JP2004512010A - インスリン及びｉｇｆ−１受容体のアゴニスト及びアンタゴニスト - Google Patents

インスリン及びｉｇｆ−１受容体のアゴニスト及びアンタゴニスト Download PDF

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Abstract

アゴニスト又はアンタゴニスト活性をもって、インスリン及び／又はインスリン様増殖因子受容体に結合することができ、様々なペプチドライブラリーから同定されたペプチド配列を開示する。本発明はまた、本発明のペプチドを選択的に結合するインスリン及びインスリン様増殖因子受容体上に存在する少なくとも２つの異なる結合部位を同定する。アゴニストとして、本発明のペプチドのうちあるものは、内在性のペプチドホルモンを補い又は置換するための治療薬として開発するのに有用である。アンタゴニストも治療薬として開発し得る。

Description

【０００１】
【発明の分野】
本発明は、ホルモン受容体の活性化又は阻害の分野に関する。より具体的には、本発明は、アゴニスト又はアンタゴニストとして、インスリン又はインスリン様増殖因子受容体の何れかに作用することができる分子構造物、とりわけペプチドの同定に関する。本発明は、公知の構造物から有用な分子構造物を得る分子モデリングの分野にも関する。
【０００２】
【発明の背景】
インスリンは、細胞に作用してグルコース、タンパク質、および脂質の代謝、並びにＲＮＡおよびＤＮＡ合成を促進する強力な代謝および成長促進ホルモンである。よく知られているインスリンの効果は、身体全体のグルコースレベルの制御である。インスリンによるこの効果は、主に肝臓、脂肪組織、および筋肉において生じる。肝臓では、インスリンはグルコースのグリコーゲンへの取り込みを促進し、グルコースの産生を阻害する。筋肉および脂肪組織では、インスリンはグルコースの取り込み、貯蔵、および代謝を促進する。糖尿病を発症した個体群では、グルコースの利用が混乱しているのが極めて一般的である。
【０００３】
標的細胞におけるシグナル伝達は、インスリンが特異的な細胞表面受容体、インスリン受容体（ＩＲ）に結合することによって開始する。この結合によって受容体の細胞外ドメインの構造変化が引き起こされ、該変化は細胞膜を通って伝達されて、受容体のチロシンキナーゼ活性の活性化をもたらす。次に、インスリン受容体のチロシンキナーゼの自己リン酸化が引き起こされ、ホスホイノシトール−３−キナーゼ、Ｒａｓ　ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質、およびホスホリパーゼＣγなどのＳＨ２ドメインを含有する可溶性エフェクター分子がＩＲに結合する（Ｌｅｅ　ａｎｄ　Ｐｉｌｃｈ、１９９４）。
【０００４】
インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）は、組織増殖および修復の様々な局面に関与する１本鎖の小タンパク質（ＭＷ＝７，５００Ｄａ）であり、前立腺癌、乳癌、結腸癌および卵巣癌を含む種々の形態の癌に関わっていることが近年わかってきた。これは、大きさ、配列および構造がインスリンと類似しているが、インスリン受容体に対する親和性が１００〜１０００倍低い（Ｍｙｎａｒｃｉｋ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７）。
【０００５】
臨床的には、組換えヒトＩＧＦ−１は、１型糖尿病（Ｃａｒｒｏｌｌ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７、Ｃｒｏｗｎｅ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８）、筋萎縮性側索硬化症（Ｌａｉ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７）、および糖尿病運動神経障害（Ａｐｆｅｌ　ａｎｄ　Ｋｅｓｓｌｅｒ、１９９６）を含むいくつかの疾患を治療するために研究されてきた。骨粗鬆症（Ｃａｎａｌｉｓ、１９９７）、免疫変調（Ｃｌａｒｋ、１９９７）およびネフローゼ症候群（Ｆｅｌｄ　ａｎｄ　Ｈｉｒｓｈｂｅｒｇ、１９９６）など、その他の治療にＩＧＦ−１を適用する可能性が研究されている。
【０００６】
数多くの研究によって、種々の疾患状態における天然ＩＧＦ−１の役割が分析された。最も興味深いのは、ＩＧＦ−１がインビトロおよびインビボいずれにおいても正常および癌性の前立腺細胞の増殖を促進することを示したいくつかの報告である（Ａｎｇｅｌｌｏｚ−Ｎｉｃｏｕｄ　ａｎｄ　Ｂｉｎｏｕｘ、１９９５、Ｆｉｇｕｅｒｏａ　ｅｔ　ａｌ．，１９９５、Ｔｏｒｒｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７）。さらに、血清ＩＧＦ−１レベルの上昇は前立腺癌の危険性の増加と関係があり、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）よりも早期の癌予測因子と成り得る（Ｃｈａｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８）。最近の研究によって、ＩＧＦ−１と乳癌、結腸癌および卵巣癌などその他の癌との関係が示された。血清ＩＧＦ−１レベルは、ＩＧＦ−１に結合しＩＧＦ−１Ｒとの相互作用を妨害するＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）の存在によって調節される（Ｃｏｎｏｖｅｒによる概説、１９９６、及びＲａｊａｒａｍ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７）。興味深いことに、ＰＳＡはＩＧＦＢＰ−３を分解するプロテアーゼで、血清中の遊離ＩＧＦ−１を増加させることが示された（Ｃｏｈｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９２、Ｃｏｈｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９４、Ｌｉｌｊａ、１９９５）。ＩＧＦ−１Ｒ活性の制御が様々な疾患状態で重要な役割を果たし得ることは明らかであり、ＩＧＦ−１アゴニストおよびアンタゴニストの両者を臨床適用できる可能性を示している。
【０００７】
１型インスリン様増殖因子受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）およびインスリン受容体（ＩＲ）は、増殖因子受容体のチロシンキナーゼ受容体スーパーファミリーの関連員子である。両受容体は２個のαサブユニットおよび２個のβサブユニットから構成されており、ジスルフィド結合によってヘテロテトラマー（β−α−α−β）を形成している。これらの受容体は細胞外リガンド結合ドメイン、１個の膜貫通ドメイン、チロシンキナーゼ活性を示す細胞質ドメインを有する。細胞外ドメインは、αサブユニット全体とβサブユニットのＮ末端の一部から構成されているのに対し、βサブユニットの細胞内部分にはチロシンキナーゼドメインが含まれる。ＩＲおよびＩＧＦ−１Ｒの他、ＩＲファミリーとして知られているその他のものはインスリン関連受容体（ＩＲＲ）であるが、その天然のリガンドは知られていない。
【０００８】
ＩＧＦ−１およびインスリン受容体は構造が同一であるが、生理学的機能は異なっている。ＩＲは主に代謝機能に関与し、一方ＩＧＦ−１Ｒは成長および分化を媒介する。しかし、インスリンおよびＩＧＦ−１はいずれも分裂誘発効果および代謝効果を誘導することができる。それぞれのリガンドが自身の受容体を介して両活性を表すのか、インスリンがＩＧＦ−１受容体に弱い親和性で結合することによって分裂誘発効果を発揮するのか、あるいはＩＧＦ−１がインスリン受容体を介して代謝効果を発揮するのかについては、議論が続いている（Ｄｅ　Ｍｅｙｔｓ、１９９４）。
【０００９】
インスリン受容体は、（糖鎖形成程度に応じた）分子量３５０〜４００ｋＤａの糖タンパク質である。１本のポリペプチド鎖として合成され、タンパク分解酵素によって切断されると、ジスルフィド結合したモノマーα−βインスリン受容体が生じる。２個のα−βモノマーがαサブユニット間のジスルフィド結合によって結合して、２量体型の受容体（β−α−α−β型構造）を形成する。αサブユニットは７２３個のアミノ酸から構成され、システインリッチな領域（アミノ酸１５６〜３１２）によって分断される２つの大きくて相同なドメイン、Ｌ１（アミノ酸１〜１５５）およびＬ２（アミノ酸３１３〜４６８）に分けることができる（Ｗａｒｄ　ｅｔ　ａｌ．，１９９５）。インスリン結合の決定因子の多くはαサブユニットに存在するようである。インスリン受容体に特有な特性は、リガンドが存在しなくても２量体をとることである。
【００１０】
ＩＲの配列は、１型インスリン様増殖因子受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）の配列と相同性が高い。αサブユニット内の位置に応じて、相同性のレベルは約４０％から７０％まで変化する。したがって、両受容体の３次元構造は類似している可能性がある。ＩＧＦ−１Ｒの最初の３個のドメインの結晶構造が決定された（Ｇａｒｒｅｔｔ　ｅｔ　ａｌ．１９９８）。Ｌドメインは右巻き１本鎖βへリックス（β鎖のらせん構造）から成るが、一方システインリッチな領域はジスルフィドで結合された８つのモジュールから構成される。
【００１１】
インスリン受容体のβサブユニットは６２０個のアミノ酸残基を有し、３個のドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインを有する。細胞外ドメインはジスルフィド架橋によってαサブユニットと結合している。細胞質ドメインには、チロシンキナーゼドメインが含まれ、その３次元構造が解明されている（Ｈｕｂｂａｒｄ　ｅｔ　ａｌ．１９９４）。
【００１２】
薬剤開発を支えるために、ＩＲの膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインをイムノグロブリンＦｃまたはγサブユニットの定常領域と置換することによって可溶型の膜結合受容体が作製された（Ｂａｓｓ　ｅｔ　ａｌ．１９９６）。組換え遺伝子はヒト胎児腎２９３細胞中で発現させた。発現したタンパク質は、完全にプロセッシングされたヘテロテトラマーであって、そのインスリン結合能は完全長のホロ受容体（ｈｏｌｏｒｅｃｅｐｔｏｒ）と同様であった。
【００１３】
ＩＧＦ−１およびインスリンは競合的にＩＧＦ−１ＲおよびＩＲに交叉反応する（Ｓｃｈａｆｆｅｒ、１９９４）。アミノ酸の相同性は全体で４５％であるが、インスリンおよびＩＧＦ−１は互いの受容体に弱くしか結合しない。各ペプチドの非コグネイト（ｎｏｎ−ｃｏｇｎａｔｅ）受容体に対する親和性は、コグネイト受容体よりもがオーダーが約３桁低い（Ｍｙｎａｒｃｉｋ　ｅｔ　ａｌ．１９９７）。この結合親和性の違いは、一つにはアミノ酸配列の違い、およびリガンドの特有な３次構造に寄与する特有のドメインの違いによって説明することが可能である（Ｂｌａｋｅｓｌｅｙ他　ｅｔ　ａｌ．，１９９６）。
【００１４】
インスリンとＩＧＦ−１は、共に、他の領域に加えて、隣接したＡ、ＢおよびＣペプチド領域（ＣペプチドはＡおよびＢペプチドを連結する介在ペプチドである）を含む前駆体タンパク質として発現する。成熟インスリン分子は、ジスルフィド結合によって結合したＡ鎖およびＢ鎖から構成されており、結合していたＣペプチドは翻訳後のプロセッシング中に除去される。ＩＧＦ−１は、より小さなＣペプチドおよびＡ鎖のＣ末端に位置する小さなＤ伸長部分を保持しているので、成熟ＩＧＦ−１はインスリンよりもやや大きくなる（Ｂｌａｋｅｓｌｅｙ、１９９６）。ヒトインスリン様増殖因子（ＩＧＦ−１）のＣ領域は、親和性の高い１型ＩＧＦ受容体への結合に不可欠なようである（Ｐｉｅｔｒｚｋｏｗｓｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，１９９２）。特に、この領域内に位置するチロシン３１は、親和性の高い結合に必須であるようである。さらに、ＩＧＦ−１のＤドメインが欠失すると、変異ＩＧＦ−１がＩＲに結合する親和性が増加し、一方ＩＧＦ−１Ｒ受容体に対する親和性が減少する（Ｐｉｅｔｒｚｋｏｗｓｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，１９９２）。２個のホルモン間の更なる構造上の違いは、インスリンとは異なり、ＩＧＦ−１は自己会合性が非常に弱く、６量体にならないことである（Ｄｅ　Ｍｅｙｔｓ、１９９４）。
【００１５】
ＩＲおよびＩＧＦ−１Ｒのリガンド結合領域を含有するαサブユニットの全アミノ酸相同性は４７〜６７％であることが示されている。αサブユニット、Ｌ１−Ｃｙｓリッチ−Ｌ２の配列分析によって、両受容体について３種類の一般的なドメインが報告された。Ｃリッチな領域におけるシステイン残基は、２種の受容体間でよく保存されているが、このシステインリッチなドメインの全アミノ酸にわたる相同性は４８％にすぎない。
【００１６】
これら２種の受容体で類似性が認められたにもかかわらず、特異的なリガンドの結合における前記ドメインの役割は異なっている。キメラ受容体の研究によって（ＩＲおよびＩＧＦ−ＩＲのαサブユニットが入れ替わったドメイン）、リガンドと特異的な受容体との相互作用部位は異なることが研究者等によって報告された（Ｂｌａｋｅｓｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６）。たとえば、ＩＧＦ−１Ｒのシステインリッチドメイン（アミノ酸１９１〜２９０）は、高い親和性でＩＧＦを結合するために必須であるが、このＩＧＦ−１Ｒ領域（アミノ酸１９８−３００）をＩＲの対応する領域に導入すると、ＩＲは、なお高い親和性でインスリンを結合しつつ、ＩＧＦ−１も高い親和性で結合することが観察されたので、インスリンの結合には必須ではない。逆に、ＩＲの対応する領域をＩＧＦ−１Ｒに導入すると、インスリンに対する親和性は変化しないまま、ＩＧＦ−１への親和性も検出できなくなった。
【００１７】
ＩＲとＩＧＦ−１Ｒの結合領域の更なる違いは、Ｎ末端およびＣ末端領域への依存性が異なることである。（推定Ｌ１およびＬ２ドメイン内に位置する）ＩＲのＮ末端およびＣ末端領域はいずれも、親和性の高いインスリン結合に重要であるが、ＩＧＦ−１結合にはほとんど影響を及ぼさないようである。ＩＧＦ−１ＲのＮ末端残基（アミノ酸１〜６２）をＩＲの対応する残基（アミノ酸１〜６８）と交換すると、ＩＧＦ−１Ｒにインスリン結合能がもたらされる。この領域内では、残基Ｐｈｅ−３９、Ａｒｇ−４１およびＰｒｏ−４２が、インスリンとの相互作用に寄与する主な因子であることが報告されている（Ｗｉｌｌｉａｍｓ　ｅｔ　ａｌ．，１９９５）。これらの残基をＩＧＦ−１Ｒの等価な部位に導入すると、インスリンに対する親和性が著しく増加するが、一方、ＩＲ内のこれらの残基をアラニンと置換するとインスリンに対する親和性は著しく減少する。同様に、ＩＲのＣ末端のアミノ酸７０４〜７１７の間に位置する領域はインスリン特異性に主要な役割を果たすことが示された。これらの残基をアラニンで置換すると、同様にインスリン結合が損なわれる。（Ｍｙｎａｒｃｉｋ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６）。
【００１８】
アラニンスキャニングによって前記受容体をさらに研究すると、インスリンおよびＩＧＦ−１はいくつかの共通接触部位を使用してＩＧＦ−１受容体に結合しているようであるが、これらの接触部位は、インスリン受容体に結合するためにインスリンが使用するものとは異なることが示唆されている（Ｍｙｎａｒｃｉｋ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７）。したがって、文献のデータから、ある著者は「各受容体上に存在するインスリン及びＩＧＦ−１との結合接触部位はこの接触部位内では相同であるかもしれないが、実際に接触し、特異性を決定する側鎖は両リガンド−受容体系では全く異なり得る」という解釈を導いている（Ｄｅ　Ｍｅｙｔｓ、１９９４）。
【００１９】
何れか一方の受容体に対して特異性の高い分子構造物を同定することは、効果的かつ安全な治療法を開発するために重要である。たとえば、インスリンアゴニストとして開発された分子は、ＩＧＦ−１の分裂誘発活性および新生物増殖促進の可能性を回避するために、ＩＧＦ−１活性をほとんど、または全く有してはならない。
【００２０】
したがって、インスリンおよびＩＧＦ−１が共通な３次元構造を有するが、それぞれの受容体に対する選択性をもたらすのに十分な差異を有しているかどうかを決定することは重要である。同様に、インスリンおよび／またはＩＧＦ−１の活性な結合領域に類似し、選択的なアゴニストまたはアンタゴニスト活性をもたらすその他の分子構造を同定することが望ましいだろう。
【００２１】
ある種のタンパク質は重要な薬剤であるが、治療剤として使用するには、製造および製剤にかかる費用が高いことや、投与は通常注射によるため血流中での安定性に限界があることを含むいくつかの困難な問題点がある。したがって、インスリンまたはＩＧＦ−１を含むタンパク質を分子量の小さい薬剤に置換することに関心が寄せられてきた。しかし、このような努力にもかかわらずまだ有効な薬剤の発見には至っていない。
【００２２】
タンパク質ホルモンの機能を模倣するペプチドが既に報告されている。Ｙａｎｏｆｓｋｙら（１９９６）は、ＩＬ−１受容体とのナノモルレベルの親和性で、ＩＬ−１と拮抗するモノマーペプチドを単離したと報告している。この成果には、多くのファージディスプレイペプチドライブラリーの作製および使用、ならびに高度なファージパニング方法が必要とされた。
【００２３】
Ｗｉｒｇｈｔｏｎら（１９９６）およびＬｉｖｎａｈら（１９９６）は、インビボでエリスロポエチン（ＥＰＯ）受容体と結合し、完全なアゴニスト活性を示す２量体ペプチドを報告した。これらのペプチドは環状で、ペプチド内にジスルフィド結合を有する。ＩＬ−１受容体アンタゴニストのように、これらは天然のリガンドと有意な配列同一性を示してない。重要なことに、Ｘ線結晶学によって、２個のＥＰＯ受容体の２量体化を可能にする非共有結合ペプチドホモダイマーが自然形成することが明らかになった。
【００２４】
ごく最近、Ｃｗｉｒｌａら（１９９７）は、ヒトトロンボポイエチン（ＴＰＯ）受容体に結合し、天然ＴＰＯリガンドの結合と競合する２つのペプチドファミリーを同定したと報じた。最高の親和性を有するペプチドは、化学的手段によって２量体化すると、インビボにおいて天然リガンドであるＴＰＯと同等の効果的なアゴニストになることがわかった。
【００２５】
ＷＯ９６／０４５５７は、生物学的標的の活性部位に結合するペプチドおよび抗体を使用し、次いで競合アッセイに用いて、前記生物学的標的のアゴニストまたはアンタゴニストとなる小分子を同定することを報告している。
【００２６】
【発明の概要】
本発明は、ＩＲ及び／又はＩＧＦ−１Ｒの活性化に関与する部位を特異的に認識するアミノ酸配列の同定に関する。特異的なアミノ酸配列を同定し、ＩＲ又はＩＧＦ−１Ｒに対するそれらのアゴニスト又はアンタゴニスト活性を決定した。このような配列は、治療薬の候補として、又はより効果的な他の化合物を開発するためのリード化合物として発展させ得る。さらに、これらの配列は、これらの部位に結合し、インスリン又はＩＧＦ−１の機能を模倣し、又は拮抗する小分子を同定し、該小分子に関する情報を提供するために、ハイスループットスクリーニングにおいて使用することができる。さらに、本発明によって提供されるペプチド配列は、ＩＲ又はＩＧＦ−１Ｒへの原ペプチドの結合及び／又は活性を増加もしくは調節する配列変種（ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｖａｒｉａｎｔｓ）を同定するために使用し得る二次ペプチドライブラリーをデザインするために使用することができる。
【００２７】
本発明の１つの側面では、ＩＲ又はＩＧＦ−１Ｒへの結合及び活性特性に関して、数多くのペプチドをスクリーニングした。それらのアミノ酸配列の分析によって、一定のコンセンサス配列が同定され、該コンセンサス配列はそのまま使用することもできるし、又はより大きなアミノ酸配列中で、該配列にアゴニスト又はアンタゴニスト活性を与えるコア配列として使用してもよい。各モチーフのグループ内に同定された様々なペプチドの特異的配列に応じて、様々な程度のアゴニスト又はアンタゴニスト活性でＩＲ及びＩＧＦ−１Ｒに結合する、少なくとも１０個の一般的アミノ酸配列が同定された。より大きなアミノ酸配列の一部の場合に、前記コンセンサス配列の親和性及び／又は薬理学的活性を修飾し得るアミノ又はカルボキシル末端伸長部も提供される。
【００２８】
ＩＲ及び／又はＩＧＦ−１Ｒを結合する本発明のアミノ酸配列には、
ａ．Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５（ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４、及びＸ５は芳香族アミノ酸であり、Ｘ３は任意の極性アミノ酸である）
ｂ．Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３（ここで、Ｘ６及びＸ７は芳香族アミノ酸であり、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１１、及びＸ１２は任意のアミノ酸であり、Ｘ１０及びＸ１３は疎水性アミノ酸である）
ｃ．Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｘ２１（ここで、Ｘ１４及びＸ１７は疎水性アミノ酸であり、Ｘ１５、Ｘ１６、Ｘ１８、及びＸ１９は任意のアミノ酸であり、Ｘ２０及びＸ２１は芳香族アミノ酸である）
ｄ．Ｘ２２Ｘ２３Ｘ２４Ｘ２５Ｘ２６Ｘ２７Ｘ２８Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１Ｘ３２Ｘ３３Ｘ３４Ｘ３５Ｘ３６Ｘ３７Ｘ３８Ｘ３９Ｘ４０Ｘ４１（ここで、Ｘ２２、Ｘ２５、Ｘ２８、Ｘ２９、Ｘ３０、Ｘ３３、Ｘ３４、Ｘ３５、Ｘ３６、Ｘ３７、Ｘ３８、Ｘ４０及びＸ４１は任意のアミノ酸であり、Ｘ３５及びＸ３７はＩＲに結合する任意のアミノ酸であり得るが、ＩＧＦ−１Ｒに結合させ、且つアゴニスト又はアンタゴニスト活性をもたせるためには、Ｘ３５は好ましくは疎水性アミノ酸であり、Ｘ３７は好ましくはグリシンである。Ｘ２３及びＸ２６は疎水性アミノ酸である。該配列は、好ましくはＸ２５とＸ４０に、少なくとも２つのシステイン残基をさらに含む。Ｘ３１及びＸ３２は小アミノ酸である）
ｅ．Ｘ４２Ｘ４３Ｘ４４Ｘ４５Ｘ４６Ｘ４７Ｘ４８Ｘ４９Ｘ５０Ｘ５１Ｘ５２Ｘ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６Ｘ５７Ｘ５８Ｘ５９Ｘ６０Ｘ６１（ここで、Ｘ４２、Ｘ４３、Ｘ４４、Ｘ４５、Ｘ５３、Ｘ５５、Ｘ５６、Ｘ５８、Ｘ６０、及びＸ６１は任意のアミノ酸であり得、Ｘ４３、Ｘ４６、Ｘ４９、Ｘ５０、及びＸ５４は疎水性アミノ酸であり、Ｘ４７及びＸ５９は好ましくはシステインであり、Ｘ４８は極性アミノ酸であり、Ｘ５１、Ｘ５２、及びＸ５７は小アミノ酸である）
ｆ．Ｘ６２Ｘ６３Ｘ６４Ｘ６５Ｘ６６Ｘ６７Ｘ６８Ｘ６９Ｘ７０Ｘ７１Ｘ７２Ｘ７３Ｘ７４Ｘ７５Ｘ７６Ｘ７７Ｘ７８Ｘ７９Ｘ８０Ｘ８１（ここで、Ｘ６２、Ｘ６５、Ｘ６８、Ｘ６９、Ｘ７１、Ｘ７３、Ｘ７６、Ｘ７７、Ｘ７８、Ｘ８０、及びＸ８１は任意のアミノ酸であり得、Ｘ６３、Ｘ７０、Ｘ７４は疎水性アミノ酸であり、Ｘ６４は極性アミノ酸であり、Ｘ６７及びＸ７５は芳香族アミノ酸であり、Ｘ７２及びＸ７９は、好ましくは、ループを形成することができるシステインである）
ｇ．ＨＸ８２Ｘ８３Ｘ８４Ｘ８５Ｘ８６Ｘ８７Ｘ８８Ｘ８９Ｘ９０Ｘ９１Ｘ９２（ここで、Ｘ８２はプロリン又はアラニンであり、Ｘ８３は小アミノ酸であり、Ｘ８４はロイシン、セリン、又はトレオニンから選択され、Ｘ８５は極性アミノ酸であり、Ｘ８６、Ｘ８８、Ｘ８９、及びＸ９０は任意のアミノ酸であり、Ｘ８７、Ｘ９１、及びＸ９２は脂肪族アミノ酸である）
ｈ．Ｘ１０４Ｘ１０５Ｘ１０６Ｘ１０７Ｘ１０８Ｘ１０９Ｘ１１０Ｘ１１１Ｘ１１２Ｘ１１３Ｘ１１４（ここで、Ｘ１０６乃至Ｘ１１１のアミノ酸のうち少なくとも１つ、好ましくは２つは、３つのアミノ酸によって隔てられたトリプトファンであり、Ｘ１０４、Ｘ１０５、及びＸ１０６のうち少なくとも１つ、並びにＸ１１２、Ｘ１１３、及びＸ１１４のうち少なくとも１つはシステインである）
ｉ．配列ＤＹＫＤＬＣＱＳＷＧＶＲＩＧＷＬＡＧＬＣＰＫＫを含むアミノ酸配列
ｊ．ＷＸ１２３ＧＹＸ１２４ＷＸ１２５Ｘ１２６（ここで、Ｘ１２３はプロリン、グリシン、セリン、アルギニン、アラニン、又はロイシンから選択されるが、より好ましくはプロリンであり、Ｘ１２４は任意のアミノ酸であるが、好ましくは荷電アミノ酸又は芳香族アミノ酸であり、Ｘ１２５は疎水性アミノ酸、好ましくはロイシン又はフェニルアラニンであり、最も好ましくはロイシンである。Ｘ１２６は任意のアミノ酸であるが、好ましくは小アミノ酸である）
ある実施態様では、ＩＲ及びＩＧＦ−１Ｒ上の部位に競合的に結合し、アゴニスト又はアンタゴニスト活性の何れかを有する好ましいアミノ酸配列ＦＹＸ３ＷＦ（「Ａ６」モチーフ）及びＦＹＸ８Ｘ９Ｌ／ＩＸ１１Ｘ１２Ｌ（「Ｂ６」モチーフ）が同定された。驚くべきことに、ＩＧＦ−１Ｒに対するアゴニスト活性を有するＦＹＸ３ＷＦは、ＩＲに対するアゴニスト又はアンタゴニスト活性を有することができる。同様に、ＩＧＦ−１ＲのアンタゴニストであるＦＹＸ８Ｘ９Ｌ／ＩＸ１１Ｘ１２Ｌは、ＩＲに対するアゴニスト活性を有する。
【００２９】
本発明は、前記ぺプチドうちある種のペプチドが、ＩＲ及びＩＧＦ−１Ｒへの結合について、互いに、及びインスリン又はＩＧＦ−１と競合する能力が異なるということに基づいて、ＩＲ及びＩＧＦ−１Ｒ上に存在する少なくとも２つの異なる結合部位も同定する。従って、本発明は、ＩＲ及び／又はＩＧＦ−１Ｒの一方又は双方の部位に特異的に結合するアミノ酸配列を提供する。さらに、それらがＩＲの特異的部位に結合する能力に基づいて、アゴニスト又はアンタゴニスト特性のうち何れかを有する特異的なアミノ酸配列を提供する。
【００３０】
本発明の別の実施態様では、ＩＲ又はＩＧＦ−１Ｒの１以上の部位に結合するアミノ酸配列は、共有結合によって互いに連結されて、多価リガンドを形成してもよい。これらの多価リガンドは、複数のＩＲ又はＩＧＦ−１Ｒと複合体を形成することができる。同一のアミノ酸配列又は異なるアミノ酸配列の何れかを互いに共有結合させて、ホモ複合体又はヘテロ複合体を形成させてもよい。同一のアミノ酸配列の二量体は、例えば、対応する同一の部位を介して結合した受容体複合体を形成するために使用し得る。他方、ヘテロ二量体は、１つの受容体上に存在する異なる部位に結合させるために、又は異なる部位を介して受容体を複合体化させるために使用し得る。
【００３１】
本発明はまた、インスリンの結合特性を模倣する化合物を同定するためのアッセイを提供する。このような化合物は、細胞ベースのアッセイにおいて、インスリン機能のアンタゴニスト又はアゴニストとして作用し得る。
【００３２】
本発明は、インスリン受容体へのインスリンの結合を阻害するペプチド等のアミノ酸配列、及び組換え抗体可変領域（ｒＶａｂ）も提供する。このようなアミノ酸配列及びｒＶａｂは、インスリンを模倣する化合物を同定するために、本発明のアッセイにおいて使用される。
【００３３】
本発明は、インスリン受容体に結合する化合物を同定するためのキットも提供する。本発明は、さらに、インスリン受容体を結合する治療用化合物を提供する。
【００３４】
別の実施態様では、本発明は、ＩＧＦ１の結合特性を模倣する化合物を同定するためのアッセイを提供する。このような化合物は、細胞をベースとしたアッセイにおいて、ＩＧＦ−１のホルモン機能のアンタゴニスト又はアゴニストとして作用する。
【００３５】
本発明は、ＩＧＦ−１ＲへのＩＧＦ−１の結合を阻害するペプチド等のアミノ酸配列及びｒＶａｂも提供する。このようなアミノ酸配列及びｒＶａｂは、ＩＧＦ−１を模倣する化合物を同定するために、本発明のアッセイにおいて使用される。
【００３６】
本発明の別の実施態様は、本発明のアミノ酸配列をコードする核酸配列である。該核酸を含有するベクター、及びＩＲ又はＩＧＦ−１Ｒに結合し、アゴニスト又はアンタゴニスト活性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子を発現する宿主細胞も本発明の範囲に属する。
【００３７】
ＩＲ及び／又はＩＧＦ−１Ｒの活性部位に結合するアミノ酸配列を提供すること、及びＩＲ及び／又はＩＧＦ−１Ｒに対するアゴニスト活性又はアンタゴニスト活性を与える構造的な基準を同定することが、本発明の目的である。
【００３８】
ＩＲ又はＩＧＦ−１Ｒに対するアゴニスト、部分アゴニスト、又はアンタゴニスト活性を有する特異的なアミノ酸配列を提供することが本発明のさらなる目的である。このようなアミノ酸配列は、それ自体治療薬として有用な可能性があるし、又は他の分子、とりわけ、ＩＲ又はＩＧＦ−１Ｒに対するアゴニスト又はアンタゴニスト活性を有する小有機分子を同定するために使用してもよい。
【００３９】
本発明の別の目的は、本発明のアミノ酸配列に由来する構造的な情報であって、関連のＩＲ又はＩＧＦ−１Ｒ結合部位での所望の活性を有する他の分子を構築するために使用し得る情報を提供することである。
【００４０】
【発明の詳細な記述】
本発明は、ＩＧＦ−１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）及び／又はインスリン受容体（ＩＲ）に結合するモチーフを含んだアミノ酸配列に関する。ＩＲ及びＩＧＦ−１Ｒへの結合に加え、該アミノ酸配列は、これらの受容体の一方又は双方に対するアゴニスト、部分アゴニスト、又はアンタゴニスト活性のうち何れかをも有する。結合及び活性に重要であることが報告されているＩＲとＩＧＦ−１Ｒの様々な領域を基礎として、本発明は、驚くべきことに、これらの受容体に対するアゴニスト及び／又はアンタゴニスト活性を付与することができる、ＩＲ及びＩＧＦ−１Ｒ上に存在する共通の結合モチーフを規定するアミノ酸配列を提供する。さらに、本発明は、アロステリックに共役していると思われる、ＩＲとＩＧＦ−１Ｒ上の複数の結合部位（部位１及び部位２）を同定する。
【００４１】
アゴニスト又はアンタゴニスト活性の付与に関与するＩＲ及び／又はＩＧＦ−１Ｒの部位に結合し得るが、前記アミノ酸配列は、インスリン又はＩＧＦ−１のネイティブな配列には基づいていないし、このような配列の何れに対しても明確な相同性を呈していない。
【００４２】
本発明のアミノ酸配列は、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質であり得る。本明細書で使用するこれらの用語は、本明細書に表記されている様々なアミノ酸のサイズに関して限定を加えるものと解してはならず、それらは本発明に包含される。このため、本明細書に開示されたＩＲ又はＩＧＦ−１Ｒ結合モチーフのうち少なくとも１つを含み、前記受容体の１つに結合する任意のアミノ酸配列が本発明の範囲に属する。好ましい実施態様では、前記アミノ酸配列はインスリン又はＩＧＦアゴニスト若しくはアンタゴニスト活性を与える。本発明のアミノ酸配列は、典型的には、人工のアミノ酸配列、すなわち、天然には存在しないペプチド又はポリペプチドである。本発明において有用なアミノ酸配列は、化学合成、ファージディスプレイ、タンパク質若しくはポリペプチドを切断し断片にすること、又は結合能を有するのに十分な長さのアミノ酸配列を作製し、又は取得し得る任意の手段などの様々な手段によって得ることができる。
【００４３】
本発明が提供するアミノ酸配列は、意図する用途にとって十分な結合を与える親和性をＩＲ又はＩＧＦ−１Ｒに対して有するべきである。従って、治療薬として使用する場合、本発明によって提供されるペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質は、約１０−７〜約１０−１５Ｍの親和性（Ｋｄ）を有するべきである。より好ましくは、前記親和性は１０−８〜約１０−１２Ｍである。最も好ましくは、前記親和性は１０−９〜約１０−１１Ｍである。他のリガンドを同定するための競合的結合アッセイの試薬として使用する場合には、前記アミノ酸配列は、好ましくは、前記受容体に対して約１０−５〜約１０−１２Ｍの親和性を有する。本発明が提供するペプチドを治療薬として使用し得ることを明らかにするためにさらに考慮すべきは、ＩＲ又はＩＧＦ−１Ｒの何れかに対する相対活性である。このため、ＩＲに対して効力を有し、ＩＧＦ−１Ｒに対して臨床的に無視できる活性を有するペプチドは、たとえこのようなペプチドが比較的高い親和性でＩＧＦ−１Ｒに結合し得るとしても有用な治療薬となり得る。
【００４４】
ＩＲ上の活性部位に結合する少なくとも１０個の異なる結合モチーフを同定した。これらのうち少なくとも４つは、ＩＧＦ−１Ｒにも結合する。数個の異なるアミノ酸配列に対する分析に基づき、前記アミノ酸の特定の位置に特定のアミノ酸又は特定の種類のアミノ酸が現れる頻度を分析して、該結合モチーフは確定されている。
【００４５】
本発明においては、アミノ酸は、以下のように分類される。アルコール基を有するアミノ酸はセリン（Ｓ）及びトレオニン（Ｔ）である。脂肪族アミノ酸はイソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、及びメチオニン（Ｍ）である。芳香族アミノ酸は、フェニルアラニン（Ｆ）、ヒスチジン（Ｈ）、トリプトファン（Ｗ）、及びチロシン（Ｙ）である。疎水性アミノ酸は、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、リシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アルギニン（Ｒ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）、及びチロシン（Ｙ）である。負のアミノ酸は、アスパラギン酸（Ｄ）とグルタミン酸（Ｅ）である。以下のアミノ酸：システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、ヒスチジン（Ｈ）、リシン（Ｋ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、及びトレオニン（Ｔ）は、極性アミノ酸である。正のアミノ酸は、ヒスチジン（Ｈ）、リシン（Ｋ）、及びアルギニン（Ｒ）である。小アミノ酸は、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グリシン（Ｇ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、及びバリン（Ｖ）である。極小アミノ酸は、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、及びセリン（Ｓ）である。ターンの形成に関与する可能性があるアミノ酸は、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、リシン（Ｋ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、プロリン（Ｐ）、及びトレオニン（Ｔ）である。
【００４６】
定義されたこれらの各群に属するアミノ酸は、本明細書に記載されている具体的な優先度に従って、以下で記載するモチーフの中で、互いに置換してもよい。さらに、合成又は非天然アミノ酸を本発明に使用してもよい。
【００４７】
本明細書に開示された教示に基づいて、置換、付加、又は欠失を含有し、同じ親和性で、又は異なる親和性でＩＲ又はＩＧＦ−１Ｒに結合するアミノ酸配列も本発明の範囲に属する。例えば、必要に応じて、以下に記載されたコンセンサスモチーフのカルボキシ及びアミノ末端領域に位置するアミノ酸残基（特定のアミノ酸が特に優先されることがないアミノ酸残基）を欠失させて、末端切断配列を得てもよい。前記アミノ酸配列の安定性を促進するリシンのようなある種のアミノ酸は、例えば、該配列の用途（可溶性であるより大きな配列の一部として前記配列を発現させる、又は固相支持体に連結させる）に応じて欠失させてもよい。
【００４８】
ＩＧＦ−１Ｒに結合するペプチド、このようなペプチドを同定するための方法及びキットは、１９９８年９月２日に出願されたＢｅａｓｌｅｙらの米国特許出願第０９／１４６，１２７号に開示されており、その全体を参考文献として援用する。
【００４９】
Ａ．コンセンサスモチーフ
以下のモチーフが、ＩＲ及び／又はＩＧＦ−１Ｒに対する結合活性を与えるものと同定された。
【００５０】
１．Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５（式１（ｆｏｒｍｕｌａ　１）、Ａ６モチーフ）（ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４、及びＸ５は芳香族アミノ酸であり、好ましくはフェニルアラニン又はチロシンである。最も好ましくは、Ｘ１及びＸ５はフェニルアラニンであり、Ｘ２はチロシンである。Ｘ３は任意の小極性アミノ酸であり得るが、好ましくは、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、又はセリンから選択され、最も好ましくは、アスパラギン酸又はグルタミン酸である。Ｘ４は、最も好ましくは、トリプトファン、チロシン、又はフェニルアラニンであり、最も好ましくはトリプトファンである。）Ａ６モチーフのうち特に好ましい実施態様は、ＦＹＤＷＦとＦＹＥＷＦである。Ａ６モチーフはＩＧＦ−１Ｒに対するアゴニスト活性を有するが、Ａ６に隣接するアミノ酸の種類に応じて、ＩＲに対するアゴニスト又はアンタゴニスト活性を有する。図１１Ａ参照。ＩＲに対するアゴニスト活性を有するＡ６モチーフを含んだ２つのアミノ酸配列は、ＦＨＥＮＦＹＤＷＦＶＲＱＶＳＫＫ（Ｄ１１７；Ｈ２Ｃ）とＧＲＶＤＷＬＱＲＮＡＮＦＹＤＷＦＶＡＥＬＧ−ＮＨ２（Ｓ１７５）である。式１のアミノ酸配列の非限定的な例が、図１Ａ〜１Ｏに示されている。
【００５１】
２．Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３（式２、Ｂ６モチーフ）（ここで、Ｘ６及びＸ７は芳香族アミノ酸、好ましくはフェニルアラニン又はチロシンである。最も好ましくは、Ｘ６はフェニルアラニンであり、Ｘ７はチロシンである。Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１１、及びＸ１２は任意のアミノ酸であり得る。Ｘ１０及びＸ１３は疎水性アミノ酸、好ましくは、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、又はメチオニンであるが、より好ましくはロイシン又はイソロイシンである。最も好ましくは、ＩＲに結合させるためにはＸ１０はイソロイシンであり、ＩＧＦ−１Ｒに結合させるためにはロイシンである。Ｘ１３は最も好ましくはロイシンである。式２のアミノ酸配列は、ＩＧＦ−１Ｒに対するアンタゴニストとして機能することもあり、あるいは、ＩＲに対するアゴニストとして機能することもある。好ましい式２のモチーフのコンセンサス配列は、ＦＹＸ８Ｘ９ＬＸ１１Ｘ１２Ｌ、ＦＹＸ８Ｘ９ＩＸ１１Ｘ１２Ｌ、ＦＹＸ８ＡＩＸ１１Ｘ１２Ｌ、及びＦＹＸ８ＹＦＸ１１Ｘ１２Ｌである。
【００５２】
本発明とともに使用するための別の２のモチーフには、ＦＹＸ８ＹＦＸ１１Ｘ１２Ｌが含まれ、式２Ａ（「ＮＮＲＰ」）として以下に示されている。
【００５３】
Ｘ１１５Ｘ１１６Ｘ１１７Ｘ１１８ＦＹＸ８ＹＦＸ１１Ｘ１２ＬＸ１１９Ｘ１２０Ｘ１２１Ｘ１２２
（ここで、Ｘ１１５〜Ｘ１１８及びＸ１１８〜Ｘ１２２は、ＩＲ又はＩＧＦ−１Ｒへの結合を可能とする任意のアミノ酸であり得る。Ｘ１１５は、好ましくは、トリプトファン、グリシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、及びアルギニンからなる群から選択される。アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、及びアルギニンが、さらに好ましい。トリプトファンが最も好ましい。トリプトファンが好ましいことは、アスパラギン酸、グルタミン酸、及びアルギニンはランダムに置換した場合に予想される頻度の約２倍で存在するのに対して、ランダムに置換した場合に予想される可能性を３〜５倍上回る頻度でクローンに現れることに基づいている。
【００５４】
Ｘ１１６は、好ましくは、アスパラギン酸、ヒスチジン、グリシン、及びアスパラギンからなる群から選択されるアミノ酸である。Ｘ１１７とＸ１１８は、好ましくは、グリシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、又はアラニンである。より好ましくは、Ｘ１１７は、グリシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、及びアスパラギンであるが、Ｘ１１８は、より好ましくは、グリシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、又はアラニンである。
【００５５】
式２Ａのモチーフ中に存在する場合、Ｘ８は、好ましくは、アルギニン、グリシン、グルタミン酸、又はセリンである。
【００５６】
式２Ａのモチーフ中に存在する場合、Ｘ１１は、好ましくは、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、又はトリプトファンであるが、最も好ましくはグルタミン酸である。
【００５７】
式２Ａのモチーフ中に存在する場合、Ｘ１２は、好ましくは、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、リシン、又はグルタミンであるが、最も好ましくはアスパラギン酸である。
【００５８】
Ｘ１１９は、好ましくは、グルタミン酸、グリシン、グルタミン、アスパラギン酸、又はアラニンであるが、最も好ましくはグルタミン酸である。
【００５９】
Ｘ１２０は、好ましくは、グルタミン酸、アスパラギン酸、グリシン、又はグルタミンであるが、最も好ましくはグルタミン酸である。
【００６０】
Ｘ１２１は、好ましくは、トリプトファン、チロシン、グルタミン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、又はアスパラギン酸であるが、最も好ましくはトリプトファン又はチロシンである。
【００６１】
Ｘ１２２は、好ましくは、グルタミン酸、アスパラギン酸、又はグリシンであるが、最も好ましくはグルタミン酸である。
【００６２】
好ましいアミノ酸残基は、クローン中の頻度がランダムな事象に対して予想される頻度の２倍を超えることに基づいて同定されているが、最も好ましい配列は、予想の約３〜５倍の頻度で生じる。
【００６３】
式２のモチーフ及び式２Ａのモチーフを有するアミノ酸配列の非限定的な例は、図２Ａ〜２Ｐに記載されている。
【００６４】
