CN100558895C - 抗血小板膜糖蛋白vi单克隆抗体 - Google Patents

Abstract

本发明提供与人血小板膜糖蛋白VI特异性结合，但单独不会引发人血小板凝聚的人抗体或其活性片段；产生上述抗体或其活性片段的细胞；含有上述抗体或其活性片段作为有效成分的药物组合物。上述细胞例如可如下获得：通过体外免疫法活化对GPVI产生自身抗体的人的末梢血淋巴细胞，制备与小鼠骨髓瘤细胞的杂交瘤，选择分泌具有与GPVI的结合能力，具有抑制胶原导致的人血小板凝聚的活性的单克隆抗体的杂交瘤。

Description

抗血小板膜糖蛋白VI单克隆抗体

技术领域

本发明涉及人血小板膜糖蛋白VI(以下可简称GPVI)的抗体和产生该抗体的细胞。

背景技术

血小板在血液凝固、机体防御中担负着极其重要的作用，由其生理学作用可以阐明多种病态相关。特别是在血小板形成止血栓的功能中引人注目，例如，血管内皮细胞受到损伤，则血管内皮下的主要基质蛋白——胶原暴露出来，血小板与其粘附。接着，通过来自胶原的信号，血小板被活化，最终，血小板经由血纤蛋白原凝聚。根据情况，这成为血栓栓塞性疾病等病状的原因，作为治疗的目标而引人注目。

以往，为了由于血小板凝聚而导致的血栓形成的治疗、预防，人们使用了阿司匹林、噻氯匹定、GPIIb/IIIa拮抗剂等抗血小板药物，但在有效性和出血等副作用方面人们也指出了很多的问题，人们希望有不具上述问题、具有充分的安全性和确切且适合的作用的优异的抗血小板药面世。

已经明确：存在于血小板膜上的GPVI是血小板的胶原受体，由胶原刺激导致血小板活化中起主要的作用(非专利文献1：高山博史，日本学血栓止血学会志，2003年，第14卷，第2号，参照75-81页)。即，Sugiyama等人在自身免疫性血小板减少患者的血小板中发现了62kDa膜蛋白特异性缺失，未见胶原导致的血小板凝聚(参照非专利文献2：Tateo Sugiyama等6人，Blood，(美国)，1987年，第69卷，第6号，1712-1720页)，还有报告指出，该患者的血小板中，缺失的蛋白是GPVI，由患者的血清纯化得到的抗体Fab片段抑制胶原引发的血小板凝聚(参照非专利文献2和非专利文献3：Masaaki Moroi等4人，Journalof Clinical Investigation，(美国)，1989年，第84卷，第5号，1440-1445页)。

目前，Sugiyama等人(参照非专利文献2)和Takahashi等人(参照非专利文献4)报道了来自自身免疫疾病患者的抗人GPVI自身抗体。但是，Sugiyama等人的报告中，由患者的血浆纯化得到的抗人GPVI自身抗体具有引发血小板凝聚的作用，不可直接用于药物。非专利文献4(Hoyu Takahashi等2人，American Journal of Hematology，美国，2001年，第67卷，第4号，262-267页)中记载：有推测为GPVI的约62kDa的蛋白的自身抗体存在，以及该抗体引发血小板凝聚。另外，为了将来自这些患者的抗GPVI抗体作为药物应用于临床，必须以稳定的品质、大量生产安全性高的抗体，但工业生产的方法尚未确立。

目前制备的抗GPVI抗体有：抗小鼠GPVI单克隆大鼠抗体(参照专利文献1：EP1228768)、以及抗人GPVI单克隆小鼠抗体(参照专利文献2：WO01/00810和专利文献3：WO02/080968，Thromb Haemost。2003年7月号；89(6)：996-1003)。它们是来自非人动物的抗体，施用于人时，具有高度的免疫原性(也可以称作“抗原性”)，因此有副作用的危险性，将该抗体直接施用于人是不适当的，人们希望施用于人的抗体是纯粹的来自人的人抗体。

另外，采用噬菌体显示法等制备识别人GPVI的人单链抗体(scFv)(参照专利文献2、专利文献3和非专利文献5：Peter A Smethurst)共16人、Blood，(美国)，2002年，第100卷，第11号，474a页)。这些单链抗体是通过肽接头使人抗体的VH与VL连接而成的，是具有来自人的可变区的抗体，但与细胞产生的通常的免疫球蛋白相比，通常与抗原的亲和性低，在机体内的半衰期也短。

通过CDR(互补决定区)移植等制备人源抗体的方法已是公知的，但CDR的氨基酸序列、以及大多情况下的支架区(FR)的一部分来自非人动物抗体，抗体的氨基酸序列的全部不是来自人，因此有人认为有可能在机体内产生对所施用的抗体的抗体，从免疫原性方面来看，作为药物，并不是有效且安全的。关于人抗体的制备已有很多报道，这些报道的方法都存在各种问题，目前的现状是尚未认识到可适合所有抗原的常规化方法，通常难以获得高滴度的人抗体。

发明内容

由此，在人们需求安全性高、有效性优异且易于使用的药物作为抗血小板药的状况下，迫切需要的是可以施用于人的纯粹地来自人的抗GPVI抗体。

本发明的目的在于提供与存在于人血小板膜上的糖蛋白——GPVI特异性结合的新型抗体，优选单克隆抗体。特别提供可施用于人、有效且副作用方面没有问题的纯粹来自人的抗GPVI人抗体。还提供与人GPVI特异性结合、含有新的CDR序列的抗体。

进一步提供产生这些抗体的细胞，具体提供特定的杂交瘤。

本发明人为解决上述课题，以产生GPVI的自身抗体的人淋巴细胞为出发材料，着力获得有效抑制经由GPVI的血小板凝聚的人抗体。基于该想法，进行了深入地研究，结果发现：在通过特定条件的体外免疫法活化末梢血淋巴细胞，制备与小鼠骨髓瘤细胞的杂交瘤时，从多个杂交瘤中成功地获得了产生具有与GPVI的结合能力，具有抑制胶原导致的血小板凝聚的活性的抗体的杂交瘤。分离该克隆，进一步研究，结果成功地获得了编码该抗体的基因，明确了该抗体的CDR的氨基酸序列是新的序列。并通过基因重组技术制备了重组抗体，从而完成了本发明。

本说明书中，将杂交瘤(例如克隆#2-6)产生的抗体记为#2-6抗体，将由该杂交瘤的抗体基因进行基因工程重组的抗体记为R#2-6抗体。

本发明的第1方案是与人GPVI特异性结合的人抗体，优选单克隆抗体(以下分别记为抗人GPVI抗体和人GPVI单克隆抗体)或其活性片段，优选单独不会引发人血小板凝聚的抗体或其活性片段。具体为：

(1)与人GPVI特异性结合，通过体内施用，抑制胶原导致的人血小板凝聚的人抗体或其活性片段，优选将该抗体或活性片段体内施用后，对于由血液中分离出的血小板，由胶原引发的凝聚能比通常的血小板低或未观察到；

(2)具有以下任何一个或以上的作用的人抗体或其活性片段：与人GPVI特异性结合，特异性抑制血小板上的GPVI与胶原的结合，使血小板上的功能性GPVI消失，或者通过预先与人血小板接触，抑制胶原导致的血小板凝聚，即，使人血小板因应答胶原而凝聚的能力降低或缺失；

(3)上述(1)-(2)的抗体或其活性片段，该抗体或其活性片段将血小板上的人GPVI摄入该血小板的细胞内(内化)，或者通过切断来抑制胶原导致的人血小板凝聚。

上述(1)-(3)的抗体优选为单独不引发人血小板凝聚和/或体内施用时不会引起血小板减少的抗体。优选的例子有：克隆#2-6或#2-4的杂交瘤所产生的抗体或将其与人IgG、更优选人IgG4重组的抗体。另外，本发明的抗体是人GPVI与抗体的解离常数(Kd值)优选为100nM或以下，更优选为50nM或以下的抗体。本发明的抗体的活性片段只要具有与GPVI的结合能力即可，例如是Fab(抗原结合片段)、Fab’、F(ab’)₂、单链抗体(scFv)、二硫键稳定化抗体(dsFv)、含有CDR的肽等。

具体来说，是

(4)与人GPVI特异性结合，特异性抑制胶原导致的人血小板凝聚、但不抑制凝血酶导致的凝聚，单独不会引发人血小板凝聚的人抗体或其活性片段。在与抑制由胶原导致的血小板凝聚的浓度或用量同等、优选10倍、更优选100倍、进一步优选1000倍的情况下单独不会显著引发人血小板凝聚的抗体或其活性片段。

这里，上述(1)-(4)的抗体中，抑制人GPVI与胶原的结合的抗体优选以10nM或以下、更优选以1nM或以下、进一步优选0.1nM或以下的解离常数(Kd值)抑制人GPVI与胶原的结合。

本发明的抗体并不限定为特定的克隆，具有与本发明的优选的例子(#2-6、#2-4、R#2-6或#2-4抗体等)同样作用的抗体都包含在本发明的范围。本发明的抗体的作用的有无可以通过实施例所示的方法或公知的方法确认。

与本发明优选的抗体在GPVI上的结合部位或表位相同或至少部分相同的抗体、例如在与GPVI的结合中存在互相竞争的关系的抗体也包含在本发明的范围内。与本发明的抗体的结合部位是否有共通性，可以按照实施例记载的方法或公知的方法确认。

本发明的第2方案是含有新型的CDR氨基酸序列或可变区氨基酸序列的抗人GPVI抗体，优选为单克隆抗体。具体来说，是

(5)抗人GPVI抗体或其活性片段，其中，至少抗体的H链或L链一方中的3组CDR、优选抗体的H链和L链双方的6组CDR含有表4记载的克隆、优选选自克隆#2-6和#2-4的任意杂交瘤产生的抗体的CDR氨基酸序列，以此作为分别对应的CDR的氨基酸序列；

(6)VH CDR1中含有SEQ ID NO.47的氨基酸序列、VH CDR2中含有SEQ ID NO.48的氨基酸序列、VH CDR3中含有SEQ ID NO.49的氨基酸序列、VLCDR1中含有SEQ ID NO.98的氨基酸序列、VLCDR2中含有SEQ ID NO.99的氨基酸序列、VLCDR3中含有SEQID NO.100的氨基酸序列的抗体或其活性片段，或者VH CDR1中含有SEQ ID NO.7的氨基酸序列、VH CDR2中含有SEQ ID NO.8的氨基酸序列、VH CDR3中含有SEQ ID NO.9的氨基酸序列、VLCDR1中含有SEQ ID NO.10的氨基酸序列、VLCDR2中含有SEQ ID NO.11的氨基酸序列、VLCDR3中含有SEQ ID NO.12的氨基酸序列的抗体或其活性片段；

(7)抗人GPVI抗体或其活性片段，其中，至少抗体的H链或L链的可变区、优选抗体的H链和L链双方的可变区含有表4记载的克隆、优选选自克隆#2-6和#2-4的任意杂交瘤产生的抗体所具有的可变区的氨基酸序列，以此作为分别对应的可变区的氨基酸序列；

(8)H链的可变区含有SEQ ID NO.143的氨基酸序列、L链的可变区含有SEQ ID NO.144的氨基酸序列的抗体或其活性片段，或者H链的可变区含有SEQ ID NO.15的氨基酸序列、L链的可变区含有SEQ IDNO.16的氨基酸序列的抗体或其活性片段；

(9)#2-6细胞或#2-4细胞产生的单克隆抗体或其活性片段。

本发明的第3方案是产生第1或第2方案的抗体的细胞。具体来说，是

(10)产生上述(1)-(9)记载的任何抗体的转化细胞、

(11)上述(10)的细胞，该细胞为#2-6细胞或#2-4细胞。

本发明的第4方案是多核苷酸或核酸，该多核苷酸或核酸含有编码第1或第2方案的抗体或其活性片段的至少H链或L链一方中的3组CDR、优选可变区的碱基序列。具体来说，是编码第1或第2方案的抗体或其活性片段的多核苷酸，

(12)多核苷酸，该多核苷酸含有在表4记载的克隆、优选选自克隆#2-6和2-4的任意的杂交瘤的抗体的基因中编码分别对应的CDR的碱基序列，以此作为编码至少抗体的H链或L链一方中的3组CDR、优选抗体的H链或L链两方的6组CDR的碱基序列；

(13)分别含有编码VH CDR1的SEQ ID NO.147的碱基序列、编码VH CDR2的SEQ ID NO.148的碱基序列、编码VH CDR3的SEQ IDNO.149的碱基序列、编码VL CDR1的SEQ ID NO.150的碱基序列、编码VL CDR2的SEQ ID NO.151的碱基序列、编码VL CDR3的SEQID NO.152的碱基序列的多核苷酸，或者分别含有编码VH CDR1的SEQ ID NO.23的碱基序列、编码VH CDR2的SEQ ID NO.24的碱基序列、编码VH CDR3的SEQ ID NO.25的碱基序列、编码VL CDR1的SEQ ID NO.26的碱基序列、编码VL CDR2的SEQ ID NO.27的碱基序列、编码VL CDR3的SEQ ID NO.28的碱基序列的多核苷酸；

(14)多核苷酸，该多核苷酸含有在表4记载的克隆、优选选自克隆#2-6和#2-4的任意的杂交瘤的抗体基因中编码分别对应的可变区的碱基序列，以此作为至少抗体的H链或L链的可变区、优选抗体的H链和L链两方的可变区；

(15)含有编码H链的可变区的SEQ ID NO.145的碱基序列和编码L链的可变区的SEQ ID NO.146的碱基序列的多核苷酸，或者含有编码H链的可变区的SEQ ID NO.31的碱基序列和编码L链的可变区的SEQ ID NO.32的碱基序列的多核苷酸。

本发明的第5方案是制备第1或第2方案的抗体的方法。具体来说，制备第1或第2方案的抗体的方法包括，

(16)包含培养上述(10)的细胞的步骤、以及收集该细胞产生的单克隆抗体的步骤的制备方法；

(17)包含培养上述(10)的细胞的步骤、以及收集该细胞产生的单克隆抗体的步骤的制备方法；

(18)包含使用第4方案的多核苷酸、含有该多核苷酸的表达载体、含有该多核苷酸或该表达载体的细胞的任意的步骤的制备方法。

本发明的第6方案涉及含有本发明第1或第2方案的抗体为有效成分的药物组合物，优选为用于血栓性、栓塞性或动脉硬化性疾病的预防和/或治疗的药物组合物。

本发明的第7方案是使用本发明第1或第2方案的抗体对试样中GPVI进行检测或定量，由此来进行疾病的诊断的方法，优选对血液凝固异常相关疾病进行诊断的方法。

本发明的第8方案是由重组人抗体、特别是重组人-人嵌合抗体、具体说就是通过基因工程的方法重组人抗体(例如IgM抗体)来制备其它类的人抗体(例如IgG抗体、特别是人IgG4抗体)或编码它们的多核苷酸的方法，该方法包含例如通过基因工程方法重组编码杂交瘤产生的抗体(例如人IgM)的多核苷酸、和公知的人抗体(例如IgG4抗体)的多核苷酸的步骤。该方法有：以杂交瘤的mRNA和/或基因组DNA为模板的PCR法，具体有实施例9、优选实施例10记载的方法。实施例10中，以基因组DNA为模板，通过PVR扩增多个外显子，将这些多种(IgG有4种)的PCR扩增产物混合，同时实施PCR，可以简便地制备编码目标抗体的多核苷酸。

