WO2005007800A2

WO2005007800A2 - 抗血小板膜糖蛋白質ⅵモノクローナル抗体

Info

Publication number: WO2005007800A2
Application number: PCT/JP2004/010596
Authority: WO
Inventors: Hiroshi Takayama; Kamon Shirakawa; Tooru Yamakawa; Tetsushi Kawahara
Original assignee: Mochida Pharm Co Ltd; Hiroshi Takayama; Kamon Shirakawa; Tooru Yamakawa; Tetsushi Kawahara
Priority date: 2003-07-18
Filing date: 2004-07-20
Publication date: 2005-01-27
Also published as: CN1852981A; EP1647596A2; JPWO2005007800A1; CN100558895C; EP1647596A4; WO2005007800A3; US20070025992A1; CA2532781A1

Description

明細書抗血小板膜糖蛋白質 VIモノク口一ナル抗体技術分野

本発明は、ヒト血小板膜糖蛋白質 VI (以下、 GPVI と略称することがある）に対する抗体および該抗体を産生する細胞に関するものである。背景技術

血小板は血液凝固 ·生体防御において極めて重要な役割を担っており、生理的な役割から種々の病態における関わりが解明されつつある。特に、血小板は止血血栓を形成するという機能においても注目されており、例えば、血管内皮細胞が損傷を受けると、血管内皮下の主要なマトリックス蛋白質であるコラーゲンが露出し、ここへ血小板が粘着する。次に、コラーゲンからのシグナルにより血小板が活性化され、最終的にはフイブリノ一ゲンを介して血小板が凝集する。そして場合によってはこれが血栓塞栓性疾患のような病的状態の原因となることから治療の標的として注目されている。

従来、血小板凝集に基づく血栓症の治療 ·予防の目的で、アスピリン、チクロビジン、 G P II b / I II aアン夕ゴニス卜等の抗血小板薬が用いられてきたが、有効性および出血等の副作用の面から多くの問題が指摘されており、これらの問題の無い、十分な安全性、および確実かつ適切な作用を有する優れた抗血小板薬の登場が望まれている。

血小板膜上に存在する GPVIは、血小板のコラーゲン受容体であり、コラーゲン刺激による血小板の活性化に中心的役割を担っていることが明らかにされている (非特許文献 1 ：高山博史，日本血栓止血学会誌， 2 0 0 3年，第 1 4巻，第 2 号， p . 7 5— 8 1参照）。すなわち、スギヤマらは自己免疫性血小板減少患者の血小板では 6 2 k D aの膜蛋白質が特異的に欠損しており、コラーゲンによる血小板凝集が認められないこと（非特許文献 2 ：タテオ 'スギヤマ（Tateo Sugiyama) 、外 5名，ブラッド（Blood) ，（米国）， 1 9 8 7年，第 6 9巻，第 6号， p. 1712— 1720参照）、さらに、この患者の血小板で欠損していた蛋白が GPVIであり、患者の血清より精製した抗体の Fab断片がコラーゲン惹起血小板凝集を抑制することを報告している（非特許文献 2および非特許文献 3 ：マサアキ ·モロイ (Masaaki Moroi) 、外 3名，ジャーナル ·ォブ ·クリニカル ·インべスティゲーシヨン（Journal of Clinical Investigation) , (米国）， 1989年，第 84巻，第 5号， ρ.· 1440— 1445参照）。

これまでに自己免疫疾患患者由来の抗ヒト GPVI自己抗体は、スギヤマら（非特許文献 2参照）やタカハシら (非特許文献 4参照) が報告している。しかしながら、スギヤマらの報告では患者血漿を精製した抗ヒト GPVI自己抗体には血小 f反凝集を惹起する作用があり、直ちに医薬応用はできない。非特許文献 4 (ホウュゥ ·タカハシ (Hoyu Takahas i) 、外 1名, アメリカン ·ジャーナル ·ォブ ·へマトロジー（American Journal of Hematology) , (米国）， 2001年，第 6 7巻，第 4号， p. 262 - 267) には、 GPVIと推測される約 62kDaの蛋白に対する自己抗体の存在、及び、この抗体が血小板凝集を惹起することが記載され： Cいる。また、これらの患者由来の抗 GPVI抗体を医薬として臨床応用するためには安全性の高い抗体を安定した品質で大量に生産する必要があるが、工業的に生産する方法は未だ確立されていない。

現在までに作製されている抗 GPVI抗体として、マウス GPVIに対するモノクロ一ナルラッ卜抗体（特許文献 1 ：欧州特許出願公開公報第 1228768号参照）、およびヒト GPVIに対するモノクローナルマウス抗体がある（特許文献 2 ：国際特許出願公開公報第 01/00810号および特許文献 3 ：国際特許出願公開公報第 02/080968号参照、 T romb Haemost. 2003 Jim ;89 (6) :996-1003) 。これらは、非ヒト動物由来の抗体であり、ヒトに投与した場合、高度な免疫原性 ( 「抗原性」という場合もある）を有するために副作用が危惧され、該抗体をそのままヒトに投与することは不適当であり、ヒトに投与する抗体は純粋にヒト由来のヒト抗体であることが求められている。

また、ヒト GPVIを認識するヒトー本鎖抗体（scFv： single chain Fv) がファージディスプレー法等を用いて作製されている（特許文献 2、特許文献 3、および非特許文献 5 ：ピーター · A ·スメサ一スト（Peter A Smet urst) 、外 15 T JP2004/010596

名、ブラッド（Blood) , (米国）， 2 0 0 2年，第 1 0 0巻，第 1 1号， p . 4 7 4 a参照）。これらの一本鎖抗体はヒ卜抗体の VHと V Lをペプチドリンカ —で結合させたものであり、ヒ卜由来の可変領域を有する抗体であるが、細胞が産生する通常のィムノグロブリンに比べると、一般的に抗原への親和性が低く、生体内での半減期も短い。

C D R (相補性決定領域）移植等によるヒト化抗体の作製方法は公知であるが、 C D Rのアミノ酸配列および多くの場合にはフレームワーク領域（F R) の一部が非ヒト動物抗体由来であり、抗体のアミノ酸配列のすべてがヒ卜由来ではないために、投与した抗体に対する抗体が生体内で産生される可能性が指摘されてお . り、免疫原性の面から医薬として有効でかつ安全なものとは言えない。ヒト抗体の作製について複数の報告があるが、いずれの報告の方法も種々の問題点を有し、あらゆる抗原に適用可能な一般化された方法であるとは認識されていないのが現状であり、一般的に高力価のヒト抗体を取得することは困難である。発明の開示

このように抗血小板薬として、安全性が高く、有効性が優れ、かつ使いやすい薬剤が求められている状況において、ヒ卜に投与可能な、純粋にヒト由来の抗

GPVI抗体が切望されている。

本発明の目的は、ヒト血小板膜上に存在する糖蛋白質である GPVI に特異的に結合する新規な抗体、好ましくはモノクローナル抗体を提供するものである。特にヒトに投与可能で、有効でかつ副作用の点で問題のない、純粋にヒト由来である抗 GPVI ヒト抗体を提供するものである。また、ヒト GPVI に特異的に結合し新規な C D R配列を含有する抗体を提供するものである。

さらに、これらの抗体を産生する細胞、具体的には特定のハイプリドーマを提供するものである。

本発明者らは、上記の課題を解決すべく、 GPVI に対する自己抗体を産生するヒ卜のリンパ球を出発材料として、 GPVIを介する血小板凝集を効果的に抑制するヒト抗体の取得を着想した。この着想に基づき、鋭意研究を重ねた結果、末梢血リンパ球を特定の条件の体外免疫法（in vitro immunization) で活性化し、マウスミエ口一マ細胞とのハイプリドーマを作製したところ、複数のハイプリド —マから、 GPVI との結合能を有し、コラーゲンによる血小板凝集を抑制する活性を有する抗体を産生するハイプリドーマを得ることに成功した。そして、当該クローンを単離し、さらに検討,を重ねた結果、該抗体をコードする遺伝子を得ることに成功し、この抗体の C D Rのアミノ酸配列が新規の配列であることを明らかにした。さらに、遺伝子組換技術により組換抗体を作製し、本発明を完成した。なお、本明細書においては、ハイプリドーマ（例えば、クローン # 2 _ 6 ) が産生する抗体を # 2 _ 6抗体と、また、該ハイブリドーマの抗体遺伝子から遺伝子工学的に組み換えた抗体を R# 2— 6抗体のように記載することがある。

'本発明の第 1の態様は、ヒト G PVI に特異的に結合するヒト抗体、好ましくはモノクローナル抗体 (以下抗ヒト G PVI抗体及びヒト G PVIモノクローナルヒト抗体と各々記載することがある）またはその活性断片であり、好ましくは、単独ではヒト血小棱凝集を惹起しない抗体また'はその活性断片である。具体的には、

( 1 ) ヒト G PVI と特異的に結合し、生体内に投与することでコラーゲンに ^るヒト血小板の凝集を抑制するヒト抗体またはその活性断片で、好ましくは、該抗体または活性断片を生体内へ投与した後に血液中より単離した血小板について、コラーゲンにより惹起される凝集能が通常の血小板に比べて低下あるいは認められないもの、

( 2 ) ヒ卜 G P VIと特異的に結合し、血小板上の G PVIとコラーゲンとの結合を特異的に阻害する、血小板上の機能的な G PVI を消失させる、あるいは、予めヒト血小板と接触させることによりコラーゲンによるヒト血小板の凝集を抑制する、すなわち、ヒト血小板がコラーゲンに応答して凝集する能力を低下もしくは欠如させる、いずれか一つ以上の作用を持つヒト抗体またはその活性断片、 ( 3 ) 血小板上のヒト G P VI を該血小板の細胞内に取り込ませる

(internalize) 、もしくは、切断することによりコラーゲンによるヒト血小板の凝集を抑制する、前記（1 ) ないし（2 ) の抗体またはその活性断片である。前記（1 ) ないし（3 ) の抗体は、単独ではヒト血小板凝集を惹起しない、及び Zまたは、生体内に投与した場合、血小板減少を引き起こさない抗体が好ましレ^ 好適な例として、クローン # 2— 6または # 2— 4のハイブリドーマが産生する抗体またはそれをヒト I g G、より好ましくはヒト I g G 4に組み替えた抗体が挙げられる。また、本発明の抗体は、ヒト G PVI と抗体との解離定数（K d値）が好ましくは ΙΟΟηΜ以下、より好ましくは 50nM以下の抗体である。本発明の抗体の活性断片とは、 GPVI との結合能を有する限りにおいて、例えば、 Fab (Fragment of antigen binding) 、 Fab\ F(ab')2、ー条貝体 (scFv) 、ジスルフィド安定化抗体 (dsFv) 、 CDRを含むぺプチド等である。

また、具体的には、

( 4 ) ヒト G PVI に特異的に結合し、コラーゲンによるヒト血小板の凝集を特異的に抑制するがトロンビンによる凝集は抑制せず、単独ではヒト血小板凝桌を惹起しないヒト抗体またはその活性断片である。該抗体は、コラーゲンによるヒト血小板の凝集を抑制する濃度または用量と同等、好ましくは 1 0倍、より好ましくは 1 0 0倍、さらに好ましくは 1 0 0 0倍において、単独ではヒト血小板凝集を有意に惹起しない抗体またはその活性断片である。

ここで前記 ( 1 ) ないし ( 4 ) の抗体のうち、ヒ卜 G PVI とコラーゲンとの合を阻害する抗体は、好ましくは ΙΟηΜ以下、より好ましくは InM以下、さらに好ましくは O.lnM以下の解離定数（K d値）でヒト GPVIとコラーゲンとの結合を阻害する抗体である。

本発明の抗体は必ずしも特定のクローンに限定されるものではなく、本発明の好ましい例（# 2— 6、 # 2—4、 R # 2— 6または R # 2— 4抗体等）と同様の作用を有する抗体は本発明の範囲に包含される。本発明の抗体の作用の有無は実施例に示される方法または公知の方法によつて確認し得る。

また、本発明の好ましい抗体と G PVI上の結合部位もしくはェピト一プが同一か少なくとも部分的に共通である抗体、例えば、 GPVI との結合において互いに競合する関係にある抗体は本発明の範囲に包含される。本発明の抗体との結合部位の共通性の有無は実施例に記載の方法に準じて、または公知の方法によって確認し得る。

本発明の第 2の態様は、新規な C D Rアミノ酸配列または可変領域アミノ酸配列を含有する抗ヒト G PVI抗体であり、好ましくはモノクローナル抗体である。具体的には、

( 5 ) 少なくとも抗体の H鎖または L鎖の一方の 3.組の C D R、好ましくは抗体の H鎖および L鎖両方の 6組の C D尺が、表 4に記載のクロ一ン、好ましくはクロ一ン# 2— 6および # 2— 4からなる群から選択される何れかのハイブリド —マが産生する抗体の C D Rのアミノ酸配列を、それぞれ対応する C D Rのアミノ酸配列として含有する抗ヒ卜 G P V I抗体またはその活性断片、

( 6 ) 配列番号 4 7のアミノ酸配列を VH CDR1 に、配列番号 4 8のァミノ酸配列を VH CDR2に、配列番号 4 9のアミノ酸配列を VHCDR3に、配列番号 9 8のアミノ酸配列を VLCDR1 に、配列番号 9 9のアミノ酸配列を VLCDR2 、配列番号 1 0 0のアミノ酸配列を VLCDR3に、それぞれ含有する抗体もしくはその活性断片、または配列番号 7のアミノ酸配列を VH CD 1 に、配列番号 8のアミノ酸配列を VH CDR2に、配列番号 9のァミノ酸配列を VHCDR3に、配列番号 1 0のアミノ酸配列を VLCDR1 に、配列番号 1 1のアミノ酸配列を VLCDE2 に、配列番号 1 2のアミノ酸配列を VLCDR3 に、それぞれ含有する抗体もしくはその活性断片、

( 7 ) 少なくとも抗体の H鎖または L鎖の可変領域、好ましくは抗体の H鎖および L鎖両方の可変領域が、表 4に記載のクローン、好ましくはクローン # 2— 6および # 2—4からなる群から選択される何れかのハイプリドーマが産生する抗体が有する可変領域のアミノ酸配列を、それぞれ対応する可変領域のアミノ酸配列として含有するヒト G P V I抗体またはその活性断片、

