JP2002509708A

JP2002509708A - コラーゲンペプチド及びその使用

Info

Publication number: JP2002509708A
Application number: JP2000541183A
Authority: JP
Inventors: ウィリアムファーンデール，リチャード; ジョンバーンズ，マイケル
Original assignee: ケンブリッジユニバーシティテクニカルサービシズリミティド
Priority date: 1998-03-30
Filing date: 1999-03-30
Publication date: 2002-04-02
Also published as: WO1999050281A3; CA2325017A1; AU3160599A; WO1999050281A2; GB9806806D0; EP1068313A2

Abstract

(57)【要約】コラーゲンペプチド、フラグメント及び変異体は、インテグリンα２β１、インテグリンα１β１及び／又は血小板レセプターＧｐＶＩと相互作用し及び／又はそれに結合する。このようなペプチド、その擬態物及びそれらに結合する物質は、凝集及び活性化を含む、血小板及び他の細胞機能を調節するのに役立つ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、凝集及び活性化を含む、血小板及び他の細胞機能を調節するのに役
立つペプチド：特にコラーゲン配列に基づくペプチドに関する。本発明は、これ
らペプチドの生産の方法、トリマーへのアセンブリー、及び使用の方法にも関す
る。

【０００２】コラーゲンは、ヒトの体で最も豊富なタンパク質であり、それは結合組織で重
大な役割を果たし、例えば骨、軟骨、皮膚及び腱に引張り強さを与える。分離し
た遺伝子の産物である約２０の異なるコラーゲンが知られている。これらのコラ
ーゲンのいくつかは天然で繊維状であり、例えばＩ型及びIII 型コラーゲンであ
る。これらの両方は血管壁に存在する。繊維状コラーゲンは三重ヘリックスとし
てアセンブルした３つのα鎖、トロポコラーゲン分子又はコラーゲンモノマーか
ら構成される。２つの遺伝子産物、別個のα１（Ｉ）及びα２（Ｉ）鎖は構造〔
α１（Ｉ）〕₂〔α２（Ｉ）〕₁を有する、Ｉ型コラーゲンを形成する。III 型コ
ラーゲンはトリマー構造〔α１（III)〕₃を有する、繊維の形成のためには高次の構造が必要であり、ここでは三重ヘリックスは更にアセンブルしてトロポコラ
ーゲン分子のアレイから規則正しい繊維を形成する。

【０００３】コラーゲンが三重ヘリックスとして自発的にアセンブルするために、α鎖の一
次構造がアミノ酸のトリプレットを含むことが必要である。ここでは、トリプレ
ットの最初の残基は常にグリシン（Ｇｌｙ又はＧ）、２番目はしばしばプロリン
（Ｐｒｏ又はＰ）、そして３番目はより頻度は少いが、ヒドロキシプロリン（Ｈ
ｙｐ又はＯ、又はＰ^*）である。コラーゲン配列は、しばしば単純化して〔ＧＰＯ〕_n（ここでｎは３３０等である）として供される。この理想的な配列からの発展が極めてしばしばあり、ＧＰＯトリプレットは、実際には、Ｉ型及びIII 型
コラーゲンの約１０〜１２％だけしか実際にはない。もちろん、この系は、Ｐ又
はＯ以外の残基が２番目及び３番目の位置に極めて一般的にあることである。コ
ラーゲンが三重ヘリックスを形成する能力は、（ｉ）１つのプロトン置換基がヘ
リックスの軸に近い小さな空間を占めるように、Ｇにおけるかさ高い側鎖の欠如
、（ii）三重ヘリックス構造を適合させることができるような、コラーゲンのポ
リペプチド骨格内で特定のベンドがおこるのを許容するＰ及びＯに存在するゆが
んだプロリン環構造、並びに（iii)ヘリックスの安定性に寄与するＯのヒドロキ
シル基に関与する鎖内水素結合から生ずる。

【０００４】細胞は、通常レセプターとして知られる特定の細胞表面タンパク質の媒介手段
を介して直接又は間接にコラーゲンと相互作用することができる。しばしばこれ
らはグリコプロテイン（Ｇｐｓ）と呼ばれる。直接的相互作用の例は、血小板内
で、コラーゲンのインテグリンα２β１（ＧｐＩａ−IIａ，ＶＬＡ₂又はＣＤ４９ｂ／ＣＤ２９）への結合、又は非特徴的レセプター、ＧｐＶＩへの結合であろ
う（Kehrel, 1995 ; Sixmaら、1995, Sixma ら1997 ; Moroi及びJung, 1997）。
間接的相互作用の例には、コラーゲン分子の特定のドメインとＧｐＩＢとの間の
結合又は架橋を形成するための補助分子、例えばフォン−ウィルブランド因子の
使用がある。

【０００５】多くの異なる細胞型がこれらの方法でコラーゲンと相互作用する。細胞−コラ
ーゲン相互作用は、創傷治癒、腫瘍転移、脈管形成及び新血管形成、並びに血栓
症の急性の原因である血小板凝集を導く血小板の活性化を含む過程のために必要
である。コラーゲンは、動脈の中膜から脈管内膜への脈管平滑筋細胞のマイグレ
ーションを含む細胞マイグレーションも支持し、それはアテロームの発達に寄与
し、アテロームの動脈壁を厚くする。細胞は、成長因子のような化学誘因的刺激
によりマイグレートするよう誘導されるが、それらは、移動するために、下にあ
る基質への物理的接着を必要とする。それゆえ、インテグリンは細胞運動性のた
めの機械的支持を供し得る。

【０００６】本発明は、一部は、細胞−コラーゲン相互作用のために前もって必要なものと
して三重ヘリシティに関する実験に基づく。コラーゲンは、臨界温度を超えて、
典型的には４０℃又はそれより高く加熱することにより変性（融解）させること
ができ、三重ヘリックス構造の再生を避けるために適切な予防措置をとった場合
、多くの細胞は、ゼラチンとしてより一般的に知られるこの変性したコラーゲン
を認識しない。変性したコラーゲンがトロポコラーゲン分子を再び形成して繊維
として再びアセンブルしないなら、それは血小板表面と相互作用せず、血小板活
性化を引きおこさない。

【０００７】コラーゲンレセプターは、いくつかの型のものであり得るが、これらのいくつ
かの分子構造は十分に規定されていない。例えば血小板レセプターＧｐＶＩは、
その分子量（約６５kDa)により、日本において今日、同定された極めて少い患者
が有する自己抗体により（Sugiyamaら、1993）、コンブルキシンとして知られる
特定のヘビ毒に結合する能力により（Polgarら、1997）、及び現在、ＧｐＶＩ欠
損血小板を用いる研究により、“コラーゲン関連ペプチド”又は“ＣＲＰ”とし
て知られるＧＰＯベースのポリマーのような本発明の合成ペプチドに結合する能
力により（Mortonら、1995 ; Gibbinsら、1997 ; Kehrel ら、1998）同定されて
いる。ＧｐＶＩの配列は知られていないし、その膜トポロジーも知られていない
が、それはMoroi 及びJung, 1997に定義されている、別の血小板コラーゲンレセ
プターＣＤ３６又はＧｐＩＶは配列決定されており、１つの膜貫通ドメインを有
する（Greenwalt ら、1992 ; Platt & Gordon, 1998）。ＣＤ３６はマラリアに感染した赤血球の他の組織への接着に関連することが示されている（Ockenhouse
ら、1989）。コラーゲン内のＣＤ３６結合モチーフは知られていない。

【０００８】インテグリンα２β１はよく規定されたコラーゲンレセプターである。それは
、２つの同一でないサブユニットα２及びβ１からなり、インテグリンファミリ
−の各々のメンバーは、１つの膜貫通ドメインを有し、そしてα２β１は、ウァ
ン−ウィルブランド因子のＩドメインと相同な配列を有するＩドメインとして知
られるα２サブユニットの特殊な領域を介してコラーゲンに結合することが知ら
れている。インテグリンは異なる細胞に広く分布しており、細胞−コラーゲン相
互作用は十分にしばしば、α２β１又はα１β１のいずれかのβ１インテグリン
により直接、媒介され得る。

【０００９】特定のインテグリンはモチーフＲＧＤを含むそれらのリガンド中のアミノ酸の
特定の配置を認識する。これは、いくつかのタンパク質、例えばフィブロネクチ
ン及びフィブリノーゲンの、それらのインテグリンレセプターへの結合を媒介す
る。これらのレセプターのペプチドアンタゴニストは、このＲＧＤモチーフ又は
その誘導体のいずれかを用いるように開発されている。

【００１０】 Staatzら（1991, J. Biol. Chem 266, 7363〜7367)は、インテグリンα２β１
とのコラーゲンの相互作用の部位はα１（Ｉ）鎖の残基４３５〜４３８の配列Ｄ
ＧＥＡであるとした。しかしながら、コラーゲン内にはいくつかのα２β１認識部位が存在すること
が知られている。この知見は、α鎖中のメチオニン残基を特異的に開裂するシア
ノーゲンブロマイド（ＣＢ）を用いて特定の及び再現可能なペプチドに加水分解
した精製されたα鎖由来のコラーゲンフラグメントの使用から生じる。これらの
ＣＢペプチドのいくつかは極めて長く、おそらく１００を超えるアミノ酸であり
、親コラーゲン分子の所定の三重ヘリックスフラグメントを形成するために復元
させることができる。それらは、例えばＩ型コラーゲンのα１鎖からの３番目の
ＣＢペプチドであるα１（Ｉ）ＣＢ３として、精製手順からの溶出の順番により
知られている。再生された及び三重ヘリックス形態のこれらのＣＢペプチドのい
くつかは血小板に結合するが、他はそうではない。特定のレセプターに対して生
じたモノクローナル抗体又は他の特定の抗体の使用は、この相互作用を支持する
血小板コラーゲンレセプターの同定を許容する。この型の実験は、α２β１を介
しての血小板の結合を支持するが他のものは不活性であることを示した（Morton
ら、1989 ; Morton ら、1994）。

【００１１】更に、一連のオーバーラップする短いペプチドとしてのこれらの活性ＣＢペプ
チドの合成は、親コラーゲン分子の特定の配列又は領域を、α２β１によるコラ
ーゲンの認識に寄与するものとして同定することを許容している。これにより、
α１（III)ＣＢ４内に位置したIII 型コラーゲンからの特定の配列、III 型コラ
ーゲンα鎖の残基５２２〜５２８のＧＧＰＯＧＰＲはIII 型コラーゲン内のイン
テグリンα２β１認識部位に寄与するとして同定された（Mortonら、1997）。

【００１２】この配列は自発的に三重ヘリックスコンホメーションを、とるために十分に長
くなく、また十分なＧＰＯ成分も有さない。これを達成するために、問題の配列
のいずれかの端にいくつかのＧＰＯトリプレットを合成する。ＧＰＰトリプレッ
トは同じ目的を供するであろう。Ｃ末端はリシル−リシル基に結合したＮ−連結
アミノヘキサノエート残基を用いて共有結合することができる。３成分ペプチド
鎖の各々のＮ末端、Ｃ末端又は両方におけるシステイン又は他の反応性残基の組
込みは、後の三重ヘリックス構造の架橋を許容する（Mortonら、1995）。

【００１３】本発明によれば、種々のペプチドが合成され、α１（Ｉ）ＣＢ３内に位置した
Ｉ型コラーゲンのα２β１−認識部位がα１（Ｉ）鎖の残基５０２〜５１６内に
あるとして同定された。α１（Ｉ）ＣＢ３のペプチドフラグメントを、一連のオ
ーバーラップするペプチドとして合成し、上述のようなＧＰＯ又はＧＰＰモチー
フ内にそれらを組み込んだ。但し、１つの例外で、上述の通りヘキサン酸を用い
てＣ末端共有結合を用いなかった。更に、配列の特定の改変を行い、上述の１５
残基配列から特定のアミノ酸トリプレットを削除し、示すようにＥのかわりにＡ
を含むよう特定のアミノ酸を置換する。そのペプチドは実験目的のために用いる
ために十分に高い融解温度を有することが見い出されている。