３．Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｘ２１（式３、リバースＢ６、ｒｅｖＢ６）（Ｘ１４とＸ１７は疎水性アミノ酸である。Ｘ１４、Ｘ１７は、好ましくは、ロイシン、イソロイシン、及びバリンであるが、最も好ましくはロイシンである。Ｘ１５、Ｘ１６、Ｘ１８、及びＸ１９は任意のアミノ酸であり得る。Ｘ２０は芳香族アミノ酸、好ましくはチロシン又はヒスチジンであるが、最も好ましくはチロシンである。Ｘ２１は、芳香族アミノ酸であるが、好ましくはフェニルアラニン又はチロシンであり、最も好ましくはフェニルアラニンである。）ＩＧＦ−１Ｒ結合リガンドとして使用する場合、芳香族アミノ酸がＸ１８に位置することが極めて好ましい。式３のアミノ酸配列の非限定的な例に関しては図３Ａ〜３Ｄを参照。
【００６５】
４．Ｘ２２Ｘ２３Ｘ２４Ｘ２５Ｘ２６Ｘ２７Ｘ２８Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１Ｘ３２Ｘ３３Ｘ３４Ｘ３５Ｘ３６Ｘ３７Ｘ３８Ｘ３９Ｘ４０Ｘ４１（式４、「Ｆ８」）（ここで、Ｘ２２、Ｘ２５、Ｘ２６、Ｘ２８、Ｘ２９、Ｘ３０、Ｘ３３、Ｘ３４、Ｘ３５、Ｘ３６、Ｘ３７、Ｘ３８、Ｘ４０及びＸ４１は任意のアミノ酸である。ＩＲ結合リガンドとして、又はＩＲ結合リガンドの成分としてＦ８モチーフを使用する場合には、Ｘ３５及びＸ３７は任意のアミノ酸であり得るが、ＩＧＦ−１Ｒの結合リガンドとして使用する場合には、Ｘ３７はグリシンであることが非常に好ましく、Ｘ３５は、疎水性アミノ酸、特に、ロイシンであることが好ましい。Ｘ２３は、疎水性アミノ酸である。メチオニン、バリン、ロイシン、又はイソロイシンは、Ｘ２３に対する好ましいアミノ酸であるが、ＩＧＦ−１Ｒ結合リガンドを調製する場合にはロイシンが最も好ましく、ＩＲ結合リガンドを調製する場合には非常に好ましい。少なくとも１つのシステインがＸ２４〜Ｘ２７に、１つのシステインがＸ３９又はＸ４０に位置する。これらのシステインは、両者で、システイン架橋を形成することができ、ループ状のアミノ酸配列を与え得る。さらに、２つのシステイン残基の間には１４個のアミノ酸が介在することが好ましいが、ＩＧＦ−１Ｒ又はＩＲへの結合が保持されているのであれば、これ以外の個数のアミノ酸が介在していてもよい。従って、システインが他の位置を占めるのであれば、Ｘ２４とＸ３９位のシステインを他のアミノ酸と置き換えてもよい。ある実施態様では、例えば、Ｘ２４位のシステインはＸ２７位に位置してもよく、その場合、システインをＸ３９位に固定するのであれば、より小さなループとなるであろう。これらのより小さなループ状ペプチドは、本明細書の以降に式５として記載されている。Ｘ２７は任意の極性アミノ酸であるが、好ましくは、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、アスパラギンから選択され、又は上述のようにシステインが選択される。Ｘ２７位にグルタミン酸が存在すると、ＩＧＦ−１Ｒへの結合に対する影響ほどではないが、ＩＲへの結合が減少する。Ｘ３１は任意の芳香族アミノ酸であり、Ｘ３２は任意の小アミノ酸である。ＩＧＦ−１Ｒに結合させる場合、Ｘ３１位には、グリシン又はセリンが好ましいが、ＩＲに結合させる場合には、トリプトファンが極めて好ましい。Ｘ３２位には、ＩＧＦ−１ＲとＩＲ結合の何れの場合にも、グリシンが好ましい。Ｘ３６は芳香族アミノ酸である。Ｆ８に対する好ましいコンセンサス配列は、Ｘ２２ＬＣＸ２５Ｘ２６ＥＸ２８Ｘ２９Ｘ３０ＷＧＸ３３Ｘ３４Ｘ３５Ｘ３６Ｘ３７Ｘ３８ＣＸ４０Ｘ４１である（アミノ酸は先に定義したとおりである）。より好ましいＦ８配列は、ＨＬＣＶＬＥＥＬＦＷＧＡＳＬＦＧＹＣＳＧ（「Ｆ８」）である。好ましくは、Ｆ８配列モチーフを含むアミノ酸配列は、ＩＧＦ−１ＲよりＩＲに結合する。図４Ａ〜４Ｅには、式４のアミノ酸配列の非限定的な例が列記されている。
【００６６】
５．Ｘ４２Ｘ４３Ｘ４４Ｘ４５Ｘ４６Ｘ４７Ｘ４８Ｘ４９Ｘ５０Ｘ５１Ｘ５２Ｘ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６Ｘ５７Ｘ５８Ｘ５９Ｘ６０Ｘ６１（「ミニＦ８」、式５）（ここで、Ｘ４２、Ｘ４３、Ｘ４４、Ｘ４５、Ｘ５３、Ｘ５５、Ｘ５６、Ｘ５８、Ｘ６０、及びＸ６１は任意のアミノ酸である。Ｘ４３、Ｘ４６、Ｘ４９、Ｘ５０、及びＸ５４は疎水性アミノ酸であるが、Ｘ４３とＸ４６は、好ましくはロイシンであり、Ｘ５０は、好ましくはフェニルアラニン又はチロシンであるが、最も好ましくはフェニルアラニンである。Ｘ４７及びＸ５９はシステインである。Ｘ４８は、好ましくは極性アミノ酸、すなわち、アスパラギン酸又はグルタミン酸であるが、最も好ましくはグルタミン酸である。５４位に小アミノ酸を使用すると、ＩＧＦ−１Ｒ特異性を与え得る。Ｘ５１、Ｘ５２、及びＸ５７は小アミノ酸、好ましくはグリシンである。ミニＦ８に関して好ましいコンセンサス配列は、Ｘ４２Ｘ４３Ｘ４４Ｘ４５ＬＣＥＸ４９ＦＧＧＸ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６ＧＸ５８Ｘ５９Ｘ６０Ｘ６１である。式５の配列を含むアミノ酸配列は、好ましくは、ＩＧＦ−１Ｒ又はＩＲに結合する。式５のアミノ酸配列の非限定的な例は、図５に記載されている。
【００６７】
６．Ｘ６２Ｘ６３Ｘ６４Ｘ６５Ｘ６６Ｘ６７Ｘ６８Ｘ６９Ｘ７０Ｘ７１Ｘ７２Ｘ７３Ｘ７４Ｘ７５Ｘ７６Ｘ７７Ｘ７８Ｘ７９Ｘ８０Ｘ８１（式６、「Ｄ８」）（ここで、Ｘ６２、Ｘ６５、Ｘ６８、Ｘ６９、Ｘ７１、Ｘ７３、Ｘ７６、Ｘ７７、Ｘ７８、Ｘ８０、及びＸ８１は任意のアミノ酸であり得る。Ｘ６６も任意のアミノ酸であり得るが、グルタミン酸であることが特に好まれる。Ｘ６６をグルタミン又はバリンで置換すると、結合が弱まるかもしれない。Ｘ６３、Ｘ７０、及びＸ７４は、疎水性アミノ酸である。Ｘ６３は、好ましくは、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、又はバリンであるが、最も好ましくはロイシンである。Ｘ７０とＸ７４は、好ましくは、バリン、イソロイシン、ロイシン、又はメチオニンである。Ｘ７４は、最も好ましくはバリンである。Ｘ６４は極性アミノ酸であり、より好ましくはアスパラギン酸又はグルタミン酸、最も好ましくはグルタミン酸である。Ｘ６７とＸ７５は、芳香族アミノ酸である。Ｘ６７に対してトリプトファンが極めて好ましい場合には、Ｘ７５は、好ましくはチロシン又はトリプトファンであるが、最も好ましくはチロシンである。ここでも、Ｘ７２とＸ７９は、ループを形成すると考えられるシステインであり、この位置のアミノ酸は、アミノ酸配列中の該システインをシフトさせることによって変化させてもよい。バックグラウンドを超えて、ＩＧＦ−１Ｒに結合することができるＤ８配列は２〜３個しか検出されていないので、優先してＩＲに結合するアミノ酸配列としては、Ｄ８が最も有用である。ＩＲに結合する好ましい配列は、Ｘ６２ＬＸ６４Ｘ６５Ｘ６６ＷＸ６８Ｘ６９Ｘ７０Ｘ７１Ｃ７３Ｘ７４Ｘ７５Ｘ７６Ｘ７７Ｘ７８ＣＸ８０Ｘ８１である。式６のアミノ酸配列の非限定的な例は、図６Ａ〜６Ｅに記載されている。
【００６８】
７．ＨＸ８２Ｘ８３Ｘ８４Ｘ８５Ｘ８６Ｘ８７Ｘ８８Ｘ８９Ｘ９０Ｘ９１Ｘ９２（式７）（ここで、Ｘ８２は、プロリン又はアラニンであるが、最も好ましくはプロリンである。Ｘ８３は、小アミノ酸、より好ましくはプロリン、セリン、又はトレオニン、最も好ましくはプロリンである。Ｘ８４は、ロイシン、セリン、又はトレオニンから選択されるが、最も好ましくはロイシンである。Ｘ８５は極性アミノ酸、好ましくは、グルタミン酸、セリン、リシン、又はアスパラギンであるが、より好ましくはセリンである。Ｘ８６は、任意のアミノ酸であり得るが、好ましくは、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、又はグルタミンなどの極性アミノ酸である。Ｘ８７は、脂肪族アミノ酸、好ましくはロイシン、メチオニン、又はイソロイシンであり、最も好ましくはロイシンである。アミノ酸Ｘ８８、Ｘ８９、及びＸ９０は任意のアミノ酸であり得る。Ｘ９１は脂肪族アミノ酸であり、Ｘ９２としてはロイシンが非常に好ましい。９２位には、フェニルアラニンを使用してもよい。）式７の好ましいコンセンサス配列は、ＨＰＰＬＳＸ８６ＬＸ８８Ｘ８９Ｘ９０ＬＬである。式７のモチーフはＩＲに結合するが、ＩＧＦ−１Ｒには、殆ど又は全く結合しない。式７のアミノ酸配列の非限定的な例は図７に記載されている。
【００６９】
８．別の配列は、１１個のアミノ酸を含むＸ１０４Ｘ１０５Ｘ１０６Ｘ１０７Ｘ１０８Ｘ１０９Ｘ１１０Ｘ１１１Ｘ１１２Ｘ１１３Ｘ１１４（式８）である（ここで、Ｘ１０６乃至Ｘ１１１のアミノ酸のうち少なくとも１つ、好ましくは２つはトリプトファンである。さらに、該配列中に２つのトリプトファンアミノ酸が存在するときには、それらは、３つのアミノ酸（好ましくは、順にプロリン、トレオニン、及びチロシン、アミノ終末端のトリプトファンにプロリンが隣接する）によって隔てられていることも好ましい。従って、Ｘ１０７Ｘ１０８Ｘ１０９Ｘ１１０Ｘ１１１に対して最も好ましい配列はＷＰＴＹＷである。アミノ末端に存在する３つのアミノ酸（Ｘ１０４、Ｘ１０５Ｘ１０６）のうち少なくとも１つ、並びにカルボキシ末端に存在し、Ｘ１０７〜Ｘ１１１に直接隣接するアミノ酸のうち少なくとも１つ（Ｘ１１２Ｘ１１３Ｘ１１４）のうち少なくとも１つは、好ましくはシステイン残基であり、それぞれＸ１０５とＸ１１３に位置することが最も好ましい。）。理論に拘泥するものではないが、前記システインは、ループ構造の形成が可能なように間隔を置くことが好ましい。Ｘ１０４とＸ１１４は、何れも、例えば、アラニン及びグリシンのような小アミノ酸である。最も好ましくは、Ｘ１０４はアラニンであり、Ｘ１１４はグリシンである。Ｘ１０５は任意のアミノ酸であり得るが、好ましくはバリンである。Ｘ１１２は、好ましくはアスパラギンである。このため、最も好ましい配列は、ＡＣＶＷＰＴＹＷＮＣＧである。ＩＲ結合を示したアミノ酸配列は、図８に記載されている。
【００７０】
９．ＤＹＫＤＬＣＱＳＷＧＶＲＩＧＷＬＡＧＬＣＰＫＫを含むアミノ酸配列（式９、ＪＢＡ５）。式９モチーフは、ＩＲとＩＧＦ−１Ｒの両者に対してアゴニスト活性を有し、システインループを形成すると考えられている別のモチーフである。ＥＬＩＳＡによってはＩＲ結合は検出できないが、ＩＲへの式９の結合は、インスリンと競合し、アゴニスト作用を示す。図１１Ａ参照。ＩＧＦ−１Ｒを介した式９の結合は、ＥＬＩＳＡによって検出される。式９アミノ酸配列の非限定的な例は、図９Ａ〜９Ｃに記載されている。
【００７１】
１０．ＷＸ１２３ＧＹＸ１２４ＷＸ１２５Ｘ１２６（式１０、グループ６二次ライブラリー）（ここでＸ１２３は、プロリン、グリシン、セリン、アルギニン、アラニン、又はロイシンから選択されるが、より好ましくはプロリンである。Ｘ１２４は任意のアミノ酸であるが、好ましくは荷電アミノ酸又は芳香族アミノ酸である。Ｘ１２５は疎水性アミノ酸、好ましくはロイシン又はフェニルアラニンであり、最も好ましくはロイシンである。Ｘ１２６は任意のアミノ酸であるが、好ましくは小アミノ酸である。式１０のアミノ酸配列の非限定的な例は、図１０Ａ〜１０Ｂに記載されている）。
【００７２】
１１．他のモチーフ
本発明とともに使用される別のモチーフには、ＷＰＧＹが含まれる。該モチーフを含む具体的なペプチド配列の例には、
ＫＶＲＧＦＱＧＧＴＶＷＰＧＹＥＷＬＲＮＡＡＫＫ（Ｅ８）、及び
ＫＳＭＦＶＡＧＳＤＲＷＰＧＹＧＶＬＡＤＷＬＫＫ（Ｆ２）が含まれる。
【００７３】
ＩＲ及び／又はＩＧＦ−１Ｒを結合する様々なアミノ酸配列は、上述したモチーフの何れにも対応しない、好ましいＩＲ又はＩＧＦ−１Ｒコンセンサス配列を同定するためにデザインされた様々なライブラリーをパニングすることによって同定された。このような配列は、図１０Ｃ〜１０Ｉに記載されている。
【００７４】
Ｂ．アミノ末端及びカルボキシ末端伸長部はモチーフの活性を調節する
上述したモチーフに加え、本発明は、アミノ末端又はカルボキシル末端に位置し、ＩＲ又はＩＧＦ−１Ｒの一方又は双方への該モチーフの結合を増強することができる好ましい配列も提供する。さらに、以下に記載されている前記伸長部の使用は、ＩＲ又はＩＧＦ−１Ｒの一方又は双方への結合を可能とするこれ以外の置換、付加、又は欠失を有するモチーフが使用可能である場合に、その使用を除外するものではない。
【００７５】
１．式１
活性を調節するある種のアミノ酸がアミノ末端伸長部に同定されるかもしれないが、Ａ６のアミノ末端の伸長部には任意のアミノ酸配列を使用してもよい。Ａ６に関して好ましいカルボキシ末端の伸長部は、Ａ６Ｘ９３Ｘ９４Ｘ９５Ｘ９６Ｘ９７（Ｘ９３は、任意のアミノ酸であり得るが、好ましくは、アラニン、バリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、及びアルギニンからなる群から選択される。Ｘ９４とＸ９７は任意のアミノ酸である。Ｘ９５は、好ましくは、グルタミン、グルタミン酸、アラニン、またはリシンであるが、最も好ましくはグルタミンである）。しかしながら、Ｘ９５にグルタミン酸が存在すると、幾分ＩＲに対する選択性を与えるかもしれない。さらに、Ｘ９５位にアスパラギン又はアスパラギン酸を有する配列を得ることができないことは、ＩＲ及びＩＧＦ−１Ｒへの十分な結合を維持又は増強するためには、これらのアミノ酸を避けるべきであることを示しているといえるかもしれない。Ｘ９６は、好ましくは、疎水性又は脂肪族アミノ酸であり、より好ましくはロイシン、イソロイシン、バリン、又はトリプトファンであるが、最も好ましくはロイシンである。Ｘ９６の疎水性残基、とりわけトリプトファンは、ＩＲ選択性を増大させるために使用し得る。
【００７６】
２．式２
アミノ末端伸張部及びカルボキシ末端伸長部を有するＢ６は、Ｘ９８Ｘ９９Ｂ６Ｘ１００と表し得る。Ｘ９８は、必要に応じて、アスパラギン酸であり、Ｘ９ ９は、グリシン、グルタミン、及びプロリンからなる群から独立に選択されるアミノ酸である。Ｘ９８にアスパラギン、Ｘ９９にプロリンが存在すると、ＩＲとＩＧＦ−１Ｒの両者に対する結合が増強される。Ｘ１００のアミノ酸は疎水性アミノ酸が好ましく、脂肪族アミノ酸がより好ましい。ＩＲの場合、最も好ましいのはロイシンであり、ＩＧＦ−１Ｒの場合、バリンである。２Ａ型のアミノ及びカルボキシ末端には、ともに、負に帯電したアミノ酸が好ましい。
【００７７】
３．式３
Ｘ１０１Ｘ１０２Ｘ１０３ｒｅｖＢ６として表される式３のアミノ末端伸張部（Ｘ１０３は、疎水性アミノ酸、好ましくはロイシン、イソロイシン、又はバリンであり、Ｘ１０２とＸ１０１は、好ましくは極性アミノ酸であり、より好ましくはアスパラギン酸又はグルタミン酸である）は、ＩＲ及びＩＧＦ−１Ｒへの結合を増強させるために有用であり得る。式３のカルボキシ終末端のアミノ酸には、明らかな優先度は見られない。
【００７８】
Ｃ．二次構造
理論に拘泥するものではないが、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ１０、及びＸ１３（Ｂ６）、並びにＸ１４Ｘ１７Ｘ２０、及びＸ２１（ｒＢ６）位の最も好ましい残基がヘリックスの同じ側に来るように、Ｂ６及びリバースＢ６モチーフは、αへリックスの形成に関与しているものと考えられている。図１２参照。Ｂ６モチーフおよびＲＢ６モチーフは何れも、パリンドローム配列から得られる構造的に類似のモチーフを形成するので、典型的なＬアミノ酸に代えてＤアミノ酸を使用しても、Ｌアミノ酸配列と同様の特性を有するアミノ酸配列を与えるものと思われる。得られる配列が、Ｌアミノ酸の配列に比べて酵素による分解を受けにくい可能性があるので、Ｄアミノ酸は有益であり得る。さらに、へリックスの適切な側に、極めて好ましいアミノ酸配列の適切な配向性を維持するためには、前記アミノ酸配列に沿ったこれらの残基の間隔を維持することが重要である。例えば、Ｂ６の第２及び第３アミノ酸（Ｘ７とＸ８）は、へリックスの反対側に配向される。図１２参照。
【００７９】
Ｄ．ＩＲへの結合の優先度
上述のように、本発明のモチーフを含有するアミノ酸配列は、モチーフの特定の位置又はそれらに隣接する領域の適切なアミノ酸を選択することによって、ＩＲ又はＩＧＦ−１Ｒの何れかに対する選択性が増大するように構築し得る。ＩＲ又はＩＧＦ−１Ｒを好むアミノ酸を与えることによって、本発明は、非コグネイト受容体に対する活性が最小限であるアミノ酸配列を構築する手段を提供する。例えば、ＩＲに対して高い親和性と活性を有し、ＩＧＦ−１Ｒに対して低い親和性と活性を有する本発明に開示されているアミノ酸配列は、望ましくない細胞増殖を促進し、ＩＧＦ−１アゴニスト活性を促進させる傾向が低下しているので、ＩＲアゴニストとして望ましい。ある特定の配列のＩＧＦ−１Ｒ結合親和性に対するＩＲ結合親和性の比は、図１Ａ〜１０Ｉに示されている。インスリン治療薬としては、ＩＲ／ＩＧＦ−１Ｒ結合親和性の比率は１００を超えるのが好ましい。反対に、ＩＧＦ−１Ｒ治療薬として使用する場合には、ＩＲ／ＩＧＦ−１Ｒ比は０．０１を下回るべきである。ＩＧＦ−１Ｒに選択的に結合するペプチドの例を以下に示す。
【００８０】
【化１４】
Figure 2004512010
【化１５】
Figure 2004512010
【化１６】
Figure 2004512010
【化１７】
Figure 2004512010
【化１８】
Figure 2004512010
【化１９】
Figure 2004512010
治療薬の候補を選択するためには、ＩＲ又はＩＧＦ−１Ｒへの相対的結合の以外に、コグネイト受容体での相対的効力を考慮することも重要である。このため、ＩＧＦ−１Ｒに対しては殆ど又は全く有意な活性を有していないが、ＩＲに対しては有効な配列もまた、ＩＲ及びＩＧＦ−１Ｒに対する相対結合親和性にかかわらず、重要なＩＲ治療薬と考え得る。
【００８１】
Ａ６のＩＲに対する選択性は、Ｘ９５位のカルボキシル末端伸長部にグルタミン酸を含ませることによって増大させ得る。Ｂ６モチーフのＩＲ選択性は、Ｘ１１をトリプトファン又はフェニルアラニンにすることによって増大させ得る。Ｘ１３位をトリプトファンとすることによっても、ＩＲの選択性が高まる。ＩＲに対する選択性を増大させるためには、Ｘ１３位にロイシンではなく、トリプトファンアミノ酸を使用してもよい。リバースＢ６モチーフでは、Ｘ１５を大アミノ酸とすると、ＩＲ選択性が高まる。逆に、小アミノ酸はＩＧＦ−１Ｒに対する特異性を与えるかもしれない。Ｆ８モチーフでは、Ｘ２３位のＬは、ＩＲへの結合には必須である。さらに、Ｘ３１はトリプトファンとすることも極めて好ましい。ＩＲ選択性を得るためには、Ｘ３２をグリシンとすることが好ましい。
【００８２】
Ｅ．ＩＲ及びＩＧＦ−１Ｒ上の複数の結合部位
本明細書に開示されている競合データによって、ＩＲ及びＩＧＦ−１Ｒ上には、本発明が提供する様々な配列モチーフを認識する少なくとも２つの別個の結合部位が存在することが明らかとなっている。
【００８３】
図１３に示すように、Ａ６、Ｂ６、ｒｅｖＢ６及びＦ２モチーフを含むペプチドは、ＩＲ上の同一部位（部位１）への結合について競合するが、Ｆ８及びＤ８モチーフは、これとは異なる部位（部位２）について競合することが、競合データ（例１５参照）によって示されている。同様に、Ｄ８リガンドによって、ＩＧＦ−１ＲからのＢ６モチーフペプチド（２０Ｅ２）の解離が減少するということは、相互作用する複数の結合部位を示唆している。
【００８４】
ＩＲ及びＩＧＦ−１Ｒ上に存在する別個の結合部位に結合するペプチドを同定することによって、ＩＲ又はＩＧＦ−１Ｒの活性を増加又は減少させるための、それらへの様々な結合スキームが得られる。ＩＲに関するこのようなスキームの例が、図１５に示されている。
【００８５】
下表は、これらのグループに基づいた、部位１又は部位２を結合する配列を示している。
【００８６】
【化２０】
Figure 2004512010
【化２１】
Figure 2004512010
Ｆ．多価リガンド
本発明は、ＩＲ及びＩＧＦ−１Ｒ上の異なる部位に優先的に結合するリガンドを提供する。ＩＲの一方の部位（部位１、図１３）に結合するアミノ酸モチーフは、Ａ６、Ｂ６、ｒｅｖＢ６、及びＦ２である。もう一方の部位（部位２、図１３）は、Ｆ８及びＤ８と結合する。従って、本発明によれば、アミノ酸配列を共有結合で連結することによって、多量体のリガンドを調製し得る。想定する多価リガンドの用途に応じて、同一部位又は異なる部位に結合するアミノ酸を組み合わせて、単一の分子を形成させてもよい。異なる受容体、又はある受容体の異なるサブユニット上に存在する同一の対応する部位に結合するように多価リガンドを構築する場合には、異なるアミノ酸配列が使用され、それらが何れも同じ部位に結合するとすれば、受容体に結合させるためのリガンドのアミノ酸配列は、同一であってもよいし、異なってもよい。
【００８７】
多価リガンドは、各部位に結合するアミノ酸配列を各別に発現させた後に、それらを互いに共有結合で連結させることによって、又は特定の結合用アミノ酸配列の組み合わせをその中に含む単一のアミノ酸配列を多価リガンドとして発現させることによって調製し得る。
【００８８】
特定の望ましい特性を有する多価リガンドを作製するために、様々な組み合わせのアミノ酸配列を結合させてもよい。このため、アゴニストをアゴニストと組み合わせてもよいし、アンタゴニストをアンタゴニストと組み合わせてもよいし、アゴニストをアンタゴニストと組み合わせてもよい。多価リガンドを形成させるために同じ部位に結合するアミノ酸配列を組み合わせることは、複数の受容体ユニットを互いに架橋させることができる分子を作製するのに有用であり得る。異なる部位に結合するアミノ酸配列を組み合わせるために、多価リガンドを構築してもよい（図１５）。
【００８９】
本明細書に開示されている、ＩＲ又はＩＧＦ−１Ｒに対してアゴニスト特性を有するモノマーの発見に照らして、単一分子に複数の結合部位が存在するため、より望ましい薬物動態学的特性を有するリガンドを調製するために多価リガンドを調製することも有用であり得る。さらに、異なる親和性で異なる部位に結合するアミノ酸配列を組み合わせることによって、ＩＲ又はＩＧＦ−１Ｒに対するリガンドの総体的な効力と親和性を調節するための手段が与えられる。
【００９０】
１．ハイブリッドの構築
ある実施態様では、任意の適切な発現系の中で発現される組換え融合ポリペプチドとして、少なくとも２つのペプチドのハイブリッドが作製され得る。該ポリペプチドは、リガンド結合配列の他にアミノ酸配列を含有する融合構築物として、又はシグナル配列若しくはリガンド結合とは無関係な他の配列が除去された被切断タンパク質として受容体を結合し得る。前記融合タンパク質の精製を容易にするための配列を前記構築物の一部として発現させてもよい。このような配列は、その後、必要に応じて、終局的な結合リガンドを作製するために除去してもよい。組換え発現は、大量のリガンドを作製するための手段も提供する。さらに、組換え発現は、様々な組み合わせのアミノ酸配列を発現させるために、及びそれらの組み合わせの配向（すなわち、アミノ末端からカルボキシル末端への配向（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ））を変えるために使用してもよい。
【００９１】
組換え遺伝子発現によって作製した場合であろうと、従来の化学結合技術によって作製した場合であろうと、前記様々なアミノ酸配列は、様々な長さのリンカーによって結合させ得る。連結した配列を組換えによって発現させた場合、約４オングストロームというアミノ酸の平均長に基づけば、２つのアミノ酸配列を接続するためのリンカーは、典型的には、約３〜約１２アミノ酸（約１２〜約４８オングストロームに相当）の範囲にあるであろう。従って、結合配列間の好ましい距離は、約２〜約５０オングストロームである。さらに好ましくは４〜約４０である。アミノ酸配列間のリンカーの柔軟性の程度は、リンカーを構築するために使用されるアミノ酸を選択することによって調節し得る。柔軟で、比較的非制限的なリンカーを作製するには、グリシンとセリンの組み合わせが有用である。より剛直なリンカーは、連結配列内により複雑な側鎖を有するアミノ酸を使用することによって構築し得る。
【００９２】
以下に示されている好ましい実施態様では（図１６）、ジペプチドを与える融合構築物ＭＢＰ−ＦＬＡＧ−ＰＥＰＴＩＤＥ−（Ｇ，Ｓ）ｎ−ＰＥＰＴＩＤＥ−Ｅ−ＴＡＧは、マルトース結合タンパク質のアミノ酸配列（ＭＢＰ）又は発現されたペプチド配列のアフィニティークロマトグラフィー精製を可能とするのに有用な類似の配列を備える。次いで、最初の配列を除去するための切断部位を与えるために、フラッグ配列に該精製促進配列を付着させ得る。続いて、介在するリンカーを含む前記ペプチド二量体が続き、ペプチド発現の同定／精製を促進するために、カルボキシル末端部にタグ配列を含ませ得る。上述した代表的な構築物中では、ＧとＳはグリシンとセリン残基であり、リンカー配列を構成する。
【００９３】
組換えタンパク質発現によって二量体ペプチドを作製することに加えて、ペプチド合成によって二量体を作製してもよくメリーフィールド合成（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，１９９７）などの合成技術を使用して、完全なペプチドを構築してもよい。
【００９４】
二量体を構築する他の方法には、第二のペプチドに共有結合できるように、ペプチドの末端終末部を活性化するリンカー分子を導入することが含まれる。このよなリンカーの例には、オキシアミノ官能基で活性化されたジアミノプロピオン酸が含まれる。好ましいリンカーは、式
Ｏ＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ＝Ｏ
を有するジアルデヒドである（ｎは２〜６であるが、長さ約２５〜３０オングストロームのリンカーを得るためには好ましくはｎは６である）。リンカーは、カルボキシル末端又はアミノ末端に二量体を連結させるために使用し得る。
【００９５】
２．具体的な二量体の性質決定
インスリン受容体の部位１、部位２、又は部位１と部位２の両者に、高い親和性で結合する具体的な二量体が表１に示されている。アゴニスト活性は部位１−部位１二量体に関して観察されているが、部位１−部位２二量体も所望の特性を有し得る。
【００９６】
【表１】
Figure 2004512010
他のペプチドの組み合わせも本発明の範囲に属し、本明細書で記載した例で実証されているように決定し得る。２つのＤ１１７（Ｈ２Ｃ）ペプチドを含む部位１アゴニストの調製に関しては、僅か３つのアミノ酸（１２オングストローム）のリンカーが、９つのアミノ酸（３６オングストローム）の連結領域を用いて調製した対応するリガンドよりも、ＩＲの部位１に対してより大きな親和性を有するリガンド与えた。図１７。
【００９７】
注目すべきことに、ＩＲ自己リン酸化アッセイによって測定したところによれば、幾つかの融合ペプチドがＩＲアゴニスト活性を示す（例２０参照）。図７４。特に、融合ペプチド、４３９、４３６、４４９、及び４６３は顕著なＩＲ、アゴニスト活性を示す（図７４）。
【００９８】
Ｇ．ペプチド合成技術
本発明とともに使用するためのアミノ酸配列を作製するために、分子生物学、タンパク質生化学、及び免疫学における多くの慣用技術を使用し得る。
【００９９】
１．組換え合成
組換えペプチドを得るためには、そのままの状態の宿主細胞の中で、又は無細胞翻訳系の中で発現させるために、本分野で周知の方法によって、対応するＤＮＡ配列を任意の適切なベクター中にクローニングすればよい（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，１９８９）。ベクター、宿主、又は翻訳系の具体的な選択は、本発明の実施には重要ではない。
【０１００】
組換えペプチドを発現させるためのクローニングベクターには、ｐＵＣ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、ｐＥＴ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、又はｐＲＥＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）ベクターが含まれるがこれらに限定されない。ベクターは、１以上のクローニング又は発現用複製及び遺伝系、宿主中で選択するための１以上のマーカー（例えば、抗生物質耐性）、１以上の発現カセットを含有することができる。挿入されたコーディング配列は、標準的な方法によって合成し、天然の採取源から単離することができ、又はハイブリッドとして調製することなどができる。転写制御要素及び／又は他のアミノ酸コーディング配列への前記コーディング配列の連結は、確立された方法を用いて実施することができる。所望であれば、ある宿主生物中でより効率的に発現させるために、ＤＮＡ配列を最適化することができる。例えば、本分野で日常的に実施されている技術を用いて、ある宿主細胞又は無細胞翻訳系の中で好まれるコドンの使用に適合するようにコドンを改変することができる。
【０１０１】
組換えペプチドを発現させるための適切な無細胞系には、例えば、ウサギの網状赤血球可溶化液、麦芽抽出物、イヌの膵臓ミクロソーム膜、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓ３０抽出物、及び被共役転写／翻訳系（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）が含まれる。クローニングベクター、ＤＮＡ断片、又はコーディング領域を含有するＲＮＡ配列、及び適切なプロモーター要素を添加すると、このような系は組換えポリペプチドを発現することが可能となる。
【０１０２】
クローニングベクターの宿主細胞には、細菌、古細菌、真菌、植物、昆虫、及び動物細胞、特に哺乳類細胞が含まれる。特に興味深いのは、Ｅ．Ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ　ｃｒａｓｓａ、ＳＦ９、Ｃ１２９、２９３、ＮＩＨ　３Ｔ３、ＣＨＯ、ＣＯＳ、及びＨｅＬａ細胞である。これらの細胞は、電気穿孔、ＣａＣｌ２−、ＬｉＣＬ−、ＬｉＡｃ／ＰＥＧ−、スフェロプラスティング、Ｃａ−ホスフェート、ＤＥＡＥ−デキストラン、リポソームを介したＤＮＡの取り込み、インジェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、又は他の確立した方法を含む任意の適切な方法によって、必要に応じて形質転換し、トランスフェクトし、又は形質導入することができる。
【０１０３】
ある種の用途では、精製を容易にする付加配列タグを担持するペプチドを組換え系の中で作製することが好ましいかもしれない。非限定的なタグの例には，ｃ−ｍｙｃ、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ポリヒスチジン（６Ｘ−ＨＩＳ）、ＧＬＵ−ＧＬＵ、及びＤＹＫＤＤＤＤＫ（ＦＬＡＧ（登録商標））エピトープタグが含まれる。エピトープタグは、数多くの確立された方法によって、ペプチドに付加することができる。エピトープタグのＤＮＡ配列は、オリゴヌクレオチドとして、又はＰＣＲ増幅で使用されるプリマーを通じて、ペプチドのコーディング配列中に挿入することができる。これに代えて、ペプチドのコーディング配列は、エピトープタグとの融合物を与える特定のベクター、例えばｐＲＥＳＴベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）中にクローニングすることができる。発現したタグが付加されたペプチドは、続いて、適切な固相マトリックス上でのクロマトグラフィーによって、無細胞翻訳系の粗可溶化液から、又は宿主細胞から精製することができる。
【０１０４】
細胞又は細胞外の可溶化液などの天然の採取源からペプチドを直接精製する方法は、本分野において周知である（Ｈａｒｒｉｓ　ａｎｄ　Ａｎｇａｌ，１９８９参照）。このような方法には、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、調製用ディスクゲル電気泳動、等電点電気泳動、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、逆相ＨＰＬＣ、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー及び分配クロマトグラフィー、向流分配、及びこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。天然に存在するペプチドは、可能性のある多くの採取源から、例えば、哺乳類、鳥、魚、及び昆虫由来のものを含むヒト又は動物から得られる血漿、身体組織、又は体液の可溶化液から精製することができる。
【０１０５】
天然に存在するペプチド又は組換えによって作製したペプチドを精製するために、抗体をベースとした方法を使用してもよい。これらのペプチド又は該ペプチドから得られる断片を認識する抗体を作製し、単離することができる。次いで、抗体を抱合させた固相マトリックス上でのクロマトグラフィーによって、粗可溶化液から前記ペプチドを精製することが可能となる（Ｈａｒｌｏｗ　ａｎｄ　Ｌａｎｅ，１９９８参照）。
【０１０６】
２．ペプチドの化学合成
これに代えて、純固相合成、部分的固相法、断片縮合、又は古典的な溶液合成を含む（これらに限定されない）自動化された市販の操作によって、化学的にペプチドを合成してもよい。前記ポリペプチドは、好ましくは、固相ペプチド合成によって、例えば、メリーフィールド（１９６５、１９９７）の記載に従って調製される。さらに、半合成ポリペプチドを作製するために、ポリペプチドを作製する組換え及び合成法を組み合わせることもできる。
【０１０７】
Ｈ．スクリーニングアッセイ
本発明の別の実施態様では、ＩＲ及び／又はＩＧＦ−１Ｒに対して薬理学的に活性なリガンドを同定するためのスクリーニングアッセイが提供される。本発明によって提供されるスクリーニングアッセイは、国際出願ＷＯ　９６／０４５５７号（その全体が本明細書に援用される）に開示されているものに基づいている。簡潔に述べると、ＷＯ　９６／０４５５７号は、標的上の活性部位に結合し、標的に対してアゴニスト又はアンタゴニスト活性を有するレポーターペプチドの使用を開示している。これらのレポーターは、組換えライブラリーから同定され、ランダムなアミノ酸配列を有するペプチドか、又はランダム化された少なくとも１つのＣＤＲ領域を有する可変抗体領域（ｒＶａｂ）の何れかである。前記レポーターペプチドは、細胞組換え発現系、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ中で、又はファージディスプレイによって発現され得る。ＷＯ　９６／０４５５７号及びＫａｙ　ｅｔ　ａｌ．（１９９６）を参照（何れも、参考文献として、本明細書に援用される）。本発明によれば、前記ライブラリーから同定されたレポーターは、次いで、それ自体治療薬として、又は他の分子、好ましくは、レポーターと同様の特性を有する小さな活性分子をスクリーニングするための競合的結合アッセイの何れかにおいて使用し、アゴニスト又はアンタゴニスト活性を与えるための薬物候補として発展させ得る。これらの小有機分子は、経口投与したときに活性であることが好ましい。
【０１０８】
インスリンに代わる小有機分子の不均質スクリーニングの基礎としてのインビトロ競合的受容体結合アッセイの基本的なフォーマットは以下のとおりであり得る。ビオチン化されたペプチド（ｂＰ）に複合体化されたストレプトアビジン標識ユーロピウム（ｓａＥｕ）を用いた時間分解蛍光検出（ＴＲＦＤ）によって、ＩＲの活性部位の占有を定量する。該アッセイでは、ｓａＥｕは、ｂＰ及びＩＲと三次複合体（すなわち、ＩＲ：ｂＰ：ｓａＥｕ複合体）を形成する。ＴＲＦＤアッセイのフォーマットは、十分に確立されており、感度も高く、定量的である（Ｔｏｍｐｋｉｎｓ　ｅｔ　ａｌ．，１９９３）。該アッセイは、一本鎖抗体又はビオチン化されたペプチドを使用することができる。さらに、両アッセイフォーマットは、インスリンによる、ビオチン化リガンドの活性部位への結合の競合を忠実に報告している。
【０１０９】
これらのアッセイでは、ＰＢＳ中の０．５％　ＢＳＡ及び２％無脂肪乳の溶液によってブロッキングした後、ビオチン化ペプチド又はｒＶａｂとともにインキュベートすることによって、可溶性ＩＲがマイクロタイターウェルの表面上にコートされる。続いて、結合していないｂＰを洗浄除去し、ｓａＥｕを加えて受容体に結合したｂＰと複合体を形成させる。酸性増強溶液を添加すると、結合したユーロピウムは、遊離のＥｕ３＋として放出され、遊離のＥｕ３＋は、前記増強溶液の成分とともに強い蛍光の安定な複合体を素早く形成する。続いて、ＩＲ：ｂＰに結合したｓａＥｕを、強い蛍光状態に転換し、Ｗａｌｌａｃ　ＶｉｃｔｏｒＩＩ（ＥＧ＆Ｇ　Ｗａｌｌａｃ，Ｉｎｃ．）などの検出器によって検出する。
【０１１０】
薬学的に活性な公知の化合物の模倣体（ｍｉｍｅｔｉｃｓ）のデザインは、「リード」化合物に基づいて医薬品を開発するための公知のアプローチである。活性な化合物を合成することが困難若しくは高価であるか、又は特定の投与方法が不適切である場合（例えば、ペプチドは、消化管中でプロテアーゼによって急速に分解されることが多いので、ペプチドは、一般的に、経口組成物用の活性成分としては適していない）に、これは望ましいかもしれない。模倣体の設計、合成、及び試験は、一般的には、目標とする特性に関して、多数の分子をランダムにスクリーニングすることを避けるために使用される。
【０１１１】
目標とする所定の特性を有する化合物から模倣体を設計する際には、一般的に、数個の段階を経る。まず、目標とする特性を決定する上で決定的及び／又は重要である前記化合物の部分を決定する。ペプチドの場合には、ペプチド中に存在するアミノ酸残基を系統的に変化させることによって（例えば、各残基を順番に置換することによって）これを為すことができる。前記化合物の活性な領域を構成するこれらの部分又は残基は、「ファルマコフォア」として知られている。
【０１１２】
一旦ファルマコフォアが見出されると、広範な情報源（例えば、分光学的な技術、エックス線散乱データ、及びＮＭＲ）から得られたデータを用いて、その物理的特性（例えば、立体化学、結合、サイズ、及び／又は電荷）に従って、その構造がモデル化される。コンピューター分析、（原子間の結合ではなく、ファルマコフォアの荷電及び／又は体積をモデル化する）類似性マッピング、及びその他の技術を、該モデリング工程に使用することができる。
【０１１３】
該アプローチの変法では、リガンドの三次元構造及びその結合の相手方がモデル化される。結合によってリガンド及び／又は結合の相手方がコンフォメーションを変える場合に、これは特に有用であり得、模倣体の設計に際して、これをモデルに考慮することが可能となる。
【０１１４】
次いで、前記ファルマコフォアを模倣する化学的な基をその上に植設することができるテンプレート分子を選択する。該テンプレート分子及びその上に植設される化学的な基は、前記模倣体の合成が容易で、薬理学的に許容される可能性が高く、インビボで分解せず、リード化合物の生物活性を保持するように、簡便に選択することができる。続いて、見出した模倣体をスクリーニングして、該模倣体が目標とする特性を発現する程度を確かめ、又は該模倣体が前記特性を阻害する程度を確かめる。その後、インビボでの試験又は臨床試験用の１以上の最終模倣体に到達するために、さらなる最適化又は修飾を実施することができる。
【０１１５】
本発明は、ＩＲ及び／又はＩＧＦ−１Ｒに対して、アゴニスト又はアンタゴニストのうち何れかとして機能する特異的なＩＲ及びＩＧＦ−１Ｒアミノ酸配列を提供する。本発明で使用するのに適切なファージディスプレイライブラリーの例には、ランダム化された４０アミノ酸のペプチドを含有するライブラリー（ＲＡＰＩＤＬＩＢＴＭ、図１６）、ヒトゲノム抗体ＤＮＡ（ＧＲＡＢＬＩＢＴＭ、図３０）に由来するｒＶａｂを含有する別のライブラリーが含まれる。これらのライブラリーの構築及び分析、並びに結合剤のバイオパニング及び選択のための基本的な操作の詳細は、他の文献に記載されている（ＷＯ　９６／０４５５７、Ｍａｎｄｅｃｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７、Ｒａｖｅｒａ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８、Ｓｃｏｔｔ　ａｎｄ　Ｓｍｉｔｈ，　１９９０、Ｇｒｉｈａｌｄｅ　ｅｔ　ａｌ．，１９９５，Ｃｈｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６、Ｋａｙ　ｅｔ　ａｌ．，１９９３，　Ｃａｒｃａｍｏ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８）（全て、参考文献として本明細書に援用される））。本発明ともに使用するのに適した別のファージディスプレイライブラリーは、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｐｈ．Ｄ．Ｃ７Ｃ　Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ　Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｌｉｂｒａｒｙ）から市販されている。本明細書に記載されている操作に従えば、更なる配列が得られる可能性がある。
【０１１６】
Ｉ．本発明によって提供されるペプチドの使用
本発明によって提供されるＩＲ及びＩＧＦ−１Ｒアゴニスト及びアンタゴニストペプチドは、薬学的組成物中の治療薬の候補として、他のより強力な又はより選択的な治療薬を同定するためのリード化合物として、例えば、競合的スクリーニングアッセイによって他の有用なリガンドを同定するためのアッセイ試薬として、並びにＩＲ及びＩＧＦ−１Ｒをさらに分析するための研究ツールとして有用である。特に、本発明によって提供されるペプチド配列は、ＩＲ又はＩＧＦ−１Ｒの第１部位及び／又は第２部位に結合する要素を含む二次ペプチドライブラリーを設計するために使用することができる。このようなライブラリーは、ＩＲ又はＩＧＦ−１Ｒに対する初発ペプチドの結合及び／又は活性を増加又は調節する配列変種を同定するために使用することができる。
【０１１７】
本発明によって提供されるＩＲアゴニストのアミノ酸配列は、インスリン類縁体として有用であり、従って、糖尿病、又はインスリン応答若しくは産生の減少を伴う他の疾病の治療法として発展させ得る。インスリンを補助するために、又はインスリンの代わりに使用する場合、好ましいアミノ酸配列は、ＦＨＥＮＦＹＤＷＦＶＲＱＶＳＫ（Ｄ１１７，Ｈ２Ｃ）、ＤＹＫＤＦＹＤＡＩＱＬＶＲＳＡＲＡＧＧＴＲＤＫＫ（Ｄ１１８，２０Ｅ２）、ＫＤＲＡＦＹＮＧＬＲＤＬＶＧＡＶＹＧＡＷＤＫＫ（Ｄ１１９，２０Ｃ１１）、ＤＹＫＤＬＣＱＳＷＧＶＲＩＧＷＬＡＧＬＣＰＫＫ（Ｄ１１６，ＪＢＡ５）、ＤＹＫＤＶＴＦＴＳＡＶＦＨＥＮＦＹＤＷＦＶＲＱＶＳＫＫ（Ｄ１１３，Ｈ２）、及びＧＲＶＤＷＬＱＲＮＡＮＦＹＤＷＦＶＡＥＬＧ（Ｓ１７５）である。最も好ましいＩＲアゴニストは、ＦＨＥＮＦＹＤＷＦＶＲＱＶＳＫ（Ｄ１１７，Ｈ２Ｃ）、及びＧＲＶＤＷＬＱＲＮＡＮＦＹＤＷＦＶＡＥＬＧ（Ｓ１７５）。最も好ましいのは、ＧＲＶＤＷＬＱＲＮＡＮＦＹＤＷＦＶＡＥＬＧ（Ｓ１７５）である。好ましい二量体配列は、Ｓ１７０、Ｓ１７１、Ｓ１７２、Ｓ２３２、Ｓ３００配列として表記されている（表１５参照）。
【０１１８】
