出した。2次抗体で染色さ
れた細胞のみをネガティブコントロールとして使用した。比較のために、親CHO
細胞に結合する抗体も実験した。パネルBにおいて、αVβ3−CHO細胞を、75n
M Alexa−ペントンベース(aPB)または106nm WOW-1 Fabと30分、室温で、
活性化αVβ3のための1:50希釈のAP5腹水の、または特異的リガンド結合阻
害のための5mM EDTAの非存在下または存在下でインキュベートした。aPBとWOW
-1 Fabの結合を、実験法に記載のようなフローサイトメトリーで測定した。デ
ータは、EDTAにより阻害されるものとして定義される特異的リガンド結合を示し
、3つの独立した実験の平均±SEMとして示す。同様の結果が、αVβ3を、AP5
腹水の代わりに他の活性化抗体(LIBS6)の精製Fabフラグメントで刺激した場合に
得られた。アスタリスクは、リガンド結合が、AP5の非存在下よりも存在下で有
意に大きいことを示す(p<0.01)。
【0007】 図2:aPBおよびWOW-1 FabのαVβ3−CHO細胞への結合におけるインテグリン
阻害剤の効果。 リガンド結合を、図1のように、AP5腹水(1:50)およびインテグリン阻害
剤の存在下で示すように行った。EDTAは5mM、RGDS 2mM、cRGDfV 50μMお
よびインテグリン 1μMであった。データを、阻害剤の非存在下のAP5−処置サ
ンプルの値の割合としてプロットし、3つの実験の平均±SEMとして示す。
阻害剤の効果。 リガンド結合を、図1のように、AP5腹水(1:50)およびインテグリン阻害
剤の存在下で示すように行った。EDTAは5mM、RGDS 2mM、cRGDfV 50μMお
よびインテグリン 1μMであった。データを、阻害剤の非存在下のAP5−処置サ
ンプルの値の割合としてプロットし、3つの実験の平均±SEMとして示す。
【0008】 図3:αVβ3は、インサイドアウトシグナルによる親和性調整に感受性である
。 パネルAにおいて、JYリンパ芽球状細胞を、75nM aPBまたは425nM WOW-
1 Fabの存在下で、15分、アゴニストなし(Txなし)で、100nMホルボールミ
リステートアセテート(PMA)と、またはホルボールミリステートアセテート+AP5
腹水(1:50)の存在下でインキュベートした。次いで、特異的リガンド結合を
、フローサイトメトリーにより測定した。データは3つの実験の平均±SEMであ
る。アスタリスクはTxなしのサンプルと比較した有意差を意味する(P<0.05)
。パネルBにおいて、WOW-1のJY細胞への結合を、Fab濃度の範囲にわたり試験し
た。データを特異的(RGDS阻害可能)結合としてプロットし、シグナル部位への結
合に関して非直線回帰分析に付した。見かけの値はKdであり、最大結合を表1に
示す。曲線は、コンピューターで作ったデータの最良の適合である。適合度(R2 )は、0.94−1.00の範囲である。
。 パネルAにおいて、JYリンパ芽球状細胞を、75nM aPBまたは425nM WOW-
1 Fabの存在下で、15分、アゴニストなし(Txなし)で、100nMホルボールミ
リステートアセテート(PMA)と、またはホルボールミリステートアセテート+AP5
腹水(1:50)の存在下でインキュベートした。次いで、特異的リガンド結合を
、フローサイトメトリーにより測定した。データは3つの実験の平均±SEMであ
る。アスタリスクはTxなしのサンプルと比較した有意差を意味する(P<0.05)
。パネルBにおいて、WOW-1のJY細胞への結合を、Fab濃度の範囲にわたり試験し
た。データを特異的(RGDS阻害可能)結合としてプロットし、シグナル部位への結
合に関して非直線回帰分析に付した。見かけの値はKdであり、最大結合を表1に
示す。曲線は、コンピューターで作ったデータの最良の適合である。適合度(R2 )は、0.94−1.00の範囲である。
【0009】 図4:αVβ3−CHO細胞およびαVβ3-M21-Lメラノーマ細胞へのaPB結合の比較
。 aPB(75nM)の各細胞系への結合を、図1のレジェンドに記載のように行った
。特異的aPB結合は、SSA6結合の平均蛍光強度(mfi)で割ったapBのmfiとして、レ
セプターベース当りで示す。各棒は、4つの実験の平均±SEMで示す。1個また
は2個のアスタリスクは、CHO細胞とメラノーマ細胞の間の差に関して、P値が各
々<0.01および<0.05であることを示す。
。 aPB(75nM)の各細胞系への結合を、図1のレジェンドに記載のように行った
。特異的aPB結合は、SSA6結合の平均蛍光強度(mfi)で割ったapBのmfiとして、レ
セプターベース当りで示す。各棒は、4つの実験の平均±SEMで示す。1個また
は2個のアスタリスクは、CHO細胞とメラノーマ細胞の間の差に関して、P値が各
々<0.01および<0.05であることを示す。
【0010】 図5:ペントンベースのαVβ3への結合におけるβ3インテグリン細胞質テイ
ルにおける変異の活性化の効果。 パネルAにおいて、αVβ3またはαVβ3(D723R)のいずれかを発現する安定CH
O細胞系を、抗−β3抗体SSA6およびフィコエリスリン−ストレプトアビジンで
染色し、αVβ3の表面発現を評価した。パネルBにおいて、aPB(75nM)の特異
的結合を図1のレジェンドに記載のように実験した。aPB結合をレセプターベー
ス当りで示す。データは4つの実験の平均±SEMで示す。アスタリスクは、αVβ 3 とαVβ3(D723R)の間の差が、P<0.01レベルであることを意味する。比
較のために、AP5−処理αVβ3CHO細胞のへのaPBの対応する値は、0.034±
0.002であった。
ルにおける変異の活性化の効果。 パネルAにおいて、αVβ3またはαVβ3(D723R)のいずれかを発現する安定CH
O細胞系を、抗−β3抗体SSA6およびフィコエリスリン−ストレプトアビジンで
染色し、αVβ3の表面発現を評価した。パネルBにおいて、aPB(75nM)の特異
的結合を図1のレジェンドに記載のように実験した。aPB結合をレセプターベー
ス当りで示す。データは4つの実験の平均±SEMで示す。アスタリスクは、αVβ 3 とαVβ3(D723R)の間の差が、P<0.01レベルであることを意味する。比
較のために、AP5−処理αVβ3CHO細胞のへのaPBの対応する値は、0.034±
0.002であった。
【0011】 図6:αVβ3を発現するCS-1メラノーマに結合するリガンドにおける単離イン
テグリン細胞質テイルの過発現の効果。 下記実施例に示すように、αVβ3−CS-1細胞を、Tac−α5、Tac−β1また
はTac−β3キメラで一過性にトランスフェクトした。トランスフェクション4
8時間後、細胞を30分、室温で(A)150nM aPBまたは(B)425nM WOW-1
Fabと、5mM EDTAの存在下または非存在下でインキュベートした。細胞を抗Tac
抗体およびフィコエリスリン接合抗マウスIgGで染色し、Tac発現細胞の生存ゲー
トを設定し、aPBおよびWOW-1 Fabの特異的結合をフローサイトメトリーにより
測定した。パネルCは、抗―β3抗体であるSSA6でモニターして、Tac構築物がα V β3の発現レベルに作用しないことを示す。データは3つの実験の平均±SEMで
示す。アスタリスクは、Tac−β1またはTac−β3の存在下でのリガンド結合が
Tac−α5とよりも有意に低いことを示した(P<0.01)。
テグリン細胞質テイルの過発現の効果。 下記実施例に示すように、αVβ3−CS-1細胞を、Tac−α5、Tac−β1また
はTac−β3キメラで一過性にトランスフェクトした。トランスフェクション4
8時間後、細胞を30分、室温で(A)150nM aPBまたは(B)425nM WOW-1
Fabと、5mM EDTAの存在下または非存在下でインキュベートした。細胞を抗Tac
抗体およびフィコエリスリン接合抗マウスIgGで染色し、Tac発現細胞の生存ゲー
トを設定し、aPBおよびWOW-1 Fabの特異的結合をフローサイトメトリーにより
測定した。パネルCは、抗―β3抗体であるSSA6でモニターして、Tac構築物がα V β3の発現レベルに作用しないことを示す。データは3つの実験の平均±SEMで
示す。アスタリスクは、Tac−β1またはTac−β3の存在下でのリガンド結合が
Tac−α5とよりも有意に低いことを示した(P<0.01)。
【0012】 図7:αVβ3−CHO細胞のペントンベースへの接着におけるαVβ3活性化の効
果。 下記実施例に示すように、マイクロタイターウェルをペントンベースでコート
し、αVβ3−CHO細胞の接着を、90分、37℃で、添加剤なし(白丸)、AP5腹
水(1:50、黒丸)またはMnCl2(0.25mM、黒三角)で実験した。一定量をま
た50μM cRGDfVと、これらの各々の条件下(白四角、十字、およびアスタリス
ク)でインキュベートし、細胞接着がαVインテグリンの存在に依存するかを評価
した。本実験はこのように行った3つの代表である。
果。 下記実施例に示すように、マイクロタイターウェルをペントンベースでコート
し、αVβ3−CHO細胞の接着を、90分、37℃で、添加剤なし(白丸)、AP5腹
水(1:50、黒丸)またはMnCl2(0.25mM、黒三角)で実験した。一定量をま
た50μM cRGDfVと、これらの各々の条件下(白四角、十字、およびアスタリス
ク)でインキュベートし、細胞接着がαVインテグリンの存在に依存するかを評価
した。本実験はこのように行った3つの代表である。
【0013】 図8:アデノウイルス介在遺伝子送達におけるαVβ3発現および活性化の効果
。 パネルAにおいて、親CS-1細胞(αVβ3なし)およびαVβ3−CS-1細胞を、1
時間、50または500の感染効率でGFPをコードするアデノウイルスと、イン
キュベートした。加えて、一定量のαVβ3−CS-1細胞を2.5mM MnCl2存在下
でウイルスとインキュベートし、最大インテグリン活性化を誘導させた。ウイル
ス感染および遺伝子送達を、フローサイトメトリーによるGFPの定量的細胞性発
現により72時間後に評価した。パネルAは一つの実験を示し、パネルBは50の
m.o.i.で行った3つの実験の平均±SEMを示す。パネルBの4番目の棒(左から)は
、1.7μM WOW-1 Fabとウイルスの添加前に20分プレインキュベートしたα V β3−CS-1細胞の効果を示す。
。 パネルAにおいて、親CS-1細胞(αVβ3なし)およびαVβ3−CS-1細胞を、1
時間、50または500の感染効率でGFPをコードするアデノウイルスと、イン
キュベートした。加えて、一定量のαVβ3−CS-1細胞を2.5mM MnCl2存在下
でウイルスとインキュベートし、最大インテグリン活性化を誘導させた。ウイル
ス感染および遺伝子送達を、フローサイトメトリーによるGFPの定量的細胞性発
現により72時間後に評価した。パネルAは一つの実験を示し、パネルBは50の
m.o.i.で行った3つの実験の平均±SEMを示す。パネルBの4番目の棒(左から)は
、1.7μM WOW-1 Fabとウイルスの添加前に20分プレインキュベートしたα V β3−CS-1細胞の効果を示す。
【0014】 (発明の詳細な説明) 本発明は、活性化αVβ3インテグリンに選択的に結合できるリガンドを提供
する。これらの活性化αVβ3特異的リガンドは、本発明に記載の方法および組
成物で特に有用である。活性化αVβ3を特異的に検出し、相互作用する能力は
、本発明が成されるまで利用可能ではなく、本発明のリガンドを使用することに
より、ビトロネクチンαVβ3がある生物学的条件下で活性化状態あり、それが
、診断的および治療的目的に、特に、ある組織への治療的薬剤のターゲティング
に有用であり得ることが判明した。
する。これらの活性化αVβ3特異的リガンドは、本発明に記載の方法および組
成物で特に有用である。活性化αVβ3を特異的に検出し、相互作用する能力は
、本発明が成されるまで利用可能ではなく、本発明のリガンドを使用することに
より、ビトロネクチンαVβ3がある生物学的条件下で活性化状態あり、それが
、診断的および治療的目的に、特に、ある組織への治療的薬剤のターゲティング
に有用であり得ることが判明した。
【0015】 αVβ3の親和性調整の役割を決定するために、新規1価リガンド模倣物(WOW-
1)を、FAC1 FabのH−CDR3を多価アデノウイルスペントンベース由来の一つの
αVインテグリン結合ドメインで置換することにより作った。WOW-1およびペント
ンベースの両方とも、レセプターと細胞の結合アッセイで、活性化αVβ3に選
択的に結合するが、αIIbβ3インテグリンには結合しなかった。したがって、
本発明は、優勢に活性化αVβ3インテグリンと免疫反応する抗体のような、活
性化αVβ3特異的リガンドの特定の組成物を記載する。更に、本発明の他の態
様において、組織中の活性化αVβ3の診断的検出のための、および治療剤の活
性化αVβ3含有組織への標的送達のための、活性化αVβ3特異的リガンドを使
用する方法を記載する。
1)を、FAC1 FabのH−CDR3を多価アデノウイルスペントンベース由来の一つの
αVインテグリン結合ドメインで置換することにより作った。WOW-1およびペント
ンベースの両方とも、レセプターと細胞の結合アッセイで、活性化αVβ3に選
択的に結合するが、αIIbβ3インテグリンには結合しなかった。したがって、
本発明は、優勢に活性化αVβ3インテグリンと免疫反応する抗体のような、活
性化αVβ3特異的リガンドの特定の組成物を記載する。更に、本発明の他の態
様において、組織中の活性化αVβ3の診断的検出のための、および治療剤の活
性化αVβ3含有組織への標的送達のための、活性化αVβ3特異的リガンドを使
用する方法を記載する。
【0016】 本発明の一つの態様は、αVβ3が親和性調整の対象となるか、そして、もし
なれば、このような調節の可能性のある異常生理学的関係を調査する。この課題
を達成するために、数種の細胞型におけるαVβ3に対する可溶性1価および多
価リガンドを特徴付けし、その理由は、1価リガンドが親和性調整に感受性であ