( 8 ) 配列番号 1 4 3のアミノ酸配列を H鎖の可変領域に、配列番号 1 4 4のアミノ酸配列を L鎖の可変領域に、それぞれ含有する抗体もしくはその活性断片、または配列番号 1 5のアミノ酸配列を H鎖の可変領域に、配列番号 1 6のァミノ酸配列を L鎖の可変領域に、それぞれ含有する抗体もしくはその活性断片、

( 9 ) # 2— 6細胞または # 2— 4細胞が産生するモノクローナル抗体またはその活性断片である。

本発明の第 3の態様は、第 1または第 2の態様の抗体を産生する細胞である。具体的には、

( 1 0 ) 前記（1 ) ないし（9 ) に記載のいずれかの抗体を産生する形質転換細胞、

(11) #2— 6細胞または #2— 4細胞である、前記（10) 記載の細胞である。

本発明の第 4の態様は、第 1 ¾たは第 2の態様の抗体またはその活性断片の少なくとも H鎖または L鎖の一方の 3組の C D R好ましくは可変領域をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドまたは核酸である。具体的には、第 1または第 2の態様の抗体またはその活性断片をコ一ドするポリヌクレオチドであって、

(12) 少なくとも抗体の H鎖または L鎖の一方の 3組の CDR、好ましくは抗体の H鎖または L鎖の両方の 6組の CDRをコードする塩基配列として、表 4 記載のクロ一ン、好ましくはクローン #2— 6および 2— 4からなる群から選択される何れかのハイプリドーマの抗体の遺伝子においてそれぞれ対応する CD Rをコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチド、

(13) VH CDR1をコードする配列番号 147の塩基配列と、 VH CDR2をコードする配列番号 148の塩基配列と、 VH CDR3をコ一ドする配列番号 14 9の塩基配列と、 VL CDR1 をコードする配列番号 1 50の塩基配列と、 VL CDR2をコ一ドする配列番号 151の塩基配列と、 VL CDR3をコードする配列番号 152の塩基配列とを、それぞれ含有するポリヌクレオチド、または VH CDR1をコードする配列番号 23の塩基配列と、 VH CDR2をコードする配列番号 24の塩基配列と、 VH CDR3 をコードする配列番号 25の塩基配列と、 VL CDR1をコードする配列番号 26の塩基配列と、 VL CDR2をコードする配列番号 27の塩基配列と、 VL CDR3をコードする配列番号 28の塩基配列とを、それぞれ含有するポリヌクレオチド、

(14) 少なくとも抗体の H鎖または L鎖の可変領域、好ましくは抗体の H鎖および L鎖両方の可変領域として、表 4に記載のクローン、好ましくはクローン # 2— 6および # 2— 4からなる群から選択される何れかのハイプリド一マの抗体の遺伝子においてそれぞれ対応する可変領域をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチド、

(15) H鎖の可変領域をコードする配列番号 145の塩基配列と、 L鎖の可変領域をコードする配列番号 146の塩基配列とを含有するポリヌクレオチド、または H鎖の可変領域をコードする配列番号 31の塩基配列と、 L鎖の可変領域をコードする配列番号 32の塩基配列とを含有するポリヌクレオチドである。本発明の第 5の態様は、第 1または第 2の態様の抗体を製造する方法である。具体的には第 1または第 2の態樺の抗体を製造する方法であって、

(16) 前記（10) の細胞を培養する工程およ ^5、該細胞が産生するモノクローナル抗体を採取する工程を含む製造方法、

(17) 前記（11) の細胞を培養する工程および、該細胞が産生するモノクローナル抗体を採取する固定を含む製造方法、

(18) 第 4の態様のポリヌクレオチド、それを含有する発現ベクター、該ポリ'ヌクレオチドもしくは該発現ベクターを含有する細胞の何れかを用いる工程を含む製造方法である。

本発明の第 6の態様は、本件第 1または第 2の態様の抗体を有効成分として含有する医薬組成物に関するもので、好ましくは血栓性、塞栓性または動脈硬化性の疾患の予防およぴンまたは治療のための医薬組成物である。

本発明の第 7の態様は、本件第 1または第 2の態様の抗体を用いて試料中の GPVI を検出または定量することにより疾患の診断をする方法であって、好ましくは血液凝固異常に関連する疾患の診断をする方法である。

本発明の第 8の態様は、組換えヒト抗体、特に、組換えヒトーヒトキメラ抗体、具体的にはヒト抗体（例えば、 I gM抗体）を遺伝子工学的手法によって組み替えることにより、他のクラスのヒト抗体（例えば、 I gG抗体、特にヒト I g G4抗体）またはそれらをコードするポリヌクレオチドを製造する方法であって、例えばハイブリド一マが産生する抗体（例えば、ヒト I gM) をコードするポリヌクレオチドおよび公知のヒト抗体（例えば、 I gG4抗体）のポリヌクレオチドを遺伝子工学的手法によって組み替える工程を含む。該手法としては、ハイプリドーマの mRNAおよびまたはゲノム DNAを鏡型として用いた PCR法が挙げられ、具体的には実施例 9、好ましくは実施例 10記載の方法が挙げられる。実施例 10においては、ゲノム DNAを鐯型として複数のェクソンを PCR で増幅し、それら複数（I gGでは 4種類）の PCR増幅産物を混合して同時に PCRを実施することにより、簡便に目的の抗体をコ一ドするポリヌクレオチドを製造しうる。図面の簡単な説明

図 1は、 GPVI- Fc発現プラスミドである pCAGGS- GPVI- Fcの構築を示すフローチヤ一卜である。

図 2は、組換えウイルスを作製するためのトランスファーベクターのクローンである pYNG- GPVI- Fcの構築を示すフローチヤ一トである。

図 3は、抗 GPVIモノクローナルヒト抗体 1 8種類の結合活性を、 GPVI— F c との反応性により、 E L I S A法で測定した結果を示したグラフである。図 4 は kト末梢血より調製した血小板に組換抗 GPVIヒト抗体（R#2- 4および R#2- 6) ' が結合することを示すグラフである。

図 5は、各種ヒト IgG化 GPVI抗体の GPVI- hFcへの結合性を示すグラフである。発明を実施するための最良の形態

(構成）

本件発明の第 1の態様の抗体は、ヒト血小板上に存在する膜糖蛋白質である G P V Iを特異的に認識するものである。なお、本発明の抗体が認識する G PVIは必ずしも血小板上のものに限られず、例えば、巨核球の G PVIをも認識し得るものである。以下に、本発明をさらに詳しく説明する。

本発明の抗体は、モノクローナル抗体である。このモノクローナル抗体の作製方法には特定の方法に限らず、例えばハイプリドーマが産生したモノクロ一ナル抗体、抗体の遺伝子を組み込んだ組換え細胞が産生したモノクローナル抗体、または E B V (ェブスタイン ·バ一ウィルス）により形質転換した細胞が産生するモノクローナル抗体のいずれであってもよい。

ヒト抗体とは、可変領域全体および定常領域全体のいずれもがヒト由来のアミノ酸配列からなる抗体である。本発明のヒト抗体の作製方法は特定の方法に限らず、例えばヒトーヒトハイブリドーマが産生したヒト抗体、トランスジエニック動物が産生したヒト抗体、ヒト抗体の遺伝子を組み込んだ組換え細胞が産生したヒト抗体、 E B Vにより形質転換したヒト細胞が産生するヒト抗体、または自己抗体を産生するヒ卜のリンパ球を用いて作製したハイプリドーマが産生したヒト抗体のいずれであってもよい。

本発明の抗体はヒト GPVIと特異的に結合する抗体である。本発明の抗体はヒト G PVIと抗体との解離定数（K d.値）が好ましくは ΙΟΟηΜ以下、より好ましくは 50nM以下である。ヒ卜 GPVIと抗体との解離定数を測定する方法は特定の方法に限定されず、常法により行うことができる。例えば、チップ上に固定化した GPVI - Fcを用いて B I A C O R E 3 0 0 0のような蛋白質相互作用解析装置により測定することができる。具体的には、実施例 7に示されている。

本発明の抗体はコラーゲンによるヒト血小板の凝集を抑制する作用を有するも. のである。ここで、血小板凝集は公知の方法で測定し得るが、例えば、血小板凝集能測定装置等で光透過率を指標として凝集率を計算することにより測定でき、一般的には、光透過率が最大となる点の凝集率（以下、最大凝集率と称することがある）で表される。後述の実施例 6に記載された方法において、本発明の抗体は好ましくは lO g/mL以下、より好ましくは l g/mL以下、さらに好ましくは O. J g/mL以下の濃度で、最大凝集率を好ましくは対照の 50%以下に、より好ましくは対照の 30%以下に、さらに好ましくは対照の 20%以下に、最も好ましくは対照の 10%以下に減少させる。コラーゲンによるヒト血小板の凝集の抑制を測定する方法は上記の方法に限定されず、他の常法によっても行うことができる。また、実施例 6に記載された方法においてコラーゲン惹起ヒト血小板凝集を抑制する作用、すなわち直接的な作用の有無に係わらず、ヒト血小板がコラーゲンに応答して凝集する能力を低下ないしは欠除させることにより、間接的にコラーゲン惹起ヒト血小板凝集を抑制する作用を有する抗体が好ましい。例えば実施例 1 5 に記載された方法において、本発明の抗体は、例えば 3(Vg/mL以下、好ましくは l(^g/mL以下、より好ましくは l g/mL以下の濃度で、最大凝集率を好ましくは対照の 30%以下に、好ましくは対照の 10%以下に、より好ましくは対照の 5%以下に減少させる。

本発明の抗体は、好ましくは、コラーゲン以外の血小板凝集を惹起する物質、例えばトロンビンによる凝集は抑制せず、後述の実施例 6に記載された方法において、本発明の抗体は好ましくは 0. ^g/mL以上、より好ましくは l g/raL以上、 04 010596

11 さらに好ましくは l(Vg/mL以上、特に好ましくは lOO g/mLの抗体濃度で、最大凝集率が好ましくは対照の 80%以上、より好ましくは対照の 85%以上、さらに好ましくは対照の 90%以上、特に好ましくは対照の 95%以上である。コラーゲン以外の血小板凝集を惹起する物質によるヒト血小板の凝集の抑制を測定する方法は上記の方法に限定されず、他の常法によっても行うことができる。

本発明の抗体は抗体単独、すなわち血小板凝集を惹起させる物質の非存在下においてヒト血小板の凝集を促進または惹起せず、後述の実施例 6に記載された方法において、好ましくは 0.

以上、さらに好ましくは l(Vg/mL以上、特に好ましくは 10(Vg/mLの抗体濃度で、最大凝集率が好ましくは 2 0 %以下、より好ましくは 1 0 %以下である。抗体単独でのヒト血小板凝集を測定する方法は必ずしも限定されず、他の常法によっても行うことができる。また、例えば、全血、好ましくは抗トロンビン剤（アルガトロバン等）で処理した全血を用いて、間接的に血小板に対する影響を評価することもできる。実施例 1 4にその一例を示した。

„現在まで報告されているヒト GPVIに対する抗体のほとんどは、前記ヒト自己抗体を含めて、 in vi t roにおいて抗体単独で血小板を活性化させる作用、及び Zまたは、血小板凝集を惹起もしくは促進する作用を有することから、生体に投与した場合、血小板減少を引き起こす可能性力考えられる。 F a b断片等の形態では、血小板凝集を惹起しないものも報告されている力生体内においては、何らかの原因により F a bが架橋または凝集して、 I g G等と同様な挙動を示す可能性も完全には否定できない。よって、抗体の活性断片ではなく完全な抗体分子、例えば、 I g Gの形態でも、そのような作用を示さない、または、そのような作用が低い抗 GPVI抗体が好ましい。

また、生体内における動態及び安定性は、自然の形態である抗体分子、例えば、 I g G等が優れている。一般に、血中半減期は F a b等の断片に比べて I g Gの方が遥かに長く、特に、血栓症等の慢性的疾患や長期間の抗体投与が必要な病態においては、血中半減期の長い分子形態、特に I g Gが望ましい。

本発明の抗体は血小板上の GPVI とコラーゲンとの結合を特異的に阻害するものであってもよく、後述の実施例 7に記載された方法において、本発明の抗体は GPV Iとコラ一ゲンの結合を好ましくは 100 g/mL以下で、より好ましくは lOpg/mL以下、さらに好ましくは lpg/mL以下、特に好ましくは O.lpg/mL の濃度で 50%阻害する抗体である。コラーゲンと GP V Iとの結合を測定する方法は特定の方法に限定されず、，他の常法により行うことができる。

本発明の抗体は生体内に投与することで、コラーゲンによる血小板凝集を抑制する。本発明の抗体がコラーゲンによる血小板凝集を抑制する機序としては、（i) 血管内皮細胞傷害により露出したコラーゲンと血小板上に存在する GPV Iとの結合を本発明の抗体が阻害する、（ii)本発明の抗体をあらかじめ血小板表面上に存在する GP VIに結合させておきコラーゲンと結合できない状態にする、 (iii) 本発明の抗体が血小板及び Zまたは巨核球表面上の GPV Iと結合することで G P V Iを内部に取り込ませて（internalize) 、結果として血小板表面から G P V Iを消失させる、または (iv)本発明の抗体の有する活性により血小板及び Zまたは巨核球表面に存在する GPV Iを切断して結果として血小板表面から GPV Iを消失させる、等が考えられる。本発明のヒト抗体によるコラーゲンによる血小板凝集抑制の機序としては何れでも良いが、複数の機序を併せ持ってもよい。 -本発明の第 2の態様として、新規な C D Rァミノ酸配列または可変領域ァミノ酸配列を含有する抗ヒ卜 GPVIモノクローナル抗体がある。

抗体の重鎖および軽鎖の N末端側には可変領域が存在し、それぞれ重鎖可変領域（VH) 、軽鎖可変領域（VL) と呼ばれる。可変領域内には相補性決定領域 (complementarity determining region; CDR) が存在し、この部分が抗原認識の特異性を担っている。可変領域の CD R以外の部分は、 CDRの構造を保持する役割を有し、フレームワーク領域（FR) と呼ばれる。重鎖および軽鎖の C末端側には定常領域が存在し、それぞれ重鎖定常領域（CH) 、軽鎖定常領域（C L) と呼ばれる。