本発明によって提供されるＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストのアミノ酸配列は、乳癌及び前立腺癌を含む癌の治療するのに有用であるが、これらに限定されない。ヒト及び乳癌は、毎年４万人を超える死亡の原因であり、手術、化学療法、放射線療法、及び免疫療法などの現在の治療の成功例は限られている。本明細書に開示されているＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストのアミノ酸配列は、糖尿病性網膜症の治療又は予防にも有用である。最近の報告は、これまでに同定されたＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストは、糖尿病性網膜症を引き起こす網膜の新血管新生を抑制し得ることを示している（Ｓｍｉｔｈ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９）。
【０１１９】
本発明によって提供されるＩＧＦ−１Ｒアゴニストのアミノ酸配列は、脳卒中及び糖尿病性神経障害を含む神経疾患の治療を開発するのにも有用である。複数の異なるグループによって、脳全体の虚血の低減にＩＧＦ−１Ｒが関わっていることが報告されており、ＩＧＦ−１を糖尿病性神経障害の治療に使用できることを支持している（Ａｕｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８；Ａｐｆｅｌ，１９９９に総説されている）。
【０１２０】
Ｊ．投与の方法
本発明のアミノ酸配列は、タンパク質及びペプチドを供給するための本分野で公知の標準的な担体を含む薬学的組成物として、及び遺伝子治療によって投与し得る。アミノ酸配列の性状は不安定なので、非経口投与が好ましい。好ましい投与様式には、鼻又は気管から吸収させるためのエアロゾル、静脈内、筋肉内、胸骨内、又は皮下注射するための懸濁物、及び経口投与するための化合物が含まれる。該実施態様で使用するための他の投与様式及び適切な製剤成分の例を以下に論述する。他の投与様式には、鼻内、くも膜下、皮内、経皮、経腸、及び舌下が含まれる。注射可能な投与の場合、滅菌溶液若しくは懸濁物中に組成物を入れるか、または薬学的且つ生理的に許容される水性又は油性のビークル中に乳化させることができ、防腐剤、安定化剤、溶液又は懸濁物をレシピエントの体液（すなわち、血液）と等張にするための物質を含有し得る。使用に適した賦形剤は、水、リン酸で緩衝化したｐＨ７．４の生理的食塩水、０．１５Ｍの塩化ナトリウム水溶液、デキストロース、グリセロール、低濃度のエタノールなど、及びこれらの混合物である。安定化剤の具体例は、ポリエチレングリコール、タンパク質、糖類、アミノ酸、無機酸、及び有機酸であり、単独で、又は混合物として使用し得る。使用すべき数量及び分量並びに投与経路は、個別に決定され、当業者に公知である類似の用途又は適応で使用される量に相当する。
【０１２１】
本明細書に記載されている構築物は、本発明の１以上のアミノ酸配列の発現を可能にするために、遺伝子導入及び遺伝子治療法において使用してもよい。本発明のアミノ酸配列を遺伝子治療に使用することは、インスリンの投与又は発現に依拠しない代替的な糖尿病の治療法を与える可能性がある。遺伝子治療で使用するためにインスリンを発現させるには、前駆産物の発現が必要であり、その後、該前駆産物が切断やジスルフィド結合の形成を含むプロセッシングを経て、活性な産物を形成しなければならない。活性を有する本発明のアミノ酸配列は、比較的小さく、そのため、活性になるのに複雑なプロセッシング工程を必要としない。従って、これらの配列は、遺伝子治療により適した産物を与える。
【０１２２】
本分野で公知の遺伝子導入システムは、本発明を実施する上で有用であり得る。ウイルス及び非ウイルス法は何れも適している。このような導入システムの例には、リポソーム又はアデノ随伴ウイルス若しくはワクシニアウイルスのようなウイルスを介した送達が含まれるが、これらに限定されない。パポーバウイルス（例えば、ＳＶ４０、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＨＳＶ及びＥＢＶを含むヘルペスウイルス、鳥、マウス、及びヒト起源のレトロウイルス）を含む多数のウイルスが遺伝子導入ベクターとして使用されている。当業者であれば理解できるように、ヒトの遺伝子治療のプロトコールの多くは、無能力化されたマウスレトロウイルスに基づくものである。組換えレトロウイルスは、ヘルパーが不要な高力価の組換えレトロウイルス株を産生することができる広宿主性パッケージング細胞株（例えば、Ｃｏｎｅ　ａｎｄ　Ｍｕｌｌｉｇａｎ，１９８４参照）とともに使用することもできる。
【０１２３】
組換えレトロウイルスベクターは、以下の部分、レトロウイルスパッケージングシグナル配列を含有するＤＮＡが続く、ＭＭＴＶなどの適切なレトロウイルスから得られる完全な状態の５’ＬＴＲ、置換遺伝子治療用の特異的な細胞に導入すべき遺伝子を含有する転写ユニットのエンハンサー及びプロモーターの間に置かれた絶縁因子（ｉｎｓｕｌａｔｏｒ　ｅｌｅｍｅｎｔ）、以下に記載されている選択可能な遺伝子、ウイルスのエンハンサー領域中に欠失を含有しているか、ウイルスのエンハンサーとプロモーター領域の両者に欠失を含有する３’ＬＴＲを含有し得る。前記選択可能な遺伝子は、パッケージング細胞株中、及び被トランスフェクト細胞中で活性な５’プロモーターを有してもよいし、有さなくてもよい。
【０１２４】
組換えレトロウイルスベクターＤＮＡは、広宿主性パッケージング細胞株Ψ−ＡＭ（Ｃｏｎｅ　ａｎｄ　Ｍｕｌｌｉｇａｎ，１９８４参照）、又はヘルパーが不要な高力価の組換えレトロウイルス株を産生することができる他のパッケージング細胞株の中にトランスフェクトすることができる。トランスフェクション後に、増殖培地中に適切な濃度で存在するＧ４１８に対する耐性に関して、前記パッケージング細胞株を選択する。アデノウイルスベクター（例えば、ＤＮＡウイルスベクター）、特に複製欠損アデノウイルスベクター、又はアデノ随伴ベクターが、本分野において記載されている（Ｋｏｃｈａｎｅｋ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６；　Ａｓｃａｄｉ　ｅｔ　ａｌ．，１９９４；　Ａｌｉ　ｅｔ　ａｌ．，１９９４）。
【０１２５】
本分野で公知の非ウイルス的遺伝子導入法には、リン酸カルシウム共沈殿のような化学的技術、直接的なＤＮＡの取り込み及び受容体を介したＤＮＡ導入、並びに、マイクロインジェクションや膜融合を介したリポソーム導入などの機械的手段が含まれる。さらに、ウイルスを介した遺伝子導入は、リポソームを用いた直接的なインビボ遺伝子導入と組み合わせることができ、それによって、例えば、周囲の分裂していない細胞には、ウイルスベクターを送達せずに、腫瘍細胞にはウイルスベクターを送達することが可能となる。細胞中にＤＮＡ又はＲＮＡを導入するのに有用であると述べられている様々なリポソームについての記載は、米国特許第５、２８３，１８５号及び第５、７９５，５８７号に存在する。レトロウイルスベクター産生細胞株は、手術不能な脳腫瘍に冒された患者に使用することが認可されているようなウイルス粒子の継続的な供給源を与えるために、特定の細胞種（例えば、腫瘍）の中に直接的に注入することもできる。
【０１２６】
受容体を介した遺伝子導入法によって、前記構築物中のＤＮＡを特定の組織に直接誘導することが可能となる。これは、ポリリシンを介して、ＤＮＡ（共有結合によって閉じられたスーパーコイル状プラスミドの形態であることが多い）をタンパク質リガンドに抱合させることによって達成される。適切なリガンド又は適したリガンドは、標的細胞又は組織種の細胞表面上の対応するリガンド受容体の存在に基づいて選択される。これらのリガンドーＤＮＡ抱合体は、所望であれば、血中に直接注入することができ、受容体結合とＤＮＡ−タンパク質複合体の内部移行が起こる標的組織に誘導される。エンドソーム機能を破壊するために、アデノウイルスとの同時注入を使用して、ＤＮＡの細胞内破壊の問題を克服することができる。
【０１２７】
生物学的遺伝子導入及び物理的遺伝子導入法を組み合わせたアプローチでは、アデノウイルスのヘキソンタンパク質と特異的に反応するポリリシン抱合抗体と結合された任意のサイズのプラスミドを利用する。生じた複合体をアデノウイルスベクターに結合させる。続いて、細胞を感染させるために該三分子複合体を使用する。前記アデノウイルスベクターは、細胞への効率的な結合、内部移行、及び結合されたＤＮＡが損傷を受け得るより前にエンドソームを破壊することを可能とする。
【０１２８】
多くの種類の細胞及び細胞株（例えば、初代細胞株又は確立された細胞株）並びに組織が、本発明の構築物を安定にトランスフェクトし、又は本発明の構築物を受容することができる。使用し得る細胞の例には、幹細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、マクロファージ、他の白血球リンパ球（例えば、骨髄球、マクロファージ、単球）、様々な発育段階にある免疫系細胞、赤血球系統の細胞、膵臓細胞、肺細胞、筋肉細胞、肝臓細胞、脂肪細胞、神経細胞、膠細胞、他の脳細胞、正常細胞の相応物に対応する様々な細胞系統（例えば、Ｋ５６２、ＨＥＬ、ＨＬ６０、及びＭＥＬ細胞）の被形質転換細胞、前述したもの全てに由来する確立された、あるいは形質転換された細胞株が含まれるが、これらに限定されない。さらに、本発明の構築物は、様々な手段によって、組織中に直接導入してもよく、構築物は、ここで該組織を構成する細胞の中に安定に取り込まれるであろう。さらに、本発明の前記ペプチドのＤＮＡ配列を含有する構築物は、胚及び胎児段階を含む様々な発育段階にある初代細胞中に導入して、発育の初期段階での遺伝子治療を実施することができる。
【０１２９】
記載されている構築物は、薬学的に許容される担体及び生理学的賦形剤を含有する薬学的調製物又は組成物の形態で投与することができる。その調製においては、ヒト及びヒト以外の哺乳動物を含む対象レシピエント生物の細胞、組織、又は臓器を標的とするために、前記ベクターは、ウイルスベクター構築物などであり得る。前記組成物は、無菌生理食塩水又は他の注射可能な水性の液体などの薬学的に許容される適切な液体又は溶液中に前記成分を分散させることによって形成させ得る。このような組成物中に使用される前記成分の量は、当業者によって、日常的に決定し得る。前記組成物は、皮下、静脈内、筋肉内、及び胸骨内を含む非経口的な注射経路によって投与し得る。
【０１３０】
以下の非限定的な例は、本発明の様々な側面及び実施態様を説明するものであって、本発明の範囲を限定するものと解するべきではない。
【０１３１】
【実施例】
以下に説明する実施例では次の材料を使用した。溶解性ＩＧＦ−１Ｒは、Ｒ＆Ｂ　Ｓｙｓｔｅｍｓから入手した（カタログ番号３９１−ＧＲ／ＣＦ）。インスリン受容体は、Ｂａｓｓ他、１９９６に従って調製した。インスリンはＳｉｇｍａ（カタログ番号Ｉ−０２５９）またはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒから入手した。ＩＧＦ−１はＰｅｐｒｏＴｅｃｈから入手した（カタログ番号１００−１１）。合成ペプチドは全てＮｏｖｏ　Ｎｏｒｄｉｓｋ、ＡｎａＳｐｅｃ、Ｉｎｃ．（Ｓａｎ　Ｊｏｓｅ、ＣＡ）、ＰｅｐｔｉｏＧｅｎｉｃｓ（Ｌｉｖｅｒｍｏｒｅ、ＣＡ）、またはＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）において、純度＞８０％で合成された。Ｍａｘｉｓｏｒｂ　ＰｌａｔｅｓはＮｕｎｃ　ｖｉａ　Ｆｉｓｈｅｒから入手した（カタログ番号１２５６３４７）。ＨＲＰ／抗Ｍ１３複合体はＰｈａｒｍａｃｉａから入手した（カタログ番号２７−９４２１−０１）。ＡＢＴＳ溶液はＢｉｏＦ／Ｘから入手した（カタログ番号ＡＢＴＳ−１０１１−０４）。
【０１３２】
例１
Ａ．ＩＧＦ−１ＲおよびＩＲ結合リガンドを同定するためのファージライブラリーの作製
繊維状ファージのペプチドライブラリー「ＲＡＰＩＤＬＩＢ（商標）」の模式図を図１６に示す。４０個のランダムなアミノ酸を含有するペプチドをコードするＤＮＡ断片を以下の方法で作製した。配列（ＮＮＫ）４０（Ｎ＝Ａ、Ｃ、ＴまたはＧ、およびＫ＝ＧまたはＴ）を含めるために、１４５塩基のオリゴヌクレオチドを合成した。このオリゴヌクレオチドを鋳型として、いずれも５′末端をビオチン化した２個のより短いオリゴヌクレオチドプライマーと共にＰＣＲ増幅に使用した。得られた１９０ｂｐの産物を精製して、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　ｓｐｉｎカラム（ＱＩＡＧＥＮ、Ｉｎｃ．Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）で濃縮して、次いでＳｆｉＩおよびＮｏｔＩで消化した。ストレプトアビジン−アガロース（ＧｉｂｃｏＢＲＬ　Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を該消化混合物に添加して、ＰＣＲ産物の切断末端および未切断ＤＮＡを除去した。得られた１５０ｂｐ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ　ｓｐｉｎカラムで再度精製した。ファージミドｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）をＳｆｉＩおよびＮｏｔＩで消化して、次いでホスファターゼ処理した。消化したＤＮＡを１％アガロースゲル、次いでＱＩＡＥＸ　ＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して精製した。ベクターおよび挿入断片を１５℃で一晩連結させた。連結した産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ　ｓｐｉｎカラム（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。エレクトロポレーションは、ＤＮＡ　１２．５μｇおよびＴＧ１エレクトロコンピテント細胞　５００μｌを含有するエレクトロポレーション用容器（幅０．１ｍｍ、容量０．５ｍｌ）内で、１５００ｖで実施した（以下参照）。パルス直後、グルコース２％を含有する予め加温した（４０℃）２ｘＹＴ培地　１２．５ｍｌを添加して、形質転換体を３７℃で１時間増殖させた。形質転換細胞を収集し、量を測定して、１００ｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２ｘＹＴ−Ｇ（２ｘＹＴ−ＡＧ）プレートに一部を播種し、形質転換体の総数を測定した。
【０１３３】
無作為に選択したクローンの配列分析によって、全クローンの５４％がインフレームであることが示された（Ｍａｎｄｅｃｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７）。図１６に示したように、ＦＬＡＧ配列（Ｈｏｐｐ　ｅｔ　ａｌ．，１９８８）を免疫アフィニティータグとしてライブラリーに取り込ませた。
【０１３４】
２０マーペプチドを発現する他のファージライブラリーを同様の操作によって作製した。ライブラリーの多様性は、異なるクローンが１．１ｘ１０１１である。
【０１３５】
Ｂ．エレクトロコンピテント細胞の調製
エレクトロコンピテント細胞を調製するために、一晩培養したＥ．ｃｏｌｉ　ＴＧ１細胞（Ｆ′＿ｔｒａＤ３６　ｌａｃｌｑ　Δ（ｌａｃＺ）Ｍ１５　ｐｒｏＡＢ／ｓｕｐＥ　Δ（ｈｓｄＭ−ｍｃｒＢ）５ｒｋ −ｍｋ −　ＭｃｒＢ−）ｔｈｉΔ（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）を２ｘＹＴ　５００ｍｌ中でＯＤ６００＝０．０５〜０．１まで希釈し、次いで４リットルのＥｈｒｌｅｎｍｙｅｒフラスコ内において、３７℃でＯＤ６００＝０．５〜０．６まで増殖させた。予め冷却した遠心瓶に培養物を注ぎ、氷上で３０分インキュベートしてから２０００ｘｇで３０分間（２℃）遠心した。上清を廃棄し、氷冷した滅菌蒸留水計４００ｍｌ中に細胞ペレットを再懸濁した。遠心および再懸濁の工程を２回繰り返した。最後の遠心を行ってから、グリセロール１０％を含有する全量２５ｍｌの氷冷水にペレットを再懸濁した。細胞懸濁物を予め冷却した３５ｍｌの遠心瓶に移し、次いで４℃で２０００ｘｇ、１０分間でペレットにした。次に、この細胞を同じ１０％のグリセロール溶液０．３ｍｌに懸濁して、小さな管に分取し、ドライアイス上で迅速に凍結した。この分取試料を−８０℃で保存した。
【０１３６】
ライブラリーを増幅するために、形質転換体を４Ｌの２ｘＹＴ−ＡＧ培地に接種して、Ａ６００が約４００倍に増加するまで増殖させた。この細胞を３０００ｘｇで２０分間遠心してペレットにした後、最終濃度８％になるまでグリセロールを添加した４０ｍｌの２ｘＹＴ−ＡＧ培地に再懸濁した。このライブラリーを−８０℃で保存した。
【０１３７】
Ｃ．ファージレスキュー
このプロセスは、標準的なファージ調製法に以下の変更を加えたプロトコールを用いて実施した。５個の組換え細胞ライブラリー（総多様性＝１．６ｘ１０１０）を一緒にして、２ｘＹＴ−ＡＧ中において３０℃で振盪しながら（２５０ｒｐｍ）ＯＤ６００＝０．５になるまで増殖させた。次いで、ヘルパーファージ（Ｍ１３Ｋ０７）を添加して（感染効率（ＭＯＩ）＝１５）、振盪せずに３７℃で３０分、次いで振盪しながら（２５０ｒｐｍ）３７℃で３０分間、細胞をインキュベートした。感染後、細胞をペレットにして、ヘルパーファージを含有する上清を廃棄した。カナマイシン　５０ｍｇ／ｍｌを含有する最初の培養量の２ｘＹＴ−Ａ（グルコース無し）中にこの細胞ペレットを再懸濁して、振盪させながら（２５０ｒｐｍ）３０℃で一晩増殖させた。一晩培養した細胞を４℃で３０００ｘｇ、３０分間でペレットにして、ファージを含有する上清を回収した。この溶液を４％　ＰＥＧ、ＮａＣｌ　５００ｍＭに調整し、氷上で１時間冷却した。沈殿したファージを１０，０００ｘｇで３０分間遠心してペレットにして、次いでリン酸緩衝生理食塩水（最初の培養量の１／１００）に再懸濁して、０．４５μｍのフィルターに通した。このファージをＴＧ１細胞に感染させて力価を測定した。４０マーペプチドライブラリーのファージ力価は４ｘ１０１３ｃｆｕ／ｍｌであった。２０マーライブラリーのファージ力価は３ｘ１０−３であった。
【０１３８】
ライブラリーを増幅するために、４Ｌの２ｘＹＴ−ＡＧ培地中に形質転換体を接種して、ＯＤ６００が約４００倍に増加するまで増殖させた。３０００ｘｇで２０分間遠心することによって細胞をペレットにして、次いでグリセロールを最終濃度８％になるまで添加した４０ｍＬの２ｘＹＴ−ＡＧ培地に再懸濁した。このライブラリーを−８０℃で保存した。
【０１３９】
例２：
Ａ．ＩＧＦ−１Ｒのパニング
標準的方法を使用して、全てのマイクロタイタープレートをコーティングしてブロッキングした。１ｍｇ／ｍＬになるように、可溶性ＩＧＦ−１Ｒ（「ｓＩＧＦ−１Ｒ」）を５０ｍＭの炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．５で希釈した。この溶液１００マイクロリットルを９６ウェルマイクロタイタープレート（ＮａｘｉＳｏｒｐプレート、Ｎｕｎｃ）の適切な数のウェルに添加し、４℃で一晩インキュベートした。次いで、ＭＰＢＳ（２％のカーネーション（登録商標）脱脂ドライミルクを含有したＰＢＳ緩衝液　ｐＨ７．５）を用いて、ウェルを室温（ＲＴ）で１時間ブロックした。
【０１４０】
パニング各回毎に８個のウェルを使用した。ファージをＭＰＢＳとともにＲＴで３０分間インキュベートして、その後各ウェルに１００μｌずつ添加した。１回目に投入したファージの力価は４ｘ１０１３ｃｆｕ／ｍｌであった。２回目および３回目に投入したファージの力価は約１０１１ｃｆｕ／ｍｌであった。ファージをＲＴで２から３時間結合させた。次いでウェルを素早く２００μｌ／ウェルのＭＰＢＳで１３回洗浄した。結合したファージは、１００μｌ／ウェルの２０ｍＭ　グリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．２　で３０秒間インキュベートすることによって溶出した。次いで、得られた溶液をＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０で中和した。対数期のＴＧ１細胞を該溶出ファージに感染させた後、２ｘＹＴ−ＡＧを含有する２４ｃｍｘ２４ｃｍプレートに播種した。該プレートを３０℃で一晩インキュベートした。翌朝、細胞をこすり取って採取し、１０％グリセロール中で−８０℃で保存した。その後のアフィニティー濃縮のために、これらの凍結保存物から細胞を増殖させ、ファージを前述のように調製した。最小でも７２個のクローンを２回目、３回目、および４回目のパニングから無作為に採取して、結合活性をスクリーニングした。クローンのＤＮＡ配列によって、図１８にまとめたように多数の配列が明らかになった。いくつかのクローン（図１９）はフレームシフトしており、すなわち、関連するペプチド配列がＦＬＡＧフレーム内にはコードされておらず、＋１または−１フレームのいずれかにコードされていた。
【０１４１】
Ｂ．ファージのＥＬＩＳＡ分析
ファージプールについて、凍結保存した細胞を増殖させ、ファージを前述のように調製した。個々のクローンを分析するために、コロニーを採取して、前述のようにファージを調製した。次段階は、プールしたファージでもクローニングしたファージでも同様である。前述の通りにマイクロタイターウェルをコーティングしてブロックした。ＩＧＦ−１Ｒか、又は対照ＩｇＧ　ｍＡｂでウェルをコーティングした。ＭＰＢＳに再懸濁したファージを２連のウェルに添加し（１００μＬ／ウェル）、ＲＴで１時間インキュベートした。次いで、このファージ溶液を除去して、室温においてウェルをＰＢＳで３回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼと結合させた抗Ｍ１３抗体（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）をＭＰＢＳで１：３０００に希釈して、各ウェルに添加した（１００μＬ／ウェル）。ＲＴで１時間インキュベートし、次いで前述のようにＰＢＳで洗浄した。ＡＢＴＳ溶液を添加することによって（１００μＬ／ウェル、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）発色させた。各ウェルを０．５％のＳＤＳに調節することによって、発色を停止させた。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ　３４０プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ　Ｃｏｒｐ．、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ　ＣＡ）およびＳｏｆｔＭａｘ　Ｐｒｏソフトウェアを使用して、プレートを４０５ｎｍで分析した。適切なブランクを差し引いた後、データ点を平均化した。ウェルのＡ４０５がバックグランドの２倍以上であれば、クローンを「陽性」と見なした。
【０１４２】
競合ＥＬＩＳＡでＩＣ５０を測定するために、マイクロタイタープレートを前述のようにＩＧＦ−１Ｒでコーティングしてブロックした。ファージは前述のように調製した。ファージをプレートに添加する前に、ペプチドまたは組換えられた様々な抗体または断片（「ｒＶａｂ」）、または適切な対照をＰＢＳで希釈して、２連のウェルに添加した（１００μＬ／ウェル）。ＲＴで１時間インキュベートした後、ペプチドまたはｒＶａｂ溶液を除去せずに、調製した前記ファージを各ウェルに添加した（１００μＬ／ウェル）。ＲＴで１時間インキュベートした後、ウェルを洗浄して、前述のように発色させた。
【０１４３】
次に、受容体活性部位に対するクローンの結合性を分析した（図２０Ａおよび図２０Ｂ）。ファージ結合の競合はコグネイトリガンド（すなわち、ＩＧＦ−１）を用いて行った。固定したＩＧＦ−１Ｒへのクローンの結合はＩＧＦ−１で阻害することができたので、試験した４種のファージクローン全て（Ｂ６、Ｆ６、Ｃ６、およびＥ５）がＩＧＦ−１と同一の部位に結合した。
【０１４４】
ファージペプチドの序列を決定するために、化学的アミノ結合法および製造元推奨のプロトコールを使用してヒトＩＧＦ−１Ｒ（２５ｍｇ／ｍＬ）をＣＭ−５（ＢＩＡｃｏｒｅ）センサーチップに固定した。最終表面密度は１０００ＲＵであった。対照表面として、モノクローナル抗体を他のフローセル上に固定した。１μＬ／分の緩衝液流速でファージを直接注入した（３０〜１００μｌ）。さらに分析する前に、対照表面へのバックグランド結合を差し引いた。
【０１４５】
Ｃ．ファージ配列分析
いくつかのクローンの配列を分析すると、クラス１（式モチーフ２）およびクラスＩＩ（式モチーフ１、図２１）と称する２個の異なる集団が存在することが示される。これらのいくつかを、その後の試験のために化学的に合成した。クラスＩのペプチドはコンセンサス配列Ｄ−ｘ−Ｆ−Ｙ−ｘ−ｘ−Ｌ−ｓ−ｘ−Ｌを含有し、細胞をベースとしたアッセイで拮抗作用を示すことが示されている（図２２）。クラスＩＩペプチドはコンセンサスＮ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｗ−Ｆ−Ｖを含有し、細胞をベースとしたアッセイではアゴニスト作用を示すことが示されている（図２３）。これらのコンセンサス配列中の連続する３又は４以上のアミノ酸は何れも、成熟ＩＧＦ−１と有意な配列類似性を有していない。
【０１４６】
例３：合成ペプチドのアッセイ
４種の合成ペプチド、５．１、５．２、５．３および５．４（図２１）を作製して、ファージディスプレイ法によって人工ペプチドリガンドの特性を調べた。
【０１４７】
合成ペプチドは、市販の業者（Ａｎａｓｐｅｃ）から入手した。ＨＰＬＣによって９０％を越える純度のペプチドを入手した。質量分析によって測定したペプチドの分子量は、予測値と一致した。
【０１４８】
化学的アミン結合法および製造元推奨のプロトコールを使用して、ＩＧＦ−１Ｒ（１００μｇ／ｍＬ）をＣＭ−５センサーチップ（Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ）のフローセルに固定した。対照表面として、関係のないＩｇＧを同様の方法で同チップの他のフローセルに固定した。合成ペプチドの濃度を増加させて両表面に注入し、結合応答が平衡に達するようにした。対照表面のバックグラウンド結合を差し引いた後、ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析を使用して平衡解離定数を得るために、該結果を用いた（図２４Ａ）。
【０１４９】
別の実験では、ＩＧＦ−１Ｒ（１００μｇ／ｍＬ）を前述のようにＣＭ−５センサーチップに固定し、同様の方法で、無関係なＩｇＧを同じチップの他のフローセルに固定した。ＩＧＦ−１単独、ペプチド５．１単独（Ｂ６ファージクローンに対応）、または２種の異なる混合物を誘導体化したチップ表面に注入した。図２４Ｂに示した結果によって、５．１ペプチドはＩＧＦ−１の結合を阻害し、この阻害はペプチドの量を増加させることよって増加することが示された。得られた結果によって、ＩＧＦ−１Ｒ上のペプチド５．１結合部位とＩＧＦ−１結合部位が重なっているという考えが支持される。
【０１５０】
例４：二次ファージライブラリーの作製
細胞をベースとしたアッセイにおいてアゴニスト特性を有することが知られるクラスＩＩ結合剤の配列に基づいて、２種類のファージライブラリーを設計した。ペプチドを受容体結合アッセイに使用したり、細胞をベースとした活性のアッセイで試験したりできる範囲に親和性を高めることが最終目標である。利用可能ないくつかの変異誘発法のうち、本発明者らは遺伝子合成およびファージディスプレイに基づいた方法を選択した。この方法では、単一のＤＮＡ分子内にいくつかの変異を有するドープ化オリゴヌクレオチドのライブラリーを使用して変異遺伝子のプールを得、その発現産物をファージディスプレイする。
【０１５１】
Ａ．ファージライブラリーＡ６Ｌ
使用したアプローチは、このペプチドの配列をコードするオリゴヌクレオチドのドープ化合成であった。ペプチドをコードする配列および作製した合成オリゴヌクレオチドの配列を図２５Ａ〜２５Ｂに示してある。コンセンサス配列に属するアミノ酸残基は一定に保ち、変異しなかった。各縮合物におけるヌクレオシドの比は、ＤＮＡレベルではヌクレオチド配列の変化が平均６個で、ペプチド全域にわたるアミノ酸レベルでは変異が４〜５個となるように選択した。ＦＬＡＧ、ＳｆｉＩおよびＮｏｔＩ部位に対応する領域は変異しなかった。
【０１５２】
図２５Ａに示したように、Ａ６ペプチドをコードするＤＮＡ配列は、全体で２４個のヌクレオチドを置換することによって、Ｅ．ｃｏｌｉが使用するコドンに最も適するようにした。（使用したＴＧ１　Ｅ．ｃｏｌｉ株では抑制されている）ＴＡＧ停止コドンをＣＡＧ（グルタミン）に置換した。次いで、コンセンサスなＮＦＹＤＷＦＶを除くＡ６ペプチドのコード領域に対応する位置にドープ化ヌクレオシドが導入されるように、オリゴヌクレオチド配列を設計した（図２５Ａ）。次に、この合成オリゴヌクレオチド（図２５Ｂ）をＰＣＲ反応の鋳型として使用した。次に、該ＰＣＲ反応の産物を精製して、ＳｆｉＩおよびＮｏｔＩ制限酵素で切断して、最初のペプチドライブラリーで説明したようにｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅベクターにクローニングした。最終ライブラリーでは１０１０以上の異なるクローンが得られた。
【０１５３】
Ｂ．ファージライブラリーＡ６Ｓ
図２６Ａに示したように、コンセンサス配列ＮＦＹＤＷＦＶはＡ６Ｓライブラリー中で一定に保ったが、隣接する領域はランダム化した。ランダム領域中のコドンは、停止コドンの頻度を減少させるために、ＮＮＫ型（Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴ、Ｋ＝ＧまたはＴ）とした。作製した合成オリゴヌクレオチドの配列を図２６Ｂに挙げる。次に、この合成オリゴヌクレオチドをＰＣＲ反応の鋳型として使用した。続いて、このＰＣＲ反応の産物を精製して、ＳｆｉＩおよびＮｏｔＩ制限酵素で切断して、最初のペプチドライブラリーで説明したようにｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅベクターにクローニングした。最終ライブラリーでは１０９以上の異なるクローンが得られた。
【０１５４】
Ｃ．クローンＨ５をベースとした二次ファージライブラリー
独立した実験において、ペプチドＨ５（ＬＣＱＲＬＧＶＧＷＰＧＷＬＳＧＷＣＡ）は、ラット成長ホルモン結合タンパク質への結合剤として同定された。このペプチドおよび２Ｃ３−６０（図２７）を含むその他のＨ５−様ペプチド４種は、細胞培養実験でＩＧＦ−１Ｒ＋細胞に対してはアゴニスト活性を有するが、ＩＧＦ−１Ｒ−細胞に対しては有さないことがわかった。さらに、その後のインビトロでの実験で、Ｈ５様ペプチドはＩＧＦと競合しないことが示された。このことは、これらのペプチドがＩＧＦ−１Ｒ上の第２のアロステリックな部位を認識することを示唆している。ビアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）分析によって、２Ｃ３−６０ペプチドのＩＧＦ−１Ｒへの結合は、約２０μＭであることが示された。その後、Ｈ５配列の変異種のファージライブラリーを作製して、ＩＧＦ−１Ｒに対するパニングのために使用した。
【０１５５】
突然変異を導入するための遺伝子合成およびファージディスプレイを使用して、Ｈ５二次ライブラリーを作製した。この方法では、単一のＤＮＡ分子内にいくつかの変異を有するドープ化オリゴヌクレオチドのライブラリーを使用して、ファージディスプレイした変異遺伝子のプールを得る。この方法によって、非常に大きなライブラリー（＞１０１０）中に、対照として最初の５Ｈペプチドをコードするとともに、ペプチド当たり多数の変異を含有するバージョンをともにコードすることが可能になった。
【０１５６】
したがって、Ｈ５二次変異体ライブラリーは、ペプチド当たり平均４個のアミノ酸変化（変異）を含有するように設計された。４個の変異を有する変異Ｈ５ペプチド配列候補の数は、１．０ｘ１０１０であり、二次ファージライブラリーの実際の大きさと同等である。配列分析によって、これらのペプチドの３０％は３−４個の変異、３３％は１−２個の変異、３２％は５−６個の変異を有することが示されている。また、７−８個の変異を有するものの割合は小さく、変異を有さないクローンは５％であった。
【０１５７】
Ｈ５ペプチドをコードするＤＮＡ配列に基づいたオリゴヌクレオチドを合成した。このオリゴヌクレオチドの配列は、５′−ＣＴＡＣＡＡＡＧＡＣＣＴＧＴＧＴＴＡＧＡＧＴＴＴＧＧＧＧＧＴＴＡＣＧＴＡＴＣＣＧＧＧＴＴＧＧＴＴＧＧＣＧＧＧＧＴＧＧＴＧＴＧＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＴＧＴＧＡ−３′である。
【０１５８】
下線を引いた位置の塩基は、以下の４種ヌクレオシドの混合物として合成した。
【０１５９】
Ａ＝９０％　Ａ；３．３％　Ｃ；３．３％　Ｇ；および３．３％　Ｔ
Ｃ＝３．３％　Ｃ；９０％　Ｃ；３．３％　Ｇ；および３．３％　Ｔ
Ｇ＝３．３％　Ｃ；３．３％　Ｃ；９０％　Ｇ；および３．３％　Ｔ
Ｔ＝３．３％　Ｃ；３．３％　Ｃ；３．３％　Ｇ；および９０％　Ｔ
鋳型としてこのオリゴヌクレオチドを使用し、Ｈ５二次ライブラリーを作製して、エレクトロポレーションし、増幅して、ほぼ最初のペプチドライブラリーで説明したとおりにレスキューした。この二次ライブラリーの最終的多様性は約１０１０であった。
【０１６０】
Ｄ．ライブラリーの性質決定
各二次ライブラリー（０回目、パニング前）から無作為に抽出した４８個のクローンをレスキューし、ファージの抗Ｅ−ｔａｇ　ｍＡｂへの結合性、並びにＩＧＦ−１Ｒへの結合性をＥＬＩＳＡでアッセイした（Ｅ−ｔａｇはファージ表面上にディスプレイされるペプチドの発現指標として使用する）。該結果から、２つのライブラリー中のクローンの多く（７０％）がペプチドをディスプレイしているが（すなわち、Ｅ−ｔａｇが陽性）、ファージＥＬＩＳＡによってＩＧＦ−１Ｒに結合するＡ６ロング（Ａ６Ｌ）ライブラリーのクローンは僅か約６％にすぎず、Ａ６ショート（Ａ６Ｓ）ライブラリーで試験した２４個のクローンはいずれもＩＧＲ−１Ｒに結合しないことが示された。このことは、ランダムな変異誘発によって得られる最も一般的な結果は、ＩＧＲ−１Ｒ親和性の損失であることを示唆している。それにもかかわらず、結合特性を維持している変異体もいくつかあり、親和性が強まったものもある（以下参照）。
【０１６１】
Ｅ．二次ライブラリーによるパニング
例４の２種の二次ライブラリーをＩＧＦ−１Ｒに対するパニング実験に使用した。４回のパニングそれぞれについて約５０個のクローンをファージＥＬＩＳＡで分析して、受容体に結合するクローンを同定した。陽性クローンのＤＮＡ配列決定を行い、タンパク質配列の比較を行った。図２８は、Ａ６Ｓライブラリーのパニングによって得られた様々な配列のリストである。この結果は、様々なファージペプチド配列がＩＧＦ−１Ｒに結合可能であり、コンセンサス配列ＮＦＹＤＷＦＶが大多数の例に保存されていることを示している。
【０１６２】
Ｈ５二次ファージライブラリーをＩＧＦ−１Ｒに対してパニングして、ＩＧＦ−１Ｒに対して高い親和性を有するＨ５様ペプチドを発見した。
【０１６３】
Ｈ５ライブラリーは、ファージ力価１．０ｘ１０３ファージ　ｍｌ−１を有する約２．６ｘ１０１０個の多様性を有する。パニングは全部で３回実施した。表２は、３回のパニングの結果をまとめた表であり、各回毎に選択された個々のクローンに対するＥＬＩＳＡの結果、各回のパニングで調べたクローン数、およびＥ−Ｔａｇ＋クローンおよびＩＧＦ−１Ｒ＋クローンの数およびパーセントを示している。
【０１６４】
【表２】
Figure 2004512010
高いＥ−Ｔａｇ値を有する１５個のＩＧＦ−１Ｒ−クローン（吸光度＞１．０）のように、各ＩＧＦ−１Ｒ＋クローンを配列決定した。これらの配列は図２９に示してある。結合配列全てが常に６位にＧｌｙを有すること以外は、結合配列と非結合配列との間には差は認められない。配列は全て、結合配列および非結合配列とも、常に３位にＴＡＧ停止コドンを有している（ファージ産生に使用したＥ．ｃｏｌｉ株はｓｕｐＥ４４変異を含んでおり、したがってＧｌｎはＴＡＧに置換され、図２９ではＱと表記されている）。このことは、ＴＡＧ停止コドンはファージ産生には必要であるが、結合には必要ないことを示唆している。
【０１６５】
例５：ｒＶａｂの作製
組換え抗体可変領域ライブラリー
１本鎖抗体の設計、発現および精製は概説されている（Ｒａｄｅｒ　ａｎｄ　Ｂａｒｂａｓ、１９９７；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ、１９９７）。簡単に言うと、重鎖（ＶＨ）の可変部分をフレキシブルなペプチドリンカーによって軽鎖（ＶＬ）の可変部分に結合する。組換え可変領域抗体（ｒＶａｂ）のライブラリーに必要な多様性のいくつかを与えるために、ＶＨおよびＶＬ遺伝子のランダムな組み合わせを遺伝学的手法で結合させることができる（図３０）。本発明のライブラリーでは、ＶＨＣＤＲ３を含む６〜１２個のアミノ酸（図３０において「Ｄ」として示している）を完全にランダム化することによってさらに多様性を高めている。
【０１６６】
全部で４９個のヒトゲノムＶｈ遺伝子および１０個のヒトゲノムＶｌ遺伝子（図３１）をＰＣＲによってヒトゲノムＤＮＡ全体から単離した。ライブラリーのその他の遺伝子成分（Ｖｈ、ＣＤＲ３、ｊｈ、リンカー、およびｊｌ）は、合成オリゴヌクレオチドから得た。これらの成分の組み立ては、図３２および図３３に概略したようにディレクショナルクローニング（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ　ｃｌｏｎｉｎｇ）を使用して行った。
【０１６７】
Ａ．連結
ｒＶａｂライブラリー（「ＧＲＡＢＬＩＢ（商標）」）の組み立ての概略図を図３０に示す。４個の遺伝子断片（ＶＨ、ＶＨＣＤＲ３／ＪＨ／リンカー、ＶＬおよびＪＬ）を適切な方向に連結して、ｐＣＡＮＴＡＢ　５Ｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にクローニングした。ディレクショナルクローニングは、ＢｓｒＤＩ制限酵素を使用して実施した（図３２）。ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、ヒトＶＨおよびＶＬレパートリーから多くの遺伝子をコードする４９個の生殖細胞ＶＨセグメントおよび１０個のＶＬセグメントを単離した（図３１）。ＶＨ　ＣＤＲ３（６から１２個のアミノ酸）／ＪＨ／リンカー断片は、４個のオリゴヌクレオチド（ＷＭ２．１、２．２、２．３および２．４）を連結することによって作製し、既にＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによって切断されたプラスミドｐＵＣ１８中に得られた断片をクローニングした。次いで、ＰＣＲおよびオリゴヌクレオチドプライマーを使用して挿入部分を増幅して、ランダム配列およびＢｓｒＤＩ制限部位を有する６個から１２個のアミノ酸の合成Ｄセグメントを導入した。２個の合成オリゴヌクレオチドをアニーリングした結果、ＪＬ遺伝子断片が構築された。この構築断片（２００ｎｇ）を鋳型として、これより短い２個のオリゴヌクレオチドプライマーと共に（両方とも５′末端をビオチン化した）ＰＣＲ増幅に使用した。得られた８００ｂｐ産物を精製して、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　ｓｐｉｎカラム（ＱＩＡＧＥＮ）で濃縮して、次いでＳｆｉＩおよびＮｏｔＩ制限酵素で消化した。ストレプトアビジン−アガロース（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を消化混合物に添加して、ＰＣＲ産物の切断末端並びに全ての未切断ＤＮＡを除去した。得られた８００ｂｐ断片は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　ｓｐｉｎカラムにＤＮＡを通すことによって精製した。
【０１６８】
ファージミドｐＣＡＮＴＡＢ　５Ｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）をＳｆｉＩおよびＮｏｔＩ制限酵素で消化して、次にアルカリホスファターゼ処理して生成した制限断片の末端を脱リン酸化した。消化したプラスミドＤＮＡを１％アガロースゲルに通し、次いでＱＩＡＥＸ　ＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ）カラムを使用してＤＮＡ精製することによって、消化したＤＮＡを精製した。ベクターと挿入ＤＮＡを１６℃で一晩連結させた。連結した産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ　ｓｐｉｎカラム（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製し、エレクトロポレーション用キュベット（幅０．１ｍｍ、容量０．５ｍｌ、ＢＴＸ、Ｉｎｃ．）中にて、１５００ｖでエレクトロポレーションを実施した。エレクトロポレーション１回のＤＮＡ量はＴＧ１エレクトロコンピテント細胞５００μｌ当たり１２．５μｇであった。パルス直後に、２％グルコースを含有する予め加温した（４０℃）１２．５ｍＬの２ｘＹＴ培地（２ｘＹＴ−Ｇ）を添加し、形質転換体を３７℃で１時間増殖させた。形質転換体をプールし、量を測定し、アンピシリン１００μｇ／ｍＬを含有する２ｘＹＴ−Ｇ培地（２ｘＹＴ−ＡＧ）プレートに一部を播種し、形質転換体の総数を測定した。異なる形質転換体の数およびライブラリーの多様性は３ｘ１０１０であった。
【０１６９】
エレクトロコンピテント細胞の調製、ファージライブラリーの増幅、ライブラリーファージレスキュー、ファージ調製およびマイクロタイタープレートのコーティングは、前記のペプチドライブラリーで説明した通りに行った。
【０１７０】
Ｂ．ｒＶａｂ抗体ライブラリーによるＩＧＲ−１Ｒ結合剤のパニング
１．パニング法
抗体ライブラリーのパニングは、ほぼペプチドライブラリーで説明した通りに全部で４回実施した。試験したクローン２００個のうち、約１０％がｓＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合した。これらの特異的結合剤の中でも、４０％はＩＧＦ−１と競合して受容体に結合することができる。クローンの分析およびＤＮＡ配列決定（図３１〜３９）、その後のＥＬＩＳＡおよび細胞をベースとしたアッセイ（図４０〜４６）によって、２個のクローン、４３Ｇ７およびＭ１００が、約２０ｎＭのＥＤ５０値でアゴニスト作用をすることが示された（４３Ｇ７抗体のプロットを図４１に示す）。２個の他のｒＶａｂ、１Ｇ２Ｐおよび３９Ｆ７は、約２０ｎＭのＩＣ５０値でアンタゴニスト作用をすることが示された（図４２）。
【０１７１】