り、多価リガンドが親和性および親和力調整の両方に感受性であるからである。
アデノウイルスタイプ2からのコートタンパク質であるペントンベースを、その
5つのサブユニットが、αVインテグリンを介したウイルス内在化を介在する5
0アミノ酸RGD領域を含むため、多価リガンドとして選択した。PAC1 FabのH−C
DR3をペントンベースの一つの印テグRに結合ドメインで置換することにより作っ
た新規WOW-1 Fabは、PAC1のH−CDR3置換が、Fabの選択性を活性化αIIbβ3か
らαVβ3インテグリンに切換え、それによりαVβ3親和性状態の直接の評価が
可能となるため、1価リガンドとして使用できる。このように、得られる1価Fa
b、WOW-1はPAC1抗体およびペントンベースタンパク質の活性化依存性特性を保持
し、αVβ3インテグリンと相互作用するが、αIIbβ3インテグリンとはしない
。αVβ3インテグリンを実験するためにWOW-1 Fabをを使用して、αVβ3イン
テグリン機能に関する数個の結論に達する:αVβ3の規定の親和性状態は細胞
型で変わり、リンパ細胞で非常に低く、メラノーマ細胞系で高い。更に、αVβ
3は、プロテインキナーゼの顆粒のものを含むインサイドアウトシグナルにより
急速親和性調整に付される。αVβ3親和性を調節する幾つかの細胞性シグナル
はインテグリンの細胞質テイルに集まる。親和性調整は、αVβ3の細胞質テイ
ルおよびシグナル伝達機能の両方で、およびアデノウイルス介在遺伝子移入で直
接機能因果関係を有する。このように、本発明は、αVβ3が親和性調節に付さ
れ、αVβ3の固定依存的機能およびαVβ3を発現する細胞への遺伝子送達と、
特に、アデノウイルス介在遺伝子送達と直接関係を有する。
なれば、このような調節の可能性のある異常生理学的関係を調査する。この課題
を達成するために、数種の細胞型におけるαVβ3に対する可溶性1価および多
価リガンドを特徴付けし、その理由は、1価リガンドが親和性調整に感受性であ
り、多価リガンドが親和性および親和力調整の両方に感受性であるからである。
アデノウイルスタイプ2からのコートタンパク質であるペントンベースを、その
5つのサブユニットが、αVインテグリンを介したウイルス内在化を介在する5
0アミノ酸RGD領域を含むため、多価リガンドとして選択した。PAC1 FabのH−C
DR3をペントンベースの一つの印テグRに結合ドメインで置換することにより作っ
た新規WOW-1 Fabは、PAC1のH−CDR3置換が、Fabの選択性を活性化αIIbβ3か
らαVβ3インテグリンに切換え、それによりαVβ3親和性状態の直接の評価が
可能となるため、1価リガンドとして使用できる。このように、得られる1価Fa
b、WOW-1はPAC1抗体およびペントンベースタンパク質の活性化依存性特性を保持
し、αVβ3インテグリンと相互作用するが、αIIbβ3インテグリンとはしない
。αVβ3インテグリンを実験するためにWOW-1 Fabをを使用して、αVβ3イン
テグリン機能に関する数個の結論に達する:αVβ3の規定の親和性状態は細胞
型で変わり、リンパ細胞で非常に低く、メラノーマ細胞系で高い。更に、αVβ
3は、プロテインキナーゼの顆粒のものを含むインサイドアウトシグナルにより
急速親和性調整に付される。αVβ3親和性を調節する幾つかの細胞性シグナル
はインテグリンの細胞質テイルに集まる。親和性調整は、αVβ3の細胞質テイ
ルおよびシグナル伝達機能の両方で、およびアデノウイルス介在遺伝子移入で直
接機能因果関係を有する。このように、本発明は、αVβ3が親和性調節に付さ
れ、αVβ3の固定依存的機能およびαVβ3を発現する細胞への遺伝子送達と、
特に、アデノウイルス介在遺伝子送達と直接関係を有する。
【0017】 本発明は、αVβ3親和性が細胞型で変化することを証明する。非刺激Bリンパ
芽球状細胞はWOW-1 Fabに殆ど結合しないが(見かけのKd=2.4μM)、ホルボー
ルミリステートアセテートでの急性刺激は、レセプター数を変化させずに、レセ
プター親和性を>30倍増加させる(Kd=80nM)ことを証明する。対照的に、メ
ラノーマ細胞におけるαVβ3は、構造的に活性であるが、リガンド結合がβ3
細胞質テイルの過発現により抑制できる。αVβ3親和性の上方調節は、細胞接
着を増加させ、アデノウイルス介在遺伝子移入を拡散および促進させるという点
で、機能的関係を有する。本発明は、したがって、このインテグリンの生物学的
機能に影響する親和性のαVβ3が急速な調節された変化に付されることを確立
する。
芽球状細胞はWOW-1 Fabに殆ど結合しないが(見かけのKd=2.4μM)、ホルボー
ルミリステートアセテートでの急性刺激は、レセプター数を変化させずに、レセ
プター親和性を>30倍増加させる(Kd=80nM)ことを証明する。対照的に、メ
ラノーマ細胞におけるαVβ3は、構造的に活性であるが、リガンド結合がβ3
細胞質テイルの過発現により抑制できる。αVβ3親和性の上方調節は、細胞接
着を増加させ、アデノウイルス介在遺伝子移入を拡散および促進させるという点
で、機能的関係を有する。本発明は、したがって、このインテグリンの生物学的
機能に影響する親和性のαVβ3が急速な調節された変化に付されることを確立
する。
【0018】 本発明は、一つの態様において活性化αVβ3特異的リガンド組成物、また活
性化αVβ3に優勢に結合するリガンドとも呼ばれるが、を記載する。特異性の
程度は変化し得るが、典型的には、活性化αVβ3への結合定数が、血小板レセ
プターαIIbβ3のような他のインテグリンのような他の標的へのものより大き
く、好ましくは2から1000倍大きく、より好ましくは100から1000倍
大きいとき、リガンドは優勢に結合する。結合活性は当分野で既知であり、種々
の方法で測定できる。
性化αVβ3に優勢に結合するリガンドとも呼ばれるが、を記載する。特異性の
程度は変化し得るが、典型的には、活性化αVβ3への結合定数が、血小板レセ
プターαIIbβ3のような他のインテグリンのような他の標的へのものより大き
く、好ましくは2から1000倍大きく、より好ましくは100から1000倍
大きいとき、リガンドは優勢に結合する。結合活性は当分野で既知であり、種々
の方法で測定できる。
【0019】 好ましい活性化αVβ3特異的リガンドは単離形のアデノウイルス−2ペント
ンベースタンパク質、αVβ3に結合するペントンベースタンパク質のフラグメ
ント、または活性化αVβ3と優勢に免疫反応する抗体である。アデノウイルス
−2由来のペントンベース(PB)タンパク質は既知であり、下記に記載の方法を含
む種々の方法で製造できる。加えて、抗体は当分野で既知であり、Fab、Av、一
本鎖Fv(scFv)、Fdおよび、当分野で既知のように相補性決定領域(CDR)により定
義される抗体の抗原結合部位部分を含む同様のフラグメントのような、ポリクロ
ーナルまたはモノクローナル抗体またはそれらの機能的フラクションを含み得る
。
ンベースタンパク質、αVβ3に結合するペントンベースタンパク質のフラグメ
ント、または活性化αVβ3と優勢に免疫反応する抗体である。アデノウイルス
−2由来のペントンベース(PB)タンパク質は既知であり、下記に記載の方法を含
む種々の方法で製造できる。加えて、抗体は当分野で既知であり、Fab、Av、一
本鎖Fv(scFv)、Fdおよび、当分野で既知のように相補性決定領域(CDR)により定
義される抗体の抗原結合部位部分を含む同様のフラグメントのような、ポリクロ
ーナルまたはモノクローナル抗体またはそれらの機能的フラクションを含み得る
。
【0020】 活性化αVβ3と免疫反応する抗体は種々の方法で製造でき、したがって、本
発明は、それで限定する必要はない。典型的に、所望の抗原標的を含む免疫原、
この場合、活性化αVβ3を含むサンプルを使用する。免疫化に続き、得られる
抗体を、活性化αVβ3インテグリンと免疫反応する抗体を同定するためのスク
リーニングアッセイを使用して単離できる。好ましい抗体は、下記のように製造
したWOW-1抗体である。
発明は、それで限定する必要はない。典型的に、所望の抗原標的を含む免疫原、
この場合、活性化αVβ3を含むサンプルを使用する。免疫化に続き、得られる
抗体を、活性化αVβ3インテグリンと免疫反応する抗体を同定するためのスク
リーニングアッセイを使用して単離できる。好ましい抗体は、下記のように製造
したWOW-1抗体である。
【0021】 特異的に、活性化αVβ3と免疫反応する抗体を、Fab抗体から組換え核酸法を
使用して製造する。抗体を、アデノウイルス−2ペントンベースタンパク質の5
0アミノ酸ストレッチを、PAC1抗体をコードするクローン化遺伝子のCDR3部分に
置換することにより製造する。PAC1抗体は、血小板糖タンパク質レセプターと免
疫反応する十分特徴付けされ、既知のモノクローナル抗体である。修飾PAC1抗体
(WOW-1と命名)を次いでショウジョウバエの発現系において、His−Tagを含む融
合タンパク質として発現させ、ショウジョウバエ培養培地から、固定化ニッケル
クロマトグラフィーを使用して精製する。
使用して製造する。抗体を、アデノウイルス−2ペントンベースタンパク質の5
0アミノ酸ストレッチを、PAC1抗体をコードするクローン化遺伝子のCDR3部分に
置換することにより製造する。PAC1抗体は、血小板糖タンパク質レセプターと免
疫反応する十分特徴付けされ、既知のモノクローナル抗体である。修飾PAC1抗体
(WOW-1と命名)を次いでショウジョウバエの発現系において、His−Tagを含む融
合タンパク質として発現させ、ショウジョウバエ培養培地から、固定化ニッケル
クロマトグラフィーを使用して精製する。
【0022】 特異的に、WOW-1 Fab抗体は以下のように製造する。オリゴヌクレオチド
【化1】 および
【化2】 を、ペントンベースの50アミノ酸で代表されるアデノウイルス−2DNAからのP
CR増幅配列として使用する。得られたDNAフラグメントを使用して、PAC1のFdの
形のCDR3部分を、
CR増幅配列として使用する。得られたDNAフラグメントを使用して、PAC1のFdの
形のCDR3部分を、
【化3】 および
【化4】 を、Bgl2およびAge1部位を各々添加しながら使用したオーバーラップPCRにより
、置換した。この接木した“WOW-1”のFd DNAフラグメントをBgl2/Age1消化し
、ショウジョウバエメタロチオニン(MT)プロモーターおよびBip分泌シグナルを
含むショウジョウバエ発現ベクター、pMT/Bip/V5-His B(Invitrogen, Carlsbad,
CA)にクローン化する。同様に、Pac1−k軽鎖を
、置換した。この接木した“WOW-1”のFd DNAフラグメントをBgl2/Age1消化し
、ショウジョウバエメタロチオニン(MT)プロモーターおよびBip分泌シグナルを
含むショウジョウバエ発現ベクター、pMT/Bip/V5-His B(Invitrogen, Carlsbad,
CA)にクローン化する。同様に、Pac1−k軽鎖を
【化5】 および
【化6】 を使用して、Nco1およびAge1部位を添加し、続いてpMT/BiP/V5-His Bベ急ター
のNco1/Age1部位にクローン化することにより調整した。
のNco1/Age1部位にクローン化することにより調整した。
【0023】 リン酸カルシウムトランスフェクション法を使用して、WOW-1のクローン化重
鎖および軽鎖の各々の19μgを1μgの選択ベクターpCoHYGRO(Invitrogen, Car
lsbad, CA)と、キイロショウジョウバエ、Schneider 2(S2)細胞の3ml培養に、
1×106細胞/mlで共トランスフェクトした。安定な細胞系をヒグロマイシン
Bの存在下で選択した。500μM濃度の硫酸銅を使用してメタロチオニンプロモ
ーターを誘導させ、分泌したWOW-1 Fab(His−Tagを含む)をNi−NTAカラムクロ
マトグラフィー(Quiagen, CA)を使用して、直接培地から精製した。得られる抗
体はFab WOW-1と命名し、活性化αVβ3と優勢に免疫反応する。Fab WOW-1の
特異性を証明するのに適した例示的結合アッセイは、下記実施例4に記載する。
鎖および軽鎖の各々の19μgを1μgの選択ベクターpCoHYGRO(Invitrogen, Car
lsbad, CA)と、キイロショウジョウバエ、Schneider 2(S2)細胞の3ml培養に、
1×106細胞/mlで共トランスフェクトした。安定な細胞系をヒグロマイシン
Bの存在下で選択した。500μM濃度の硫酸銅を使用してメタロチオニンプロモ
ーターを誘導させ、分泌したWOW-1 Fab(His−Tagを含む)をNi−NTAカラムクロ
マトグラフィー(Quiagen, CA)を使用して、直接培地から精製した。得られる抗
体はFab WOW-1と命名し、活性化αVβ3と優勢に免疫反応する。Fab WOW-1の
特異性を証明するのに適した例示的結合アッセイは、下記実施例4に記載する。
【0024】 得られるWOW-1 Fab抗体の重鎖および軽鎖の両方についてのヌクレオチドおよ
びアミノ酸残基配列は、下記実施例1に示す。一つの態様において、好ましい抗
体は実施例1に示すアミノ酸残基を含む。より好ましくは、抗体は実施例1に記
載するFab WOW-1である。
びアミノ酸残基配列は、下記実施例1に示す。一つの態様において、好ましい抗
体は実施例1に示すアミノ酸残基を含む。より好ましくは、抗体は実施例1に記
載するFab WOW-1である。
【0025】 他の態様において、本発明は、本発明の活性化特異的αVβ3リガンドを使用
した、組織内の活性化αVβ3の検出法を記載する。αVβ3が存在し、重要な生
物学的役割を担い、したがって活性化αVβ3の検出を成すことが有用な診断的
ツールである、種々の組織および生物学的状態がある。本発明は、生物学的過程
における活性化αVβ3の役割に関する発見が続いているため、任意の特定の組
織または状態に限定する必要はない。
した、組織内の活性化αVβ3の検出法を記載する。αVβ3が存在し、重要な生
物学的役割を担い、したがって活性化αVβ3の検出を成すことが有用な診断的