附图简述

图1是表示构建GPVI-Fc表达质粒pCAGGS-GPVI-Fc的流程图。

图2是表示构建用于制备重组病毒的转移载体的克隆——pYNG-GPVI-Fc的流程图。

图3是表示通过与GPVI-Fc的反应性，由ELISA法测定18种抗GPVI单克隆人抗体的结合活性的结果图。图4是表示重组抗GPVI人抗体(R#2-4和R#2-6)与由人末梢血制备的血小板结合的图。

图5是表示各种人IgG化GPVI抗体与GPVI-hFc的结合性的图。

实施发明的最佳方式

(构成)

本发明的第1方案的抗体是特异性识别存在于人血小板上的膜糖蛋白GPVI的抗体。本发明的抗体所识别的GPVI不限于血小板上的，例如也可以识别巨核细胞的GPVI。以下，进一步详细说明本发明。

本发明的抗体是单克隆抗体。该单克隆抗体的制备方法不限于特定的方法，例如可以是杂交瘤产生的单克隆抗体、掺入抗体的基因的重组细胞所产生的单克隆抗体、或者由EB病毒转化的细胞所产生的单克隆抗体等任何抗体。

人抗体是指可变区全体和恒定区全体都含有来自人的氨基酸序列的抗体。本发明的人抗体的制备方法不限于特定的方法，例如可以是人-人杂交瘤所产生的人抗体、转基因动物所产生的人抗体、掺入人抗体的基因的重组细胞所产生的人抗体、由EB病毒转化的人细胞所产生的抗体、或者用产生自身抗体的人的淋巴细胞制备的杂交瘤所产生的人抗体的任何抗体。

本发明的抗体是与人GPVI特异性结合的抗体。优选本发明的抗体中，人GPVI与抗体的解离常数(Kd值)为100nM或以下，更优选为50nM或以下。测定人GPVI与抗体的解离常数的方法不限于特定的方法，可通过常规方法进行。例如可使用固定于芯片上的GPVI-Fc，通过如BIACORE3000这样的蛋白质相互作用分析装置来测定。具体如实施例7所示。

本发明的抗体具有抑制由胶原导致的人血小板凝聚的作用。这里，血小板凝聚可通过公知的方法测定，例如可用血小板凝聚能测定装置等，以透光率为指标，通过计算凝聚率来测定，通常，以透光率为最大的点的凝聚率(以下可称为最大凝聚率)表示。在后述的实施例6所记载的方法中，本发明的抗体在优选10μg/mL或以下、更优选1μg/mL或以下、进一步优选0.1μg/mL或以下的浓度下，使最大凝聚率减少至优选对照的50％或以下、更优选对照的30％或以下、进一步优选对照的20％或以下、最优选对照的10％或以下。测定抑制胶原导致的人血小板凝聚的方法不限于上述方法，可通过常规方法进行。还优选在实施例6所记载的方法中具有抑制胶原引发人血小板凝聚的作用、即不管是否有直接的作用，通过使人血小板应答胶原而凝聚的能力降低或缺失，间接地抑制胶原引发人血小板凝聚的作用的抗体。例如在实施例15记载的方法中，本发明的抗体在例如30μg/mL或以下、优选10μg/mL或以下、更优选1μg/mL或以下的浓度下，优选使最大凝聚率减少至对照的30％或以下、优选对照的10％或以下、进一步优选对照的5％或以下。

本发明的抗体优选不抑制胶原以外的引发血小板凝聚的物质例如凝血酶导致的凝聚，在后述的实施例6记载的方法中，本发明的抗体在优选0.1μg/mL或以上、更优选1μg/mL或以上、进一步优选10μg/mL或以上、特别优选100μg/mL或以上的抗体浓度下，最大凝聚率优选为对照的80％或以上、更优选为对照的85％或以上、进一步优选为对照的90％或以上、特别优选为对照的95％或以上。测定对由胶原以外的引发血小板凝聚的物质导致的人血小板凝聚的抑制的方法不限于上述方法，可通过其它常规方法进行。

即在引发血小板凝聚的物质不存在下，本发明的抗体单独不会促进或引发人血小板凝聚，在后述的实施例6记载的方法中，优选在0.1μg/mL或以上、更优选1μg/mL或以上、进一步优选10μg/mL或以上、特别优选100μg/mL或以上的抗体浓度下，最大凝聚率优选为20％或以下、更优选为10％或以下。在单独的抗体下测定血小板凝聚的方法不受限定，可通过常规方法进行。另外，例如使用全血、优选经抗凝血剂(阿加曲班等)处理的全血，可以间接评价对血小板的影响。实施例14中给出了一例。

目前所报告的几乎所有的人GPVI的抗体，包括上述人自身抗体在内，单独的抗体在体外具有活化血小板的作用、和/或引发或促进血小板凝聚的作用，因此在施用于机体时，有可能引起血小板减少。有报道称：以Fab片段等的形式不会引发血小板凝聚，但在机体内，由于某些原因，不能完全否定Fab发生交联或凝聚，显示与IgG等同样的问题的可能性。因而，优选不仅抗体的活性片段，即使是完整的抗体分子、例如IgG的形式也不显示上述作用或上述作用低的抗GPVI抗体。

另外，自然形态的抗体分子例如IgG等在机体内的动态和稳定性优异。通常，与Fab等片段相比，IgG在血液中的半衰期长很多，特别是血栓形成等慢性疾病或需要长时间施用抗体的病态中，希望是血液中半衰期长的分子形态，特别优选IgG。

本发明的抗体可以特异性抑制血小板上的GPVI和胶原的结合，在后述的实施例7记载的方法中，本发明的抗体为优选以100μg/mL或以下、更优选100μg/mL或以下、进一步优选1μg/mL或以下、特别优选0.1μg/mL或以下的浓度50％抑制GPVI与胶原的结合的抗体。测定胶原与GPVI的结合的方法不限于特别的方法，可按照常规方法进行。

通过体内施用，本发明的抗体抑制胶原导致的血小板凝聚。可以认为本发明的抗体抑制胶原导致的血小板凝聚的机理是：(i)本发明的抗体抑制因血管内皮细胞伤害而暴露的胶原与存在于血小板上的GPVI的结合；(ii)预先使本发明的抗体与存在于血小板表面上的GPVI结合，形成不能与胶原结合的状态；(iii)通过本发明的抗体与血小板和/或巨核细胞表面上的GPVI结合而将GPVI摄入内部(内化)，结果使GPVI从血小板表面消失；或者(iv)通过本发明的抗体所具有的活性，切断存在于血小板和/或巨核细胞表面的GPVI，结果使GPVI从血小板表面消失等。本发明的人抗体对于胶原导致的血小板凝聚的抑制的机理可以是任何一种，也可以兼具多种机理。

本发明的第2方案有：含有新型CDR氨基酸序列或可变区氨基酸序列的抗人GPVI单克隆抗体。

抗体的重链和轻链的N末端一侧存在可变区，分别称为重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)。可变区内存在互补决定区(CDR)，该部分担负着抗原识别的特异性。可变区除CDR以外的部分具有保持CDR结构的作用，称为支架区(FR)。重链和轻链的C末端存在恒定区，分别称为重链恒定区(CH)、轻链恒定区(CL)。

重链可变区中存在第一互补决定区(CDR1)、第二互补决定区(CDR2)和第三互补决定区(CDR3)三个互补决定区。将重链可变区中的三个互补决定区总括起来称为重链互补决定区。轻链可变区中也同样，存在第一互补决定区(CDR1)、第二互补决定区(CDR2)和第三互补决定区(CDR3)三个互补决定区。将轻链可变区中的三个互补决定区总括起来称为轻链互补决定区。

本发明的抗体的CDR序列并没有限定，优选抗体含有作为VHCDR1的SEQ ID NO.47的氨基酸序列、作为VH CDR2的SEQ IDNO.48的氨基酸序列、作为VH CDR3的SEQ ID NO.49的氨基酸序列、作为VL CDR1的SEQ ID NO.98的氨基酸序列、作为VL CDR2的SEQID NO.99的氨基酸序列或作为VL CDR3的SEQ ID NO.100的氨基酸序列中的任何一个或以上，优选含有H链的三个、更优选含有全部的氨基酸序列。

本发明的抗体的VH和VL的氨基酸序列不受限定，优选的抗体有：含有作为VH的SEQ ID NO.143的氨基酸序列或作为VL的SEQ IDNO.144的氨基酸序列的任意一个或以上的抗体，或者含有作为VH的SEQ ID NO.15的氨基酸序列或作为VL的SEQ ID NO.16的氨基酸序列的任意一个或以上的抗体。

本发明的抗体不必限定于特定的氨基酸序列，在对其活性和/或抗原性不产生实质影响的范围内，允许在本发明的抗体的氨基酸序列中，例如在可变区、特别是FR部分进行1至多个氨基酸残基的附加、缺失、置换和/或插入。

本发明的抗体为恒定区含有优选来自人抗体、更优选来自人IgG、进一步优选来自人IgG4的氨基酸序列的抗体。

本发明的抗体并不限定于特定的分子种类。抗体、即免疫球蛋白的结构含有重链(H链)和轻链(L链)，根据重链的类型(γ、α、μ、δ、ε)而分为5种同型(IgG、IgA、IgM、IgD、IgE)。其中，IgG和IgA由于重链不同(例如人有γ1、γ2、γ3、γ4、α1、α2)而分有亚类(例如人有IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2)。轻链被分类为κ或λ的其中之一型。本发明的抗体并不限于类、亚型或同型，可以是任何类型。优选同型为IgG的抗体，从没有补体结合性的观点看，进一步优选亚类为IgG4的抗体。

对于本发明的抗体的活性，例如只要具有与GPVI的结合能力即可，可以是抗体的片段或一部分。例如可以是Fab(抗原结合片段)、Fab’、(Fab’)₂、单链抗体(scFv)、二硫键稳定化抗体(dsFv)、含有CDR的肽等。

本发明的第3方案提供产生本发明的抗体的细胞。所述细胞的例子有杂交瘤、转化物、或者导入了本发明的抗体的基因的基因重组细胞等。产生抗体的杂交瘤具体有：使用从产生GPVI的自身抗体的人末梢血采集的淋巴细胞制备的杂交瘤——#2-6细胞或#2-4细胞。本发明还提供上述发明的细胞所产生的抗体。抗体生成细胞不限于特定的细胞，优选使用从产生GPVI的自身抗体的人末梢血采集的淋巴细胞制备的杂交瘤所产生的抗体，进一步优选#2-6细胞或#2-4细胞所产生的抗体、以及通过基因重组技术由该抗体制备的重组抗体。

本发明的第4方案提供编码本发明第1或第2方案的抗体的多核苷酸或核酸。该多核苷酸只要是编码本发明的抗体的氨基酸序列的即可，不受限定，多核苷酸包含DNA和RNA。

编码本发明的抗体的CDR序列的多核苷酸不受限定，优选为含有编码作为VH CDR1的氨基酸序列的SEQ ID NO.147碱基序列、编码作为VH CDR2的氨基酸序列的SEQ ID NO.148碱基序列、编码作为VH CDR3的氨基酸序列的SEQ ID NO.149碱基序列、编码作为VLCDR1的氨基酸序列的SEQ ID NO.150碱基序列、编码作为VL CDR2的氨基酸序列的SEQ ID NO.151碱基序列或编码作为VL CDR3的氨基酸序列的SEQ ID NO.152碱基序列中的任何一个或以上、更优选含有H链的三个、进一步优选含有全部的碱基序列的多核苷酸，还优选为含有编码作为VH CDR1的氨基酸序列的SEQ ID NO.23碱基序列、编码作为VH CDR2的氨基酸序列的SEQ ID NO.24碱基序列、编码作为VH CDR3的氨基酸序列的SEQ ID NO.25碱基序列、编码作为VLCDR1的氨基酸序列的SEQ ID NO.26碱基序列、编码作为VL CDR2的氨基酸序列的SEQ ID NO.27碱基序列或编码作为VL CDR3的氨基酸序列的SEQ ID NO.28碱基序列中的任何一个或以上、更优选含有H链的三个、进一步优选含有所全部的碱基序列的多核苷酸。

编码本发明的抗体的VH和VL的氨基酸序列的多核苷酸不受限定，优选含有编码作为VH的氨基酸序列的SEQ ID NO.145碱基序列、或编码作为VL的氨基酸序列的SEQ ID NO.146碱基序列中的任意一个，更优选含有两种碱基序列的多核苷酸，还优选含有编码作为VH的氨基酸序列的SEQ ID NO.31碱基序列、或编码作为VL的氨基酸序列的SEQ ID NO.32碱基序列中的任意一个，更优选含有两种碱基序列的多核苷酸。

编码本发明抗体的恒定区的多核苷酸含有优选来自人抗体、更优选来自人IgG、进一步优选来自人IgG4的碱基序列。

通过将含有本发明的抗体的核苷酸序列的基因移入细胞中，可以制备产生本发明的抗体的细胞。移入的基因为含有编码作为VH CDR1的氨基酸序列的SEQ ID NO.147碱基序列、编码作为VH CDR2的氨基酸序列的SEQ ID NO.148碱基序列、编码作为VH CDR3的氨基酸序列的SEQ ID NO.149碱基序列、编码作为VL CDR1的氨基酸序列的SEQ ID NO.150碱基序列、编码作为VL CDR2的氨基酸序列的SEQ IDNO.151碱基序列或编码作为VL CDR3的氨基酸序列的SEQ IDNO.152碱基序列中的任何一个或以上的基因，还优选含有编码作为VH CDR1的氨基酸序列的SEQ ID NO.23碱基序列、编码作为VHCDR2的氨基酸序列的SEQ ID NO.24碱基序列、编码作为VH CDR3的氨基酸序列的SEQ ID NO.25碱基序列、编码作为VL CDR1的氨基酸序列的SEQ ID NO.26碱基序列、编码作为VL CDR2的氨基酸序列的SEQ ID NO.27碱基序列或编码作为VL CDR3的氨基酸序列的SEQID NO.28碱基序列中的任何一个或以上的基因。移入的基因优选含有编码作为VH的氨基酸序列的SEQ ID NO.145碱基序列或编码作为VL的氨基酸序列的SEQ ID NO.146碱基序列中的任意一个或以上的基因，或者优选含有编码作为VH的氨基酸序列的SEQ ID NO.31碱基序列、或编码作为VL的氨基酸序列的SEQ ID NO.32碱基序列中的任意一个或以上的基因。引入的基因还优选具有编码作为VH的氨基酸序列的SEQ ID NO.145碱基序列和编码作为VL的氨基酸序列的SEQ IDNO.146碱基序列的基因，或者具有编码作为VH的氨基酸序列的SEQID NO.31碱基序列和编码作为VL的氨基酸序列的SEQ ID NO.32碱基序列的基因；进一步优选含有编码恒定区来自人抗体的氨基酸序列的碱基序列的基因。