前述のようにＩＧＦ−１Ｒでマイクロタイターウェルをコーティングして、各回のパニングにつき８個のウェルを使用した。ＭＰＢＳととともにファージをＲＴで３０分間インキュベートした後、１００μＬのファージ懸濁液を各ウェルに添加した。第１回目の投入ファージの力価は８ｘ１０１３ｃｆｕ／ｍＬであった。２回目および３回目の投入ファージの力価は約１０１１ｃｆｕ／ｍＬであった。ファージはＲＴで２乃至３時間結合させた。次いで、２００μｌ／ウェルのＭＰＢＳでウェルを迅速に１３回洗浄した。結合したファージは、１００μＬ／ウェルの２０ｍＭ　グリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．２とともに３０秒間インキュベートすることによって溶出した。次に、得られた溶液をＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０で中和した。対数期のＴＧ１細胞に溶出したファージを感染させ、次いで２ＸＹＴ−ＡＧを含有する２枚の４ｃｍｘ４ｃｍプレート上に播種した。これらのプレートを３０℃で一晩インキュベートした。翌朝、細胞を掻き取って採取し、１０％グリセロール中で−８０℃で保存した。これに続くアフィニティー濃縮のラウンドでは、これらの凍結保存物から細胞を増殖させ、前述のようにファージを調製した。
【０１７２】
２．ファージプールのＥｌｉｓａ分析
ファージプールを調製するために、凍結保存物の細胞を増殖させ、前述のようにファージを調製した。マイクロタイターウェルを前述のようにコーティングして、ブロックした。ＩＧＦ−１Ｒ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．）または対照ＢＳＡのうち何れかでウェルをコーティングした。ＭＰＢＳに再懸濁したファージを２連のウェルに添加し（１００μＬ／ウェル）、ＲＴで１時間インキュベートした。次いでファージ溶液を除去して、ＰＢＳを用い、ＲＴでこのウェルを３回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼを抱合した抗Ｍ１３抗体（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）をＭＰＢＳで１：３０００に希釈して、各ウェルに添加した（１００μＬ／ウェル）。ＲＴで１時間インキュベートして、次いで説明したようにＰＢＳで洗浄した。ＡＢＴＳ溶液を添加することよって（１００μＬ／ウェル、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）、発色させた。発色は各ウェルを０．５％ＳＤＳに調節することによって停止させた。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ　３４０プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ）およびＳｏｆｔＭａｘ　Ｐｒｏソフトウェアを使用して、プレートを４０５ｎｍで分析した。適切なブランクを差し引いた後に、データ点を平均した。ウェルのＡ４０５がバックグランドの２倍超であれば、ファージプールを「陽性」と見なした。
【０１７３】
３．競合ＥＬＩＳＡ
ＩＣ５０を測定するために、マイクロタイタープレートを前述のようにＩＧＦ−１Ｒでコーティングしてブロックした。ファージおよび可溶性ｒＶａｂは前述のように調製した。ファージまたは可溶性ｒＶａｂをプレートに添加する前に、ＩＧＦ−１のＰＢＳ溶液（１μｇ／ｍＬ）を２連のウェルに添加した（１００μＬ／ウェル）。ＲＴで１時間インキュベートした後、ＩＧＦ−１溶液を除去せずに、調製したファージを各ウェルに添加した（１００μＬ／ウェル）。ＲＴで１時間インキュベート後、ウェルを洗浄して、前述のように発色させた。
【０１７４】
６個のｒＶａｂクローンがＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合した。これらのクローンの配列を図３４〜３９に示す。
【０１７５】
４．可溶性ｒＶａｂの発現および精製
ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅプラスミド（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上にｒＶａｂ遺伝子を有するＥ．ｃｏｌｉ　ＨＢ２１５１を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンおよび１％グルコースを補充した２ｘＹＴ中、３７℃で一晩増殖させた後、グルコース無しでＯＤ６００、０．１で継代培養し、ＯＤ６００が１．０になるまで２１℃で増殖させた。発現はＩＰＴＧを１ｍＭまで添加することによって誘導し、細胞を３０℃で１６時間増殖させた。細胞と培養上清を遠心によって分離し、細胞ペレットおよび上清の試料を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析し、次いでマウスモノクローナル抗体抗Ｅ−Ｔａｇ−ＨＲＰ抱合体（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いてウェスタンブロット分析を行い、発現産物を視覚化した。発現したｒＶａｂを硫酸アンモニウムで２１℃で沈殿させることによって（７０％飽和になるまで添加）上清から精製した後、１０，０００ｇで１５分間遠心した。水相を廃棄し、ペレットを再懸濁して、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）に対して４℃で一晩透析した。１００００ｇで遠心することによって不溶性物質を除去して、上清を０．２２μｍの膜で濾過して、抗Ｅ−Ｔａｇ抗体アフィニティカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で精製した。アフィニティ樹脂をＴＢＳ（０．０２５Ｍ　Ｔｒｉｓ−緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）で平衡化し、結合したタンパク質を溶出緩衝液（１００ｍＭ　グリシン、ｐＨ３．０）で溶出した。ｒＶａｂを１ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、ＴＢＳに対して透析して、４℃で保存した。アフィニティ精製物質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット分析およびＮ末端配列分析は標準的なプロトコールに従って実施した。
【０１７６】
５．サイズ排除ＦＰＬＣクロマトグラフィ
アフィニティ精製ｒＶａｂをＳｕｐｅｒｄｅｘ　７５　ＨＲ１０／３０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のサイズ排除ＦＰＬＣによって分画して、ｒＶａｂの分子サイズおよび凝集状態を測定した。カラムの較正のためには、高分子量および低分子量ゲル濾過キャリブレーションキット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用した。分子量３０ｋＤａに対応するいくつかのクロマトグラフィ分離から得られた画分をプールし、アミコンＸＭ１０膜を使用して０．７〜１．０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用して、タンパク質濃度を測定した。
【０１７７】
６．ビアコア分析
ＩＧＦ−１Ｒを化学的アミン結合法および製造者推薦のプロトコールを使用してＣＭ−５センサーチップ（Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ）の１つのフローセルに固定した。対照表面として、ＢＳＡを同チップの別のフローセルに同方法で固定した。アフィニティ精製ｒＶａｂの濃度を増加させて両表面に注入し、結合応答を平衡に至らせた。バックグラウンド結合を（対照表面から）差し引いた後、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析を使用して平衡解離定数を求めた。
【０１７８】
７．時間分解蛍光アッセイ
ＩＧＦ−１と置換する有機小分子の不均質スクリーニングのベースとして、本発明者らは、インビトロの競合的受容体結合アッセイの基本的なフォーマットを選択した。このアッセイでは、ビオチン化したペプチド（ｂＰ）を結合したストレプトアビジン標識ユーロピウム（ｓａＥｕ）を用いた時間分解蛍光検出（ＴＲＦＤ）によって、ＩＧＦ−１受容体の活性部位の占有を測定した。該アッセイでは、ｓａＥｕはｂＰおよびＩＧＦ−１受容体と３元複合体を形成する（すなわち、ＩＧＦ−１Ｒ：ｂＰ：ｓａＥｕ複合体）。ＴＲＦＤアッセイは、十分に確立され、感度も高く、定量的である（Ｔｏｍｐｋｉｎｓ　ｅｔ　ａｌ．，１９９３）。４３Ｇ７　ｒＶａｂ又はビオチン化ペプチドを使用してアッセイを実施する。さらに、両アッセイフォーマットは、ＩＧＦ−１Ｒの活性部位に対するビオチン化リガンドとＩＧＦ−１との結合の競合を正確に表すことが示された。
【０１７９】
これらのアッセイでは、可溶性ＩＧＦ−１受容体をマイクロタイタープレートウェルの表面にコーティングして、ミルクおよびＢＳＡを含有したＰＢＳでブロックして、次いでビオチン化ペプチドまたはｒＶａｂとともにインキュベートする。次いで未結合ｂＰを洗浄して、ｓａＥｕを添加して受容体−結合ｂＰと複合体を形成させる。酸性増強溶液を添加すると、結合したユーロピウムが遊離Ｅｕ＋３として放出され、強い蛍光性を有する安定な複合体を前記増強溶液の成分と迅速に形成する。次に、ＩＧＦ−１Ｒ：ｂＰ結合ｓａＥｕを強い蛍光状態に変換し、ＴＲＦＤによって検出する。
【０１８０】
ａ．［Ｅｕ ３＋ ］標識ｒＶａｂ　４３Ｇ７の調製
３００ｎｍｏｌのＥｕ３＋−キレート化Ｎ１（Ｐ−イソチオシアナトベンジル）−ジエチレントリアミン−Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３−四酢酸（Ｗａｌｌａｃ）に、１ｍｇのｒＶａｂ　４３Ｇ７（配列は図３４に示してある）を添加した。この反応はｐＨ８．５で実施した。この試験管をゆっくり混合して、周囲温度に静置した。反応が完了したとき（１６時間）、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）、ｐＨ７．５で該試料を１０倍に希釈し、ＰＤ−１０カラムを用いて、非標識ｒＶａｂおよび遊離−Ｅｕ３＋から標識ｒＶａｂを分離した。タンパク質濃度および標識効率は、ユーロピウム標準溶液（Ｗａｌｌａｃ）を使用して測定した。
【０１８１】
ｂ．アッセイ方法
低蛍光ＭａｘｉＳｏｒｐ（Ｎｕｎｃ）プレート（１００μＬ／ウェル）上に、４℃で、ＩＧＦ−１Ｒ（５０ｍＭ　ＮａＨＣＯ３中５μｇ／ｍＬ）を一晩コーティングした。該プレートを２％脱脂ミルクおよび０．０５％ＢＳＡを含有するＰＢＳでＲＴで２時間ブロックして、次にＰＢＳで３回洗浄した。競合ＥＬＩＳＡのために、非標識ＩＧＦ−１の希釈系列（０．１ｎＭ〜１００μＭ）をプレートに添加し（１００μＬ／ウェル）、ＲＴで１〜２時間インキュベートした。ＷａｌｌａｃのＤＥＬＦＩＡアッセイ緩衝液（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、ＮａＣｌ　１５０ｍＭ、０．５％　ＢＳＡ、０．０５％　ウシＩｇ、０．０５％　ＮａＮ３、０．０１％　Ｔｗｅｅｎ−２０）中の［Ｅｕ３＋］ｒＶａｂ　４３Ｇ７　１００μＬを添加して、ＲＴで１．５時間インキュベートした。次いで、該プレートをＴＴＢＳ（Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＴＢＳ緩衝液、Ｗａｌｌａｃ）で５回洗浄し、たたいて乾燥させた。その後、１００μＬのＤＥＬＦＩＡ増強溶液（１００ｍＭ　アセトン−フタル酸水素カリウム、ｐＨ３．２、１５ｍＭ　２−ナフチルトリフルオロアセテート、５０ｍＭ　トリ（ｎ−オクチル）−ホスフィンオキシド、０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００）を各ウェルに添加して、該プレートをＲＴで１０分間振盪した。各試料ウェルの蛍光をＤＥＬＦＩＡ１２３４蛍光計（ＥＧ＆Ｇ　Ｗａｌｌａｃ）を使用して６１５ｎｍで測定した。
【０１８２】
ＥｕのＴＲＦＤでの用量応答をマイクロタイターウェルで調べた。０．２ｆｍｏｌから２００ｆｍｏｌの範囲にわたって直線性が検出され、検出限界は０．０５ｆｍｏｌ（バックグラウンドの２倍）であった。Ｅｕのｆｍｏｌ当たり６０１０蛍光単位（ＦＵ）が存在する。ビオチン化したＢＳＡ（ｂＢＳＡ）（６ｍｏｌ　ビオチン／ｍｏｌ　ＢＳＡ）をコーティングしたウェルにＥｕ−ＳＡ（４．７ｍｏｌ　Ｅｕ／ｍｏｌ　ストレプトアビジン）を結合させて検出すると、試験した全範囲で直線である。（４．７ｍｏｌ　Ｅｕ／ｍｏｌ　ＳＡの）ストレプトアビジンＥｕ−ＳＡの特異的蛍光活性は、２８ｋｆｕ／ｆｍｏｌであり、検出限界（すなわち、バックグラウンドの２倍）は０．０３０ｆｍｏｌである。ＩＧＦ−１Ｒでコーティングすると投入２００ｎｇ／ウェルまで直線的なので、その後ウェル当たり約６６０ｎｇ　ｂＩＧＦ−１（ビオチン化ＩＧＦ−１）で飽和するようである。これは、これらのウェルのタンパク質飽和密度に関する製造元の情報（Ｎｕｎｃマニュアル）に基づいた予測量である。これらの研究から、ｂＩＧＦ−１の検出限界（すなわち、バックグラウンドの２倍）は、０．０５ｆｍｏｌのｂＩＧＦ−１であることが示される。ＩＧＦ−１Ｒをコーティングしたウェルに特異的に結合したｂＩＧＦ−１（またはｂペプチド）を検出するこのアッセイフォーマットの性能を測定した。
【０１８３】
８．Ｅｌｉｓａ分析
選択したｒＶａｂに対してＥＬＩＳＡを実施した。図４３に示したように、天然のＩＧＦ−１リガンドがペプチド５．１（該配列はファージクローンＢ６から得られた）の結合を阻害することを発見した。該ペプチドの検出には、Ｅｕ標識ストレプトアビジンによるサンドイッチ構造を必要とした。図４４に示したように、Ｅｕ−標識ｒＶａｂ　４３Ｇ７のＩＧＦ−１Ｒへの結合は、ＩＧＦ−１によってＩＣ５０約２ｎＭで阻害されることが測定された。ビオチン化ペプチド５．１の結合は、ｒＶａｂ　４３Ｇ７によって約１０ｎＭのＩＣ５０で阻害されるので（図４５）、該ペプチドとｒＶａｂは何れも、ＩＧＦ−１Ｒ分子上の同じ部位に結合することを示している。
【０１８４】
図４６Ａ〜４６Ｄは、４３Ｇ７抗体の結合特性を示している。Ｅｕ標識４３Ｇ７抗体の結合は、ペプチド５．１（クローンＢ６）（図４６Ａ）および非標識４３Ｇ７（図４６Ｂ）、並びにｒＶａｂ　３９Ｆ７（図４６Ｃ）およびｒＶａｂ　１Ｇ２Ｐ（図４６Ｄ）と競合する。ｒＶａｂ　１Ｇ２Ｐおよび３９Ｆ７の配列をそれぞれ、図３５および図３６に挙げてある。
【０１８５】
Ｃ．結論
前述の結果によって、ＩＧＦ−１を結合するヒトＩＧＦ−１Ｒ上の部位に親和性を有する薬剤のハイスループットスクリーニングとして、このアッセイ操作を使用できることが支持される。これらの研究によって、ＩＧＦ−１特異的ペプチドは用量依存的に、飽和可能な方法で結合し、受容体の活性部位に結合することが知られている薬剤によって結合が妨害されることが示された。この競合は再現可能で、容易に定量することができる。さらに、自動化可能なＴＲＦＤアッセイは、ＥＬＩＳＡよりもさらに感度が優れている。
【０１８６】
例６：ＩＧＦ−ＩＲ結合ペプチドのアゴニストおよびアンタゴニスト活性
ＩＧＦ−１Ｒを発現しているＦＤＣＰ２細胞（ＮＩＨ）で、ＩＧＦ−１特異的ペプチドのアゴニストおよびアンタゴニスト活性を試験した。該細胞株は、増殖にＩＬ−３またはＩＧＦ−１のいずれかを必要とし、１５％のＦＣＳ（牛胎児血清）を含有するＲＰＭＩ　１６４０培地中に該細胞を維持した。アゴニスト活性のアッセイは、９６ウェルプレート（平底）中、全量１００μＬで実施した。３連のウェル中の１５％　ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ　１６４０（ＩＬ−３なし）培地５０μＬに、３００００細胞／ウェルで細胞を播種した。各ウェルに濃度の異なるＩＧＦ−１、ｒＶａｂまたはペプチドのいずれかを含有する５０μＬの溶液を添加した後、ＣＯ２インキュベータ内で３７℃で４２時間インキュベートした。
【０１８７】
アンタゴニスト活性を測定するアッセイは、９６ウェルプレート中にて１００μＬの全量で実施した。ＩＧＦ−１特異的ペプチド、ｒＶａｂまたは適切な対照を０．００３μＭのヒトＩＧＦ−１を含有するウェルに添加して、ＣＯ２インキュベータの中で、１８時間３７℃でインキュベートした。増殖アッセイはＷＳＴ−１試薬を使用して実施した。生細胞でのみ活性のあるコハク酸−テトラゾリウムレダクターゼ系によって、ＷＳＴ−１テトラゾリウム塩（赤みがかっている）がホルマザン（暗赤色）に切断される。細胞数の増加は、脱水素酵素の総活性の増加をもたらし、その結果４５０ｎｍにおける吸光度がより高くなる。１０μＬのＷＳＴ−１試薬を各ウェルに添加し、該プレートを３７℃で１〜４時間インキュベートした。４５０ｎｍの吸光度によって増殖を測定した。５．３および５．４ペプチドはともに１０μＭの濃度でアゴニスト活性を示した（図２３）。ペプチド５．１および５．２は、３〜３０μＭの濃度範囲で著しいアンタゴニスト活性を示した（図２２）。対照ペプチドは、試験した濃度ではアンタゴニスト活性を示さなかった。
【０１８８】
前述した結果は、化学合成および組換え発現ベクターの構築が、アゴニストおよびアンタゴニスト活性を試験するために（遊離体またはある担体タンパク質との融合体としての）十分な可溶性ペプチドまたはｒＶａｂを作製するために実施可能であることを示している。これらの結果によって、部位特異的競合的結合アッセイ（ＩＧＦ−１Ｒをペアの一方として、ペプチドまたはｒＶａｂを他方として使用することができる）で使用すべきペプチド−受容体対が提供される。各要素の標識、および放射活性または非放射活性標識型の何れかの成分を用いたの形成の検出は、競合的結合アッセイを構築する分野の当業者にとって公知の様々な方法によって可能である。このアッセイによって、ＩＧＦ−１Ｒの活性部位に結合する有機小分子を同定するハイスループットスクリーニングアッセイが提供される。
【０１８９】
例７：ファージライブラリー　Ｂ６−２
このライブラリーは、細胞増殖アッセイでアンタゴニスト活性を有するクラスＩ結合部位１（Ｂ６）の「コア」配列に基づいて設計された。該コア配列は、ＤＰＦＹＨＫＬＳＥＬと決定され、残基Ｆ（位置３、式２のＸ６）、Ｙ（位置４、式２のＸ７に対応する）、Ｌ（位置７、式２のＸ１０に対応する）、およびＬ（位置１０、式２のＸ１３に対応する）は、それらの位置に観察される唯一の残基であった。コア配列とは異なる結合剤、とりわけこれまでに置換が観察されていない位置がコア配列と異なる結合剤が存在する可能性を調べることが、該ライブラリーの目的であった。したがって、ペプチド当たり平均して半数のアミノ酸残基が変更されるように、ドープ化オリゴヌクレオチドからライブラリーを作製した。該ライブラリーは、最初のＢ６ライブラリーで説明したように作製した。すなわち、まずＰＣＲ反応で合成オリゴヌクレオチドを増幅した。既に説明したように、ＳｆｉＩおよびＮｏｔＩ制限部位を介して、得られた産物をｐＡＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）中にクローニングした。１０１０を上回る異なるクローンが最終ライブラリーで得られた。
【０１９０】
Ａ．ランダムな２０マーライブラリー
１．Ｂ６−２およびランダムな２０マーライブラリーを用いたパニング
ライブラリーをＩＧＦ−１Ｒに対してアフィニティー選択した。Ｂ６−２ライブラリーからのパニングの第３ラウンドから得られた９６個のクローンとランダムな２０マーライブラリーからのパニングの第４ラウンドから得られた９６個のクローンとをファージＥＬＩＳＡで分析して、結合剤を同定した。次に、結合剤のＤＮＡを決定した。両ライブラリーから得られた結果は、前述のように３、４、７および１０位以外の位置は比較的容易に変化することが可能であるが（以下の表参照）、３、４、７位および１０の可変性は非常に限定されていることを示している。Ｂ６−２ライブラリーの結果から、限定されたコア残基が１つを除いて（１例だけ、Ｌ（７位）は、その位置が別の疎水性残基であるＭによって置換され得る）、全ての結合剤に保持されていることが示された。ランダム２０マーライブラリーのパニングの結果から、７位のＬの代えて他の脂肪族アミノ酸残基Ｉに置換できることが明らかになった。さらに、１０位（Ｌ）の制限残基も、アミノ酸残基Ｍで置換することが可能である。したがって、これまでに同定された制限的な残基のうち２つの残基（７位および１０位のＬ）は、これらの位置においてはＬが好ましいがものの、これは絶対的なものではない。特定の残基位置に置換が認められないからといって、失活をともなわずに置換できないということを必ずしも示しているのではなく、むしろこのような置換が存在しないということは置換が好まれるか、好まれないかを示していることに注意されたい。以下にこれらの知見をまとめる。
【０１９１】
Ｂ．結果
Ｂ６−２（ドープ化コア）ライブラリーと式２モチーフのランダム２０ライブラリーから単離された結合クローンを合わせた結果を以下の表３に示す。Ｂ６−２由来の２５個のクローンおよびランダム２０マーライブラリー由来の２９個のクローンの配列を分析した。アミノ酸残基の隣の数は、特異的アミノ酸が対応する位置に認められる頻度を表している。
【０１９２】
【表３】
Figure 2004512010
先に観察された置換に基づくと、ＩＧＦ−１Ｒに結合させるには、表４に示されている以下の選好性に従って、式２のアミノ酸配列を置換するのが好ましい。
【０１９３】
【表４】
Figure 2004512010
例８：
ランダムな２０マー、４０マーおよびＡ６（式１）クローンの配列に認められるアミノ酸残基の組成を以下に示す。
【０１９４】
Figure 2004512010
Ａ６残基に好ましいものを以下の表５にまとめる。ＩＧＦ−１Ｒ結合配列に特徴的な残基（親配列の上）および一般的には結合配列に現れない残基（親配列の下）が例示されている。表６。
【０１９５】
【表５】
Figure 2004512010
【表６】
Figure 2004512010
例９：インスリン受容体のパニング
標準的方法を使用して、マイクロタイタープレート全部をコーティングし、ブロックした。ＩＲ（Ｂａｓｓ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６に従って調製）をＰＢＳで２μｇ／ｍＬに希釈した。この溶液５０μＬを９６ウェルマイクロタイタープレート（ＭａｘｉＳｏｒｐプレート、Ｎｕｎｃ）の適切な数のウェルに添加し、４℃で一晩インキュベートした。次いで、ＰＢＳに溶かした２％脱脂ミルクの溶液（ＭＰＢＳ）を用いて、ＲＴで少なくとも１時間、ウェルをブロックした。
【０１９６】
Ａ．２日間パニングの操作
ＩＲをコーティングした８個のウェルを各回のパニングに使用した。１００μＬのファージを各ウェルに添加した。パニングの最初のラウンドでは、投入ファージ力価は４ｘ１０１３ｃｆｕ／ｍＬであった。その後のラウンドでは、投入ファージ力価は約１０１１ｃｆｕ／ｍＬであった。ファージをＲＴで２から３時間結合させた。次いで、０．５％　Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する３００μＬ／ウェルのＰＢＳ（ＰＢＳＴ）でウェルを素早く１３回洗浄した。結合したファージは、１５０μＬ／ウェルの５０ｍＭグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．０で１５分間インキュベートすることによって溶出した。得られた溶液をプールした後、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０で中和した。等量の対数期のＴＧ１細胞に溶出したファージを感染させて、次いで２ｘＹＴ−ＡＧを含有する２４ｃｍｘ２４ｃｍの２枚のプレートに播種した。このプレートを３０℃で一晩インキュベートした。翌朝、細胞をかき取って、１０％グリセロール中で−８０℃で保存した。その後のアフィニティー濃縮のために、これらの凍結保存物から細胞を増殖させ、前述のようにファージを調製した。２０マーライブラリーからは全部で２１６個のクローンを、４０マーライブラリーからは１２０個のクローンを３回目および４回目のパニングによって無作為に採取し、ＩＲ結合活性をスクリーニングした。クローンのＤＮＡ配列決定によって、図１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｃ、１０Ａおよび１０Ｂにまとめた通りの多数の配列が明らかになった。
【０１９７】
Ｂ．１日パニングの操作
対数期ＴＧ１細胞を溶出したファージに感染させ、ヘルパーファージ、アンピシリンおよびグルコース（最終濃度２％）を添加する前に、２ｘＹＴ培地中で３０℃で１時間増殖させた。３７℃で１時間インキュベートした後、該細胞を遠心し、２ｘＹＴ−ＡＫ培地に再懸濁した。次いで該細胞を振盪機に戻し、３７℃で一晩インキュベートした。次に、一晩経たファージを沈殿させ、次のパニングを行った。３ラウンドおよび４ラウンドから全部で９６個のクローンを無作為に採取し、結合活性をスクリーニングした。
【０１９８】
特異的な結合剤を単離するため、各ライブラリーを可溶型のヒトＩＲに対してパニングした。このＩＲは、天然受容体のαおよびβ鎖両者の細胞外ドメイン、およびイムノグロブリンＦｃの定常ドメインから構成され、前述のβ−α−α−β構造を維持している。ＩＲは真核細胞系で発現するので、ジスルフィド結合の形成およびグリコシル化のパターンは野生型受容体に類似しているはずである。この組換えタンパク質構造物の詳細は、Ｂａｓｓら（１９９６）に記載されている。
【０１９９】
ペプチドライブラリーを用いたパニングでは、ＩＲを直接プラスティックのタンパク質結合面に固定し、４回のパニングおよび濃縮を実施した。３回目および４回目のファージクローンの分析によって、２０マーランダムペプチドライブラリーから得られた２１６個のクローンのうち１１４個、および４０マーランダムペプチドライブラリーから得られた１２０個のクローンのうち１７個がＩＲに結合することが示された（図１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｃ、４Ａ、６Ａ、１０Ａおよび１０Ｂ）。受容体結合についてインスリンとの競合を試験したクローンのうち、全てが天然リガンドの存在によって妨害された。この結果は、これらのファージクローンおよびインスリンがＩＲ上の同一部位（または少なくとも重複した部位）に結合することを示していた。
【０２００】
数個のクローンの配列分析によって、群１から群８（図１〜８）と称する数個の異なる集団が存在することが示された（図４７および図４８）。これらの群の配列に基づいたペプチドのうちいくつかは、その後の試験のために化学的に合成された。群１（式１のモチーフ）ペプチドは、コンセンサス配列ＦＹｘＷＦを含有し、細胞をベースとしたアッセイにおいてアゴニストとして作用するものと考えられている。群２（式６のモチーフ）は、コンセンサス配列ＶＹＧＲおよびそれぞれ２個のシスチン残基を有する２個のペプチドから構成される。したがって、群２のペプチド類はジスルフィド結合によって架橋された環状ペプチドを形成することができる。群３（式２のモチーフ）ペプチドは、好ましいコンセンサス配列Ｆ−Ｙ−ｘ−Ａ／Ｇ−Ｌ／Ｉ−ｘ−ｘ−Ｌ（Ａ／Ｇはアラニンまたはグリシン残基を表し、Ｌ／Ｉはロイシンまたはイソロイシン残基を表す）を含む。群３のペプチドには、細胞をベースとしたアッセイでアゴニスト活性をを示すものがある（図４９）。これらのコンセンサス配列中の連続する３又は４以上のアミノ酸は何れも、成熟インスリンと有意な配列類似性を有していない。
【０２０１】
群７（式４のモチーフ）は２個のペプチド例から構成され、有意な配列相同性は有していないが、１３〜１４残基離れた２個のシステイン残基を有しており、したがってジスルフィド架橋によってつながれた長いループを有する環式ペプチドを形成することが可能である。
【０２０２】
例１０：ファージのＥＬＩＳＡ分析
この一連の実験は、ＩＲのバイオパニング中に発見された様々なコンセンサス配列群の性質決定の一助とするために考えられたものである。各群からファージを調製した（独特な２配列それぞれを調べた）。各ファージをインスリン受容体に結合させ、競合実験を実施した。
【０２０３】
ファージ産生。それぞれのファージ培養は、５０ｍＬの遠心管中の２ｘＹＧＴ−ＡＧ　２０ｍＬに、３０μＬの原株を添加することによって開始した。培養物をＯＤ６００が約０．６〜１．０になるまで３７℃でインキュベートした。約５ｘ１０１０ｃｆｕ　ｍｌ−１の濃度になるまで、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージを添加して、ＲＴで３０分間インキュベートした。該培養物を約２５００ｇで、４℃で２０分間遠心した。３０ｍＬの２ｘＹＴ−ＡＫに細菌のペレットを再懸濁した。該培養物を２５０ｍＬの瓶に移し、Ｏ／Ｎ下で、３７℃でインキュベートした。該培養物を（５０ｍＬ遠心管で）約２５００ｇで、４℃で２０分間遠心した。上清を新しい５０ｍＬの遠心管に移した。
【０２０４】
ファージＥＬＩＳＡ。ＰＢＳに溶かした２ｎｇ／μＬのＩＲまたはｓＩＧＦ−１Ｒのいずれか５０μＬを用いて、ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）表面を備えたＮｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ（商標）プレートの各ウェルを４℃で一晩コーティングした。２００μＬのＭＰＢＳを用いて、ＲＴで１．５時間、該ウェルをブロックした。ウェル当たり１００μＬのファージを添加した。以下に示したようにペプチドを添加して、ＲＴで３時間インキュベートした。該プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。１：３０００に希釈したＨＲＰ：抗Ｍ１３接合体の溶液をウェル当たり１００μＬ、１時間添加した。洗浄を繰り返した後、１００μＬのＡＢＴＳを１５〜３０分間添加した。ＯＤをＳｐｅｃｔｒａＭａｘ　３４０　Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ　Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して４０５ｎｍで測定した。
【０２０５】
ペプチドによる競合。前述のようにファージＥＬＩＳＡを使用して、可溶性ペプチドを添加することによるファージディスプレイペプチドの競合を実施した。２０μＬの合成ペプチド原溶液をＡ列に添加した。１００μＬに２０μＬ入れる系列希釈をＧ列まで行った。Ｇ列から２０μＬを除去して、ウェル当たり１００μＬを維持した。Ｈ列はペプチドを入れないウェルとして取っておいた。Ｂ６ペプチドの開始濃度は両受容体について６８μＭであった。ＩＲについては、Ｃ１ペプチドの開始濃度は４８．５μＭであった。ＩＧＦ−１Ｒを含有するウェルのＡ列に２μＬのＣ１ペプチドのみを添加した。したがって、開始濃度は４．９μＭであった。Ａ列に１８μＬのファージ溶液を添加することによって量を維持した。
【０２０６】
天然リガンドとの競合。「最初にファージ」の実験は、ファージＥＬＩＳＡにおいて、ＰＢＳ中の５．５μＭ、５５０ｎＭ、若しくは５５ｎＭ　インスリンまたは１０μＬのＩＧＦ−１をファージ含有ウェルに添加することによって実施した。作用濃度は５００ｎＭ、５０ｎＭ、および５ｎＭであった。リガンドを含まないウェルの量は、１０μＬのＰＢＳを添加することによって維持した。
【０２０７】
「最初にリガンド」の実験は、０．５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ中の５０μＬの２μＭ、２００ｎＭ、若しくは２０ｎＭインスリンまたはＩＧＦ−１を、ファージを含有しないウェルに添加して、１５分間インキュベートすることによって実施した。次いで、５０μＬのファージ溶液を該ウェルに添加し、よく混合した。この混合物をＲＴで２時間インキュベートし、ファージＥＬＩＳＡを続行した。
【０２０８】
データを表７および図５０Ａ〜５０Ｄに示す。配列はＤＮＡ配列決定によって全てのクローンについて確かめた。
【０２０９】
【表７】
Figure 2004512010
Ｃ１ペプチド（Ｄ１１２）は、ＦＹＸ３ＷＦ式１のモチーフおよびアミノ酸配列ＤＹＫＤＣＷＡＲＰＣＧＤＡＡＮＦＹＤＷＦＶＱＱＡＳＫＫを有する。
【０２１０】
Ｂ６ペプチドは、ＦＹＸ８Ｘ９ＬＸ１１Ｘ１２Ｌ式２のモチーフおよびアミノ酸配列ＷＮＴＶＤＰＦＹＨＫＬＳＥＬＬＲＥＫＫを有する。
所見および結論
１．Ｃ１およびＢ６ペプチドはＩＲに結合する。ファージディスプレイペプチドとして発現したＣ１およびＢ６ペプチドは負に荷電している。
【０２１１】
２．群１、３および６（それぞれ式１、２および１０）は、ＩＲおよびＩＧＦ−１Ｒに結合するとき、Ｃ１およびＢ６ペプチドの両者によって阻害されるようである。３つの群はいずれも同様の特性および同様の親和性を備えている。競合データによって示されるように、これらは全て共通部位（部位１）に結合する。
【０２１２】
３．群２（式６のモチーフ）ファージクローンは配列が類似しているにも関わらず異なる特性を有する。ファージ２０Ａ４はＩＲ特異的クローンである。そのＩＲへの結合は、Ｃ１又はＢ６ペプチドによって阻害されず、したがって部位２に結合する。ファージＤ８は、ＩＲおよびＩＧＦ−１Ｒの両者に結合する。Ｃ１ペプチドおよびＢ６ペプチドによる阻害は、ＩＧＦ−１Ｒに結合するときにのみ生じる。Ｄ８は、群１、３、および６よりもＣ１およびＢ６ペプチド阻害に感受性が高く、アロステリックな競合であることが示唆される。
【０２１３】
４．ファージの中には大量のファージを使用すると、配列の中にプラスチック結合（マイクロタイタープレートのウェルに結合する）成分を有するものがあるようである。ファージＡ２、Ｄ９−２、Ｈ４、４０Ｆ１０、４０Ａ２、および４０Ｈ４は、シグナルに有意なバックグラウンドを有する。４０Ｈ４以外全てのシグナルは、ＩＲ存在下でバックグラウンドシグナルを上回って増加する。ファージＡ２およびＤ９−２のシグナルも、ＩＧＦ−１Ｒのバックグラウンドを上回って増加する。ＩＧＦ−１Ｒ結合剤Ｂ６のファージはこれと同様の特徴を示すことに注意されたい。
【０２１４】
５．群２ファージ２０Ａ４および群４ファージＤ１０は、ＩＲに特異的である。ＩＧＦ−１Ｒに対する結合は検出できない。Ｄ１０は、Ｃ１ペプチドによって僅かに阻害され得る。
【０２１５】
６．群７、Ｆ８（式４のモチーフ）のファージは、群２、Ｄ８（式６のモチーフ）と同様の特性を有する。このクローンは、ＩＲおよびＩＧＦ−１Ｒの両者に結合するが、Ｃ１およびＢ６ペプチドは、ＩＧＲ−１Ｒに結合したときにＤ８の結合にのみ影響を及ぼす。Ｆ８は、群１、３および６（それぞれ、式１、２および１０のモチーフ）よりもＣ１およびＢ６ペプチドの阻害に対してより感受性が高い。
【０２１６】
例１１：交叉反応研究
ファージＥＬＩＳＡ実験によって、ＩＧＦ−１ＲペプチドＨ２およびＥ４は、ファージ融合物として発現すると、ＩＲに検出可能な結合をすることが示される。Ａ６、Ｃ１、Ｂ６およびＪＢＡ５などの他のＩＧＦ−１Ｒ特異的ペプチドはファージとして発現したとき、ＩＲへの結合は検出されない。
【０２１７】
Ａ．実験の操作
ファージ産生。それぞれのファージ培養は、５０ｍＬの遠心管中に存在する２０ｍＬの２ｘＹＧＴ−ＡＧに、４０μＬの原株を添加することによって開始した。ＯＤ６００が約０．６〜１．０になるまで、３７℃で培養物をインキュベートした。濃度約５ｘ１０１０ｃｆｕ／ｍＬになるまでＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージを添加して、ＲＴで３０分間インキュベートした。約２５００ｇ、４℃で２０分間、該培養物を遠心した。２０ｍＬの２ｘＹＴ−ＡＫに細菌のペレットを再懸濁し、Ｏ／Ｎ下で３７℃でインキュベートした。約２５００ｇ、４℃で２０分間、該培養物を遠心した。５０ｍＬの新しい遠心管に上清を移した。
【０２１８】
ファージＥＬＩＳＡ。ＰＢＳ中の２ｎｇ／μＬのＩＲまたはＩＧＦ−１Ｒのうち何れか５０μＬを用いて、ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）表面を備えたＮｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ（商標）プレートの各ウェルを４℃でコーティングした。ＰＢＳに溶かした２００μＬの２％カーネーション脱脂乾燥ミルクによって、該ウェルをＲＴで１．５時間ブロックした。ウェル当たり１００μＬのファージを添加した。以下に示したようにペプチドを添加して、ＲＴで３時間インキュベートした。該プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。１：３０００に希釈したＨＲＰ：抗Ｍ１３複合体の溶液をウェル当たり１００μＬ、１時間添加した。洗浄を繰り返した後、１００μｌのＡＢＴＳを１５〜３０分間添加した。ＯＤ４０５をＳｐｅｃｔｒａＭａｘ　３４０　Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ　Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒを使用して測定した。
【０２１９】
ペプチド競合。ペプチド競合曲線を、横列３連のファージＥＬＩＳＡによって作製した。全量が１５０μＬとなるように（必要ならば、ファージ溶液をさらに添加した）、合成ペプチド原溶液をカラム１２に添加した。カラム１２から５０μＬをカラム１１中の１００μＬに移し、カラム１１からの５０μＬをカラム１０の１００μＬに移し、カラム２まで連続希釈を継続して系列希釈を作製した。カラム２から５０μＬを除去して、ウェル当たり１００μｌを維持した。ペプチドを含まないウェルとしてカラム１を残した。各ペプチドの開始作用濃度は、Ｈ２−５０μＭ、Ｈ２Ｃ−１００μＭ、Ｃ１Ｃ−１００μＭ、Ｄ２Ｃ−１００μＭ、Ｅ４−３３．３μＭ、Ｃ１−５０μＭ、Ａ６−１００μＭ、およびｐ５３−１００μＭであった。
【０２２０】
Ｂ．ＩＧＦ−１Ｒペプチド競合
ＩＧＦ−１ＲペプチドがＩＲに結合するファージと競合する能力を有するかどうかを確かめるために実験を計画した。競合はＩＲまたはＩＧＦ−１Ｒコートされたウェルのいずれかで生じるであろう。ＩＧＦ−１ＲペプチドＨ２、Ｈ２Ｃ、Ｃ１Ｃ、Ｄ２Ｃ、Ｅ４、Ｃ１およびＡ６について、２つの別個のファージとの競合を試験した。第１に、２０Ｄ３は（図５１Ａ、５１Ｃ）は、ＩＲのパニング中に発見されたファージであるが、ＩＧＲ−１Ｒにも結合する。第２に、Ｈ２（図５１Ｂ、５１Ｄ）は、ＩＧＦ−１Ｒのパニング中に発見されたファージであるが、ＩＲにも結合する。ＭＤＭ２に結合するｐ５３様ペプチドは、陰性対照として使用された。
【０２２１】
ヒルプロットデータを以下の表８に示し、図５２Ａ〜５２Ｄに図として表す。
【０２２２】
【表８】
Figure 2004512010
Ｃ．所見および結論
ａ．これらのペプチドはＩＲに結合可能で、ＩＲ（２０Ｄ３）またはＩＧＦ−１Ｒ（Ｈ２）のうち何れかのパニングによって発見されたファージの結合を阻害することができる。これらのファージディスプレイした同一ペプチドの多くの結果が陰性であるにも関わらず、２個の受容体間では交叉現象が生じる。
【０２２３】
ｂ．Ｃ１ペプチドはファージ結合の最も有力な阻害物候補であるが、Ｃ１ペプチドはＩＧＦ−１Ｒの代わりにＩＲに結合するその他のペプチドに対して優位な能力をほとんど失っている。さらに、Ａ６は、他のペプチドと比較して、ＩＲへの結合能が高まっている。総合すると、受容体の活性部位に隣接した表面は十分に異なっているので、何れかの受容体に対して特異的なペプチドおよび有機性小分子を発見し得ることが示唆される。
【０２２４】
ｃ．ＩＧＦ−１Ｒに結合するペプチドのヒル係数は、ＩＲに結合する同じファージおよびペプチドよりも常に１．５から２倍高い。
【０２２５】
例１２：インスリンとのファージ結合の競合
ランダムペプチドライブラリーから単離された多くの様々なペプチドの天然リガンドインスリンとの競合能力について試験した。試験したクローンは、Ｂ８（Ｄ１０３）（式モチーフ１）、Ｆ４（式モチーフ１）、Ａ７（Ｄ１２２）（２０Ａ４）（式モチーフ６）、Ｄ８（Ｄ１２３、データ示さず）（式モチーフ６）、Ｃ６（式モチーフ２）、Ｅ８（式モチーフ１０）、Ｈ４（群５、データ示さず）、Ａ４（群６）、Ｇ８（群７）、Ｇ７（Ｆｃ結合剤）であった。Ｈ４はマイクロタイタープレートを形成する材料に、非特異的に結合する可能性が高い。
【０２２６】
Ａ．インスリン競合の操作
１００μｇ／ｍＬ、５０μＬ／ウェルで受容体をコーティングした。ＭＰＢＳでブロックし、ＰＢＳＴで３回洗浄した後、ＩＲ結合ファージを添加する前に、０．１％　Ｔｗｅｅｎ−２０の存在下で、２μＭ、１００ｎＭ、および５ｎＭのインスリンを１５分間添加した。インスリンの最終濃度は、１μＭ、５０ｎＭおよび２．５ｎＭであった。反応物をＲＴで１時間インキュベートし、ウェルをＰＢＳＴ（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄した。抗Ｍ１３ＨＲＰを添加して、ＲＴで１時間インキュベートした。ＡＢＴＳを添加する前に、ＰＢＳＴでウェルを３回洗浄した。プレートを４０５ｎｍで読み取った。
【０２２７】
Ｂ．結果
インスリン用量が高いと、Ｆ４、Ｇ７、およびＨ４＃（示さず）以外のクローンは全て阻害された。Ｂ８の阻害が最高で＞５０％であった。Ｆ４（群１）の結合の見かけ上の喪失は、存在するファージのレベルが不十分なためであろう。Ｇ７はＦｃ結合ファージであり、インスリンによって阻害されないはずである。Ｈ４はプラスチック結合ファージであるものと思われる。結果を図５４に示す。
【０２２８】
Ｃ．結論
各群の代表物とインスリンとの競合によって、ほとんど全ての群がインスリンと競合することが示された。「プラスチック結合剤」およびＦｃ結合ファージのみが競合しなかった。これらのペプチド（ファージ）による阻害の程度が異なることは、該ペプチドが受容体の活性部位の上または近隣の異なるエピトープを認識していることを示唆している。
【０２２９】
例１３：合成ペプチド２０Ａ４の競合結果
この実験は例１２のように実施した。２０Ａ４ペプチド（Ｄ１２２）開始濃度は５８μＭであった。
【０２３０】
結果．結果を表７に含めた。ペプチド２０Ａ４（Ｄ１２２）（Ａ７）は、群２のメンバー（式６のモチーフ）、群４のメンバー（多種）Ｄ１０、および群７のメンバー（式４のモチーフ）Ｆ８（Ｄ１２４）と競合する。群６メンバーＦ２の阻害は部分的である。このデータは、２０Ａ４結合部位が群１、群３および群６の部位と異なるという結論と一致する。
【０２３１】
例１４：マルト−ス結合タンパク質に対するペプチドの融合−作成、精製、及びインスリン受容体への結合性の性質決定
Ａ．クローニング
いくつかの理由から、ファージに提示される対象のペプチド配列が、マルト−ス結合タンパク質（ＭＢＰ）融合物として提示し直すことが望ましい。まず、より感度の高い親和性評価を得るため、ファージディスプレイペプチドが多価なら一価の系に変換するべきである。かかる目的のため、前記ペプチド配列は、一般にシステイン残基を有さない単量体として存在するＭＢＰと融合される。次に、同種又は異種のペプチドを用いて競合実験を行い得る（一方のファージはディスプレイされ、他方のファージはＭＢＰに融合される）。最後に、ＤＮＡ配列中の遺伝子操作を行った部位において融合タンパク質を開裂することによって、精製ペプチドを得ることができる。