重鎖可変領域中には、第 1の相補性決定領域（CDR 1) 、第 2の相補性決定領域（CDR2) および第 3の相補性決定領域（CDR3) の 3つの相補性決定領域が存在する。重鎖可変領域中の 3つの相補性決定領域をまとめて重鎖相補性決定領域と呼ぶ。軽鎖可変領域中にも同様に、第 1の相補性決定領域（CDR 1) 、第 2の相補性決定領域（CDR2) および第 3の相補性決定領域（CDR 3 ) の 3つの相補性決定領域が存在する。軽鎖可変領域中の 3つの相補性決定領域をまとめて軽鎖相補性決定領域と呼ぶ。

本発明の抗体の C D R配列は必ずしも限定されないが、好ましくは VH CDR1 として配列番号 4 7のァミノ酸配列、 VH CDR2として配列番号 4 8のアミノ酸配列、 VH CDR3として配列番号 4 9のアミノ酸配列、 VL CDR1として配列番号 9 8のアミノ酸配列、 VL CDR2 として配列番号 9 9のアミノ酸配列または VL CDR3として配列番号 1 0 0のアミノ酸配列のうち、いずれか 1つ以上、好ましくは H鎖の 3つ、より好ましくは全てのァミノ酸配列を含有する抗体である。本発明の抗体の VHおよび V Lのアミノ酸配列は必ずしも限定されないが、好ましい抗体として、 VHとして配列番号 1 4 3のアミノ酸配列もしくは V Lとして配列番号 1 4 4のアミノ酸配列のいずれか 1つ以上を含有する抗体、または V Hとして配列番号 1 5のアミノ酸配列もしくは V Lとして配列番号 1 6のァミノ酸配列のいずれか 1つ以上を含有する抗体がある。

なお、本発明の抗体は必ずしも特定のアミノ酸配列のものに限定されず、その活性及びまたは抗原性に実質的に影響のない範囲で、本発明の抗体のアミノ酸配^ Jにおいて、例えば可変領域、特に F R部分において 1ないし数個のアミソ酸残基の付加、欠失、置換及び/または挿入が許容される。

本発明の抗体は、抗体の定常領域が好ましくはヒト抗体、より好ましくはヒト I g G、さらに好ましくはヒト I g G 4由来のアミノ酸配列からなる抗体である。本件発明の抗体は特定の分子種に必ずしも限定されるものではない。抗体、すなわち免疫グロブリンの構造は重鎖（H鎖）および軽鎖（L鎖）とからなり、重鎖のクラス（γ、 α、 μ、 δ、 ε) により 5つのイソタイプ（IgG、 IgA、 IgM、 IgD、 IgE) に分けられる。このうち IgGと IgAは重鎖の違い（例えばヒトの場合、 γ 1、 γ 2、 γ 3、 γ 4、 α 1、 α 2 ) からサブクラス（例えばヒトの場合 IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgAl、 IgA2) に分けられる。軽鎖は、 κ または λ のいずれかのタイプに分類される。本発明の抗体はクラス、サブタイプまたはイソタイプは限定されず、いずれに分類されるものでもあってもよい。好ましくはイソ夕イブが IgG の抗体であり、さらに好ましくは補体結合性のないという点においてサブクラスが IgG4の抗体である。本発明の抗体としては、その活性、例えば、 G P V Iとの結合能を有する限りにおいて、抗体の断片または一部でもよい。例えば、 Fab (fragment of antigen binding) 、 Fab'、（Fab')₂、一本鎖抗体（scFv) 、ジスルフィド安定化抗体 (dsFv) 、 CDRを含有するペプド等が挙げられる。

本発明第 3の態様として、本発明の抗体を産生する細胞が提供される。このような細胞の例としては、ハイプリドーマ、形質転換体、または本発明の抗体の遺伝子を導入した遺伝子組換え細胞等がある。抗体を産生するハイプリドーマとしては、具体的には GPVI に対する自己抗体を産生するヒトから採取した末梢血のリンパ球を用いて作製したハイプリドーマである # 2 6細胞または # 2— 4 細胞がある。また、本発明により上記発明の細胞が産生する抗体が提供される。抗体産生細胞は特定の細胞に限定されないが、好ましくは GPVI に対する自己抗体を産生するヒトの末梢血から採取したリンパ球を用いて作製したハイプリド —マが産生した抗体であり、さらに好ましくは # 2 _ 6細胞または # 2— 4細胞が産生した抗体、及び該抗体より遺伝子組換技術により作製した組換抗体である。本発明の第 4の態様として、本発明第 1または第 2の態様の抗体をコードするポ ϋヌクレオチドまたは核酸が提供される。該ポリヌクレオチドは、本発明の抗体のアミノ酸配列をコ—ドするものであれば必ずしも限定されず、ポリヌクレオチドとしては、 D NA及びR NAが含まれる。

本発明の抗体の C D R配列をコードするポリヌクレオチドは必ずしも限定はないが、好ましくは VH CDR1 としてのアミノ酸配列をコードする配列番号 1 4 7の塩基配列、 VH CDR2としてのアミノ酸配列をコ一ドする配列番号 1 4 8の塩基配列、 VH CDR3としてのアミノ酸配列をコ一ドする配列番号 1 4 9の塩基配列、 VL CDR1としてのアミノ酸配列をコードする配列番号 1 5 0の塩基配列、 VL CDR2としてのアミノ酸配列をコードする配列番号 1 5 1の塩基配列または VL CDR3としてのアミノ酸配列をコードする配列番号 1 5 2の塩基配列のうち、いずれか 1つ以上、より好ましくは Η鎖の 3つ、さらに好ましくは全ての塩基配列を含有するポリヌクレオチドであり、また、好ましくは VH CDR1 としてのアミノ酸配列をコードする配列番号 2 3の塩基配列、 VH CDR2としてのァミノ酸配列をコードする配列番号 2 4の塩基配列、 VH CDR3としてのアミノ酸配列をコードする配列番号 2 5の塩基配列、 VL CDR1 としてのアミノ酸配列をコードする配列番号 2 6の塩基配列、 VL CDR2としてのアミノ酸配列をコードする配列番号 2 7の塩基配列または VL CDR3としてのアミノ酸配列をコードする配列番号 2 8の塩基配列のうち、いずれか 1つ以上、より好ましくは H鎖の 3つ、さらに好ましくは全ての塩基配列を含有するポリヌクレオチドである。

本発明の抗体の VHおよび V Lのアミノ酸配列をコ一ドするポリヌクレオチドは必ずしも限定はないが、好ましくは V Hとしてのァミノ酸配列をコードする配列番号 1 4 5の塩基配列、または V Lとしてのアミノ酸配列をコードする配列番号 1 4 6の塩基配列のいずれか 1つ、より好ましくは両方の塩基配列を含有するポリヌクレオチドであり、また、好ましくは VHとしてのアミノ酸配列をコードする配列番号 3 1の塩基配列、または V Lとしてのアミノ酸配列をコードする配列番号 3 2の塩基配列のいずれか 1つ、より好ましくは両方の塩基配列を含有するボリヌクレオチドである。

本発明の抗体の定常領域をコ一ドするポリヌクレオチドは、好ましくはヒト抗体、より好ましくはヒト I g G、さらに好ましくはヒト I g G 4由来の塩基配列を含有する。

本発明の抗体のヌクレオチド配列を含有する遺伝子を細胞に移入することにより、本発明の抗体を産生する細胞を製造することができる。移入する遗伝子として、好ましくは VH CDE としてのアミノ酸配列をコードする配列番号 1 4 7 の塩基配列、 VH CDR2としてのァミノ酸配列をコードする配列番号 1 4 8の塩基配列、 VH CDR3としてのアミノ酸配列をコードする配列番号 1 4 9の塩基配列、 VL CDR1としてのアミノ酸配列をコードする配列番号 1 5 0の塩基配列、 VL CDR2としてのアミノ酸配列をコードする配列番号 1 5 1の塩基配列または VL CDR3としてのアミノ酸配列をコードする配列番号 1 5 2の塩基配列のいずれか一つ以上を含有する遺伝子であり、また、好ましくは VH CDR1 としてのアミノ酸配列をコードする配列番号 2 3の塩基配列、 VH CDR2としてのァミノ酸配列をコードする配列番号 2 4の塩基配列、 VH CDR3としてのアミノ酸配列をコードする配列番号 2 5の塩基配列、 VL CDR1としてのアミノ酸配列をコードする配列番号 2 6の塩基配列、 VL CDR2としてのアミノ酸配列をゴ一ドする配列番号 2 7の塩基配列または VL CDR3としてのアミノ酸配列をコードする配列番号 2 8の塩基配列のいずれか一つ以上を含有する遺伝子である。また、移入する遺伝子として、好ましくは VHとしてのアミノ酸配列をコードする配列番号 1 4 5の塩基配列もしくは V L してのアミノ酸配列をコードする配列番号 1 4 6の塩基配列のいずれか 1つ以上を含有する遺伝子、または VHとしてのァミノ酸配列をコードする配列番号 3 1の塩基配列もしくは V Lとしてのアミノ酸配列をコードする配列番号 3 2の塩基配列のいずれか 1つ以上を含有する遺伝子である。また、移入する遺伝子として、好ましくは VHとしてのアミノ酸配列をコ一ドする配列番号 1 4 5の塩基配列、および V Lとしてのアミノ酸配列をコードする配列番号 1 4 6の塩基配列を有する遺伝子、または VHとしてのアミノ酸配列をコードする配列番号 3 1の塩基配列、および V Lとしてのアミノ酸配列をコ一ドする配列番号 3 2の塩基配列を有する遺伝子、さらに好ましくは、定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有する遺伝子である。 (製法）

本発明の第 5の態様として、抗体の生産方法が提供される。この発明の抗体を痄成する方法には限定はないが、以下に記載の方法でも作成しうる。すなわち、 G P V Iに対する自己抗体を産生する患者の末梢血からリンパ球を採取し、体外免疫法で活性化したリンパ球とマウスミエローマ細胞とのハイプリドーマを作製する。作製したハイプリドーマが産生する抗体を得て、 G P V Iとの結合能を有し、コラーゲンによる血小板凝集を抑制する活性を有する抗体を選択し、この抗体を産生する細胞を得る。この細胞を培養することにより、本発明の抗体を得ることができる。

本発明の抗体は、公知の方法（それぞれ Nature,312:643,1984 、 Nature,32i:522,1986以来、多くの方法が開発されている）を用いた組換えヒト抗体としても作製できる。まず、本発明の抗体を産生する細胞、例えば、リンパ球、好ましくは、抗 G P V Iモノクローナル抗体を生産するハイプリドーマより、 VHまたは VLをコードする核酸、例えば cDNAを取得し、塩基配列およびアミノ酸配列を決定する。次に、取得した VHおよび VLをコードする cDNA を同一細胞又は別のヒト細胞より作製したヒト抗体 CH および/"またはヒ卜抗体 CLをコ一ドする遺伝子を含有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト抗体発現べクタ一を構築し、動物細胞へ導入し発現させることにより製造することができる。動物細胞に導入する遺伝子の作製方法には限定はなく、ハイブリドーマ由来のゲノム DNA または cDNAから得てもよく、ハイプリド一マの mRNAから PCRによって得てもよく、また化学合成によっても得てもよい。本発明の抗体の VHまたは VLをコードする核酸を組み込むベクターとしては、必ずしも限定されないが、蛋白質遺伝子等の発現に汎用され、特に抗体遺伝子の発現に適合するベクターまたは高発現用ベクターが好ましい。好適な例としては、 EFプロモーター及び/または CMVェンハンサ一を含有するベクターが挙げられ'、例えば、 pEF-BOS または実施例で用いたベクターがある。また、通常 VH または VLをコードする核酸を組み込んだ発現ベクターをそれぞれ作製し、宿主細胞に c o t r a n s f e c tするが、単一の発現ベクターに組み込んでも良い。発現ベクターを導入する宿主細胞としては、必ずしも限定されないが、蛋白質遺伝子等の発現に汎用され、特に抗体遺伝子の発現に適合する細胞が好ましい。例えば、細菌（大腸菌等）、放線菌、酵母、昆虫細胞（SF9 等）、哺乳類細胞 (COS-1, CHO、ミエローマ細胞等) が挙げられる。

組換えヒト抗体の作製に用いるヒト抗体の定常領域としては、例えば、ヒト抗体重鎖定常領域としては C_Y 1や C_Y4、ヒト抗体軽鎖定常領域としては C κ等の任意のヒ卜抗体の定常領域を用いることができる。

ヒ卜の C D R配列を含有する抗体は、ヒ卜体内に天然に存在する抗体の他に、ヒ卜抗体ファージライブラリ一およびヒ卜抗体産生トランスジエニック動物から得られる抗体等も含まれる。ヒト抗体ファージライブラリ一は、ヒト B細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することにより Fab 、一本鎖抗体等の抗体の活性断片をファージ表面に発現させたライブラリ一である。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体の活性断片を発現しているファージを回収することができる。該抗体の活性断片は、更に遺伝子工学的手法により、 2本の完全な H鎖および 2本の完全な L鎖からなるヒト抗体分子へも変換することができる。

本発明は重鎖 2本と軽鎖 2本からなる抗体のほかに、本発明の抗体の活性断片等も含まれる。抗体の活性断片としては、例えば Fab (fragment of antigen binding ) 、 Fab'、 F(ab')2 があり、抗体の活性断片をリンカ一等で結合したものとして例えば一本鎖抗体（single chain Fv ： scFv ) やジスルフィド安定化抗体（disulfide stabilized Fv ： dsFv) があり、抗体の活性断片を含むペプチドとして例えば CDR を含有するぺプチドが挙げられる。これらは、本発明の抗体を適当な蛋白分解酵素で処理する方法または遺伝子組換技術等、公知の方法で製造することができる。

本発明の Fab は、本発明の抗 G P V I抗体を IgMの場合はタンパク質分解酵素ペプシンで処理して、 IgGの場合はタンパク分解酵素パパィンで処理して得るとができる。または、該抗体の Fab をコードする DNAを原核生物用発現べクタ一あるいは真核生物用発現ベクターに揷入し、該ベクタ一を原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、 Fab を製造することができる。本発明の F(ab')2 は、本発明の抗 G P V I抗体をタンパク質分解酵素ペプシンで処理して得ることができる。または、下記の Fab'をチォェ一テル結合あるいはジスルフィド結合させ、作製することができる。