【００１４】三重ヘリックスを安定化する手段としてＧＰＯ又はＧＰＤを含むよう作られた
ペプチドを表１に示す。表１のペプチド５／６として再合成したペプチド５及び６のオーバーラップ領
域からのコラーゲン由来配列に含まれるとして同定されたこれらのペプチドによ
り包含されるα２β１認識配列も、トリプルヘリックスを安定化する別の手段と
してＧＰＰＮ末端及びＣ末端配列内に合成した。ＧＰＯ配列を欠如するこのペプ
チドはＧｐＶＩと反応せず、α２β１に特異的である。

【００１５】本発明の一態様によれば、アミノ酸配列ＧＦＯＧＥＲＧＶＥＧＰＯＧＰＡ（配
列番号：１）又はα２β１レセプターと相互作用し及び／又は結合する能力を保
持するそのフラグメントからなるコラーゲンのペプチドフラグメントを供する。更に、本発明は、プロリン（Ｐ）がヒドロキシプロリン（Ｏ）で置換された本
発明の一態様のコラーゲンフラグメントである配列ＧＦＰＧＥＲＧＶＥＧＰＰＧ
ＰＡ（配列番号：２）のペプチドも供する。本明細書で実験により証明するよう
に、このような改変したフラグメントは、驚くことに、α２β１インテグリンレ
セプターのα２Ｉドメインについて優れた結合活性を保持する。

【００１６】 α２β１を認識する最小配列を突きとめるために１つのアミノ酸又はそれ超だ
け上手く短くして作ったこれら２つのペプチド配列番号：１及び配列番号：２の
配列変異体であるペプチドも供する。１つのこのようなペプチドは活性配列、Ｇ
ＦＯＧＥＲ（配列番号：３）を有する。 α２β１に結合する能力を保持し、配列番号：１又は配列番号：２と少くとも
１０／１５のアミノ酸同一性、好ましくは１１／１５のアミノ酸同一性、より好
ましくは１２／１５，１３／１５又は１４／１５のアミノ酸同一性を有するか、
又は配列番号：３と少くとも３／６のアミノ酸同一性、より好ましくは４／６又
は５／６のアミノ酸同一性を有する、これらペプチド配列番号：１、配列番号：
２、及び配列番号：３のうちの１つの配列変異体であるペプチドも供する。好ましくは、このような態様によるペプチドは、ＧＦＯＧＥＲモチーフ内にフェ
ニルアラニン（Ｆ）、グルタミル（Ｅ）、及びアルギニル（Ｒ）残基の各々の保
持し、α２β１に結合する能力が要求されることを仮定する。結合活性は、ヒド
ロキシプロリン（Ｏ）をプロリン（Ｐ）で置換するなら、Ｅをアスパラテート（
Ｄ）で置換するなら、又はＲをリシン（Ｋ）で置換するなら、更に結合活性を失
わないいずれかの他の置換を行うなら、保持することができ、当業者はこれを容
易にテストすることができる。このような能力を減少させ又は失わせる場合、こ
れらの重大な残基のうちの１つ又は他のものを別のアミノ酸、例えばＡ（実験的
に例示）、又は残基、例えばＨｉｓ，Ｌｙｓ又はＡｒｇ、特にＴｒｙｐ，Ｔｙｒ
又はＰｈｅに置換することができる。このようなペプチドは、例えば試験管内接
着研究に役立つ構造的に不活性なアナログとして機能する。

【００１７】このようなコラーゲンフラグメントを含む非天然ペプチド及びポリペプチドも
、特にコラーゲンフラグメント又はその変異体が１又は複数の非コラーゲン配列
に融合されたものも本発明の態様として供する。これにより、例えば、本発明は、ペプチドの誘導体、例えばカップリングパー
トナー例えばエフェクター分子、ラベル、薬剤、毒素及び／又は担体もしくは輸
送分子、及び／又はターゲッティング分子、例えば抗体もしくはその結合フラグ
メントもしくは他のリガンドに結合したペプチドの誘導体も含む。本発明のペプ
チドのペプチジル及び非ペプチジルカップリングパートナーの両方へのカップリ
ングのための技術は当該技術分野で公知である。

【００１８】本発明の種々の態様によるペプチドは、別個の又はインテグリンの残りから単
離された形態の又は完全なヘテロダイマーのα２β１インテグリンレセプターの
α２Ｉドメインに結合することができる。ペプチドは、完全なα２β１のα２Ｉ
ドメイン、又はコラーゲンに結合し及び／又は本発明のＧＦＯＧＥＲＧＶＥＧＰ
ＯＧＰＡモチーフ又はＧＦＯＧＥＲに結合することができるフラグメントもしく
は変異体を用いて結合する能力について評価することができる。

【００１９】本発明によれば、ＧＰＰ反復配列及びコラーゲンフラグメントを含むペプチド
、又は議論されるようなその変異体又は誘導体、好ましくはα２β１コラーゲン
レセプターと相互作用し及び／又は結合することが（少くともトリマーにおいて
）できるコラーゲンフラグメント又は変異体を供する。このようなペプチドは好
適な条件下でトリマーを形成するであろうが、コラーゲンレセプターＧｐＶＩに
結合し及び／又は刺激しないであろう、そのペプチドは非天然、即ち天然に見い
出されないものである。一般に、ＧＰＰ反復配列は前記コラーゲンフラグメント
又は変異体に隣接するように含まれ、そのペプチドの末端に又はそれに隣接し得
る。

【００２０】 α２β１コラーゲンレセプターと相互作用し及び／又はそれに結合することが
できるコラーゲンフラグメント又は変異体は、開示されるような本発明の他の態
様に従ってＧＧＰＯＧＰＲフラグメント（Mortonら、1997）又はフラグメントも
しくは変異体を含み、又はそれからなり得、これには先に議論したもの（例えば
ＧＦＯＧＥＲＧＶＥＧＰＯＧＰＡ，ＧＦＰＧＥＲＧＶＥＧＰＰＧＰＡ又はＧＦＯ
ＧＥＲ）を含む。

【００２１】これは、α２β１コラーゲンレセプターと相互作用することができるがＧｐＶ
Ｉコラーゲンレセプターとはできないペプチドのトリマーを供する。配列番号：３のＧＦＯＧＥＲモチーフにより例示される本発明のペプチドはα
１インテグリンＩドメインによっても認識されるので、それらは、インテグリン
α１β１と相互作用し、その活性を調節するために、用いることができる。

【００２２】更なる態様において、本発明は、ＧＰＯ反復配列及びコラーゲンフラグメント
を含むペプチド又は開示されるようなその変異体又は誘導体、好ましくはα２β
１コラーゲンレセプターと相互作用し、及び／又はそれに結合することが（少く
ともトリマーにおいて）できるコラーゲンフラグメント又は変異体を供する。こ
れらのペプチドは、好適な条件下でトリマーを形成するであろうし、コラーゲン
レセプターＧｐＶＩに結合し及び／又はそれを刺激するであろう。そのペプチド
は非天然のもの、即ち天然に見い出されないものである。一般に、ＧＰＯ反復配
列は、コラーゲンフラグメント又は変異体に隣接するように含まれ、ペプチドの
末端に又はそれに隣接し得る。

【００２３】 α２β１コラーゲンレセプターと相互作用し及び／又はそれに結合することが
できるコラーゲンフラグメント又は変異体は、ＧＧＰＯＧＰＲを含み、又はそれ
からなり得る（Mortonら、1997）が、最も好ましくは、上述のものを含む、本明
細書に開示される本発明の他の態様によるフラグメント又は変異体である。これは、α２β１コラーゲンレセプターと相互作用することができ、ＧｐＶＩ
コラーゲンレセプターとも相互作用することができるペプチドのトリマーを供す
る。

【００２４】本発明による分子は、ＧＰＰ及び／又はＧＰＯ単位を含み得る。更に、三重ヘリックスコンホメーションは、特定の配列の各々の端で反復ＧＰ
とモチーフにより支持され得、ここで、Ｐ及び／又はＯにより供される可能性に
加えて、三重ヘリックスの安定性を保護するいずれかのアミノ酸、例えばＡ又は
Ｒを用いることができる。

【００２５】本発明のペプチドは、三量体化のためのいずれのヘキサン酸（例えば以下に実
験で示されるリシル−リシルアミノヘキサノエート架橋）も含まない。本発明の一態様によるペプチドは、任意のＧＰＰ又はＧＰＯ反復配列に加えて
コラーゲンフラグメントに連結した１又は複数の異種アミノ酸を含み得る。“異
種”とは、関連するコラーゲンフラグメントに介在アミノ酸なしでペプチド結合
により結合した関連コラーゲン内にないことを意味する。即ち、通常、本発明の
ペプチド内での融合の位置でコラーゲンフラグメントに天然で連結して見い出さ
れないアミノ酸の鎖である。通常、異種アミノ酸を含むなら、アミノ酸の隣接配
列は、コラーゲン内になく、コラーゲン内に隣接して存在しない配列で、５又は
それ超、好ましくは１０又はそれ超、より好ましくは１５又はそれ超、２０又は
それ超、又は３０又はそれ超のアミノ酸であり得る。

【００２６】本発明の異なる態様によるペプチドは、短くなる傾向があり、約６０アミノ酸
又はそれ未満、好ましくは約５０アミノ酸又はそれ未満、好ましくは約４０アミ
ノ酸又はそれ未満、好ましくは３５アミノ酸又はそれ未満、好ましくは約３０ア
ミノ酸又はそれ未満、好ましくは約２５アミノ酸又はそれ未満、好ましくは約２
０アミノ酸又はそれ未満好ましくは約１５アミノ酸又はそれ未満、好ましくは約
１０アミノ酸又はそれ未満の長さであり得る、ペプチドは、１０〜１５、１５〜
２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜５０又は５０
〜６０アミノ酸長であってよい。ＧＰＰ及び／又はＧＰＯ反復が含まれる場合、
トリプレット反復の数は約３〜５、好ましくは２、好ましくは３，４又は５であ
る。５超を含んでもよい（おそらく約１０未満）が、３，４又は５の反復が室温
で三重ヘリックスとして安定であるので、必要でないかもしれない。

【００２７】本発明の異なる態様によるペプチドは、上述のようにホモダイマーであってよ
く、ここで全ての３つの鎖は同一の配列であるが、天然でヘテロダイマーであっ
てもよく、即ちそれらの鎖のうちの１つが他のものと異なり、３つでなく２つの
鎖が同一の配列であり得る。一実施形態において、３つでなく１又は２の鎖を、
α２β１又はα１β１に特異的なレセプター特異的認識モチーフ、例えば配列番
号：３、ＧＦＯＧＥＲ、又はＧｐＶＩに特異的なＧＰＯモチーフに組み込むこと
ができる。このようなペプチドにおいて、適切な手段を用いて、好ましくはＣ末
端に、共有結合架橋を含めることが必要であり得る。ヘテロトリマーをアセンブ
ルするために適した手順は、当該技術分野で確立されており、例えばM. Goodman
ら、(1996) (A template-induced incipient collagen-like triple-helical st
ructure), J. Am. Chem. Soc. 118, 5156-5157 ; J. Ottl and L. Moroder, (19
99) (Disulfide-bridged heterotrimeric collagen peptides containing the c
ollagenase cleavage site of collagen type I), Synthesis and conformation
al properties. (J. Am. Chem. Soc. 121, 653-661, J. Ottl and L. Moroder,
(1999)), A new strategy for regioselective interstrand disulfide bridgin
g of multiple cysteine peptides (Tetrahedron Lett. 40, 1487-1490）がある
。