【０２３２】
図５５にＭＢＰペプチド構築物を模式図で示す。該構築物において、ペプチド配列のＮ端はＭＢＰのＣ端に融合される。二種のペプチド隣接型エピトープのタグには、Ｎ末端の短縮ＦＬＡＧとＣ末端のＥタグが含まれる。対応する遺伝子の融合は対象ペプチドをコードするＰＣＲ産物を用いて、ＭＢＰをコードするベクター断片をインフレームに連結することによって作製した。ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを用いてプラスミドｐＭＡＬ−ｃ２（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）を分解した後、エビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ；Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて断片を処理することによって、ベクター断片を得た。１％アガロースゲル上で被消化ＤＮＡ断片を分離し、切り出し、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ）によって精製を行った。まず、２０アミノ酸の対象ペプチド配列をファージディスプレイベクターｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）中にコードした。これらの配列を得るため、短縮ＦＬＡＧ又はＥ−Ｔａｇエピトープをコードする配列にアニールし、必要な制限酵素部位であるＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩも含有するプライマーを合成した。個々のファージのクローンからＰＣＲ産物を採取し、制限酵素で消化して挿入断片を得た。ベクターと挿入部位を１５℃で一晩連結させた。ＱＩＡクイックスピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて連結産物を精製し、１０ｎｇのＤＮＡと４０μＬのＥ．ｃｏｌｉ株ＥＲ２５０８（ＲＲ１ｌｏｎ：ｍｉｎｉＴｎ１０（Ｔｅｔｒ）（ｍａｌＢ）（ａｒｇＦ−ｌａｃ）Ｕ１６９Ｐｒｏ＋ｚｊｃ：：Ｔｎ５（Ｋａｎｒ）ｆｈｕＡ２）エレクトロコンピテント細胞（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）を含有するエレクトロポーレーションキュベット（幅０．１ｍｍ、体積０．５ｍＬ）中、１５００Ｖでエレクトロポーレーションを行った。パルス直後に、２％グルコース（２ｘＹＴ−Ｇ）を含有し、予め４０℃に加熱した２ｘＹＴ培地１ｍＬを加えて、３７℃で１時間形質転換体を増殖させた。細胞の形質転換体を２ｘＹＴ−ＡＧプレートに播種し、３７℃で一晩培養した。配列により、正しい構築物を含有するクローンを確認した。
【０２３３】
Ｂ．可溶性ＭＢＰ−ペプチド融合タンパク質の小規模発現
ＭＢＰペプチド融合タンパク質をコードするプラスミドを担持するＥ．ｃｏｌｉＥＲ２５０８（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）を２ｘＹＴ−ＡＧ中で、一晩３７℃で培養した（２５０ｒｐｍ）。翌日、ＯＤ６００が０．１に達するまで該培養液を用いて、培地（２ｘＹＴ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ−Ｇ）に播種した。培養液のＯＤ６００が０．６に達したら、最終濃度０．３ｍＭになるようにＩＰＴＧを加えて発現を誘導した後、３時間細胞を培養した。細胞を遠心分離によって沈殿させ、全細胞由来のサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって分析した。抗Ｅ−Ｔａｇ−ＨＲＰ抱合モノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いたウエスタンブロッティング分析によって、正しい分子量の融合タンパク質が産生されたことを確認した。
【０２３４】
Ｃ．可溶性ＭＢＰ−ペプチド融合タンパク質の大規模発現
ＭＢＰ−ペプチド融合タンパク質をコードするプラスミドを担持するＥ．ｃｏｌｉＥＲ２５０８を２ｘＹＴ−ＡＧ培地中で８時間（２５０ｒｐｍ、３７℃）培養した。ＯＤ６００が０．１に達するまで、２ｘＹＴ−ＡＧ中に培養液を継代し、３０℃で一晩培養した。以下の組成の培地（ｇ／Ｌ）を有する培養槽に、該培養液を用いて播種した。
【０２３５】
グルコース　　　　　　　　３．００
硫酸アンモニウム　　　　　５．００
硫酸マグネシウム七水和物　０．２５
リン酸二水素カリウム　　　３．００
クエン酸　　　　　　　　　３．００
ペプトン　　　　　　　　　１０．００
酵母菌抽出物　　　　　　　５．００
ｐＨ６．８
培地由来のグルコースが消費されるまで（ＯＤ６００＝約６．０〜７．０）、を３７℃、７００ｒｐｍで、前記培養液を増殖させた。０．３ｍＭ　ＩＰＴＧを加えることによって融合タンパク質の発現を誘導し、５０％グルコースを定率２ｇ／Ｌ／ｈで供給する流加培養法による培養槽において、培養物を２時間増殖させた。遠心分離によって培地から細胞を採取した。細胞の沈殿物のサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した後、抗Ｅ−Ｔａｇ−ＨＲＰ抱合モノクローナルマウス抗体（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いたウエスタンブロッティング分析によって発現した産物を可視化して分析した。
【０２３６】
Ｄ．精製
機械的に超音波処理するか又は化学的に穏やかな界面活性剤であるＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００で処理することによって細胞沈殿物を破砕した。遠心分離により、細胞の砕片を除去した後、クロマトグラフィー精製を行うために、適切な開始バッファー中に希釈又は透析することによって、可溶性タンパク質を調製した。ＭＢＰ融合物は、まずアミロースアフィニティークロマトグラフィー又は陰イオン交換クロマトグラフィーのいずれかによって精製した。最終精製は、抗Ｅ−Ｔａｇ抗体アフィニティーカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して行った。ＴＢＳ（０．０２５Ｍ　Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水、ｐＨ７．４）中でアフィニティー樹脂を平衡化し、溶出用バッファー（１００ｍＭグリシン、ｐＨ３．０）を用いて結合したタンパク質を溶出した。標準的プロトコ−ルに従って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析及びウエスタンブロット分析によって、純度と完成度について精製タンパク質を分析した。
【０２３７】
インスリン受容体に結合する融合タンパク質及び合成ペプチドのＢＩＡｃｏｒｅ分析のため、アミンカップリングによって、インスリン（ｐＨ５の１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液に５０μｇ／ｍＬ）をＣＭ５センサーチップ（Ｆｌｏｗｃｅｌｌ−２）上に固定化した。フローセル１は、何らかの非特異的な結合を補正するためのバックグラウンド結合用に使用した。インスリン受容体（４５０ｎＭ）をフローセルに注入し、ＩＲのインスリンへの結合を共鳴値（ＲＵｓ）で計測した。インスリンに結合した受容体は２２０ＲＵの読み値を得た。表面を２５ｍＭ水酸化ナトリウムで再生した。チューブの中で、受容体をインスリンとともに室温でプレインキュベートすると、反応ユニットが１６ＲＵまで完全に抑制された。これ故、該システムは競合性の研究に有効であった。競合性研究のためインスリンチップに注入する前に、いくつかのマルト−ス結合性融合タンパク質、ペプチド、及びｒＶａｂｓをインスリン受容体とともにプレインキュベートした。結合／共鳴値の減少により、いくつかのＭＢＰ融合タンパク質がインスリン結合部位を遮断し得ることが示される。結果を表９及び１０に示す。４４７及び２Ａ９配列を除き、以下に示すように図４７、４８において、表に掲げたアミノ酸配列が同定される。
【０２３８】
【表９】
Figure 2004512010
【表１０】
Figure 2004512010
例１５：ファージディスプレイペプチド及びＭＢＰ−ペプチド融合タンパク質を用いたインスリン受容体競合ＥＬＩＳＡ
様々なペプチドに対するインスリン受容体上の結合部位（接触部位）が同様であるかどうかを決定するため、様々な集団由来のファージディスプレイペプチドと共に、精製融合タンパク質を用いてＥＬＩＳＡ競合実験を行った。同定したコンセンサス配列により、ＩＲに結合し得るファージディスプレイペプチドを様々な群に分類した（図４７および４８参照）。対象のペプチド配列は、前述したように、ＭＢＰのＣ端に融合させた。融合タンパク質構築物を可溶性タンパク質として発現させ、精製し、タンパク質濃度を決定した。ＥＬＩＳＡ競合実験において、表１１に示す様々な群から得られるファージディスプレイペプチドと共に精製融合タンパク質を使用した。
【０２３９】
予想どおり、Ａ７（２０Ａ４）、Ｄ８、Ｄ１０、及びＦ８ペプチドを含有する融合タンパク質は、対照値の２８％〜５４％の範囲で、ファージディスプレイされた対応する同一のペプチド配列と競合することができた。融合タンパク質ＭＢＰ−Ａ７は、ファージディスプレイぺプチドＤ８、Ｄ１０、Ｆ８と有意に競合（５４％未満）することができた。第２群（式６のモチーフ）由来の他の融合タンパク質ＭＢＰ−Ｄ８はファージディスプレイされるＡ７及びＤ１０ペプチドと競合することができた。さらに、第７群（式４のモチーフ）の融合タンパク質ＭＢＰ−Ｆ８はＡ７及びＤ１０のファージディスプレイペプチドと競合した。図５６Ａ及び５６Ｂは、表１１から得られたデータのプロットを示す。図５６Ａには、少なくとも２つのシステイン残基を共通して有するような融合タンパク質とファージディスプレイペプチドに有意な競合反応（５４％以下）が生じる点で、明白なパターンが見受けられる。（ペプチド配列については、図４７及び図４８参照）
コンセンサス（ＩＧＦ　Ａ６様）配列を含有する第１群由来のファージディスプレイペプチド（式１のモチーフ）及びシステイン残基を有しないファージディスプレイペプチドに対し、システインを含有する融合タンパク質は競合することができなかったことも特筆すべき知見である（図５６Ａ）。図５６Ｂにおいて第１群（式１のモチーフ）のコンセンサス配列を含有する融合タンパク質は、どの集団群の如何なるファージディスプレイペプチドとも有意な程度では競合することができなかった。但し、第１群由来の対応する同一のファージは調べなかった。インスリン受容体に結合するためにコンセンサス配列含有ペプチド（第１群、（式１のモチーフ））を要する接触部位（部位１）とは異なる接触部位（部位２）に、システイン含有ペプチドが結合するという結論をデータは支持している。
【０２４０】
【表１１】
Figure 2004512010
上記の表に報告されたデータは以下のようにして得た。２ｎｇ／μＬのＩＲ５０μＬを用いて、９６ウェルプレートをＩＲでコートし、一晩４℃でインキュベートした。次に、ウェルをＭＰＢＳで１時間ブロックした。融合タンパク質（ＭＰＢＳとともに＃１：５で混合）をウェルに加え、ＲＴで３０分インキュベートした。次に、等量のファージ（各集団由来の様々なペプチドをディスプレイする）を加え、１．５時間インキュベートした。対照ウェルは、ファージ及び等量の緩衝液のみを含有した。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した後、ＨＲＰ／抗―Ｍ１３抱合体とともに４５分間インキュベートした。プレートを再度洗浄し、その後基質ＡＢＴＳを加えた。値は％対照として標準化したＯＤ４０５における読み値を示している。対照の融合タンパク質ＭＢＰ−４４７は、成長ホルモン受容体を結合するペプチドを含有する。太字のペプチドはシステイン残基を含有する。太字で下線が付されているのは、対照値が５４％以下の値のものである。
【０２４１】
例１６：ｒＶａｂライブラリーのバイオパニング
例５に記載したものと同じｒＶａｂライブラリーであって、ＩＧＦ−１Ｒを結合する員子をパニングしたライブラリーに対して、ＩＲを結合する員子もパニングした。ｐＨ９．５の５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液中に、１ｍｇ／ｍＬヒトインスリン受容体となるように希釈した。１００μＬの溶出液を９６ウェルマイクロタイタープレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ　ｐｌａｔｅｓ，Ｎｕｎｃ）中の適切な数のウェルに加え、４℃で一晩インキュベートした。その後、各ウェルに１００μｌのＭＰＢＳを加えることでウェルをブロックし、１時間、ＲＴでインキュベートした。
【０２４２】
ＭＰＢＳとともに、ＲＴで３０分間室温をインキュベートし、その後、１００μＬのファージ溶液を各ウェルに加え、２時間ＲＴでインキュベートした。最初のラウンドで注入したファージの力価は約１０１３ｃｆｕ／ｍＬであった。次のラウンドでは、約１０１１ｃｆｕ／ｍＬの力価のファージを注入した。
【０２４３】
２００μＬ／ウェルのＭＰＢＳでウェルを１３回洗浄し、次いで、ＰＢＳ（２００μＬ／ウェル）で一度洗浄した。結１００μＬの２０ｍＭ　グリシン−ＨＣｌ　ｐＨ２．２を各ウェルに加えることによって、結合したファージを溶出した。３０秒後、ファージをエッペンドルフチューブに移し、各ウェルの体積当たり、５０μＬの１Ｍ　Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ、ｐＨ８．０を加えることによって、溶液を中和した。
【０２４４】
ＴＧ１細胞を対数期中間部（ＯＤ６００＝０．５）まで培養した。等量のＴＧ１細胞培養と中和したファージ溶液とを混合し、振盪せずに１時間３７℃でインキュベートした後、二つの２４ｃｍ×２４ｃｍの２ｘＹＴ―ＡＧ寒天プレート上に播種した。翌朝、寒天培地の表面をかき取って細胞を採取した後、２４ｍＬの２ｘＹＴ中に細胞を懸濁し、１０％グリセロール中に−８０℃で保存した。
【０２４５】
バイオパニングの次のラウンドのために、これらの凍結ストック原株由来の細胞を１００μＬ培養することによって、注入したファージを調製し、続いて以下に記載したファージの調製プロトコ−ルに従ってファージを調製した。
【０２４６】
プロトコ−ル：ファージの調製
ファージディスプレイされたｒＶａｂを調製するのに用いたファージの調製のため一般的プロトコルを以下に記載する。
【０２４７】
１．２ｘＹＴ−ＡＧ培地がＯＤ６００＝０．５になるまで、３７℃で振盪しながら（２５０ｒｐｍ）ファージミドを含有したＴＧ１細胞を培養した。
【０２４８】
２．次にＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージを加え（ＭＯＩ＝２０）、細胞を穏やかに振盪させながら（１５０ｒｐｍ）、一時間３７℃でインキュベートした。
【０２４９】
３．インフェクションの後、細胞を１０００ｇで２０分間遠心分離することによって沈殿させ、ヘルパーファージを含有する上清を廃棄した。
【０２５０】
４．最初の培養液量の２ｘＹＴ−ＡＫ中に細胞の沈殿を再懸濁し、３０℃で一晩振盪（２５０ｒｐｍ）させながら培養した。
【０２５１】
５．一晩おいた培養液由来の細胞を４℃で３０分、３０００ｇで沈殿させ、ファージを含有する上清を回収した。
【０２５２】
６．４％ＰＥＧ、５００ｍＭ　塩化ナトリウムを含有するように上清を調節し、１時間氷冷した。沈殿したファージを３０分間１０，０００ｘｇで遠心分離して沈殿物を得た。該沈殿物をＭＰＢＳ中に再懸濁した。
【０２５３】
例１７：ＩＲ結合ｒＶａｂクローンの発現と性質決定
Ａ．Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ２１５１細胞のインフェクション
ａ．対数期の細胞を調製するため、新鮮な最小培地プレートからＥ．ｃｏｌｉ株ＨＢ２１５１細胞（遺伝型）を２ｘＹＴ培地に播種し、３７℃で振盪（２５０ｒｐｍ）させながら、ＯＤ６００＝０．５になるまで該細胞を培養した。
【０２５４】
ｂ．バイオパニングのラウンド３（又はラウンド４）で得られたプールしたファージ５０μＬを対数期にある２ｍＬのＨＢ２１５１細胞に導入した。穏やかに振盪させながら、前記細胞を３７℃で１時間インキュベートした。
【０２５５】
ｃ．前記細胞を２ｘＹＴ培地で適切に希釈し、２ｘＹＴ−ＡＧＮプレートに播種し、３０℃で一晩インキュベートした。
【０２５６】
Ｂ．ＩＧＦの反復スクリーニングのための可溶性抗体の調製
ａ．（マイクロタイター形式の９６チューブの試験管立て、Ｃｏｓｔａｒ＃４４１１に入った）クラスターチューブ毎に４００μＬの２ｘＹＴ−ＡＧ培地を加えた。
【０２５７】
ｂ．無菌のつまようじを用いて、２ｘＹＴ−ＡＧＮプレートから、良好に単離している各コロニーを移し変えることによって、クラスターチューブ内の培地に播種した。その後、クラスターチューブを振盪しながら（２５０ｒｐｍ）、一晩３０℃でインキュベートした。クラスターチューブ内の一連の細菌培養液はマスタープレートを構成する。
【０２５８】
ｃ．翌日、マスタープレートの各チューブから、飽和状態の培養液４０μＬを一揃いの新しいクラスターチューブに入った２ｘＹＴ−ＡＧ培地４００μＬへ移すことによって、マスタープレートを複製した。マイクロタイターフォーマット中の一連の新しい複製培養液をＳ１と標識した。
【０２５９】
ｄ．振盪させながら（２５０ｒｐｍ）、３０℃で２時間プレートＳ１をインキュベートした後、マイクロタイタープレートアダプターを備えた遠心分離機中で、１，０００Ｘｇ、ＲＴで２０分間遠心分離した。
【０２６０】
ｅ．各クラスターチューブから上清を入念に取り出し、適切な廃棄物用容器に廃棄した。４００μＬの２ｘＹＴ−ＡＩ培地（グルコース非添加）をプレートＳ１内の各チューブに加え、振盪させながら（２５０ｒｐｍ）、３０℃で一晩プレートをインキュベートした。
【０２６１】
ｆ．プレートＳ１を上述のように遠心分離し、（可溶性の組み換え抗体を含有する）新しい一揃えの９６本のクラスターチューブ内の対応するチューブ中に、３２０μＬの各上清を慎重に移し変えた。新しいプレートはＳ２と標識した。
【０２６２】
ｇ．（すでに上清３２０μＬを含有している）プレートＳ２の各チューブに、８０μＬのＭＰＢＳブロッキング緩衝液を加え、ＲＴで１０分間インキュベートした。これで、該ｒＶａｂ調製物を上述のとおり実施するＥＬＩＳＡに使用できる準備が整った。
【０２６３】
Ｃ．ＨＲＰ／抗Ｅ−Ｔａｇ抱合体を使用したｒＶａｂ結合の検出
ａ．マイクロタイタープレートに標的タンパク質をコートし、先述したようにブロックした。ネガティブコントロールとして用いるため、マイクロタイタープレ−トのうちいくつかのウェルを無関係な抗原でコートした。
【０２６４】
ｂ．上述のように調製したｒＶａｂ調製物をＭＰＢＳブロッキング緩衝液を用いて２倍に希釈した。抗原をコートした一組のウェル及び対照ウェルに、２００μＬの溶液を加えた。
【０２６５】
ｃ．２時間ＲＴでプレートをインキュベートした後、ＰＢＳＴで３回洗浄した。
【０２６６】
ｄ．ＨＲＰ／抗―Ｅ−Ｔａｇ抱合体をＭＰＢＳブロッキング緩衝液で１：４０００に希釈した。希釈した抱合体２００μＬを各ウェルに加え、プレートをＲＴで１時間インキュベートした。
【０２６７】
ｅ．マイクロタイタープレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。
【０２６８】
ｆ．２００μＬのＡＢＴＳ溶液を各ウェルに加え、マイクロタイタープレートをＲＴで２０分間インキュベートし、適切なマイクロタイタープレートリーダー中において、各ウェルの４０５ｎｍでの吸光度を読み取った。
【０２６９】
Ｄ．可溶性ｒＶａｂｓの産生
ａ．ＨＢ２１５１細胞中の適切なｒＶａｂクローンを２ｘＹＴプレートから３ｍＬの２ｘＹＴ−ＡＧ培地に移し、振盪（２５０ｒｐｍ）させながら、３０℃で一晩培養液をインキュベートした。
【０２７０】
ｂ．一晩置いた培養液（２．５ｍＬ）の一部に２５ｍＬの２ｘＹＴ培地を加え、振盪させながら（２５０ｒｐｍ）、３０℃で１時間培養液をインキュベートした。
【０２７１】
ｃ．培養液を１０００ｇ、２０分間ＲＴで遠心分離し、沈殿細胞から上清を除去し、廃棄した。２５ｍＬの２ｘＹＴ−Ａｌ培地で（グルコース添加せず）中に沈殿細胞を再懸濁し、振盪させながら（２５０ｒｐｍ）、３０℃で一晩インキュベートした。
【０２７２】
Ｅ．ｒＶａｂｓの精製
Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＲＰＳＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｍｏｄｕｌｅ　ｋｉｔ（Ｃａｔ．＃　１７−１３６２−０１）を用いて、製造元の指示に従って精製を実行した。
【０２７３】
ａ．シリンジを溶出用バッファーで満たした（１００ｍＭグリシン、ｐＨ３．０）
ｂ．抗―Ｅ−Ｔａｇカラムの先端のストッパーを取り外し、溶出用バッファーを一滴カラムの先端に加えた。ルアーアダプター（Ｌｕｅｒ　ａｄａｐｔｅｒ）を用いてシリンジをカラムと結合した。カラムへの空気の侵入を避けるため、「ｄｒｏｐ　ｔｏ　ｄｒｏｐ」でシリンジを接続した。
【０２７４】
ｃ．口蓋を捻って外し、流速５ｍＬ／分で、１５ｍＬの溶出バッファーを用いてカラムを洗浄した。その後直ちに、２５ｍＬのＢｉｎｄｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ（１０ＸＢｉｎｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ：０．２０Ｍ、リン酸緩衝液、０．０５％アジ化ナトリウム、ｐＨ７．０）で洗浄した。
【０２７５】
ｄ．ぺリスタポンプＰ−１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｃａｔ．＃１９−４６１１−０２）を用いて、４℃、５ｍｌ／分の流速でサンプルをアプライした。
【０２７６】
ｅ．５ｍＬ／分の流速で、Ｂｉｎｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ２５ｍＬを用いてカラムを洗浄し、結合していないＥ．ｃｏｌｉタンパク質を除去した。
【０２７７】
ｆ．溶出用バッファーを用いて抗Ｅ−Ｔａｇカラムから、結合したｒＶａｂを溶出した。カラムから溶出した物質のうち最初の４．５ｍｌは廃棄した。
【０２７８】
ｇ．（精製Ｅ−ｔａｇｇｅｄ　ｒＶａｂを含有する）次の５ｍＬを一つ又は複数のフラクションのいずれかにして収集した。
【０２７９】
ｈ．次のサンプルに使用するため、Ｂｉｎｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ２５ｍｌを用いて直ちにカラムを再平衡化した。
【０２８０】
例１８：ｒＶａｂｓを用いた競合ＥＬＩＳＡ
ＩＣ５０を決定するため、マイクロタイタープレートをＩＲで被覆し、例９のようにブロックした。可溶性ｒＶａｂを例９で記述されるように調製した。可溶性ｒＶａｂをプレートに加える前に、ＰＢＳ中の１００ｎＭ　インスリン溶液を１００Ｌ／ウェルになるように二連のウェルに加えた。１時間ＲＴでインキュベートした後、インスリン溶液を除去せずに、調製した可溶性ｒＶａｂを各々のウェルに加えた（１００μｌ／ウェル）。１時間ＲＴでインキュベーションした後、ウェルを洗浄し、例９において記載のように発色させた。
【０２８１】
例１９：細胞をベースとしたアッセイにおけるｒＶａｂの活性
ヒトＩＲ及びＩＲＳ−１（インスリン受容体の基質）をコードする遺伝子が安定にトランスフェクトされた９６９細胞中で、ＩＲ特異的な可溶性ｒＶａｂのアゴニスト及びアンタゴニスト活性を調べた。得られた細胞株は、増殖にＩＬ−３、ＩＬ−４、又はインスリンを必要とする。陰性対照細胞株は、増殖にＩＲＳ−１を必要としない。１０％のＦＣＳと１ｍＬに２０ユニットのＩＬ−３を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で前記細胞を増殖させた。バックグラウンドを低減するために、ＦＣＳに代えてウマ血清を含有する５０μＬのＰＲＭＩ１６４０（ＩＬ−３なし）培地中に、３０，０００細胞／ウェルになるように細胞を播種した。異なる濃度の５０μＬのインスリン又は可溶性ｒＶａｂを二連のウェルに添加した後、ＣＯ２インキュベーター中で、１８時間インキュベートした。細胞増殖アッセイは、ＷＳＴ−１試薬を用いて行った。生きた細胞に対してのみ活性を示すコハク酸−テトラゾリウム還元酵素系によって、ＷＳＴ−１テトラゾリウム塩を開裂させてホルマザンを形成させた。細胞数の増加は、脱水素酵素の総酵素活性の増加をもたらし、４５０ｎｍの吸光度を上昇させる。１０μＬのＷＳＴ−１試薬を加え、前記プレートを３６℃で１〜４時間インキュベートした。図６０は、これらの実験の結果を示している。図から明らかなように、ｒＶａｂ　１２ｈ１０は、約５０ｎＭのＥＤで５０で、ＩＲを発現している３２Ｄ細胞中におけるアゴニスト反応を誘導することができた。
【０２８２】
例２０：ＩＲ活性化アッセイ
キナーゼ受容体活性化ＥＬＩＳＡは、３２Ｄ細胞中にトランスフェクトされたインスリン受容体構築物の自己リン酸化を刺激又は阻害するサンプルの能力に基づいた機能的アッセイである（Ｗａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，１９９３；ｃｌｏｎｅ　９６９）。該アッセイ操作は、細胞の刺激から始まる。５×１０６細胞／ウェルで、９６ウェル組織培養プレート中にＩＲをトランスフェクトした３２Ｄ細胞を播種し、３７℃で一晩インキュベートした。インスリンを加えた、又は加えない刺激培地（２５ｎＭ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ７．２を加えたＰＲＩＭ１６４０）中に１：１０でサンプルを希釈した。前記細胞培養プレートから細胞培地の上清を移し取り、希釈したサンプルを細胞に加えた。該プレートを３７℃で３０分間インキュベートした。前記刺激培地の上清をプレートから除去して、細胞溶解緩衝液（５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ　７．２、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、１ｍＭ　ＡＥＢＳＦ、１０ＫＩＵ／ｍＬ　アプロチニン、５０μＭ　ロイペプチン、及び２ｍＭ　オルトバナジン酸ナトリウム）を加えた。細胞を３０分間溶解させた。
【０２８３】
該アッセイのＥＬＩＳＡ部分では、ＢＳＡでブロックした抗ＩＲユニットｍＡｂ（Ｕｐｓｔａｔｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｌａｋｅ　Ｐｌａｃｉｄ、ＮＹ）をコートしたＥＬＩＳＡプレートに細胞溶解液を加えた。２時間インキュベートした後、ＰＢＳＴで該プレートを６回洗浄し、ビオチン化した抗ホスホチロシン抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を加える。さらに２時間インキュベートした後、再度、該プレートを６回洗浄する。続いて、ストレプトアビジン−Ｅｕを加えて、該プレートを１時間インキュベートした。プレートを再度洗浄した後、ＥＧ＆Ｇ　Ｗａｌｌａｃ増強溶液（１００ｍＭ　アセトン−フタル酸水素カリウム、ｐＨ３．２、１５ｍＭ　２−ナフチルトリフルオロアセテート、５０ｍＭ　トリ（ｎ−オクチル）−ホスフィンオキサイド、０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００）を各ウェルに加え、室温で２０分間、該プレートを振盪器の上に置いた。ＶＩＣＴＯＲ　１４２０　Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ　Ｃｏｕｎｔｅｒ（ＥＧ＆Ｇ　Ｗａｌｌａｃ）を用いて、各ウェル中に存在するサンプルの６１５ｎｍの蛍光を測定した。
【０２８４】
あるいは、ホロ酵素リン酸化アッセイを用いてＩＲの自己リン酸化を測定した。本アッセイでは、１０μＭのＡＴＰを含有する５０μＬの自己リン酸化緩衝液（５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ．８．０、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．０２５％のＴＲｉｔｏｎ−Ｘ−１００、５ｍＭ　Ｍｎ２Ｃｌ、５０μＭのオルトバナジン酸ナトリウム）中の２５ｎＭ　インスリン、又は１０若しくは５０μＭ　ペプチドとともに、１μＬの精製インスリン受容体（Ｗｈｅａｔ　Ｇｅｒｍ　Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍから単離）をインキュベートした。β−メルカプトエタノール（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を含有する５０μＬのゲルローディング緩衝液を加えることによって、反応を停止させた。４〜１２％のＳＤＳ−ポリアクリルゲル上でサンプルを展開した。ニトロセルロース膜上にタンパク質を転写させることによって、ウェスタンブロット分析を行った。３％のミルクを含有するＰＢＳ中で一晩膜をブロッキングした。抗ホスホチロシン４Ｇ１０　ＨＲＰ標識抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とともに膜を２時間インキュベートした。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ　Ｗｅｓｔ　Ｄｕｒａ　Ｅｘｔｅｎｄｅｄ　Ｄｕｒｅａｔｉｏｎ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．）を用いて、タンパク質のバンドを可視化した。
【０２８５】
例２１：可溶性ｒＶａｂ抗体とビオチン化ペプチドを用いたＩＲアッセイの開発
ａ．不均一時間分解蛍光アッセイ　９６ウェル低蛍光ＭａｘｉＳｏｒｐ（Ｎｕｎｃ）プレート上に、４℃で一晩、６０μＬのインスリン受容体（６０ｎｇ／ウェル）をコートした。室温で１時間、２％のミルクと０．５％のＢＳＡを含有するＴＢＳでプレートをブロックした後、ＴＢＳで三回洗浄した。ペプチドのインスリン受容体への結合を調べるために、ＩＲコートされたプレートに系列希釈したビオチン化ペプチドを２時間から一晩加えた。ＴＢＳで洗浄した後に、アッセイ緩衝液（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．５％　ＢＳＡ、０．０５％　ウシＩｇ、０．０５％　ＮａＮ３、０．０１％　Ｔｗｅｅｎ−２０）１μｇ／ｍＬのユーロピウム標識したストレプトアビジンをプレートに加えて、１時間インキュベートした。ＩＲへのｒＶａｂ抗体の結合を調べるために、アッセイ緩衝液中のＥｕ標識ｒＶａｂ抗体をプレートに加え、２時間から一晩インキュベートした。Ｅｕ標識したストレプトアビジン（ペプチド試験の場合）またはユーロピウム標識したｒＶａｂとともにインキュベートした後、０．１％　Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＴＢＳ）を含有するＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．５）で前記プレートを５回洗浄し、叩いて乾燥させた。６０μＬのＥＧ＆Ｇ　Ｗａｌｌａｃ増強溶液（１００ｍＭ　アセトン−フタル酸水素カリウム、ｐＨ３．２、１５ｍＭ　２−ナフチルトリフルオロアセテート、５０ｍＭ　トリ（ｎ−オクチル）−ホスフィンオキサイド、０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００）を各ウェルに加え、室温で２０分間、前記プレートを振盪器の上に置いた。ＶＩＣＴＯＲ　１４２０　Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ　Ｃｏｕｎｔｅｒ（ＥＧ＆Ｇ　Ｗａｌｌａｃ）を用いて、各ウェル中に存在するサンプルの６１５ｎｍの蛍光を測定した。
【０２８６】
ｂ．均一時間分解蛍光アッセイ　０．１％のＢＳＡを含有するＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水中の２７ｎＭ　Ｃｙ５−標識ｒＶａｂ　４３Ｇ７と６〜８ｎＭ　ＬＡＮＣＥ標識ＩＧＦ−１Ｒ（ＥＧ＆Ｇ　Ｗａｌｌａｃ）との混合物を、９６ウェル又は３８４ウェルの白色低蛍光プレート（Ｎｕｎｃ）に２時間又は一晩添加する。ライブラリースクリーニングの場合、２％　ＤＭＳＯ中の２０μＭの有機小分子が前記混合物中に含まれる。５０ｎＭの未標識ｒＶａｂ　４３Ｇ７又は３μＭのＩＧＦを陽性対照として使用する。ＶＩＣＴＯＲ　１４２０　Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ　Ｃｏｕｎｔｅｒ（ＥＧ＆Ｇ　Ｗａｌｌａｃ）を用いて、各ウェル中に存在するサンプルの６１５ｎｍと６６５ｎｍの蛍光をともに測定する。
【０２８７】
例２２：合成ペプチドのインスリン受容体への結合
一連の合成ペプチドを合成し、ビオチン化した（Ａｎａｓｐｅｃ，　Ｉｎｃ．，　Ｓａｎ　Ｊｏｓｅ，　ＣＡ）ＩＲ及びＩＧＦ−１Ｒへのこれらのペプチドの結合親和性を調べた。これらのペプチドの多くは、μＭのレンジでＩＲに結合する（図６３）。ＩＧＦ−１ＲとＩＲへのビオチン化Ｃ１ペプチドの結合の比較を図６４に示す。図６４は、Ｃ１がＩＧＦ−１にｎＭレンジで結合するのに対して、ＩＲにはμＭレンジで結合することを示している。ＩＲへの競合的結合を調べるために、一連の未標識ペプチド又はｒＶａｂを加えた（図６５）。３０μＭのＨ２Ｃペプチドは、第１群（式１のモチーフ）から得られたビオチン化ペプチド（２０Ｄ１と２０Ｄ３）及びＡ６をベースとした２つのペプチド（Ｃ１及びＨ２）とはＩＲへの結合を競合したが、第２群（式６のモチーフ）（２０Ａ４とＤ８）から得られるペプチド、第３群（式２のモチーフ）（２０Ｃ１１）又はＩＧＦペプチドＡ９とは競合しないようである。３３Ｆ７可溶性ｒＶａｂ抗体は第１及び第２群のペプチド並びにＣ１ペプチドと競合するが、２０Ｃ１１又は２Ａ９とは競合しない。図６６は、Ｈ２Ｃとビオチン化ペプチド２０Ｄ３、Ｈ２、及びＣ１とのＩＲへの結合の競合が用量依存性であることを示している。Ｃ１Ｃペプチドは、ＩＲ結合についてもＣ１と競合する（図６７）。
【０２８８】
例２３：ペプチド及びＭＢＰ−ペプチド融合タンパク質によるｒＶａｂ１２Ｈ１０への結合に対する競合
数個のペプチドと４つのＭＢＰ−ペプチド融合ペプチドが可溶性ｒＶａｂ　１２Ｈ１０とＩＲへの結合を競合するか調べた。図６８は、３０μＭのＣ１とＨ２Ｃが対照の４０〜５０％まで結合を阻害し、３０μＭのＣ１Ｃが６０％まで阻害することを示している。Ｂ６と成長ホルモンは、ＩＲへの１２Ｈ１０の結合と競合しない。４つのＭＢＰ−ペプチド融合タンパク質（Ｄ１０、２０Ａ４、Ｅ７、及びＨ８）は全て、対照の２０〜３０％まで、１２Ｈ１０のＩＲへの結合を阻害する（図６９）。
【０２８９】
例２４：ＩＲのリン酸化に対する有機小分子の影響
ＩＧＦ−１Ｒへの結合が陽性の有機分子及び陰性対照がインスリン受容体のリン酸化に対して与える影響を調べることができる。
【０２９０】
例２５：ペプチドのインスリン受容体結合の測定方法
他のインスリン結合アッセイでは、被検物質の濃度を様々に変化させて、１２５Ｉ標識インスリンとともにＩＲをインキュベートし、Ｋｄを計算した。該方法によれば、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００で可溶化した後、トランスフェクト細胞からヒトインスリン受容体（ＨＩＲ）又はヒトＩＧＦ−１受容体（ＨＩＧＦ−１Ｒ）を精製した。アッセイ緩衝液は、１００ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　ＭＳＧ、０．５％　ヒト血清アルブミン、０．２％　ガンマグロブリン、及び０．０２５％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を含有する。受容体の濃度は、その２０００ｃｐｍ（３ｐＭ）の１２５Ｉ標識リガンド（ＴｙｒＡ１４−１２５Ｉ−ＨＩ、又はＴｙｒ３１−１２５Ｉ−ＩＧＦ１）のうち３０〜６０％が結合するように選択し、検査すべき前記物質の希釈系列を加えた。４℃で２日間平衡化させた後、４００μＬの２５％　ＰＥＧ　６０００を加えることによって、各試料（２００μＬ）を沈殿させ、遠心し、１ｍＬの１５％　ＰＥＧ　６０００を用いて洗浄して、ガンマカウンター中でカウントした。
【０２９１】
一部位結合モデルにインスリン／ＩＧＦ−１競合曲線をフィッティングさせ、被検物質の結合定数を計算する際に、受容体濃度、インスリン親和性、及び非特異的結合に対して算出したパラメーターを使用した。インスリンとＩＧＦ−１に対する代表的な曲線が、図７１Ａ〜７１Ｎに示されている。
【０２９２】
分析したあるペプチドの配列が、ペプチドＤ１２５とＤ１２６を除き、表１２に示されている。合成ペプチドには、Ｄ１ＸＸという番号が付けられている。Ｄ１１７Ｋは、可溶性を促進させるためにＮ末端の外にリシンを付加したＤ１１７の類縁体である。ファージによって組換え産生されたペプチドは、Ｄ１ＸＸＡと表記されている。
【０２９３】
前記ペプチドは全て、Ｃ末端のリシン（Ｄ１１７Ａを除く）の側鎖がビオチン化されている。組換えによって作製されたペプチドは、Ｃ末端が酸であるが、合成ペプチドはＣ末端がアミドである。
【０２９４】
結合及びリン酸化アッセイの結果を表１３に示す。
【０２９５】
【表１２】
Figure 2004512010
【表１３】
Figure 2004512010
例２６：脂肪細胞への ３ Ｈグルコースの取り込みに基づいたインスリンアゴニスト活性の測定
インスリンは、３Ｈグルコースの脂肪細胞への取り込み、及び３Ｈグルコースの脂肪への転換を増加させる。脂肪相への３Ｈの取り込みは、シンチレーション混合物の中に脂肪相を分配することによって（これにより、水溶性の３Ｈ産物が除かれる）測定された。最大に至らないインスリン用量での、３Ｈグルコースの取り込みに対する化合物の影響を測定し、完全なインスリン応答に対する増加として、結果を表した。該方法は、Ｍｏｏｄｙら（１９７４）を改変したものである。
【０２９６】
マウスの精巣上体の脂肪パッドを切除し、分解緩衝液（Ｋｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ　２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、４％　ＨＳＡ、１．１ｍＭ　グルコース、０．４ｍｇ／ｍＬ　コラーゲナーゼ１型、ｐＨ７．４）の中で細かく刻み、３６．５℃で最大１．５時間分解した。ろ過、洗浄（Ｋｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ　ＨＥＰＥＳ、１％　ＨＳＡ）、及びアッセイ緩衝液（Ｋｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ　ＨＥＰＥＳ、１％　ＨＳＡ）中への再懸濁後、試験溶液とおよそＥＤ２０のインスリンとを含有する９６ウェルＰｉｃｏｐｌａｔｅｓ（Ｐａｃｋａｒｄ）中に細胞を移した。最終濃度０．４５ｍＭのグルコース中に、３Ｈグルコース（Ａｍｅｒｓｈａｍ　ＴＲＫ　２３９）を加えることによって、アッセイを開始した。Ｌａｂｓｈａｋｅｒのインキュベーションタワー（４００ｒｐｍ）の中で、２時間、３６．５℃でアッセイをインキュベートした後、Ｐｅｒｍａｂｌｅｎｄ／トルエン　シンチラント（又は均等物）を加えることによって停止させ、少なくとも１時間静置させ、Ｐａｃｋａｒｄ　Ｔｏｐ　Ｃｏｕｎｔｅｒ又は均等物中で検出する前に、プレートを密封した。各プレート上に対照として、完全なインスリンの標準曲線（８種の用量）を展開させた。（およそ）ＥＤ２０のインスリン応答に対する化合物の影響として、データをグラフで表示し、完全なインスリン応答に対してデータを標準化した。基底又は最大濃度のインスリンに対してもアッセイを行うことができる。インスリン及びＩＧＦ−１に対する代表的な用量応答曲線を図７１Ａ〜７１Ｚ、７１Ａ２〜７１Ｚ２、７１Ａ３〜Ｂ３に示す。定量的な参考図が表１４に示されている。
【０２９７】
【表１４】
Figure 2004512010
結果：
結合アッセイは、ペプチドの多くが、０．３〜２０μＭのＩＣ５０値で、インスリンのＨＩＲへの結合を完全に阻害することを示した。１つのペプチド（Ｄ１２４）はこれより低い濃度でも活性を示したが、インスリンを部分的に置換するに留まった（図７１参照）。１つのペプチド（Ｄ１１２）は、ＨＩＧＦ−１Ｒに対して高い親和性を有していたが、他のペプチドは全て、ＨＩＲに対して２〜２０倍の選択性を示した（図７１参照）。
【０２９８】
効果アッセイ（ＦＦＣ）では、前記ペプチドのうち数個は全く効果を有しておらず、一部はアンタゴニストであり、２〜３個のペプチドは、完全なインスリン刺激の応答と同等の応答に達するアゴニストであった。最高のペプチド（Ｄ１１３とＤ１１７）のＥＤ５０は、約２０〜３０μＭであった。
【０２９９】
インスリンに比べて用量応答曲線が右にシフトしていたにもかかわらず、これらのペプチドは、インスリン受容体に結合することによって、最大のインスリン応答を示すことが明らかとなった、これまでで初めての非インスリン化合物である。このようなペプチドは、それ自体を治療薬として開発する上で有用であるかもしれない。
【０３００】
前記ペプチドは、ＩＲに結合して、ｉＲを活性化するために必要な分子の要件をさらに特定するためのリード化合物として、及び／又は活性化に関与する機序を同定するためのツールとしても有用であり得る。
【０３０１】
別の群のペプチドの親和性と活性の分析が、表１５に示されている。一本鎖又はループ状ペプチドに対するデータを提示するだけでなく、表１５は、ある種の二量体の高親和性結合を示すデータも報告している。
【０３０２】
【表１５】
Figure 2004512010
Figure 2004512010
Figure 2004512010
Figure 2004512010
例２７：ヒトインスリン受容体（ＨＩＲ）に対する親和性を有する式８の合成 ペプチド
ＩＲに結合する要素を求めて、市販のファージディスプレイライブラリー（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　Ｐｈ．Ｄ．−Ｃ７Ｃ　Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ　Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｌｉｂｒａｒｙ）をスクリーニングした。
【０３０３】
Ａ．ＩＲ結合ファージの同定