(制备方法)

本发明的第5方案提供抗体的生产方法。制作本发明的抗体的方法没有限定，可以用以下记载的方法制备。即，从对GPVI产生自身抗体的患者末梢血中采集淋巴细胞，制备通过体外免疫法活化的淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞的杂交瘤。得到制备的杂交瘤所产生的抗体，选择具有与GPVI的结合能力、具有抑制胶原导致的血小板凝聚的活性的抗体，得到产生该抗体的细胞。通过培养该细胞，可得到本发明的抗体。

本发明的抗体也可以制成采用公知的方法(自Nature，312：643，1984、Nature，321：522，1986以来开发了很多方法)制备的重组人抗体的形式。首先，由产生本发明的抗体的细胞例如淋巴细胞、优选由生产抗GPVI单克隆抗体的杂交瘤获得编码VH或VL的核酸例如cDNA，确定碱基序列和氨基酸序列。接着，将获得的编码VH和VL的cDNA分别插入动物细胞用表达载体中，构建人抗体载体，通过导入动物细胞使其表达来制备，其中，动物细胞用表达载体含有编码由相同细胞或不同的人细胞制备的人抗体CH和/或人抗体CL的基因。导入动物细胞的基因的制备方法没有限定，可以由来自杂交瘤的基因组DNA或cDNA获得，也可以通过PCR由杂交瘤的mRNA获得，还可以通过化学合成获得。

掺入有编码本发明的抗体VH或VL的核酸的载体没有限定，优选常用于蛋白质基因等表达、特别是适合抗体基因的表达的载体或高表达用载体。优选的例子有：含有EF启动子和/或CMV增强子的载体，例如pEF-BOS或实施例中使用的载体。另外，通常还可以分别制备掺入编码VH或VL的核酸的表达载体，共转染宿主细胞，也可以掺入到单一的表达载体中。

要导入表达载体的宿主细胞没有限定，优选常用于蛋白质基因等的表达，特别是适合抗体基因的表达的细胞。例如有细菌(大肠杆菌等)、放线菌、酵母、昆虫细胞(SF9等)、哺乳类细胞(COS-1、CHO、骨髓瘤细胞等)。

对于重组人抗体的制备中所使用的人抗体的恒定区，例如人抗体重链恒定区可以使用Cγ1或Cγ4，人抗体轻链恒定区可以使用Ck等任意的人抗体恒定区。

含有人的CDR序列的抗体除在人体内天然存在的抗体之外，也包含由人抗体噬菌体文库和人抗体生成转基因动物获得的抗体等。人抗体噬菌体表达文库是通过将由人B细胞制备的抗体基因插入到噬菌体基因中，使Fab、单链抗体等抗体的活性片段在噬菌体的表面表达的文库。可由该文库回收表达具有所希望的抗原结合活性的抗体的活性片段的噬菌体，其中所述抗原结合活性是以对固定有抗原的基质的结合活性为指标。该抗体的活性片段还可以进一步通过基因工程方法，变换成含有2条完全的H链和2条完全的L链的人抗体分子。

本发明除含有2条重链和2条轻链的抗体之外，也包含本发明的抗体的活性片段等。抗体的活性片段例如有Fab(抗原结合片段)、Fab’、F(ab’)₂，用接头等将抗体的活性片段结合的例子有：单链抗体(scFv)、二硫键稳定化抗体(dsFv)，含有抗体的活性片段的肽例如有：含有CDR的肽。这些可以通过用适当的蛋白质分解酶处理本发明的抗体的方法或基因重组技术等公知的方法来制备。

本发明的Fab可以如下获得：当本发明的抗GPVI采用IgM时，用蛋白质分解酶——胰蛋白酶来处理，采用IgG时，用蛋白质分解酶——木瓜酶来处理。或者将编码该抗体的Fab的DNA插入原核生物用表达载体或真核生物用表达载体，通过将该载体导入原核生物或真核生物来使其表达，制备Fab。

本发明的F(ab’)₂可通过用蛋白质分解酶——胰蛋白酶处理本发明的抗GPVI抗体来获得。或者使下述Fab’进行硫醚键合或二硫键合来制备。

本发明的Fab’可以将与GPVI特异性反应的F(ab’)₂进行还原剂二硫苏糖醇处理来获得。

本发明的scFv中含有的VH和VL可以使用本发明的杂交瘤所产生的抗体或人抗体的任何一种。本发明的scFv可如下制备：获得编码本发明的抗GPVI抗体的VH和VL的cDNA，构建编码scFv的DNA，将该DNA插入原核生物用表达载体或真核生物用表达载体，将该表达载体导入原核生物或真核生物，使其表达，可以制备scFv。

dsFv是指将VH和VL中的各1个氨基酸残基置换成半胱氨酸残基，经由该半胱氨酸残基间的二硫键，使上述置换后的多肽结合而得到抗体。要置换为半胱氨酸残基的氨基酸残基可以按照Reiter等人公开的方法[Protein Engineering，7，697(1994)]，基于抗体的立体结构预测来选择。本发明的dsFv中所含的VH和VL也可以使用来自本发明的第1方案或第2方案的抗体的任何一种。

本发明的dsFv可如下制备：获得编码本发明的抗GPVI抗体的VH和VL的cDNA，构建编码dsFv的DNA，将该DNA插入原核生物用表达载体或真核生物用表达载体，将该表达载体导入原核生物或真核生物，使其表达，可以制备dsFv。

含有CDR的肽含有H链或L链CDR的至少一个区而构成。多个CDR可以直接或经由适当的肽接头结合。本发明的含有CDR的肽可如下制备：获得编码本发明的抗GPVI抗体的VH和VL的cDNA，构建编码CDR的DNA，将该DNA插入原核生物用表达载体或真核生物用表达载体，将该表达载体导入原核生物或真核生物，使其表达，可以制备含有CDR的肽。含有CDR的肽也可以通过Fmoc法(芴甲氧羰基法)，tBoc法(t-叔丁氧羰基法)等化学合成方法来制备。

本发明的抗体也包含例如杂交瘤所产生的人抗体、用EB病毒转化的细胞所产生的人抗体、由cDNA表达的重组人抗体、或者将放射性同位素、蛋白质、肽或低分子化合物等与这些抗体的活性片段结合得到的抗体。可以通过化学方法[抗体工学入门(金光修著1994年(株)地人书馆)]，将放射性同位素、蛋白质、肽或低分子化合物等与本发明的抗GPVI抗体或抗体的活性片段的H链或L链的N末端一侧或C末端一侧、抗体或抗体的活性片段中的适当的取代基或支链、以及抗体或抗体的活性片段中的糖链结合来制备。杂交瘤是指使淋巴细胞与来自人、小鼠、大鼠等的骨髓瘤细胞进行细胞融合而得到的、产生具有所需的抗原特异性的单克隆抗体的细胞。

制备单克隆抗体时，优选考虑到与细胞融合所使用的骨髓瘤细胞的配合性来进行选择。骨髓瘤细胞可以使用公知的各种细胞。其中包含来自人的SKO-007、人小鼠杂交骨髓瘤SHM-D33、来自小鼠的P3、P3U1、SP2/O、NS-1、来自大鼠的YB2/0和Y3-Ag1，2，3等骨髓瘤细胞。

杂交瘤制备所使用的细胞不受限制，优选杂交瘤制备所使用的多种细胞中的至少一种为来自人的细胞。来自人的细胞可以使用末梢血、淋巴结或脾脏等的人的淋巴细胞，特别优选可以确认有自身抗体产生的人的淋巴细胞。

淋巴细胞的活化可通过公知的方法进行。例如优选由人的末梢血或脾脏采集B细胞，通过体外免疫法刺激抗原，用来自人B细胞的骨髓瘤细胞或来自小鼠的骨髓瘤细胞制备杂交瘤的方法；用EB病毒转染，使其与小鼠骨髓瘤细胞融合的方法；用PWM等促分裂原刺激，将B细胞活化为多克隆并融合的方法(免疫实验操作法I·II、右田俊介等人编辑、南江堂)等。

用于刺激细胞的抗原不受限定。抗原蛋白质的来源动物可以根据抗体的使用目的适当选择，可以是来自天然产物的、通过基因工程制备的、化学合成的、与其它蛋白质或肽得到的融合蛋白质等的任何形式。例如可以使用血小板、血小板的膜、纯化GPVI、重组GPVI、GPVI-Fc，优选GPVI-Fc。

活化淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合可以采用Milstein等的方法(Methods in Enzymol.，73卷3页)等公知的方法进行。例如有使用聚乙二醇(PEG)作为融合剂的方法(单克隆抗体实验操作法入门、安东民卫·千叶丈/著、讲谈社)或电融合法等。免疫细胞与骨髓瘤细胞的混合比只要是它们可融合的比例即可，没有限定，优选相对于活化淋巴细胞，使用1/10量至等量的骨髓瘤细胞。使用PEG(平均分子量为1,000-4,000)进行细胞融合的方法中，PEG浓度不受限定，优选以50％进行。可以添加二甲基亚砜(DMSO)等辅助剂作为融合效率促进剂。融合是通过将加温至37℃的PEG溶液添加到混合的细胞中而起始，反应1-5分钟后通过添加培养基而终止。

将由该融合形成的杂交瘤在含有次黄嘌呤、胸苷和氨基蝶啶的培养基(HAT)等选择培养基上培养1天-10天，与未融合细胞分离。再通过所产生的抗体进一步选择所得的杂交瘤。按照公知的有限稀释法，将所选择的杂交瘤进行单一克隆，建立单一克隆性抗体生成杂交瘤。

检测杂交瘤所产生的抗体的活性的方法可以使用公知的方法。这里，抗体的活性的检测如下进行：第一步是检测与GPVI抗原的结合能力，第二步检测抑制GPVI与胶原结合的活性。第一步的活性的检测方法例如有ELISA法、蛋白质印迹法、放射免疫法。第二步的活性的检测法例如有ELISA法(结合抑制型)、蛋白质相互作用分析法(BIOCORE等)、血小板凝聚抑制测定法。

可通过公知的方法培养确立的杂交瘤，由其培养上清获得单克隆抗体。

抗体的纯化可以使用盐析法、凝胶过滤法、离子交换色谱法或亲和柱层析法等公知的纯化方法进行。

抗体的浓度可通过公知的蛋白质定量方法、例如280nm下的吸光度测定来测定。

确认本发明的抗GPVI抗体的抗原结合性的方法、或者使用本发明的抗GPVI抗体检测生物试样中的GPVI的方法可以采用荧光抗体法、免疫酶联抗体法(ELISA)、放射性物质标记免疫抗体法(RIA)、免疫组织染色法、免疫细胞染色法等免疫组织化学染色法(ABC法、CSA法等)、蛋白质印迹法、免疫沉降法、以上阐述的酶联免疫测定法、夹心ELISA法[单克隆抗体试验手册(讲谈社Scientific、1987年)、续生化学实验讲座5免疫生化学研究法(东京化学同人、1986年)]等。

本发明的抗体对于由例如胶原等引发血小板凝聚的物质导致的血小板凝聚的影响的测定方法不受限定，可通过常规方法进行。具体是：向人血小板悬浮液中添加本发明的抗体，然后添加胶原，用血小板凝聚能测定装置等测定凝聚率。

在单独的抗体下测定血小板凝聚的方法不受限定，可通过常规方法进行。具体是：向人血小板悬浮液中添加本发明的抗体，用血小板凝聚能测定装置等测定凝聚率。

(用途)

本发明的抗体是与人GPVI特异性结合的抗体，含有本发明的抗体、抗体的活性片段、与化学物质结合的抗体的修饰物、或者上述的混合液的组合物等有各种用途，其中包括人的疾病预防、诊断和治疗用途，或受试样品、细胞和组织等中的人GPVI的检测用途等的。

特别是本发明的抗体的一个方案是抗体单独不会引起人血小板凝聚，因此，不仅是抗体的活性片段，抗体本身也抑制人血小板凝聚，不仅制成活性片段，即使施用抗体本身，也可以用于人的疾病预防、诊断和治疗等。

用途：药物

本发明的抗体与GPVI的结合的特异性高，且来自人，优选单独不具有促进或引发人血小板凝聚的作用，因此对人的疾病、例如因血小板的活化或凝聚、或者血管内皮障碍或动脉硬化性的反应而引起的疾病的预防和/或治疗特别有效，还可用于对血栓或栓塞起因的疾病例如血栓形成和栓塞形成等的预防和/或治疗。这些疾病不仅包含动脉性血栓形成，也包含静脉性血栓形成，还包含起因于心房颤动的脑梗塞。

可由本发明的抗体预防和/或治疗的人的疾病或病态具体有：心肌梗塞，在溶栓疗法、施行经皮冠状窦瓣内腔扩张术、施行支架、施行旁路手术或施行人工血管时的或者之后的血管内皮肥厚、血管再狭窄、心绞痛或心肌梗塞，心房颤动或心房扑动以及起因于这些的血栓形成、栓塞形成或脑梗塞、闭塞性血栓性脉管炎、急性动脉硬化闭塞、闭塞性动脉硬化或深部静脉血栓等；还有脑梗塞(动脉粥样变性形血栓性梗塞、腔梗、心源性梗塞)、瞬时性脑缺血发作、蛛网膜下腔出血后的脑血管痉挛、肺血栓、肺栓塞、血管性紫癜、特发性血小板减少性紫癜、血栓性血小板减少性紫癜、弥散行血管内凝血、体外循环使防止血液凝固、系统性红斑狼疮、多发性动脉炎、抗磷脂抗体综合征、紫癜性肾炎、伴随糖尿病的内皮细胞伤害、糖尿病性肾炎、糖尿病性视网膜病、肾栓塞、伴随移植治疗的并发症(肝静脉闭塞病、移植物抗宿主病)等。