【００２８】本発明によるペプチドは、非コラーゲンペプチドもしくはポリペプチド又はポ
リペプチドドメインとの融合物として供することができる。本発明のペプチドの
三量化特性を利用することが要求される場合、三量化を妨害しないようにするこ
とがいずれの融合にも必要であろう。多重特異性は、例えば、レセプターをα２
β１及び／又はＧｐＶＩに架橋させるため、レセプター間の相互作用及びこのよ
うな異種相互作用から生ずる細胞内の出来事の調査のため、治療及び／又は診断
において利用されるこのような生物学的応答のために、１つの分子内に供するこ
とができる。

【００２９】本発明は、特定の又は他のレセプターの同種の架橋を誘導するために、レセプ
ター反応性配列の複数のコピーの組込みを供するこれにより、例えばＧＰＰトリ
プレットを１０までのトリプレットに介在させることにより適切な間隔があいた
配列ＧＦＯＧＥＲの２又はそれ超のコピーを含むペプチドを、レセプターα２β
１の２つのコピーの架橋のために用いることができる。同様に、レセプターＧｐ
ＶＩに特異的であるＧＰＯのような他のコラーゲンレセプターに特異的な配列は
、ＧｐＶＩの架橋のために用いることができる。これらのペプチドは、開示され
るように、ＧＰＰ隣接トリプレットの存在によりトリプレットヘリックス形態で
維持することができる。

【００３０】更なる態様において、本発明は、本発明による１又は複数のペプチドを含む、
好ましくは本発明による３つのペプチドからなるペプチドトリマーを供する。なお更なる態様は、ペプチドトリマーを製造する方法であって、本発明のペプ
チドを供し、そして（好適な条件下で）そのペプチドを会合させてトリマーを形
成することを含む方法を供する。

【００３１】三量化の次に、例えば後の使用及び／又は操作のために、トリマーの単離を行
うことができる。三重ヘリックス構造をとることを許容しない隣接配列内に含まれる認識モチー
フ、例えばＧＡＰのポリマーは、レセプターと相互作用する配列の能力を支持す
ることができない。このようなペプチドは、生物活性のアッセイにおいて重要な
不活性コントロール調製物を形成し得る。これは、結果のセクションで例示され
る。

【００３２】三量化のかわりとして、本発明によるペプチドは環化することができる。これ
は、それが適切な形状の標的、例えばレセプターとより高いアフィニティーで相
互作用することができるように、実質的にペプチドの自由度を減少させる。これ
を行うための化学は当該技術分野で利用でき、例えば市販の固相ペプチドシンセ
サイザーに基づく。ペプチドは、環状デンドリマーとして、典型的には短いスペ
ーサー配列の各々の端に５等のハープとして要求されるペプチドを有する種とし
て供することができる（Shao及びTam, 1995)。

【００３３】本発明の態様によるペプチド、特にトリマー型又は環化型のものは、コラーゲ
ン及び／又は他の細胞型への細胞接着、特に血小板、平滑筋細胞、腫瘍細胞又は
脈管内皮細胞の接着に用いることができる。それらは、細胞、例えば血小板、の
活性化、調節、特に阻害又はブロッキング、活性化に作用するために用いること
ができる。これは、治療、例えば血栓症の治療又は予防においてであり得る。

【００３４】ペプチドは、化学合成により全体を、又は部分的に作り出すことができる。本
発明の化合物は、十分に確立された標準的な液体又は好ましくは固相ペプチド合
成法に従って直ちに調製することができる。それらの一般的な記載は広く利用で
きるJ.M. Stewart及びJ.D. Young (Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd editi
on, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois (1984)), M. Bodanzsky 及
びA. Bodanzsky (The Practice of Peptide Synthesis, Springer Verlag, New
York (1984)); J.H. Jones (The Chemical Synthesis of Peptides. Oxford Uni
versity Press, Oxford 1991); Applied Biosystems 430A Users Manual (ABI I
nc., Foster City, California), G.A. Grant, (Ed.) Synthetic Peptides, A U
ser's Guide. (W.H. Freeman & Co., New York 1992), E. Atherton 及びR.C. S
heppard (Solid Phase Peptide Synthesis, A Practical Approach), IRL Press
1989 and in G.B. Fields, (Ed.) Solid-Phase Peptide Synthesis (Methods i
n Enzymology Vol. 289)), Academic Press, New York and London 1997)。ある
いは、それらは、液相法により又は固相、液相及び溶液化学により、例えば最初
に各々のペプチド部分を完成し、そして次に、必要に応じて適切なら、存在する
いずれかの保護基を除去した後、各々の炭酸もしくはスルホン酸又はそれらの反
応性誘導体の反応により残基Ｘを導入することにより溶液中で調製することがで
きる。

【００３５】本発明によるペプチドを供するための適切な技術は、以下の実験セクションに
より詳細に例示される。本発明によるペプチジル分子（ペプチド又はポリペプチド）を生産する別の便
利な方法は、発現系で核酸を用いることによりそれをコードする核酸を発現する
ことである。これは、Ｏを含まないペプチド、例えばＧＰＰ反復を含みＧＰＯ反
復を含まないもの、及び配列番号：１でなく配列番号：２を含むもの又はそれに
基づくものに特に適用できる。但し、ＧＰＯ含有ペプチドの生産は、リシル残基
で行われているように、例えば適切なヒドロキシラーゼの同時発現により行うこ
とができる（Nokelainenら、1998）。Ｈｙｐ（Ｏ）へのヒドロキシル化により翻
訳後に変換されるＰｒｏ残基を含むペプチドのために、プロリルヒドロキシラー
ゼを同時発現させることができる。

【００３６】従って、本発明は、種々の態様において、本発明のポリペプチド及びペプチド
をコードする核酸も供する。一般に、本発明による核酸は、おそらく発現のための１又は複数の調節配列を
除いて、単離及び／又は精製型で単離物として供される。本発明による核酸は、
組換えベクターの一部として供することができる。

【００３７】本発明によるポリペプチド又はペプチドをコードする核酸配列は、本明細書に
記載される情報及び引用文献並びに当該技術分野で知られた技術（例えばSambro
ok, Fritsch 及びManiatis, “Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, 1989, and Ausubel et al, Current Protoc
ols ｉn Molecular Biology, John Wiley and Sons, 1992を参照のこと）を用い
て当業者により直ちに調製することができる。

【００３８】核酸配列の発現を得るために、配列は、その発現を調節するために核酸に作用
可能に連結された１又は複数の調節配列を有するベクターに組み込むことができ
る。そのベクターは、挿入された核酸の発現を駆動するためのプロモーター又は
エンハンサーのような他の配列、そのポリペプチドもしくはペプチドが融合物と
して生産されるような核酸配列及び／又は宿主細胞内で生産されたポリペプチド
がその細胞から分泌されるような分泌シグナルをコードする核酸を含み得る。次
に、ポリペプチドは、ベクターを、そのベクターが機能的である宿主細胞に形質
転換し、そのポリペプチドが生産されるように宿主細胞を培養し、そして宿主細
胞又は周囲の媒体からポリペプチドを回収することによって得られる。大腸菌の
株、イースト及び真核細胞、例えばＣＯＳ又はＣＨＯ細胞を含む、当該技術分野
でこの目的のために用いられる。

【００３９】これにより、本発明は、（開示されるような）ポリペプチド又はペプチドを作
る方法であって、ポリペプチド又はペプチドをコードする核酸（一般に本発明に
よる核酸）からの発現を含む方法も包含する。これは、便利には、このようなベ
クターを含む培養物中の、宿主細胞を、そのポリペプチドの発現を引きおこし又
は許容する適切な条件下で増殖させることにより行うことができる。ポリペプチ
ド及びペプチドは、網状赤血球ライゼートのような試験管内系でも発現させるこ
とができる。

【００４０】上述の通り、化学合成によりペプチドを作る方法も本発明に含まれる。これにより、本発明の更なる態様は、本明細書に開示されるような異種核酸を
含む宿主細胞を供する。本発明の核酸は、宿主細胞のゲノム（例えば染色体）に
組み込むことができる。組込みは、標準的な方法に従って、ゲノムでの組換えを
促進する配列を含めることにより促進することができる、その核酸は、細胞内の
染色体外ベクター上にあっても、同定できる異種のもの又はその細胞に対して外
来性であってもよい。

【００４１】なお、更なる態様は、核酸を宿主細胞に導入することを含む方法を供する。“
形質転換”と限定なしに一般に（特に試験管内導入のために）呼ぶことができる
導入は、いずれかの利用できる技術を用いることができる。真核生物細胞のため
に、適切な技術は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキス
トラン、エレクトロポレーション、リポソーム媒介形質転換及びレトロウイルス
又は他のウイルス、例えばワクシニアウイルス、昆虫細胞のためにバキュロウイ
ルスを用いる導入を含み得る。細菌細胞のために、適切な技術は、塩化カルシウ
ム形質転換、エレクトロポレーション及びバクテリオファージを用いるトランス
フェクションを含む。かわりとして、核酸の直接の注入を用いることができよう
。

【００４２】マーカー遺伝子、例えば抗生物質耐性又は感受性遺伝子は、当該技術分野で公
知であるように、関心の核酸を含むクローンを同定することにおいて用いること
ができる。導入の次に、例えば宿主細胞（実際に形質転換された細胞も含み得るが、より
多い細胞は形質転換された細胞の子孫であろう）を、遺伝子の発現のための条件
下で、そのコードされたポリペプチド（又はペプチド）が生産されるように培養
することにより、核酸からの発現を引きおこし又は許容することができる。ポリ
ペプチドが好適なシグナルリーダーペプチドに結合して発現されるなら、それは
、細胞から培養培地に分泌され得る。発現による生産の後、ポリペプチド又はペ
プチドは、場合により宿主細胞及び／又は培養培地から単離及び／又は精製され
得、次に必要に応じて、例えば１又は複数の更なる成分を含み得る組成物、例え
ば１又は複数の医薬として許容される賦形剤、ビヒクル又は担体を含む医薬組成
物の調剤に用いられ得る（以下を参照のこと）。

【００４３】本発明によるペプチド及びポリペプチドは、α２β１レセプター及び／又はＧ
ｐＶＩレセプター、特にα２β１及び／又はＧｐＶＩに結合することができる本
明細書に開示されるもののようなペプチドの非ペプチジル擬態物（mimetics）で
ある分子とのコラーゲンの相互作用に影響を与える分子のためのアッセイに用い
ることができる。

【００４４】本発明によるアッセイ方法は、本発明のペプチドとα２β１及びＧｐＶＩレセ
プターのいずれか又は両方とを、テスト物質と一緒に、ペプチドとレセプターと
の間の相互作用のインヒビターであるテスト物質の欠如下でペプチド及びレセプ
ターが相互作用する条件下で接触させ、そして相互作用を決定することに関する
。本発明のペプチドと関連するレセプターとの間の相互作用を増強することがで
きる物質を供することが要求される場合、ペプチド及びレセプターがテスト物質
が相互作用を十分に増強することができないなら相互作用しない条件下で、ペプ
チド及びレセプターが供されるアッセイをデザインすることができる。