ツールである、種々の組織および生物学的状態がある。本発明は、生物学的過程
における活性化αVβ3の役割に関する発見が続いているため、任意の特定の組
織または状態に限定する必要はない。
【0026】 例えば、αVβ3が関与する過程は、ビトロネクチンレセプターαVβ3により
介在される内皮細胞成長、特に血管形成を含み、種々の疾患過程で重要な役割を
担う。血管形成中の活性化αVβ3の組織分布のモニターにより、疾患の進行、
疾患への介入、症状の緩解およびある場合、疾患の治癒をモニターできる。した
がって、診断的過程は、治療的処置を支持できる。
介在される内皮細胞成長、特に血管形成を含み、種々の疾患過程で重要な役割を
担う。血管形成中の活性化αVβ3の組織分布のモニターにより、疾患の進行、
疾患への介入、症状の緩解およびある場合、疾患の治癒をモニターできる。した
がって、診断的過程は、治療的処置を支持できる。
【0027】 新規血管の成長が、疾患に関与する病因を引き起こすか、または病因の一因で
ある場合、活性化αVβ3の検出は疾患の進行および処置の重大な情報の収集を
可能にする。例は艦列リウマチ、糖尿病性網膜症、炎症性疾患、再狭窄を含む。
新規血管の成長は、有害な組織の成長の支持に必要であり、したがって、更なる
疾患の例は、腫瘍が厚さで数ミリを超えて成長し、固体腫瘍転移を確立するため
に、新血管新生が継続的に必要である、腫瘍の成長を含む。
ある場合、活性化αVβ3の検出は疾患の進行および処置の重大な情報の収集を
可能にする。例は艦列リウマチ、糖尿病性網膜症、炎症性疾患、再狭窄を含む。
新規血管の成長は、有害な組織の成長の支持に必要であり、したがって、更なる
疾患の例は、腫瘍が厚さで数ミリを超えて成長し、固体腫瘍転移を確立するため
に、新血管新生が継続的に必要である、腫瘍の成長を含む。
【0028】 αVβ3が関与する例示的疾患は、米国特許第5,753,230号に詳述され
、その記載を本明細書に引用して包含させる。
、その記載を本明細書に引用して包含させる。
【0029】 診断法は、典型的に (a)本発明のリガンドとαVβ3を含む組織を混合し、結合反応混合物を形成さ
せる; (b)混合物を、リガンドがαVβ3に結合し、リガンド−αVβ3複合体を形成す
るのに十分な、結合反応と一致した時間、温度および生理学的環境パラメーター
を含む条件下に維持する;そして (c)リガンド−αVβ3複合体の存在を、そしてそれにより組織に存在するαVβ
3を測定する ことにより実施される。
せる; (b)混合物を、リガンドがαVβ3に結合し、リガンド−αVβ3複合体を形成す
るのに十分な、結合反応と一致した時間、温度および生理学的環境パラメーター
を含む条件下に維持する;そして (c)リガンド−αVβ3複合体の存在を、そしてそれにより組織に存在するαVβ
3を測定する ことにより実施される。
【0030】 本方法はインビトロまたはインビボで実施でき、診断分野でこのような変法は
既知である。加えて、リガンドを種々の方法により標識できる。例示的ラベルお
よびアッセイ法は、下記実施例に記載する。
既知である。加えて、リガンドを種々の方法により標識できる。例示的ラベルお
よびアッセイ法は、下記実施例に記載する。
【0031】 好ましい方法において、活性化特異的αVβ3は、アデノウイルス−2ペント
ンベース、活性化αVβ3に結合するペントンベースのフラグメント、および活
性化αVβ3と免疫反応する抗体からなる群から選択する。好ましくは、リガン
ドはFab抗体WOW-1である。
ンベース、活性化αVβ3に結合するペントンベースのフラグメント、および活
性化αVβ3と免疫反応する抗体からなる群から選択する。好ましくは、リガン
ドはFab抗体WOW-1である。
【0032】 (治療剤の送達法) 他の態様において、本発明は、組織における生物学的調整修飾を行う目的で、
治療組成物中の薬剤を活性化ビトロネクチンレセプターαVβ3を含む組織へ送
達するための活性化特異的αVβ3リガンドの使用を記載する。本方法は: (a)αVβ3含有組織を、有効量の活性化αVβ3と結合するリガンドを含む治療
組成物と接触させ、ここでリガンドは薬剤に機能可能に結合しており、薬剤は治
療的活性を有する; (b)リガンドが組織中に存在する活性化αVβ3と結合するのに十分な条件下で、
該治療組成物の組織との接触を維持させ、それにより薬剤を組織に送達させる 段階を含む。
治療組成物中の薬剤を活性化ビトロネクチンレセプターαVβ3を含む組織へ送
達するための活性化特異的αVβ3リガンドの使用を記載する。本方法は: (a)αVβ3含有組織を、有効量の活性化αVβ3と結合するリガンドを含む治療
組成物と接触させ、ここでリガンドは薬剤に機能可能に結合しており、薬剤は治
療的活性を有する; (b)リガンドが組織中に存在する活性化αVβ3と結合するのに十分な条件下で、
該治療組成物の組織との接触を維持させ、それにより薬剤を組織に送達させる 段階を含む。
【0033】 本発明は、既知のように、組成物を処置する組織を含む患者の身体に投与する
ことにより、または組織を含む組織または臓器を提示させ、エキソビボ法で生物
と接触させることにより、組織が治療組成物と接触するようにインビボまたはエ
キソビボで実施し得る。
ことにより、または組織を含む組織または臓器を提示させ、エキソビボ法で生物
と接触させることにより、組織が治療組成物と接触するようにインビボまたはエ
キソビボで実施し得る。
【0034】 薬剤は、治療性質の生物学応答に最終的に作用する種々の種類の物質であり得
、したがって、本発明はこの点で限定する意図はない。例示的薬剤は、共役医薬
、毒素、生物学的活性ペプチドまたはタンパク質、ホルモン、および類似化合物
、アンチセンス分子として作用し得るような核酸、リボザイムのような触媒的核
酸分子として、または遺伝子移入に作用し得るような核酸等のような、任意の生
物学的活性化合物である。このような方法および組成物は一般に当分野で既知で
あり、したがって、本発明はそれで限定される必要なない。
、したがって、本発明はこの点で限定する意図はない。例示的薬剤は、共役医薬
、毒素、生物学的活性ペプチドまたはタンパク質、ホルモン、および類似化合物
、アンチセンス分子として作用し得るような核酸、リボザイムのような触媒的核
酸分子として、または遺伝子移入に作用し得るような核酸等のような、任意の生
物学的活性化合物である。このような方法および組成物は一般に当分野で既知で
あり、したがって、本発明はそれで限定される必要なない。
【0035】 一つの態様において、本発明は、活性化ビトロネクチンレセプターαVβ3を
含む組織への遺伝子送達のための活性化特異的αVβ3リガンドの使用を記載す
る。遺伝子送達または遺伝子移入媒体は、活性化特異的αVβ3リガンドを含む
ように修飾されているウイルス表面タンパク質を有する、例えば、アデノウイル
ス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびヘルペスウイ
ルスのようなウイルス由来であり得る。あるいは、遺伝子送達または遺伝子移入
媒体は、活性化特異的αVβ3リガンドが結合した、プラスミドのような非ウイ
ルス遺伝子送達または遺伝子移入媒体であり得る。他の例において、遺伝子送達
または遺伝子移入媒体は、カプセル封入され、媒体を発現するプロテオリポソー
ムであり得、プロテオリポソームは活性化特異的αVβ3リガンドを含む。
含む組織への遺伝子送達のための活性化特異的αVβ3リガンドの使用を記載す
る。遺伝子送達または遺伝子移入媒体は、活性化特異的αVβ3リガンドを含む
ように修飾されているウイルス表面タンパク質を有する、例えば、アデノウイル
ス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびヘルペスウイ
ルスのようなウイルス由来であり得る。あるいは、遺伝子送達または遺伝子移入
媒体は、活性化特異的αVβ3リガンドが結合した、プラスミドのような非ウイ
ルス遺伝子送達または遺伝子移入媒体であり得る。他の例において、遺伝子送達
または遺伝子移入媒体は、カプセル封入され、媒体を発現するプロテオリポソー
ムであり得、プロテオリポソームは活性化特異的αVβ3リガンドを含む。
【0036】 例示的に本発明の方法により治療剤の送達の標的となる典型的組織は、送達が
薬剤を特異的に活性化αVβ3含有組織に存在させるように、αVβ3が発現され
活性化された任意の組織である。これらの組織は、例えば、新血管細胞、平滑筋
細胞、内皮細胞、特に平滑筋内皮細胞、動脈細胞、破骨細胞、腫瘍細胞等を含む
が、本発明はそれで限定する必要はない。好ましい態様において、治療剤は悪性
腫瘍の新生血管におけるαVβ3発現内皮細胞を標的とする。
薬剤を特異的に活性化αVβ3含有組織に存在させるように、αVβ3が発現され
活性化された任意の組織である。これらの組織は、例えば、新血管細胞、平滑筋
細胞、内皮細胞、特に平滑筋内皮細胞、動脈細胞、破骨細胞、腫瘍細胞等を含む
が、本発明はそれで限定する必要はない。好ましい態様において、治療剤は悪性
腫瘍の新生血管におけるαVβ3発現内皮細胞を標的とする。
【0037】 薬剤は、リガンドを含む治療組成物に、種々の手段により本発明により存在で
きる。典型的に薬剤は、接合、化学的結合または他の共有的関係によりリガンド
に機能可能に結合するが、例えば、特異的結合相互作用、化学的親和性などに依
存して、非共有法も利用し得る。
きる。典型的に薬剤は、接合、化学的結合または他の共有的関係によりリガンド
に機能可能に結合するが、例えば、特異的結合相互作用、化学的親和性などに依
存して、非共有法も利用し得る。
【0038】 本発明は、本発明の教示にしたがった治療的誘導タンパク質を製造するための
核酸発現ベクターも意図する。治療的誘導タンパク質は、生物学的活性ポリペプ
チドに機能可能に結合した活性化αVβ3特異的リガンドを含み、活性化αVβ3 を含む組織に生物学的活性化ポリペプチドを標的化させるのに有用である。
核酸発現ベクターも意図する。治療的誘導タンパク質は、生物学的活性ポリペプ
チドに機能可能に結合した活性化αVβ3特異的リガンドを含み、活性化αVβ3 を含む組織に生物学的活性化ポリペプチドを標的化させるのに有用である。
【0039】 活性化αVβ3特異的リガンドは、本発明に記載の任意のリガンドであり得る
。好ましいリガンドは上記のように、PAC1抗体に置換された、ペントンベースの
50アミノ酸残基配列である。他の好ましいリガンドは、活性化αVβ3と免疫
反応するFab WOW-1のドメイン、例えば、WOW-1の重鎖CDR3ドメインである。
。好ましいリガンドは上記のように、PAC1抗体に置換された、ペントンベースの
50アミノ酸残基配列である。他の好ましいリガンドは、活性化αVβ3と免疫
反応するFab WOW-1のドメイン、例えば、WOW-1の重鎖CDR3ドメインである。
【0040】 上記の生物学的活性ポリペプチドは、融合タンパク質に治療的重要性の生物学
的機能を付与する任意のポリペプチドであり得、したがって、本発明はそれで限
定される必要はない。例示的ポリペプチドは、ジフテリア毒素、リシン、ペプチ
ドホルモン、ペプチド細胞アクティベーター、ケモカイン、サイトカイン、キナ
ーゼ、および類似の生物学的活性ポリペプチドの活性部分を含む。
的機能を付与する任意のポリペプチドであり得、したがって、本発明はそれで限
定される必要はない。例示的ポリペプチドは、ジフテリア毒素、リシン、ペプチ
ドホルモン、ペプチド細胞アクティベーター、ケモカイン、サイトカイン、キナ
ーゼ、および類似の生物学的活性ポリペプチドの活性部分を含む。
【0041】 本発明の発現ベクターは、本発明の融合タンパク質をコードする遺伝子の発現
に適した種々の既知の構築物であり得、限定する必要はない。例示的ベクターは
、真核生物および原核生物ベクター、特に、哺乳類、特にヒトに発現可能な遺伝
子の送達をするのに当分野で既知のレトロウイルスおよびアデノウイルスベクタ
ーを含む。
に適した種々の既知の構築物であり得、限定する必要はない。例示的ベクターは
、真核生物および原核生物ベクター、特に、哺乳類、特にヒトに発現可能な遺伝
子の送達をするのに当分野で既知のレトロウイルスおよびアデノウイルスベクタ
ーを含む。
【0042】 他の使用は本明細書の観点から、当業者には明白である。 続く実施例は、本発明の好ましい態様を説明し、いかなる方法でも本明細書ま
たは特許請求の範囲を限定しない。
たは特許請求の範囲を限定しない。
【0043】 実施例 実施例1:可溶性αVβ3リガンドの製造 アデノウイルスタイプ2由来の組換えペントンベースを、先に記載のようにTr
ichoplusia Tn 5B1-4昆虫細胞にバキュロウイルス−発現させ、精製した(Wickha
m, T. J., Mathias, P., Cheresh, D. A. and Nemerow, G. R. (1993) Cell 73,
309-319)。精製タンパク質はそのままのポリアクリルアミドゲルで〜325kDa
バンドとして移動し、SDS−ポリアクリルアミドゲルで〜80kDaバンドとして移
動した。製造者(Molecular Probes, Eugene, OR)の指示にしたがってペントンベ
ースをAlexa-488に接合させ、Alexa-ペントンベース(aPB)を形成させた。精製ヒ
トフィブリノーゲンをEnzyme Research Laboratories (South Bend, IN)から得
、FITC(Shattil, S. J., Cunningham, M., and Hoxie, J. A. (1987) Blood. 70
, 307-315)で標識した。
ichoplusia Tn 5B1-4昆虫細胞にバキュロウイルス−発現させ、精製した(Wickha
m, T. J., Mathias, P., Cheresh, D. A. and Nemerow, G. R. (1993) Cell 73,
309-319)。精製タンパク質はそのままのポリアクリルアミドゲルで〜325kDa
バンドとして移動し、SDS−ポリアクリルアミドゲルで〜80kDaバンドとして移