本发明的抗体还可以对于之前所述的预防和/或治疗对象的疾病单独施用，也可以与其它药理活性成分联合使用，所述药理活性成分例如有：公知的溶栓剂(例如包括组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)及其衍生物(包括变异体或所谓的第二代)、尿激酶、链激酶)、或者公知的抗血小板药物(例如阿司匹林、噻氯匹定、氯吡格雷、血栓烷拮抗剂、血栓烷合成抑制剂、GPIIb/IIIa拮抗剂)、公知的抗凝固药(例如华法林、肝素、低分子肝素、戊多糖、凝血酶抑制剂、Fxa抑制剂、FVIIa抑制剂)等。这里，关于联合使用，除了施用同时含有本发明的抗体和该药理活性成分的合剂之外，也包括将本发明的抗体和相应的药理活性成分分别制成制剂，在相同时期或不同时间施用的情况，只要在患者的血液中同时存在即可，不限定施用形式。

含有本发明的抗体以及制剂学上可接受的组合物作为有效成分的药物可以使用通常使用的制剂用载体或赋型剂、其它添加剂例如片剂、注射剂、散剂、栓剂等制备，施用于人类等动物。

应用于人时，其施用途径有口服给药、静脉内给药(大丸剂给药、连续输液、间歇输液)、皮下给药、肌内给药、关节内给药、经皮给药、经鼻给药等，通常为口服给药或静脉内给药。本发明的抗体对人的临床给药量可考虑所使用的患者的症状、体重、年龄、性别等适当确定，通常成人每天静脉内给药为1-10000mg、优选10-1000mg，将其一次或分数次给药。给药量依据各种条件而变动，也有用比上述给药量的范围少的量即足够的情况。

这里，虽然本发明的抗体在识别GPVI这点上是共通的，但本发明包含具有不同机理的各种抗体。例如，直接抑制GPVI与胶原的结合、或者通过切断GPVI来抑制血小板的活化和/或凝聚的抗体有望即时获得效果，因此有可能至少在疾病的急性期(例如在心肌梗塞时或实施PTCA时或者它们发生之前一点或刚发生之后)有用。这种情况下，优选使本发明的抗体与血液中血小板表面的GPVI的大部分结合，因此可以施用较大量的抗体，例如可以单次或者分次进行静脉注射或输液。另外，将GPVI摄入到内部的抗体或许不能得到即时的效果，但考虑到人血小板在血液中的寿命(9-10天左右)以及人抗体在血液中的半衰期(IgG为数周)，则有望得到持续性的效果，因此例如可能在疾病的慢性期(例如心肌梗塞发病后或实施PTCA后数天-数个月)中有用。这种情况下，可以以较大的间隔例如以几天或数周作为1个疗程，以部分、优选完全抑制血液中的血小板与胶原的反应性的程度施用以使血小板表面的GPVI消失所需要的量的抗体，例如可以采取一次或分次进行静脉注射或输液的方式。优选的方案中，本发明的抗体可以同时具有这些效果。还可以将多种预期分别具有上述效果的抗GPVI抗体组合实施治疗。

用于肠道外给药的组合物通常含有溶解于可接受的载体、优选水性载体中的免疫球蛋白的溶液或其混合液。可使用各种水性载体例如水、缓冲水、磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)、0.4％生理盐水、0.3％甘氨酸、人白蛋白溶液等。这些溶液是无菌的，并且通常不存在微粒物质。这些组合物可通过常用的、熟知的灭菌方法灭菌。为了使组合物接近生理学条件，可根据要求含有药学上可接受的辅助物质、例如pH调节和缓冲剂、毒性调节剂等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙和乳酸钠。这些制剂中的抗体的浓度可以在广范围、即低于约0.005％重量(通常至少约为1％重量)至15-20％重量这样大量的范围内变化，主要根据所选择的给药的特定方式，基于液容量、粘性等选择。

制备肠道外给药组合物的现实的方法对于本技术领域熟练人员来讲是公知或清楚的，例如在Remington’s Pharmaceutical Sciences(第15版、Mack Publishing Campany、Easton、Pennsylvania、1980)(该引用例也为本说明书的一部分)中有更详细的记载。适合用于清洗(灌洗)或其它途径的组合物可根据所需的特定应用进行选择。几种药学组合物可含有抗GPVI抗体及其疾病中常用的其它治疗药。任何情况下都适用于大丸剂给药和持续给药。另外，预防或治疗的有效量可以根据对象疾病、病态和患者的状态等适当确定。

为了贮藏，本发明的抗体可以冷冻或冷冻干燥，可在要使用之前在适当的载体中复原。已知该技术对于通常的免疫球蛋白有效，可以采用公知的冷冻干燥和复原技术。冷冻干燥和复原可能导致不同程度的抗体的活性损失(例如通常的免疫球蛋白、IgM抗体有比IgG抗体产生较大的活性损失的倾向)，以及为了弥补其损失而必须调节使用水平，这点使本领域人员应可认识到。

用途：GPVI检测

使用本发明的抗体或抗体活性片段检测受检样品中的GPVI的方法可包含以下步骤：使受试样品与本发明的抗体或抗体的活性片段接触的步骤，检测与本发明的抗体或抗体活性片段结合的受检样品中的GPVI的步骤。还可以包含对受检样品中的GPVI进行定量的步骤。通过检测受试样品中GPVI的方法，可以进行疾病的诊断。特别是可用于人的疾病、例如血栓性、栓塞性或动脉硬化性疾病的诊断。

使用本发明的抗体检测受检样品中的GPVI的方法有夹心ELISA系统、抑制ELISA类、荧光抗体法、免疫组织化学染色法、放射性物质标记免疫抗体法、蛋白质印迹法、免疫沉降法等，但不限于这些。作为对象的受检样品不受限定，可以使用生物样品，有动物特别是人的体液或组织、细胞和菌体以及它们的提取液、培养上清、涂片和切片，优选为血小板。

使用本发明的抗体或抗体活性片段抑制GPVI或血小板上的GPVI与胶原的结合的方法可包含至少一步以下的方法：使GPVI或血小板表面上的GPVI与本发明的抗体或抗体活性片段接触的步骤，使GPVI或血小板表面上的GPVI与胶原接触的步骤，本发明的抗体或抗体活性片段抑制GPVI或血小板表面上的GPVI与胶原结合的步骤。

检测本发明的抗体或抗体活性片段对GPVI或血小板表面上的GPVI的血小板凝聚的抑制作用的步骤除采用上述的体外测定系统外，还可以采用体内测定系统。这里所述的体内测定系统是指对机体施用本发明的抗体或抗体活性片段，检测该抗体或抗体活性片段对机体功能或状态的影响的评价系统。例如有：对施用胶原的模型动物施用本发明的抗体或抗体活性片段，评价对病态的严重程度指标的影响的系统。

实施例

以下通过实施例进一步具体说明本发明，这些只是举例，本发明并不受这些实施例的任何限制。另外，以下记载中使用的简略符号基于本领域中的常用简略符号。

实施例1人可溶型GPVI-Fc的制备

制备人GPVI的胞外结构域与人IgG的Fc片段的融合蛋白(GPVI-Fc)，以此作为体外免疫用抗原和筛选用抗原。DNA操作没有特别限定，按照分子克隆第二版(Molecular Cloning A Laboratory Manual3rd.，Joseph S.，等人.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001))进行。

GPVI-Fc表达质粒按照以下顺序进行基因工程制备。首先，以掺入了江角等人克隆的人GPVI cDNA的质粒pBK-CMV-GPVI-1(Biochem Biophys.Res.Commun.20008月号14；277(1)：27-36)为模板，使用有义引物-1(SEQ ID NO.33，5’末端一侧含有限制酶Xba I识别序列)和反义引物-1(SEQ ID NO.34，5’末端一侧含有限制酶BamH I识别序列)进行PCR，得到编码人GPVI胞外结构域(269个氨基酸)的cDNA。另一方面，以含有人IgG₁Fc结构域的cDNA的质粒pM1304(记载于WO 97/42319)为模板进行PCR，预先得到编码可与GPVI胞外结构域框内连接的人IgG₁Fc结构域(506个氨基酸)的cDNA。用于该PCR的有义引物-2(SEQ ID NO.35)设计为含有编码人IgG₁Fc结构域N末端一侧的cDNA序列、并在其5’末端一侧配置限制酶BamH I识别序列，反义引物-2(SEQ ID NO.36)设计为在人IgG₁Fc结构域的C末端一侧配置限制酶Kpn I识别序列。用限制酶处理由PCR得到的两个cDNA片段，然后插入到以哺乳动物细胞为宿主的表达质粒pCAGGS(专利第2824434号公报)的克隆位点。即，编码人GPVI胞外结构域的cDNA片段用限制酶Xba I和BamH I切断，编码人IgG₁Fc结构域的cDNA片段用限制酶BamH I和切断KpnI切断。在PCAGGS的克隆位点插入接头，附加适当的限制酶切位点(Xba I、KpnI)，然后，框内连接编码人GPVI胞外结构域的cDNA和编码人IgG₁Fc结构域的cDNA并插入。其步骤如图1所示。

以所得表达质粒(pCAGGS-GPVI-Fc)为基础，制备杆状病毒的转移载体和重组病毒，在蚕蛹中进行表达。即，用限制酶Xba I和Hind III切断pCAGGS-GPVI-Fc，切取编码GPVI-Fc的DNA片段，用BluntingKit(TAKARA)使其末端为平末端。将该DNA片段插入杆状病毒的转移载体pYNG的Sma I位点，选择沿多角体蛋白启动子正方向插入的克隆(pYNG-GPVI-Fc)。该步骤如图2所示。以该克隆为基础制备重组病毒，通过蛋白质印迹确认GPVI-Fc蛋白质在病毒感染细胞中的表达。将最终制备的病毒溶液接种于蚕蛹上，进行GPVI-Fc的表达。

结果，蚕蛹磨碎液中可见足够量的GPVI-Fc的表达，将其磨碎液用蛋白A柱(Prosep-A、MILLIPORE)进行GPVI-Fc的纯化。

实施例2使用具有抗GPVI自身抗体的人末梢血淋巴细胞制备抗GPVI 单克隆人抗体

抗GPVI单克隆人抗体是将已确认具有GPVI的自身抗体的供血者的淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，如下制备。首先，将6ml从征得书面同意的供血者身体无菌采血得到的添加肝素的血液铺于加入有3mlFicoll-Plus(Amersham Pharmacia Biotech AB)的Leucosep离心分离管(Greiner)中，1000g离心，回收淋巴细胞组分。将所得淋巴细胞组分在Dulbecco’s PBS(以下可称为D-PBS)中以800g离心清洗2次，然后悬浮于含有10％FCS(胎牛血清)的Hybridoma-SFM(Invitrogen)，得到7.4×10⁷个细胞。

分别向上述淋巴细胞组分中添加2.5μg/ml PHA-L(Sigma)、20μg/ml LPS(DIFCO)、10μg/ml实施例1记载的纯化GPVI-Fc，制备成细胞浓度为1×10⁶个/ml，培养3天，进行淋巴细胞的活化。培养时，再添加400U/mL IL-4(PeproTech)，微调节成适当的条件，例如使培养时间为8天等，尝试使淋巴细胞活化。细胞融合按照安藤等人(单克隆抗体实验操作法入门、安东民卫·千叶丈/著、讲谈社)，将活化的人淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/O-Ag14、ATCC CRL 1581)以4∶1混合，通过50％聚乙二醇(Sigma)进行细胞融合。融合后，悬浮于含有10％FCS、1×HAT(Invitrogen)的Hybridoma-SFM中，培养10天，然后对增殖的杂交瘤的培养上清取样，通过ELISA法筛选产生目标抗体的杂交瘤。

即，向每孔添加并固定了0.25μg纯化GPVI-Fc的免疫板(Maxisorb、NUNC)上添加50μl杂交瘤的培养上清，在37℃反应1小时。作为对照，将人纯化Fc(Athens Research And Technology，Inc.)同样地制成固相化微孔，添加培养上清使其反应。反应终止后，清洗各孔，向各孔中添加过氧化物酶标记抗人κ抗体(DAKO、P129)或过氧化物酶标记抗人λ抗体(DAKO、P130)。在37℃反应1小时，然后同样地清洗，向各孔中添加TMB显色液(BioFix)，反应10分钟后，添加0.5M硫酸溶液，中止反应。接着通过读板仪测定450nm的吸光度，在纯化人Fc中，吸光度未上升，只在固定有GPVI-Fc的孔中吸光度上升，即，选择出了存在产生抗GPVI抗体的杂交瘤的孔。

进一步通过有限稀释法进行培养，得到单一克隆。即，与上述同样地对培养10天后的培养液进行筛选，得到产生抗GPVI单克隆人抗体的杂交瘤。

将选择的杂交瘤在含有10％FCS的Hybridoma-SFM中培养，使培养基无血清化以产生抗体。按照说明书，通过Prosep-Thiosorb M柱(MILLIPORE)纯化IgM抗体，IgG抗体使用Prosep-A柱(MILLIPORE)纯化。纯化抗体用0.076M磷酸缓冲液(PBS)(pH 6.4)透析，由280nm的吸光度计算浓度。

实施例3制备的抗GPVI单克隆人抗体的分型

实施例2得到的抗体的分型通过Human IgG Subclass ProfileELISA Kit(Zymed Laboratories)和蛋白质印迹进行。ELISA是按照试剂盒使用说明进行，以抗体的稀释液作为样品使用。对于不能用试剂盒检测出的抗体则：通过4-20％的SDS-PAGE分别分离出约1μg样品，然后转印PVDF膜(MILLIPORE)，进行蛋白质印迹。即，封闭PVDF膜后，与过氧化物酶标记兔抗人IgM抗体(P0322、DAKO)反应。清洗后，使其与ECL试剂(Amersham Pharmacia Biotech AB)反应，通过光捕获仪(ATTO)检测反应的条带。所得的抗GPVI抗体的分型结果如表1所示。

表1分型结果

实施例4抗GPVI单克隆人抗体的GPVI结合活性的测定(ELISA法)

通过实施例2记载的ELISA法测定实施例2得到的纯化抗体的GPVI结合活性。实施例2中，添加20ng实施例2中制备的纯化抗GPVI单克隆人抗体代替杂交瘤的培养上清，使用纯化人IgM(Cappel)作为对照。

结果如图3所示，作为对照使用的人IgM中，吸光度未上升，而所选择的杂交瘤产生的纯化抗GPVI单克隆人抗体中，吸光度都显著上升，可见制备的抗体特异性识别GPVI。

实施例5关于抗GPVI单克隆人抗体抑制GPVI-Fc与胶原结合的研究

为了验证实施例2中得到的抗体特异性抑制GPVI与胶原的结合，采用蛋白质相互作用分析装置(BIACORE3000)进行分析。首先，按照BIACO公司的使用手册，将6303RU(共振单元)人胶原TypeI(生化学工业制造)固定于CM5芯片上(BIACORE制造)上。这里，RU是BIACORE装置中使用的表示响应的单位，1000RU表示有约1.2ng的物质结合。将GPVI-Fc和纯化人IgM或纯化抗GPVI抗体分别以50μg/ml混合，注入固定有胶原的芯片。