【００４５】本発明のアッセイの正確な形態は、慣用的な技術及び知識を用いて当業者によ
り変えることができる。例えば、物質間の相互作用は、一方を検出可能な標識で
ラベルしてそれを、固体支持体上に固定されている他方のものに接触させること
により試験管内で研究することができる。好適な検出可能ラベル、特にペプチジ
ル物質のためのものは、組換え生産されたペプチド及びポリペプチドに組み込む
ことができる³⁵Ｓ−メチオニンを含む、組換え生産されたペプチド及びポリペプ
チドは、抗体で標識することができるエピトープを含む融合タンパク質として発
現させることができる。

【００４６】固体支持体上に固定されたタンパク質は、固体支持体に結合したタンパク質に
対する抗体を用いて、又はそれ自体、知られている他の技術を介して固定するこ
とができる。好ましい試験管内相互作用はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラー
ゼ（ＧＳＴ）を含む融合タンパク質を利用し得る。これは、グルタチオンアガロ
ースビーズ上に固定することができる。上述の型の試験管内アッセイ形態におい
て、テスト化合物は、固定されたＧＳＴ−融合ポリペプチドに結合するラベルさ
れたペプチド又はポリペプチドの量を減らす能力を決定することによりアッセイ
することができる。これは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりグ
ルタチオン−アガロースビーズを分画することにより決定することができる、あ
るいは、ビーズは、ゆすいで未結合のタンパク質を除去して結合しているタンパ
ク質の量を、存在するラベルの量を、例えば好適なシンチレーションカウンター
でカウントすることにより決定することができる。

【００４７】２−ハイブリッドアッセイは、標準的なプラクテイスに従ってデザインするこ
とができる。ペプチド及び他の分子は、α２β１及び／又はＧｐＶＩコラーゲンレセプター
に結合する能力について評価することができ、調節、特に阻害又はブロック、血
小板活性化又は細胞培養（例えばＨＴ１０８０細胞のもの）が、例えば脈管平滑
筋細胞、腫瘍細胞又は脈管内皮細胞の細胞マイグレーションに作用し、又は細胞
増殖又は細胞生存性を調節する。

【００４８】アッセイは、凝集もしくは接着又は細胞機能の他のテストにおいてネイティブ
コラーゲン繊維の作用をブロックするテスト物質に関し得る。基礎をなすネイテ
ィブコラーゲン物質から細胞を置きかえる物質を用い又は見い出すことができる
。あるいは、ペプチドは、接着物質を形成し得、ここでテスト物質は結合する細
胞もしくはレセプターに置きかわることにおいて又は細胞マイグレーション、増
殖又は生存性のような１又は複数の細胞プロセスに作用することにおいて効率を
テストするため適用される。

【００４９】本発明のアッセイに加えることができるテスト物質又は化合物の量は、通常、
試験により決定され、誤差は用いる化合物の型に依存する。典型的には、約０．
０１μＭ〜１００μＭ又はそれ超、例えば０．１〜５０μＭ、特に３μＭ〜３０
μＭ、例えば約１０μＭの濃度の予想されるインヒビター化合物を用いることが
できる。ペプチドがテスト物質である場合には、より大きい濃度を用いることが
できる。弱い結合の分子でさえ、更なる研究及び開発のための有用なリード化合
物であり得る。

【００５０】用いることができる化合物は、薬剤スクリーニングプログラムに用いられる天
然の又は合成の化学化合物であり得る。いくつかのキャラクタライズされた又は
キャラクタライズされていない成分を含む植物の抽出物を用いることができる。いずれかのタンパク質中の相互作用の部位に対する抗体は予想されるインヒビ
ター化合物の更なるクラスを形成する。候補インヒビター抗体はキャラクタライ
ズすることができ、それらの結合領域を決定してその相互作用を破壊する原因と
なる一本鎖抗体及びそのフラグメントを供することができる。

【００５１】抗体は、当該技術分野で標準物である技術を用いて得ることができる。本発明によるアッセイ法を行った後、陽性である化合物、物質又は分子の単離
及び／又は製造及び／又は使用を行うことができる。物質又は剤を更に許容することができる。更に、それは、製造し、及び／又は
調製に、即ち医薬、医薬組成物又は薬剤のような組成物の製造又は調剤に用いる
ことができる。これらは、例えば本明細書に他所で議論される目的のいずれかの
ために、個体に投与することができる。

【００５２】上述の通り、剤は、ペプチジル、例えば上述の配列を含むペプチドであっても
、このようなペプチドの機能的アナログであってもよい。本明細書に用いる場合、“機能的アナログ”との表現は、コラーゲンと関連レ
セプターとの間の結合を妨害し得る問題のペプチドと同じ機能的活性を有するペ
プチド変異体又は有機化合物に関する。このようなアナログの例は、接触領域内
の関連するコラーゲンフラグメントの３次元構造、特にそれらがコラーゲン内に
現れるような重要なアミノ酸残基の配置に似るようにモデリングされた化学化合
物を含む。

【００５３】更なる態様において、本発明は、物質の擬態物についてデザインし又はスクリ
ーニングする方法における上述の物質の使用を供する。従って、本発明は、本発明のペプチド又は他の分子の擬態物（mimetics）をデ
ザインする方法であって、（ｉ）関連する生物活性（特にα１β１，α２β１又はＧｐＶＩレセプターと
相互作用する又はいずれかのレセプターとのコラーゲン相互作用を増強しもしく
は妨害する能力）を有する物質を分析してファルマコホアを規定する活性のため
に本質的で重要なアミノ酸残基を決定し；そして（ii）そのファルマコホアをモデリングして生物活性を有する候補擬態物をデ
ザイン及び／又はスクリーニングすることを含む方法を供する。

【００５４】適切なモデリング技術は当該技術分野で知られている。これは、標的レセプタ
ー、例えばα１β１，α２β１又はＧｐＶＩの蛍光発生誘導体の、それらの認識
モチーフとの機能的相互作用の研究に関するいわゆる“擬態物（mimetics）”の
デザイン及びそれらがこれらの相互作用を再現するような様式で配置された官能
基を含む化合物のデザインを含む。

【００５５】知られている医薬活性化合物の擬態物のデザインは、“リード”化合物に基づ
く医薬の開発への知られたアプローチである。これは、活性化合物が合成するの
が困難で又は高価である場合又は特定の投与の方法のために不適切である場合、
例えばペプチドが消化管内のプロテアーゼにより迅速に分解される傾向があるの
で経口組成物のための活性剤としてあまり適切でない場合に要求され得る。擬態
物のデザイン、合成及びテストは、標的特性について多数の分子をランダムにス
クリーニングするのを避けるために用いることができる。

【００５６】所定の標的特性を有する化合物からの擬態物のデザインにおいては一般にいく
つかのステップがとられる。最初に、標的特性を決定することにおいて重大で及
び／又は重要である化合物の特定の部分を決定する、ペプチドの場合、これは例
えば各々の残基を順に置換することにより、ペプチド中のアミノ酸残基を合成に
より変化させることにより行うことができる。化合物の活性領域を構成するこれ
らの部分又は残基はその“ファルマコホア”として知られる。

【００５７】ファルマコホアを見い出した後、その構造を、その物理特性、例えば立体化学
、結合、大きさ及び／又は電荷に従って、所定範囲のソース、例えば分光光学的
技術、Ｘ線反射データ及びＮＭＲからのデータを用いてモデリングする。コンピ
ューター分析、類似性マッピング（原子間の結合でなくファルマコホアの電荷及
び／又は容量をモデル化するもの）及び他の技術をこのモデリングプロセスに用
いることができる。

【００５８】このアプローチの変形として、リガンド及びその結合パートナーの３次元構造
をモデリングする。これは、リガンド及び／又は結合パートナーが結合に基づい
てコンホメーションを変化させて擬態物のデザインにこれを考慮したモデルを許
容する場合に特に役立ち得る。次に、そのファルマコホアに擬態した化学基を移植することができるテンプレ
ート分子を選択する。そのテンプレート分子及びそれに移植した化学基は、擬態
物が容易に合成できるように、薬理的に許容されるように、そして生体内で分解
しないように便利に選択され、ここでリード化合物の生物活性は保持される。次
にこのアプローチにより見い出された１又は複数の擬態物は、スクリーニングし
てそれらが標的特性を有するか否か又はどの程度それを示すかを見ることができ
る。次に生体内又は臨床テストのために１又は複数の最終的擬態物に到達するよ
う最適化又は改良を行うことができる。

【００５９】次にこのアプローチにより見い出された１又は複数の擬態物は、スクリーニン
グして、それらが標的特性を有するか否か、又はそれを示す程度を見ることがで
きる。生体内で又は臨床テストで１又は複数の最終的擬態物に到達するように更
なる最適化又は改良を行うことができる。この型の擬態物は、それらの治療における使用と共に、本発明の更なる態様を
形成する。

【００６０】本発明は、コラーゲンとα２β１コラーゲンレセプター及び／又はＧｐＶＩコ
ラーゲンレセプターとの間の相互作用を調節することができる物質についてスク
リーニングすることにおけるα２β１コラーゲンレセプター及び／又はＧｐＶＩ
コラーゲンレセプターと相互作用することができる、開示されるような配列を含
むペプチド、又はその誘導体、活性部分、アナログ、変異体もしくは擬態物の使
用を供する。

【００６１】一般に、本発明によるこのような物質、例えばペプチド、擬態物、インヒビタ
ーは、単離され及び／又は精製された形態で、即ち実質的に純粋な形態で供され
る。これは組成物中、少くとも約９０％の活性成分、より好ましくは少くとも約
９５％、より好ましくは少くとも約９８％の活性成分を含み得る。しかしながら
、このような組成物は、不活性担体材料又は他の医薬として及び薬理的に許容さ
れる賦形剤を含んでもよい。以下に示すように、本発明による組成物は、開示さ
れるインヒビター化合物に加えて、１又は複数の治療に用いる他の分子を含んで
もよい。

【００６２】本発明は、開示されるように同定されるペプチド及び他の物質ばかりでなく、
このような物質を含む医薬組成物、薬剤、医薬又は他の組成物、予防処置を含む
例えば本明細書で他所に議論される目的のための、患者に組成物を投与すること
を含む方法、例えば本明細書で他所に議論される目的のための、投与のための組
成物の製造におけるこれら物質の使用、並びにこのような物質を医薬として許容
される賦形剤、ビヒクル又は担体、及び任意に他の成分と混合することを含む医
薬組成物を製造する方法を包含する。

【００６３】個体に与えるべき本発明による医薬として有用な化合物は、好ましくは、“予
防に有効な量”又は“治療に有効な量”（場合によるが、予防は治療であると考
えることができる）で投与され、これは、個体に利益を示すのに十分な量である
。投与される実際の量及び比率並びに投与の時間は治療すべき対象の性質及び激
しさによるであろう。治療の処方、例えば投与量等に基づく決定は、一般の実施
者及び他の医師の責任の範囲内である。

【００６４】組成物は、治療する条件により、単独で、又は他の処置と組み合わせて、同時
に又は逐次的に投与することができる。本発明による及び本発明による使用のための医薬組成物は、活性成分に加えて
、医薬として許容される賦形剤、担体、緩衝液、安定剤又は当業者に公知である
他の材料を含み得る。このような材料は、非毒性であるべきで、活性成分の効能
を妨害するべきでない。担体又は他の材料の正確な性質は投与の経路に依存する
であろう。それは、経口、注入、例えば皮膚、皮下又は静脈内注入による。

【００６５】経口投与のための医薬組成物は、錠剤、カプセル、粉末又は液体形態であり得
る。錠剤は、個体担体、例えばゼラチン又はアジュバントを含み得る。液体医薬
組成物は、一般に、液体担体、例えば水、ペトロレウム、動物もしくは植物油、
鉱油又は合成油を含む。生理食塩水、デキストロースもしくは他のサッカライド
溶液又はグリコール、例えばエチレングリコール、プロピレングリコールもしく
はポリエチレングリコールを含めることができる。