'本発明の Fab'は、 G P V Iに特異的に反応する F(ab')2 を還元剤ジチオスレィトール処理して得ることができる。

本発明の scFvに含まれる VHおよび VLは、本発明のハイプリドーマが産生する抗体またはヒ卜抗体のいずれをも用いることができる。本発明の scFvは、本発明の抗 G P V I抗体の VHおよび VLをコードする cDNAを取得し、 scFv をコードする DNA を構築し、該 DNAを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、 scFvを製造することができる。

dsFvは、 VHおよび VL中のそれぞれ 1アミノ酸残基をシスティン残基に置換したポリペプチドを該システィン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システィン残基に置換するアミノ酸残基は Reiter らにより示された方法 [Pi'otein Engineering, 7, 697 (1994)] に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。本発明の dsFvに含まれる VHおよび VLは本発明の第 1または第 2の態様の抗体のいずれに由来するものをも用いることができる。

本発明の dsFvは、本発明の抗 G P V I抗体の VHおよび VL をコードする cDNAを取得し、 dsFvをコードする DNAを構築し、該 DNAを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用現ベクターに挿入し、該発現べク夕一を原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、 dsFv を製造することができる。

CDR を含むペプチドは、 H鎖または L鎖 CDR の少なくとも 1領域以上を含んで構成される。複数の CDRは、直接または適当なぺプチドリンカーを介して結合させることができる。本発明の CDR を含むペプチドは、本発明の抗 G P V'l抗体の VHおよび VLをコードする cDNAを取得した後、 CDR をコードする DNAを構築し、該 DNAを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現べクタ一を原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、 CDR を含むペプチドを製造することができる。また、 CDR を含むペプチドは、 Fmoc法 (フルォレニルメチルォキシカルポニル法) 、 tBoc 法 ( ブチルォキシカルポニル法) 等の化学合成法によって製造することもでき本発明の抗体には、例えばハイプリドーマが産生するヒト抗体、 E B Vを用いて形質転換した細胞が産生するヒト抗体、 c D N Aより発現した組換えヒト抗体、またはそれらの抗体の活性断片に放射性同位元素、タンパク質、ペプチドまたは低分子の化合物などを結合させた抗体も含まれる。本発明の抗 G P V I抗体または抗体の活性断片の H鎖或いは L鎖の N末端側或いは C末端側、抗体または抗体の活性断片中の適当な置換基あるいは側鎖、さらには抗体または抗体の活性断片中の糖鎖に放射性同位元素、タンパク質、ペプチドあるいは低分子の化合物などを化学的手法 [抗体工学入門（金光修著 1 9 9 4年（株）地人書館） ] により結合させることにより製造することができる。ハイプリドーマとは、リンパ球と、ヒ卜、マウス、ラット等に由来するミエローマ細胞とを細胞融合させて得られる、所望の抗原特異性を有したモノクローナル抗体を産生する細胞を意味する。

モノクローナル抗体を作製する場合は、細胞融合に使用するミエローマ細胞との適合性を考慮して選択することが好ましい。ミエ口一マ細胞ほ、公知の種々の細胞が使用可能である。これにはヒト由来の SKO— 007、ヒトマウスへテロミエ口一マである SHM— D 33、マウス由来の P 3、 P 3U1、 SP 2/0、 NS— 1、ラッ卜由来の YB 2/0及び Y3— Ag 1， 2, 3等の骨髄腫細胞が含まれる。 .

ハイプリドーマ作製に用いる細胞としては、必ずしも限定はされないが、ハイプリドーマ作製に用いる複数の細胞のうち少なくとも 1種はヒト由来の細胞であることが好ましい。ヒト由来の細胞としては、末梢血、リンパ節または脾臓等のヒトのリンパ球が用いられ、特に自己抗体の産生が確認されているヒトのリンパ球が好ましい。

りンパ球の活性化は公知の方法により行なうことができる。例えば、ヒトの末梢血又は脾臓から B細胞を採取し、 i n v i t r o immun i z a t i o n法により抗原刺激し、ヒ卜の B細胞由来のミエ口一マ細胞あるいはマウス由来のミエローマ細胞とのハイブリドーマを作製する方法、 EBVでトランスフォームし、マウスミエローマ細胞と融合させる方法、 PWM等のマイトジェンで刺激し B細胞をポリクローナルに活性化し融合させる方法（免疫実験操作法 I · II、右俊介他編集、南江堂）等が好ましい。

細胞を刺激するために用いる抗原は、必ずしも限定はない。抗原とするタンパク質の由来動物は、抗体の使用目的に応じて適宜選択し得るが、天然物由来のもの、遺伝子工学的に作成したもの、化学的に合成したもの、他のタンパク質ゃぺプチドとの融合タンパク質等、いずれでもよい。例えば血小板、血小板の膜、精製 GPV I、組換え GPV I、 G P V I -Fc を用いることができ、好ましくは G P V I -Fcである。

活性化リンパ球とミエローマ細胞との融合は、 Milstein等の方法 (Methods in Enzymol.,73巻 3 頁）等の公知の方法を用いて行なうことができる。例えば、融合剤としてポリエチレングリコール（PEG) を使用する方法（単クローン抗体実験操作法入門、安東民衛 ·千葉丈/著、講談社）または電気融合法等が挙げられる。免疫細胞とミエローマ細胞との混合比は、それらが融合できる比率であれば限定されないが、活性化リンパ球に対し、ミエローマ細胞を 1 10量ないし等量を使用することが好ましい。細胞融合を PEG (平均分子量 1, 000〜 4, 000) を使用して行なう方法では PEG濃度は必ずしも限定されないが 5 0 %で行なうことが好ましい。また、融合効率促進剤としてジメチルスルフォキシド（DMSO) 等の補助剤を添加してもよい。融合は 37口に加温した PEG 溶液を混合した細胞に添加することにより開始し、 1〜5分間反応後、培地を添加することにより終了する。

この融合により形成されたハイプリドーマをヒポキサンチン、チミジン及びァミノプテリンを含む培地（HAT培地）等の選択培地で 1日〜 10日間培養し、未融合細胞と分離する。得られたハイプリドーマをその産生する抗体により更に選択する。選択したハイプリドーマを公知の限界希釈法に従って単一クローン化じ、単一クローン性抗体産生ハイプリドーマとして樹立する。 ' ハイプリドーマの産生する抗体の活性を検出する方法は公知の方法を使用することができる。ここで抗体の活性は、第一段階として、 GPV I抗原への結合能を、第二段階として、 GPV Iとコラーゲンの結合を阻害する活性を検出する。第一段階の活性の検出方法としては、例えば EL I SA法、ウエスタンプロット法、ラジオイムノアツセィ法が挙げられる。第二段階の活性の検出法としては、えば EL I SA法（結合阻害型）、タンパク相互作用解析法（B I ACORE 等）、血小板凝集抑制測定法が挙げられる。

樹立したハイプリドーマを公知の方法で培養し、その培養上清よりモノクロナール抗体を得ることができる。

抗体の精製は、塩析法、ゲル濾過法、イオン交換クロマト法またはァフィニティークロマト法等の公知の精製手段を用いて行うことができる。

抗体の濃度は公知のタンパク質の定量方法、例えば 280 nmにおける吸光度の測定により測定することができる。

本発明の抗 GP V I抗体の抗原結合性を確認する方法、または本発明の抗 GP V I抗体を用いて生物試料中の GPV Iを検出する方法としては、蛍光抗体法、免疫酵素抗体法 (ELISA) 、放射性物質標識免疫抗体法 (RIA) 、免疫組織染色法、免疫細胞染色法などの免疫組織化学染色法（ABC 法、 CSA法等）、ウェス夕ンブロッテイング法、免疫沈降法、上記に記した酵素免疫測定法、サンドイッチ ELISA法 [単クローン抗体実験マニュアル（講談社サイエンティフィック、 1987年）、続生化学実験講座 5免疫生化学研究法（東京化学同人、 1986年） ] などを用いることができる。

本発明の抗体の、例えばコラ一ゲンのような血小板凝集を惹起させる物質によるヒ卜血小板凝集へ及ぼす影響測定方法は、必ずしも限定はされず、常法により行うことができる。具体的には、ヒト血小板浮遊液に本発明の抗体を添加し、その後コラーゲンを添加し、血小板凝集能測定装置等で凝集率を測定する。

抗体単独でのヒト血小板凝集を測定する方法は必ずしも限定されず、常法により行うことができる。具体的には、ヒト血小板浮遊液に本発明の抗体を添加し、血小板凝集能測定装置等で凝集率を測定する。

、

(用途）

本発明の抗体は、ヒト G P V Iに特異的に結合するものであり、本発明の抗体、抗体の活性断片、化学物質と結合させた抗体の修飾物、またはこれらの混液を含む組成物等は、ヒトの疾患の予防、診断および治療の用途、また被験試料、細胞および組織等のヒト G P V Iの検出の用途等を含めて、種々の用途がある。

~特に、本発明の抗体の一態様としては、抗体単独ではヒト血小板の凝集を起こさないものであるから、抗体の活性断片だけでなく抗体自体もヒ卜血小板の凝集を抑制し、活性断片とせず抗体そのものをヒトに投与して、ヒ卜の疾患の予防、診断および治療等に用いることができる。用途：医薬

本発明の抗体は GPVI への結合の特異性が高く、かつヒト由来であって、好ましくは、単独ではヒト血小板の凝集を促進または惹起する作用を有さないことから、特に、ヒトの疾患、例えば、血小板の活性化もしくは凝集、または血管内皮障害もしくは動脈硬化性の反応によって引き起こされる疾病の予防及び/または治療に有効であり、また、血栓もしくは塞栓に起因する疾患、例えば、血栓症及び塞栓症等の予防及びノまたは治療に利用することができる。これらの疾患には、動脈性血栓症のみならず、静脈性血栓症も含まれ、また、心房細動に起因する脳梗塞も含まれる。' 本発明の抗体により予防及び zまたは治療が可能なヒトの疾患または病態としては、具体的には、心筋梗塞、血栓溶解療法時、経皮的冠静脈内腔拡張術施行時、ステント施行時、バイパス手術施行時もしくは人工血管施行時の、またはこれらの後の血管内皮肥厚、血管再狭窄狭心症もしくは心筋梗塞、心房細動もしくは心房粗動及びこれらに起因する血栓症、塞栓症もしくは脳梗塞、閉塞性血栓性血管炎、急性動脈閉塞症、閉塞性動脈硬化症または深部静脈血栓症等があり、脳梗塞（ァテローム性血栓性梗塞、ラクナ梗塞、心原性梗塞）、一過性脳虚血発作、くも膜下出血後の脳血管攣縮、肺血栓、肺塞栓症、血管性紫斑病、特発性血小板減少性紫斑病、血栓性血小板減少性紫斑病、播種性血管内凝固症候群、体外循環時での血液凝固防止、全身性エリテマトーデス、多発性動脈炎、抗リン脂質抗体症候群、紫斑病性腎炎、糖尿病に伴う内皮細胞傷害、糖尿病性腎炎、糖尿病性網膜症、腎塞栓、移植治療に伴う合併症（肝静脈閉塞症、移植片対宿主病）等が挙げられる。

本発明の抗体は、また、先述の予防及び Zまたは治療対象の疾患に対して、単独で投与されるか、あるいは他の薬理活性成分と併用されることもできる。かかる集理活性成分とは、例えば公知の血栓溶解剤 (例えば組織プラスミノーゲンァクチベータ一 ( t - P A) ならびにそれらの誘導体 (改変体あるいはいわゆる第二世代といわれるものも含む）、ゥロキナーゼ、ストレプトキナーゼ）、あるいは公知の抗血小板薬（例えばアスピリン、チクロビジン、クロピドグレル、トロンボキサンアンタゴニスト、トロンボキサン合成阻害剤、 G P II b /III aアン夕ゴニスト）、公知の抗凝固薬（例えばヮ一フアリン、へパリン、低分子へパリン、ペン夕サッカライド、トロンビン阻害剤、 F X a阻害剤、 FVII a阻害剤）などが挙げられる。ここで併用とは、本発明の抗体と、当該薬理活性成分とをともに含む合剤を投与する他、本発明の抗体と当該薬理活性成分とがそれぞれ別個の製剤として一時期にもしくは時間をずらして投与される場合をも含み、患者の血中において同時に存在する限りにおいて投与の形態は問われない。

本発明の抗体ならびに製剤学的に許容される組成物を有効成として含有する医薬品は、通常用いられる製剤用の担体ゃ賦形剤、その他の添加剤を用いて例えば錠剤、注射剤、散剤、坐剤等に調製され、人間その他の動物に対して投与される。

ヒ卜に適用する場合、その投与経路は、経口投与、静脈内投与（ポーラス投与、連続点滴、間欠的点滴）、皮下投与、筋肉内投与、関節内投与、経皮投与、経鼻投与等があるが、通常、経口投または静脈内投与である。本発明の抗体のヒ卜に対する臨床投与量は適用される患者の症状、体重、年齢や性別等を考慮して適宜決定されるが、通常成人一日あたり、静脈内投与で 1〜1 0 0 0 0 m g、好ましくは 1 0〜1 0 0 O m gであり、これを 1回あるいは数回にわけて投与する。投与量は種々の条件で変動するので、上記投与量範囲より少ない量で十分な場合ある。

こで、本発明の抗体は G PVI を認識する点で共通するものの、本発明は異なる機序を有する多様な抗体を包含するものである。.例えば、 G PVI とコラーゲンの結合を直接阻害する、または G PVI を切断することにより血小板の活性化及び/または凝集を抑制する抗体は比較的即時的な効果を期待できるので、少なくとも疾患の急性期（例えば、心筋梗塞時もしくは P T C A実施時またはそれらの直前もしくは直後）において有用である可能性がある。このような場合には、好'ましくは血中の血小板表面の G PVI の大部分に本発明の抗体を結合させるために比較的大量の抗体を投与、例えば、単回もしくは分割静注または点滴静注することができる。また、 G PVI を内部に取り込ませる抗体は即時的効果は期待できないかもしれないが、ヒト血小板の血中での寿命（9〜1 0日前後）及びヒト抗体の血中半減期（I g Gの場合、数週間）を考慮すると持続的な効果が期待できるので、例えば、疾患の慢性期（例えば、心筋梗塞発症後または P T C A実施後数日〜数ケ月）において有用である可能性がある。このような場合には、血中の血小板のコラーゲンに対する反応性を部分的に、好ましくは完全に、阻止する程度に血小板表面の G PVI を焼失させるために必要な量の抗体を比較的間隔を置いて、例えば、 1クールを数日から数週間として、投与、例えば、単回もしくは分割静注または点滴静注することができる。従って、好ましい態様において、本発明の抗体はこれらの効果を併せ持っても良い。また、それぞれの効果が期待できる抗 G PVI抗体を複数組み合わせた治療を実施しても良い。