实施例6抗体对人血小板凝聚能的影响

按照常规方法(Takayama H等人.，Biochemical and BiophysicalResearch Communication，174，922-927页(1991))，从征得书面同意的健康人采集血液，从其中制备血小板，按照终浓度约2×10⁸-3×10⁸个/mL使用。血小板凝聚能的测定按照Ezumi Y等人.(Blood，99，3250-3255页(2002))如下实施。添加作为受检物质的实施例2中得到的抗体或其溶剂，然后在37℃温育5分钟。再添加CaCl₂溶液，使终浓度为1mM，在37℃边搅拌边温育3分钟。加入胶原(NYCOMED PHARMA GMBH)的溶液，使终浓度为3-4μg/mL，用血小板凝聚能测定装置(兴和株式会社制造PA-200)随时测定透光率，由此测定抗体对胶原引发的血小板凝聚的抑制作用。其结果如表2所示。血小板凝聚的测定结果用透光率最大时的透光率(最大凝聚率)表示。

接着，添加人凝血酶(Sigma)代替胶原作为血小板凝聚引发物质，其浓度为0.3单位/mL，同样地测定抗体对血小板凝聚的影响。结果，#2-4抗体在10μg/mL的抗体浓度下的最大凝聚率为96％。

再在上述测定中不添加胶原等引发血小板凝聚的物质，测定受检物质(抗体)单独的引发血小板凝聚的作用，结果，#2-4抗体在10μg/mL的抗体浓度下的最大凝聚率为3％。

由以上的结果可以观察到：#2-4抗体单独不具有引发血小板凝聚的作用，只特异性抑制胶原导致的血小板凝聚。

表2

(A)#2-4抗体

抗体终浓度	最大凝聚率(胶原4μg/mL)
		对照	77％
0.1μg/mL	63％
		0.3μg/mL	49％
1μg/mL	27％

实施例7抗GPVI单克隆人抗体的解离常数的测定

使用蛋白质相互作用分析装置(BIACORE3000)测定实施例6中确认具有血小板凝聚抑制活性的抗体的解离常数。按照BIACORE公司的使用手册，将实施例1中记载的纯化GPVI-Fc固定于CM5芯片上。对于#2-4抗体用BIACORE3000的Wizard Program测定，使用BIACORE公司的BIAevaluation软件进行分析，计算出#2-4抗体的解离常数(K_d)为4.13×10^-8M。

实施例8抗GPVI抗体的CDR氨基酸序列的确定

按照实施例2培养通过实施例2的ELISA法的筛选选择的杂交瘤。在细胞浓度为2×10⁵个/ml的阶段回收培养液，使用TRIzol(Invitrogen)，由回收的细胞提取mRNA。接着，按照SuperscriptFirst-strand synthesis System II(Invitrogen)的使用手册，通过寡聚dT引物，由mRNA合成单链cDNA。参考论文(J.Immunol.Methods 19952月号27；179(2)：203-14)和J.Mol.Biol.199112月5：222(3)：581-97)的信息，合成扩增重链和轻链可变区的PCR引物(序列记载于表3)，以之前制备的来自杂交瘤的单链cDNA为模板进行PCR。用2％的琼脂糖确认扩增的DNA条带，然后用自旋柱(Sigma)纯化PCR产物。将纯化的PCR产物与pT7BlueT载体(Novagen)混合，使用连接试剂盒verII(TAKARA)，在16℃进行30分钟的连接反应。用该反应液转化感受态细胞大肠杆菌(JM109、TAKARA)，接种于含X-Gal、IPTG的LB板上，培养过夜。挑取出现的白色集落，用EX Taq聚合酶(TAKARA)、U-19mer引物(序列记载于表3)、T7启动子引物(序列记载于表3、Novagen)，通过集落直接PCR确认插入片段插入到了载体中。接着，将确认有插入片段的集落在LB培养基上培养过夜，使用QIAGENplasmid mini kit(QIAGEN)纯化质粒。纯化的质粒与U-19mer引物、T7启动子引物，通过DYEnamic ET terminator cycle sequencing kit(Amersham Biosciences制造)反应，然后用测序仪ABI PRISM3100(Applied Biosystems制造)进行分析。

确定的CDR序列表示在表4中。编码#2-4的克隆的VL CDR3的碱基序列(SEQ ID NO.28)中第31位的鸟嘌呤实际上未检测出，但可从其它克隆的分析结果预测为鸟嘌呤。基于该预测，描述了#2-4的克隆的VL CDR3(SEQ ID NO.12)和VL CDR(SEQ ID NO.16)的氨基酸序列。

表3

引物	序列(SEQ ID NO.)
		PCR引物：#2-37 VH  5’	GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG(37)
PCR引物：#2-37 VH  3’	TGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCC(38)
		PCR引物：#2-4 VH   5’	GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG(39)
PCR引物：#2-4 VH  3’	TGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCC(40)
		PCR引物：#2-37 VL 5’	CAGTCTGCCCTGACTCAGCCGGC  (41)
PCR引物：#2-37 VL 3’	AGAGGAGGGTGGGAACAGAGTGAC(42)
		PCR引物：#2-4 VL 5’	CAGTCTGTCTTGACGCAGCCGGC(43)
PCR引物：#2-4 VL 3’	AGAGGAGGGTGGGAACAGAGTGAC(44)
		U-19mer  引物	GTTTTCCCAGTCACGACGT    (45)
T7启动子引物	CTAATACGACTCACTATAGG    (46)

表4

表5和表6分别表示#2-4和#2-6的克隆的H链和L链可变区的氨基酸序列和核苷酸序列，表7表示#2-4和#2-6的克隆的CDR的核苷酸序列。

表5

克隆编号	H链可变区氨基酸序列	L链可变区氨基酸序列
			#2-4	SEQ ID NO.15	SEQ ID NO.16
#2-6	SEQ ID NO.143	SEQ ID NO.144

表6

克隆编号	H链可变区核苷酸序列	L链可变区核苷酸序列
			#2-4	SEQ ID NO.31	SEQ ID NO.32
#2-6	SEQ ID NO.145	SEQ ID NO.146

表7

实施例9通过基因重组生产人抗体

(1)重组人IgG表达质粒的构建

参考数据库信息，制备含有人IgG重链基因的翻译起始密码子的ATG的有义引物和含有翻译终止密码子的反义引物，以人脾脏5’-Stretch cDNA文库(Clonetech公司制造)为模板进行PCR。将含有人IgG基因的扩增的DNA片段掺入pT7Blue(Novagen)，确认碱基序列。通过不切断人IgG基因的内部的限制酶将人IgG基因从pT7Blue中切出，然后插入到表达质粒pCAGGS的克隆位点，进行人IgG重链表达质粒的构建。人IgG轻链表达质粒的构建也以与重链的情况同样的方法进行。

(2)抗体基因的克隆

培养杂交瘤#2-6，制备细胞。将所得细胞用D-PBS(Sigma)清洗，然后使用TRIzol Reagent(Invitrogen)分离纯化总RNA。接着使用寡聚-dT引物和SuperScriptII system(Invitrogen)合成单链cDNA。合成扩增重链和轻链可变区的PCR引物，以来自杂交瘤的单链cDNA为模板进行PCR。将扩增的DNA片段掺入pT7Blue(Novagen)，进行碱基序列的确认。

(3)人-人嵌合抗体表达质粒的构建

使用可切取人IgG基因的重链可变区的适当的限制酶，切取重链可变区，与来自杂交瘤的重链可变区置换。此时，来自杂交瘤的重链可变区的DNA片段通过含有与插入的限制酶切位点相同的序列的引物进行PCR扩增。具有来自杂交瘤的轻链可变区的重组人IgG表达质粒的构建也以与重链的情况相同的方法进行。

(4)人-人嵌合抗体生成克隆的选择

导入到CHO(CCL-61)或SP2/0-ag14(ATCC CRL 1581)并经培养后在上清种表达的目标抗体通过与GPVI的结合活性进行选择。具体来说，首先，将各4μg(共12μg)嵌合抗体重链表达质粒、轻链表达质粒、pSV2-neo与60μg转染试剂FuGENE6(Roche Diagnostics)混合，静置一段时间。接着，在培养面积为150cm²的培养烧瓶中培养至半汇合的状态，向该细胞的培养液中添加质粒和FuGENE的混合液。培养2、3天后，将细胞接种于96孔板上，浓度为0.7个/孔，再用含有0.2mg/mlG-418的培养基进行2、3周的培养。从形成有集落的孔中回收培养上清，通过EIA研究与GPVI的结合活性，得到具有结合活性的克隆。

(5)人-人嵌合抗体的生成

将人-人嵌合抗体生成克隆在含有血清的培养基上培养，在汇合阶段更换为无血清培养基(Hybridoma-SFM、Invitrotec)，然后再进行2天的培养。将所得培养上清用蛋白A柱(ProseP-A、MILLOPRE)纯化，得到纯化嵌合抗体。

实施例10IgG4化和Fab化来自杂交瘤的抗GPVI抗体的制备

(1)材料和装置

所使用的材料和装置如下所示。

·引物(由SIGMA Genosys Japan合成)

HV3-11-a      5’GGAGTTTCCATTCGGTGATCAG 3’(SEQ ID NO.153)

IGLV2-14-a    5’GTGCTGGGGTCTCAGGAGGCAG 3’(SEQ ID NO.154)

IgL-a         5’CTATGAACATTCTGTAGGGGC 3’ (SEQ ID NO.155)

IgL-b         5’TGCAGCTCTAGTCTCCCGTGG 3’ (SEQ ID NO.156)

IgM-l         5’GGGAAGGAAGTCCTGTGCGA 3’  (SEQ ID NO.157)

IGLV1-51-a    5’CAGCTGTGAGCGCAGAAGGCAG 3’(SEQ ID NO.158)

IGLV1-51-b    5’TCGGGACAATCTTCATCATG 3’  (SEQ ID NO.159)

IgG4-a    5’CGGTCACATGGCACCACCTCT 3’(SEQ ID NO.160)

IgG4-c    5’TGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTC 3’(SEQ ID NO.161)

IgG4-d    5’GACCATATTTGGACTCAACTCTCTTGTCCA 3’(SEQ ID NO.162)

IgG4-f    5’GCCCATCATGCCCAGCACCTGAGTTCCTGG 3’(SEQ ID NO.163)

IgG4-g    5’CCAGGAACTCAGGTGCTGGGCATGATGGGC 3’(SEQ ID NO.164)

IgG4-h    5’TCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGC 3’(SEQ ID NO.165)

IgG4-i    5’GCTCTCGGGGCTGCCCTTTGGCTTTGGAGA 3’(SEQ ID NO.166)

IgG4-j    5’CCCTGGCACTCATTTACCCAG 3’(SEQ ID NO.167)

IgG4-k    5’GACGGGGTACGTGCCAAGCATCCT 3’(SEQ ID NO.168)

IgG4-m    5’AGCGCTAGCACCAAGGGCCCATCCGTCTTC 3’(SEQ ID NO.169)

IgG4-n    5’AGATCTTCATGGGGGACCATATTTGGACTC 3’(SEQ ID NO.170)

IgG4-t    5’TTAATGATGATGATGATGATGTGGGGGACC 3’(SEQ ID NO.171)

M4        5’GTTTTCCCAGTCACGACG 3’(SEQ ID NO.172)

HchainREV-ScaI   5’GGGCGGAGTACTGGAGACGGTGACC 3’(SEQ ID NO.173)

HchainEco47NheI  5’CCCCCGCTAGCGCTGGAGACGGTGACC 3’(SEQ ID NO.174)

mIgG2c-a  5’GGATCCAAAACAACAGCCCCATCGGTCTAT 3’(SEQ ID NO.175)

mIgG2c-b  5’TGGACAAGAAAATTGAGCCCAGAGTGCCCA 3’(SEQ ID NO.176)

mIgG2c-c  5’TGGGCACTCTGGGCTCAATTTTCTTGTCCA 3’(SEQ ID NO.177)

mIgG2c-d  5’GTCCCCCATGCGCAGCTCCAGACCTCTTGG 3’(SEQ ID NO.178)

mIgG2c-e  5’CCAAGAGGTCTGGAGCTGCGCATGGGGGAC 3’(SEQ ID NO.179)

mIgG2c-f  5’TCTCAAAACCCAGAGGGCCAGTAAGAGCTC 3’(SEQ ID NO.180)

mIgG2c-g  5’GAGCTCTTACTGGCCCTCTGGGTTTTGAGA 3’(SEQ ID NO.181)

mIgG2c-h  5’AGATCTTCATTTACCCAGAGACCGGGAGAT 3’(SEQ ID NO.182)

·PCR反应用酶

Ex Taq(TAKARA BIO INC.)

10X反应缓冲液和dNTP mixture使用所附产品

·基因组DNA

HeLa基因组lot：N34707-1(BD Biosciences Clontech)

小鼠基因组DNA(由B6小鼠尾部提取)

·PCR装置

DNA Engine(MJ RESEARCH，INC.)

·琼脂糖凝胶电泳

SeaKem GTG Agarose(TAKARA BIO INC.)

潜水型电泳装置(ADVANCE)

50X TAE(2mol/L Tris-乙酸，0.05mol/L EDTA)(NIPPONGENE)

分子量标志(Sty I消化的λDNA片段)

·由凝胶提取DNA片段的试剂盒

QIAEX II(QIAGEN K.K.)

·哺乳动物细胞用表达载体

pEF2cew(pEF-BOS的EF启动子上游附加有CMV增强子的改良型表达载体)

·TA克隆载体和连接试剂

pT7BlueT(NOVAGEN)

TaKaRa连接试剂盒ver.2(TAKARA BIO INC.)

·大肠杆菌感受态细胞JM109(TAKARA BIO INC.)

·质粒纯化试剂盒(QIAGEN K.K.)