【００６６】静脈、皮膚又は皮膚下注入、又は病気の部位への注入のために、活性成分は、
パイロジエンを含まず、適切なpH、等張性及び安定性を有する非経口的に許容さ
れる水溶液の形態であろう。当業者は、例えば等張ビヒクル、例えば塩化ナトリ
ウム注入、リンガー液、乳化リンガー液を用いて適切な溶液を十分に調製するこ
とができる。必要に応じて防腐剤、安定剤、緩衝液、酸化防止剤及び／又は他の
添加物を含めることができる。

【００６７】リポソーム、特にカチオン性リポソームは担体製剤に用いることができる。上述の技術及びプロトコルの例は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 1
6th edition, Osol, A (ed), 1980 に見い出すことができる。その剤は、要求される部位に局所的に投与しても特定の細胞又は組織を標的に
する様式でデリバリーしてもよい。組成物は、治療すべき状態により、単独で、
又は同時に逐次的に他の治療と組み合わせて投与してもよい。

【００６８】本明細書に開示されるポリペプチド、ペプチド又は他の物質、又はペプチジル
分子をコードする核酸分子は、キットにおいて、例えば外部環境からその内容物
を保護する適切な容器内に密閉することができる。このようなキットは使用のた
めの説明書を含み得る。本明細書に開示されるペプチド及び他の物質は、α２β１−及び／又はＧｐＶ
Ｉ認識モチーフによりコラーゲンのための特定の細胞レセプターに向かわせるこ
とができる。以下の適用が本発明の更なる態様として供される。

【００６９】１．例えば冠状脈血栓症又は関連する心臓血管疾患を制御することにおける、
血小板活性化の阻害。２．例えばいくつかの異なる病因、例えば転移及びアテローム発生における細
胞マイグレーションの阻害。これらの同じペプチドは試験管内で実験的研究にお
いて同様の適用を見い出すであろう。

【００７０】３．例えば特定のコラーゲンレセプターをラベルすることにおける診断テスト
。ペプチドは、インジケーター、例えば蛍光染料、例えばフルオレセイン又はロ
ダミン、又は放射化学ラベル、例えば ¹²⁵Ｉ、又はラベルされたストレプトアビ
ジンと後に組み合わせるビオチンで共有結合でラベルすることができる。リポー
ター分子は、直接又は間接的に、検出可能な、好ましくは測定可能なシグナルを
作り出す。リポーター分子の結合は、直接又は間接に、共有結合で、例えばペプ
チド結合を介して又は非共有結合であり得る。ペプチド結合を合する結合は、ペ
プチド又はポリペプチド及びリポーター分子をコードする遺伝子融合物の組換え
発現の結果としておこり得る。１つの好ましい態様は、スペクトルとして分離さ
れた吸収又は放射特性を有する個々の蛍光色素、リン光体又はレーザー染料との
ペプチドの共有結合によるものである。好適な蛍光色素はフルオレセイン、ロダ
ミン、フィコエリトリン及びテキサスレッドを含む。好適な色原染料は、ジアミ
ノベンジジンを含む。他のリポーターは、高分子コロイド粒子又は粒状材料、例
えば色のついたラテックスビーズ、磁気又は常磁性のもの、及び目により観察さ
れ、電子的に検出され又は記録される検出シグナルを直接的に又は間接的に引き
おこすことができる生物学的に又は化学的に活性な剤を含む。これらの分子は、
例えば色を発達させ又は変化させ、又は電気特性を変化させる反応を触媒する酵
素であり得る。それらは、エネルギー状態間の電子の遷移が特徴的な吸収又は放
射を引きおこすように分子的に励起し得る。それらは、バイオセンサーと組み合
わせて用いる化学物質を含み得る。ビチオン／アビジン又はビオチン／ストレプ
トアビジン及びアルカリホスファターゼ検出システムを用いることができる。

【００７１】結合を決定する態様は、本発明の特徴でなく、当業者は彼らの好み及び、一般
的な知識に従って適切な態様を選択することができる。体から除去した細胞及び／又は組織のサンプルに基づいて試験管内で又は生体
内で方法を行うことができる。４．コラーゲン内の所定の配列に対する抗体を作り出し又は得る。これらの抗
体は、コラーゲンのレセプター結合ドメインを探し出す手段として研究において
用いることができる。

【００７２】関心の標的に特異的な抗体は、当該技術分野で標準的である技術を用いて得る
ことができる。抗体を作り出す方法には、哺乳動物（例えばマウス、ラット、ウ
サギ、ウマ、ヤギ、ヒツジ又はサル）をタンパク質もしくはそのフラグメント、
又はそのタンパク質もしくはフラグメントを発現する細胞もしくはウイルスで免
疫化することを含む。標的ポリペプチドをコードするＤＮＡでの免疫化も可能で
ある（例えばWolff ら、Science 247 : 1465〜1468 (1990) ; Tongら、Nature 3
56 : 152〜154 (1992) ; Ulmer J.B. ら、Science 259 : 1745〜1749 (1993))。
抗体は、当該技術分野で知られた種々の技術のいずれかを用いて免疫化した動物
から得ることができ、好ましくは関心の抗原に対する抗体の結合を用いてスクリ
ーニングすることができる。例えば、ウエスタン・ブロッティング技術又は免疫
沈降法を用いることができる（Armitageら、 1992, Nature 357 : 80〜82）。

【００７３】モノクローナル抗体の生産は当該技術分野で十分に確立されている。モノクロ
ーナル抗体は、組換えＤＮＡ技術にかけて、もとの抗体の特異性を保持する他の
抗体又はキメラ分子を生産することができる。このような技術は、抗体のイムノ
グロブリン可変領域又は相補性決定領域（ＣＤＲｓ）をコードするＤＮＡを、異
なるイムノグロブリンの定常領域又は定常領域＋骨格領域に導入することに関す
る。例えば、ＥＰ１８４１８７Ａ，ＧＢ２１８８６３８Ａ又はＥＰ−Ａ−０２３
９４００を参照のこと。モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマは、遺伝
子変異又は他の変化にかけることができ、それは、生産された抗体の結合特異性
を変化してもさせなくてもよい。

【００７４】哺乳動物をペプチドで免疫化することのかわりに、又はそれを補って、タンパ
ク質に特異的な抗体を、発現されたイムノグロブリン可変ドメインの組換え生産
されたライブラリーから、例えばそれらの表面上に機能的なイムノグロブリン結
合ドメインを提示するラムダバクテリオファージ又は糸状バクテリオファージを
用いて得ることができる。例えばＷＯ９２／０１０４７を参照のこと。ライブラ
リーはネイティブであっても、即ち標的で免疫化されていない生物から得られた
配列から構成されても、関心の抗原（又はそのフラグメント）に露出した生物か
ら得た配列を用いて作製されたものであってもよい。

【００７５】抗体は、いくつかの方法で改変することができる。実際用語“抗体”は、要求
される特異性を有する結合ドメインを有するいずれかの特定の結合物質を包含す
るものとして解釈すべきである。これにより、これは、天然であるか合成である
かにかかわらず、イムノグロブリン結合ドメインを含む、いずれかのポリペプチ
ドを含む、抗体フラグメント、抗体の誘導体、機能的等価物及び相同体を包含す
る。それゆえ、別のポリペプチドに融合したイムノグロブリン結合ドメインを含
むキメラ分子又は等価物が含まれる。キメラ抗体のクローニング及び発現はＥＰ
−Ａ−０１２０６９４及びＥＰ−Ａ−０１２５０２３に記載される。

【００７６】結合する抗体の機能は、完全な抗体のフラグメントにより行われ得ることが示
されている。結合抗体の例は、（ｉ）ＶＬ，ＶＨ，ＣＬ及びＣＨ１ドメインから
なるＦａｂフラグメント；（ii）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメ
ント；（iii)単一抗体のＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；（iv
）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Word. E.S. ら、Nature 341, 544
〜546 (1989))；（ｖ）単離されたＣＯＲ領域；（vi）２つの結合したＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントであるＦ（ａｂ）′２フラグメント；（vii)
２つのドメインが会合して抗体結合部位を形成するのを許容するペプチドリンカ
ーによりＶＨドメイン及びＶＬドメインが連結されている一本鎖Ｆｖ分子（Ｓｃ
Ｆｖ）（Birdら、 Science, 242, 423〜426, 1988 ; Hustonら、PNAS USA, 85,
5879〜5883, 1988) ；（viii）二重特異性一本鎖Ｆｖダイマー（ＰＣＴ／ＵＳ９
２／０９９６５）及び（ix）遺伝子融合により作製された多価又は多重特異的フ
ラグメントである“ディアボディー（diabodies)”（ＷＯ９４／１３８０４；P.
Holligerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444〜6448, 1993)。

【００７７】５．コラーゲンレセプターに特異的な抗体を作り、同定する。本発明によるペ
プチドは、例えば（便利にはＳｃＦｖ形態であり得る）バクテリオファージライ
ブラリーにおいて、レセプター特異的抗体を同定するために用いることができる
。これは、例えばα２β１の、又はα１β１のα１サブユニットのＩ−ドメイン
の、α２β１のα２サブユニットのＩ−ドメインの、又はコラーゲンレセプター
を発現する細胞、例えばα２β１を発現する血小板又はＨＴ１０８０細胞からの
、又は他の細胞、例えばＧｐＶＩを発現する巨核球又は血小板からの精製された
レセプター調製物を用いて置換により又は選択により行うことができる。この方
法において、このようなコラーゲンレセプターに特異的な抗体を同定することが
できる。これらは、本発明に従うペプチドと同様の特性及び適用を有し得る。こ
れにより、ペプチドは、本発明のペプチドと比べて、治療に用いた時にタンパク
質分解からの保護のような特定の利点を供し得る別のセットの材料（抗体−例え
ばｓｃＦｖｓ）の生産への経路を供する。

【００７８】６．他のコラーゲンレセプター分子、例えばＣＤ３６（ＧｐＩＶ）と相互作用
するコラーゲン内のドメインをさがす。これらの相互作用は、それ自体、治療標
的を供し得る。７．他の非レセプター分子、例えばフィブロネクチン又はフォン−ウィルブラ
ンド因子のような他の細胞外タンパク質と相互作用するコラーゲン内のドメイン
を探し出す。これらの相互作用は、治療標的自体を供し得る。この更なる例は、
脈管内皮下のコラーゲンに結合するグリコサミノグリカン、デコリンのための結
合部位であり得、アテローマの発達に関連し得るリポタンパク質蓄積のための場所を供する（Pentikainen ら、1997）。

【００７９】本発明の態様及び実施形態は、以下の実験例及びサポート、並びに添付の図面
を引用することにより示されよう。更なる態様及び実施形態は、本開示の観点か
ら当業者に明らかであろう。本明細書に用いる用語“含む”は、“含む”、即ち
１又は複数の更なる成分の存在を許容する意味を有する。本明細書に言及される
全ての文献は引用により組み込まれる。

【００８０】実験 α１（Ｉ）ＣＢ３のペプチドフラグメントを、それらをＧＰＯ又は上述のＧＰ
Ｐモチーフに組み込むが、１つを除いて先に概説するヘキサン酸を用いるＣ末端
共有結合架橋なしに一連のオーバーラッピングペプチドとして合成した。更に、
特定の配列の修飾を、示すように、ＥをＡで置換することで行った。そのペプチ
ドは実験目的のために用いるのに十分に高い融解温度を有することが見い出され
た。