動した。製造者(Molecular Probes, Eugene, OR)の指示にしたがってペントンベ
ースをAlexa-488に接合させ、Alexa-ペントンベース(aPB)を形成させた。精製ヒ
トフィブリノーゲンをEnzyme Research Laboratories (South Bend, IN)から得
、FITC(Shattil, S. J., Cunningham, M., and Hoxie, J. A. (1987) Blood. 70
, 307-315)で標識した。
【0044】 WOW-1 Fabを抗体PAC1 Fabの19アミノ酸H−CDR3(Abrams, C., Deng, J. St
einer, B., and Shattil, S. J. (1994) J. Biol. Chem. 269, 18781-18788)を
アデノウイルスタイプ2ペントンベース由来の50アミノ酸αVインテグリン結
合ドメイン(Mathias, P., Wickham, T., Moore, M., and Nemerow, G. (1994) J
Virol 68(19), 6811-4)でスプライス−オーバーラップPCRにより、オリゴヌク
レオチド
einer, B., and Shattil, S. J. (1994) J. Biol. Chem. 269, 18781-18788)を
アデノウイルスタイプ2ペントンベース由来の50アミノ酸αVインテグリン結
合ドメイン(Mathias, P., Wickham, T., Moore, M., and Nemerow, G. (1994) J
Virol 68(19), 6811-4)でスプライス−オーバーラップPCRにより、オリゴヌク
レオチド
【化7】 を使用して置換することにより作った。
【0045】 得られるWOW-1 Fd DNAフラグメントをBglII/AgeIで消化させ、ショウジョウ
バエメタロチオニンプロモーターおよびBiP分泌シグナルを含み、FdのC−末端に
(His)6タグを配置するショウジョウバエ発現ベクターpMT/BiP/V5-His B(Invitr
ogen, Carlsbad, CA)にクローン化した。同様に、NcoIおよびAgeI部位を含むPAC
1κを、PCRキットで
バエメタロチオニンプロモーターおよびBiP分泌シグナルを含み、FdのC−末端に
(His)6タグを配置するショウジョウバエ発現ベクターpMT/BiP/V5-His B(Invitr
ogen, Carlsbad, CA)にクローン化した。同様に、NcoIおよびAgeI部位を含むPAC
1κを、PCRキットで
【化8】 および
【化9】 で増幅させ、pMT/BiP/V5-His Bにクローン化した。19μgのpMT/BiP/V5-His B
中のWOW-1およびPAC1 κを1μgの選択ベクター(pCoHYGRO;Invitrogen)と、キ
イロショウジョウバエS2細胞に、リン酸カルシウム沈殿により共トランスフェク
トした。安定なS2細胞をヒグロマイシンBで選択し、500μM CuSO4で誘導し
た36−72時間後、WOW-1 Fabの分泌に関してスクリーニングした。
中のWOW-1およびPAC1 κを1μgの選択ベクター(pCoHYGRO;Invitrogen)と、キ
イロショウジョウバエS2細胞に、リン酸カルシウム沈殿により共トランスフェク
トした。安定なS2細胞をヒグロマイシンBで選択し、500μM CuSO4で誘導し
た36−72時間後、WOW-1 Fabの分泌に関してスクリーニングした。
【0046】 WOW-1 Fabを250−1000mlの無血清培地から、Ni−NTA(Qiagen, CA)で
のカラムクロマトグラフィーにより精製した。典型的に収率は、銀またはクーマ
シーブルーで染色したSDSゲル上で概算して>90%の純度で2−5mg/Lであっ
た。WOW-1 Fabは非還元SDSゲルで一つの〜58KDaバンドとして移動し、ウエス
タンブロットでペントンベースのインテグリン結合ドメインにおける直鎖状エピ
トープに特異的な抗体(Stewart, P. L., Chiu, C. Y., Huang, S., Muir, T., Z
hao, Y., Chait, B., Mathias, P., and Nemerow, G. R. (1997) Embo J 16&6),
1189-88)および親和性精製ヤギ−抗マウスκ(Biosource International, Camar
illo, CA)と反応する。還元後、WOW-1 Fabは〜22kDa Fd鎖および〜25kDa
κ鎖として移動した。Fdまたはκホモダイマーの証拠はなかった。PAC1 Fab
と同様に(Abrams, C., Deng, J., Steiner, B., and Shattil, S. J. (1994) J.
Biol. Chem. 269, 18781-18788)、Sephadex G-200カラム上のWOW-1 Fabの相対
的な移動は、水溶液中でモノマーであり、したがって、1価であることを示した
。
のカラムクロマトグラフィーにより精製した。典型的に収率は、銀またはクーマ
シーブルーで染色したSDSゲル上で概算して>90%の純度で2−5mg/Lであっ
た。WOW-1 Fabは非還元SDSゲルで一つの〜58KDaバンドとして移動し、ウエス
タンブロットでペントンベースのインテグリン結合ドメインにおける直鎖状エピ
トープに特異的な抗体(Stewart, P. L., Chiu, C. Y., Huang, S., Muir, T., Z
hao, Y., Chait, B., Mathias, P., and Nemerow, G. R. (1997) Embo J 16&6),
1189-88)および親和性精製ヤギ−抗マウスκ(Biosource International, Camar
illo, CA)と反応する。還元後、WOW-1 Fabは〜22kDa Fd鎖および〜25kDa
κ鎖として移動した。Fdまたはκホモダイマーの証拠はなかった。PAC1 Fab
と同様に(Abrams, C., Deng, J., Steiner, B., and Shattil, S. J. (1994) J.
Biol. Chem. 269, 18781-18788)、Sephadex G-200カラム上のWOW-1 Fabの相対
的な移動は、水溶液中でモノマーであり、したがって、1価であることを示した
。
【0047】 WOW-1 Fabの重鎖および軽鎖配列: WOW-1 Fab重鎖配列(配列番号7)
【化10】
【0048】 WOW-1 Fab重鎖アミノ酸配列(配列番号8)
【化11】
【0049】 WOW-1 Fab軽鎖ヌクレオチド配列(配列番号9)
【化12】
【0050】 WOW-1 Fab軽鎖アミノ酸配列(配列番号10)
【化13】
【0051】 実施例2:哺乳類細胞およびDNAトランスフェクション 完全長ヒトαVおよびβ3をコードするcDNAを、pcDNA3およびpCDM8に各々サブ
クローン化し、各々の2μgをCHO−K1細胞にトランスフェクトして一過性の安
定なトランスフェクタントを記載のように得た(O'Toole, T. E., Katagiri, Y.
Faull, R. J., Peter, K., Tamura, R., Quaranta, V., Loftus, J. C., Shatti
l, S. J., and Ginsberg, M. H. (1994) J. Cell Biol. 124, 1047-1059)。更に
抗生物質選択で生存する安定なトランスフェクタントを、αVβ3特異的モノク
ローナル抗体、LM609を使用した単一細胞FACSソーティングにより、高αVβ3発
現に関してスクリーニングした(Cheresh, D. A. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci
. USA. 84, 6471-6475)。野生型ヒトαIIbβ3およびαVβ3(D723R)を発現する
CHO細胞は、先に記載されている(O'Toole, T. E., Katagiri, U., Faull, R. J.
, Peter, K., Tamura, R., Quaranta, V., Loftus, J. C., Shattil, S. J., an
d Ginsberg, M. H. (1994) J. Cell Biol. 124, 1047-1059; Hughes, P. E., Di
az-Gonzalez F., Leong, L., Wu, C. Y., McDonald, J. A., Shattil, S. J., a
nd Ginsberg, M. H. (1996) J. Biol. Chem. 271, 6571-6574)。M21-Lはヒトメ
ラノーマ細胞系M21のクローンであり、αVサブユニットを欠く(Cheresh, D. A.,
and Spiro, R. C. (1987) J Biol Chem 262(36), 17703-11)。αVβ3-M21-L細
胞を、各々2μgのαV/pcDNA3およびβ3/pCDM8による、Superfectを使用した
M21-Lの一過性トランスフェクションにより作った。CS-1は、β3またはβ5サ
ブユニットを合成しないため、αVβ3またはαVβ5を発現しないハムスターメ
ラノーマ細胞である。ハムスターαVおよびヒトβ3を安定に発現するαVβ3-C
S-1細胞をヒトβ3でのCS-1細胞のトランスフェクションにより得た(Filardo, E
. J., Brooks, P. C., Deming, S. L., Damsky, C., and Cheresh, D. A. (1995
) J. Cell Biol. 130, 441-450)。JYは、αVβ3を発現するが、αVβ5を発現
しない不死化ヒトBリンパ芽球状細胞系である(Stupack, D. G., Shen, C., and
Wilkins, J. A. (1992) Exp. Cell Res. 203, 443-448; Rothlein, R., and Spr
inger, T. A. (1986) J Exp Med 163(5), 1132-49)。
クローン化し、各々の2μgをCHO−K1細胞にトランスフェクトして一過性の安
定なトランスフェクタントを記載のように得た(O'Toole, T. E., Katagiri, Y.
Faull, R. J., Peter, K., Tamura, R., Quaranta, V., Loftus, J. C., Shatti
l, S. J., and Ginsberg, M. H. (1994) J. Cell Biol. 124, 1047-1059)。更に
抗生物質選択で生存する安定なトランスフェクタントを、αVβ3特異的モノク
ローナル抗体、LM609を使用した単一細胞FACSソーティングにより、高αVβ3発
現に関してスクリーニングした(Cheresh, D. A. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci
. USA. 84, 6471-6475)。野生型ヒトαIIbβ3およびαVβ3(D723R)を発現する
CHO細胞は、先に記載されている(O'Toole, T. E., Katagiri, U., Faull, R. J.
, Peter, K., Tamura, R., Quaranta, V., Loftus, J. C., Shattil, S. J., an
d Ginsberg, M. H. (1994) J. Cell Biol. 124, 1047-1059; Hughes, P. E., Di
az-Gonzalez F., Leong, L., Wu, C. Y., McDonald, J. A., Shattil, S. J., a
nd Ginsberg, M. H. (1996) J. Biol. Chem. 271, 6571-6574)。M21-Lはヒトメ
ラノーマ細胞系M21のクローンであり、αVサブユニットを欠く(Cheresh, D. A.,
and Spiro, R. C. (1987) J Biol Chem 262(36), 17703-11)。αVβ3-M21-L細
胞を、各々2μgのαV/pcDNA3およびβ3/pCDM8による、Superfectを使用した
M21-Lの一過性トランスフェクションにより作った。CS-1は、β3またはβ5サ
ブユニットを合成しないため、αVβ3またはαVβ5を発現しないハムスターメ
ラノーマ細胞である。ハムスターαVおよびヒトβ3を安定に発現するαVβ3-C
S-1細胞をヒトβ3でのCS-1細胞のトランスフェクションにより得た(Filardo, E
. J., Brooks, P. C., Deming, S. L., Damsky, C., and Cheresh, D. A. (1995
) J. Cell Biol. 130, 441-450)。JYは、αVβ3を発現するが、αVβ5を発現
しない不死化ヒトBリンパ芽球状細胞系である(Stupack, D. G., Shen, C., and
Wilkins, J. A. (1992) Exp. Cell Res. 203, 443-448; Rothlein, R., and Spr
inger, T. A. (1986) J Exp Med 163(5), 1132-49)。
【0052】 実施例3:表面インテグリン発現の分析 細胞を“インキュベーション緩衝液”(137mM NaCl、2.7mM KCl、3.3
mM NaH2PO4、3.8mM HEPES、1mM MgCl2、5.5mMグルコースおよび1mg
/mlウシ血清アルブミン、pH7.4)に懸濁し、30分、氷上でαVβ3(LM609)、
αIIbβ3(D57)(O'Toole, T. E., Katagiri, Y., Faull, R. J., Peter, K., Ta
mura, R., Quaranta, V., Loftus, J. C., Shattil. S. J., and Ginsberg, M.