·测序仪用试剂盒和分析装置

DYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing Premix Kit

lot.1767(Amersham Biosciences)

ABI3100遗传分析仪(Applied Biosystems)

·培养液

Dulbecco’s MEM培养基(Sigma)

·转染用试剂

FuGENE6(ロシユダイアグノステイツクス)

(2)实验方法

所使用的主要的实验方法如下所示。

·PCR反应

酶按照所附使用说明书进行。以下表示反应液的组成例。

反应液

TaKaRa Ex Taq(5units/μL)       0.25μL

10X Ex Taq缓冲液                5μL

dNTP混合物(各2.5mM)             4μL

人的肾脏第一链cDNA              1μL

有义引物(10pmol/μL)            1μL

反义引物(10pmol/μL)            1μL

水                              37.75μL

(a)琼脂糖凝胶电泳

首先制备0.8％浓度的琼脂糖凝胶。将其放入装满1x TAE的电泳槽。孔中加入5μL样品，然后在135V下进行15分钟的电泳。泳动结束后，将凝胶用溴化乙啶染色，再通过UV照射检测条带。同时电泳分子量标志。

(b)由凝胶提取DNA片段

用剃刀切取目标条带，使用QIAEX II试剂盒从凝胶片中提取DNA。方法按照所附说明书进行。提取的DNA片段溶解于20μL的无菌水中。

(c)连接反应

将1μL完成提取的DNA片段、1μL克隆用载体pT7BlueT和2μL连接试剂盒ver.2的I液混合，在室温下静置15分钟，进行连接反应。

(d)转化大肠杆菌

将50μL感受态大肠杆菌在冰上融解，加入4μL连接反应产物，直接在冰上静置30分钟。在42℃热休克45秒，涂布在含有终浓度为50μg/mL的氨苄青霉素的LB板上，在37℃培养过夜。

(e)质粒的纯化和测序反应

分别按照试剂盒的使用说明书进行。

(f)转染

按照FuGENE6使用说明书进行。采用6孔板时，转染前一天以1.5×10⁵个细胞/ml的密度将2mL COS-1细胞铺于各孔中。第二天，在97μL的Dulbecco’s MEM培养基上混合3μL的FuGENE6和1μg的表达质粒，静置15分钟或以上，然后滴加到2mL无血清Dulbecco’sMEM培养基上，通过与该培养液交换，进行转染。

(3)编码重链可变区和轻链的基因的克隆

1)通过用寡聚dT引物对由各杂交瘤提取的总RNA进行反转录，合成单链cDNA。接着通过如下所示的各反应，分别扩增编码各重链可变区和轻链的基因片段。

a)#2-4以单链cDNA为模板，使用引物(HV3-11-a和IgM-1)，通过PCR反应特异性扩增重链可变区的cDNA。另一方面，使用引物(IGLV1-51-a和IgL-b)进行第一次PCR反应，接着，以该反应产物为模板，使用引物(IGLV1-51-b和IgL-a)进行第2次的PCR反应(嵌套式PCR)，扩增轻链cDNA。

b)#2-6以单链cDNA为模板，使用引物(HV3-11-a和IgM-1)，通过PCR反应特异性扩增重链可变区的cDNA。同样，使用引物(IGLV2-14-a和IgL-b)进行PCR反应，扩增轻链cDNA。

2)将各扩增片段克隆到pT7-BlueT载体中，确认序列。具有#2-4的重链可变区的质粒为pT7-#2-4H，具有轻链的为pT7-#2-4λ，#2-6也同样，分别为pT7-#2-6H、pT7-#2-6λ。

(4)编码重链恒定区(Cγ4)的基因的克隆

以HeLa基因组DNA为模板，用以下的引物对进行PCR反应。结果，扩增了编码以下结构域的基因区：IgG4-a和IgG4-d中的CH1结构域、IgG4-c和IgG4-g中的铰链部分、IgG4-f和IgG4-i中的CH2结构域、IgG4-h和IgG4-k中的CH3结构域。接着，将这4种扩增产物混合，使用引物IgG4-m和IgG4-j进行PCR反应，由此得到各结构域相联接的扩增产物。将该扩增产物克隆到pT7-BlueT载体中，确认为编码重链恒定区(Cγ4)的序列，从而制成了pTK-2232。

(5)抗体表达用的重链表达质粒的构建

使用引物(M4和HchainREV-ScaI)对编码pT7-#2-4H和pT7-#2-6H的重链可变区的基因区进行PCR扩增，然后将该扩增产物用限制酶EcoR I和Sca I切断，制备片段A。

另一方面，将pTK-2232用限制酶Eco 47III和Bam HI切断，制备编码重链恒定区(Cγ4)的基因片段B。

将这些片段用EcoR I和Bam HI切断，与制备的表达载体pEF2cew的EF启动子下游连接成片段A+片段B，构建各重链表达质粒。确认序列后，作为pTK-#2-4γ和pTK-#2-6γ。

(6)Fab表达用重链表达质粒的构建

①只表达Fab重链的质粒的构建

使用引物(M4和HchainEco47NheI)对编码pT7-#2-4H和pT7-#2-6H的重链可变区的基因区进行PCR扩增，然后将该扩增产物用限制酶EcoR I和Nhe I切断，制备片段C。

另一方面，以pTK-2232为模板，使用引物(IgG4-m和IgG4-n)进行PCR反应，扩增紧接CH1结构域其后具有终止密码子的CH1基因片段。将该CH1扩增片段克隆到pT7-BlueT载体上，构建pT7-IgG4-mn。将该pT7-IgG4-mn用Nhe I和Bgl II切断，得到片段D。

将这些片段用EcoR I和Bam HI切断，与制备的表达载体pEF2cew的EF启动子下游连接成片段C+片段D，构建只表达各Fab重链的质粒。确认序列后，作为pTK-#2-4Fab和pTK-#2-6Fab。

②表达C末端具有组氨酸标志(His-tag)的Fab重链(Fab-His)的质粒的构建

以pTK-2232为模板，使用引物(IgG4-m和IgG4-t)进行PCR反应，扩增紧接CH1结构域其后具有His-tag的CH1基因片段。将该CH1扩增片段克隆到pT7-BlueT载体上，构建pT7-IgG4mt。将该pT7-IgG4mt用限制酶Nhe I和Bam HI切断，得到片段E。

将这些片段用EcoR I和Bam HI切断，与制备的表达载体pEF2cew的EF启动子下游连接成片段C+片段E，构建表达C末端具有His-tag的Fab重链的质粒。确认序列后，作为pTK-#2-4Fab-His和pTK-#2-6Fab-His。

(7)轻链表达质粒的构建

用不会切断轻链部分的适当的限制酶(例如Eco RI和Xba I等)切取具有各轻链基因的质粒(pT7-#2-4λ和pT7-#2-6λ)，制备片段F。

将该片段F用相同的酶切断，连接到制备的表达载体pEF2cew的EF启动子下游，构建各轻链表达质粒。确认序列后，作为pTK-#2-4λ和pTK-#2-6λ。

(8)重组抗体和Fab的表达

1)COS-1细胞在含有10％胎牛血清的Dulbecco’s MEM培养基上继代培养，转染前一天以1.5×10⁵个细胞/ml的密度将其铺于培养容器中。第二天，将重链(或Fab)表达质粒和轻链表达质粒与转染试剂(FuGENE6、Roche Diagnostics)进行适量混合，然后滴加到无血清的Dulbecco’s MEM培养基上，将其与培养液交换，进行转染。

结果，转染pTK-#2-4γ和pTK-#2-4λ时，可以使重组IgG4抗体——R#2-4抗体在培养液中分泌表达。同样，通过使用pTK-#2-6γ和pTK-#2-6λ，可以在培养液中分泌表达R#2-6抗体；使用pTK-#2-4Fab和pTK-#2-4λ、或者pTK-#2-6Fab和pTK-#2-6λ，可以在培养液中分泌表达重组Fab(pTK-#2-4Fab和pTK-#2-6Fab)；使用pTK-#2-4Fab-His和pTK-#2-4λ、或者pTK-#2-6Fab-His和pTK-#2-6λ，可以在培养液中分泌表达具有His-tag的重组Fab(R#2-4Fab-His和(R#2-6Fab-His)。

2)在50％CO₂存在下，在37℃培养2-3天，回收培养液。

(9)重组抗体的纯化

[重组IgG抗体的纯化]

从培养液中纯化重组IgG4抗体(R#2-4抗体和R#2-6抗体)，可以使用Prosep-A柱(MILLIPORE)进行，用PBS(pH 7.4)透析，然后由280nm的吸光度计算浓度。

[重组Fab的纯化]

1)从培养液中纯化重组Fab分子(R#2-4Fab和R#2-6Fab)，可以使用抗人λ轻链抗体柱(自己制作)进行。

2)从培养液中纯化具有His-Tag的重组Fab分子(R#2-4Fab-His和R#2-6Fab-His)，可以首先使用Hi-Trap Chelating HP(Amersham)进行初次纯化，然后使用抗人λ轻链抗体柱进行二次纯化，从而实现。

3)全部Fab在纯化后用PBS(pH 7.4)透析，由280nm吸光度计算浓度。另外，血小板凝聚抑制实验中要使用的Fab用生理盐水透析。

实施例11人GPVI-小鼠Fc融合蛋白的制备

(1)GPVI-mFc融合蛋白表达质粒的构建

1)以小鼠基因组DNA为模板，用以下的引物对进行PCR反应。结果，如mIgG2c-a和mIgG2c-c中的CH1结构域、mIgG2c-b和mIgG2c-e中的铰链部分、mIgG2c-d和mIgG2c-g中的CH2结构域、mIgG2c-f和mIgG2c-h中的CH3结构域，编码小鼠免疫球蛋白(mIgG2c)重链恒定区的各结构域的基因区得到扩增。接着，将这4种扩增产物混合，使用引物mIgG2c-a和mIgG2c-h进行PCR反应，由此得到各结构域相连接的扩增产物。将该扩增产物克隆到pT7-BlueT载体中，确认为编码重链恒定区(Cγ2c)的序列，从而制成了pT7-mIgG2c。

2)用限制酶Bam HI和Kpn I从该pT7-mIgG2c切取编码小鼠Fc区的基因片段，制备片段H。另一方面，用限制酶Xba I和Bgl II从pCAGGS-GPVI-Fc质粒中切取编码人GPVI胞外结构域的基因片段，制备片段I。将这些片段用Xba I和Kpn I切断，与制备的表达载体pEF2cew的EF启动子下游连接成片段H+片段I，构建表达人GPVI和小鼠Fc的融合蛋白(GPVI-Fc)的质粒。确认序列后，作为pTK-2249。

(2)GPVI-mFc融合蛋白的表达和纯化

1)COS-1细胞在含有10％胎牛血清的Dulbecco’s MEM培养基上继代培养，转染前一天以1.5×10⁵个细胞/ml的密度将其铺于培养容器中。第二天，将pTK-2249与转染试剂(FuGENE6、Roche Diagnostics)进行适量混合，然后滴加到无血清的Dulbecco’s MEM培养基上，将其与培养液交换，进行转染。

2)在50％CO₂存在下，在37℃培养2-3天，回收培养液。

3)从培养液中纯化GPVI-mFc融合蛋白，使用Prosep-A柱(MILLIPORE)进行，用PBS(pH 7.4)透析，然后由280nm的吸光度计算浓度。

实施例12各种抗GPVI抗体与GPVI结合活性的测定(细胞计量术)

从健康人采集血液，通过离心制备血小板组分。将5×10⁶个血小板悬浮于50μL含有5％人血浆、0.5％热灭活胎牛血清(FBS)的PBS中，添加2μg实施例10中制备的各种重组抗GPVI人抗体(IgG4)，然后在室温下温育1小时。用1mL含有0.5％热灭活FBS的PBS清洗2次，然后再悬浮于50μL含有0.5％热灭活胎牛血清(FBS)的PBS中，加入1μg抗人IgG抗体FITC标记抗体，然后温育1小时。用1mL含有0.5％热灭活FBS的PBS清洗2次，然后用Cytometric FC500(BeckmanCoulter)测定FITC阳性血小板数。

结果，与R#2-6抗体反应的血小板为90％或以上，R#2-4抗体中，68％为FITC阳性细胞。

图4是表示重组GPVI人抗体(R#2-4和R#2-6)与由人末梢血制备的血小板结合的图。图4中，白色直方图表示与作为阴性对照的人全部IgG反应时的荧光强度分布。灰色表示的直方图表示与R#2-4或R#2-6抗体反应时的荧光强度分布。

实施例13各种抗GPVI抗体与GPVI结合活性的测定(ELISA法)

用PBS制备成3μg/mL的GPVI-hFc嵌合蛋白或GPVI-mFc嵌合蛋白，分别以50μL/孔添加到ELISA用96孔板中，在37℃温育2小时，使其形成固相。用400μL/孔PBS清洗5次，然后用2％稳定剂/PBS在室温下进行1小时封闭处理。以10μg/mL的浓度将实施例10中制备的各种重组抗GPVI人抗体(IgG4)添加到GPVI-Fc固相化免疫板中，在室温下反应2小时。用含0.05％吐温20的PBS清洗3次，用PBS清洗2次，然后分别用PBS将二次抗体(抗人κ-轻链抗体HRP标记或抗人λ-轻链抗体HRP标记)稀释1000倍、稀释2000倍，添加到各孔中，在室温下温育2小时。用含0.05％吐温20的PBS清洗3次，用PBS清洗2次，然后添加TMB溶液，室温下显色20分钟，加入1M硫酸，中止显色，测定450nm的吸光度。

结果，作为阴性对照的人全部IgG几乎未与GPVI-hFc结合，但R#2-4和R#2-6抗体以10μg/mL显示与GPVI-hFc的明显的结合活性(图5)。R#2-6和R#2-4抗体也与GPVI-mFc显示了亲和性。

实施例14单独的抗GPVI抗体对全血和血小板的影响

(1)抗GPVI抗体对使用全血形成血凝块时的影响

使用抗凝血酶剂从健康人采血，向2mL采集的血液中添加各种GPVI抗体，使终浓度为30μg/mL，在37℃温育2小时。然后目视确认血凝块的形成。已知的抗GPVI抗体例如来自自身免疫性血小板减少患者血液中的IgG可单独引发血小板凝聚(非专利文献2)，因此可以推断该系统中，凝固系统过度活化，引起血凝块形成，但与添加对照IgG的情形相同，添加了R#2-4和R#2-6抗体的样品中，完全未见血凝块的形成。

(2)抗GPVI抗体对血小板的影响

按照实施例6，使用PRP测定抗体单独引发血小板凝聚的作用。结果，即使在100μg/mL的浓度下，R#2-4和R#2-6抗体单独没有引发人血小板凝聚。

实施例15人IgG化抗GPVI抗体对于血小板的胶原应答性的效果

使用抗凝血酶，由健康人采血，向2mL所采集的血液中添加各种GPVI抗体，在37℃温育3小时。然后分离血小板，制备成3×10⁸个血小板/mL，添加CaCl₂溶液，使终浓度为1mM，边在37℃搅拌边温育3分钟。加入胶原溶液，使终浓度为1-2μg/mL，用血小板凝聚能测定装置(A C Medical株式会社、MCM hematoracer801)测定浊度。

结果显示：用30μg/mL的R#2-4或R#2-6抗体处理的血小板中，血小板对胶原的凝聚能显著降低。

表8

	抗体浓度	最大凝聚率
			对照	-	70％
R#2-4	30μg/mL	10％
			R#2-6	30μg/mL	2％

产业实用性

本发明的抗体通过与人血小板上的GPVI特异性结合，使血小板凝聚能降低，因此，例如可以用作抗血小板药等药物。本发明的人抗体作为药物施用于人，没有异种抗体、嵌合抗体、人源抗体所具有的免疫原性，因此有用。本发明的抗体单独不会引发人血小板凝聚，这例如可以无需经过制成Fab等的处理即可直接作为药物施用。本发明的抗体比已有抗体可以以低用量抑制胶原导致的血小板凝聚，可以以更少的用量有效地作为药物应用。

序列表

<110>Mochida Pharmaceutical，Co.，Ltd.