【００８１】三重ヘリックスを安定化する手段としてＧＰＯ及びＧＰＰを含むこのように作
ったペプチドを表１に示す。先に、構成鎖のアラインメントを、低ＧＰＯ成分のペプチドのために必要であ
ると考えられるリシル−リシル−アミノヘキサノエート構造を含むテンプレート
上でそれらを合成することにより保証した。しかしながら、アラインメントは自
発的に決定し得、これはその会合したペプチドの最小自由エネルギー状態を示し
、そしてペプチドはヘキサン酸架橋なしに正確に会合し得る。

【００８２】配列ＧＣＰ（ＧＰＰ）₁₀ＧＣＰＧを有する（ＧＰＰ）_nは、４１℃の融解温度（Ｔｍ_1/2 ）を有することが見い出された。配列ＧＣＡ（ＧＰＡ）₁₄ＧＣＡを有する３つのペプチドがリシル−リシルアミ
ノヘキサノエート構造により架橋されている（ＧＰＡ）_nは２９℃の融解温度を有することが見い出された。両方は、そのペプチドをプラスチック上に固定した
時にモノマーへのわずかな血小板接着しか示さず、例えば（ＧＰＰ）_n１％±０．４；コラーゲン１７％±１．３であった。以下の結果は、架橋されたペプチド
による血小板凝集について得られた：（ＧＰＰ）_n−ＣＲＰが５０μｇ／mLで活性である時、１０μｇ／mLで活性（即ちＣＲＰより２０００倍小さい）。

【００８３】（ＧＰＡ）_n−ＣＲＰが１００μｇ／mLで活性である時、１．５mg／mLで活性なし（即ちＣＲＰより少くとも１５，０００倍小さい）。（ＧＰＲ）_n−２mg／mLでの測定まで活性はない。表１のペプチド５／６として再合成したペプチド５及び６のオーバーラップ領
域からのコラーゲン由来配列に含まれるものとして同定されたこれらのペプチド
に含まれるα２β１認識配列も、三重ヘリックスを安定化する別の手段としてＧ
ＰＰＮ末端及びＣ末端配列内に合成した。ＧＰＯ配列を欠如するこのペプチド
はＧｐＶＩと反応せず、これによりα２β１に特異的である。

【００８４】ペプチドの細胞反応性を、これらのペプチドの以下の特性に関して研究した。１．血小板凝集を支持すること。２．血小板接着を支持すること。３．（α２β１を介して排他的にコラーゲンに結合する）ヒト繊維肉腫細胞系
ＨＴ１０８０の接着を支持すること。（１及び２におけるα２β１の関係は、α
２β１に対して生じた機能的にブロックする抗体の包含物に対する接着の感受性
により決定される。）４．精製された血小板α２β１に結合すること。α２の組換えＩ−ドメインに
結合すること。

【００８５】５．α１の組換えＩ−ドメインに結合すること。方法血小板接着及び凝集血小板接着を、細胞接着についての比色法（Knightら、1999を参照のこと）又
は記載されるような⁵¹Ｃｒラベルしたゲルろ過したヒト血小板（Zijenah 及びBa
rnes, 1990）のいずれかを用いて、３５mm又は他のペトリ皿（Falcon 1008 が好
適である）で測定した。阻害活性についてｍＡｂをテストする場合、血小板を１
５分、抗体とプレインキュベートした。ｍＡｂの効果の統計的有意性を、実験中
で、又は少くとも３回の別個の実験からの平均値を用いて、直ちに利用できるコ
ンピューター統計ソフトウエア（Instat, Graphlad, Sun Diego, CA, USAにより
製造）を用いて、分散の一元分析（one-way analysis of variance）(“ANOVA”
）により決定した。

【００８６】血小板凝集を、先に記載（Mortonら、1995）されるようにヒトのクエン酸添加
した血小板の豊富な血漿を用いて濁度計により測定した。凝集を測定する別の方
法、例えば電子粒子カウンティング又はインピーダンス測定が可能である（McMi
col. 1995）。ヒト繊維肉腫（ＨＴ１０８０）細胞の接着例えばEuropean Collection of Anima Cell Cultures, Porton Down, Wiltshi
re, UKから得ることができるＨＴ１０８０細胞を、１５％ＦＢＳ、２mMグルタ
ミン、ペニシリン（１００I.V.／mL）、ストレプトマイシン（１００μｇ／mL）
及びアンホテリシン（２．５ng／mL）を含むＥａｇｌｅ’ｓＭＥＭ又は適切な
ら他の増殖培地に維持した。細胞をトリプシン／ＥＤＴＡで収集し、２０％Ｆ
ＢＳを含むＥａｇｌｅ’ｓＭＥＭ又は他の緩衝液中に懸濁し、Ｄｕｌｂｅｃｃ
ｏ’ｓＰＢＳ（Ｃａ²⁺及びＭｇ²⁺なし）で４回、洗い、最後に１mM Ｍｇ²⁺を
含む接着緩衝液（ＴＢＳ）に懸濁した。Ｉｍｍｕｌｏｎ２又は他の好適なマル
チウエルプレートを２０℃で１時間、通常１０μｇ／mLでコラーゲン又はペプチ
ドでコートした。細胞懸濁液（０．１mL、３×１０⁴細胞）を各々のウエルに加え、必要に応じて２０℃又は３７℃で９０分の後、接着を測定した。接着は、未
接着の細胞をカウントするためにＣｏｕｌｔｅｒＣｏｕｎｔｅｒ（ｍｏｄｅｌ
ＺＦ）を用いて測定した。血小板のための比色法（Bellavite ら、1994, Anal
. Biochem. 216 : 444〜450)を、ＨＴ１０８０の適切な代替物及び他の細胞接着
アッセイを供するために直ちに適合させた。細胞を、阻害についてテストする場
合、１５分、抗体とプレインキュベートした、ｍＡｂによる接着のいずれの阻害
の有意性も、血小板と同じ統計分析を用いてテストした。

【００８７】インテグリンα２β１の単離インテグリンα２β１を、Messent ら（Kernら、1993）に詳細に記載されるよ
うに、コラーゲン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅでのアフィニティークロマトグラフィー
によりヒト血小板の可溶化膜から精製した。その純度を、ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動、免疫沈降法及びウエスタン・ブロッティングにより確立した。タン
パク質濃度をＢＣＡ試薬（Pierce）又は他の好適な方法並びに製造元の説明に従
ってビオチニル化キット（例えばAmershamから市販）を用いてビオチン化した精
製インテグリンで測定した。

【００８８】インテグリンα２β１結合アッセイそのアッセイ法は、本質的にTuckwellら（1995）に記載される通り行った。要
約すると、９６ウエルＥＬＩＳＡプレート（Nunc Mayisorp)を１００μＬの０．
０１Ｍ酢酸中１〜１０μｇ／mLのコラーゲン又はペプチドの溶液で、室温で２時
間、コートした。次にウエルを１時間、５０mg／mLでＢＳＡ（Sigma 、グレード
Ａ４５０３）を含む１００μＬのＴＢＳ（５０mM ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、pH７．４
中１５０mM ＮａＣｌ）でブロックし、１mg／mLでＢＳＡ（Sigma 、グレードＡ
７６３８）を含むＴＢＳ２００μＬし洗浄緩衝液）で３回、洗った。０．５μ
ｇ／mLでビオチニル化インテグリンを含む１００μＬの接着緩衝液（洗浄緩衝液
＋２mM ＭｇＣｌ₂及び１mM ＭｎＣｌ₂又は１０mM ＥＤＴＡ（二ナトリウム塩
）のいずれか、必要に応じて）を各々のウエルに適用し、室温で２時間、インキ
ュベートした。次にウエルを上述の通り洗い、３０分、１：１５００に洗浄緩衝
液で希釈した１００μＬのストレプトアビジン−ＨＲＰ（Amersham Life Scienc
es）とインキュベートした。そのウエルを再び３回、洗い、結合したインテグリ
ンを、製造元の説明に従って、ＴＭＢ−ペルオキシダーゼ基質システム（KPL, G
aithersburg, Maryland, USA）を用いて検出した。光学密度をＭａｘｌｉｎｅ
Ｅｍａｘプレートリーダー（Molecular Devices)又は他の好適な装置を用いて記
録した。アッセイを３回重複して行い、ペプチド又はコラーゲン基質の欠如下で
０．０１Ｍ酢酸でウエルをコートすることにより得られたバッグラウンドの読み
取りについて補正した。

【００８９】組換えインテグリンα１及びα２Ｉ−ドメインの生産組換えヒトα１及びα２インテグリンＩ−ドメインを、逆転写ポリメラーゼ鎖
反応により作った適切なｃＤＮＡからTuckwellら（1995）に詳細に記載される通
り生産し、大腸菌株ＤＨ５αＦ′の形質転換についてｐＧＥＸ−２Ｔにクローニ
ングした。インテグリンα１又はα２Ｉ−ドメイン−グルタチオン−Ｓ−トラン
スフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質を、グルタチオン−アガロースカラムで
のアフィニティークロマトグラフィーにより細菌ライゼートから単離した。

【００９０】インテグリンα１−ドメイン又はα２Ｉ−ドメイン結合アッセイ結合を、本質的にTuckwellら、1995に記載されるようにアッセイした。要約す
ると、ＮｕｎｃＭａｘｉｓｏｒｐマルチウエルプレートを室温で１時間、コラ
ーゲン又はペプチドでコートし、上述のようにＢＳＡでブロックした。ブロッキ
ングの後、ウエルを１mM ＭｇＣｌ₂及びＢＳＡ（１mg／mL）を含むＴＢＳで３回、洗った。上述の緩衝液中５０μｇ／mLのα１又はα２Ｉ−ドメイン融合タン
パク質（又は交換可能に供するトロンビンで開裂したＩ−ドメイン）の溶液又は
Ｍｇ²⁺のかわりに５mM ＥＤＴＡを含むもの１００μＬをウエルに適用し、プレ
ートを室温で３時間、インキュベートした。次にウエルを上述のように洗った。
結合したＩ−ドメインを、ウエル当り１００μＬのＴＢＳ中１０μｇ／mLのポリ
クローナルウサギ抗ＧＳＴ（＋１mM ＭｇＣｌ₂及びＢＳＡ、１mg／mL）を加えることにより検出した。血小板を４５分、インキュベートし、次に上述の通り３
回、洗ったＴＢＳ（＋Ｍｇ²⁺及びＢＳＡ）中に２０００に希釈したペルオキシダ
ーゼ接合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＰＡＫＯ）をウエルに加え、プレートを更に４５
分インキュベートし、上述の通り最終洗浄を供した。次にウエルをＴＭＢ−ペル
オキシダーゼ基質システム（ＫＰＬ）で処理し、Ｅｍａｘプレートリーダーを用
いて４５０nmで色を読んだ。アッセイを３回重複して行い、上述の通り読み取り
値を補正した。