H. (1994) J. Cell Biol. 124, 1047-1058)またはαVβ5(P1F6)Lin, E. C. K.,
Ratnikov, B. I., Tsai, P. M., Carron, C. P., Myers, D. M., Barbas, C. F
., Ill, and Smith, J. W. (1997) J. Biol. Chem. 272, 23912-23920)のいずれ
かに特異的なモノクローナル抗体(10μg/ml)とインキュベートした。洗浄後
、細胞を更に30分氷上でFITC-接合ヤギ抗マウスIgG(H+L鎖特異的;Biosource
)とインキュベートし、再び洗浄し、FACSCaliburフローサイトメーター(Becton
Dickinson, Mountain View, CA)(Hato, T., Pampori, N., and Shattil, S. J.
(1998) J. Cell Biol. 141(7), 1685-1685)で分析した。ネガティブコントロー
ルとして、サンプルを二次抗体単独とインキュベートした。
mM NaH2PO4、3.8mM HEPES、1mM MgCl2、5.5mMグルコースおよび1mg
/mlウシ血清アルブミン、pH7.4)に懸濁し、30分、氷上でαVβ3(LM609)、
αIIbβ3(D57)(O'Toole, T. E., Katagiri, Y., Faull, R. J., Peter, K., Ta
mura, R., Quaranta, V., Loftus, J. C., Shattil. S. J., and Ginsberg, M.
H. (1994) J. Cell Biol. 124, 1047-1058)またはαVβ5(P1F6)Lin, E. C. K.,
Ratnikov, B. I., Tsai, P. M., Carron, C. P., Myers, D. M., Barbas, C. F
., Ill, and Smith, J. W. (1997) J. Biol. Chem. 272, 23912-23920)のいずれ
かに特異的なモノクローナル抗体(10μg/ml)とインキュベートした。洗浄後
、細胞を更に30分氷上でFITC-接合ヤギ抗マウスIgG(H+L鎖特異的;Biosource
)とインキュベートし、再び洗浄し、FACSCaliburフローサイトメーター(Becton
Dickinson, Mountain View, CA)(Hato, T., Pampori, N., and Shattil, S. J.
(1998) J. Cell Biol. 141(7), 1685-1685)で分析した。ネガティブコントロー
ルとして、サンプルを二次抗体単独とインキュベートした。
【0053】 実施例4:リガンド結合アッセイ aPB、WOW-1 FabおよびFITC−フィブリノーゲンの細胞への結合をフローサイ
トメトリーにより評価した。典型的に、細胞を一晩低血清培地(例えば、0.5%
ウシ胎児血清)中で培養し、インキュベーション緩衝液に1−1.5×107細胞
/mlで再懸濁させ、4−6×105細胞をこれらのリガンドの一つと、30分、
室温で50μlの最終容量でインキュベートした。示されるように、あるサンプ
ルをまた以下の試薬の1個またはそれ以上の存在下でインキュベートとした:活
性化β3インテグリンに関して抗体AP5腹水(1:50)(Pelletier, A. J., Kuni
cki, T, Ruggeri, Z. M., and Quaranta, V. (1995) J. Biol. Chem. 270, 1813
3-18140)、活性化インテグリンに関して0.24mM MnCl2、インテグリンに結
合する特異的遮断リガンドに関して2mM RGDSまたは5mM EDTA、選択的αVイ
ンテグリンである50μM cRGDfV(Oeninsula Laboratories, Inc., Belmont, C
A)、選択的αIIbβ3アンタゴニストである65μM Integrilin(Scarborough,
R. M., Naughton, M. A., Teng, W., Rose, J. W., Phillips, D. R., Nannizzi
, L., Argsten, A., Campbell, A. M., and Charo, I. F. (1993)J Biol. Chem.
269, 1066-1073)または100μgの機能遮断抗体LM609またはP1F6。ある実験に
おいて、リガンド結合およびαVβ3発現を、細胞とリガンドをビオチン−SSA6(
7μg/ml)である非機能遮断抗β3モノクローナル抗体の存在下でインキュベー
トするこにより同時に測定した(Abrams, C., Deng, J., Steiner, B., and Shat
til, S. J. (1994) J. Biol. Chem. 269, 18781-18788)。室温で30分後、細胞
を洗浄し、フィコエリスリン−ストレプトアビジン(1:25最終希釈;Molecul
ar Probes)と20分、氷上でインキュベートした。WOW-1 Fabの場合、Alexa−
接合抗(His)6モノクローナル抗体(Accurate Chemical and Scientific Corp.,
Westbury, NY)をこの段階で加えた(50μg/ml)。細胞を洗浄し、2μg/mlヨ
ウ化プロピジウム(Sigma, St. Louis, MO)含有0.5mlインキュベーション緩衝
液に再懸濁させた。リガンド結合(FL1チャネル)を、αVβ3発現に関して強く陽
性であった(FL2)生存細胞のゲーティッド(gated)サブセットで直ぐに分析した(
ヨウ化プロピジウムネガティブ、FL3)。結合等温線を、片側結合の等式を使用し
て非直線、最小二乗回帰分析に付した(Prism 2.0ソフトウェア;GraphPad Softw
are, Dan Diego, CA)。対のサンプルの両側P値をスチューデントのt検定で得た
。
トメトリーにより評価した。典型的に、細胞を一晩低血清培地(例えば、0.5%
ウシ胎児血清)中で培養し、インキュベーション緩衝液に1−1.5×107細胞
/mlで再懸濁させ、4−6×105細胞をこれらのリガンドの一つと、30分、
室温で50μlの最終容量でインキュベートした。示されるように、あるサンプ
ルをまた以下の試薬の1個またはそれ以上の存在下でインキュベートとした:活
性化β3インテグリンに関して抗体AP5腹水(1:50)(Pelletier, A. J., Kuni
cki, T, Ruggeri, Z. M., and Quaranta, V. (1995) J. Biol. Chem. 270, 1813
3-18140)、活性化インテグリンに関して0.24mM MnCl2、インテグリンに結
合する特異的遮断リガンドに関して2mM RGDSまたは5mM EDTA、選択的αVイ
ンテグリンである50μM cRGDfV(Oeninsula Laboratories, Inc., Belmont, C
A)、選択的αIIbβ3アンタゴニストである65μM Integrilin(Scarborough,
R. M., Naughton, M. A., Teng, W., Rose, J. W., Phillips, D. R., Nannizzi
, L., Argsten, A., Campbell, A. M., and Charo, I. F. (1993)J Biol. Chem.
269, 1066-1073)または100μgの機能遮断抗体LM609またはP1F6。ある実験に
おいて、リガンド結合およびαVβ3発現を、細胞とリガンドをビオチン−SSA6(
7μg/ml)である非機能遮断抗β3モノクローナル抗体の存在下でインキュベー
トするこにより同時に測定した(Abrams, C., Deng, J., Steiner, B., and Shat
til, S. J. (1994) J. Biol. Chem. 269, 18781-18788)。室温で30分後、細胞
を洗浄し、フィコエリスリン−ストレプトアビジン(1:25最終希釈;Molecul
ar Probes)と20分、氷上でインキュベートした。WOW-1 Fabの場合、Alexa−
接合抗(His)6モノクローナル抗体(Accurate Chemical and Scientific Corp.,
Westbury, NY)をこの段階で加えた(50μg/ml)。細胞を洗浄し、2μg/mlヨ
ウ化プロピジウム(Sigma, St. Louis, MO)含有0.5mlインキュベーション緩衝
液に再懸濁させた。リガンド結合(FL1チャネル)を、αVβ3発現に関して強く陽
性であった(FL2)生存細胞のゲーティッド(gated)サブセットで直ぐに分析した(
ヨウ化プロピジウムネガティブ、FL3)。結合等温線を、片側結合の等式を使用し
て非直線、最小二乗回帰分析に付した(Prism 2.0ソフトウェア;GraphPad Softw
are, Dan Diego, CA)。対のサンプルの両側P値をスチューデントのt検定で得た
。
【0054】 αVβ3に結合するリガンドにおける単離インテグリン細胞質テイルの過発現
の効果を試験するために、αVβ3-CS-1細胞を、Tac−β1、Tac−β3またはTa
c−α5のいずれかをコードする哺乳類発現プラスミドで、Fugene-6トランスフ
ェクション試薬(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)を使用してトランス
フェクトした(LaFlamme, S. E., Thomas, L. A., Yamada, S. S., and Yamada,
K. M. (1994)J. Cell Biol. 126, 1287-129+8; Chen, Y.-P., O'Toole, T. E.,
Shipley, T. Forsyth, J., LaFlamme, S. E., Yamada, K. M., Shattil, S. J.
and Ginsberg, M. H. (1994) J. Biol. Chem. 269, 18307-18310)。トランスフ
ェクション48時間後、細胞をインキュベーション緩衝液に1.5×106/ml
で懸濁させ、30分、室温で150nM aPBまたは425nM WOW-1 Fabと5mM
ERTAの存在下または非存在下でインキュベートした。洗浄後、細胞を更に30
分、氷上で2.5μg/mlのビオチニル化抗Tacモノクローナル抗体(7F7B6)とイン
キュベートし、続いてフィコエリスリン接合抗マウスIgG、および(WOW-1 Fabが
存在するとき)50μg/mlのAlexa−抗−(His)6とインキュベートした。リガン
ド結合をTac発現に関して強く陽性の生存細胞のゲーティッドサブセットで分析
した。平行した試験管で、細胞をSSA6および抗Tac抗体と共染色し、Tac陽性細胞
におけるαVβ3発現を定量した。
の効果を試験するために、αVβ3-CS-1細胞を、Tac−β1、Tac−β3またはTa
c−α5のいずれかをコードする哺乳類発現プラスミドで、Fugene-6トランスフ
ェクション試薬(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)を使用してトランス
フェクトした(LaFlamme, S. E., Thomas, L. A., Yamada, S. S., and Yamada,
K. M. (1994)J. Cell Biol. 126, 1287-129+8; Chen, Y.-P., O'Toole, T. E.,
Shipley, T. Forsyth, J., LaFlamme, S. E., Yamada, K. M., Shattil, S. J.
and Ginsberg, M. H. (1994) J. Biol. Chem. 269, 18307-18310)。トランスフ
ェクション48時間後、細胞をインキュベーション緩衝液に1.5×106/ml
で懸濁させ、30分、室温で150nM aPBまたは425nM WOW-1 Fabと5mM
ERTAの存在下または非存在下でインキュベートした。洗浄後、細胞を更に30
分、氷上で2.5μg/mlのビオチニル化抗Tacモノクローナル抗体(7F7B6)とイン
キュベートし、続いてフィコエリスリン接合抗マウスIgG、および(WOW-1 Fabが
存在するとき)50μg/mlのAlexa−抗−(His)6とインキュベートした。リガン
ド結合をTac発現に関して強く陽性の生存細胞のゲーティッドサブセットで分析
した。平行した試験管で、細胞をSSA6および抗Tac抗体と共染色し、Tac陽性細胞
におけるαVβ3発現を定量した。
【0055】 WOW-1 Fabの、ヒト胎盤由来の精製αVβ3レセプターおよびヒト血小板由来
のαIIbβ3への結合を、50μM CaCl2、MgCl2およびMnCl2の存在下で測定
した。非特異的結合を、2mM RGDSの存在下で測定した(Abrams, C., Deng, J.,
Steiner, B., and Shattil., S. J. (1994) J. Biol. Chem. 269, 18781-18788
)。
のαIIbβ3への結合を、50μM CaCl2、MgCl2およびMnCl2の存在下で測定
した。非特異的結合を、2mM RGDSの存在下で測定した(Abrams, C., Deng, J.,
Steiner, B., and Shattil., S. J. (1994) J. Biol. Chem. 269, 18781-18788
)。
【0056】 実施例5:細胞接着アッセイ Immulon-2マイクロタイターウェル(Dynex Laboratories, Chantilly, VA)を非
標識ペントンベース(1−100ng/ウェル)で一晩4℃でコートし、続いて20
mg/ml BSAで遮断した。安定にαVβ3を発現するCHO細胞をBCECF−AM(Molecul
ar Probes, Eugene, OR)で標識し、固定化ペントンベースへの細胞接着を485
/530nmの細胞蛍光測定法で定量した(Hato, T., Pampori, N., and Shattil,
S. J. (1998) J. Cell Biol. 141(7), 1685-1695)。
標識ペントンベース(1−100ng/ウェル)で一晩4℃でコートし、続いて20
mg/ml BSAで遮断した。安定にαVβ3を発現するCHO細胞をBCECF−AM(Molecul
ar Probes, Eugene, OR)で標識し、固定化ペントンベースへの細胞接着を485
/530nmの細胞蛍光測定法で定量した(Hato, T., Pampori, N., and Shattil,
S. J. (1998) J. Cell Biol. 141(7), 1685-1695)。
【0057】 実施例6:アデノウイルス介在遺伝子送達 CS-1およびαVβ3-CS-1細胞(105細胞)を5分、室温で100μlのインキ
ュベーション緩衝液に懸濁させた。ある場合、2.5mM MnCl2もまた存在し、
最大インテグリン活性を誘導した。次いで、緑色蛍光タンパク質(GFP)をコード
する非増殖性(replication-deficient)アデノウイルスタイプ5を細胞懸濁液に
50または500の感染効率で添加した(Huang, S., Stupack, D., Mathias, P.