<120>抗血小板膜糖蛋白VI单克隆抗体

<130>G05-0095

<150>JP 2003-199192

<151>2003-07-18

<160>182

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>5

<212>PRT

<213>智人

<400>1

Asp Tyr Tyr Met Ser

1               5

<210>2

<211>17

<212>PRT

<213>智人

<400>2

Tyr Ile Thr Ser Ser Ser Ser Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1               5                   10                  15

Gly

<210>3

<211>15

<212>PRT

<213>智人

<400>3

Asp Arg Ala Val Arg Gly Val Ile Ile Ile Arg Pro Pro Asp Tyr

1               5                   10                  15

<210>4

<211>14

<212>PRT

<213>智人

<400>4

Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser

1               5                   10

<210>5

<211>7

<212>PRT

<213>智人

<400>5

Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser

1               5

<210>6

<211>10

<212>PRT

<213>智人

<400>6

Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Leu Val

1               5                   10

<210>7

<211>5

<212>PRT

<213>智人

<400>7

Ser Tyr Ala Met Ser

1               5

<210>8

<211>17

<212>PRT

<213>智人

<400>8

Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1               5                   10                  15

Gly

<210>9

<211>9

<212>PRT

<213>智人

<400>9

His Phe Ile Leu Thr Gly Tyr His Tyr

1               5

<210>10

<211>13

<212>PRT

<213>智人

<400>10

Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Tyr Val Ser

1               5                   10

<210>11

<211>7

<212>PRT

<213>智人

<400>11

Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser

1               5

<210>12

<211>11

<212>PRT

<213>智人

<400>12

Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu Ser Ala Gly Val

1               5                   10

<210>13

<211>124

<212>PRT

<213>智人

<400>13

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

            20                  25                  30

Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Ser Tyr Ile Thr Ser Ser Ser Ser Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val

    50                  55                  60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Arg Asp Arg Ala Val Arg Gly Val Ile Ile Ile Arg Pro Pro Asp

            100                 105                 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>14

<211>126

<212>PRT

<213>智人

<400>14

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1               5                   10                  15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr

            20                  25                  30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

        35                  40                  45

Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65                  70                  75                  80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser

                85                  90                  95

Ser Thr Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln

            100                 105                 110

Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser

        115                 120                 125

<210>15

<211>137

<212>PRT

<213>智人

<400>15

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly

1               5                   10                  15

Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

            20                  25                  30

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

        35                  40                  45

Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

    50                  55                  60

Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala

65                  70                  75                  80

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn

                85                  90                  95

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

            100                 105                 110

Tyr Tyr Cys Ala Asn His Phe Ile Leu Thr Gly Tyr His Tyr Trp Gly

        115                 120                 125

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

    130                 135

<210>16

<211>129

<212>PRT

<213>智人

<400>16

Met Thr Cys Ser Pro Leu Leu Leu Thr Leu Leu Ile His Cys Thr Gly

1               5                   10                  15

Ser Trp Ala Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala

            20                  25                  30

Pro Gly Gln Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile

        35                  40                  45

Gly Asn Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro

    50                  55                  60

Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp

65                  70                  75                  80

Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr

                85                  90                  95

Gly Leu Gln Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp

            100                 105                 110

Ser Ser Leu Ser Ala Gly Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val

        115                 120                 125

Leu

<210>17

<211>15

<212>DNA

<213>智人

<400>17

gactactaca tgagc                                              15

<210>18

<211>51

<212>DNA

<213>智人

<400>18

ta cattacta gtagtagtag ttacacaaac tacgcagact ctgtgaaggg c     51

<210>19

<211>45

<212>DNA

<213>智人

<400>19

gatcgagcgg ttcggggagt tattataatc cgcccgccag actac             45

<210>20

<211>42

<212>DNA

<213>智人

<400>20

actggaacca gcagtgacgt tggtggttat aactatgtct cc             42

<210>21

<211>21

<212>DNA

<213>智人

<400>21

gatgtcagta at cggccctc a                                    21

<210>22

<211>30

<212>DNA

<213>智人

<400>22

agctcatata caagcagcag cactctggta                            30

<210>23

<211>15

<212>DNA

<213>智人

<400>23

agctatgcca tgagc                                            15

<210>24

<211>51

<212>DNA

<213>智人

<400>24

gctattagtg gtagtggtgg tagcacatac tacgcagact ccgtgaaggg c    51

<210>25

<211>27

<212>DNA

<213>智人

<400>25

cactttattttgactggtta tcactac                                27

<210>26

<211>39

<212>DNA

<213>智人

<400>26

tctggaagca gctccaacat tgggaataat tatgtatcc                          39

<210>27

<211>21

<212>DNA

<213>智人

<400>27

gacaataata agcgaccctc a                                              21

<210>28

<211>33

<212>DNA

<213>智人

<400>28

ggaacatggg atagcagcct gagtgctggg gtg                                 33

<210>29

<211>372

<212>DNA

<213>智人

<400>29

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtcaagc ctggagggtc cctgagactc    60

tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt gactactaca tgagctggat ccgccaggct    120

ccagggaagg ggctggagtg ggtttcatac attactagta gtagtagtta cacaaactac    180

gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat    240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagatcga    300

gcggttcggg gagttattat aatccgcccg ccagactact ggggccaggg aaccctggtc    360

accgtctcct ca                                                        372

<210>30

<211>378

<212>DNA

<213>智人

<400>30

cagtctgccc tgactcagcc ggcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc    60

tcctgcactg gaaccagcag tgacgttggt ggttataact atgtctcctg gtaccaacaa    120

cacccaggca aagcccccaa actcatgatt tatgatgtca gtaatcggcc ctcaggggtt    180

tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc    240

caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcatata caagcagcag cactctggta    300

ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta ggtcagccca aggctgcccc ctcggtcact    360

ctgttcccac cctcctct                                                  378

<210>31

<211>412

<212>DNA

<213>智人

<400>31

atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtggctattt taaaaggtgt ccagtgtgag    60

gtgcagctgt tggagtctgg gggaggcttg gtacagcctg gggggtccct gagactctcc    120

tgtgcagcct ctggattcac ctttagcagc tatgccatga gctgggtccg ccaggctcca    180

gggaaggggc tggagtgggt ctcagctatt agtggtagtg gtggtagcac atactacgca    240

gactccgtga agggccggtt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg    300

caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtatatt actgtgcgaa tcactttatt    360

ttgactggtt atcactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc ag            412

<210>32

<211>387

<212>DNA

<213>智人

<400>32

atgacctgct cccctctcct cctcaccctt ctcattcact gcacagggtc ctgggcccag    60

tctgtgttga cgcagccgcc ctcagtgtct gcggccccag gacagaaggt caccatctcc    120

tgctctggaa gcagctccaa cattgggaat aattatgtat cctggtacca gcagctccca    180

ggaacagccc ccaaactcct catttatgac aataataagc gaccctcagg gattcctgac    240

cgattctctg gctccaagtc tggcacgtca gccaccctgg gcatcaccgg actccagact    300

ggggacgagg ccgattatta ctgcggaaca tgggatagcagcctgagtgc tggggtgttc     360

ggcggaggga ccaagctgac cgtccta                                        387

<210>33

<211>31

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>33

gctctagagc atgtctccat ccccgaccgc c       31

<210>34

<211>29

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>34

cgggatccgt tgcccttggt gtagtactg          29

<210>35

<211>32

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>35

aaaggatcca gatctaacga gcccaaatct tg      32

<210>36

<211>34

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>36

aaaggtaccc tatcatttac ccggagacag ggag    34

<210>37

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>37

gaggtgcagc tggtggagtc tgg     23

<210>38

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>38

tgaggagacg gtgaccaggg ttcc    24

<210>39

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>39

gaggtgcagc tggtggagtc tgg     23

<210>40

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>40

tgaggagacg gtgaccaggg ttcc    24

<210>41

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>41

cagtctgccc tgactcagcc ggc    23

<210>42

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>42

agaggagggt gggaacagag tgac    24

<210>43

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>43

cagtctgtct tgacgcagcc ggc     23

<210>44

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>44

agaggagggt gggaacagag tgac    24

<210>45

<211>19

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>45

gttttcccag tcacgacgt    19

<210>46

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>46

ctaatacgac tcactatagg    20

<210>47

<211>5

<212>PRT

<213>智人

<400>47

Asn Tyr Ala Met Ala

1               5

<210>48

<211>17

<212>PRT

<213>智人

<400>48

Ala Ile Ser Val Ser Gly Thr Ser Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1               5                   10                  15

Gly

<210>49

<211>12

<212>PRT

<213>智人

<400>49

Arg Gly Leu Pro His Pro Lys Tyr Phe Cys Asp Ser

1               5                   10

<210>50

<211>5

<212>PRT

<213>智人

<400>50

Ser Asn Tyr Met Ser

1               5

<210>51

<211>16

<212>PRT

<213>智人

<400>51

Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly

1               5                   10                  15

<210>52

<211>15

<212>PRT

<213>智人

<400>52

Leu Lys Ala Asp His Tyr Asp Ser Leu Ala Pro Asp Phe Asp Tyr

1               5                   10                  15

<210>53

<211>5

<212>PRT

<213>智人

<400>53

Ser Tyr Asp Met His

1               5

<210>54

<211>16

<212>PRT

<213>智人

<400>54

Ala Ile Gly Thr Ala Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Gly Ser Val Lys Gly

1               5                   10                  15

<210>55

<211>12

<212>PRT

<213>智人

<400>55

Ala Gly Lys Met Trp Trp Arg Gly Ala Phe Asp Ile

1               5                   10

<210>56

<211>5

<212>PRT

<213>智人

<400>56

Ser Tyr Ala Met Ser

1               5

<210>57

<211>17

<212>PRT

<213>智人

<400>57

Ala Ile Thr Gly Ser Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1               5                   10                  15

Gly

<210>58

<211>12

<212>PRT

<213>智人

<400>58

Gly Gly Tyr Thr Ser Gly Asn Ser Tyr Phe Asp Tyr

1               5                   10

<210>59

<211>5

<212>PRT

<213>智人

<400>59

Thr Phe Tyr Ile His

1               5

<210>60

<211>17

<212>PRT

<213>智人

<400>60

Phe Ile Asn Pro Ser Gly Val Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1               5                   10                  15

Asp

<210>61

<211>12

<212>PRT

<213>智人

<400>61

Asp Thr Arg Gly Trp Ser Leu Asn Gly Leu Asp Val

1               5                   10

<210>62

<211>5

<212>PRT

<213>智人

<400>62

Asp Tyr Ala Met His

1               5

<210>63

<211>17

<212>PRT

<213>智人

<400>63

Leu Ile Asn Gly Asp Gly Gly Gln Thr His Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1               5                   10                  15

Gly

<210>64

<211>13

<212>PRT

<213>智人

<400>64

Gly Lys Arg Ser Gly Thr Tyr Tyr Asn Gly Leu Glu Tyr

1               5                   10

<210>65

<211>5

<212>PRT

<213>智人

<400>65

Asp Tyr Tyr Met Ser

1               5

<210>66

<211>17

<212>PRT

<213>智人

<400>66

Phe Ile Ser Ser Ser Ser Gly Tyr Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1               5                   10                  15

Gly

<210>67

<211>9

<212>PRT

<213>智人

<400>67

Arg Ser Ser Gly Phe Pro Phe Asp Leu

1               5

<210>68

<211>5

<212>PRT

<213>智人

<400>68

Ser Asn Tyr Met Ser

1               5

<210>69

<211>16

<212>PRT

<213>智人

<400>69

Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly

1               5                   10                  15

<210>70

<211>7

<212>PRT

<213>智人

<400>70

Gly Arg Trp Ser Tyr Asp Tyr

1               5

<210>71

<211>5

<212>PRT

<213>智人

<400>71

Asp Tyr Tyr Met Ser

1               5

<210>72

<211>17

<212>PRT

<213>智人

<400>72

Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1               5                   10                  15

Gly

<210>73

<211>13

<212>PRT

<213>智人

<400>73

Thr Leu Tyr Gly Ser Gly Ser Gly Asp Ala Phe Asp Ile

1               5                   10

<210>74

<211>5

<212>PRT

<213>智人

<400>74

Asp Tyr Gly Met Ser

1               5

<210>75

<211>17

<212>PRT

<213>智人

<400>75

Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1               5                   10                  15

Gly

<210>76

<211>9

<212>PRT

<213>智人

<400>76

Ala Val Ala Thr Asp Ala Phe Asp Ile

1               5

<210>77

<211>5

<212>PRT

<213>智人

<400>77

Ser Tyr Trp Met His

1               5

<210>78

<211>17

<212>PRT

<213>智人

<400>78

Arg Ile Asn Ser Asp Gly Ser Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1               5                   10                  15

Gly

<210>79

<211>12

<212>PRT

<213>智人

<400>79

Asp Leu Ser Pro Gly Ser Gly Ser Pro Phe Asp Tyr

1               5                   10

<210>80

<211>7

<212>PRT

<213>智人

<400>80

Thr Ser Gly Val Gly Val Gly

1               5

<210>81

<211>16

<212>PRT

<213>智人

<400>81

Phe Ile Tyr Trp Asn Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser Leu Lys Ser

1               5                   10                  15

<210>82

<211>13

<212>PRT

<213>智人

<400>82

Arg Glu Ile Ala Ala Ala Gly Leu Tyr Ala Phe Asp Ile

1               5                   10

<210>83

<211>5

<212>PRT

<213>智人

<400>83

Asp Tyr Ala Met His

1               5

<210>84

<211>17

<212>PRT

<213>智人

<400>84

Leu Ile Ser Gly Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1               5                   10                  15

Gly

<210>85

<211>15

<212>PRT

<213>智人

<400>85

Gly Ser Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Pro Gly Ala Phe Asp Ile

1               5                   10                  15

<210>86

<211>5

<212>PRT

<213>智人

<400>86

Asp Tyr Gly Met Ser

1               5

<210>87

<211>17

<212>PRT

<213>智人

<400>87

Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1               5                   10                  15