非経口投与のための組成物は、通常、許容される担体、好ましくは水性担体中に溶解された免疫グロブリンの溶液又はそれの混液を含む。種々の水性担体、例えば、水、緩衝水、リン酸塩緩衝生理食塩水（P B S ) 、 0 . 4 %生理食塩水、 0 . 3 %グリシン、ヒトアルブミン溶液等が用いられ得る。これらの溶液は、無菌であり、そして一般的には微粒子物質が存在しない。これらの組成物は、慣用の、良く知られた滅菌方法により滅菌されうる。組成物は、生理学的条件に近づけるために、要求に応じて、薬学的に許容できる補助物質、例えば p H調節及び緩衝化剤、毒性調節剤等、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化力リウム、塩化カルシウム及び乳酸ナトリウムを含みうる。これらの製剤中の抗体の濃度は、広範囲に、即ち、約 0 . 0 0 5重量％未満（通常は、少なくとも約 1重量'％) から 1 5又は 2 0重量％と大きい量まで変化することができ、主として、選択された投与の特定の様式に従って、液容量、粘性等に基づいて選択される。非経口投与組成物を調製するための現実の方法は、本技術分野の熟練者にとつて公知又は明白であり、例えば、レミントンズファーマシューティカルサイエンス (第 1 5版、マックパブリツシングカンパニー、イーストン、ペンシルバニァ、 1 9 8 0 ) (本引例をもって本明細書の一部と成す）に更に詳細に記載されている。洗浄 ( 1 a V a g e ) 又はその他のルートのために適した組成物は、意図される特定の使用に従って選択される。いぐつかの薬学的組成物は、抗 G P V I抗体及びその疾患に於いて常用される他の治療剤を含みうる。いずれの場合も、ポーラス投与および持続投与が適用されうる。また、予防的または治療的有効量は、対象疾患、病態および患者の状態等によって適宜決定される。

本発明の抗体は、貯蔵のため凍結又は凍結乾燥され、使用に先だって適当な担体中で再構成されうる。この技術は、慣例の免疫グロブリンにおいて有効であると知られており、公知の、凍結乾燥及び再構成技術が用いられ得る。凍結乾燥及び再構成が、様々な程度の抗体の活性損失をもたらしうる（例えば、慣例の免疫グロプリン、 I g M抗体は、 I g G抗体よりも大きい活性損失を生じる傾向にある）ということ、及び使用レベルが、それを補うために調節されなけらばならないかもしれないということは、当業者にとって認識されることである。用途： G P V I検出本発明の抗体または抗体の活性断片を用いて、被検試料中の G P V Iを検出する方法は、被験試料と本発明の抗体または抗体の活性断片を接触させる工程、本発明の抗体または抗体の活性断片に結合した被検試料中の G P V Iを検出するェ程を含み得る。被検試料中の G P V Iを定量する工程を更に含んでも良い。被験試料中の GPVI を検出する方法により、疾患の診断を行うことができる。特に、ヒトの疾患、例えば、血栓性、塞栓性または動脈硬化性の疾患の診断に利用することができる。

本発明の抗体を用いて、被検試料中の G P V Iを検出する方法としては、サンドイッチ E L I S A系、インヒピション ELISA系、蛍光抗体法、免疫組織化学染色法、放射性物質標識免疫抗体法、ウェスタンブロッテイング法、免疫沈降法などがあげられるが、これらに限定されるものではない。対象となる被検試料は限定されないが生物試料が用いられ、動物、特にヒトの体液あるいは、組織、細胞および菌体ならびにそれらの抽出液、培養上清、塗末標本および切片が挙げられるが、血小板であることが好ましい。

本発明の抗体または抗体の活性断片を用いて、 G P V I又は血小板上の G P V I'のコラーゲンに対する結合を阻害する方法は、 G P V I又は血小板表面上の G P V Iと本発明の抗体または抗体の活性断片を接させる工程、 G P V I又は血小板表面上の G P V Iとコラーゲンを接触させる工程、本発明の抗体または抗体の活性断片による G P V I又は血小板表面上の G P V Iのコラーゲンに対する結合を阻害する工程の少なくとも一つを含み得る。

本発明の抗体または抗体の活性断片による G P V I又は血小板上の G P V Iの血小板凝集に対する阻害作用を検出する工程は、前述の in vitroアツセィ系の他、 in vivoアツセィ系を用いることも可能である。ここでいう in vivoアツセィ系とは、生体に本発明の抗体または抗体の活性断片を投与し、当該抗体または抗体の活性断片が生体の機能やステータスに与える影響を検出する評価系を意味する。たとえば、コラーゲン投与モデル動物に本発明の抗体または抗体の活性断片を投与し、病態の重篤度の指標に与える影響を評価する系が例として挙げられる。実施例

以下に、実施例をもって本発明を一層具体的に説明するが、これらは一例として示すものであり、本発明はこれらにより何等限定されるものではない。また、以下の記載において用いる略号は、当該分野における慣用略号に基づくものである。実施例 1 ヒト可溶型 GPVI- Fcの作製

in vi t ro immunizaUon用の抗原及びスクリーニング用抗原として用いるため、ヒ卜 GPVIの細胞外ドメインとヒト IgGの Fcフラグメントとの融合蛋白質（GPVI - Fc)'を作製した。なお、 DNA操作は特に断りのない限り、モレキュラークロー二ング第二版 (Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3^rd ed. , Joseph S.， e t al. , Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) ) にしたがって行った。

GPVI- Fc発現プラスミドは、以下の手順により遺伝子工学的に作製した。まず、江角らがクロ一ニングしたヒト GPVI cDNAを組込んだプラスミド pBK- CMV- GPVI - 1 (Bioc em. Biop ys. Res. Commun. 2000 Oct 14 : 277 (1) : 27-36) を铸型とし、セ'ンスプライマー 1 (配列番号 3 3。 5 '末端側に制限酵素 Xba l 認識配列を含む）およびアンチセンスプライマー 1 (配列番号 3 4。 5 '末端側に制限酵素 Bam H I 認識配列を含む）を用いて PCR を行い、ヒト GPVI細胞外ドメイン（269 アミノ酸）をコードする cDNA を得た。一方、ヒト IgG!Fcドメイン cDNAが含まれるプラスミド pM1304 (W097/42319に記載）を錶型とし PCR を行い、あらためて GPVI細胞外ドメインにインフレームで連結可能となるヒト IgGiFcドメイン（506 ァミノ酸）をコードする cDNA を得た。この PCRのためのセンスプライマ一 2 (配列番号 3 5 ) は、ヒト IgG cドメイン N 末端側をコードする cDNA配列を含み、さらにその 5 '末端側に制限酵素 BamH I 認識配列を配置して設計し、またアンチセンスプライマー 2 (配列番号 3 6 ) はヒト IgG!Fcドメイン C 末端側に制限酵素 Kpnl認識配列を配置して設計したものを使用した。 PCRにより得られた二つの cDNA断片を制限酵素で処理した後、哺乳動物細胞を宿主とする発現プラスミドである pCAG GS (特許第 2824434号公報）のクローニング部位に挿入した。すなわち、ヒト GPV I細胞外ドメインをコードする cDNA断片は制限酵素 Xba Iおよび BamH Iで切断し、ヒ卜 IgG cドメインをコードする cDNA断片は制限酵素 BaniHIおよび Kpnlで切断した。 pCAGGSのクローニング部位にはリンカ一を挿入し、適当な制限酵素切断部位 (Xbal、 Kpnl) を付加した後に、ヒト GPVI細胞外ドメインをコードする cDNAおよびヒト IgGFcドメインをコ一ドする cDNAがインフレームで連結させて挿入した。この工程を図 1に示す。

得られた発現プラスミド (pCAGGS-GPVI-Fc).を基にバキュロウィルスへのトランスファーべクタ一および組換えウィルスを作製し、カイコ蛹での発現を行った。すなわち、 pCAGGS- GPVI- Fcを制限酵素 Xbalおよび Hind IIIで切断することにより GPVI- Fcをコードする DNA断片を切り出し、その末端を Blunting Kit (TAKARA ) 用いて平滑末端とした。その DNA断片をバキュロウィルスへのトランスファ一ベクターである pYNGの Smal部位に挿入し、ポリヘドリンプロモーターに対して正方向で挿入されているクローン（pYNG- GPVI-Fc) を選択した。この工程を図 2に示す。そのクローンを基に組換えウィルスを作製し、ウィルス感染細胞での GPVI- Fc蛋白質の発現をウエスタンプロッティングで確認した。最終的に作製したウィルス溶液をカイコ蛹に接種することにより、 GPVI-Fcの発現を行った。

の結果、カイコ蛹磨砕液中に充分な量の GPVI- Fcの発現が認められ、その磨砕液をプロテイン Aカラム（Prosep- A、ミリポア) に供することにより GPVI- Fcの精製を行った。実施例 2 抗 GPVI自己抗体を有するヒ卜の末梢血リンパ球を用いた抗 GPVIモノクロ一ナルヒ卜抗体の作製

抗 G PVIモノクローナルヒト抗体は G PVIに対する自己抗体を有していることが確認されている供血者のリンパ球とミエローマ細胞を融合し、以下のように調製した。まず、書面にて同意を得た供血者から無菌的に採血したへパリン加血液 6mlを、 F i c o l l- P l u s (Am e r s h am Pharmac i a B i o t ech AB) を 3mlカロえた L e u c o s e p (Gr e i ne r) に重層し、 l O O Ogにて遠心し、リンパ球分画を回収した。得られたリンパ球分画をダルべコ PBS (以下、 D— PBSと記載する場合がある）にて 800 gで 2回遠心洗浄後、 10%FCS (ゥシ胎児血清）を含む Hyb r i doma - S 2004/010596

29

FM ( I 11 v i t r o g e n) に懸濁し、 7.4x10⁷個の細胞を得た。

前記リンパ球分画に、 PHA- L (S i gma) を 2. 5pg/mし LP S ( D I F CO) を 20 μ g /m 1、実施例 1記載の精製 GPVI - Fcを 1 0 μ g /m 1 となるようにそれぞれ添加し、細胞濃度は 1x1 0⁶個/ ni 1 となるように調製し 3日間培養しリンパ球の活性化を行った。なお、培養時に、さらに I L一 4 (P e p r oT e c h) を 400 U/m Lを添カ卩し、また、培養期間を 8日間にする等、適宜条件を微調整し、リンパ球の活性化を試みた。細胞融合は安藤ら（単クローン抗体実験操作法入門、安東民衛*千葉丈ノ著、講談社）にしたがい、活性化したヒトリンパ球とマウスミエ口一マ細胞 (S P 2/O-A g 14、 ATCC C RL 1 581) を 4 : 1で混合し 50 %ポリエチレングリコール（ S i gma) により細胞を融合した。融合後、 1 0 % F C S、 1XHAT ( I n V i t r o g e n) を含む Hy b r i d o m a - S FMに懸濁し、 1 0日間培養後に、増殖したハイプリドーマの培養上清をサンプリングし、目的の抗体を産生しているハイプリドーマを E L I S A法によりスクリ一二ングした。

すなわち、精製 GPVI- Fcを 1ゥエルあたり 0. 25pg添加して固相化したィムノプレート（Ma x i s o r b、 NUNC) にハイブリドーマの培養上清 50 を添加し 37。じで 1時間反応した。対照としてヒト精製 F c (At h e n s Re s e a r c h An d Te c hn o l o g y, I n c. ) を同様に固相化したゥエルを調製し、培養上清を添加し反応させた。反応終了後、各ゥエルを洗浄し、次にペルォキシダーゼ標識抗ヒトカッパ抗体（DAKO、 P I 29) またはペルォキシダーゼ標識抗ヒトラムダ抗体（DAKO、 P I 30) を各ゥエルに添加した。 37°C1時間反応後、同様に洗浄し、 TMB発色液（B i o F i X ) を各ゥエルに添加し 10分反応後、 0. 5 M硫酸溶液を添加し反応を停止した。続けてプレート吸光度計により 450 nmの吸光度を測定し、精製ヒト F cでは吸光度が上昇せず、 GPVI- Fcを固定化したゥエルのみで吸光度が上昇する、すなわち抗 GPVI抗体を産生しているハイプリドーマが存在するゥエルを選択したさらに、限界希釈法により培養を行い単一クローンを得た。すなわち、 10日間培養後の培養液について前記と同様にスクリーニングを行い、抗 GPVIモノクローナルヒト抗体を産生するハイプリドーマを得た。

選択したハイブリドーマを 10%FCSを含むHyb r i (10111&— 3 で培養後、無血清化し抗体を産生させた。 I gM抗体はマニュアルに従い P r 0 s e p— Th i o s o r bMカラム（M I LL I PORE) により精製し、 I gG 抗体は P r o s e p— Aカラム（M I L L I PORE) を用いて精製した。精製抗体は 0. 076M リン酸緩衝液（PBS.) (pH6. 4) で透析し、 280 nmの吸光度より濃度を算出した。実施例 3 作製した抗 GPVIモノクローナルヒト抗体のタイピング

'実施例 2で得られた抗体の夕ィピングは H uma n I gG S ub c l a s s P r o f i l e EL I S A K i t (Zyme d L ab o r a t o r i e s) 及びウェスタンブロティングにより行った。 EL I S Aはマニュアルに従い、抗体の希釈液をサンプルとして使用した。キットで検出されなかった抗体は · 、それぞれ約 lpgを 4〜20%の SDS— PAGEにより分離後、 PVDF膜 (MI LL I PORE) に転写し、ウエスタンブロッテイングを行った。すなわも、 PVDF膜をブロッキング後、ペルォキシダ一ゼ標識ゥサギ抗ヒト I gM抗体（P 0322、 DAKO) と反応した。洗浄後、 ECL試薬（Ame r s h a m Ph a rma c i a B i o t e c h AB) と反応させ、ライトキヤプチャ (ATTO) により反応するバンドを検出した。得られた抗 GPVI抗体のタイピング結果を表 1に示した。