ディスプレイされたペプチドとのファージの結合は、ＥＬＩＳＡアッセイによって検出した。室温で２時間、又は４℃で一晩、プレートを抗ＦＣ抗体でコートした。スキムミルク（２％）を用いて、室温で１時間、非特異的な部位をブロックした。続いて、室温で２時間、ｓＩＲ−Ｔｃ（細胞質領域がＩｇＧ−Ｆｃ断片で置換された改変型ＩＲ）（Ｂａｓｓ　ｅｔ　ａｌ．，１９９０）をウェルに加えた。ついで、ファージをウェルに加え、競合ペプチドを入れ、又は入れずに室温で２時間インキュベートした。前記ウェルに加えた抗ファージＨＲＰ抗体を用いて結合を検出し、室温で２．５時間インキュベートした。５〜１０分の間、ＯＤＰ（ｏ−フェニレンジアミン；ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｅ）呈色反応を検出した。
【０３０４】
Ｂ．ファージディスプレイペプチドの性質決定
ＩＲのＬＩ部分の二量体に対してパニングされた直鎖１２マーペプチドライブラリー（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）から、１５の異なるファージを単離した（ＩＲ　Δ７０３）（Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８）。表１６。ディスプレイされた配列のコンセンサス配列に基づいて、これを３つのグループ（式モチーフ１、２、及び７に対応）に分けた。表１６から明らかなように、モチーフ７のペプチドは、ｓＩＲに強固に結合するが、ｓＩＧＦ−１Ｒ−ＦＣには強固に結合しない。
【０３０５】
該ファージライブラリー中に同定されたある種のペプチドが他のペプチドと競合する能力が、下表１７に示されている。
【０３０６】
Ｊ１０１（図８参照）（ファージＣＰ４２によって発現されるペプチドであり、式８のモチーフを含有する）は、約５μＭのＩＣ５０でＩＲからインスリンを置換し、受容体自己リン酸化アッセイと脂肪細胞アッセイではアンタゴニストであることが明らかとなった。Ｊ１０１もＩＲΔ７０３構築物を結合せず、インスリンによってＩＲから置換されない。従って、Ｊ１０１は、インスリン結合部位の外側でＩＲを結合するのかもしれない。２つのシステイン残基を含有するＪ１０１環状構造を有している可能性がある。
【０３０７】
上述したようにｓＩＲ−Ｆｃでコートされたプレートにファージを結合させ、結合していないファージを洗浄除去することによって、ファージディスプレイＩＲ結合ペプチドも同定された。グリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．２を用いて、結合しているファージを１０分間溶出した。
【０３０８】
ＩＲを結合するディスプレイペプチドの配列は図８に示されている。
【０３０９】
２〜３のペプチド（例えば、Ｊ１０１とＪ１１５）（図８）を脂肪細胞アッセイで調べたが、全て完全なアンタゴニストであった。
【０３１０】
【表１６】
Figure 2004512010
【表１７】
Figure 2004512010
例２８：二量体の調製
Ａ．物質
一般的には、適切に保護されたＮ−Ｆｍｏｃ（フルオレニルメトキシカルボキシル）−アミノ酸はＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）はＰｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）はＦｌｕｋａから購入した。ペプチドの分子量は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）を用いて決定し、Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ（Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上に記録した。シナピン酸のマトリックスを使用した。それぞれ、ＷａｔｅｒｓのＲＣＭ８×１０モジュールとＣ−１８カラム（１９×３００ｍｍ）及びＣ−１８（２５×３００ｍｍ）を用いて、４０℃で分析用及び半調製用高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を行った。分析用ＨＰＬＣと半調製用ＨＰＬＣの両者の溶媒系は緩衝液Ａ；水中の０．１％　ＴＦＡ、及び緩衝液Ｂ；１００％中の０．０７％　ＴＦＡ、ＵＶ検出は２１５ｎｍであった。分析用ＨＰＬＣ（１．５ｍＬ／分）に対するグラジエントは、２５分にわたって５〜９０％の緩衝液Ｂの線形グラジエント、半調製用ＨＰＬＣ（４ｍＬ／分）；５分にわたって２０％の緩衝液Ｂのイソクラティックグラジエント、その後、４０分にわたって２０〜６０％の緩衝液Ｂの線形グラジエント。
【０３１１】
Ｂ．固相ペプチド合成とＤ１１７単量体（ＦＨＥＮＦＹＤＷＦＶＲＱＶＳＫＫ−Ｄａｐ（ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−ＮＨ２））の分析
予めロードしたＲｉｎｋアミドリンカー（ＲＡＭ）−ＴｅｎｔａＧｅｌ（０．２６ｍｍｏｌ／ｇ）を用いて、ライゲーションに利用可能なペプチド単量体をプラスチックシリンジの中に手動で合成した。完全に保護したＮ−Ｆｍｏｃアミノ酸（３当量）を使用し、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）中の３０％のピペリジンによって、各サイクルの後に、一時的なＦｍｏｃ保護基を除去した。ＤＩＣ（３モル当量）とＨＯＡｔ（３モル当量）を結合添加剤として使用して、天然のアミノ酸を遊離酸としてＮＭＰ中で結合させた。
【０３１２】
まず、上述のように、Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ａｌｌｏｃ）を結合した。次いで、ヘリウム存在下で、ＣＨＣｌ３／ＡｃＯＨ／Ｎ−メチルモルホリン（３７：２：１、ｖ／ｖ／ｖ）中のＰｄ（０）（３ｍｏｌ当量）によって、ａｌｌｏｃ基を除去した。２時間後、室温で、２％ジエチルジチオカルバミド、ナトリウム塩を含有するＮＭＰ中、５％でレジンを洗浄した。最後に、ＨＯＢｔ（ヒドロキシベンゾトリアゾール）を含有するＮＭＰでレジンを洗浄した。続いて、Ｄａｐ（ジアミノプロピオン酸）の側鎖上に、保護されたオキシアミノ酢酸（３モル当量）を結合させた。全てのアシル化反応の終了は、ブロモフェノールブルーを使用することによって視覚的にモニターした。Ｆｍｏｃ−脱保護とアシル化反応の間に、ＮＭＰ（ｘ６）でレジンを洗浄した。
【０３１３】
合成後、ＤＣＭ（ジクロロメタン）（×３）でペプチドを洗浄した。ペプチドをレジンから同時に切断し、トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）（４モル当量）を含有する９５％の水性ＴＦＡで１．５時間処理することによって、側鎖の保護基を除去した。９５％の酢酸水溶液でレジンをリンスした（×４）。ＴＦＡと酢酸を蒸発させ、最終的にはジエチルエーテル中にペプチドを沈殿させ、一晩凍結乾燥した。分析用ＨＰＬＣとＭＡＬＤＩ−ＭＳの両者で、ペプチドを分析した。ＭＡＬＤＩ−ＭＳによる分析、ｍ／ｚ２２８７．５（Ｍ＋Ｈ）＋（ｍ／ｚ、２２８８．３を要する）によって、予想産物であることが確認された。
【０３１４】
ペプチド単量体ＦＨＥＮＦＹＤＷＦＶＲＱＶＳＫＫ−Ｄａｐ（ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−ＮＨ２）（９．１ｍｇ、３．９ｍｏｌ）に、８０％ＤＭＳＯ（水溶液）（２８Ｌ）中に溶かしたジアルデヒドリンカー（０．８１ｍｏｌ）を加えた。次いで、固体の酢酸ナトリウムを用いて、ｐＨを５に調整した。３７℃で一晩、溶液を放置して、ＲＰ−ＨＰＬＣによって反応の進行をモニターした。半調製用ＨＰＬＣによって、形成された二量体（表１８参照）を精製した。ＭＡＬＤＩ−ＭＳによる分析によって、予想産物であることが確認された（表１８参照）。様々なリンカーの分子量とペプチド間の距離を以下に示す。
【０３１５】
【表１８】
Figure 2004512010
連結の化学（連結部位にオキシム結合）（Ｃ末端ドメインを介して付着）によって、二量体を調製した。
【０３１６】
Ｃ．様々なＩＲ構築物への二量体の結合は、ペプチドが２つの独立した部位に結合することを示している
Ｌ１−ｃｙｓ−Ｌ２領域、Ｌ１−ｃｙｓ−Ｌ２−ＦｎＩＩＩα領域、及びＬ２−ＦｎＩＩＩα領域からなるＩＲの構築物へのＤ１１７（式１のモチーフ）、Ｄ１２３（式６のモチーフ）、Ｄ１２４（式４のモチーフ）。及びＣＰ４２（ファージ発現ペプチドＪ１０１、式８のモチーフ）単量体のファージの結合結果が表１９にまとめてある。
【０３１７】
【表１９】
Figure 2004512010
上記データは、Ａ６（式１のモチーフ）とＦ８（式４のモチーフ）モチーフが物理的に異なっており、ＩＲの異なる部分に存在するという結論と一致している。さらに、上記の競合データは、Ｂ６（式２のモチーフ）に対する結合部位が、Ａ６モチーフに対する結合部位と同じサブユニット上に存在することを示している。
【０３１８】
以下に示されているように、ＢＩＡｃｏｒｅ競合試験は、部位１（Ａ６、Ｂ６）及び２（Ｄ８、Ｆ８、Ｊ１０１）が別個の部位であることと合致している。
【０３１９】
Ｄ．組換え切断ジペプチドによる部位１及び部位２ファージディスプレイペプチドの競合
２ｎｇ／μＬのＩＲの溶液５０μＬを用いて、９６ウェルのプレートにインスリン受容体をコートし、４℃で一晩インキュベートした。続いて、ＭＰＢＳでウェルを１時間ブロックした。
【０３２０】
ＭＢＰ融合産物として発現することによって、二量体を調製した。表１上記参照。ＭＢＰ切断二量体の配列を以下に示す（コアペプチド配列に下線が付してある）。
【０３２１】
【表２０】
Figure 2004512010
ＭＢＰ切断融合タンパク質混合物を適切に希釈し、ウェルに加え、室温で３０分間インキュベートした。続いて、各ウェルに等量のＦ８又はＨ２Ｃファージディスプレイペプチドを加え、１時間インキュベートした。対照ウェル（１００％ファージ結合）は、ファージ及び等量の緩衝液のみを含有していた。対照の切断融合タンパク質混合物は、ｌａｃＺ遺伝子に由来するペプチドを含有する。ＰＢＳＴ中でプレートを３回洗浄した後、ＨＲＰ／抗Ｍ１３抱合体とともに４５分間インキュベートした。プレートを再度洗浄した後、ＡＢＴＳ基質を加えた。ＯＤ４０５で読み取った値を示している。図７２Ａは、切断された単量体及び二量体及びＦ７ファージが、ＩＲの部位２への結合を競合することを示している。図７２Ｂは、Ｈ２Ｃ、及び切断された単量体と切断されていない単量体、及び二量体が、部位１への結合を競合することを示している。ＩＣ５０の値は、表２０に示されている。
【０３２２】
【表２１】
Figure 2004512010
Ｅ．ＭＢＰ−融合ペプチドによるＩＲの自己リン酸化の刺激
融合ペプチドを、上述のように調製した、次いで、ＩＲ活性化をアッセイした（例２０参照）。図７４に示したこれらの実験結果は、Ｈ２Ｃ単量体とＨ２Ｃ−Ｈ２Ｃホモ二量体が、インビボで、ＩＲの自己リン酸化を刺激することを示している。
【０３２３】
６アミノ酸リンカー（Ｈ２Ｃ−６−Ｈ２Ｃ）で連結されたＨ２Ｃ二量体（部位１−部位１）が、自己リン酸化アッセイにおいて最も活性であった。他の活性な二量体、特にＨ２Ｃ−９−Ｈ２Ｃ、Ｈ２Ｃ−１２−Ｈ２Ｃ、Ｈ２Ｃ−３−Ｈ２Ｃ、及びＦ８も図７４に示されている。
【０３２４】
例２９：ＩＧＦ−１Ｒペプチドアッセイ
Ａ．ＩＣ５０の測定
親和性、選択性、及び活性の適切な基準に適合するペプチドを使用して、ＩＧＦ−１Ｒ上に存在する部位に結合する活性な分子を同定するための部位指定アッセイを開発し得る。時間分解蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を用いてアッセイを開発した。これらのアッセイは、放射性、均一（洗浄工程なし）でなく、９６ウェル又は３８４ウェルのマイクロタイタープレート中で迅速に実施することができ、有機性小分子のハイスループットスクリーニングアッセイでの使用が容易である。
【０３２５】
該アッセイは、ＩＧＦ−１Ｒに対するペプチドの親和性を評価するために、又はハイスループット能で、有機性小分子のリード化合物を見出すために使用することができる。幾つかのペプチドに対するＩＣ５０の測定値を以下に記載する。
【０３２６】
１．アッセイ成分
ＩＧＦ−１Ｒは、Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｃａｔ．　＃３９１−ＧＲ／ＣＦから購入した。ＥＧ＆Ｇ　Ｗａｌｌａｃによって、ＩＧＦ−１Ｒをユーロピウム（Ｅｕ）で購入した。１０ｍｇのＩＧＦ−１ＲをＷａｌｌａｃに送付し、ＷａｌｌａｃのＷ−１０２４　Ｅｕ−キレートでＩＧＦ−１Ｒを標識した。
【０３２７】
Ｐｒｏｚｙｍｅ　Ｃａｔ．＃ＰＪ２５Ｓから、ストレプトアビジン−アロフィコシアニン（ＳＡ−ＡＰＣ）を購入した。［ＤＹＫＤＦＹＤＡＩＤＱＬＶＲＧＳＡＲＡＧＧＴＲＤＫＫ（ε−ビオチン）］（「ｂ−２０Ｅ２」）は、Ｎｏｖｏ　Ｎｏｒｄｉｓｋ又はＰｅｐｔｉｄｏＧｅｎｉｃ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　＆　Ｃｏ．，Ｉｎｃ．によって合成された。ＩＧＦ−１は、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ　Ｃａｔ．＃１００−１１から市販のものを購入した。
【０３２８】
２．アッセイ法
ａ．Ａｓｓａｙ　Ｍｉｘの調製。４ｎＭ　Ｅｕ−標識ＩＧＦ−１Ｒ、３０ｎＭ　ｂ−２０Ｅ２、４ｎＭ　ＳＡ−ＡＰＣ、及び０．１％　ＢＳＡからなる２倍濃度のＡｓｓａｙ　Ｍｉｘを調製した。競合物質を加える前に、該混合物を室温、暗所で１〜２時間プレインキュベートした。
【０３２９】
ｂ．９６ウェルのマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ　Ｃａｔ．＃３９１２）上で、前記競合物質の希釈を行った。第１列から１１列まで、１００μＬの緩衝液（ＴＢＳ　ｐＨ８．０＋０．１％　ＢＳＡ）をウェルに分配した。総容量が１５０μＬになるように、１２列のウェルに競合物質と緩衝液を加えた。
【０３３０】
ｃ．ＩＧＦ−１Ｒの活性部位も結合する小有機化合物を同定するために、９６ウェルのマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ　Ｃａｔ．＃３９１２）上で小有機化合物の希釈も行った。化合物は、１００％のＤＭＳＯに溶解させた。従って、１列から１０列のウェルに、４％のＤＭＳＯを加えた１００μＬの緩衝液（ＴＢＳ　ｐＨ８．０＋０．１％　ＢＳＡ）を分配した。１１列は、２．７％のＤＭＳＯを加えた１００μＬの緩衝液を含有する。列１２まで、化合物（６μＬ）を１４４μＬの緩衝液（ＤＭＳＯなし）中に加える。
【０３３１】
ｄ．プレート上の列を横切って、希釈を行った。列１２に競合物質を分配、混合し、５０μＬの溶液１２列を１１列のウェルに写し、混合した。１１列の混合物５０μＬを、列１０のウェルに移した。３列の混合物５０μＬを２列のウェルに移すまで、これを繰り返した。２列まで達したら、２列から５０μＬを除去して、廃棄した。第１列のウェルは、競合物質なしのウェル用にとっておいた。従って、全ての列に対して１００μＬの容量が維持された。
【０３３２】
ｅ．新しい９６ウェルのマイクロタイタープレート上のウェルに、５０μＬのＡｓｓａｙ　Ｍｉｘを分配した。Ｄｉｌｕｔｉｏｎｓ　Ｐｌａｔｅから得た５０μＬは、次いで、該プレートに加えた。
【０３３３】
ｆ．Ａｓｓａｙ　Ｍｉｘ　Ｐｌａｔｅから得た３０μＬを、９６ウェルから二つずつ３８４ウェルのマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ　Ｃａｔ．＃２６４５１２）上に移した。カバーされた該プレートを室温で一時間インキュベートさせた。
【０３３４】
ｇ．ＷａｌｌａｃのＶｉｃｔｏｒＩＩフルオロメーターを用い、３４０ｎｍの励起波長、６６５及び６１５ｎｍの発光波長によって結合を測定した。
【０３３５】
ｈ．該アッセイの作用濃度は、２ｎＭ　Ｅｕ標識ＩＧＦ−１Ｒ、１５ｎＭ　ｂ−２０Ｅ２、２ｎＭ　ＳＡ−ＡＰＣ、及び０．１％　ＢＳＡであった。ペプチドは、通常、１００μＭの希釈から開始し、ＩＧＦ−１は３０μＭから開始する。化合物は、２％の作用濃度のＤＭＳＯ中、２００μＭから開始する。対象も、２％のＤＭＳＯを含有していた。
【０３３６】
３．結果
ある種のペプチドに対するＩＣ５０とホロ酵素リン酸化活性（例２０参照）の値を以下に示す。
【０３３７】
【表２２】
Figure 2004512010
Figure 2004512010
Ｂ．ＩＧＦ−１Ｒペプチドアッセイ競合的解離
ＩＧＦ−１Ｒペプチドアッセイ中で、何れかのペプチドが２０Ｅ２（Ｂ６モチーフ）ペプチドの解離速度を変化させるかどうかを調べるために、競合的解離実験を行った。解離速度の変化は、競合に使用されたペプチドがＩＧＦ−１Ｒ上に存在する第２の部位に結合し、このため、アロステリック相互作用を通じて、２０Ｅ２の解離速度を増大又は遅延させることを示唆している。
【０３３８】
１．物質
Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍ、Ｃａｔ．＃３９１−ＧＲ／ＣＦからＩＧＦ−１Ｒを購入した。ＥＧ＆Ｇ　Ｗａｌｌａｃによって、ＩＧＦ＝１Ｒをユーロピウム（Ｅｕ）が標識された。１０ｍｇのＩＧＦ−１ＲをＷａｌｌａｃに送付し、ＷａｌｌａｃのＷ−１０２４　Ｅｕ−キレートでＩＧＦ−１Ｒを標識した。
【０３３９】
Ｐｒｏｚｙｍｅ　Ｃａｔ．＃ＰＪ２５Ｓから、ストレプトアビジン−アロフィコシアニン（ＳＡ−ＡＰＣ）を購入した。
【０３４０】
［ＤＹＫＤＦＹＤＡＩＤＱＬＶＲＧＳＡＲＡＧＧＴＲＤＫＫ（ε−ビオチン）］は、Ｎｏｖｏ　Ｎｏｒｄｉｓｋ又はＰｅｐｔｉｄｏＧｅｎｉｃ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　＆　Ｃｏ．，Ｉｎｃ．によって合成された。ＩＧＦ−１は、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ　Ｃａｔ．＃１００−１１から市販のものを購入した。
【０３４１】
２．方法
ａ．Ａｓｓａｙ　Ｍｉｘの調製。２．５ｎＭ　Ｅｕ標識ＩＧＦ−１Ｒ、１８．７５ｎＭ　ｂ−２０Ｅ２、２．５ｎＭ　ＳＡ−ＡＰＣ、及び０．１％　ＢＳＡからなる１．２５倍濃度のＡｓｓａｙ　Ｍｉｘを調製した。該混合物をプレインキュベートした。
【０３４２】
ｂ．９６ウェルのマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ　Ｃａｔ．＃３９１２）に、２０μＬの競合物質と緩衝液を加えた。
【０３４３】
ｃ。物質を含有しているウェルのみ、複数回反復して（９９）、６６５ｎｍのみを読むように、Ｗａｌｌａｃ　ＶｉｃｔｏｒＩＩフルオロメーターを準備した。
【０３４４】
ｄ．８０μＬの１．２５倍Ａｓｓａｙ　Ｍｉｘを９６ウェルのマイクロタイタープレートに加え、測定のために直ちにＶｉｃｔｏｒＩＩ上に載せた。
【０３４５】
ｅ．最初の９９回反復測定後にも、平衡に達するまで定期的に測定した。
【０３４６】
注：これらの実験には、異なる条件を使用することができる。例えば、１．１倍濃度のアッセイミックスを最初に使用することができる。続いて、まず、１０μＬの競合物質と緩衝液をマイクロタイタープレートに加えた後、９０μＬのＡｓｓａｙ　Ｍｉｘを加える。
【０３４７】
ｆ．該アッセイの作用濃度は、２ｎＭ　Ｅｕ標識ＩＧＦ−１Ｒ、１５ｎＭ　ｂ−２０Ｅ２、２ｎＭ　ＳＡ−ＡＰＣ、及び０．１％　ＢＳＡであった。ペプチドは、通常、１００μＭで競合させたが、ＩＧＦ−１は３０μＭで競合させた。結果は、図１４に示されている。
【０３４８】
３．結果
図１４は、実験の１つの結果を示している。明らかに、ＩＧＦ−１とＤ８（Ｂ１２）は、２０Ｅ２（モチーフ２）、Ｈ２Ｃ（モチーフ１）、Ｃ１（モチーフ１）、及びＲＰ６（モチーフ２）ペプチドよりずっと遅い解離速度を引き起こす。このことは、ＩＧＦ−１とＤ８（Ｂ１２）が、２０Ｅ２、Ｈ２Ｃ、Ｃ１、及びＲＰ６とは異なる位置でＩＧＦ−１Ｒに接触することを示唆している。
【０３４９】
前出のデータ（例２８）は、モチーフ６の系列が、モチーフ１及び２とは異なるＩＧＦ−１Ｒの位置に結合し、これら２つの部位が互いに独立していないことを示唆している。ＩＧＦ−１とＤ８（Ｂ１２）によって解離速度が遅くなることは、ＩＧＦ−１Ｒへの結合部位が少なくとも２つ存在し、これら２つの部位は互いに独立していないことを示唆している。
【０３５０】
以下の文献（その一部は、本明細書に引用されている）は、一般的な背景の情報を与えるために引用したものであり、その全体が参考文献として援用される。
【０３５１】
【参考文献】
Figure 2004512010
Figure 2004512010
Figure 2004512010
Figure 2004512010
Figure 2004512010
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【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
ＩＲに対してパニングされたランダムな４０マーのライブラリーから得られた式１モチーフのペプチド配列。
なお、図１Ａ−１０Ｇは、式１〜式１０のモチーフを含むアミノ酸配列である。これら配列は、ＩＧＦ−１Ｒ及び／又はＩＲに対してペプチドライブラリーをパニングすることによって同定した。アミノ酸は、１文字の略号によって表されている。バックグラウンドに対する比は、４０５ｎｍのシグナル（Ｅ−Ｔａｇ、ＩＧＦ−１Ｒ、又はＩＲ）を、無脂肪乳に対する４０５ｎｍのシグナルで除することによって求められる。ＩＧＦ−１Ｒ／ＩＲ比の比較は、ＩＧＦ−１Ｒの比をＩＲの比で除することによって求められる。ＩＲ／ＩＧＦ−１Ｒ比の比較は、１Ｒの比を１ＧＦ−１Ｒの比で除することによって求められる。
各ライブラリーのデザインは、最初の行に太字で示されている。該デザインにおいて、「Ｘ」という表記はランダムな部位を示し、下線を付されたアミノ酸は、ドープされたヌクレオチドレベルでの位置を示し、他の位置は通常の表記である。Ｂ６Ｈライブラリー中のこれ以外の表記として、「Ｏ」はＮＧＹコドンを表し（ＹはＣ又はＴである）、「Ｊ」はＲＨＲコドンを表し（ＲはＡ又はＧであり、ＨはＡ、Ｃ、又はＴである）、「Ｕ」はＶＶＹコドンを表す（ＶはＡ、Ｃ、又はＧであり、ＹはＣ又はＴである）。２０Ｅ２ライブラリー中の「ｈ」は、ＮＴＮコドンを示す。
列記された配列中の記号は、Ｑ−ＴＡＧ停止；＃−ＴＡＡ停止；＊−ＴＧＡ停止；及び？未知のアミノ酸である。発現されたときには、ＷはＴＧＡ停止コドンを置き換えると考えられている。２０Ｃ、Ａ６Ｌ、及びＢ６Ｌライブラリーを除き、全てのライブラリーは、列記された配列のＮ末端に位置する短いＦＬＡＧエピトープＤＹＫＤ（Ｈｏｐｐ　ｅｔ　ａｌ．，１９８８）とＣ末端に位置するＡＡＡＧＡＰとによってデザインされている。２０Ｃ、Ａ６Ｌ、及びＢ６Ｌライブラリーは、完全長のＦＬＡＧエピトープＤＹＫＤＤＤＤＤＫを有する。
【図１Ｂ】
ＩＧＦ−１Ｒに対してパニングされたランダムな４０マーのライブラリーから得られた式１のモチーフのペプチド配列。
【図１Ｃ】
ＩＲに対してパニングされたランダムな２０マーのライブラリーから得られた式１のモチーフのペプチド配列。
【図１Ｄ】
ＩＧＦ−１Ｒに対してパニングされたランダムな２０マーのライブラリーから得られた式１のモチーフのペプチド配列。
【図１Ｅ−１】
Ｘ１−１０ＮＦＹＤＷＦＶＸ１８−２１（「Ａ６Ｓ」とも表記される）を含有するように構築され、ＩＲに対してパニングされた２１マーのライブラリーから得られた式１のモチーフのペプチド配列。
【図１Ｅ−２】
Ｘ１−１０ＮＦＹＤＷＦＶＸ１８−２１（「Ａ６Ｓ」とも表記される）を含有するように構築され、ＩＲに対してパニングされた２１マーのライブラリーから得られた式１のモチーフのペプチド配列。
【図１Ｅ−３】
Ｘ１−１０ＮＦＹＤＷＦＶＸ１８−２１（「Ａ６Ｓ」とも表記される）を含有するように構築され、ＩＲに対してパニングされた２１マーのライブラリーから得られた式１のモチーフのペプチド配列。
【図１Ｆ−１】
Ｘ１−１０ＮＦＹＤＷＦＶＸ１８−２１を含有するように構築され、ＩＧＦ−１Ｒに対してパニングされた２１マーのライブラリー（「Ａ６Ｓ」とも表記する）から得られた式１のモチーフのペプチド配列。
【図１Ｆ−２】
Ｘ１−１０ＮＦＹＤＷＦＶＸ１８−２１を含有するように構築され、ＩＧＦ−１Ｒに対してパニングされた２１マーのライブラリー（「Ａ６Ｓ」とも表記する）から得られた式１のモチーフのペプチド配列。
【図１Ｆ−３】
Ｘ１−１０ＮＦＹＤＷＦＶＸ１８−２１を含有するように構築され、ＩＧＦ−１Ｒに対してパニングされた２１マーのライブラリー（「Ａ６Ｓ」とも表記する）から得られた式１のモチーフのペプチド配列。
【図１Ｇ−１】
表記のとおりＡ６ペプチドのコンセンサスコアの外側に変異を含有するように構築され、ＩＲに対してパニングされたライブラリー（「Ａ６Ｌ」と表記する）から得られた式１のモチーフのペプチド配列。
【図１Ｇ−２】
表記のとおりＡ６ペプチドのコンセンサスコアの外側に変異を含有するように構築され、ＩＲに対してパニングされたライブラリー（「Ａ６Ｌ」と表記する）から得られた式１のモチーフのペプチド配列。
【図１Ｈ】
表記のとおりＡ６ペプチドのコンセンサスコアの外側に変異を含有するように構築され、ＩＧＦ−１Ｒに対してパニングされたライブラリー（「Ａ６Ｌ」と表記する）から得られた式１のモチーフのペプチド配列。
【図１Ｉ−１】
（表記のとおり）Ｅ４Ｄペプチドのコンセンサスコアに変異を含有するように構築され、ＩＲに対してパニングされたライブラリーから得られた式１のモチーフのペプチド配列。
【図１Ｉ−２】
（表記のとおり）Ｅ４Ｄペプチドのコンセンサスコアに変異を含有するように構築され、ＩＲに対してパニングされたライブラリーから得られた式１のモチーフのペプチド配列。
【図１Ｉ−３】
（表記のとおり）Ｅ４Ｄペプチドのコンセンサスコアに変異を含有するように構築され、ＩＲに対してパニングされたライブラリーから得られた式１のモチーフのペプチド配列。
【図１Ｊ−１】
（表記のとおり）Ｅ４Ｄペプチドのコンセンサスコアに変異を含有するように構築され、ＩＧＦ−１Ｒに対してパニングされたライブラリーから得られた式１のモチーフのペプチド配列。
【図１Ｊ−２】
（表記のとおり）Ｅ４Ｄペプチドのコンセンサスコアに変異を含有するように構築され、ＩＧＦ−１Ｒに対してパニングされたライブラリーから得られた式１のモチーフのペプチド配列。
【図１Ｋ−１】
（表記のとおり）Ｅ４Ｄペプチドのコンセンサスコアに変異を含有するように構築され、ＩＧＦ−１Ｒに対してパニングされたライブラリーから得られた式１のモチーフのペプチド配列。
【図１Ｋ−２】
（表記のとおり）Ｅ４Ｄペプチドのコンセンサスコアに変異を含有するように構築され、ＩＧＦ−１Ｒに対してパニングされたライブラリーから得られた式１のモチーフのペプチド配列。
【図１Ｋ−３】
（表記のとおり）Ｅ４Ｄペプチドのコンセンサスコアに変異を含有するように構築され、ＩＧＦ−１Ｒに対してパニングされたライブラリーから得られた式１のモチーフのペプチド配列。
【図１Ｋ−４】
（表記のとおり）Ｅ４Ｄペプチドのコンセンサスコアに変異を含有するように構築され、ＩＧＦ−１Ｒに対してパニングされたライブラリーから得られた式１のモチーフのペプチド配列。
【図１Ｌ−１】
配列Ｘ１−６ ＦＨＥＮＦＹＤＷＦＶＲＱＶＳＸ ２１−２６を用いて構築され、ＩＧＦ−１Ｒに対してパニングされたライブラリー（Ｈ２Ｃ−Ａ）から得られた式１のモチーフのペプチド配列。
【図１Ｌ−２】
配列Ｘ１−６ ＦＨＥＮＦＹＤＷＦＶＲＱＶＳＸ ２１−２６を用いて構築され、ＩＧＦ−１Ｒに対してパニングされたライブラリー（Ｈ２Ｃ−Ａ）から得られた式１のモチーフのペプチド配列。
【図１Ｍ−１】
配列Ｘ１−６ ＦＨＸＸＦＹＸＷＦＸ１６−２１を用いて構築され、ＩＲに対してパニングされたライブラリー（Ｈ２Ｃ−Ｂ）から得られた式１のモチーフのペプチド配列。
【図１Ｍ−２】
配列Ｘ１−６ ＦＨＸＸＦＹＸＷＦＸ１６−２１を用いて構築され、ＩＲに対してパニングされたライブラリー（Ｈ２Ｃ−Ｂ）から得られた式１のモチーフのペプチド配列。
【図１Ｍ−３】
配列Ｘ１−６ ＦＨＸＸＦＹＸＷＦＸ１６−２１を用いて構築され、ＩＲに対してパニングされたライブラリー（Ｈ２Ｃ−Ｂ）から得られた式１のモチーフのペプチド配列。
【図１Ｍ−４】
配列Ｘ１−６ ＦＨＸＸＦＹＸＷＦＸ１６−２１を用いて構築され、ＩＲに対してパニングされたライブラリー（Ｈ２Ｃ−Ｂ）から得られた式１のモチーフのペプチド配列。
【図１Ｍ−５】
配列Ｘ１−６ ＦＨＸＸＦＹＸＷＦＸ１６−２１を用いて構築され、ＩＲに対してパニングされたライブラリー（Ｈ２Ｃ−Ｂ）から得られた式１のモチーフのペプチド配列。
【図１Ｎ−１】
配列Ｘ１−６ ＦＨＸＸＦＹＸＷＦＸ１６−２１を用いて構築され、ＩＧＦ−１Ｒに対してパニングされたライブラリー（Ｈ２Ｃ−Ｂ）から得られた式１のモチーフのペプチド配列。
【図１Ｎ−２】
配列Ｘ１−６ ＦＨＸＸＦＹＸＷＦＸ１６−２１を用いて構築され、ＩＧＦ−１Ｒに対してパニングされたライブラリー（Ｈ２Ｃ−Ｂ）から得られた式１のモチーフのペプチド配列。
【図１Ｎ−３】
配列Ｘ１−６ ＦＨＸＸＦＹＸＷＦＸ１６−２１を用いて構築され、ＩＧＦ−１Ｒに対してパニングされたライブラリー（Ｈ２Ｃ−Ｂ）から得られた式１のモチーフのペプチド配列。
【図１Ｏ−１】
ＩＲに対してパニングされた他のライブラリーから得られた式１のモチーフのペプチド配列。
【図１Ｏ−２】
ＩＲに対してパニングされた他のライブラリーから得られた式１のモチーフのペプチド配列。
【図１Ｏ−３】
ＩＲに対してパニングされた他のライブラリーから得られた式１のモチーフのペプチド配列。
【図２Ａ】
ＩＲに対してパニングされたランダムな４０マーのライブラリーから同定された式２のモチーフのペプチド配列。
【図２Ｂ】
ＩＧＦ−１Ｒに対してパニングされたランダムな４０マーのライブラリーから同定された式２のモチーフのペプチド配列。
【図２Ｃ】
ＩＲに対してパニングされたランダムな２０マーのライブラリーから同定された式２のモチーフのペプチド配列。
【図２Ｄ】
ＩＧＦ−１Ｒに対してパニングされたランダムな２０マーのライブラリーから同定された式２のモチーフのペプチド配列。
【図２Ｅ】
ＩＧＦ−１Ｒに対してパニングされたＸ１−４ＣＸ６−２０ライブラリーから同定された式２のモチーフのペプチド配列。
【図２Ｆ】
表記のとおりＢ６ペプチドのコンセンサスコアの外側に変異を含有するように構築され、ＩＲに対してパニングされたライブラリー（「Ｂ６Ｌ」と表記）から同定された式２のモチーフのペプチド配列。
【図２Ｇ】
表記のとおりＢ６ペプチドのコンセンサスコアの外側に変異を含有するように構築され、ＩＧＦ−１Ｒに対してパニングされたライブラリー（「Ｂ６Ｌ」と表記）から同定された式２のモチーフのペプチド配列。
【図２Ｈ−１】
表記のとおりＢ６ペプチドに基づくヘリックス−ターン−ヘリックスを含有するように構築され、ＩＲに対してパニングされたライブラリー（「Ｂ６Ｈ」と表記）から同定された式２のモチーフのペプチド配列。
【図２Ｈ−２】
表記のとおりＢ６ペプチドに基づくヘリックス−ターン−ヘリックスを含有するように構築され、ＩＲに対してパニングされたライブラリー（「Ｂ６Ｈ」と表記）から同定された式２のモチーフのペプチド配列。
【図２Ｈ−３】
表記のとおりＢ６ペプチドに基づくヘリックス−ターン−ヘリックスを含有するように構築され、ＩＲに対してパニングされたライブラリー（「Ｂ６Ｈ」と表記）から同定された式２のモチーフのペプチド配列。
【図２Ｈ−４】
表記のとおりＢ６ペプチドに基づくヘリックス−ターン−ヘリックスを含有するように構築され、ＩＲに対してパニングされたライブラリー（「Ｂ６Ｈ」と表記）から同定された式２のモチーフのペプチド配列。
【図２Ｉ−１】
表記のとおりＢ６ペプチドに基づくヘリックス−ターン−ヘリックスを含有するように構築され、ＩＧＦ−１Ｒに対してパニングされたライブラリー（「Ｂ６Ｈ」と表記）から同定された式２のモチーフのペプチド配列。
【図２Ｉ−２】
表記のとおりＢ６ペプチドに基づくヘリックス−ターン−ヘリックスを含有するように構築され、ＩＧＦ−１Ｒに対してパニングされたライブラリー（「Ｂ６Ｈ」と表記）から同定された式２のモチーフのペプチド配列。
【図２Ｊ−１】
表記のとおりＢ６ペプチドのコンセンサスコアに変異を含有するように構築され、ＩＲに対してパニングされたライブラリー（「Ｂ６Ｃ」と表記）から同定された式２のモチーフのペプチド配列。
【図２Ｊ−２】
表記のとおりＢ６ペプチドのコンセンサスコアに変異を含有するように構築され、ＩＲに対してパニングされたライブラリー（「Ｂ６Ｃ」と表記）から同定された式２のモチーフのペプチド配列。
【図２Ｊ−３】
表記のとおりＢ６ペプチドのコンセンサスコアに変異を含有するように構築され、ＩＲに対してパニングされたライブラリー（「Ｂ６Ｃ」と表記）から同定された式２のモチーフのペプチド配列。
【図２Ｋ】
表記のとおりＢ６ペプチドのコンセンサスコアに変異を含有するように構築され、ＩＧＦ−１Ｒに対してパニングされたライブラリー（「Ｂ６Ｃ」と表記）から同定された式２のモチーフのペプチド配列。
【図２Ｌ−１】
ＩＲに対してパニングされ、配列Ｘ１−６ ＦＹＤＡＩＤＱＬＶＸ１６−２１を用いて構築されたライブラリー（２０Ｅ２−Ａ）から同定された式２のモチーフのペプチド配列。
【図２Ｌ−２】
ＩＲに対してパニングされ、配列Ｘ１−６ ＦＹＤＡＩＤＱＬＶＸ１６−２１を用いて構築されたライブラリー（２０Ｅ２−Ａ）から同定された式２のモチーフのペプチド配列。
【図２Ｌ−３】
ＩＲに対してパニングされ、配列Ｘ１−６ ＦＹＤＡＩＤＱＬＶＸ１６−２１を用いて構築されたライブラリー（２０Ｅ２−Ａ）から同定された式２のモチーフのペプチド配列。
【図２Ｍ−１】
ＩＧＦ−１Ｒに対してパニングされ、配列Ｘ１−６ ＦＹＤＡＩＤＱＬＶＸ１６−２１を用いて構築されたライブラリー（２０Ｅ２−Ａ）から同定された式２のモチーフのペプチド配列。
【図２Ｍ−２】
ＩＧＦ−１Ｒに対してパニングされ、配列Ｘ１−６ ＦＹＤＡＩＤＱＬＶＸ１６−２１を用いて構築されたライブラリー（２０Ｅ２−Ａ）から同定された式２のモチーフのペプチド配列。
【図２Ｍ−３】
ＩＧＦ−１Ｒに対してパニングされ、配列Ｘ１−６ ＦＹＤＡＩＤＱＬＶＸ１６−２１を用いて構築されたライブラリー（２０Ｅ２−Ａ）から同定された式２のモチーフのペプチド配列。
【図２Ｍ−４】
ＩＧＦ−１Ｒに対してパニングされ、配列Ｘ１−６ ＦＹＤＡＩＤＱＬＶＸ１６−２１を用いて構築されたライブラリー（２０Ｅ２−Ａ）から同定された式２のモチーフのペプチド配列。
【図２Ｎ−１】
ＩＲに対してパニングされ、配列Ｘ１−６ ＦＹＸＸｈＸＸｈｈＸ１６−２１を用いて構築されたライブラリー（２０Ｅ２−Ｂ）から同定された式２のモチーフのペプチド配列。
【図２Ｎ−２】
ＩＲに対してパニングされ、配列Ｘ１−６ ＦＹＸＸｈＸＸｈｈＸ１６−２１を用いて構築されたライブラリー（２０Ｅ２−Ｂ）から同定された式２のモチーフのペプチド配列。
【図２Ｎ−３】
ＩＲに対してパニングされ、配列Ｘ１−６ ＦＹＸＸｈＸＸｈｈＸ１６−２１を用いて構築されたライブラリー（２０Ｅ２−Ｂ）から同定された式２のモチーフのペプチド配列。
【図２Ｏ−１】
ＩＧＦ−１Ｒに対してパニングされ、配列Ｘ１−６ ＦＹＸＸｈＸＸｈｈＸ１６ −２１を用いて構築されたライブラリー（２０Ｅ２−Ｂ）から同定された式２のモチーフのペプチド配列。
【図２Ｏ−２】
ＩＧＦ−１Ｒに対してパニングされ、配列Ｘ１−６ ＦＹＸＸｈＸＸｈｈＸ１６−２１を用いて構築されたライブラリー（２０Ｅ２−Ｂ）から同定された式２のモチーフのペプチド配列。
【図２Ｐ−１】
ＩＲに対してパニングされ、配列Ｘ１−６ ＦＹＲＹＦＸＸＬＬＸ１６−２１を用いて構築されたライブラリー（ＮＮＲＰ）から同定された式２のモチーフのペプチド配列。
【図２Ｐ−２】
ＩＲに対してパニングされ、配列Ｘ１−６ ＦＹＲＹＦＸＸＬＬＸ１６−２１を用いて構築されたライブラリー（ＮＮＲＰ）から同定された式２のモチーフのペプチド配列。
【図２Ｐ−３】
ＩＲに対してパニングされ、配列Ｘ１−６ ＦＹＲＹＦＸＸＬＬＸ１６−２１を用いて構築されたライブラリー（ＮＮＲＰ）から同定された式２のモチーフのペプチド配列。
【図２Ｐ−４】
ＩＲに対してパニングされ、配列Ｘ１−６ ＦＹＲＹＦＸＸＬＬＸ１６−２１を用いて構築されたライブラリー（ＮＮＲＰ）から同定された式２のモチーフのペプチド配列。
【図２Ｐ−５】
ＩＲに対してパニングされ、配列Ｘ１−６ ＦＹＲＹＦＸＸＬＬＸ１６−２１を用いて構築されたライブラリー（ＮＮＲＰ）から同定された式２のモチーフのペプチド配列。
【図３Ａ】
ＩＧＦ−１Ｒに対してパニングされたランダムな２０マーのライブラリーから同定された式３のモチーフのペプチド配列。
【図３Ｂ】
ＩＧＦ−１Ｒに対してパニングされ、Ｘ１−４ＣＸ６−２０ライブラリーから同定された式３のモチーフのペプチド配列。
【図３Ｃ】
ＩＲに対してパニングされ、配列Ｘ３ＬＸＸＬＸＸＹＦＸ１２−１７を用いて構築されたライブラリー（リバースＢ６、ｒＢ６）から同定された式３のモチーフのペプチド配列。
【図３Ｄ−１】
ＩＧＦ−１Ｒに対してパニングされ、配列Ｘ３ＬＸＸＬＸＸＹＦＸ１２−１７を用いて構築されたライブラリー（リバースＢ６、ｒＢ６）から同定された式３のモチーフのペプチド配列。
【図３Ｄ−２】
ＩＧＦ−１Ｒに対してパニングされ、配列Ｘ３ＬＸＸＬＸＸＹＦＸ１２−１７を用いて構築されたライブラリー（リバースＢ６、ｒＢ６）から同定された式３のモチーフのペプチド配列。
【図４Ａ】
ＩＲに対してパニングされたランダムな２０マーのライブラリーから同定された表式４モチーフのペプチド配列。
【図４Ｂ−１】
ＩＲに対してパニングされ、表記のようにＦ８ペプチド中に変異を含有するように構築されたライブラリー（１５％ドープ、「Ｆ８１５」と表記）から同定された表式４モチーフのペプチド配列。
【図４Ｂ−２】
ＩＲに対してパニングされ、表記のようにＦ８ペプチド中に変異を含有するように構築されたライブラリー（１５％ドープ、「Ｆ８１５」と表記）から同定された表式４モチーフのペプチド配列。
【図４Ｂ−３】
ＩＲに対してパニングされ、表記のようにＦ８ペプチド中に変異を含有するように構築されたライブラリー（１５％ドープ、「Ｆ８１５」と表記）から同定された表式４モチーフのペプチド配列。
【図４Ｃ】
ＩＧＦ−１Ｒに対してパニングされ、表記のようにＦ８ペプチド中に変異を含有するように構築されたライブラリー（１５％ドープ、「Ｆ８１５」と表記）から同定された表式４モチーフのペプチド配列。
【図４Ｄ−１】
ＩＲに対してパニングされ、表記のようにＦ８ペプチド中に変異を含有するように構築されたライブラリー（２０％ドープ、「Ｆ８２０」と表記）から同定された表式４モチーフのペプチド配列。
【図４Ｄ−２】
ＩＲに対してパニングされ、表記のようにＦ８ペプチド中に変異を含有するように構築されたライブラリー（２０％ドープ、「Ｆ８２０」と表記）から同定された表式４モチーフのペプチド配列。
【図４Ｅ−１】
ＩＲに対してパニングされ、他のライブラリーから同定された表式４モチーフのペプチド配列。
【図４Ｅ−２】
ＩＲに対してパニングされ、他のライブラリーから同定された表式４モチーフのペプチド配列。
【図４Ｅ−３】
ＩＲに対してパニングされ、他のライブラリーから同定された表式４モチーフのペプチド配列。
【図５】
ＩＧＦ−１Ｒに対してパニングされ、表記のようにＦ８ペプチド中に変異を含有するように構築されたライブラリー（１５％ドープ、「Ｆ８１５」と表記）から同定された表式５モチーフのペプチド配列。
【図６Ａ】
ＩＲに対してパニングされたランダムな２０マーのライブラリーから同定された表式６モチーフのペプチド配列。
【図６Ｂ−１】
ＩＲに対してパニングされ、表記のようにＤ８ペプチド中に変異を含有するように構築されたライブラリー（１５％ドープ、「Ｄ８１５」と表記）から同定された表式６モチーフのペプチド配列。
【図６Ｂ−２】
ＩＲに対してパニングされ、表記のようにＤ８ペプチド中に変異を含有するように構築されたライブラリー（１５％ドープ、「Ｄ８１５」と表記）から同定された表式６モチーフのペプチド配列。
【図６Ｃ−１】
ＩＲに対してパニングされ、表記のようにＤ８ペプチド中に変異を含有するように構築されたライブラリー（２０％ドープ、「Ｄ８２０」と表記）から同定された表式６モチーフのペプチド配列。
【図６Ｃ−２】
ＩＲに対してパニングされ、表記のようにＤ８ペプチド中に変異を含有するように構築されたライブラリー（２０％ドープ、「Ｄ８２０」と表記）から同定された表式６モチーフのペプチド配列。
【図６Ｄ−１】
ＩＧＦ−１Ｒに対してパニングされ、表記のようにＤ８ペプチド中に変異を含有するように構築されたライブラリー（２０％ドープ、「Ｄ８２０」と表記）から同定された表式６モチーフのペプチド配列。
【図６Ｄ−２】
ＩＧＦ−１Ｒに対してパニングされ、表記のようにＤ８ペプチド中に変異を含有するように構築されたライブラリー（２０％ドープ、「Ｄ８２０」と表記）から同定された表式６モチーフのペプチド配列。
【図６Ｅ】
ＩＲに対してパニングされ、他のライブラリーから同定された表式６モチーフのペプチド配列。
【図７】
表式７モチーフのペプチド配列。
【図８−１】
市販のファージディスプレイペプチドライブラリーから同定された表式８モチーフのペプチド配列と合成配列。小文字はＤアミノ酸を表す。幾つかの配列では、３文字の略号で、非天然アミノ酸を表記している。２×１０−５より大きなＫｄ値は、およそのものである。
【図８−２】
市販のファージディスプレイペプチドライブラリーから同定された表式８モチーフのペプチド配列と合成配列。小文字はＤアミノ酸を表す。幾つかの配列では、３文字の略号で、非天然アミノ酸を表記している。２×１０−５より大きなＫｄ値は、およそのものである。
【図８−３】
市販のファージディスプレイペプチドライブラリーから同定された表式８モチーフのペプチド配列と合成配列。小文字はＤアミノ酸を表す。幾つかの配列では、３文字の略号で、非天然アミノ酸を表記している。２×１０−５より大きなＫｄ値は、およそのものである。
【図８−４】
市販のファージディスプレイペプチドライブラリーから同定された表式８モチーフのペプチド配列と合成配列。小文字はＤアミノ酸を表す。幾つかの配列では、３文字の略号で、非天然アミノ酸を表記している。２×１０−５より大きなＫｄ値は、およそのものである。
【図９−１】
図９Ａは、ＩＧＦ−１Ｒに対してパニングされ、表記のＨ５ペプチド中に変異を含有するように構築されたライブラリー（「Ｈ５」と表記する）から同定された式９のモチーフのペプチド配列。図９Ｂは、ＩＧＦ−１Ｒに対してパニングされ、表記のＪＢＡ５ペプチド中に変異を含有するように構築されたライブラリー（「ＪＢＡ５」と表記する）から同定された式９のモチーフのペプチド配列。
【図９−２】
図９Ｃは、ＩＲに対してパニングされ、表記のＪＢＡ５ペプチド中に変異を含有するように構築されたライブラリー（「ＪＢＡ５」と表記する）から同定された式９のモチーフのペプチド配列。
【図１０−１】
図１０Ａは、ＩＧＦ−１Ｒに対してパニングされたランダムな２０マーのライブラリーから同定された式１０のモチーフのペプチド配列。
【図１０−２】
図１０Ｂは、ＩＲに対してパニングされたランダムな２０マーのライブラリーから同定された式１０のモチーフのペプチド配列。図１０Ｃは、ＩＲに対してパニングされたランダムな２０マーのライブラリーから同定された種々雑多なペプチド配列。
【図１０−３】