【００９１】ペプチド合成ペプチドを合成するいずれの適切な方法用いることができる、以下のものが好
適であることが見い出された。ペプチドを、Ｆｍｏｃ／ｔ−Ｂｕ化学によりPerSeptive Biosystems 9050 Plu
s PepSynthesiserにおいてTentaGel R RAM樹脂でＣ末端アミドとして合成した。
側鎖保護基は次の通りであった：Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ａｓｎ（Ｔｒｔ），Ａｓｐ
（Ｏｔ−Ｂｕ），Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｇｌｕ（Ｏｔ−Ｂｕ）
，Ｈｙｐ（ｔ−Ｂｕ）及びＬｙｓ（Ｂｏｃ）。一般に、Ｆｍｏｃ−アミノ酸（４
等量）は、ジイソプロピルエチルアミン（８等量）の存在下でＨＡＴＶ（４等量
）で活性化した（Carpino ら、(1994) J. Chem. Soc, Chem. Commun. 201〜203)
。ＨＯＡｔ（４等量）を、Ａｓｎ及びＧｌｎをカップリングする時に加えた。Ｆ
ｍｏｃ脱保護化を２％（ｖ／ｖ）ピペリジン及び２％（ｖ／ｖ）の１，８−ジア
ザビシクロ〔５．４．０〕ウンデク−７−エンの混合物で行った。但し、ジメチ
ルホルムアミド中２０％ピペリジン及び０．１Ｍ１−ヒドロキシベンゾトリア
ゾールをアスパルチミド形成を最小化するために用いた場合のＡｓｐを含むペプ
チドは除いた（Mortinez, J. 及びBodanszky, M. (1978) Int. J. Pert. Prot.
Res. 12, 277 ; Fields ら、(1996) Lett. Pert. Sci. 3, 3-16)。Ａｓｐ−Ｇｌ
ｙ配列も含むペプチドは特にアスパルチミドを供する傾向があり（Quibellら (1
994) J. Chem. Soc., Chem. Commun. 2343-2344)、これらはＦｍｏｃ−（Ｆｍｏ
ｃ−Ｈｍｂ）−Ｇｌｙ及びＦｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｏｔ−Ｂｕ）−ＯＰｔｐを用いて
行った。（Packman, L.C. (1995) Tetrahedron. Lett. 36, 7523〜7526）。ペプ
チドを、トリフルオロ酢酸、チオアニソール、エタンジオール及びトリイソプロ
ピルシランの混合物（容量で９０：５：２．５：２．５）で室温で６時間の処理
により樹脂から遊離させた。粗ペプチドを、０．１％トリフルオロ酢酸を含む水
中５〜４５％アセトニトリルの直線勾配を用いてＶｙｄａｃ２１９ＴＰ１０１５
２２のカラムで逆相ＨＰＬＣにより精製した。均一の産物を含む画分をＶｙｄａ
ｃ２１９ＴＰ５４のカラムで分析用ＨＰＬＣにより同定し、プールして凍結乾燥
させた。精製したペプチドの同一性を質量分析により確認した。

【００９２】全てにおいて、フラグメント１（Ｉ）ＣＢ３の配列に基づく１〜７で示す７つ
のオーバーラップするペプチドを合成した（表１を参照のこと）。更に、ペプチ
ド５及び６の間のオーバーラップ配列に基づいていくつかの関連するペプチドを
、特定のアミノ酸を置換しまたは特定のアミノ酸を削除して行った。配列を表１
Ａ〜１Ｄに示す。ＧＰＯ又はＧＰＰトリプレットのいずれかの隣接配列を用いて
表１Ａ〜１Ｄに示すように三重ヘリックス構造を維持した。

【００９３】各々のペプチドの三重ヘリックスの安定性を、上述のように偏光計により評価
した。架橋ペプチドを、先に記載のように、３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオン酸
Ｎ−ヒドロキシスクシニシドエステルで架橋した（Mortonら、1995）。

【００９４】結果ペプチドがそれらのレセプターとの相互作用のためにコンホメーション的に束
縛された構造を有することが重要である。これは、偏光計を用いて施光度により
三重ヘリックスのコンホメーションをペプチドについて確認した。ペプチド６についての試料の結果を図１に示す。ペプチドの融解温度は次の通
りであった：ペプチド１３２℃ ペプチド２３９℃ ペプチド３３７℃ ペプチド４３６℃ ペプチド５３０℃ ペプチド６３０℃ ペプチド７２６℃ ペプチド５／６３９℃ Ｄｅｓ−Ｅ５／６４４℃ 配列をＧＰＰ，ＧＰＡ又はＧＰＲＮ−及びＣ−末端ポリマー内に合成した時
、融解温度は特徴的に低かったが室温よりは高く、これらのペプチドを三重ヘリ
ックスコンホメーションでテストすることができた。配列ＧＦＯＧＥＲもＧＡＰ
ポリマーＮ−及びＣ−末端ペプチド内に合成した。このペプチドについて融解曲
線を得ることができ、それは三重ヘリックス構造をとらないことも示した。

【００９５】図２は、完全なコラーゲンがα２β１インテグリンに結合するがペプチド１，
２，３及び４はそうでないことを示す。ペプチド７も図３に示す通り結合しない
ことが見い出された。ペプチド５及び６は図３に示す通りコラーゲンより大きい
結合性でコラーゲンに結合した。α２β１インテグリン認識部位は、配列：ＧＦ
ＯＧＥＲＧＶＥＧＰＯＧＰＡに対応するペプチド５及び６のオーバーラップ領域
に局在化した。ペプチド５／６は、この配列で合成した。

【００９６】ＨＴ１０８０細胞はα２β１インテグリンを発現するので、このインテグリン
により媒介される接着の更なるテストに用いた。細胞は、ペプチド２，３，４及
び７への有意な接着に示さなかったが、コラーゲンに対するのと同程度にペプチ
ド５，６及び５／６への優れた接着があった。即ちこれは９０分、室温で約８０
％であった。ペプチド１への接着は約６０％であった。

【００９７】コラーゲン及びペプチド１，５，６及び５／６への接着は抗インテグリン６Ｆ
１により強力に阻害された（Collerら、1989, Blood, 74 : 182〜192）、その阻
害は実験の間、６５〜９０％で変化した。６Ｆ１の存在下でのいずれの残った接
着も細胞の広がりの全くの欠如においておこった。コラーゲン並びにペプチド５／６、５／６ＧＥＡ及び５／６ＧＡＲ変異体への
組換えＩ−ドメインの接着をアッセイした。結果を図４に示す。接着が、インテ
グリンの結合活性のために必要なＭｇ²⁺に結合するキレーターであるＥＤＴＡに
より阻害され、これによりそのアッセイを確認した。ペプチド５／６ＧＡＲは
α２β１に結合する能力を欠如することが見い出され、このことは、α２β１へ
の（おそらくコラーゲンによる）５／６の結合のためのＧｌｕの重要性を示し、
同様に、Ａｒｇ残基はＡｌａにより置換され得なかった。

【００９８】ペプチド５／６へのα２Ｉ−ドメイン及びα２β１の両方の接着も、６Ｆ１抗
体により及びＥＤＴＡにより阻害された。同様の結果が、ＨＴ１０８０細胞及び
完全な血小板を用いて得られた。図５及び６は、５／６オーバーラップペプチドからアミノ酸トリプレットを削
除する効果を示す。α２Ｉ−ドメインの（並びに示さないが血小板、ＨＴ１０８
０細胞及び精製したα２β１の）接着は、ペプチドＤｅｓ−ＧＰＡ，Ｄｅｓ−Ｇ
ＶＥ及びＤｅｓ−ＧＰＯにより保持されたが、Ｄｅｓ−ＧＦＯは接着を支持せず
、このことは、配列ＧＦＯＧＥＲがα２Ｉ−ドメイン及び完全なインテグリンと
の反応性の重大な決定基を含んでいることを示す。

【００９９】図７は、ＧＦＯＧＥＲ配列内のＧｌｕ（Ｅ）残基の重要性を示す。なぜならペ
プチドＧＦＯＧＤＲ（ＧＰＰポリマー構造内に合成したもの）はα２β１結合を
支持することができなかったからである。図８は、Ｄｅｓ−ＧＶＥ内のこの同じ配列、ＧＦＯＧＥＲが、その配列がイン
テグリンα１β１によっても認識されるように、α１Ｉ−ドメインの結合を支持
することを示す。ＧＦＯＧＤＲはα１結合を支持する能力を示さなかった。

【０１００】図９は、ペプチドＧＦＯＧＥＫにおけるＲのＫによる置換がα２結合を支持し
ないことを示す。従って、２つの保存性置換はα２β１を認識する配列の能力を
破壊し得る。これは、精製したα２β１結合及び完全な血小板結合を用いて確認
した。ペプチドＭＡＤＥ４２は、ＧＰＰトリプレットを介在させることにより分離さ
れたタンデムＧＦＯＧＥＲモチーフを、そのペプチドのＮ及びＣ末端のＧＰＰト
リプレットと共に含む。このペプチドはＩ型コラーゲンと同じくらい優れたα２
Ｉ−ドメインの接着を示した。但し、ＧＦＯＧＥＲモチーフの単一コピーを含む
Ｄｅｓ−ＧＶＥ−ＧＰＰより低かった。このペプチドは、α２β１及びα１β１
のようなレセプターの架橋を研究するための道具を供するであろう。

【０１０１】コラーゲンへの細胞結合をブロックするためのペプチドの使用は本発明の重要
な部分である。血小板をＤｅｓ−ＧＶＥ−ＢＰＰと共にインキュベートし、次に
コラーゲンＩ及びIVと相互作用させた。その相互作用の阻害を、基質としてＩ型
及びIV型の両方のコラーゲンを用いて図１０に示す。同様に、α１及びα２Ｉ−ドメインのコラーゲンへの結合は、Ｄｅｓ−ＧＶＥ
−ＧＰＰのレベルの増加により阻害することができ、このことは、この同じ配列
がα１β１及びα２β１の妨害を供し得ることを示す。これらのデータを図１１
に示す。

【０１０２】図１２は、この点でのペプチドコンホメーションの重要性を示し：配列ＧＦＯ
ＧＥＲの型をＧＡＰポリマー配列内に合成したが、それは三重ヘリックス構造を
支持せず、即ち図１に示すような融解曲線は見られなかった。このペプチドＤｅ
ｓ−ＧＶＥ−ＧＡＰはα２Ｉ−ドメイン結合を阻害しなかった。図１３は、最初に、ＧＰＰポリマーが血小板接着を支持しないことを示す。但
し、ＣＲＰ，ＧＰＯポリマーはそうでない。２つの変異体ペプチドを合成し、テ
ストした。ＡｃＧＰＯ２とＡｃＧＰＯ４である。これらは本質的に表１に示す通
りタンデム及び４量（ｑｕａｄｒｕｐｌｅｔ）ＧＰＯ配列を含むＧＰＰポリマー
である。データは、ＣＲＰと比べてＡｃＧＰＯ２を用いて部分的な接着しか得ら
れないが、ＡｃＧＰＯ４はＣＲＰより大きくはないが低い接着のレベルを支持す
ることを示す。これは、ＧｐＶＩのためのリガンドは単一ＧＰＯモチーフより、
又はタンデムの２つの上述の配列よりも長い配列からなり得ることを示す。Ｇｐ
ＶＩへの三重ヘリックスペプチドの十分な結合は、上述のα２β１結合モチーフ
ＧＦＯＧＥＲより長い分子を要求し得る。

【０１０３】図１４は、コラーゲンでなく、ＡｃＧＰＯ４及びＣＲＰへの血小板の接着はＧ
ｐＶＩに依存しているが、α２β１と独立していることの、抗ＧｐＶＩＦａｂ
フラグメントを用いて得られた証拠を供する。なぜなら抗α２抗体、６Ｆ１は血
小板接着にほとんど効果を有さないからである。次に、これは、図１３と合わせ
て、ＧＰＯもＧＰＰモチーフもα２β１を認識しないという証拠を供する。

【０１０４】図１５は、α２β１による認識におけるヒドロキシプロリン（Ｏ又はＰ^*）及びプロリン（Ｐ）残基の交換可能性を示す。ペプチド５及び６のオーバーラップ
領域からの１５アミノ酸配列の変異体を含むペプチド（表１Ａ）をα２Ｉ−ドメ
インの接着のための基質として用いた。ペプチドＧＰＰ−５６はヒドロキシプロ
リンのかわりに、２つのプロリン残基を含み、優れた接着を支持する。ペプチド
５６−Ｈｙｐは配列の最初のトリプレット内にのみプロリンを含み、より優れた
接着を支持する。ＧＦＯＧＥＲでのＯのＰでの置換は、α２β１結合を保持した
。両方のグルタミン（Ｅ）のアラニン（Ａ）での置換及びＯのＰでの置換（ペプ
チドＤｅｓ−Ｅ−ＧＰＰ）はα２β１についての接着能力を失わせた。