Gly

<210>88

<211>13

<212>PRT

<213>智人

<400>88

Gly Pro Thr Ile Ala Gly Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val

1               5                   10

<210>89

<211>5

<212>PRT

<213>智人

<400>89

Asn Tyr Ala Met His

1               5

<210>90

<211>17

<212>PRT

<213>智人

<400>90

Val Ile Ser Phe Asp Gly Arg Ser Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Arg

1               5                   10                  15

Gly

<210>91

<211>15

<212>PRT

<213>智人

<400>91

Glu Ile Gly Ala Ser Tyr Tyr Gly Ser Gly Gly Thr Pro Gly Tyr

1               5                   10                  15

<210>92

<211>5

<212>PRT

<213>智人

<400>92

Ser Tyr Tyr Trp Ser

1               5

<210>93

<211>16

<212>PRT

<213>智人

<400>93

Arg Ile Tyr Thr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser

1               5                   10                  15

<210>94

<211>11

<212>PRT

<213>智人

<400>94

Asp Leu Ala Ala Arg Pro Asn Trp Phe Asp Pro

1               5                   10

<210>95

<211>5

<212>PRT

<213>智人

<400>95

Ser Tyr Ala Met Ser

1               5

<210>96

<211>17

<212>PRT

<213>智人

<400>96

Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1               5                   10                  15

Gly

<210>97

<211>24

<212>PRT

<213>智人

<400>97

Asn Leu Pro Ala Pro Gly Tyr Cys Ser Ser Thr Ser Cys Tyr Ala Leu

1               5                   10                  15

Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val

            20

<210>98

<211>14

<212>PRT

<213>智人

<400>98

Thr Gly Thr Ser Ser Asp Ile Gly Ala Tyr Asp Phe Val Ser

1               5                   10

<210>99

<211>7

<212>PRT

<213>智人

<400>99

Asp Val Arg Asn Arg Pro Ser

1               5

<210>100

<211>10

<212>PRT

<213>智人

<400>100

Ser Ser Phe Thr Thr Ser Ser Val Trp Val

1               5                   10

<210>101

<211>14

<212>PRT

<213>智人

<400>101

Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser

1               5                   10

<210>102

<211>7

<212>PRT

<213>智人

<400>102

Glu Val Ser Lys Arg Pro Ser

1               5

<210>103

<211>10

<212>PRT

<213>智人

<400>103

Ser Ser Tyr Ala Gly Ser Asn Met Gly Val

1               5                   10

<210>104

<211>7

<212>PRT

<213>智人

<400>104

Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser

1               5

<210>105

<211>9

<212>PRT

<213>智人

<400>105

Gln Gln Tyr Tyr Arg Phe Pro Leu Thr

1               5

<210>106

<211>13

<212>PRT

<213>智人

<400>106

Ser Gly Arg Ser Ser Asn Ile Glu Ser Asn Asn Val Asn

1               5                   10

<210>107

<211>7

<212>PRT

<213>智人

<400>107

Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser

1               5

<210>108

<211>11

<212>PRT

<213>智人

<400>108

Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Gly Gln Val

1               5                   10

<210>109

<211>17

<212>PRT

<213>智人

<400>109

Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Lys Lys Asn Tyr Leu

1               5                   10                  15

Ala

<210>110

<211>7

<212>PRT

<213>智人

<400>110

Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser

1               5

<210>111

<211>9

<212>PRT

<213>智人

<400>111

Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Leu Thr

1               5

<210>112

<211>13

<212>PRT

<213>智人

<400>112

Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Tyr Val Ser

1               5                   10

<210>113

<211>7

<212>PRT

<213>智人

<400>113

Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser

1               5

<210>114

<211>11

<212>PRT

<213>智人

<400>114

Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu Ser Ala Gly Val

1               5                   10

<210>115

<211>11

<212>PRT

<213>智人

<400>115

Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Lys Tyr Ala Cys

1               5                   10

<210>116

<211>7

<212>PRT

<213>智人

<400>116

Gln Asp Ser Lys Arg Pro Ser

1               5

<210>117

<211>9

<212>PRT

<213>智人

<400>117

Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Tyr Val

1               5

<210>118

<211>11

<212>PRT

<213>智人

<400>118

Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Asn Val His

1               5                   10

<210>119

<211>7

<212>PRT

<213>智人

<400>119

Arg Asp Ser Asn Arg Pro Ser

1               5

<210>120

<211>11

<212>PRT

<213>智人

<400>120

Gln Val Trp Asp Ser Ser Thr Ala Cys Gly Val

1               5                   10

<210>121

<211>11

<212>PRT

<213>智人

<400>121

Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser

1               5                   10

<210>122

<211>7

<212>PRT

<213>智人

<400>122

Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser

1               5

<210>123

<211>11

<212>PRT

<213>智人

<400>123

Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Leu Val

1               5                   10

<210>124

<211>14

<212>PRT

<213>智人

<400>124

Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser

1               5                   10

<210>125

<211>7

<212>PRT

<213>智人

<400>125

Glu Val Thr Lys Arg Pro Ser

1               5

<210>126

<211>10

<212>PRT

<213>智人

<400>126

Cys Ser Tyr Ala Gly Ser Tyr Thr Phe Leu

1               5                   10

<210>127

<211>11

<212>PRT

<213>智人

<400>127

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala

1               5                   10

<210>128

<211>7

<212>PRT

<213>智人

<400>128

Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser

1               5

<210>129

<211>9

<212>PRT

<213>智人

<400>129

Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr

1               5

<210>130

<211>14

<212>PRT

<213>智人

<400>130

Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser

1               5                   10

<210>131

<211>7

<212>PRT

<213>智人

<400>131

Glu Val Ser Lys Arg Pro Ser

1               5

<210>132

<211>11

<212>PRT

<213>智人

<400>132

Ser Ser Tyr Ala Gly Ser Asn Asn Leu Tyr Val

 1              5                   10

<210>133

<211>11

<212>PRT

<213>智人

<400>133

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Tyr Leu Ala

1               5                   10

<210>134

<211>7

<212>PRT

<213>智人

<400>134

Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr

1               5

<210>135

<211>10

<212>PRT

<213>智人

<400>135

Gln Gln Arg Ser His Trp Gln Pro Leu Thr

1               5                   10

<210>136

<211>13

<212>PRT

<213>智人

<400>136

Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Tyr Val Ser

1               5                   10

<210>137

<211>7

<212>PRT

<213>智人

<400>137

Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser

1               5

<210>138

<211>11

<212>PRT

<213>智人

<400>138

Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu Ser Ala Tyr Val

1               5                   10

<210>139

<211>11

<212>PRT

<213>智人

<400>139

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn

1               5                   10

<210>140

<211>7

<212>PRT

<213>智人

<400>140

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1               5

<210>141

<211>9

<212>PRT

<213>智人

<400>141

Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr

1               5

<210>142

<211>17

<212>PRT

<213>智人

<400>142

Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asp Tyr Phe

1               5                   10                  15

Ala

<210>143

<211>140

<212>PRT

<213>智人

<400>143

Met Glu Phe Gly Leu Arg Trp Leu Phe Leu Val Ala Phe Leu Lys Gly

1               5                   10                  15

Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln

            20                  25                  30

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

        35                  40                  45

Ser Asn Tyr Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

    50                  55                  60

Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Val Ser Gly Thr Ser Thr Ala Tyr Ala

65                  70                  75                  80

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn

                85                  90                  95

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Asp Asp Thr Ala Val

            100                 105                 110

Tyr Tyr Cys Ala Lys Arg Gly Leu Pro His Pro Lys Tyr Phe Cys Asp

        115                 120                 125

Ser Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

    130                 135                 140

<210>144

<211>129

<212>PRT

<213>智人

<400>144

Met Ala Trp Ala Leu Leu Phe Leu Thr Leu Leu Thr Gln Gly Thr Gly

1               5                   10                  15

Ser Trp Ala Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser

            20                  25                  30

Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Ile

        35                  40                  45

Gly Ala Tyr Asp Phe Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala

    50                  55                  60

Pro Glu Leu Val Ile Tyr Asp Val Arg Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser

65                  70                  75                  80

Asn Arg Phe Ser Ala Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile

                85                  90                  95

Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Phe

            100                 105                 110

Thr Thr Ser Ser Val Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val

        115                 120                 125

Leu

<210>145

<211>421

<212>DNA

<213>智人

<400>145

atggagtttg ggctgaggtg gctttttctt gtggcttttt taaaaggtgt ccagtgcgag    60

gtacagctgt tggagtctgg gggagacttg gtacagcctg gggggtccct gagactctcc    120

tgtgcagcct ctggattcac ctttagtaac tatgccatgg cctgggtccg ccaggctcca    180

gggaaggggc tggagtgggt ctcagcaatt agtgttagtg gtactagcac agcctacgca    240

gactccgtga agggccggtt caccgtctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtattta    300

caaatgaaca gcctgagagc cgacgacacg gccgtatatt actgtgcgaa aagagggcta    360

ccgcacccga aatacttctg tgactcctgg ggccagggaa ccatggtcac cgtctcctca    420

g                                                                    421

<210>146

<211>387

<212>DNA

<213>智人

<400>146

atggcctggg ctctgctatt cctcaccctc ctcactcagg gcacagggtc ctgggcccag    60

tctgccctga ctcagcctgc ctccgtgtct gggtctcctg gacagtcgat caccatctcc    120

tgcactggaa ccagcagtga cattggtgct tatgactttg tctcctggta ccaacaacac    180

ccaggcaaag cccccgaact cgtgatttat gatgtccgta atcggccctc aggggtttct    240

aatcgcttct ctgcctccaa gtctggcaac acggcctccc tgaccatctc tgggctccag    300

gctgaggacg aggctgatta ttactgcagc tcatttacaa ccagcagcgt ttgggtgttc    360

ggcggaggga ccaagctgac cgtccta                                        387

<210>147

<211>15

<212>DNA

<213>智人

<400>147

aactatgcca tggcc                                                      15

<210>148

<211>51

<212>DNA

<213>智人

<400>148

gcaattagtg ttagtggtac tagcacagcc tacgcagact ccgtgaaggg c             51

<210>149

<211>36

<212>DNA

<213>智人

<400>149

agagggctac cgcacccgaa atacttctgt gactcc          36

<210>150

<211>42

<212>DNA

<213>智人

<400>150

actggaacca gcagtgacat tggtgcttat gactttgtct cc   42

<210>151

<211>21

<212>DNA

<213>智人

<400>151

gatgtccgta atcggccctc a                          21

<210>152

<211>30

<212>DNA

<213>智人

<400>152

agctcattta caaccagcag cgtttgggtg                 30

<210>153

<211>22

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>153

ggagtttcca ttcggtgatc ag                         22

<210>154

<211>22

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>154

gtgctggggt ctcaggaggc ag    22

<210>155

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>155

ctatgaacat tctgtagggg c     21

<210>156

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>156

tgcagctcta gtctcccgtg g     21

<210>157

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>157

gggaaggaag tcctgtgcga      20

<210>158

<211>22

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>158

cagctgt gag cgcagaaggc ag           22

<210>159

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>159

tcgggacaat cttcatcatg               20

<210>160

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>160

cggtcacatg gcaccacctc t             21

<210>161

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>161

tggacaagag agttgagtcc aaatatggtc    30

<210>162

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>162

gaccatattt ggactcaact ctcttgtcca    30

<210>163

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>163

gcccatcatg cccagcacct gagttcctgg    30

<210>164

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>164

ccaggaactc aggtgctggg catgatgggc    30

<210>165

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>165

tctccaaagc caaagggcag ccccgagagc    30

<210>166

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>166

gctctcgggg ctgccctttg gct ttggaga    30

<210>167

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>167

ccctggcact catttaccca g              21

<210>168

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>168

gacggggtac gtgccaagca tcct           24

<210>169

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>169

agcgctagca ccaagggccc atccgtcttc     30

<210>170

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>170

agatcttcat gggggaccat atttggactc    30

<210>171

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>171

ttaatgatga tgatgatgat gtgggggacc    30

<210>172

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>172

gttttcccag tcacgacg                 18

<210>173

<211>25

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>173

gggcggagta ctggagacgg tgacc         25

<210>174

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>174

cccccgctag cgctggagac ggtgacc       27

<210>175

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>175

ggatccaaaa caacagcccc atcggtctat    30

<210>176

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>176

tggacaagaa aattgagccc agagtgccca    30

<210>177

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>177

tgggcactct gggctcaattt tcttgtcca    30

<210>178

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>178

gtcccccatg cgcagctcca gacctcttgg    30

<210>179

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>179

ccaagaggtc tggagctgcg catgggggac    30

<210>180

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>180

tctcaaaacc cagagggcca gtaagagctc    30

<210>181

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>181

gagctcttac tggccctctg ggttttgaga    30

<210>182

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>182

agatcttcat ttacccagag accgggagat    30

Claims (8)

1.人抗体或其活性片段，其与人血小板膜糖蛋白VI特异性结合，并且其单独不会引发人血小板凝聚。

2.权利要求1的人抗体或其活性片段，其具有以下的作用：与人GPVI特异性结合，通过预先与人血小板接触，使人血小板应答胶原而凝聚的能力降低或缺失。

3.权利要求1的人抗体或其活性片段，其与人血小板膜糖蛋白VI特异性结合，抑制胶原导致的人血小板凝聚。

4.抗体或其活性片段，其与人血小板膜糖蛋白VI特异性结合，其中VH CDR1由SEQ ID NO.47的氨基酸序列组成、VH CDR2由SEQ ID NO.48的氨基酸序列组成、VH CDR3由SEQ ID NO.49的氨基酸序列组成、VLCDR1由SEQ ID NO.98的氨基酸序列组成、VLCDR2由SEQ ID NO.99的氨基酸序列组成、VLCDR3由SEQ IDNO.100的氨基酸序列组成；或者VH CDR1由SEQ ID NO.7的氨基酸序列组成、VH CDR2由SEQ ID NO.8的氨基酸序列组成、VHCDR3由SEQ ID NO.9的氨基酸序列组成、VLCDR1由SEQ ID NO.10的氨基酸序列组成、VLCDR2由SEQ ID NO.11的氨基酸序列组成、VLCDR3由SEQ ID NO.12的氨基酸序列组成。

5.权利要求1-3中任一项的抗体或其活性片段，其中，抗体是单克隆人抗体或重组人-人嵌合抗体。

6.产生权利要求1-4中任一项的抗体或其活性片段的细胞。

7.多核苷酸，其由编码权利要求1-4中任一项的抗体或其活性片段的H链和/或L链的碱基序列组成。

8.药物组合物，该药物组合物含有权利要求1-3中任一项的抗体或其活性片段作为有效成分。

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