図１０Ｄは、ＩＲに対してパニングされたランダムな４０マーのライブラリーから同定された種々雑多なペプチド配列。図１０Ｅは、ＩＧＦ−１Ｒに対してパニングされたランダムな２０マーのライブラリーから同定された種々雑多なペプチド配列。
【図１０−４】
図１０Ｆは、Ｘ１−４ＣＸ６−２０から同定され、ＩＧＦ−１Ｒに対してパニングされた種々雑多なペプチド配列。
【図１０−５】
図１０Ｇは、ＩＧＦ−１Ｒに対してパニングされ、表記のＦ８ペプチドの変異を含有するように構築されたライブラリー（Ｆ８１５）から同定された種々雑多なペプチド配列。図１０Ｈは、ＩＲに対してパニングされ、表記のＦ８Ａ１１ペプチド中に変異を含有するように構築されたライブラリー（「ＮＮＫＨ」と表記される）から同定された種々雑多なペプチド配列。
【図１０−６】
図１０Ｉは、ＩＧＦ−１Ｒに対してパニングされ、表記のＦ８Ａ１１ペプチド中に変異を含有するように構築されたライブラリー（「ＮＮＫＨ」と表記される）から同定された種々雑多なペプチド配列。
【図１１Ａ】
表式１から表式１１までの特異的な代表的アミノ酸配列の要約。
【図１１Ｂ】
表式１から表式１１までの特異的な代表的アミノ酸配列の要約。
【図１１Ｃ】
？？？
【図１２】
式２及び式３のモチーフに与えられたヘリックスホイールを示す図。
【図１３】
競合データに基づいて得られたＩＲ上に存在する２つの結合部位ドメインを示す図。
【図１４】
緩衝液（黒丸）、３０μＭ　ＩＧＦ−１（白丸）、１００μＭ　Ｈ２Ｃ（黒四角）、１００μＭ　２０Ｅ２（黒三角）、１００μＭ　Ｄ８（Ｂ１２、白四角）、１００μＭ　Ｃ１（黒逆三角）、及び１００μＭ　ＲＰＧ（黒菱形）の存在下における、ＩＧＦ−１Ｒからの２０Ｅ２ペプチドの解離。
【図１５】
ＩＲ上の複数の結合部位への結合スキームとして考えられるスキームを模式的に示した図。
【図１６】
ファージディスプレイされたペプチドライブラリーの模式図。ペプチドは、ファージの微量コートタンパク質をコードする遺伝子ＩＩＩのＮ末端に融合されたタンパク質としてディスプレイされている。
【図１７】
ＩＲとＭＢＰ融合Ｈ２Ｃ−９−Ｈ２Ｃ、Ｈ２Ｃ、及びＨ２Ｃ−３−Ｈ２Ｃとの競合的結合のＢＩＡｃｏｒｅ分析。
【図１８】
クラスＩ及びクラスＩＩペプチドの配列のアラインメント。クラスＩペプチドはＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストであることが示されたが、クラスＩＩペプチドはＩＧＦ−１Ｒアゴニストである。
【図１９】
フレームシフトしたクローンのＤＮＡ配列。
【図２０】
図２０Ａは、ＩＧＦ−１Ｒへの結合を調べたファージＥＬＩＳＡの結果。１００ｎｇ／ウェルのＩＧＦ−１Ｒでウェルをコートし、ブロッキングを行った。競合物質（ＩＧＦ−１ネイティブリガンド）は、ファージのインキュベーションの前（１時間）とインキュベーションの最中（１時間）に存在していた。ＨＲＰ−抗Ｍ１３ファージ抗体でファージを検出し、記載されているように、ＯＤ４０５として表した。図２０Ａには全結合が示されている。
図２０Ｂは、ＩＧＦ−１Ｒへの結合を調べたファージＥＬＩＳＡの結果。１００ｎｇ／ウェルのＩＧＦ−１Ｒでウェルをコートし、ブロッキングを行った。競合物質（ＩＧＦ−１ネイティブリガンド）は、ファージのインキュベーションの前（１時間）とインキュベーションの最中（１時間）に存在していた。ＨＲＰ−抗Ｍ１３ファージ抗体でファージを検出し、記載されているように、ＯＤ４０５として表した。図２０Ｂにはパーセント阻害が示されている。
【図２１】
デザインしたＩＧＦ−１Ｒ特異的合成ペプチドの配列。
【図２２】
モチーフ２ペプチド（５．１と５．２）がＩＧＦ−１Ｒ＋細胞に対するＩＧＦ−１の効果を拮抗することを示すアッセイ結果。
【図２３】
モチーフ１ペプチド（５．３と５．４）がＩＧＦ−１Ｒ＋細胞の増殖を刺激することを示すアッセイ結果。ヒトＩＧＦ−１Ｒ（３０，０００細胞／ウェル）を発現する細胞を、３７℃で４２時間、５．４ペプチドとともにインキュベートした。実験は３組みで実施した。バックグラウンドシグナルＡ４５０＝０．１５。ＷＳＴ−１試薬を用いて増殖を測定した（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ／Ｒｏｃｈｅ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）。
【図２４】
図２４Ａは、ペプチド５．１がＩＧＦ−１Ｒに結合することをＢＩＡｃｏｒｅを用いて実証した。図２４Ａ：ペプチド濃度の関数としての結合。図２４Ｂは、ペプチド５．１によるＩＧＦ−１結合の阻害。ＲＵ−屈折単位。
【図２５】
図２５Ａは、クラスＩＩペプチド配列に基づく二次ファージライブラリーＡ６Ｌのデザイン。図２５Ａ：遺伝子の配列のデザイン。下線を付した残基は、Ｅ．Ｃｏｌｉ中で発現させるためにコドンを最適化するように変異させた位置を示している。図２５Ｂは、クラスＩＩペプチド配列に基づく二次ファージライブラリーＡ６Ｌのデザイン。図２５Ｂ：Ａ６Ｌ二次ライブラリー用の合成オリゴヌクレオチド。化学的ＤＮＡ合成において、下線を付した残基をドープした。混合物の定義は以下のとおり（全ての混合物は等モル量である）。Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、又はＴ；Ｋ＝Ｇ又はＴ。ヌクレオシド混合物の精度を向上させるために、ヌクレオチドはビンの中で予め混合した（ラインで混合しなかった）。ＦＬＡＧエピトープの配列は太字で示されている。
【図２６】
図２６Ａは、モチーフ１のペプチド配列に基づく二次ファージライブラリーＡ６Ｓのデザイン。図２６Ａ：Ａ６Ｓ二次ファージライブラリーのための配列のデザイン。図２６Ｂは、図２６Ｂ：Ａ６Ｌ二次ライブラリーのための合成オリゴヌクレオチド。
混合物の定義は以下のとおり（全ての混合物は等モル量である）。Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、又はＴ；Ｋ＝Ｇ又はＴ。ヌクレオシド混合物の精度を向上させるために、ヌクレオチドはビンの中で予め混合した（ラインで混合しなかった）。ＦＬＡＧエピトープの配列は太字で示されている。
【図２７】
ＩＧＦ−１Ｒに対してアゴニスト活性を示す５つのＨ５様ペプチドの配列。Ｃ末端のリシンは、側鎖のアミノ基に連結されたビオチン部分を含有する。
【図２８−１】
Ａ６Ｓライブラリーを用いたパニングから得られたアミノ酸配列を列記した図。
【図２８−２】
Ａ６Ｓライブラリーを用いたパニングから得られたアミノ酸配列を列記した図。
【図２９】
Ｈ５二次ファージライブラリーを用いたパニングから得られたアミノ酸配列を列記した図。
【図３０】
ゲノムｒＶａｂライブラリーの模式図。
【図３１】
ＩＧＦ−１Ｒ結合剤用のｒＶａｂ抗体ライブラリーを組み立てるために使用したＶＨ、κ、及びλ遺伝子を列記した図。
【図３２】
一本鎖ＩＧＦ−１と制限断片から得られるインスリン抗体ライブラリーとの組み立てを示す模式図。
【図３３Ａ】
ｒＶａｂライブラリーを組み立てるために使用した制限断片の配列。
【図３３Ｂ】
ｒＶａｂライブラリーを組み立てるために使用した制限断片の配列。
【図３４】
ＩＧＦ−１Ｒに対して特異的な４３Ｇ７　ｒＶａｂをコードする遺伝子のヌクレオチド配列。ｒＶａｂの予想アミノ酸配列が核酸配列の下に示されている。
【図３５】
ＩＧＦ−１Ｒに対して特異的なＩＧ２Ｐ　ｒＶａｂをコードする遺伝子のヌクレオチド配列。ｒＶａｂの予想アミノ酸配列が核酸配列の下に示されている。
【図３６】
ＩＧＦ−１Ｒに対して特異的な３９Ｆ７　ｒＶａｂをコードする遺伝子のヌクレオチド配列。ｒＶａｂの予想アミノ酸配列が核酸配列の下に示されている。
【図３７】
ＩＧＦ−１Ｒに対して特異的なＭ１００　ｒＶａｂをコードする遺伝子のヌクレオチド配列。ｒＶａｂの予想アミノ酸配列が核酸配列の下に示されている。
【図３８】
ＩＧＦ−１Ｒに対して特異的な４６Ａ７　ｒＶａｂをコードする遺伝子のヌクレオチド配列。ｒＶａｂの予想アミノ酸配列が核酸配列の下に示されている。
【図３９】
ＩＧＦ−１Ｒに対して特異的な４９Ｅ８　ｒＶａｂをコードする遺伝子のヌクレオチド配列。ｒＶａｂの予想アミノ酸配列が核酸配列の下に示されている。
【図４０】
可溶型の３つのｒＶａｂのＩＧＦ−１Ｒへの結合を実証するアッセイ結果。
【図４１】
４３Ｇ７　ｒＶａｂがＩＧＦ−１Ｒ＋細胞の増殖を刺激することを示すアッセイ結果。
【図４２】
ｒＶａｂ　４３Ｇ７による刺激が１Ｇ２Ｐ、４９Ｅ８、及び４６Ａ７　ｒＶａｂによって拮抗されることを示すアッセイ結果。該アッセイは、ＩＧＦ−１Ｒ＋細胞に対して行った。
【図４３】
ペプチド５．１のＩＧＦ−１Ｒへの結合がＩＧＦ−１リガンドによって競合され得ることを示すＥｕをベースとした蛍光アッセイの結果。
【図４４】
ＩＧＦ−１Ｒへの４３Ｇ７　ｒＶａｂの結合がＩＧＦ−１によって効果的に競合されることを示す時間分解蛍光アッセイの結果。
【図４５】
Ｂ６ペプチドのＩＧＦ−１Ｒへの結合が４３Ｇ７　ｒＶａｂによって効果的に競合されることを示すＥｕをベースとした蛍光アッセイ。
【図４６】
図４６Ａは、ユーロピウム標識した４３Ｇ７　ｒＶａｂのＩＧＦ−１Ｒへの結合が、ＩＧＦ−１Ｒに対して特異的な選択されたｓｃＡｂによって効果的に競合されることを示すＥｕをベースとした蛍光アッセイの結果。図４６Ｂは、ユーロピウム標識した４３Ｇ７　ｒＶａｂのＩＧＦ−１Ｒへの結合が、ＩＧＦ−１Ｒに対して特異的な選択されたｓｃＡｂによって効果的に競合されることを示すＥｕをベースとした蛍光アッセイ。図４６Ｃは、ユーロピウム標識した４３Ｇ７　ｒＶａｂのＩＧＦ−１Ｒへの結合が、ＩＧＦ−１Ｒに対して特異的な選択されたｓｃＡｂによって効果的に競合されることを示すＥｕをベースとした蛍光アッセイ。図４６Ｄは、ユーロピウム標識した４３Ｇ７　ｒＶａｂのＩＧＦ−１Ｒへの結合が、ＩＧＦ−１Ｒに対して特異的な選択されたｓｃＡｂによって効果的に競合されることを示すＥｕをベースとした蛍光アッセイ。
【図４７】
バイオパニングの結果とグループ１のＩＲ結合ペプチドの配列のアラインメント。見出された配列の数は、ＩＲ又はＩＧＦ−１Ｒ受容体のうちの何れかへのファージの結合に関するデータとともに、図の右側に示されている。吸光度のシグナルは、＋＋＋＋、バックグラウンドに対して＞３０Ｘ、＋＋＋、１５−３０Ｘ、＋＋、５−１５Ｘ、＋、２−５Ｘ、及び０、＜２Ｘによって示されている。
【図４８−１】
バイオパニングの結果とグループ２〜７のＩＲ結合ペプチドの配列のアラインメント。見出された配列の数は、ＩＲ又はＩＧＦ−１Ｒ受容体の何れかへのファージの結合に関するデータとともに、図の右側に示されている。
【図４８−２】
バイオパニングの結果とグループ２〜７のＩＲ結合ペプチドの配列のアラインメント。見出された配列の数は、ＩＲ又はＩＧＦ−１Ｒ受容体の何れかへのファージの結合に関するデータとともに、図の右側に示されている。
【図４９−１】
図４９Ａは、Ｄ１１８ペプチド（式２のモチーフ）によって刺激された、マウス脂肪細胞への３Ｈグルコースの取り込み増加の用量反応曲線。図４９Ｂは、Ｄ１１８ペプチド（式２のモチーフ）によって刺激された、マウス脂肪細胞への３Ｈグルコースの取り込み増加の用量反応曲線。
【図４９−２】
図４９Ｃは、Ｄ１１８ペプチド（式２のモチーフ）によって刺激された、マウス脂肪細胞への３Ｈグルコースの取り込み増加の用量反応曲線。図４９Ｄは、Ｄ１１８ペプチド（式２のモチーフ）によって刺激された、マウス脂肪細胞への３Ｈグルコースの取り込み増加の用量反応曲線。
【図５０−１】
図５０Ａは、ＩＲ（図５０Ａ、５０Ｂ）又はＩＧＦ−１Ｒ（図５０Ｃ、５０Ｄ）に結合した一定濃度のファージに対する合成ペプチドＣ１（図５０Ａ、５０Ｃ）又はＢ６（図５０Ｂ、５０Ｄ）の滴定。ファージは、白丸−２０Ｄ３、白四角−２０Ａ４、白三角−２０Ｅ２、白菱形―Ｆ２、黒丸−Ｆ８、及び黒四角−Ｄ８として表されている。図５０Ｂは、ＩＲ（図５０Ａ、５０Ｂ）又はＩＧＦ−１Ｒ（図５０Ｃ、５０Ｄ）に結合した一定濃度のファージに対する合成ペプチドＣ１（図５０Ａ、５０Ｃ）又はＢ６（図５０Ｂ、５０Ｄ）の滴定。ファージは、白丸−２０Ｄ３、白四角−２０Ａ４、白三角−２０Ｅ２、白菱形―Ｆ２、黒丸−Ｆ８、及び黒四角−Ｄ８として表されている。
【図５０−２】
図５０Ｃは、ＩＲ（図５０Ａ、５０Ｂ）又はＩＧＦ−１Ｒ（図５０Ｃ、５０Ｄ）に結合した一定濃度のファージに対する合成ペプチドＣ１（図５０Ａ、５０Ｃ）又はＢ６（図５０Ｂ、５０Ｄ）の滴定。ファージは、白丸−２０Ｄ３、白四角−２０Ａ４、白三角−２０Ｅ２、白菱形―Ｆ２、黒丸−Ｆ８、及び黒四角−Ｄ８として表されている。図５０Ｄは、ＩＲ（図５０Ａ、５０Ｂ）又はＩＧＦ−１Ｒ（図５０Ｃ、５０Ｄ）に結合した一定濃度のファージに対する合成ペプチドＣ１（図５０Ａ、５０Ｃ）又はＢ６（図５０Ｂ、５０Ｄ）の滴定。ファージは、白丸−２０Ｄ３、白四角−２０Ａ４、白三角−２０Ｅ２、白菱形―Ｆ２、黒丸−Ｆ８、及び黒四角−Ｄ８として表されている。
【図５１−１】
図５１Ａは、一定濃度のファージに対するＩＧＦ−１Ｒ合成ペプチドの滴定。ペプチドに対する記号は、白丸−Ｈ２、黒丸−Ｈ２Ｃ、白四角−Ｃ１、黒四角―Ｃ１Ｃ、白三角−Ｄ２Ｃ、及び黒三角−Ｅ４、白菱形−Ａ６、及び黒菱形−ｐ５３である。図５１Ｂは、一定濃度のファージに対するＩＧＦ−１Ｒ合成ペプチドの滴定。ペプチドに対する記号は、白丸−Ｈ２、黒丸−Ｈ２Ｃ、白四角−Ｃ１、黒四角―Ｃ１Ｃ、白三角−Ｄ２Ｃ、及び黒三角−Ｅ４、白菱形−Ａ６、及び黒菱形−ｐ５３である。
【図５１−２】
図５１Ｃは、一定濃度のファージに対するＩＧＦ−１Ｒ合成ペプチドの滴定。ペプチドに対する記号は、白丸−Ｈ２、黒丸−Ｈ２Ｃ、白四角−Ｃ１、黒四角―Ｃ１Ｃ、白三角−Ｄ２Ｃ、及び黒三角−Ｅ４、白菱形−Ａ６、及び黒菱形−ｐ５３である。図５１Ｄは、一定濃度のファージに対するＩＧＦ−１Ｒ合成ペプチドの滴定。ペプチドに対する記号は、白丸−Ｈ２、黒丸−Ｈ２Ｃ、白四角−Ｃ１、黒四角―Ｃ１Ｃ、白三角−Ｄ２Ｃ、及び黒三角−Ｅ４、白菱形−Ａ６、及び黒菱形−ｐ５３である。
【図５２−１】
図５２Ａは、ファージクローンのヒルブロット解析。詳細なデータは表７に掲示されている。記号は図５１と同じである。図５２Ｂは、ファージクローンのヒルブロット解析。詳細なデータは表７に掲示されている。記号は図５１と同じである。
【図５２−２】
図５２Ｃは、ファージクローンのヒルブロット解析。詳細なデータは表７に掲示されている。記号は図５１と同じである。図５２Ｄは、ファージクローンのヒルブロット解析。詳細なデータは表７に掲示されている。記号は図５１と同じである。
【図５３】
インスリンとＩＲ結合ファージとの競合。７つの異なるグループ（カテゴリー）のファージ結合剤に対する結果が示されている。
【図５４】
一定濃度のファージに対する合成ペプチド２０Ａ４の滴定。ＩＲへのファージの結合は、白丸―２０Ｄ３、黒丸−Ｂ８、白四角−２０Ａ４、黒四角−Ｄ８、上向き白三角−２０Ｅ２、下向き白三角−Ｄ１０、下向き黒三角―Ａ２、白菱形−Ｆ２、黒菱形−Ｅ８、及び中抜黒丸−Ｆ８によって表されている。
【図５５】
マルトース結合タンパク質とファージライブラリーから得られたペプチドとのタンパク質融合物の構築を模式的に示した図。
【図５６】
図５６Ａは、ＭＢＰ−ペプチド融合タンパク質を用いたインスリン受容体競合ＥＬＩＳＡ。図５６Ａ。システイン残基を含有する融合タンパク質との競合。斜線のバーは、値が対照値の５４％以下であることを示している。図５６Ｂは、コンセンサス配列を含有する融合タンパク質との競合。記号ｃ−ｃは、システイン残基を有するファージディスプレイされたペプチドを示す。図５６Ｃは、対照ペプチドを含有する融合タンパク質との競合。
【図５７】
ＩＲに結合する６ｆ６　ｒＶａｂをコードする遺伝子のヌクレオチド配列と予想アミノ酸配列。
【図５８】
ＩＲに結合する１４ｃ８　ｒＶａｂをコードする遺伝子のヌクレオチド配列と予想アミノ酸配列。
【図５９】
ＩＲに結合する異なるｒＶａｂのＶＨ　ＣＤＲ３配列の比較、及びこれらのｒＶａｂとインスリンのＩＲへの結合の競合。
【図６０】
ＩＲを発現している、又は発現していない３２Ｄ細胞でのインスリン、ｒＶａｂ　１２ｈ１０、及びｒＶａｂ　１３ｈ９の生物学的反応。
【図６１】
ＩＲへの結合に対するｒＶａｂ　６ｆ６とインスリンとの競合。
【図６２】
ＩＲへの結合に対するｒＶａｂ　６ｆ６とＩＧＦ−１との競合。
【図６３】
インスリン受容体へのビオチン化ペプチドの結合に対する合成ペプチドと可溶性ｒＶａｂ抗体との競合。表記の濃度の合成ペプチド又は可溶性ｒＶａｂを、ビオチン化ペプチドとともに、不均質ＴＲＦＡを用いて、一晩インキュベートした。
【図６４】
Ｃ１のＩＲ及びＩＧＦ−１Ｒへの結合。
【図６５】
ＩＲへの結合に対するペプチドの競合。
【図６６】
ｂ−ペプチドのＩＲへの結合に対するＨ２Ｃの競合。不均質ＴＲＦＡを用い、Ｈ２Ｃ濃度を増加させることによって、ＩＲへの結合につき表記の濃度のビオチン化ペプチドを競合させた。
【図６７】
ＩＲへのｂ−Ｃ１結合に対するＣ１Ｃの競合。不均質ＴＲＦＡを用い、Ｃ１Ｃ濃度を増加させることによって、ＩＲへの結合につき０．３μＭのビオチン化Ｃ１ペプチドを競合させた。
【図６８】
インスリン受容体へのｒＶａｂ　１２Ｈ１０の結合に対するペプチドの競合。不均質ＴＲＦＡを用い、ｒＶａｂ　１２Ｈ１０とともに、表記の濃度の合成ペプチドを一晩インキュベートした。
【図６９】
インスリン受容体へのｒＶａｂ　１２Ｈ１０の結合に対するＭＢＰ−ペプチド融合タンパク質の競合。不均質ＴＲＦＡを用い、ｒＶａｂ　１２Ｈ１０とともに、表記の濃度の４つのＭＢＰペプチド融合タンパク質を一晩インキュベートした。
【図７０−１】
図７０Ａは、様々なペプチドの存在下で、１２５インスリン又は１２５ＩＧＦ−１がＨＩＲ又はＨＩＧＦ−１Ｒが置換されることを示すペプチド結合置換曲線。図７０Ｂは、様々なペプチドの存在下で、１２５インスリン又は１２５ＩＧＦ−１がＨＩＲ又はＨＩＧＦ−１Ｒが置換されることを示すペプチド結合置換曲線。図７０Ｃは、様々なペプチドの存在下で、１２５インスリン又は１２５ＩＧＦ−１がＨＩＲ又はＨＩＧＦ−１Ｒが置換されることを示すペプチド結合置換曲線。
【図７０−２】
図７０Ｄは、様々なペプチドの存在下で、１２５インスリン又は１２５ＩＧＦ−１がＨＩＲ又はＨＩＧＦ−１Ｒが置換されることを示すペプチド結合置換曲線。図７０Ｅは、様々なペプチドの存在下で、１２５インスリン又は１２５ＩＧＦ−１がＨＩＲ又はＨＩＧＦ−１Ｒが置換されることを示すペプチド結合置換曲線。図７０Ｆは、様々なペプチドの存在下で、１２５インスリン又は１２５ＩＧＦ−１がＨＩＲ又はＨＩＧＦ−１Ｒが置換されることを示すペプチド結合置換曲線。
【図７０−３】
図７０Ｇは、様々なペプチドの存在下で、１２５インスリン又は１２５ＩＧＦ−１がＨＩＲ又はＨＩＧＦ−１Ｒが置換されることを示すペプチド結合置換曲線。図７０Ｈは、様々なペプチドの存在下で、１２５インスリン又は１２５ＩＧＦ−１がＨＩＲ又はＨＩＧＦ−１Ｒが置換されることを示すペプチド結合置換曲線。図７０Ｉは、様々なペプチドの存在下で、１２５インスリン又は１２５ＩＧＦ−１がＨＩＲ又はＨＩＧＦ−１Ｒが置換されることを示すペプチド結合置換曲線。
【図７０−４】
図７０Ｊは、様々なペプチドの存在下で、１２５インスリン又は１２５ＩＧＦ−１がＨＩＲ又はＨＩＧＦ−１Ｒが置換されることを示すペプチド結合置換曲線。図７０Ｋは、様々なペプチドの存在下で、１２５インスリン又は１２５ＩＧＦ−１がＨＩＲ又はＨＩＧＦ−１Ｒが置換されることを示すペプチド結合置換曲線。図７０Ｌは、様々なペプチドの存在下で、１２５インスリン又は１２５ＩＧＦ−１がＨＩＲ又はＨＩＧＦ−１Ｒが置換されることを示すペプチド結合置換曲線。
【図７０−５】
図７０Ｍは、様々なペプチドの存在下で、１２５インスリン又は１２５ＩＧＦ−１がＨＩＲ又はＨＩＧＦ−１Ｒが置換されることを示すペプチド結合置換曲線。図７０Ｎは、様々なペプチドの存在下で、１２５インスリン又は１２５ＩＧＦ−１がＨＩＲ又はＨＩＧＦ−１Ｒが置換されることを示すペプチド結合置換曲線。
【図７１−１】
様々なペプチドによる３Ｈ−グルコースの脂肪細胞への取り込みの濃度依存性調節。図７１Ａおよび図７１Ｂには、式１のモチーフペプチドの応答が示されている。
【図７１−２】
図７１Ｃおよび図７１Ｄには、式１のモチーフペプチドの応答が示されている。
【図７１−３】
７１Ｅおよび図７１Ｆには、式１のモチーフペプチドの応答が示されている。
【図７１−４】
図７１Ｇおよび図７１Ｈには、式１のモチーフペプチドの応答が示されている。
【図７１−５】
図７１Ｉおよび図７１Ｊには、式１のモチーフペプチドの応答が示されている。
【図７１−６】
図７１Ｋおよび図７１Ｌには、式１のモチーフペプチドの応答が示されている。
【図７１−７】
図７１Ｍおよび図７１Ｎには、式１のモチーフペプチドの応答が示されている。
【図７１−８】
図７１Ｏおよび図７１Ｐには、式１のモチーフペプチドの応答が示されている。
【図７１−９】
図７１Ｑおよび図７１Ｒには、式１のモチーフペプチドの応答が示されている。
【図７１−１０】
図７１Ｓおよび図７１Ｔには、式１のモチーフペプチドの応答が示されている。
【図７１−１１】
図７１Ｕおよび図７１Ｖには、式１のモチーフペプチドの応答が示されている。
【図７１−１２】
図７１Ｗおよび図７１Ｘには、式９のモチーフのペプチドの応答が示されている。
【図７１−１３】
図７１Ｙおよび図７１Ｚには、式９のモチーフのペプチドの応答が示されている。
【図７１−１４】
図７１Ａ２および図７１Ｂ２には、式１のモチーフペプチドの応答が示されている。
【図７１−１５】
図７１Ｃ２および図７１Ｄ２には、式１のモチーフペプチドの応答が示されている。
【図７１−１６】
図７１Ｅ２および図７１Ｆ２には、式１のモチーフペプチドの応答が示されている。
【図７１−１７】
図７１Ｇ２および図７１Ｈ２には、式１のモチーフペプチドの応答が示されている。
【図７１−１８】
図７１Ｉ２および図７１Ｊ２には、式１のモチーフペプチドの応答が示されている。
【図７１−１９】
図７１Ｋ２および図７１Ｌ２には、式２のモチーフペプチドの応答が示されている。
【図７１−２０】
図７１Ｍ２および図７１Ｎ２には、種々雑多なペプチド、式１０のモチーフペプチドの応答が示されている。
【図７１−２１】
図７１Ｏ２および図７１Ｐ２には、種々雑多なペプチド、式１０のモチーフペプチドの応答が示されている。
【図７１−２２】
図７１Ｑ２および図７１Ｒ２には、表式６モチーフペプチドの応答が示されている。
【図７１−２３】
図７１Ｓ２および図７１Ｔ２には、表式４モチーフペプチドの応答が示されている。
【図７１−２４】
図７１Ｕ２および図７１Ｖ２には、表式４モチーフペプチドの応答が示されている。
【図７１−２５】
図７１Ｗ２には、表式４モチーフペプチドの応答が示されている。
【図７１−２６】
図７１Ｘ２および図７１Ｙ２には、式１のモチーフと式２のモチーフペプチドの応答が示されている。
【図７１−２７】
図７１Ｚ２および図７１Ａ３には、式１のモチーフと式２のモチーフペプチドの応答が示されている。
【図７１−２８】
図７１Ｂ３には、融合ペプチドＳ２９１の応答が示されている。
【図７２】
図７２Ａは、部位１（図７２Ｂ）と部位２（図７２Ａ）ファージディスプレイされたペプチドと組換え切断ジペプチドとの競合。図７２Ｂは、部位１（図７２Ｂ）と部位２（図７２Ａ）に対する、ファージディスプレイの組換え切断ジペプチドとの競合。
【図７３】
ペプチド２０Ｅ２（Ｄ１１８）へのＩＧＦ−１Ｒの結合に基づく均一蛍光共鳴エネルギー移動アッセイにおける、ＩＧＦ−１Ｒ、ペプチドＨ２Ｃ（Ｄ１１７）、ペプチドＣ１（Ｄ１１２）、及びペプチドＲＰ６（２０Ｃ−３−Ｇ３−ＩＧＦＲ）の競合。
【図７４】
ＭＢＰ融合ペプチドによるインビボでのＩＲ自己リン酸化の刺激。

Claims (263)

  1. 哺乳類細胞中のインスリン活性を調節する方法であって、前記類細胞に対して、ＩＲに結合し且つアミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５を含むアミノ酸配列を投与することを含み、ここでＸ１、Ｘ２、Ｘ４、およびＸ５ は芳香族アミノ酸であり、Ｘ３は何れかの極性アミノ酸である方法。
  2. 請求項１に記載の方法であって、前記Ｘ１、Ｘ２、およびＸ５はフェニルアラニンおよびチロシンからなる群から選択され、前記Ｘ３はアスパラギン酸、グルタミン酸、グリシンおよびセリンからなる群から選択され、前記Ｘ４はトリプトファン、チロシンおよびフェニルアラニンからなる群から選択される方法。
  3. 請求項２に記載の方法であって、前記アミノ酸配列はインスリンアゴニストである方法。
  4. 請求項２に記載の方法であって、前記アミノ酸配列はインスリンアンタゴニストである方法。
  5. 請求項３または４に記載の方法であって、前記Ｘ１およびＸ５はフェニルアラニンであり、前記Ｘ２はチロシンである方法。
  6. 請求項５に記載の方法であって、前記Ｘ４はトリプトファンである方法。
  7. 請求項６に記載の方法であって、前記アミノ酸配列はインスリンアゴニストであり、前記Ｘ３はアスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群から選択される方法。
  8. 請求項７に記載の方法であって、ＦＹＤＷＦを含むアミノ酸配列を生じるように、前記Ｘ３はアスパラギン酸である方法。
  9. 請求項７に記載の方法であって、ＦＹＥＷＦを含むアミノ酸配列を生じるように、前記Ｘ３はグルタミン酸である方法。
  10. 請求項１に記載の方法であって、ＦＨＥＮＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５を含み且つインスリンアゴニスト活性を有するアミノ酸配列を生じるように、アミノ酸配列ＦＨＥＮがＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５のアミノ末端に結合される方法。
  11. 請求項１０に記載の方法であって、前記アミノ酸配列がＦＨＥＮＦＹＤＷＦである方法。
  12. 請求項１に記載の方法であって、前記アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５は更に、Ｘ５に隣接したカルボキシ末端に位置するアミノ酸配列Ｘ９３Ｘ９４Ｘ９５Ｘ９６Ｘ９７を含み、ここでＸ９３、Ｘ９４およびＸ９７は如何なるアミノ酸でもよく、Ｘ９５はグルタミン、グルタミン酸、アラニンおよびリジンからなる群から選択され、Ｘ９６は疎水性または脂肪族アミノ酸である方法。
  13. 請求項１２に記載の方法であって、Ｘ９３はアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニンおよびバリンからなる群から選択され、Ｘ９５はグルタミンまたはグルタミン酸であり、Ｘ９６はロイシン、イソロイシン、バリンおよびトリプトファンからなる群から選択される方法。
  14. 請求項１３に記載の方法であって、Ｘ９６はロイシンまたはトリプトファンである方法。
  15. 請求項１４に記載の方法であって、Ｘ９６はロイシンである方法。
  16. 請求項１３に記載の方法であって、Ｘ９５はグルタミンまたはグルタミン酸であり、Ｘ９６はトリプトファンである方法。
  17. 請求項１３に記載の方法であって、Ｘ９５はグルタミン酸であり、前記アミノ酸配列はインスリンアゴニストである方法。
  18. 請求項１３に記載の方法であって、Ｘ１のアミノ末端に結合しているアミノ酸としてアスパラギンが存在し、またＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ９３はＦＹＤＷＦＶである方法。
  19. 請求項１に記載の方法であって、前記アミノ酸配列は図１、図２および図９に列記したアミノ酸配列の群から選択される方法。
  20. 請求項１に記載の方法であって、前記配列は
    ＦＨＥＮＦＹＤＷＦＶＲＱＶＳＫ，
    ＤＹＫＤＶＴＦＴＳＡＶＦＨＥＮＦＹＤＷＦＶＲＱＶＳＫＫ，
    ＧＲＶＤＷＬＱＲＮＡＮＦＹＤＷＦＶＡＥＬＧ ａｎｄ ＡＰＴＦＹＡＷＦＮＱＱＴ
    からなる群から選択される方法。
  21. 請求項１に記載の方法であって、前記配列は下記からなる群から選択される方法：
    Figure 2004512010
    Figure 2004512010
    Figure 2004512010
    Figure 2004512010
    Figure 2004512010
    但し、下線を付した数字は表１８に定義した通りである。
  22. 請求項２に記載の方法であって、前記アミノ酸配列は少なくとも約１０−５Ｍの親和性でインスリン受容体に結合する方法。
  23. 請求項２２に記載の方法であって、前記親和性は少なくとも約１０−７ Ｍである方法。
  24. 請求項２３に記載の方法であって、前記親和性は少なくとも約１０−９ Ｍである方法。
  25. Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５を含むアミノ酸配列であって、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４、およびＸ５は芳香族アミノ酸であり、Ｘ３は何れかの極性アミノ酸であり、また前記アミノ酸配列はＩＧＦ−１Ｒに結合するアミノ酸配列。
  26. 請求項２５に記載のアミノ酸配列であって、前記ＩＧＦ−１Ｒ結合は、少なくとも約１０−５ Ｍの親和性（Ｋｄ）で生じるアミノ酸配列。
  27. 請求項２５に記載のアミノ酸配列であって、前記結合は少なくとも約１０−７ Ｍの親和性（Ｋｄ）で生じるアミノ酸配列。
  28. 請求項２５に記載のアミノ酸配列であって、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ５はフェニルアラニンおよびチロシンからなる群から選択され、Ｘ３はアスパラギン酸、グルタミン酸、グリシンおよびセリンからなる群から選択され、Ｘ４はトリプトファン、チロシンおよびフェニルアラニンからなる群から選択されるアミノ酸配列。
  29. 請求項２８に記載のアミノ酸配列であって、Ｘ３はアスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群から選択されるアミノ酸配列。
  30. 請求項２９に記載の配列であって、Ｘ１およびＸ５はフェニルアラニンであり、Ｘ２はチロシンであるアミノ酸配列。
  31. 請求項２９に記載のアミノ酸配列であって、前記Ｘ４はトリプトファンであるアミノ酸配列。
  32. 請求項３１に記載のアミノ酸配列であって、ＦＹＤＷＦを含むアミノ酸を生じるように、Ｘ３はアスパラギン酸であるアミノ酸配列。
  33. 請求項３１に記載のアミノ酸配列であって、ＦＹＥＷＦを含むアミノ酸配列を生じるように、Ｘ３はグルタミン酸であるアミノ酸配列。
  34. 請求項２８に記載のアミノ酸配列であって、ＦＨＥＮＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５を含むアミノ酸配列を生じるように、前記アミノ酸配列ＦＨＥＮがＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５のアミノ末端に結合しているアミノ酸配列。
  35. 請求項３４に記載のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列はＦＨＥＮＦＹＤＷＦを含むアミノ酸配列。
  36. 請求項２５に記載のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５は更に、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ９３Ｘ９４Ｘ９５Ｘ９６Ｘ９７を形成するようにＸ５に隣接したカルボキシ末端に位置するアミノ酸配列Ｘ９３Ｘ９４Ｘ９５Ｘ９６Ｘ９７を含み、ここでＸ９３、Ｘ９４およびＸ９７は如何なるアミノ酸であってもよく、Ｘ９５はグルタミン、グルタミン酸、アラニンおよびリジンからなる群から選択され、Ｘ９６は疎水性または脂肪族アミノ酸であるアミノ酸配列。
  37. 請求項３６に記載のアミノ酸配列であって、Ｘ９３はアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニンおよびバリンからなる群から選択され、Ｘ９５はグルタミンまたはグルタミン段であり、Ｘ９６はロイシン、イソロイシン、バリンおよびトリプトファンからなる群から選択されるアミノ酸配列。
  38. 請求項３７に記載のアミノ酸配列であって、Ｘ９７はロイシンまたはトリプトファンであるアミノ酸配列。
  39. 請求項３８に記載のアミノ酸配列であって、Ｘ９６がロイシンであるアミノ酸配列。
  40. 請求項３９に記載のアミノ酸配列であって、Ｘ９５はグルタミンであり、Ｘ９６はトリプトファンであるアミノ酸配列。
  41. 請求項４０に記載のアミノ酸配列であって、Ｘ９３はバリンであるアミノ酸配列。
  42. 請求項４１に記載のアミノ酸配列であって、Ｘ１のアミノ末端にアスパラギンが結合しているアミノ酸配列。
  43. 図１−Ａ〜図１−Ｏに列記したアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列。
  44. 請求項２５に記載のアミノ酸配列であって、前記配列は、ＦＨＥＮＦＹＤＷＦＶＲＱＶＳ、ＤＹＫＤＶＴＦＴＳＡＶＦＨＥＮＦＹＤＷＦＶＲＱＶＳＫＫ、ＧＲＶＤＷＬＱＲＮＡＮＦＹＤＷＦＶＡＥＬＧ およびＡＰＴＦＹＡＷＦＮＱＱＴからなる群から選択されるアミノ酸配列。
  45. 請求項２５に記載のアミノ酸配列であって、前記配列はＦＨＥＮＦＹＤＷＦＶＲＱＶＳを含む配列。
  46. 請求項２５に記載のアミノ酸配列であって、前記配列は下記からなる群から選択されるアミノ酸配列。
    Figure 2004512010
    Figure 2004512010
    Figure 2004512010
    Figure 2004512010
    Figure 2004512010
    但し、下線を付した数字は表１８において定義したリンカーを表す。
  47. ＩＧＦ−１Ｒに対する結合がバックグラウンド以下であるようにＩＲに特異的に結合するアミノ酸配列であって、該アミノ酸配列はＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５を含み、ここでＸｌ、Ｘ２およびＸ５はフェニルアラニンおよびチロシンからなる群から選択され、Ｘ３はアスパラギン酸、グルタミン酸、グリシンおよびセリンからなる群から選択され、Ｘ４はトリプトファン、チロシンおよびフェニルアラニンからなる群から選択されるアミノ酸配列。
  48. 哺乳類細胞におけるインスリン活性を調節する方法であって、ＩＲに結合し且つアミノ酸配列Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３を含むアミノ酸配列を前記細胞に投与することを含み、ここでＸ６およびＸ７は芳香族アミノ酸またはグルタミンであり、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１１およびＸ１２は何れのアミノ酸であってもよく、Ｘ１０およびＸ１３は疎水性アミノ酸である方法。
  49. 請求項４８に記載の方法であって、Ｘ６およびＸ７はフェニルアラニンおよびチロシンからなる群から選択され、Ｘ１０およびＸ１３はロイシン、イソロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンおよびバリンからなる群から選択される方法。
  50. 請求項４８に記載の方法であって、Ｘ６はフェニルアラニンであり、Ｘ７はチロシンである方法。
  51. 請求項５０に記載の方法であって、Ｘ１０はイソロイシンである方法。
  52. 請求項５０に記載の方法であって、Ｘ１０はロイシンである方法。
  53. 請求項５０に記載の方法であって、Ｘ１３はロイシンである方法。
  54. 請求項５０に記載の方法であって、Ｘ９はチロシンであり、Ｘ１０はフェニルアラニンである方法。
  55. 請求項５０に記載の方法であって、前記アミノ酸配列はＦＹＸ８Ｘ９ＬＸ１１Ｘ１２Ｌ、ＦＹＸ８Ｘ９ＩＸ１１Ｘ１２Ｌ およびＦＹＸ８ＹＦＸ１１Ｘ１２Ｌから選択される方法。
  56. 請求項５５に記載の方法であって、前記アミノ酸配列はＦＹＸ８Ｘ９ＬＸ１１Ｘ１２Ｌである方法。
  57. 請求項５５に記載の方法であって、前記アミノ酸配列はＦＹＸ８ＹＦＸ１１Ｘ１２Ｌである方法。
  58. 請求項４８に記載の方法であって、前記アミノ酸配列Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３は、更にアミノ末端にアミノ酸Ｘ９８およびＸ９９を含み、且つカルボキシ末端にＸ１００を含んでいて、Ｘ９８Ｘ９９Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１００を形成しており、ここでＸ９８は任意にアスパラギン酸であり、Ｘ９９は独立にグリシン、グルタミンおよびプロリンから選択されるアミノ酸であり、またＸ１００は疎水性アミノ酸である方法。
  59. 請求項５８に記載の方法であって、Ｘ１００は脂肪族アミノ酸である方法。
  60. 請求項５９に記載の方法であって、Ｘ１００はロイシンである方法。
  61. 請求項４８に記載の方法であって、前記アミノ酸配列は少なくとも約１０−５ Ｍの親和性でインスリン受容体に結合する方法。
  62. 請求項６１に記載の方法であって、前記親和性は約１０−７ Ｍの間である方法。
  63. 請求項４８に記載の方法であって、前記アミノ酸配列は ＤＹＫＤＦＹＤＡＩＤＱＬＶＲＧＳＡＲＡＧＧＴＲＤ またはＫＤＲＡＦＹＮＧＬＲＤＬＶＧＡＶＹＧＡＷＤを含む方法。
  64. 請求項４８に記載の方法であって、前記アミノ酸配列は、図２Ａ〜図２Ｐに列記したアミノ酸配列の群から選択される方法。
  65. Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３を含むアミノ酸配列であって、ここでＸ６およびＸ７は芳香族アミノ酸またはグルタミンであり、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１１およびＸ１２は何れのアミノ酸でもよく、Ｘ１０およびＸ１３は疎水性アミノ酸であり、また前記アミノ酸配列はＩＧＦ−１Ｒに結合するアミノ酸配列。
  66. 請求項６５に記載のアミノ酸配列であって、前記結合は少なくとも約１０−５ Ｍの親和性（Ｋｄ）で生じるアミノ酸配列。
  67. 請求項６６に記載のアミノ酸配列であって、前記結合は少なくとも約１０−７ Ｍの親和性（Ｋｄ）で生じるアミノ酸配列。
  68. 請求項６５に記載のアミノ酸配列であって、Ｘ６およびＸ７はフェニルアラニンまたはチロシンであり、Ｘ１０およびＸ１３はロイシン、イソロイシン、トリプトファン、フェニルアラニンまたはメチオニンであるアミノ酸配列。
  69. 請求項６８に記載のアミノ酸配列であって、Ｘ６はフェニルアラニンであり、Ｘ７はチロシンであるアミノ酸配列。
  70. 請求項６８に記載のアミノ酸配列であって、Ｘ１０はイソロイシンであるアミノ酸配列。
  71. 請求項６８に記載のアミノ酸配列であって、Ｘ１０はロイシンであるアミノ酸配列。
  72. 請求項６９に記載のアミノ酸配列であって、Ｘ１３はロイシンであるアミノ酸配列。
  73. 請求項６９に記載のアミノ酸配列であって、Ｘ９はチロシンであり、Ｘ１０はフェニルアラニンであるアミノ酸配列。
  74. 請求項６８に記載のアミノ酸配列であって、ＦＹＸ８Ｘ９ＬＸ１１Ｘ１２Ｌ、ＦＹＸ８Ｘ９ＩＸ１１Ｘ１２Ｌ およびＦＹＸ８ＹＦＸ１１Ｘ１２Ｌから選択されるアミノ酸配列。
  75. 請求項７４に記載のアミノ酸配列であって、ＦＹＸ８Ｘ９ＩＸ１１Ｘ１２Ｌであるアミノ酸配列。
  76. 請求項７４に記載のアミノ酸配列であって、ＦＹＸ８Ｘ９ＬＸ１１Ｘ１２Ｌであるアミノ酸配列。
  77. 請求項７４に記載のアミノ酸配列であって、ＦＹＸ８ＹＦＸ１１Ｘ１２Ｌであるアミノ酸配列。
  78. 請求項６５に記載のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３は、更にアミノ末端にアミノ酸Ｘ９８およびＸ９９を含み、且つカルボキシ末端にＸ１００を含んでいて、Ｘ９８Ｘ９９Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１００を形成しており、ここでＸ９８は任意にアスパラギン酸であり、Ｘ９９は独立にグリシン、グルタミンおよびプロリンから選択されるアミノ酸であり、またＸ１００は疎水性アミノ酸であるアミノ酸配列。
  79. 請求項７８に記載のアミノ酸配列であって、Ｘ１００は脂肪族アミノ酸であるアミノ酸配列。
  80. 請求項７９に記載のアミノ酸配列であって、Ｘ１００はロイシンであるアミノ酸配列。
  81. 請求項６８に記載のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列はＤＹＫＤＦＹＤＡＩＤＱＬＶＲＧＳＡＲＡＧＧＴＲＤ またはＫＤＲＡＦＹＮＧＬＲＤＬＶＧＡＶＹＧＡＷＤＫＫを含むアミノ酸配列。
  82. 請求項８１に記載のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列はＤＹＫＤＦＹＤＡＩＤＱＬＶＲＧＳＡＲＡＧＧＴＲＤを含むアミノ酸配列。
  83. 請求項６８に記載のアミノ酸配列であって、図２Ａ〜図２Ｐに列記したアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列。
  84. 下記からなる群から選択されるアミノ酸配列。
    Figure 2004512010
  85. 請求項６５に記載のアミノ酸配列であって、アミノ酸配列Ｘ１１５Ｘ１１６Ｘ１１７Ｘ１１８ＦＹＸ８ＹＦＸ１１Ｘ１２ＬＸ１１９Ｘ１２０Ｘ１２１Ｘ１２２を含み、ここでＸ１１５はトリプトファン、グリシン、アスパラギン酸、グルタミン酸および アルギニンからなる群から選択され、Ｘ１１６はアスパラギン酸、ヒスチジン、グリシンおよびアスパラギンからなる群から選択され、Ｘ１１７およびＸ１１８はグリシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギンおよびアラニンからなる群から選択され、Ｘ８ はアルギニン、グリシン、グルタミン酸およびセリンからなる群から選択され、Ｘ１１はグルタミン酸、アスパラギン、グルタミンおよびトリプトファンからなる群から選択され、Ｘ１２はアスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、リジンおよびグルタミンからなる群から選択され、Ｘ１１９はグルタミン酸、グリシン、グルタミン、アスパラギン酸およびアラニンからなる群から選択され、Ｘ１２０はグルタミン酸、アスパラギン酸、グリシンおよびグルタミンからなる群から選択され、Ｘ１２１はトリプトファン、チロシン、グルタミン酸、フェニルアラニン、ヒスチジンおよびアスパラギン酸からなる群から選択され、Ｘ１２２はグルタミン酸、アスパラギン酸およびグリシンからなる群から選択されるアミノ酸配列。