10596

31 表 1 タイピング結果

実施例 4 ' 抗 GPVIモノクローナルヒト抗体の GPVI結合活性の測定（EL I S A法）

実施例 2で得られた精製抗体の GPVI結合活性を、実施例 2に記載の EL I S A法にて測定した。実施例 2においてハイブリドーマの培養上清の代わりに、実施例 2で調製した精製抗 G P VIモノクローナルヒト抗体 20 n gを添加し、対照として精製ヒト I gM (C ap p e 1) を使用した。

その結果、図 3に示すように対照として使用した.ヒ卜 I gMでは吸光度が上昇しないのに対し、 '選択されたハイプリドーマの産生する精製抗 GPVIモノクロ一ナルヒト抗体では、いずれも顕著な吸光度上昇が認められ、調製した抗体が特異的に GPVIを認識していることが確認された。実施例 5 抗 GPVIモノクローナルヒト抗体による GPVI - Fcのコラーゲンへの結合抑制の検討 ,-'

実施例 2で得られた抗体が特異的に G P VIとコラーゲンとの結合を阻害していることを確認する目的で蛋白相互作用解析装置（B I ACORE 3000) を用いた解析を行った。まず、ヒトコラーゲン Ty p e I (生化学工業）を B I AC ORE社のマニュアルに従い、 CM 5チップ (B I ACORE) 上にコラーゲンを 6303RU (R e s o n a n c e Un i t) 固定化した。ここで RUは B I ACOR E装置で使用されるレスポンスを表す単位であり、 1000 R Uは約 1: 2 n gの物質が結合したことを示す。 GPVI— F cと、精製ヒト I gMまたは精製抗 GPVI抗体とをそれぞれ 5 Opg/m 1 となるように混合し、コラーゲン固定化チップにインジヱクトした。実施例 6 ヒト血小板凝集能に及ぼす抗体の影響

文書により同意を得た健常人より採血した血液から常法（Takayama H et al. , Biochemical and Biophysical Research Communications, 174, pp.922-92.7 (1 991)) に準じて血小板を調製し、終濃度約 2xl0⁸〜3xl0⁸個/ _mLで使用した。血小板凝集能の測定は、 Ezumi Y et al. (Blood, 99， pp.3250-3255 (2002) ) に準じて以下のように実施した。被検物質である実施例 2で得た抗体またはその溶媒を添加した後、 37°Cで 5分間ィンキュベートした。さらに CaCl₂溶液を終濃度で 1 mMとなるように添加し、 37 °Cで撹拌しながら 3分間インキュベートした。コラ一ゲン（NYC0MED PHARMA GMBH) の溶液を終濃度で 3ないし 4 pg/mLとなるように加え、血小板凝集能測定装置（興和株式会社 PA- 200) にて光透過率を経時的に測定する事により、抗体のコラーゲン惹起血小板凝集抑制作用を測定した。その結果を表 2に示した。なお、血小板凝集の測定結果は、光透過率が最大となつた時点での透過率（最大凝集率）で表した。

次に、コラーゲンの代わりに血小板凝集惹起物質としてヒトトロンビン（Sigm a) を 0.3単位/ mLの濃度になるように添加し、同様に抗体の血小板凝集へ及ぼす影響を測定した。その結果、 10pg/_mLの抗体濃度における最大凝集率は、 # 2— 4010596

33

4抗体の場合は 96 であった。

さらに、前記の測定において、コラーゲン等の血小板凝集惹起物質を添加せずに、被検物質（抗体）単独での血小板凝集惹起作用を測定した結果、 10pg/mLの抗体濃度における最大凝集率は、， # 2— 4抗体の場合は 3 %であった。

以上の結果から、 #2— 4抗体は、単独で血小板凝集惹起作用は有さず、コラ —ゲンによる血小板凝集のみを特異的に抑制する事が観察された。表 2

(A) #2— 4抗体

実施例 7 抗 GPVIモノクローナルヒ卜抗体の解離定数の測定

実施例 6で血小板凝集抑制活性が確認された抗体の解離定数を蛋白相互作用解析装置（B I ACORE 3000) を用いて測定した。実施例 1記載の精製 GP VI—F cを B I ACORE社のマニュアルに従い、 CM 5チップ上に固定化した。 # 2—4抗体について B I ACORE 3000の W i z a r d P r o g r a mにて測定し、 B I AC ORE社の B I Ae v a 1 u a t i o nソフトを用いて解析したところ、 # 2— 4抗体の解離定数（K_d) は 4. 13x10— ⁸Mと算出された。実施例 8 抗 GPVI抗体の C D Rァミノ酸配列の決定

実施例 2の EL I S A法によるスクリーニングにて選択されたハイプリドーマを実施例 2に従って培養した。細胞濃度が 2x10⁵個/ m 1になった段階で培養液を回収し、回収しこ細胞より TR I z o 1 (I nv i t r ogen) を用いて mRNAを抽出した。次に、 Sup e r s c r i p t F i r s t -s t r an d s yn t he s i s Sys t em II (I nv i t r o ge n のマニュアルに従って、 mRNAからオリゴ dTプライマーにより一本鎖 c DNAを合成した。論文 (J. Immunol. Methods 1995 Feb 27; 179 (2) :203-14および J. Mol. Biol. 1991 Dec 5;222(3) :581-97) の情報を参考にして重鎖および軽鎖可変領域を増幅させる PCRプライマー（配列は表 3に記載）を合成し、先に調製したハイブリドーマ由来の一本鎖 cDNAを錡型として PCRを行った。増幅された D NAのバンドを 2 %ァガロースを用いて確認後、 PCR産物をスピンカラム (S i gm a)を用いて精製した。精製された PCR産物と pT 7 B 1 u eTベクタ一 (N o V a g e n)を民和し、 L i g a t i on k i t ve rll 、丄， AKA RA) を用いて 16°C、 30分でライゲ一シヨン反応を行った。その反応液を用いてコンビテントセル E. c o 1 i ( JM109、 TAKA A) にトランスフォーメーシヨンを行い、 X-G a 1、 I PTGを含む LBプレートに播種し、 1 晚培養した。出現した白コロニ一をピックアップし、 Ex T a q p o 1 ym e r a s e (TAKARA)、 U— 19me r r ime r (配列は表 3に記載 ) 、 T7 p r omo t e r p r ime r (目 id歹 (Hま表 3に記載、 N o v a g e n) を用いて、コロニーダイレクト PCRでインサートがベクターに揷入されていることを確認した。次に、インサートが確認されたコロニ一を LB培地で一晩培養し、 Q I AGEN p l a sm i d m i n i k i t (Q I AGEN) を用いてプラスミドを精製した。精製したプラスミドは U— 19me r r im e r、 T 7 p r omo t e r p r i me rを用レて D YE n am i c E T t e rmi n a t o r c yc l e s e que nc i ng k i t (アマシャムバイオサイエンス）により反応後、シークェンサ一 AB I PR I SM31 00 (アプライドバイオシステムズ）を用いて解析を行った。

決定した CDR配列を表 4に示した。なお、 #2— 4のクローンの VL CD R3をコードする塩基配列（配列番号 28) のうち 31番目のグァニンは実際には検出されていないが、他のクローンの解析結果よりグァニンであることが予想される。この予想に基づいて、 #2— 4のクロ一ンの VL CDR3 (配列番号 12) および VL CDR (配列番号 16) のアミノ酸配列を記載している。 04 010596

35

表 3

表 4

クロ一重鎖 (H 鎖 )

ン CDR1 (配列

番号番号） CDR2 (配列番号） CDR3 (配列番号）

#2-4 SYAMS (7) AISGSGGSTYYADSVKG (8) HFILTGYHY (9)

#2 - 6 NYAMA (47) AISVSGTSTAYADSVKG (48) RGLPHPKYFCDS (49)

#2 - 7 SNYMS (50) VIYSGGS-TYYADSVKG (51) LKADHYDSLAPDFDY (52)

#2-16 SYDMH (53) AIGTAGD-TYYPGSVKG (54) AG画 RGAFDI (55)

#2 - 37 DYYMS (1) YITSSSSYTNYADSVKG (2) D AVRGVIIIRPPDY (3)

#4 - 1 SYAMS (56) AITGSGGTTYYADSVKG (57) GGYTSGNSYFDY (58)

#4-7 TFYIH (59) FINPSGVNTNYAQKFQD (60) DTRGWSLNGLDV (61)

#4-28 DYAMH (62) LINGDGGQTHYADSVKG (63) GK SGTYYNGLEY (64)

#4-36 DYYMS (65) FISSSSGYTDYADSVKG (66) RSSGFPFDL (67)

#4-43 SNYMS (68) VIYSGGSTYYADSVKG (69) GRWSYDY (70)

#4-44 DYYMS (71) YISSSSSYTNYADSVKG (72) TLYGSGSGDAFDI (73)

#4-45 DYGMS (74) GINWNGGSTGYADSVKG (75) AVATDAFDI (76)

#4-52 SYWMH (77) RINSDGSSTSYADSVKG (78) DLSPGSGSPFDY (79)

#4-54 TSGVGVG (80) FIYWNDDK YSPSLKS (81) REIAAAGLYAFDI (82)

#4-56 DYAMH (83) LISGDGGSTYYADSVKG (84) GSYDSSGYYPGAFDI (85)

#4-62 DYGMS (86) GINWNGGSTGYADSVKG (87) GPTIAGYYYGMDV (88)

#4-64 NYAMH (89) VISFDGRSKYYADSVRG (90) EIGASYYGSGGTPGY (91)

#4-65 SYYWS (92) RIYTSGSTNYNPSLKS (93) DLAARPNWFDP (94)

#4-68 SYAMS (95) AISGSGGSTYYADSVKG (96) NLPAPGYCSSTSCYALYYYYGMDV (97) クロー軽鎖 (L 鎖）

ン CDR2 (配列番 CDR3 (配列番番号 CDR1 (配列番号）号）号）

#2-4 SGSSSNIGNNYVS (10) DNNKRPS (11) GTWDSSLSAGV (12)

#2 - 6 TGTSSDIGAYDFVS (98) DV NRPS (99) SSFTTSSVWV (100)

#2-7 TGTSSDVGGYNYVS (101) ' EVSMPS (102) SSYAGSNMGV (103)

#2-16 未決定未決定未決定

#2-37 TGTSSDVGGYNYVS (4) DVSNRPS (5) SSYTSSSTLV (6)

#4-1 KSSQSVLYSSNNKDYFA (142) WAST ES (104) QQYYRFPLT (105)

#4-7 SGRSSNIESNNVN (106) SNNQRPS (107) AAWDDSLSGQV (108)

#4-28 KSSQSVLYSSNI(I(NYLA (109) WASTRES (110) QQYYSTPLT (111)

#4-36 未決定未決定未決定

#4-43 SGSSSNIGNNYVS (112) DNNKRPS (113) GTWDSSLSAGV (114)

#4-44 SGDKLGDKYAC (115) QDSKRPS (116) QAWDSSTYV (117)

#4 - 45 GGNNIGSKNVH (118) RDSNRPS (119) QWDSSTACGV (120)

#4-52 QGDSLRSYYAS (121) GKNN PS (122) NSRDSSGNHLV (123)

#4-54 TGTSSDVGGYNYVS (124) EVTK PS (125) CSYAGSYTFL (126)

#4-56 RASQSISSWLA (127) KASSLES (128) QQYNSYPYT (129)

#4-62 TGTSSDVGGYNYVS (130) EVSKRPS (131) SSYAGSNNLYV (132)

#4-64 ASQSVSRYLA (333) DASNMT (134) QQRSHWQPLT (135)

14-65 SGSSSNIGNNYVS (136) DNNKRPS (137) GTWDSSLSAW (138)

#4-68 ASQSISSYLN (139) AASSLQS (140) QQSYSTPLT (141) なお、 ¾ 5および表 6に、 # 2— 4および # 2— 6のクローンの H鎖および L 鎖可変領域のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列をそれぞれ示し、表 7に # 2 一 4および # '2— 6のクローンの C D Rのヌクレオチド配列を示す。表 5

クローン番号 H鎖可変領域アミノ酸配列 L鎖可変領域アミノ酸配列

# 2— 4 配列番号 1 5 配列番号 1 6

# 2— 6 配列番号 1 4 3 配列番号 1 4 4 表 6

クローン番号 H鎖可変領域ヌクレオチト"配列 L鎖可変領域ヌクレオチド配列

# 2— 4 配列番号 3 1 配列番号 3 2

# 2— 6 配列番号 1 4 5 配列番号 1 4 6 表 7

実施例 9 遺伝子組替えによるヒト抗体の生産 -

(1) 組換えヒト IgG発現プラスミドの構築

データベース情報を参考にヒト IgG重鎖遺伝子の翻訳開始コドンの ATGを含むようなセンスプライマーおよび翻訳中止コドンを含むアンチセンスプライマ一を作製し、 HumanSp l e en 5' — S t r e t c hcDNAL i b r a r y ( クローンテック社製）を錶型として PCRを行う。増幅した DNA断片をヒト IgG遺伝子を pT7Blue (Novagen) に組み込み塩基配列を確認する。ヒト IgG遺伝子の内部を切断しない適切な制限酵素によりヒト IgG遺伝子を pT7Blueから切り出した後、発現プラスミドである pCAGGSのクロ一ニンタ部位に挿入し、ヒト IgG重鎖発現プラスミドの構築を行う。なお、ヒト IgG軽鎖発現プラスミドの構築も重鎖の場合と同様の方法で行う。

(2) 抗体遺伝子のクローニング

ハイプリドーマ #2- 6を培養し、細胞を調製する。得られた細胞を D-PBS (Sig ma) で洗浄後、 total RNAを TRIzol Reagent (Invitrogen) を用いて単離精製する。次に Oligo-dTプライマーと SuperScriptll system (Invitrogen) を用いて一本鎖 cDNAを合成する。重鎖および軽鎖可変領域を増幅させる PCRプライマーを合成し、ハイプリドーマ由来の一本鎖 cDNAを铸型として PCRを行う。増幅した D NA断片を pT7Blue (Novagen) に組み込み塩基配列の確認を行う。

(3) ヒト-ヒトキメラ抗体発現プラスミドの構築

ヒト IgG遺伝子の重鎖可変領域を切り出すことができる適当な制限酵素を用いて重鎖可変領域を切り出し、ハイプリドーマ由来重鎖可変領域と置き換える。この時、ハイプリドーマ由来重鎖可変領域の DNA断片は、挿入する制限酵素切断部位と同じ配列を含むプライマ一により PCRで増幅させる。ハイプリドーマ由来軽鎖可変領域を有する組換えヒト IgG発現プラスミドの構築も重鎖の場合と同様の方法で行う。