, Wang, Y., and Nemerow, G. (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94(15), 8156-6
1)。1時間、37℃の後、内在化していないウイルスを、細胞の0.03%トリ
プシン/0.35mM EDTAとの5分、37℃でのインキュベーションにより消化
させた。72時間後、GFP発現をフローサイトメトリーにより定量した。
ュベーション緩衝液に懸濁させた。ある場合、2.5mM MnCl2もまた存在し、
最大インテグリン活性を誘導した。次いで、緑色蛍光タンパク質(GFP)をコード
する非増殖性(replication-deficient)アデノウイルスタイプ5を細胞懸濁液に
50または500の感染効率で添加した(Huang, S., Stupack, D., Mathias, P.
, Wang, Y., and Nemerow, G. (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94(15), 8156-6
1)。1時間、37℃の後、内在化していないウイルスを、細胞の0.03%トリ
プシン/0.35mM EDTAとの5分、37℃でのインキュベーションにより消化
させた。72時間後、GFP発現をフローサイトメトリーにより定量した。
【0058】 実施例7:新規1価リガンドとインテグリンαVβ3の相互作用 αVβ3の親和性調整の明白さを文書化し、実験するために、1価レポーター
リガンドを、活性化依存性抗αIIbβ3抗体、PAC1 Fabと同様に開発した。予備
的結合試験は、WOW-1 Fabと名付けた新規抗体で、細胞外ドメインでの直接作用
によりインテグリンを活性化させる50μM MnCl2存在下で精製インテグリン
を使用して行った(Bazzoni, G., and Hemler, M. E. (1998) Trends Biochem. S
ci. 23, 30-34)。WOW-1 Fabは精製αVβ3に結合し、より少ない程度で精製αV β5に結合した。結合は40nM Fabで最大の半分であり、2mM RGDSまたは5m
M EDTAにより>95%まで遮断された。対照的に、WOW-1 Fabの精製αIIbβ3 への検出は、2μMほど高い抗体の濃度での検出不可能であり、親細胞PAC1 Fab
抗体でさえ、50nMでαIIbβ3に最大の半分結合した。これらの結果は、PAC1
Fabの再操作が、活性化依存性αIIbβ3抗体から活性化αVβ3と反応するも
のにそれを変換することを示した。Fab結合を、ヒトαVβ3で安定にトランスフ
ェクトしたCHO細胞(αVβ3−CHO細胞)を使用した多価ペントンベースと比較し
た。フローサイトメトリー分析は、これらの細胞の表面が大量のαVβ3、中程
度の量のαVβ5を発現し、検出可能なαIIbβ3は発現しないことを示した(図
1A)。Alexa-ペントンベース(aPB)またはWOW-1 Fabを、広範囲のリガンド濃度(
5−1000nM)で、種々の時間、室温で細胞とインキュベートしたとき、2mM
RGDSまたは5mM EDTAで阻害可能であると定義される特異的リガンド結合は、
30分で安定状態に到達し、非特異的結合は全結合の<15%を占めた。したが
って、全ての続く結合実験をこれらの条件下で行った。aPBおよびWOW-1 Fab結
合は、非刺激αVβ3-CHO細胞に対して特異的であるが、低レベルであった。し
かし、αVβ3の、抗β3抗体AP5による直接活性化は、両方のリガンドにおける
有意な上昇をもたらした(P<0.01)(図1B)。
リガンドを、活性化依存性抗αIIbβ3抗体、PAC1 Fabと同様に開発した。予備
的結合試験は、WOW-1 Fabと名付けた新規抗体で、細胞外ドメインでの直接作用
によりインテグリンを活性化させる50μM MnCl2存在下で精製インテグリン
を使用して行った(Bazzoni, G., and Hemler, M. E. (1998) Trends Biochem. S
ci. 23, 30-34)。WOW-1 Fabは精製αVβ3に結合し、より少ない程度で精製αV β5に結合した。結合は40nM Fabで最大の半分であり、2mM RGDSまたは5m
M EDTAにより>95%まで遮断された。対照的に、WOW-1 Fabの精製αIIbβ3 への検出は、2μMほど高い抗体の濃度での検出不可能であり、親細胞PAC1 Fab
抗体でさえ、50nMでαIIbβ3に最大の半分結合した。これらの結果は、PAC1
Fabの再操作が、活性化依存性αIIbβ3抗体から活性化αVβ3と反応するも
のにそれを変換することを示した。Fab結合を、ヒトαVβ3で安定にトランスフ
ェクトしたCHO細胞(αVβ3−CHO細胞)を使用した多価ペントンベースと比較し
た。フローサイトメトリー分析は、これらの細胞の表面が大量のαVβ3、中程
度の量のαVβ5を発現し、検出可能なαIIbβ3は発現しないことを示した(図
1A)。Alexa-ペントンベース(aPB)またはWOW-1 Fabを、広範囲のリガンド濃度(
5−1000nM)で、種々の時間、室温で細胞とインキュベートしたとき、2mM
RGDSまたは5mM EDTAで阻害可能であると定義される特異的リガンド結合は、
30分で安定状態に到達し、非特異的結合は全結合の<15%を占めた。したが
って、全ての続く結合実験をこれらの条件下で行った。aPBおよびWOW-1 Fab結
合は、非刺激αVβ3-CHO細胞に対して特異的であるが、低レベルであった。し
かし、αVβ3の、抗β3抗体AP5による直接活性化は、両方のリガンドにおける
有意な上昇をもたらした(P<0.01)(図1B)。
【0059】 これらのリガンドのこのシステムにおけるαVβ3への選択性を評価するため
に、種々の機能遮断化合物を試験した。aPBおよびWOW-1 Fabの抗体AP5の存在下
における結合は、2mM RGDSまたはαVインテグリンに選択的な環状ペプチドで
ある50μM cRGDfVで>85%阻害された(Brooks, P. C., Montgomery, A. M.
P., Rosenfeld, M., Reisfeld, R. A., Hu, T., Klier, G., and Cheresh, D.
A. (1994) Cell 79, 1157-1164)。他方、αIIbβ3に選択的な環状ペプチド(Int
egrilin)は、フィブリノーゲンまたはPAC1の血小板αIIbβ3への結合を防止す
るのに必要なものよりも100倍高い濃度(1μM)でさえ、リガンド結合を20
%より低くしか阻害しなかった(Scarborough, R. M., Naughton, M. A., Teng,
W., Rose, J. W., Phillips, D. R., Nannizzi, L., Arfsten, A., Campbell, A
. M., and Charo, I. F. (1993) J. Biol. Chem. 268, 1066-1073)。更に、αV
β3機能遮断抗体LM609(100μg/ml)は、リガンド結合を70%以上阻害し、
一方αVβ5遮断抗体P1F6はこのような効果はなかった。加えて、aPBもWOW-1も
、細胞当たり>50,000のαIIbβ3レセプターを発現するが、500より少
ないαVβ3レセプターを発現する休止またはトロンビン刺激ヒト化粧伴に検出
可能に結合しなかった(Coller, B. S., Cheresh, D. A., Asch, E., and Seligs
ohn, U. (1991) Blood 77, 75-83)。まとめて、これらの結果は1価リガンドWOW
-1 Fabおよび多価リガンドaPBがαVβ3の活性化状態に感受性であり、αIIbβ 3 を認識しないことを示す。したがって、WOW-1 FabはαVβ3親和性の変化に
関する適当なレポーターである。WOW-1 Fab(およびaPB)はまたαVβ5を認識す
るため、αVβ3を発現するが、αVβ5を殆ど発現しないか、全く発現しない細
胞を利用するために、以下の実験で特に努力をした。
に、種々の機能遮断化合物を試験した。aPBおよびWOW-1 Fabの抗体AP5の存在下
における結合は、2mM RGDSまたはαVインテグリンに選択的な環状ペプチドで
ある50μM cRGDfVで>85%阻害された(Brooks, P. C., Montgomery, A. M.
P., Rosenfeld, M., Reisfeld, R. A., Hu, T., Klier, G., and Cheresh, D.
A. (1994) Cell 79, 1157-1164)。他方、αIIbβ3に選択的な環状ペプチド(Int
egrilin)は、フィブリノーゲンまたはPAC1の血小板αIIbβ3への結合を防止す
るのに必要なものよりも100倍高い濃度(1μM)でさえ、リガンド結合を20
%より低くしか阻害しなかった(Scarborough, R. M., Naughton, M. A., Teng,
W., Rose, J. W., Phillips, D. R., Nannizzi, L., Arfsten, A., Campbell, A
. M., and Charo, I. F. (1993) J. Biol. Chem. 268, 1066-1073)。更に、αV
β3機能遮断抗体LM609(100μg/ml)は、リガンド結合を70%以上阻害し、
一方αVβ5遮断抗体P1F6はこのような効果はなかった。加えて、aPBもWOW-1も
、細胞当たり>50,000のαIIbβ3レセプターを発現するが、500より少
ないαVβ3レセプターを発現する休止またはトロンビン刺激ヒト化粧伴に検出
可能に結合しなかった(Coller, B. S., Cheresh, D. A., Asch, E., and Seligs
ohn, U. (1991) Blood 77, 75-83)。まとめて、これらの結果は1価リガンドWOW
-1 Fabおよび多価リガンドaPBがαVβ3の活性化状態に感受性であり、αIIbβ 3 を認識しないことを示す。したがって、WOW-1 FabはαVβ3親和性の変化に
関する適当なレポーターである。WOW-1 Fab(およびaPB)はまたαVβ5を認識す
るため、αVβ3を発現するが、αVβ5を殆ど発現しないか、全く発現しない細
胞を利用するために、以下の実験で特に努力をした。
【0060】 実施例8:αVβ3の親和性はインサイドアウトシグナルにより調節できる αVβ3がインサイドアウトシグナルによる親和性調整に感受性であるかを決
定するために、WOW-1 FabのJY Bリンパ芽球への結合を試験した。これらの細
胞は、αVβ3を発現するが、αVβ5を発現せず、ホルボールミリステートアセ
テートのよるプロテインキナーゼCの活性化に応答してビトロネクチンに急速に
接着するために選択した(Stupack, D. G., Shen, C., and Wilkins, J. A. (199
2) Exp. Cell Res. 203, 443-448; Rothlein, R., and Springer, T. A. (1986)
J Exp Med 163(5), 1132-49)。JY細胞の15分、100nMフォルボールミリス
テートアセテートとのインキュベーションは、aPBの特異的結合の有意な増加を
もたらし(2.7±0.2倍増加;P<0.05)、αVβ3親和性および/または親
和力の増加と一致する。更に、フォルボールミリステートアセテートは、WOW-1
Fabの結合における2.4±0.1倍増加をもたらす(P<0.05)。応答は、抗
体AP5の活性化により更に増加しなかった(図3A)。フォルボールミリステートア
セテートは抗体LM609で測定して、αVβ3の表面発現を増加させなかった。WOW-
1 Fab結合の変化がαVβ3親和性を変化させるかの測定のために、リガンド結
合を広範囲の抗体濃度にわたり分析した。非刺激JY細胞はWOW-1 Fabに非常に低
い親和性を示し(見かけのKd=2,600±700nM;SEM)、24.8±4.1任意
の蛍光単位の最大結合の値を示した(図3B)。著しい対照として、フォルボール
ミリステートアセテートで刺激したJY細胞は、結合親和性の>30倍増階を示し
(見かけのKd=80±18nM)、最大結合に変化はなかった(23.5±1.1単位)
。この効果は、細胞を最初に30分、0.2%アジ化ナトリウムおよび4mg/ml
2−デオキシ−d−グルコースとプレインキュベーションすることにより、代
謝エネルギーを枯渇させた場合、防止された。これらの結果は、エネルギー依存
性インサイドアウトシグナルが、αVβ3のリガンド結合親和性を調節できるこ
とを確立する。
定するために、WOW-1 FabのJY Bリンパ芽球への結合を試験した。これらの細
胞は、αVβ3を発現するが、αVβ5を発現せず、ホルボールミリステートアセ
テートのよるプロテインキナーゼCの活性化に応答してビトロネクチンに急速に
接着するために選択した(Stupack, D. G., Shen, C., and Wilkins, J. A. (199
2) Exp. Cell Res. 203, 443-448; Rothlein, R., and Springer, T. A. (1986)
J Exp Med 163(5), 1132-49)。JY細胞の15分、100nMフォルボールミリス
テートアセテートとのインキュベーションは、aPBの特異的結合の有意な増加を
もたらし(2.7±0.2倍増加;P<0.05)、αVβ3親和性および/または親
和力の増加と一致する。更に、フォルボールミリステートアセテートは、WOW-1
Fabの結合における2.4±0.1倍増加をもたらす(P<0.05)。応答は、抗
体AP5の活性化により更に増加しなかった(図3A)。フォルボールミリステートア
セテートは抗体LM609で測定して、αVβ3の表面発現を増加させなかった。WOW-
1 Fab結合の変化がαVβ3親和性を変化させるかの測定のために、リガンド結
合を広範囲の抗体濃度にわたり分析した。非刺激JY細胞はWOW-1 Fabに非常に低
い親和性を示し(見かけのKd=2,600±700nM;SEM)、24.8±4.1任意
の蛍光単位の最大結合の値を示した(図3B)。著しい対照として、フォルボール
ミリステートアセテートで刺激したJY細胞は、結合親和性の>30倍増階を示し
(見かけのKd=80±18nM)、最大結合に変化はなかった(23.5±1.1単位)
。この効果は、細胞を最初に30分、0.2%アジ化ナトリウムおよび4mg/ml
2−デオキシ−d−グルコースとプレインキュベーションすることにより、代
謝エネルギーを枯渇させた場合、防止された。これらの結果は、エネルギー依存
性インサイドアウトシグナルが、αVβ3のリガンド結合親和性を調節できるこ
とを確立する。
【0061】 実施例9:αVβ3活性化状態の決定 実験を行い、ヒトαVβ3を安定に発現する容易にトランスフェクト可能な細
胞を使用したαVβ3親和性に作用する因子を同定した。血管細胞上のαVβ3は
、創傷治癒の過程の間に同時に複数のリガンドを競合し得る。したがって、αV
β3の親和性/親和力が種々のリガンドで違うかを評価した。aPB、WOW-1 Fab
および接着リガンドであるフィブリノーゲンの等量を、αVβ3−CHO細胞で比較
した。表1に要約のように、各リガンドは、非刺激αVβ3-CHO細胞におけるレ
セプターにほぼ同じ合計数で特異的に結合する。しかし、αVβ3のフィブリノ