  86. 請求項８５に記載のアミノ酸配列であって、Ｘ１１５はトリプトファンであり、Ｘ１１７はグリシン、アスパラギン酸、グルタミン酸およびアスパラギンからなる群から選択され、Ｘ１１８はグリシン、アスパラギン酸、グルタミン酸およびアラニンからなる群から選択され、Ｘ１１、Ｘ１１９、Ｘ１２０およびＸ１２２はグルタミン酸であり、Ｘ１２は アスパラギン酸であり、Ｘ１２１はトリプトファンまたはチロシンであるアミノ酸配列。
  87. Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３を含むアミノ酸配列であって、ここでＸ６およびＸ７は芳香族アミノ酸またはグルタミンであり、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１１およびＸ１２は何れのアミノ酸でもよく、Ｘｌ０およびＸ１３は疎水性アミノ酸であり、また前記アミノ酸配列はＩＧＦ−１Ｒに対する結合がバックグラウンド以下であるようにＩＲに結合するアミノ酸配列。
  88. 哺乳類由来のＩＲの部位１に結合する方法であって、ＩＲに結合し且つ配列Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｘ２１を含むアミノ酸配列にＩＲを接触させることを含み、ここでＸ１４、Ｘ１７およびＸ１８は疎水性アミノ酸であり、Ｘ１５、Ｘ１６およびＸ１９は何れのアミノ酸であってもよく、またＸ２０およびＸ２１は芳香族アミノ酸である方法。
  89. 請求項８８に記載の方法であって、Ｘ１４およびＸ１７はロイシン、イソロイシンおよびバリンからなる群から選択され、Ｘ２０はチロシンおよびヒスチジンからなる群から選択され、またＸ２１はフェニルアラニンおよびチロシンからなる群から選択される方法。．
  90. 請求項８９に記載の方法であって、Ｘ１４およびＸｌ７はロイシンである方法。
  91. 請求項８９に記載の方法であって、Ｘ１４はロイシンである方法。
  92. 請求項８９に記載の方法であって、Ｘｌ７はロイシンである方法。
  93. 請求項８９に記載の方法であって、Ｘ２０はチロシンである方法。
  94. 請求項８９に記載の方法であって、Ｘ２１はフェニルアラニンである方法。
  95. 請求項９０に記載の方法であって、Ｘ１５は大アミノ酸である方法。
  96. 請求項８９に記載の方法であって、前記アミノ酸配列は更にＸ１０１Ｘ１０２Ｘ１０３を含むアミノ酸延長部を含み、ここでＸ１０３はアミノ末端でＸ１４に結合し、Ｘ１０１およびＸ１０２は極性アミノ酸であり、Ｘ１０３は疎水性アミノ酸である方法。
  97. 請求項９６に記載の方法であって、Ｘ１０１およびＸ１０２は独立してアスパラギン酸またはグルタミン酸であり、またＸ１０３ はロイシン、イソロイシンまたはバリンである方法。
  98. 哺乳類由来のＩＧＦ−１Ｒの部位１に結合する方法であって、ＩＲに結合し且つ配列Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｘ２１を含むアミノ酸配列にＩＧＦ−１Ｒを接触させることを含み、ここでＸ１４、Ｘ１７およびＸ１８は疎水性アミノ酸であり、Ｘ１５、Ｘ１６およびＸ１９は何れのアミノ酸であってもよく、またＸ２０ ａｎｄ Ｘ２１は芳香族アミノ酸である方法。
  99. 請求項９８に記載の方法であって、Ｘ１４およびＸ１７はロイシン、イソロイシンおよびバリンからなる群から選択され、Ｘ１８は芳香族アミノ酸であり、Ｘ２０はチロシンおよびヒスチジンからなる群から選択され、またＸ２１はフェニルアラニンおよびチロシンからなる群から選択される方法。．
  100. 請求項９８に記載の方法であって、前記アミノ酸配列は図３Ａ〜図３Ｄの配列から選択される配列を含む方法。
  101. 哺乳類細胞由来のＩＲの部位１に結合するアミノ酸配列であって、該配列はＸ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｘ２１を含み、ここでＸ１４、Ｘ１７およびＸ１８は疎水性アミノ酸であり、Ｘ１５、Ｘ１６およびＸ１９は如何なるアミノ酸であってもよく、またＸ２０およびＸ２１は芳香族アミノ酸であるアミノ酸配列。
  102. 請求項１０１に記載のアミノ酸配列であって、Ｘ１４およびＸ１７はロイシン、イソロイシンおよびバリンからなる群から選択され、Ｘ２０はフェニルアラニンおよびチロシンからなる群から選択されるアミノ酸配列。
  103. 請求項１０２に記載のアミノ酸配列であって、Ｘ１４およびＸ１７がロイシンであるアミノ酸配列。
  104. 請求項１０２に記載のアミノ酸配列であって、Ｘ１４がロイシンであるアミノ酸配列。
  105. 請求項１０２に記載のアミノ酸配列であって、Ｘ１７がロイシンであるアミノ酸配列。
  106. 請求項１０２に記載のアミノ酸配列であって、Ｘ１８がトリプトファンであるアミノ酸配列。
  107. 請求項１０３に記載のアミノ酸配列であって、Ｘ２０がチロシンであるアミノ酸配列。
  108. 請求項１０７に記載のアミノ酸配列であって、Ｘ２１がフェニルアラニンであるアミノ酸配列。
  109. 請求項１０３に記載のアミノ酸配列であって、Ｘ１５が大アミノ酸であるアミノ酸配列。
  110. 請求項１０１に記載のアミノ酸配列であって、少なくとも一つのアミノ酸がＤ−アミノ酸であるアミノ酸配列。
  111. 請求項６５に記載のアミノ酸配列であって、少なくとも一つのアミノ酸がＤ−アミノ酸であるアミノ酸配列。
  112. 請求項１０２に記載のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列は更に、Ｘ１０１Ｘ１０２Ｘ１０３を含むアミノ酸延長部を含み、ここでＸ１０３はアミノ末端でＸ１４に結合し、Ｘ１０１およびＸ１０２は極性アミノ酸であり、またＸ１０３は疎水性アミノ酸であるアミノ酸配列。
  113. 請求項１１２に記載のアミノ酸配列であって、Ｘ１０１およびＸ１０２は独立してアスパラギン酸またはグルタミン酸であり、Ｘｌ０３はロイシン、イソロイシンまたはバリンであるアミノ酸配列。
  114. ＩＲへの結合がバックグラウンド以下であるように、哺乳類細胞由来のＩＲの部位１に結合するアミノ酸配列であって、該配列はＸ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｘ２１を含み、ここでＸ１４、Ｘ１７およびＸ１８は疎水性アミノ酸であり、Ｘ１５、Ｘ１６およびＸ１９は如何なるアミノ酸であってもよく、またＸ２０およびＸ２１は芳香族アミノ酸であるアミノ酸配列。
  115. 請求項１１４に記載のアミノ酸配列であって、Ｘ１４およびＸ１７はロイシン、イソロイシンおよびバリンからなる群から選択され、Ｘ１８は芳香族アミノ酸であり、Ｘ２０はチロシンおよびヒスチジンからなる群から選択され、Ｘ２１はフェニルアラニンおよびチロシンからなる群から選択されるアミノ酸配列。
  116. 哺乳類細胞由来のＩＲの部位２に結合する方法であって、前記細胞を、Ｘ２２Ｘ２３Ｘ２４Ｘ２５Ｘ２６Ｘ２７Ｘ２８Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１Ｘ３２Ｘ３３Ｘ３４Ｘ３５Ｘ３６Ｘ３７Ｘ３８Ｘ３９Ｘ４０Ｘ４１を含み、ここでＸ２２、Ｘ２５、Ｘ２６、Ｘ２８、Ｘ２９、Ｘ３０、Ｘ３３、Ｘ３４、Ｘ３５、Ｘ３７、Ｘ３８、Ｘ４０およびＸ４１は何れのアミノ酸でもよく、Ｘ２３は何れかの疎水性アミノ酸であり、Ｘ２７は極性アミノ酸であり、Ｘ３１は芳香族アミノ酸であり、Ｘ３２は小アミノ酸であり、位置Ｘ２４〜Ｘ２７には少なくとも一つのシステインが位置し、またＸ３９またはＸ４０には一つのシステインが位置するアミノ酸配列。
  117. 請求項１１６に記載の方法であって、Ｘ２４およびＸ３９がシステインである方法。
  118. 請求項１１７に記載の方法であって、Ｘ２３はロイシン、イソロイシン、メチオニンおよびバリンからなる群から選択され、Ｘ２７はグルタミン酸、アスパラギン酸、アスパラギンおよびグルタミンからなる群から選択され、Ｘ３１はトリプトファンであり、Ｘ３２はグリシンであり、Ｘ３６は何れかの芳香族アミノ酸である方法。
  119. 請求項１１８に記載の方法であって、ＩＲへの結合が少なくとも約１０−５Ｍの親和性（Ｋｄ）で生じる方法。
  120. 請求項１１６に記載の方法であって、Ｘ２３はロイシンであり、Ｘ２７はグルタミン酸であり、 Ｘ３１はトリプトファンであり、またＸ３２はグリシンである方法。．
  121. 請求項１１６に記載の方法であって、前記アミノ酸配列はＨＬＣＶＬＥＥＬＦＷＧＡＳＬＦＧＹＣＳＧである方法。
  122. ＩＲに結合するアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列はＸ２２Ｘ２３Ｘ２４Ｘ２５Ｘ２６Ｘ２７Ｘ２８Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１Ｘ３２Ｘ３３Ｘ３４Ｘ３５Ｘ３６Ｘ３７Ｘ３８Ｘ３９Ｘ４０Ｘ４１を含み、ここでＸ２２、Ｘ２５、Ｘ２６、Ｘ２８、Ｘ２９、Ｘ３０、Ｘ３３、Ｘ３４、Ｘ３５、Ｘ３７、Ｘ３８、Ｘ４０およびＸ４１は何れのアミノ酸でもよく、Ｘ２３は何れかの疎水性アミノ酸であり、Ｘ２７は極性アミノ酸であり、Ｘ３１は芳香族アミノ酸であり、Ｘ３２は小アミノ酸であり、位置Ｘ２４〜Ｘ２７には少なくとも一つのシステインが位置し、またＸ３９またはＸ４０には一つのシステインが位置するアミノ酸配列。
  123. 請求項１２２に記載のアミノ酸配列であって、Ｘ２４およびＸ３９がシステインであるアミノ酸配列。
  124. 請求項１２３に記載のアミノ酸配列であって、Ｘ２３メチオニン、バリンおよびロイシンからなる群から選択され、Ｘ２７はグルタミン酸、アラニン、グリシン、グルタミン、アスパラギン酸およびバリンからなる群から選択され、Ｘ３ｌおよびＸ３２は小アミノ酸であり、Ｘ３６は芳香族アミノ酸であるアミノ酸配列。．
  125. 請求項１２２に記載のアミノ酸配列であって、ＩＲへの結合が少なくとも約１０−５Ｍの親和性（Ｋｄ）で生じるアミノ酸配列。
  126. 請求項１２４に記載のアミノ酸配列であって、Ｘ２３はロイシンであり、Ｘ２７はグルタミン酸であり、Ｘ３１はトリプトファンであり、またＸ３２はグリシンであるアミノ酸配列。
  127. 請求項１２２に記載のアミノ酸配列であって、該配列はＨＬＣＶＬＥＥＬＦＷＧＡＳＬＦＧＹＣＳＧであるアミノ酸配列。
  128. 哺乳類細胞におけるインスリン活性を調節する方法であって、前記細胞に対して、ＩＲに結合し且つアミノ酸配列Ｘ４２Ｘ４３Ｘ４４Ｘ４５Ｘ４６Ｘ４７Ｘ４８Ｘ４９Ｘ５０Ｘ５１Ｘ５２Ｘ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６Ｘ５７Ｘ５８Ｘ５９Ｘ６０Ｘ６１を含むアミノ酸配列を投与することを含み、ここでＸ４２、Ｘ４３、Ｘ４４、Ｘ４５、Ｘ５３、Ｘ５５、Ｘ５６、Ｘ５８、Ｘ６０およびＸ６１は何れのアミノ酸でもよく、Ｘ４３、Ｘ４６、Ｘ４９、Ｘ５０およびＸ５４は疎水性アミノ酸であり、Ｘ４７．およびＸ５９はシステインであり、Ｘ４８は極性アミノ酸であり、Ｘ５１、Ｘ５２およびＸ５７は小アミノ酸である方法。
  129. 請求項１２８に記載の方法であって、Ｘ４３およびＸ４６ はロイシンであり、Ｘ４８はアスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群から選択され、Ｘ５０はフェニルアラニンまたはチロシンであり、Ｘ５１、Ｘ５２およびＸ５７はグリシンである方法。
  130. 請求項１２９に記載の方法であって、Ｘ４８はグルタミン酸であり、Ｘ５０はフェニルアラニンである方法。
  131. 請求項１３０に記載の方法であって、前記アミノ酸配列はＸ４２Ｘ４３Ｘ４４Ｘ４５ＬＣＥＸ４９ＦＧＧＸ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６ＧＸ５８ＣＸ６０Ｘ６１である方法。
  132. 請求項１３１に記載の方法であって、前記アミノ酸配列はＤＬＲＶＬＣＥＬＦＧＧＡＹＶＬＧＹＣＳＥ、またはＤＬＲＶＬＣＥＬＦＧＧＡＹＶＲＧＹＣＳＥである方法。
  133. 請求項１２８に記載のアミノ酸配列であって、前記ＩＲへの結合は、少なくとも約１０−５ Ｍの親和性（Ｋｄ）で生じるアミノ酸配列。
  134. ＩＲに結合するアミノ酸配列であって、該アミノ酸配列はＸ４２Ｘ４３Ｘ４４Ｘ４５Ｘ４６Ｘ４７Ｘ４８Ｘ４９Ｘ５０Ｘ５１Ｘ５２Ｘ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６Ｘ５７Ｘ５８Ｘ５９Ｘ６０Ｘ６１を含み、ここでＸ４２、Ｘ４３、Ｘ４４、Ｘ４５、Ｘ５３、Ｘ５５、Ｘ６０およびＸ６１は何れのアミノ酸でもよく、Ｘ４３、Ｘ４６、Ｘ４９、Ｘ５０およびＸ５４は疎水性アミノ酸であり、Ｘ４７およびＸ５９はシステインであり、Ｘ４８は極性アミノ酸であり、Ｘ５２、Ｘ５２およびＸ５７は小アミノ酸であるアミノ酸配列。
  135. 請求項１３４に記載のアミノ酸配列であって、前記Ｘ４３およびＸ４６はロイシンであり、Ｘ４８はアスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群から選択され、Ｘ５０はフェニルアラニンまたはチロシンであり、Ｘ５１、Ｘ５２およびＸ５７はグリシンであるアミノ酸配列。
  136. 請求項１３５に記載のアミノ酸配列であって、Ｘ４８はグルタミン酸であり、Ｘ５０はフェニルアラニンであるアミノ酸配列。
  137. 請求項１３６に記載のアミノ酸配列であって、該配列はＸ４３Ｘ４４Ｘ４５ＬＣＥＸ４９ＦＧＧＸ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６ＧＸ５８ＣＸ６０Ｘ６１を含むアミノ酸配列。
  138. 請求項１３７に記載のアミノ酸配列であって、該配列はＤＬＲＶＬＣＥＬＦＧＧＡＹＶＬＧＹＣＳＥ またはＤＬＲＶＬＣＥＬＦＧＧＡＹＶＲＧＹＣＳＥを含むアミノ酸配列。
  139. 哺乳類細胞におけるインスリン活性を調節する方法であって、Ｘ６２Ｘ６３Ｘ６４Ｘ６５Ｘ６６Ｘ６７Ｘ６８Ｘ６９Ｘ７０Ｘ７１Ｘ７２Ｘ７３Ｘ７４Ｘ７５Ｘ７６Ｘ７７Ｘ７８Ｘ７９Ｘ８０Ｘ８１を含むアミノ酸配列を前記細胞に投与することを含み、ここでＸ６２、Ｘ６５、Ｘ６６、Ｘ６８、Ｘ６９、Ｘ７１、Ｘ７３、Ｘ７６、Ｘ７７、Ｘ７８、Ｘ８０およびＸ８１は何れのアミノ酸でもよく、Ｘ６３、Ｘ７０およびＸ７４は疎水性アミノ酸であり、Ｘ６４は極性アミノ酸であり、Ｘ６７およびＸ７５は芳香族アミノ酸であり、Ｘ７２およびＸ７９はシステインある方法。
  140. 請求項１３９に記載の方法であって、Ｘ６３はロイシン、イソロイシン、メチオニンおよびバリンからなる群から選択され、Ｘ７０およびＸ７４はバリン、イソロイシン、ロイシンおよびメチオニンからなる群から選択され、Ｘ６４ はアスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群から選択され、Ｘ６７はトリプトファンであり、Ｘ７５はチロシンおよびトリプトファンからなる群から選択される方法。
  141. 請求項１４０に記載の方法であって、Ｘ６６はグルタミン酸である方法。
  142. 請求項１４１に記載の方法であって、Ｘ６３はロイシンである方法。
  143. 請求項１４０に記載の方法であって、Ｘ７４はバリンである方法。
  144. 請求項１４１に記載の方法であって、Ｘ６４はグルタミン酸である方法。
  145. 請求項１４１に記載の方法であって、Ｘ７５はチロシンである方法。
  146. 請求項１４０に記載の方法であって、前記アミノ酸配列はＷＬＤＱＥＷＡＷＶＱＣＥＶＹＧＲＧＣＰＳを含む方法。
  147. ＩＲに結合するアミノ酸配列であって、該アミノ酸配列はＸ６２Ｘ６３Ｘ６４Ｘ６５Ｘ６６Ｘ６７Ｘ６８Ｘ６９Ｘ７０Ｘ７１Ｘ７２Ｘ７３Ｘ７４Ｘ７５Ｘ７６Ｘ７７Ｘ７８Ｘ７９Ｘ８０Ｘ８１を含み、ここでＸ６２、Ｘ６５、Ｘ６６、Ｘ６８、Ｘ６９、Ｘ７１、Ｘ７３、Ｘ７６、Ｘ７７、Ｘ７８、Ｘ８０およびＸ８１は何れのアミノ酸でもよく、Ｘ６３、Ｘ７０およびＸ７４は疎水性アミノ酸であり、Ｘ６４は極性アミノ酸であり、Ｘ６７およびＸ７５は芳香族アミノ酸であり、Ｘ７２およびＸ７９はシステインあるアミノ酸配列。
  148. 請求項１４７に記載のアミノ酸配列であって、Ｘ６３はロイシン、イソロイシン、メチオニンおよびバリンからなる群から選択され、Ｘ７０およびＸ７４はバリン、イソロイシン、ロイシンおよびメチオニンからなる群から選択され、Ｘ６４はアスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群から選択され、Ｘ６７はトリプトファンであり、Ｘ７５はチロシンおよびトリプトファンからなる群から選択されるアミノ酸配列。
  149. 請求項１４８に記載のアミノ酸配列であって、Ｘ６６はグルタミン酸であるアミノ酸配列。
  150. 請求項１４９に記載のアミノ酸配列であって、Ｘ６３はロイシンであるアミノ酸配列。
  151. 請求項１４８に記載のアミノ酸配列であって、Ｘ７４はバリンであるアミノ酸配列。
  152. 請求項１４９に記載のアミノ酸配列であって、Ｘ６４はグルタミン酸であるアミノ酸配列。
  153. 請求項１４８に記載のアミノ酸配列であって、Ｘ７５はチロシンであるアミノ酸配列。
  154. 請求項１４８に記載のアミノ酸配列であって、該アミノ酸配列はＷＬＤＱＥＷＡＷＶＱＣＥＶＹＧＲＧＣＰＳを含むアミノ酸配列。
  155. 請求項１４８に記載のアミノ酸配列であって、前記ＩＲへの結合の親和性は少なくとも約１０−５ Ｍであるアミノ酸配列。
  156. 請求項１４８に記載のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列は図６Ａ〜図６Ｆの配列から選択される配列を含むアミノ酸配列。
  157. 哺乳類細胞におけるインスリン活性を調節する方法であって、ＩＲに結合し且つＨＸ８２Ｘ８３Ｘ８４Ｘ８５Ｘ８６Ｘ８７Ｘ８８Ｘ８９Ｘ９０Ｘ９１Ｘ９２を含むアミノ酸配列を前記細胞に投与することを含み、ここでＸ８２はプロリンまたはアラニンであり、Ｘ８３は小アミノ酸であり、Ｘ８４はロイシン、セリンおよびスレオニンからなる群から選択され、Ｘ８５は極性アミノ酸であり、Ｘ８６は何れのアミノ酸でもよく、Ｘ８７は脂肪族アミノ酸であり、Ｘ８８、Ｘ８９およびＸ９０は何れのアミノ酸でもよく、Ｘ９１およびＸ９２は脂肪族アミノ酸である方法。
  158. 請求項１５７に記載の方法であって、Ｘ８２はプロリンであり、Ｘ８３はプロリン、セリンおよびスレオニンからなる群から選択され、Ｘ８４はロイシンであり、Ｘ８５はグルタミン酸、セリン、リジンおよびアスパラギンからなる群から選択され、Ｘ８６は極性アミノ酸であり、Ｘ８７はロイシン、メチオニンおよびイソロイシンからなる群から選択され、Ｘ９１およびＸ９２はロイシンである方法。
  159. 請求項１５８に記載の方法であって、Ｘ８３はプロリンである方法。
  160. 請求項１５８に記載の方法であって、Ｘ８５はセリンである方法。
  161. 請求項１５８に記載の方法であって、Ｘ８６はヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸およびグルタミンからなる群から選択される方法。
  162. 請求項１５８に記載の方法であって、Ｘ８７はロイシンである方法。
  163. 請求項１５８に記載の方法であって、Ｘ９２はフェニルアラニンである方法。
  164. 請求項１６０に記載の方法であって、前記アミノ酸配列はＨＰＰＬＳＸ８６ＬＸ８８Ｘ８９Ｘ９０ＬＬである方法。
  165. 請求項１５８に記載の方法であって、前記アミノ酸配列はＨＰＰＬＥＨＬＫＡＦＬＬ、ＨＰＰＬＳＥＬＫＬＦＬＩ、ＨＰＳＬＳＤＭＲＷＩＬＬ、ＨＰＴＳＫＥＩＹＡＫＬＬ、ＨＰＴＳＫＥＩＹＡＫＬＬ、ＨＰＳＴＮＱＭＬＭＫＬＦおよびＨＡＰＬＳＶＬＱＡＬＬからなる群から選択される方法。
  166. ＩＲに結合するアミノ酸配列であって、該アミノ酸配列はＨＸ８２Ｘ８３Ｘ８４Ｘ８５Ｘ８６Ｘ８７Ｘ８８Ｘ８９Ｘ９０Ｘ９１Ｘ９２を含み、ここでＸ８２はプロリンまたはアラニンであり、Ｘ８３は小アミノ酸であり、Ｘ８４はロイシン、セリンおよびスレオニンからなる群から選択され、Ｘ８５は極性アミノ酸であり、Ｘ８６は何れのアミノ酸でもよく、Ｘ８７は脂肪族アミノ酸であり、Ｘ８８、Ｘ８９およびＸ９０は何れのアミノ酸でもよく、Ｘ９１およびＸ９２は脂肪族アミノ酸であるアミノ酸配列。
  167. 請求項１６６に記載のアミノ酸配列であって、Ｘ８２はプロリンであり、Ｘ８３はプロリン、セリンおよびスレオニンからなる群から選択され、Ｘ８４はロイシンであり、Ｘ８５はグルタミン酸、セリン、リジンおよびアスパラギンからなる群から選択され、Ｘ８６は極性アミノ酸であり、Ｘ８７はロイシン、メチオニンおよびイソロイシンからなる群から選択され、Ｘ９１およびＸ９２はロイシンであるアミノ酸配列。
  168. 請求項１６７に記載のアミノ酸配列であって、Ｘ８３はプロリンであるアミノ酸配列。
  169. 請求項１６７に記載のアミノ酸配列であって、Ｘ８５はセリンであるアミノ酸配列。
  170. 請求項１６７に記載のアミノ酸配列であって、Ｘ８６はヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸およびグルタミンからなる群から選択されるアミノ酸配列。
  171. 請求項１６７に記載のアミノ酸配列であって、Ｘ８７はロイシンであるアミノ酸配列。
  172. 請求項１６７に記載のアミノ酸配列であって、Ｘ９２はフェニルアラニンであるアミノ酸配列。
  173. 請求項１６９に記載のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列はＨＰＰＬＳＸ８６ＬＸ８８Ｘ８９Ｘ９０ＬＬであるアミノ酸配列。
  174. 請求項１６７に記載のアミノ酸配列であって、該アミノ酸配列は ＨＰＰＬＥＨＬＫＡＦＬＬ、ＨＰＰＬＳＥＬＫＬＦＬＩ、ＨＰＳＬＳＤＭＲＷＩＬＬ、ＨＰＴＳＫＥＩＹＡＫＬＬ、ＨＰＴＳＫＥＩＹＡＫＬＬ、ＨＰＳＴＮＱＭＬＭＫＬＦ およびＨＡＰＬＳＶＬＱＡＬＬからなる群から選択されるアミノ酸配列。
  175. 哺乳類細胞におけるインスリン活性を調節する方法であって、Ｘ１０４Ｘ１０５Ｘ１０６Ｘ１０７Ｘ１０８Ｘ１０９Ｘ１１０Ｘ１１１Ｘ１１２Ｘ１１３Ｘ１１４を含むアミノ酸配列を前記細胞に投与することを含み、ここでＸ１０６〜Ｘ１１１の少なくとも一つのアミノ酸はトリプトファンであり、Ｘ１０４およびＸ１１４は両者共に小アミノ酸であり、Ｘ１０５は何れかのアミノ酸であり、少なくともＸ１０４、Ｘ１０５、Ｘ１０６の一つおよびＸ１１２Ｘ１１３Ｘ１１４の一つはシステイン残基である方法。
  176. 請求項１７５に記載の方法であって、Ｘ１０６〜Ｘ１１１の少なくとも二つのアミノ酸は、少なくとも二つのアミノ酸によって相互に分離さされたトリプトファンである方法。
  177. 請求項１７６に記載の方法であって、前記分離しているアミノ酸はプロリン、スレオニンおよびチロシンからなる群から選択される方法。
  178. 請求項１７７に記載の方法であって、前記アミノ酸配列はＷＰＴＹＷを含む方法。
  179. 請求項１７８に記載の方法であって、Ｘ１０５およびＸ１１３はシステイン残基である方法。
  180. 請求項１７８に記載の方法であって、Ｘ１０４およびＸ１１４はアラニンおよびグリシンからなる群から選択される方法。
  181. 請求項１８０に記載の方法であって、Ｘ１０４はアラニンであり、Ｘ１１４はグリシンである方法。
  182. 請求項１８１に記載の方法であって、Ｘ１０５はバリンである方法。
  183. 請求項１８２に記載の方法であって、Ｘ１１２はアスパラギンである方法。
  184. 請求項１９８に記載の方法であって、ＩＲへの結合の親和性（Ｋｄ）が少なくとも約１０−５Ｍである方法。
  185. 哺乳類細胞におけるインスリン活性を調節する方法であって、図８に列記した群から選択されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を、前記細胞に投与することを含む方法。
  186. 請求項１８５に記載の方法であって、前記配列はＡＣＶＷＰＴＹＷＮＣＧを含む方法。
  187. ＩＲに結合し且つＸ１０４Ｘ１０５Ｘ１０６Ｘ１０７Ｘ１０８Ｘ１０９Ｘ１１０Ｘ１１１Ｘ１１２Ｘ１１３Ｘ１１４を含むアミノ酸配列であって、ここでＸ１０６〜Ｘ１１１の少なくとも一つのアミノ酸はトリプトファンであり、Ｘ１０４およびＸ１１４は両者共に小アミノ酸であり、Ｘ１０５は何れかのアミノ酸であり、少なくともＸ１０４、Ｘ１０５、Ｘ１０６の一つおよびＸ１１２Ｘ１１３Ｘ１１４の一つはシステイン残基であるアミノ酸配列。
  188. 請求項１８７に記載のアミノ酸配列であって、Ｘ１０６〜Ｘ１１１の少なくとも二つのアミノ酸は、少なくとも二つのアミノ酸によって相互に分離さされたトリプトファンであるアミノ酸配列。
  189. 請求項１８８に記載のアミノ酸配列であって、前記分離しているアミノ酸はプロリン、スレオニンおよびチロシンからなる群から選択されるアミノ酸配列。
  190. 請求項１８９に記載のアミノ酸配列であって、ＷＰＴＹＷを含むアミノ酸配列。
  191. 請求項１８９に記載のアミノ酸配列であって、Ｘ１０５およびＸ１１３はシステイン残基であるアミノ酸配列。．
  192. 請求項１９０に記載のアミノ酸配列であって、Ｘ１０４およびＸ１１４はアラニンおよびグリシンからなる群から選択されるアミノ酸配列。
  193. 請求項１９０に記載のアミノ酸配列であって、Ｘ１０４はアラニンであり、Ｘ１１４はグリシンであるアミノ酸配列。
  194. 請求項１９３に記載のアミノ酸配列であって、Ｘ１０５はバリンであるアミノ酸配列。
  195. 請求項１９４に記載のアミノ酸配列であって、Ｘ１１２はアスパラギンであるアミノ酸配列。
  196. 請求項２０２に記載のアミノ酸配列であって、ＩＲへの結合の親和性（Ｋｄ）が少なくとも約１０−５Ｍであるアミノ酸配列。
  197. 哺乳類細胞由来のＩＲに結合し、且つ図８に列記した群から選択されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列。
  198. 請求項１９７に記載のアミノ酸配列であって、ＡＣＶＷＰＴＹＷＮＣＧを含む配列。
  199. 哺乳類細胞にインスリンアゴニスト活性を与える方法であって、前記細胞に、ＤＹＫＤＬＣＱＳＷＧＶＲＩＧＷＬＡＧＬＣＰＫＫを含むアミノ酸配列を投与することを含む方法。
  200. 哺乳類細胞におけるインスリン活性を調節する方法であって、図９〜図１１に列記した群から選択されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を、前記細胞に投与することを含む方法。
  201. ＤＹＫＤＬＣＱＳＷＧＶＲＩＧＷＬＡＧＬＣＰＫＫを含むアミノ酸配列。
  202. 図９〜図１１に列記した群から選択されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列。
  203. 独立にＩＲに結合する少なくとも二つのアミノ酸配列を含み、これら配列の少なくとも一つはインスリンまたはその断片ではないアミノ酸配列。
  204. 請求項２０３に記載のアミノ酸配列であって、前記二つのアミノ酸配列はＩＲの部位１に結合するアミノ酸配列。
  205. 請求項２０３に記載のアミノ酸配列であって、一方のアミノ酸配列はＩＲの部位１に結合し、他方はＩＲの部位２に結合するアミノ酸配列。
  206. 請求項２０３に記載のアミノ酸配列であって、前記配列の少なくとも一つは、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５（ここでＸ１、Ｘ２、Ｘ４、およびＸ５ は芳香族アミノ酸であり、Ｘ３は何れの極性アミノ酸であってもよい）；Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３（ここでＸ６およびＸ７は芳香族アミノ酸またはグルタミンであり、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１１およびＸ１２は何れのアミノ酸であってもよく、Ｘ１０およびＸ１３は疎水性アミノ酸である）；およびＸ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｘ２１（ここでＸ１４、Ｘ１７およびＸ１８は疎水性アミノ酸であり、Ｘ１５、Ｘ１６およびＸ１９は何れのアミノ酸であってもよく、またＸ２０およびＸ２１は芳香族アミノ酸である）からなる群から選択されるアミノ酸配列。
  207. 請求項２０６に記載のアミノ酸配列であって、前記配列の少なくとも一つはＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５であり、ここでＸ１、Ｘ２、Ｘ４、およびＸ５は芳香族アミノ酸であり、Ｘ３は何れの極性アミノ酸であってもよいアミノ酸配列。
  208. 請求項２０６に記載のアミノ酸配列であって、前記配列の少なくとも一つはＦＹＸ３ＷＦを含むアミノ酸配列。
  209. 請求項２０６に記載のアミノ酸配列であって、前記配列の少なくとも一つはＸ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３を含み、ここでＸ６およびＸ７は芳香族アミノ酸またはグルタミンであり、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１１およびＸ１２は何れのアミノ酸であってもよく、Ｘ１０およびＸ１３は疎水性アミノ酸であるアミノ酸配列。
  210. 請求項２０６に記載のアミノ酸配列であって、前記配列の少なくとも一つはＦＹＸ８Ｘ９ＬＸ１１Ｘ１２Ｌを含むアミノ酸配列。
  211. 請求項２０６に記載のアミノ酸配列であって、前記配列の少なくとも一つはＸ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｘ２１を含み、ここでＸ１４、Ｘ１７およびＸ１８は疎水性アミノ酸であり、Ｘ１５、Ｘ１６およびＸ１９は何れのアミノ酸であってもよく、またＸ２０およびＸ２１は芳香族アミノ酸であるアミノ酸配列。
  212. 請求項２１１に記載のアミノ酸配列であって、前記配列の少なくとも一つはＬＸ１５Ｘ１６ＬＬＸ１９ＹＦを含むアミノ酸配列。
  213. 請求項２０３に記載のアミノ酸配列であって、前記配列の少なくとも一つは、Ｘ２２Ｘ２３Ｘ２４Ｘ２５Ｘ２６Ｘ２７Ｘ２８Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１Ｘ３２Ｘ３３Ｘ３４Ｘ３５Ｘ３６Ｘ３７Ｘ３８Ｘ３９Ｘ４０Ｘ４１（ここでＸ２２、Ｘ２５、Ｘ２６、Ｘ２８、Ｘ２９、Ｘ３０、Ｘ３３、Ｘ３４、Ｘ３５、Ｘ３６、Ｘ３７、Ｘ３８、Ｘ４０およびＸ４１は何れのアミノ酸でもよく、Ｘ２３は何れかの疎水性アミノ酸であり、Ｘ２７は極性アミノ酸であり、Ｘ３１は芳香族アミノ酸であり、Ｘ３２は小アミノ酸であり、位置Ｘ２４〜Ｘ２７には少なくとも一つのシステインが位置し、またＸ３９またはＸ４０には一つのシステインが位置する）；Ｘ４２Ｘ４３Ｘ４４Ｘ４５Ｘ４６Ｘ４７Ｘ４８Ｘ４９Ｘ５０Ｘ５１Ｘ５２Ｘ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６Ｘ５７Ｘ５８Ｘ５９Ｘ６０Ｘ６１（ここでＸ４２、Ｘ４３、Ｘ４４、Ｘ４５、Ｘ５３、Ｘ５５、Ｘ５６、Ｘ５８、Ｘ６０およびＸ６１は何れのアミノ酸でもよく、Ｘ４３、Ｘ４６、Ｘ４９、Ｘ５０およびＸ５４は疎水性アミノ酸であり、Ｘ４７およびＸ５９はシステインであり、Ｘ４８は極性アミノ酸であり、Ｘ５１、Ｘ５２およびＸ５７は小アミノ酸である）；またはＸ６２Ｘ６３Ｘ６４Ｘ６５Ｘ６６Ｘ６７Ｘ６８Ｘ６９Ｘ７０Ｘ７１Ｘ７２Ｘ７３Ｘ７４Ｘ７５Ｘ７６Ｘ７７Ｘ７８Ｘ７９Ｘ８０Ｘ８１（ここでＸ６２、Ｘ６５、Ｘ６６、Ｘ６８、Ｘ６９、Ｘ７１、Ｘ７３、Ｘ７６、Ｘ７７、Ｘ７８、Ｘ８０およびＸ８１は何れのアミノ酸でもよく、Ｘ６３、Ｘ７ ０およびＸ７４は疎水性アミノ酸であり、Ｘ６４は極性アミノ酸であり、Ｘ６７およびＸ７５は芳香族アミノ酸であり、Ｘ７２およびＸ７９はシステインある）を含むアミノ酸配列。
  214. 請求項２０３に記載のアミノ酸配列であって、前記配列の少なくとも一つは、ＨＸ８２Ｘ８３Ｘ８４Ｘ８５Ｘ８６Ｘ８７Ｘ８８Ｘ８９Ｘ９０Ｘ９１Ｘ９２（ここで、Ｘ８２はプロリンまたはアラニンであり、Ｘ８３は小アミノ酸であり、Ｘ８４はロイシン、セリンまたはスレオニンから選択され、Ｘ８５は極性アミノ酸であり、Ｘ８６は何れかのアミノ酸であり、Ｘ８７は脂肪族アミノ酸であり、Ｘ８８、Ｘ８９およびＸ９０は何れかのアミノ酸であり、Ｘ９１およびＸ９２は脂肪族アミノ酸である）；またはＸ４２Ｘ４３Ｘ４４Ｘ４５Ｘ４６Ｘ４７Ｘ４８Ｘ４９Ｘ５０Ｘ５１Ｘ５２Ｘ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６Ｘ５７Ｘ５８Ｘ５９Ｘ６０Ｘ６１（ここでＸ４２、Ｘ４３、Ｘ４４、Ｘ４５、Ｘ５３、Ｘ５５、Ｘ５６、Ｘ５８、Ｘ６０およびＸ６１は何れのアミノ酸でもよく、Ｘ４３、Ｘ４６、Ｘ４９、Ｘ５０およびＸ５４は疎水性アミノ酸であり、Ｘ４７およびＸ５９はシステインであり、Ｘ４８は極性アミノ酸であり、Ｘ５１、Ｘ５２およびＸ５７は小アミノ酸である）；またはＸ１０４Ｘ１０５Ｘ１０６Ｘ１０７Ｘ１０８Ｘ１０９Ｘ１１０Ｘ１１１Ｘ１１２Ｘ１１３Ｘ１１４（ここで、Ｘ１０６〜Ｘ１１１のアミノ酸のうち少なくとも一つはトリプトファンであり、Ｘ１０４およびＸ１１１は両者共に小アミノ酸であり、Ｘ１０５は何れかのアミノ酸であり、少なくともＸ１０４、Ｘ１０５、Ｘ１０６の一つおよびＸ１１２Ｘ１１３Ｘ１１４の一つはシステイン残基である）を含むアミノ酸配列。
  215. 請求項２０３に記載のアミノ酸配列であって、前記二つのアミノ酸配列はペプチドリンカーまたは非ペプチドリンカーで結合されているアミノ酸配列。
  216. 請求項２１５に記載のアミノ酸配列であって、前記リンカーは約２〜約１６アミノ酸からなるペプチドであるアミノ酸配列。
  217. 請求項２１５に記載のアミノ酸配列であって、前記リンカーは非ペプチドであるアミノ酸配列。
  218. 請求項２１７に記載のアミノ酸配列であって、前記リンカーはジアルデヒドであるアミノ酸配列。
  219. 請求項２０３に記載のアミノ酸配列であって、下記からなる群から選択されるアミノ酸配列。
    Figure 2004512010
  220. 部位１および／または部位２でＩＲに結合し、且つインスリン、ＩＧＦまたはそれらの断片ではないアミノ酸配列をコードする核酸配列。
  221. 請求項２２０に記載の核酸配列であって、ＦＹＤＷＦ、ＦＹＥＷＦ、ＦＨＥＮＦＹＤＷＦ、ＦＨＥＮＦＹＤＷＦＶＲＱＶＳＫ、ＤＹＫＤＶＴＦＴＳＡＶＦＨＥＮＦＹＤＷＦＶＲＱＶＳＫＫ、ＧＲＶＤＷＬＱＲＮＡＮＦＹＤＷＦＶＡＥＬＧ およびＡＰＴＦＹＡＷＦＮＱＱＴからなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸配列。
  222. 請求項２２０に記載の核酸配列であって、ＤＹＫＤＦＹＤＡＩＤＱＬＶＲＧＳＡＲＡＧＧＴＲＤＫＫ およびＫＤＲＡＦＹＮＧＬＲＤＬＶＧＡＶＹＧＡＷＤＫＫからなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸配列。
  223. 請求項２２０に記載の核酸配列であって、下記からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸配列
    Figure 2004512010
  224. ＩＧＦ−１受容体に結合する化合物を同定するためのキットであって、ＩＧＦ−１受容体と、部位１または部位２で前記受容体に結合する式１〜式１０から選択されるアミノ酸配列または図９〜図１１のアミノ酸配列とを含むキット。
  225. 請求項２２４に記載のキットであって、前記アミノ酸配列はアミノ酸配列 ＦＹＤＷＦを含むキット。
  226. 請求項２２５に記載のキットであって、前記アミノ酸配列はアミノ酸配列 ＳＡＫＮＦＹＤＷＦＶＫＫを含むキット。
  227. 請求項２２６に記載のキットであって、前記アミノ酸配列はアミノ酸配列 ＦＹＳＬＬＡＳＬを含むキット。
  228. 請求項２２７に記載のキットであって、前記アミノ酸配列はアミノ酸配列 ＱＭＫＤＩＦＹＳＬＬＡＳＬＡＡＫＫを含むキット。
  229. ＩＲ受容体に結合する化合物を同定するためのキットであって、ＩＲと、部位１または部位２で前記ＩＲに結合する式１〜式１１から選択されるアミノ酸配列または図９および図１１のアミノ酸配列とを含むキット。
  230. 部位１でＩＧＦ−１受容体に特異的に結合するＩＧＦアゴニストであるアミノ酸配列（但し、該アミノ酸配列はＩＧＦ−１、インスリンまたはそれらの断片ではない）と、薬学的に許容可能なキャリアとを含有する薬学的組成物。
  231. 請求項２３０に記載の組成物であって、前記ペプチドはアミノ酸配列 ＮＦＹＤＷＦＶを含む組成物。
  232. 請求項２３０に記載の組成物であって、前記ペプチドはアミノ酸配列 ＱＭＫＤＩＦＹＳＬＬＡＳＬＡＡを含む組成物。
  233. 部位１でＩＲ受容体に特異的に結合するインスリンアゴニストであるアミノ酸配列と、薬学的に許容可能なキャリアとを含有する薬学的組成物（但し、前記アミノ酸配列はインスリン、ＩＧＦまたはそれらの断片ではない）。
  234. 請求項２３３に記載の組成物であって、前記ペプチドはアミノ酸配列 ＦＹＤＷＦを含む組成物。
  235. 請求項２３３に記載の組成物であって、前記ペプチドはアミノ酸配列 ＦＹＳＬＬＡＳＬを含む組成物。
  236. 糖尿病を治療する方法であって、治療を必要としている個体に対して、部位１でＩＲに結合するインスリンアゴニストである治療的有効量のアミノ酸配列を投与することを含む方法（但し、前記アミノ酸配列はインスリン、ＩＧＦまたはそれらの断片ではない）。
  237. 請求項２３６に記載の方法であって、前記アミノ酸配列は、前記個体に投与される組換えベクターによって発現される方法。
  238. 請求項２３６に記載の方法であって、前記アミノ酸配列は、ポリペプチドとして前記個体に投与される方法。
  239. ＩＧＦ感受性の腫瘍を有する患者を治療する方法であって、治療を必要としている個体に対して、治療的有効量のＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストであるアミノ酸配列を投与することを含む方法（但し、前記アミノ酸配列はインスリン、ＩＧＦまたはそれらの断片ではない）。
  240. 請求項２３９に記載の方法であって、前記アミノ酸配列は、前記個体に投与される組換えベクターにより発現される方法。
  241. 請求項２３９に記載の方法であって、前記アミノ酸配列は、ポリペプチドとして前記個体に投与される方法。
  242. ＩＲに結合する化合物をスクリーニングする方法であって：
    ｉ） 表面にＩＲまたはその断片を固定化することと；
    ｉｉ） 前記ＩＲまたはその断片を、ＩＲに結合する式１〜式１０または図１０〜図１１から選択される既知量のラベルされたアミノ酸配列およびスクリーニングすべき化合物と共に、前記ラベルされたアミノ酸のＩＲへの結合を与える条件下でインキュベートすることと；
    ｉｉｉ） ＩＲに結合した前記ラベルされたアミノ酸配列の量を測定することと；
    ｉｖ） 結合したラベルされたペプチドの量から、前記化合物がＩＲに対して競争的に結合したかどうかを決定することとを含む方法。
  243. 請求項２４２に記載の方法により同定されたＩＲの部位１または部位２に結合できるアミノ酸配列であって、インスリン、ＩＧＦまたはその断片ではないアミノ酸配列。
  244. 請求項２４３に記載のアミノ酸配列であって、ＩＲアゴニストであるアミノ酸配列。
  245. 請求項２４３に記載のアミノ酸配列であって、ＩＲの部位１に結合するアミノ酸配列。
  246. 請求項２４３に記載のアミノ酸配列であって、ＩＲの部位２に結合するアミノ酸配列。
  247. ＩＧＦ−１Ｒに結合する化合物をスクリーニングする方法であって：
    ｉ） 表面にＩＧＦ−１Ｒまたはその断片を固定化することと；
    ｉｉ） 前記ＩＧＦ−１Ｒまたはその断片を、ＩＲに結合する式１〜式１０または図１０〜図１１から選択される既知量のラベルされたアミノ酸配列およびスクリーニングすべき化合物と共に、前記ラベルされたアミノ酸のＩＧＦ−１Ｒへの結合を与える条件下でインキュベートすることと；
    ｉｉｉ） ＩＧＦ−１Ｒに結合した前記ラベルされたアミノ酸配列の量を測定することと；
    ｉｖ） 結合したラベルされたペプチドの量から、前記化合物がＩＧＦ−１Ｒに対して競争的に結合したかどうかを決定することとを含む方法。
  248. 請求項２４７に記載の方法により同定されたＩＧＦ−１Ｒの部位１または部位２に結合できるアミノ酸配列であって、インスリン、ＩＧＦまたはその断片ではないアミノ酸配列。
  249. 請求項２４８に記載のアミノ酸配列であって、ＩＧＦアゴニストであるアミノ酸配列。
  250. 請求項２４８に記載のアミノ酸配列であって、ＩＧＦ−１Ｒの部位１に結合するアミノ酸配列。
  251. 請求項２４８に記載のアミノ酸配列であって、ＩＧＦ−１Ｒの部位２に結合するアミノ酸配列。
  252. ＷＸ１２３ＧＹＸ１２４ＷＸ１２５Ｘ１２６を含むアミノ酸配列であって、ここでＸ１２３はプロリン、グリシン、セリン、アルギニン、アラニンまたはロイシンであり、Ｘ１２４は何れかのアミノ酸であり、Ｘ１２５は疎水性アミノ酸であり、Ｘ１２６は何れかのアミノ酸であるアミノ酸配列。
  253. 請求項２５２に記載のアミノ酸配列であって、Ｘ１２３はプロリンであり、Ｘ１２５はロイシンまたはフェニルアラニンであるアミノ酸配列。
  254. 複数のメンバーを含む組換えペプチドライブラリーであって、該メンバーの大多数が式１のアミノ酸配列からなるペプチドライブラリー。
  255. 複数のメンバーを含む組換えペプチドライブラリーであって、該メンバーの大多数が式２のアミノ酸配列からなるペプチドライブラリー。
  256. 複数のメンバーを含む組換えペプチドライブラリーであって、該メンバーの大多数が式３のアミノ酸配列からなるペプチドライブラリー。
  257. 複数のメンバーを含む組換えペプチドライブラリーであって、該メンバーの大多数が式４のアミノ酸配列からなるペプチドライブラリー。
  258. 複数のメンバーを含む組換えペプチドライブラリーであって、該メンバーの大多数が式５のアミノ酸配列からなるペプチドライブラリー。
  259. 複数のメンバーを含む組換えペプチドライブラリーであって、該メンバーの大多数が式６のアミノ酸配列からなるペプチドライブラリー。
  260. 複数のメンバーを含む組換えペプチドライブラリーであって、該メンバーの大多数が式７のアミノ酸配列からなるペプチドライブラリー。
  261. 複数のメンバーを含む組換えペプチドライブラリーであって、該メンバーの大多数が式８のアミノ酸配列からなるペプチドライブラリー。
  262. 複数のメンバーを含む組換えペプチドライブラリーであって、該メンバーの大多数が式９のアミノ酸配列からなるペプチドライブラリー。
  263. 複数のメンバーを含む組換えペプチドライブラリーであって、該メンバーの大多数が式１０のアミノ酸配列からなるペプチドライブラリー。
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