(4) ヒ卜-ヒ卜キメラ抗体産生クローンの選択

CHO (CCL-61) 又は SP2/0- agl4 (ATCC CRL1581) に導入し、培養後上清に産生される目的抗体を GPVIに対する結合活性により選択する。具体的には、先ず、キメラ抗体重鎖発現プラスミド、軽鎖発現プラスミド、 pSV2_neoをそれぞれ 4pg ( 計 12pg) とトランスフエクション試薬である FUGENE6 (ロシュ ·ダイァグノスティ'クス） 60 gLを混合し、しばらく清置する。次に培養面積 150cm²の培養用フラスコにおいてセミコンフルェントの状態まで培養した細胞の培養液中にプラスミドと FuGENEの混合液を添加する。 2、 3日の培養後、細胞を 96wellマイクロプレートに 0.7個/ wellとなるように播種し、 0.2 mg/ m 1 G - 418を含む培地にてさらに 2、 3週間の培養を行う。コロニーが形成された wellから培養上清を回収し、 EI Aにて GPVIとの結合活性を調べ、結合活性を有するクローンを得る。

(5) ヒト-ヒトキメラ抗体の産生

ヒト-ヒトキメラ抗体産生ク口一ンを血清入りの培地で培養し、コンフルェントになった段階で無血清培地（Hy b r i d oma-S FM、 I n v i t r o t e c) と交換した後、さらに 2日間の培養を行う。得られた培養上清をプロティン Aカラム（P r o s e p— A、ミリポア）で精製し、精製キメラ抗体を得る。実施例 10 ハイプリドーマ由来抗 GPVI抗体の IgG4化および Fab化の作製

(1) 材料および装置

用いた材料および装置を以下に示した。

·プライマー（SIGMA Genosys Japanにて合成）

HV3-ll-a 5' GGAGTTTCCATTCGGTGATCAG 3' (配列番号 153)

IGLV2- 14- a 5' GTGCTGGGGTCTCAGGAGGCAG 3' (配列番号 154)

IgL-a 5' CTATGAACATTCTGTAGGGGC 3' (配列番号 155)

IgL-b 5' TGCAGCTCTAGTCTCCCGTGG 3' (配列番号 156)

IgM-1 5' GGGAAGGAAGTCCTGTGCGA 3' (配列番号 157) IGLVl-51-a 5' CAGCTGTGAGCGCAGAAGGCAG 3' (配列番号 158)

IGLVl-51-b 5' TCGGGACAATCTTCATCATG 3' (配列番号 159)

IgG4-a 5 ' CGGTCACATGGCACCACCTCT 3' (配列番号 160)

IgG4-c 5' TGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTC 3' (配列番号 161)

IgG4-d 5' GACCATATTTGGACTCAACTCTCTTGTCCA 3 ' (配列番号 162)

IgG4-f 5 ' GCCCATCATGCCCAGCACCTGAGTTCCTGG 3 ' (配列番号 163)

IgG4-g 5' CCAGGAACTCAGGTGCTGGGCATGATGGGC 3' (配列番号 164)

IgG4-h 5 ' TCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGC 3' (配列番号 165)

IgG4-i 5 ' GCTCTCGGGGCTGCCCTTTGGCTTTGGAGA 3' (配列番号 166)

IgG4-j 5' CCCTGGCACTCATTTACCCAG 3' (配列番号 167)

IgG4-k 5 ' GACGGGGTACGTGCCAAGCATCCT 3 ' (配列番号 168)

IgG4-m 5' AGCGCTAGCACCAAGGGCCCATCCGTCTTC 3 ' (配列番号 169)

IgG4-n 5' AGATCTTCATGGGGGACCATATTTGGACTC 3 ' (配列番号 170)

IgG4-t 5 ' TTAATGATGATGATGATGATGTGGGGGACC 3' (配列番号 171)

M4 5 ' GTTTTCCCAGTCACGACG 3' (配列番号 172)

Hc aiii EV-Scal 5' GGGCGGAGTACTGGAGACGGTGACC 3' (配列番号 173.) HchainEco47NheI 5 ' CCCCCGCTAGCGCTGGAGACGGTGACC 3' (配列番号 174) mIgG2c-a 5 ' GGATCCAAAACAACAGCCCCATCGGTCTAT 3' (配列番号 175) niIgG2c-b 5 ' TGGACAAGAMATTGAGCCCAGAGTGCCCA 3 ' (配列番号 176) mIgG2c-c 5 ' TGGGCACTCTGGGCTCMTTTTCTTGTCCA 3' (配列番号 177) mIgG2c-d 5 ' GTCCCCCATGCGCAGCTCCAGACCTCTTGG 3' (配列番号 178) mIgG2c-e 5' CCAAGAGGTCTGGAGCTGCGCATGGGGGAC 3 ' (配列番号 179) mIgG2c-f 5' TCTCAAAACCCAGAGGGCCAGTAAGAGCTC 3' (配列番号 180) mIgG2c-g 5' GAGCTCTTACTGGCCCTCTGGGTTTTGAGA 3 ' (配列番号 181) mIgG2c- 5 ' AGATCTTCATTTACCCAGAGACCGGGAGAT 3 ' (配列番号 182)

•PCR反応用酵素

Ex Taa (TAKARA BIO INC. )

10X反応バッファーおよび dNTP mixtureは付属のものを使用 •ゲノム DNA

HeLa genome lot. N34707-1 (BD Biosc iences Clontech)

マウスゲノム DNA (B6マウス尾部より抽出）

•PCR装置，

DNA Engine (MJ RESEARCH, INC. )

.ァガロースゲル電気泳動

SeaKeffl GTG Agarose (TAKAM BIO INC. )

サブマリン型電気泳動装置（ADVANCE)

5 OX TAE (2mol/L Tri s-ace tate, 0. 05mol/L EDTA) (NIPPON GENE)

分子量マーカ一 I 消化 A DNA断片）

•ゲルからの DNA断片抽出キット

QIAEX I I (QIAGEN K. K. )

•哺乳細胞用発現ベクター

pEF2cew (pEF-BOSの EFプロモータ一上流に、 CMVェンハンサーを付加した改良型発現ベクター）

• TAクローニング用ベクター及びライゲーシヨン用試薬

pT7BlueT (N0VAGEN)

TaKaRa Ligat ion Ki t ver. 2 (TAKARA BIO INC. )

• E. coli Competent cel l JM109 (TAKARA BIO INC. )

•プラスミド精製キット（QIAGEN K. K. )

•シークェンス用キットおよび解析装置

DYEnamic ET Terminator Cycle Se uenc ing Premix Ki t lot. 1767

(Amers am Biosc iences)

ABI3100 genet ic analyzer (Appl ied Biosys tems)

•培養液

ダルベッコ MEM培地（Sigma)

• トランスフエクシヨン用試薬 (2) 実験方法

用いた主な実験方法を以下に示した。

• PCR反応

酵素付属の取り扱い説明書に持って行った。以下に、反応液の組成例を示した。

反 L ί仪

TaKaRa Ex Taa (5units///L) 0.25 L

10X Ex Taq Buffer 5^L

dNTP Mixture (2.5niM each) L

human kidney first strand cDNA Ι Ι

sense primer (IOPEIOI/ U \ l

anti-sense primer (10脚 1/ U \ul

H₂0 37.75 L

(a) ァガ口一スゲル電気泳動

まず、 0.8%濃度のァガロースゲルを作製した。これを lx TAE を満たした泳動層にき、ゥエルにサンプル 5 Lをアプライ後、 135Vで 15分間泳動を行った。泳動終了後、ゲルをェチジゥムブ口マイドで染色し、さらに UV照射することでバンドを検出した。尚、分子量マーカーを同時に泳動した。

(b) ゲルからの DNA断片抽出

目的とするバンドを剃刀で切り出し、 QIAEX IIキットを用いてゲル片から抽出を行つた。方法は付属の取扱説明書に従った。抽出された DNA断片は 20 Lの滅菌水に溶解した。

(c) ライゲ一シヨン反応

抽出を終えた断片 ljLtLとクローニング用ベクターの pT7BlueTを 1 L、および ligation kit ver.2の I液 2 zLを混和し、室温で 15分間静置することで行った。

(d) 大腸菌への形質転換

コンビテント大腸菌 50 L を氷上で融解し、ライゲーシヨン反^産物を加え、そのまま氷上に 30分間静置した。 42 で 45秒間熱ショックを与え、終濃度 SO^g/niL アンピシリン含有 LBプレート上に塗布し、 37°Cで一晚インキュベートした。 (e) プラスミドの精製およびシークェンス反応

それぞれキッ卜の取り扱い説明書に従って行った。

(f) 卜ランスフエクシヨン

FuGENE6 の取り扱い説明書につて行った。 6穴プレートの場合、トランスフエクション前日に COS- 1細胞を 1. 5xlO"5cel ls/mLの密度で各ゥエルに 2mL植え込んでおく。翌日、 97 Lのダルベッコ MEM培地にの FuGENE6との発現プラスミドを混和し 15分以上静置した後、 2mLの無血清ダルベッコ MEM培地に滴下し、この培養液と交換することで、卜ランスフエクシヨンを行った。 ( 3 ) 重鎖可変領域および軽鎖をコードする遺伝子のクローニング

1 ) 各ハイプリドーマから抽出した全 RNAを、オリゴ dTプライマーを用いた逆転写反応により、一本鎖 cDNA を合成した。次に、以下に示す各反応により、各重鎖可変領域および軽鎖をコードする遺伝子断片をそれぞれ増幅した。

a ) #2-4 —本鎖 cDNAを鐯型とし、プライマー（HV3- 1卜 aおよび IgM - 1) を用いた PCR反応で重鎖可変領域の cDNAを特異的に増幅した。一方、プライマ一（IGLV1- 5卜 aおよび IgL- b) を用いた 1回目の PCR反応を行い、次にその反応産物を錶型とし、プライマ一（IGLV1- 5卜 bおよび IgL- a) を用いた 2回目の PCR 反応（nested- PCR) を行うことにより、軽鎖 cDNAを増幅した。

b ) #2 - 6 —本鎖 cDNAを鐯型とし、プライマー（HV3- 11- aおよび IgM - 1) を用いた PCR反応で重鎖可変領域の cDNAを特異的に増幅した。同様に、プライマー（IGLV2- 14- aおよび IgL- b) を用いた PCR反応を行い、軽鎖 cDNAを増幅した。

2 ) 各増幅断片を pT7- BlueTベクターにクローニングし、配列を確認した。 #2 - 4 の重鎖可変領域を有するプラスミドを pT7- #2- 4H、軽鎖を有するものを pT7- #2 - 4 λとし、 #2 - 6も同様に、それぞれ ρΤ7- #2-6Η、 ρΤ7 - #2 - 6 λとした。

( 4 ) 重鎖定常領域（C r 4) をコードする遺伝子のクローニング

HeLaゲノム DNAを錶型とし、以下のプライマー対で PCR反応を行った。その結果、 IgG4- aおよび IgG4- dでは CH1 ドメイン、 IgG4- cおよび IgG4- gではヒンジ部分、 IgG4- ίおよび IgG4- iでは CH2 ドメイン、 IgG4- hおよび IgG4-kでは CH3 ドメインというように、各ドメインをコードする遺伝子領域が増幅された。次に、これら 4種の増幅産物を混合し、プライマー IgG4- mおよび IgG4- ]' を用いた PCR 反応を行うことで、各ドメインが連結された増幅産物を得た。この増幅産物を pT7-BlueTベクターにクローニングし、重鎖定常領域（Cァ 4) をコードする配列であることを確認し、 pTK- 2232とした。

( 5 ) 抗体発現用の重鎖発現プラスミドの構築

ρΤ7-#2-4Ηおよび ρΤ7- #2-6Ηの重鎖可変領域をコードする遺伝子領域を、プライマ一（Μ4および HchainREV- Seal) を用いた PCR反応で増幅した後、その増幅産物を制限酵素 I および 5ca Iで切断することで、断片 Aを調製した。

一方、 pTK- 2232 を制限酵素 47UI および m で切断し、重鎖定常領域 (C r 4) をコードする遺伝子断片 Bを調製した。

これらの断片を、 EcoR I および Bam JU で切断して調製した発現ベクター pEF2cewの EFプロモー夕一下流に、断片 A+断片 Bとなるように連結し、各重鎖発現プラスミドを構築した。配列を確認後、 pTK- #2- 4ァおよび pTK- #2- 6ァとし。

( 6 ) Fab発現用の重鎖発現プラスミドの構築

① Fab重鎖のみを発現するプラスミドの構築

pT7- #2- 4Hおよび pT7- #2- 6Hの重鎖可変領域をコードする遺伝子領域を、プライマー（Μ4および HchainEco47NheI) を用いた PCR反応で増幅した後、その増幅産物を制限酵素 EcoR I および e Iで切断することで、断片 Cを調製した。

一方、 pTK- 2232を銬型とし、プライマー（IgG4-mおよび IgG4-n) を用いた PCR 反応を行い、 CH1 ドメインの直後に停止コドンを有する CH1遺伝子断片を増幅した。この CH1増幅断片を pT7- BlueTベクタ一にクローニングし、 pT7- IgG½nを構築した。この pT7- IgG4iimを制限酵素 \¾e Iおよび §7 IIで切断し、断片！）を調製した。

これらの断片を、 Ecom およびで切断して調製した発現ベクター pEF2cewの EFプロモーター下流に、断片 C+断片 Dとなるように連結し、各 Fab 0596

44

重鎖のみを発現するプラスミドを構築した。配列を確認後、 TK-#2-4Fab および pTK-i2-6Fabとした。

② C末端にヒスチジンタグ（His-tag) を有する Fab重鎖（Fab-His) を発現するプラスミドの構築 .

pTK-2232を錶型とし、プライマー (IgG4-mおよび IgG4-t) を用いて PCR反応を行い、 CH1 ドメインの直後に His-tagを有する CH1遺伝子断片を増幅した。この CH1増幅断片を pT7-BlueTベクタ一にクロ一ニングし、 pT7-IgG4mtを構築した。この pT7-IgG4mtを制限酵素 Nhe Iおよび Bam HIで切断し、断片 E を調製した。