ーゲンに対する親和性/親和力は、aPBよりも、両方のリガンドが多価であり分
子量が類似にもかかわらず、約15倍低い。αVβ3の抗体AP5での活性化は、両
方のリガンドに関して結合親和性/親和力を増加させるが、最大結合に影響しな
い(表1)。他方、aPBとWOW-1 Fabの間の結合価の差異に拘らず、それらの結合
定数は類似であった。全体として、これらの結果は、αVβ3が巨大分子リガン
ドと異なって相互作用でき、レセプターの親和性状態はこのような相互作用の一
つの決定因であることを示す。
胞を使用したαVβ3親和性に作用する因子を同定した。血管細胞上のαVβ3は
、創傷治癒の過程の間に同時に複数のリガンドを競合し得る。したがって、αV
β3の親和性/親和力が種々のリガンドで違うかを評価した。aPB、WOW-1 Fab
および接着リガンドであるフィブリノーゲンの等量を、αVβ3−CHO細胞で比較
した。表1に要約のように、各リガンドは、非刺激αVβ3-CHO細胞におけるレ
セプターにほぼ同じ合計数で特異的に結合する。しかし、αVβ3のフィブリノ
ーゲンに対する親和性/親和力は、aPBよりも、両方のリガンドが多価であり分
子量が類似にもかかわらず、約15倍低い。αVβ3の抗体AP5での活性化は、両
方のリガンドに関して結合親和性/親和力を増加させるが、最大結合に影響しな
い(表1)。他方、aPBとWOW-1 Fabの間の結合価の差異に拘らず、それらの結合
定数は類似であった。全体として、これらの結果は、αVβ3が巨大分子リガン
ドと異なって相互作用でき、レセプターの親和性状態はこのような相互作用の一
つの決定因であることを示す。
【0062】
【表1】 *リガンド結合をフローサイトメトリーにより決定し、結合等温線を実験法およ
び図3のレジェンドに記載のように分析した。データは各リガンドの3つの実験
を合わせた結果で示す。最大結合(Bmax)は任意の蛍光単位で示した。適合度(R2 )値は0.93−1.00の範囲であった。
び図3のレジェンドに記載のように分析した。データは各リガンドの3つの実験
を合わせた結果で示す。最大結合(Bmax)は任意の蛍光単位で示した。適合度(R2 )値は0.93−1.00の範囲であった。
【0063】 循環血小板において、αIIbβ3の“基底”活性化状態は血栓症を予防するた
めに低いままでなければならない。しかし、この要求は、αVβ3を発現する全
ての細胞に関係するものではない可能性がある。したがって、リガンド結合を、
αVβ3−CHO細胞と、二つの無関係メラノーマ細胞系αVβ3-M21-LおよびαVβ 3 -CS-1で同時に試験し、αVβ3の基底状態の細胞型特異的変化を評価した。α V β3発現の細胞系間のわずかな変化をコントロールするために、レセプター発
現を定量するために、抗β3抗体SSA6を使用して、リガンド結合を“レセプター
当り”を基本にして示した。非刺激αVβ3-M21-L細胞はαVβ3-CHO細胞よりも
有意に多くのaPBを結合した(P<0.01)。この差異は、抗体AP5でαVβ3を更
に活性化した後でさえ、維持された(P<0.05)(図4)。同様の結果が、αVβ
3-M21-L細胞の代わりにαVβ3-CS-1で、およびaPBの代わりにWOW-1 Fabで得
られた。非刺激JYリンパ芽球およびαVβ3-CHO細胞へのWOW-1 Fabの結合にお
いて観察される著しい変化と一緒にして(図3Bおよび表1)、これらの結果はαV β3の基底活性が細胞型で変化することを示す。
めに低いままでなければならない。しかし、この要求は、αVβ3を発現する全
ての細胞に関係するものではない可能性がある。したがって、リガンド結合を、
αVβ3−CHO細胞と、二つの無関係メラノーマ細胞系αVβ3-M21-LおよびαVβ 3 -CS-1で同時に試験し、αVβ3の基底状態の細胞型特異的変化を評価した。α V β3発現の細胞系間のわずかな変化をコントロールするために、レセプター発
現を定量するために、抗β3抗体SSA6を使用して、リガンド結合を“レセプター
当り”を基本にして示した。非刺激αVβ3-M21-L細胞はαVβ3-CHO細胞よりも
有意に多くのaPBを結合した(P<0.01)。この差異は、抗体AP5でαVβ3を更
に活性化した後でさえ、維持された(P<0.05)(図4)。同様の結果が、αVβ
3-M21-L細胞の代わりにαVβ3-CS-1で、およびaPBの代わりにWOW-1 Fabで得
られた。非刺激JYリンパ芽球およびαVβ3-CHO細胞へのWOW-1 Fabの結合にお
いて観察される著しい変化と一緒にして(図3Bおよび表1)、これらの結果はαV β3の基底活性が細胞型で変化することを示す。
【0064】 インテグリン細胞質テイルは、幾つかのインテグリンの親和性/-親和力調整
に寄与しているが(Hemler, M. E. (1998) Current Opinion in Cell Biology 10
, 578-585)、αVβ3に対するリガンド結合の調節におけるそれらの役割に関す
る直接の情報はない。β3(D723R)のようなβ3細胞質テイルのある点変異また
は切断が、CHO細胞におけるαIIbβ3の構造的活性化をもたらす(O'Toole, T. E
., Katagiri, Y., Faull, R. J., Peter, K., Tamura, R., Quaranta, V., Loft
us, J. C., Shattil, S. J., and Ginsberg, M. H. (1994) Cell Biol. 124, 10
47-1059; Hughes, P. E., Diaz-Gonzalez, F., Leong, L., Wu, C. Y., McDonal
d, J. A., Shattil, S. J., and Ginsberg, M. H. (1996) J. Biol. Chem. 271,
6571-6547)。αVβ3がこのような調整により作用されるかを決定するために、
αVβ3(D723R)評価した。この変異体はCHO細胞中で野生型αVβ3とほぼ同じレ
ベルに安定に発現された(図5A)。しかし、非刺激αVβ3(D723R)-CHO細胞は非
刺激αVβ3-CHO細胞よりも有意によりaPBに結合し(P<0.01)、AP5で処置し
たαVβ3-CHO細胞に結合するaPBの量と同等であった(図5B)。第2αVβ3(D72
3R)クローンは同じ結果となり、類似の結果が、WOW-1 FabをaPBの代わりに使用
して得られた。したがって、β3細胞質テイルにおける構造的変化は、αVβ3
の細胞外ドメインに伝達され、リガンド結合親和性に影響し得る。
に寄与しているが(Hemler, M. E. (1998) Current Opinion in Cell Biology 10
, 578-585)、αVβ3に対するリガンド結合の調節におけるそれらの役割に関す
る直接の情報はない。β3(D723R)のようなβ3細胞質テイルのある点変異また
は切断が、CHO細胞におけるαIIbβ3の構造的活性化をもたらす(O'Toole, T. E
., Katagiri, Y., Faull, R. J., Peter, K., Tamura, R., Quaranta, V., Loft
us, J. C., Shattil, S. J., and Ginsberg, M. H. (1994) Cell Biol. 124, 10
47-1059; Hughes, P. E., Diaz-Gonzalez, F., Leong, L., Wu, C. Y., McDonal
d, J. A., Shattil, S. J., and Ginsberg, M. H. (1996) J. Biol. Chem. 271,
6571-6547)。αVβ3がこのような調整により作用されるかを決定するために、
αVβ3(D723R)評価した。この変異体はCHO細胞中で野生型αVβ3とほぼ同じレ
ベルに安定に発現された(図5A)。しかし、非刺激αVβ3(D723R)-CHO細胞は非
刺激αVβ3-CHO細胞よりも有意によりaPBに結合し(P<0.01)、AP5で処置し
たαVβ3-CHO細胞に結合するaPBの量と同等であった(図5B)。第2αVβ3(D72
3R)クローンは同じ結果となり、類似の結果が、WOW-1 FabをaPBの代わりに使用
して得られた。したがって、β3細胞質テイルにおける構造的変化は、αVβ3
の細胞外ドメインに伝達され、リガンド結合親和性に影響し得る。
【0065】 αIIbβ3およびα5β1のようなあるインテグリンの活性状態は、単離β3
またはβ1細胞質テイルの過発現により優勢阻害形態で抑制できるが、α5テイ
ルによってはされない(LaFlamme, S. E., Thomas, L. A., Yamada, S. S., and
Yamada, K. M. (1994) J. Cell. Biol. 126, 1287-1298; Chen, Y.-P., O'Toole
, T. E., Shipley, T., Forsyth, J., LaFlamme, S. E., Yamada, K. M., Shatt
il. S. J. and Ginsberg, M. H. (1994) J. Biol. Chem. 269, 18307-18310; Ka
shiwagi, H., Schwartz, M. A., Eigenthaler, M. A., Davis, K. A., Davis, K
. A., Ginsberg, M. H., and Shattil, S. J. (1997) J. Cell. Biol. 137, 143
3-1443)。αVβ3がこのタイプの抑制に付されるかを測定するために、原形質膜
の付近にテイルを標的とするために使用したIL2レセプターのTacサブユニット
の細胞外および経膜ドメインにN−末端で融合したβ3、β1またはα5細胞質
テイルを含むキメラ構築物で、αVβ3-CS-1細胞を一過性にトランスフェクトし
た。キメラの発現の類似のレベルにもかかわらず、Tac−α5と比較した場合、T
ac−β3およびTac−β1はaPbおよびWOW-1 Fabの特異的結合における有意なを
もたらした(P<0.01)(図6A、B)。対照的に、これらのテイルキメラのいずれ
もαVβ3の表面発現に影響しなかった(図6C)。単離βテイルが、通常インテグ
リンと相互作用する結合タンパク質であるため(LaFlamme, S. E., Thomas, L. A
., Yamada, S. S., and Yamada, K. M. (1994) J. Cell Biol. 126, 1287-1298)
、これらの結果はαVβ3が細胞内タンパク質との相互作用により直接調節され
得ることを示す。
またはβ1細胞質テイルの過発現により優勢阻害形態で抑制できるが、α5テイ
ルによってはされない(LaFlamme, S. E., Thomas, L. A., Yamada, S. S., and
Yamada, K. M. (1994) J. Cell. Biol. 126, 1287-1298; Chen, Y.-P., O'Toole
, T. E., Shipley, T., Forsyth, J., LaFlamme, S. E., Yamada, K. M., Shatt
il. S. J. and Ginsberg, M. H. (1994) J. Biol. Chem. 269, 18307-18310; Ka
shiwagi, H., Schwartz, M. A., Eigenthaler, M. A., Davis, K. A., Davis, K
. A., Ginsberg, M. H., and Shattil, S. J. (1997) J. Cell. Biol. 137, 143
3-1443)。αVβ3がこのタイプの抑制に付されるかを測定するために、原形質膜
の付近にテイルを標的とするために使用したIL2レセプターのTacサブユニット
の細胞外および経膜ドメインにN−末端で融合したβ3、β1またはα5細胞質
テイルを含むキメラ構築物で、αVβ3-CS-1細胞を一過性にトランスフェクトし
た。キメラの発現の類似のレベルにもかかわらず、Tac−α5と比較した場合、T
ac−β3およびTac−β1はaPbおよびWOW-1 Fabの特異的結合における有意なを
もたらした(P<0.01)(図6A、B)。対照的に、これらのテイルキメラのいずれ
もαVβ3の表面発現に影響しなかった(図6C)。単離βテイルが、通常インテグ
リンと相互作用する結合タンパク質であるため(LaFlamme, S. E., Thomas, L. A
., Yamada, S. S., and Yamada, K. M. (1994) J. Cell Biol. 126, 1287-1298)
、これらの結果はαVβ3が細胞内タンパク質との相互作用により直接調節され
得ることを示す。
【0066】 実施例10:αVβ3の親和性調整における機能的結果 レセプター親和性における変化がαVβ3の接着機能に影響するかを測定する
ために、αVβ3-CHOの固定化ペントンベースへの結合を定量した。接着はペン
トンベースのコーティング濃度に依存し、30−40ng/ウェルで最大の半分で
あった(図7)。αVβ3のAP5による活性化は、用量応答曲線の7倍の左側シフト
を導き、最大の半分の接着が、約5ngのペントンベース/ウェルで起こった。細
胞の1mM CaCl2での処理は、αVβ3により深い影響を誘導するか、更なるαV インテグリンを活性化するため、用量依存曲線のより更なるシフトをもたらした
(図7)。光顕微鏡による接着細胞の分析は、それらが90分で完全な拡散となる
ことを示した。したがって、αVβ3の調整は、細胞接着および、細胞拡散のよ
うなリガンド後結合応答の両方を促進する。
ために、αVβ3-CHOの固定化ペントンベースへの結合を定量した。接着はペン
トンベースのコーティング濃度に依存し、30−40ng/ウェルで最大の半分で
あった(図7)。αVβ3のAP5による活性化は、用量応答曲線の7倍の左側シフト
を導き、最大の半分の接着が、約5ngのペントンベース/ウェルで起こった。細
胞の1mM CaCl2での処理は、αVβ3により深い影響を誘導するか、更なるαV インテグリンを活性化するため、用量依存曲線のより更なるシフトをもたらした
(図7)。光顕微鏡による接着細胞の分析は、それらが90分で完全な拡散となる
ことを示した。したがって、αVβ3の調整は、細胞接着および、細胞拡散のよ
うなリガンド後結合応答の両方を促進する。
【0067】 アデノウイルスは、細胞内に入るのにαVインテグリンを使用し、一般的な遺
伝子送達ベクターである。したがって、我々は、αVβ3親和性における変化が
、アデノウイルス介在遺伝子移入に影響するかを試験した。GFPをコードするcDN
Aを含む組換えアデノウイルスをCS-1メラノーマ細胞と、50および500のm.o
.i.でインキュベートし、続くGFPの細胞外発現を、感染および遺伝子移入のマー
カーとして取った。CS-1細胞は、それらがαVβ5を発現せず、したがって、安
定に発現されたαVβ3を介したアデノウイルス内在化を制限する可能性がある
ために、選択した。αVβ3なしの親細胞をウイルスと60分インキュベートし
、感染72時間後にモニターしたとき、それらは相対的に低いレベルのGFP発現
を示した。非刺激αVβ3-CS-1細胞は、高いレベルのGFPはt現を、特に高いm.o.