【０１０５】

【表１】

【０１０６】

【表２】

【０１０７】

【表３】

【０１０８】

【表４】

【０１０９】

【表５】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】温度（℃）に対する施光度（°）の変化をプロットしたペプチド６の融解曲線
を示す。

【図２】 α１β２インテグリンに対するＩ型コラーゲン対α１（Ｉ）ＣＢ３ペプチド（
ペプチド１〜４）の結合を示す。チャートは、種々の基質の濃度（μｇ／mL）に
おけるＡ₄₅₀ を示す。四角はＩ型コラーゲンを、ダイヤモンドはペプチド１を、
円はペプチド２を、三角はペプチド３を、十字はペプチド４を示す。

【図３】 α１β２インテグリンに対するＩ型コラーゲン対α１（Ｉ）ＣＢ３ペプチド（
ペプチド５〜７）の結合を示す。チャートは、種々の基質の濃度（μｇ／mL）で
Ａ₄₅₀ を示す。四角はＩ型コラーゲンを、ダイヤモンドはペプチド５を、円はペ
プチド６を、三角はペプチド７を示す。

【図４】Ｍｇ²⁺の欠如及び存在下でのα１β２インテグリンに対するコラーゲン、ペプ
チド５／６及びペプチド５／６ＧＥＡ及び５／６ＧＡＲの結合を示す。チャ
ートはＡ₄₅₀ を示す。

【図５】ＥＤＴＡの欠如及び存在下でのα２Ｉドメインに対するコラーゲン並びにペプ
チドＤｅｓ−ＧＶＥ、及びＤｅｓ−ＧＰＯの結合、並びに抗α２抗体６Ｆ１によ
る結合の阻害を示す。チャートは種々の基質の濃度（μｇ／mL）でＡ₄₅₀ を示す
。

【図６】図５と同様に、ＥＤＴＡの欠如及び存在下、並びに６Ｆ１の存在下でのα２Ｉ
−ドメインへのコラーゲン並びにペプチドＤｅｓ−ＧＰＡ及びＤｅｓ−ＧＦＯの
結合を示す。チャートはＡ₄₅₀ を示す。

【図７】ＥＤＴＡの欠如及び存在下でのα２β１へのコラーゲン並びにペプチドＤｅｓ
ＧＶＥ及びＧＦＯＧＤＲの結合を、並びに６Ｆ１の効果を示す。チャートはＡ₄₅ ₀ を示す。

【図８】 α１Ｉ−ドメインへのペプチドＤｅｓ−ＧＶＥ及びＧＦＯＧＤＲの結合、並び
に抗α１抗体ＡＢによる結合の阻害を示す。チャートはＡ₄₅₀ を示す。

【図９】Ｍｇ²⁺及び抗α２，５Ｅ８の存在及び欠如下でのインテグリンα２Ｉ−ドメイ
ンへのコラーゲン並びにペプチドＤｅｓ−ＧＶＥ−ＧＰＰ，ＧＦＯＧＥＫ及びＭ
ＡＤＥ４２の結合を示す。チャートはＡ₄₅₀ を示す。

【図１０】Ｉ型及びIV型コラーゲンへの血小板接着を阻害するペプチドＤｅｓ−ＧＶＥ−
ＧＰＰの能力を示す。チャートはＡ₄₀₅ を示す。四角はＩ型コラーゲンを、ダイ
ヤモンドはIV型を示す。

【図１１】Ｉ型コラーゲンへのα１及びα２Ｉ−ドメインの結合を阻害するペプチドＤｅ
ｓ−ＧＶＥ−ＧＰＰの能力を示す。チャートはＡ₄₅₀ を示す。四角はα１Ｉ−ド
メインを、ダイヤモンドはα２Ｉ−ドメインを示す。

【図１２】Ｉ型コラーゲンへのα２Ｉ−ドメインの結合を阻害するペプチドＤｅｓ−ＧＶ
Ｅ−ＧＰＰの能力を示す。ここでＤｅｓＧＶＥ−ＧＡＰは不活性である。チャー
トはＡ₄₅₀ を示す。四角はＤｅｓ−ＧＶＥ−ＧＰＰを、ダイヤモンドはＤｅｓ−
ＧＶＥ−ＧＡＰを示す。

【図１３】ペプチドＣＲＰ，ＧＰＰ１００，ＡｃＧＰＯ２，ＡｃＧＰＯ４へ、及びコラー
ゲンへの血小板の接着、並びにＭｇ²⁺又は他の二価カチオンの存在の効果を示す
。

【図１４】ペプチドＡｃＧＰＯ４，ＣＲＰ、及びコラーゲンへの血小板の接着、並びにＭ
ｇ²⁺、抗α２、６Ｆ１又はＧｐＶＩ特異的Ｆａｂフラグメントの効果を示す。チ
ャートはＡ₄₀₅ を示す。

【図１５】Ｍｇ²⁺の存在及び欠如下でのインテグリンα２Ｉ−ドメインへのコラーゲン並
びにペプチドＤｅｓ−Ｅ−ＧＰＰ，５６Ｈｙｐ及びＧＰＰ−５６の結合を示す。
チャートはＡ₄₅₀ を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者バーンズ，マイケルジョンイギリス国，ケンブリッジシービー２１キューダブリュ，テニスコートロード，ダウニングサイト，デパートメントオブバイオケミストリー，ユニバーシティオブケンブリッジＦターム(参考） 2G045 AA34 AA35 AA40 CA24 CB01 DA12 DA13 DA14 DA36 FB02 4B024 AA01 BA80 CA01 DA02 DA06 DA12 4H045 AA10 AA30 BA14 BA17 CA40 EA28 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（ｉ）ＧＦＯＧＥＲＧＶＥＧＰＯＧＰＡ（配列番号：１）、（ii）ＧＦＰＧＥＲＧＶＥＧＰＰＧＰＡ（配列番号：２）、（iii)インテグリンα２β１と相互作用し及び／又はそれに結合する能力を保
持する（ｉ）又は（ii）のフラグメントから選択されるアミノ酸の配列からなるペプチド。
【請求項２】インテグリンα２β１と相互作用し及び／又はそれに結合す
る能力を保持するアミノ酸の最小配列からなる請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】請求項１に記載のペプチドのアミノ酸配列変異体からなるペ
プチドであって、アミノ酸配列変異体が１０〜１５の隣接アミノ酸からなり、こ
こで少くとも１０のアミノ酸残基が配列番号：１又は配列番号：２の対応するア
ミノ酸残基にマッチすることを特徴とするペプチド。
【請求項４】請求項１に記載のペプチドのアミノ酸配列変異体からなるペ
プチドであって、アミノ酸配列変異体が、次式：ＧＸ₁Ｏ／ＰＧＸ₂Ｘ₃ （式中、Ｘ₁，Ｘ₂及びＸ₃はいずれかのアミノ酸を示す）のアミノ酸配列からなることを特徴とするペプチド。
【請求項５】Ｘ₁がＦであることを特徴とする請求項４に記載のペプチド。
【請求項６】Ｘ₂がＥ又はＤであることを特徴とする請求項４又は５に記載のペプチド。
【請求項７】Ｘ₃がＲ又はＫであることを特徴とする請求項４〜６のいずれか一に記載のペプチド。
【請求項８】ＧＦＯＧＥＲＧＦＰＧＥＲＧＦＰＧＥＫＧＦＰＧＤＫＧＦＰＧＤＲから選択されるアミノ酸配列からなる請求項７に記載のペプチド。
【請求項９】先の請求項のいずれか一に記載のペプチドと、（ＧＰＰ）反
復配列と、からなるペプチド。
【請求項１０】請求項１〜８のいずれか一に記載のペプチドと、（ＧＰＯ
）反復配列と、からなるペプチド。
【請求項１１】（ＧＰＰ）反復配列に隣接した請求項１〜８のいずれか一
に記載のペプチドからなるペプチド。
【請求項１２】（ＧＰＯ）反復配列に隣接した請求項１〜８のいずれか一
に記載のペプチドからなるペプチド。
【請求項１３】異種アミノ酸に融合した先の請求項のいずれか一に記載の
ペプチド。
【請求項１４】先の請求項のいずれか一に記載のペプチドを含むペプチド
トリマー。
【請求項１５】請求項１〜１３のいずれか一に記載の３つのペプチドから
なる請求項１４に記載のペプチドトリマー。
【請求項１６】ホモトリマーである請求項１５に記載のペプチドトリマー
。
【請求項１７】請求項１４〜１６のいずれか一に記載のペプチドトリマー
を作る方法であって、該方法が、ペプチドトリマーの形成のための条件下で、ペ
プチドトリマーを形成する３つのペプチドを一緒にするステップを含み、ここで
該３つのペプチドのうちの少くとも１つが、請求項１〜８のいずれか一に記載の
ペプチドであることを特徴とする方法。
【請求項１８】前記ステップが、コーディング核酸からの発現、及び任意
に１又は複数のプロリン残基をヒドロキシル化してヒドロキシプロリン（Ｏ）を
供することによる、前記３つのペプチドのうちの少くとも１の生産により行われ
ることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】請求項１〜１３のいずれか一に記載のペプチドをコードす
る単離された核酸。
【請求項２０】請求項１〜１３のいずれか一に記載の要求されるペプチド
を作る方法であって、請求項１９に記載の核酸からの発現を引きおこしてコード
されたペプチドを作り出し、そして任意に、要求されるペプチドが１又は複数の
ヒドロキシプロリン（Ｏ）残基を含む場合、前記コードされたペプチド中の１又
は複数のプロリン残基をヒドロキシル化して前記要求されるペプチドを供するこ
とを含む方法。
【請求項２１】インテグリンα２β１レセプター及び血小板レセプターＧ
ｐＶＩのいずれか又は両方とのコラーゲン相互作用のインヒビターを得るための
アッセイ方法であって、（ｉ）請求項１〜１３のいずれか一に記載のペプチド、
（ii）インテグリンα２β１レセプター及び血小板レセプターＧｐＶＩ、並びに
（iii)テスト物質を、前記ペプチドと１又は複数の前記レセプターとの間の相互
作用のインヒビターである前記テスト物質の欠如下で前記ペプチドが前記１又は
複数のレセプターと相互作用する条件下で、接触させ、そして前記ペプチドを前
記１又は複数のレセプターとの間の相互作用を決定することを含む方法。
【請求項２２】請求項１〜１３のいずれか一に記載のペプチドに結合する
剤を得るためのアッセイ方法であって、請求項１〜８のいずれか一に記載のペプ
チドとテスト物質とを接触させ、そして該ペプチドと該テスト物質との間の相互
作用を決定することを含む方法。
【請求項２３】前記インヒビター又は前記剤を単離することを更に含む請
求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項２４】前記インヒビター又は前記剤を、少くとも１の更なる成分
を含む組成物に調剤することを更に含む請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項２５】請求項１〜１３のいずれか一に記載のペプチドの擬態物を
得る方法であって、（ｉ）前記ペプチドを分析してα２β１レセプターと相互作用する能力のため
に本質的で重要であるアミノ酸残基を決定してファルマコホアを規定し；そして（ii）該ファルマコホアをモデリングして生物活性を有する候補擬態物をデザ
イン及び／又はスクリーニングすることを含む方法。
【請求項２６】請求項１〜１３のいずれか一に記載のペプチドの擬態物に
ついてデザイン又はスクリーニングする方法における前記ペプチドの使用。