こ'れらの断片を、 EcoR I および Bam HI で切断して調製した発現ベクター pEF2cew の EFプロモー夕一下流に、断片 C+断片 E となるように連結し、 C 末端に His-tagを有する Fab重鎖を発現するプラスミドを構築した。配列を確認後、 pTK-#2-4Fab-Hisおよび ρΤΚ'#2·6 Fab-Hisとした。 ( 7 ) 軽鎖発現プラスミドの構築

軽鎖遺伝子を有するプラスミド（pT7- #2- 4 λおよび pT7- #2- 6 λ ) を、軽鎖部分を切断しない適当な制限酵素（例えば Eco RIおよび Xba I等）で切り出し、断片 Fを調製した。

この断片 Fを同じ制限酵素で切断して調製した発現べクタ一 pEF2cewの EFプロモー夕一下流に連結し、各軽鎖発現プラスミドを構築した。配列を確認後、 PTK - #2 - 4λおよび ρΤΚ-#2-6 λとした。

( 8 ) 組換え抗体および Fabの発現

1 ) COS- 1細胞は 10% 胎仔ゥシ血清入りのダルべッコ MEM培地で継代し、トランスフエクシヨン前日に、 1. 5xl0' 5 cel ls/mL の密度で培養容器に植え込んだ。翌日、重鎖（あるいは Fab) 発現プラスミドおよび軽鎖発現プラスミドをトランスフエクシヨン試薬（FuGENE6、ロシュダイァグノスティックス）と適当量混和した後に、無血清のダルベッコ MEM培地に滴下し、これを培養液と交換することで、コ卜ランスフエクションを行った。その結果、 pTK- #2- 4ァおよび ρΤΚ- #2- 4 λをコトランスフエクシヨンした場合には、組換え IgG4抗体である R#2- 4抗体を培養液中に分泌発現させることができた。同様に、 pTK- #2- 6ァおよび ρΤΚ- #2- 6 λを用いることで R#2- 6 抗体を、 pTK - #2-4Fabおよび pTK - #2 - 4 、あいは pTK - #2- 6Fabおよび ρΤΚ- #2-6 λを用いることで、組換え Fab (R#2-4Fa および R#2 - 6Fab) を、 pTK- #2-4Fab- His および pTK- #2- 4 λ、あるいは pTK- #2- 6Fab- Hi s および ρΤΚ-#2-6 λを用いることで、 Hi s- tagを有する組換え Fab (M2- 4Fab- Hisおよび R#2- 6Fab- His) を培養液中に分泌発現させることができた。

2 ) 5% C0₂存在下、 37°Cで 2〜3日間培養し、培養液を回収した。

( 9 ) 組換え抗体の精製

【組換え IgG抗体の精製】

培養液からの、組換え IgG4 抗体 (R#2- 4 抗体および R#2-6 抗体）の精製は、

Prosep- Aカラム (MILLIPORE) を用いて行い、 PBS (pH 7. 4) で透析後、 280nmの吸光度より濃度を算出した。

【組換え Fabの精製】

1 ) 培養液からの、組換え Fab分子 (R#2- 4Fabおよび R#2- 6Fab)の精製は、抗ヒト lambda軽鎖抗体カラム（自家作製）を用いて行った。

2 ) 培養液からの、 Hi s- tagを有する組換え Fab分子 (R#2- 4Fab- Hi sおよび R#2- 6Fab- His)の精製は、先ず Hi- Trap Che l at ing HP (Amersham)を用いて 1 回目の精製を行った後、抗ヒト lambda軽鎖抗体カラムを用いて 2回目の精製を行うことで達成した。

3 ) 全ての Fab は精製後、 PBS (pH 7. 4) で透析し、 280ηπιの吸光度より濃度を算出した。尚、血小板凝集阻害実験に使う Fabは生理食塩水で透析した。実施例 1 1 ヒト GPVI -マウス Fc融合蛋白質の作製

( 1 ) GPVI- mFc融合蛋白発現プラスミドの構築

1 ) マウスゲノム DNAを铸型とし、以下のプライマー対で PCR反応を行った。その結果、 mIgG2c- aおよび mIgG2c-cでは CH1 ドメイン、 mIgG2c- bおよび mIgG2c- eではヒンジ部分、 mIgG2c- dおよび mIgG2c-gでは CH2 ドメイン、 mIgG2c- f および mIgG2c- h では CH3 ドメインというように、マウスィムノグロブリン (mIgG2c) 重鎖定常領域の各ドメインをコードする遺伝子領域が増幅された。次に、これら 4種の増幅産物を混合し、プライマ一 niIgG2c- aおよび mIgG2c-liを用いた PCR反応を行うことで、各.ドメインが連結された増幅産物を得た。この増幅産物を pT7- BlueT ベクタ一にクローニングし、重鎖定常領域（C r 2c) をコードする配列であることを確認し、 pT7- mIgG2cとした。

2 ) この pT7- mIgG2cからマウス Fc領域をコードする遺伝子断片を制限酵素 BMI HIおよび Ιφη Iで切り出し、断片 Hを調製した。一方、 CAGGS-GPVI-Fcプラスミドから、ヒ卜 GPVI の細胞外ドメインをコードする遺伝子断片を制限酵素 Xba Γおよび ^ I Iで切り出し、断片 I を調製した。これらの断片を、 Xba I および Ιφη Iで切断して調製した発現べクタ一 pEF2cewの EFプロモーター下流に、断片 H+断片 I となるように連結し、ヒト GPVI とマウス Fc 融合蛋白（GPVI - mFc) を発現するプラスミドを構築した。配列を確認後、 pTK- 2249とした。

( 2 ) GPVI- mFc融合蛋白質の発現および精製

1 ) COS- 1細胞は 10% 胎仔ゥシ血清入りのダルべッコ MEM培地で継代し、トランフエクシヨン前日に、 1. 5xl(T5 ce l l s/mL の密度で培養容器に植え込んだ。翌日、 TK-2249 をトランスフエクシヨン試薬 (FuGENE6、ロシュダイァグノスティックス）と適当量混和した後に、無血清のダルベッコ MEM培地に滴下し、これを培養液と交換することで、卜ランスフエクションを行った。

2 ) 5% C0₂存在下、で 2〜3日間培養し、培養液を回収した。

3 ) 培養液からの、 GPVI- mFc融合蛋白質の精製は、 Prosep- Aカラム（MILLIPORE ) を用いて行い、 PBS (pH 7. 4) で透析後、 280nmの吸光度より濃度を算出した。実施例 1 2 各種抗 GPVI抗体の GPVI結合活性の測定 (Cell cytometry)

健常人より採血した血液から遠心分離により血小板分画を調製した。 5 X 10⁶ の血小板を 5%ヒト血漿、 0.5%非働化胎仔ゥシ血清（FBS) 含有 PBS -、 50 L に懸濁し、実施例 1 0で作製した各種組換抗 GPVI ヒト抗体（I g G 4 ) 2 z g を添加後、室温 1時間ィンキュベートした。 0.5%非働ィ匕 FBS含有 PBS -、 lmL で 2回洗浄後、 0.5%非働化 FBS含有 PBS -、 50 Lに再懸濁し、の抗ヒト IgG抗体 FITC 標識抗体を加えた後、室温 1 時間インキュベーションした。 0.5%非働化 FBS含有 PBS -、 lmLで 2回洗浄後、 Cytometric FC500 (ベックマンコ一ルタ一）で FITC陽性血小板数を測定した。

この結果、 R#2-6抗体を反応きせた血小板は 90%以上が、また R#2-4抗体では 68%が FITC陽性細胞であつた。

なお、図 4は、ヒト末梢血より調製した血小板に組換抗 GPVI ヒト抗体 (R#2-4および R#2_6) が結合することを示す図である。図 4中、白抜きのヒストグラムは陰性対照としたヒト全 IgG を反応させた際の蛍光強度分布を示す。灰色で示したヒストグラムは R#2-4あるいは R#2-6抗体を反応させた際の蛍光強'度分布を示す。実施例 1 3 各種抗 GPVI抗体の GPVI結合活性測定 (ELISA法）

GPVI-hFcキメラタンパク質あるいは GPVi-mFcキメラタンパク質を PBS-で 3 g/mLに調製し、 ELISA用 96wellプレートに 50 z L/wellずつ添加し、 37°C、 2時間インキュベーションすることにより固相化した。 400 / L/wellの PBS-で 5 l 洗浄した後、 2%ス夕ピリガード/ PBS-で室温 1 時間ブロッキング処理した。実施例 1 0で調製した各種組換抗 GPVIヒト抗体（ I g G 4 ) を GPVI-Fc固相化プレートに 10 g/mL の濃度で添加し、室温 2 時間反応させた。 0.05%T een20含有 PBS-で 3回、 PBS-で 2回洗浄したのち、二次抗体 (抗ヒト κ -軽鎖抗体 HHP標識あるいは抗ヒト λ—軽鎖抗体 HRP標識)をそれぞれ PBS- で 1000倍希釈、 2000倍希釈し、各 wellに添加、室温 2時間ィンキュベ一ションした。 0.05%Tween20含有 PBS-で 3回、 PBS-で 2回洗浄したのち、 TMB溶液を添加し、室温 20分発色させ、 1 M硫酸を加え発色を停止させて、 450ηπι の吸光度を測定した。

この結果、陰性対照としたヒト全 IgGでは GPVI-hFc とほとんど結合しない力 R#2- および R#2-6抗体は 10 g/mLで GPVI-hFcに対して著明な結合活性を示した（図 5 ) 。また、 R#2-6および R#2-4抗体は GPVI-niFcにも親和性を示した。実施例 1 4 全血及び血小板に及ぼす抗 GPVI抗体単独の影響

( 1 ) 全血を用いた血餅形成における抗 GPVI抗体の影響

健常人より抗トロンピン剤を用いて採血した血液、 2 mLに各種 GPVI抗体を最終濃度 30 z g/mL になるよに添加し、 37 で 3時間インキュベーションした。その後、目視により血餅形成を確認した。既知の抗 GPVI抗体、例えば、自己免疫性血小板減少患者血中由来 I g Gは単独で血小板凝集を惹起するため (非特許文献 2 ) 、この系では凝固系が過度に活性化され血餅形成を引き起こすと考えられるが、コントロール IgG添加の場合と同様に、脆- 4及び R#2-6抗体添加のいずれにおいても血餅形成は全く認められなかづた。

{ 2 ) 血小板に及ぼす抗 GPVI抗体の影響

実施例 6に準じて、 P R Pを用いて、抗体単独での血小板凝集惹起作用を測定した。その結果、 100 x g/mLの濃度においても R#2-4及び R#2_6抗体は単独ではヒト血小板凝集を惹起しなかった。実施例 1 5 ヒト IgG化抗 GPVI抗体による血小板のコラーゲン応答性に及ぼす ¾果

健常人より抗トロンピン剤用いて採血した血液、 2 mLに各種 GPVI抗体を添加し、 37°Cで 3時間インキュベーションした。その後、血小板を単離し、 3 X 10^A8 platelets I mLに調製し、 CaCl₂溶液を終濃度で 1 mMとなるように添加し、 37 °Cで撹拌しながら 3分間インキュベートした。コラーゲン溶液を終濃度で l〜2 g/mLとなるように加え、血小板凝集能測定装置（エー ·シー ·メディカル株式会社、 MCMへマトレーサー 801) にて濁度を測定した。

この結果、 30 g/mLの R#2-6または R#2-4抗体で処理した血小板ではコラ一ゲンに対する血小板凝集能の顕著な低下が認められた。表 8

抗体濃度最大凝集率

Control ― 7 0 %

R#2-4 30 i g/mL 1 0 %

R#2-6 30 g/mL 2 % 産業上の利用可能性

本発明の抗体は、ヒト血小板上の GPVIと特異的に結合することにより血小板凝集能を低下させるので、例えば血小板薬等の医薬として用いることができる。また、本発明のヒト抗体は、医薬としてヒトに投与しても異種抗体、キメラ抗体、ヒ卜化抗体の持つ免疫原性がない点で有用である。本発明の抗体で単独でヒト血小板の凝集を惹起しないものは、例えば Fabにする等の処理をせずにそのまま医薬として投与することができる。本発明の抗体は既存の抗体よりも低用量でコラーゲンによる血小板凝集を抑制することができ、より少ない用量で医薬として有効である。 ―

Claims

請求の範囲

1 . ヒト血小板膜糖蛋白質 VIと特異的に結合し、単独ではヒト血小板凝集を惹起しないヒ卜抗体またはその活性断片。.

2 . ヒ卜血小板膜糖蛋白質 VI と特異的に結合し、生体内に投与することでコラーゲンによるヒト血小板の凝集を抑制するヒト抗体またはその活性断片。

3 . ヒト G PVIと特異的に結合し、血小板上の G PVIとコラ一ゲンとの結合を特異的に阻害する、血小板上の機能的な G PVI を消失させる、あるいは、予めヒト血小板と接触させることによりヒト血小板がコラーゲンに応答して凝集する能力を低下もしくは欠如させる、いずれか一つ以上の作用を持つヒト抗体まはその活性断片

4 . ヒト血小板膜糖蛋白質 VI に特異的に結合し、コラーゲンによるヒト血小板の凝集を抑制するが、単独ではヒト血小板凝集を惹起しないヒト抗体またはその活性断片。

5 . 配列番号 4 7のアミノ酸配列を VH CDR1に、配列番号 4 8のアミノ酸配列 ¾ VH CDR2に、配列番号 4 9のアミノ酸配列を VHCDR3 に、配列番号 9 8のアミノ酸配列を VLCDR1に、配列番号 9 9のアミノ酸配列を VLCDR2に、配列番号 1 0 0のアミノ酸配列を VLCDR3 に、それぞれ有する抗体もしくはその活性断片、または配列番号 7のアミノ酸配列を VH CD 1 に、配列番号 8のアミノ酸配列を VH CDR2に、配列番号 9のアミノ酸配列を VHCDR3に、配列番号 1 0のアミノ酸配列を VLCDR1に、配列番号 1 1のアミノ酸配列を VLCDR2に、配列番号 1 2のァミノ酸配列を VLCDR3に、それぞれ有する抗体もしくはその活性断片。

6 . 請求項 1ないし 5の抗体またはその活性断片を産生する細胞。

7 . 請求項 1ないし 5の抗体またはその活性断片の H鎖及び/または L鎖をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチド

8 . 請求項 1ないし 4の抗体またはその活性断片を有効成分として含有する医薬組成物。

9 . 組換えヒトーヒ卜キメラ抗体の製造方法。