i.で示した(図8A)。しかし、αVβ3-CS-1細胞とウイルスのインキュベーショ
ンを2.5mM MnCl2の存在下で行い、αVβ3を活性化した場合、細胞は低m.o.
i.でGFP発現のより大きな増加を示した(P<0.01)(図8AおよびB、左側の最初
の3つの棒)。MnCl2は親CS-1細胞でGFP発現に効果を有しなかった。活性化αV
β3を含む細胞における促進されたGFP発現は、細胞を、ウイルスの添加前に過
剰のWOW-1 Fab(1.7μM)とプレインキュベートした場合、遮断される(図8B、
左から4番目の棒)。このように、アデノウイルス介在遺伝子移入は、αVβ3の
親和性調整により直接影響される。
伝子送達ベクターである。したがって、我々は、αVβ3親和性における変化が
、アデノウイルス介在遺伝子移入に影響するかを試験した。GFPをコードするcDN
Aを含む組換えアデノウイルスをCS-1メラノーマ細胞と、50および500のm.o
.i.でインキュベートし、続くGFPの細胞外発現を、感染および遺伝子移入のマー
カーとして取った。CS-1細胞は、それらがαVβ5を発現せず、したがって、安
定に発現されたαVβ3を介したアデノウイルス内在化を制限する可能性がある
ために、選択した。αVβ3なしの親細胞をウイルスと60分インキュベートし
、感染72時間後にモニターしたとき、それらは相対的に低いレベルのGFP発現
を示した。非刺激αVβ3-CS-1細胞は、高いレベルのGFPはt現を、特に高いm.o.
i.で示した(図8A)。しかし、αVβ3-CS-1細胞とウイルスのインキュベーショ
ンを2.5mM MnCl2の存在下で行い、αVβ3を活性化した場合、細胞は低m.o.
i.でGFP発現のより大きな増加を示した(P<0.01)(図8AおよびB、左側の最初
の3つの棒)。MnCl2は親CS-1細胞でGFP発現に効果を有しなかった。活性化αV
β3を含む細胞における促進されたGFP発現は、細胞を、ウイルスの添加前に過
剰のWOW-1 Fab(1.7μM)とプレインキュベートした場合、遮断される(図8B、
左から4番目の棒)。このように、アデノウイルス介在遺伝子移入は、αVβ3の
親和性調整により直接影響される。
【0068】 使用した略語:RGD、アミノ酸Arg、GlyおよびAspの一文字標記;aPB、Alexa-ペ
ントンベース;GFP、緑色蛍光タンパク質;m.o.i.、感染効率
ントンベース;GFP、緑色蛍光タンパク質;m.o.i.、感染効率
【配列表】
【図1】 可溶性Alexa−ペントンベースおよびWOW-1 Fabの、αVβ3を発
現する細胞への結合。
現する細胞への結合。
【図2】 aPBおよびWOW-1 FabのαVβ3−CHO細胞への結合におけるイン
テグリン阻害剤の効果。
テグリン阻害剤の効果。
【図3】 αVβ3は、インサイドアウトシグナルによる親和性調整に感受
性である。
性である。
【図4】 αVβ3−CHO細胞およびαVβ3-M21-Lメラノーマ細胞へのaPB結
合の比較。
合の比較。
【図5】 ペントンベースのαVβ3への結合におけるβ3インテグリン細
胞質テイルにおける変異の活性化の効果。
胞質テイルにおける変異の活性化の効果。
【図6】 αVβ3を発現するCS-1メラノーマに結合するリガンドにおける
単離インテグリン細胞質テイルの過発現の効果。
単離インテグリン細胞質テイルの過発現の効果。
【図7】 αVβ3−CHO細胞のペントンベースへの接着におけるαVβ3活
性化の効果。
性化の効果。
【図8】 アデノウイルス介在遺伝子送達におけるαVβ3発現および活性
化の効果。
化の効果。
【手続補正書】特許協力条約第34条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成12年12月11日(2000.12.11)
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) A61K 39/395 A61K 45/00 4H045 45/00 48/00 48/00 A61P 9/00 A61P 9/00 27/00 27/00 29/00 29/00 101 101 35/00 35/00 C07K 16/28 C07K 16/28 G01N 33/53 D C12N 15/09 ZNA C12N 15/00 ZNAA G01N 33/53 A61K 37/02 (81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY, DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,ML, MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,K E,LS,MW,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZW ),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU, TJ,TM),AE,AL,AM,AT,AU,AZ, BA,BB,BG,BR,BY,CA,CH,CN,C R,CU,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,GB ,GD,GE,GH,GM,HR,HU,ID,IL, IN,IS,JP,KE,KG,KP,KR,KZ,L C,LK,LR,LS,LT,LU,LV,MA,MD ,MG,MK,MN,MW,MX,NO,NZ,PL, PT,RO,RU,SD,SE,SG,SI,SK,S L,TJ,TM,TR,TT,TZ,UA,UG,UZ ,VN,YU,ZA,ZW (72)発明者 グレン・ロバート・ネメロー アメリカ合衆国92024カリフォルニア州エ ンシニタス、セロ・ストリート462番 (72)発明者 羽藤 高明 愛媛県松山市鷹子町520−1−602 (72)発明者 ドウェイン・ギャリー・スタパック アメリカ合衆国92129カリフォルニア州サ ンディエゴ、ナンバー102、ツイン・トレ イルズ・ドライブ9374番 (72)発明者 ニサー・アーマド・パムポリ アメリカ合衆国92129カリフォルニア州サ ンディエゴ、ペナスクイトス・コート 14702番 Fターム(参考) 4B024 AA01 AA11 BA61 BA63 DA02 EA04 GA23 HA14 4C084 AA02 AA17 BA01 BA02 BA22 CA53 NA14 ZA332 ZA362 ZB112 ZB152 ZB262 4C085 AA13 AA14 BB41 DD62 4C086 AA01 AA02 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA33 ZA36 ZB11 ZB15 ZB26 4C087 AA01 AA02 BC83 NA14 ZA33 ZA36 ZB11 ZB15 ZB26 4H045 AA11 AA30 BA41 CA40 DA50 DA76 EA20 EA50 FA74
Claims (24)
- 【請求項1】 (a)活性化ビトロネクチンレセプターαVβ3と結合するリ
ガンドとαVβ3を含む組織を混合し、結合反応混合物を形成させる; (b)混合物を、リガンドがαVβ3に結合し、リガンド−αVβ3複合体を形成す
るのに十分な、結合反応と一致した時間、温度および生理学的環境パラメーター
を含む条件下に維持する;そして (c)リガンド−αVβ3複合体の存在を、そしてそれにより組織に存在するαVβ
3を測定する ことを含む、組織中の活性化ビトロネクチンレセプターの存在の検出法。 - 【請求項2】 リガンドがアデノウイルス−2ペントンベースおよび活性化
αVβ3と免疫反応する抗体からなる群から選択される、請求項1記載の方法
。 - 【請求項3】 該リガンドがFab抗体WOW-1である、請求項2記載の抗体。
- 【請求項4】 該リガンドが標識を含み、段階(c)の決定が、該複合体にお
ける該ラベルの存在の検出を含む、請求項1から3のいずれかに記載の方法。 - 【請求項5】 該組織が新血管細胞、平滑筋内皮細胞、動脈細胞、破骨細胞
および腫瘍細胞を含む、請求項1から4のいずれかに記載の方法。 - 【請求項6】 (a)αVβ3含有組織を、有効量の活性化αVβ3と結合する
リガンドを含む治療組成物と接触させ、ここでリガンドは薬剤に機能可能に結合
しており、薬剤は治療的活性を有する; (b)リガンドが組織中に存在する活性化αVβ3と結合するのに十分な条件下で、
該治療組成物の組織との接触を維持させ、それにより薬剤を組織に送達させる 段階を含む、活性化ビトロネクチンレセプター含有組織への治療組成物内の薬剤
の送達法。 - 【請求項7】 該接触が該組織と該治療用組成物の間でエキソビボで行われ
る、請求項6記載の方法。 - 【請求項8】 該接触が該組織と該治療用組成物の間でインビボで行われる
、請求項7記載の方法。 - 【請求項9】 該リガンドがアデノウイルス−2ペントンベース、活性化α V β3に結合するペントンベースフラグメント、および活性化αVβ3と免疫反応
する抗体からなる群から選択される、請求項6から8のいずれかに記載の方法。 - 【請求項10】 該リガンドがFab抗体WOW-1である、請求項9記載の方法。
- 【請求項11】 該薬剤が生物学的活性化合物である、請求項6から10の
いずれかに記載の方法。 - 【請求項12】 該薬剤が遺伝子、アンチセンス核酸および触媒的核酸から
なる群から選択される核酸である、請求項11記載の方法。 - 【請求項13】 該組織が新血管細胞、平滑筋内皮細胞、動脈細胞、破骨細
胞および腫瘍細胞を含む、請求項6から12のいずれかに記載の方法。 - 【請求項14】 活性化ビトロネクチンレセプターαVβ3と免疫反応する
、単離抗体分子。 - 【請求項15】 該抗体がFab、Fd、Fv、scFvフラグメントまたはそのまま
の免疫グロブリン分子である、請求項14記載の抗体。 - 【請求項16】 該抗体が活性化αVβ3と結合するペントンベースフラグ
メントを含む、請求項14または15記載の抗体。 - 【請求項17】 該抗体が多価アデノウイルスペントンベース由来の一つの
αVインテグリン結合ドメインを含む、請求項14から16のいずれかに記載の
抗体。 - 【請求項18】 該抗体が配列番号8または配列番号10に記載のアミノ酸
残基配列を含む、請求項14から17のいずれかに記載の抗体。 - 【請求項19】 該抗体がFab WOW-1である、請求項18記載の抗体。
- 【請求項20】 融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を発現でき
る発現カセットを含み、該融合タンパク質が生物学的活性剤と機能可能に結合し
たαVβ3特異的リガンドを含む、核酸発現ベクター。 - 【請求項21】 該リガンドがアデノウイルス−2ペントンベース、活性化
αVβ3に結合するペントンベースフラグメント、および活性化αVβ3と免疫反
応する抗体からなる群から選択される、請求項20記載のベクター。 - 【請求項22】 該リガンドがアデノウイルスタイプ2ペントンベース由来
のαVインテグリン結合ドメインである、請求項21記載のベクター。 - 【請求項23】 該リガンドがFab WOW-1のCDR3ドメインを含む、請求項2
1記載のベクター。 - 【請求項24】 該リガンドがFab WOW-1のαVβ3結合ドメインを含む、
請求項21記載のベクター。
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US60/110,950 | 1998-12-04 | ||
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US60/145,458 | 1999-07-23 | ||
PCT/EP1999/009460 WO2000034780A2 (en) | 1998-12-04 | 1999-12-03 | METHODS AND COMPOSITIONS USEFUL FOR TARGETING ACTIVATED VITRONECTIN RECEPTOR αvβ¿3? |
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