JP2002501201A - インテグリンアンタゴニスト／アゴニスト仲介性疾患のリスク評価 - Google Patents

インテグリンアンタゴニスト／アゴニスト仲介性疾患のリスク評価

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ヘンリー ジェイ． ジョージ
ジーニン エム． ホーリス
グレゴリー エフ． ホーリス
ジェニファー イー． コーチー
カルン ティー． オニール
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デュポン ファーマシューティカルズ カンパニー
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、インテグリンアンタゴニスト／アゴニスト仲介性疾患状態を発症するリスクを有する患者の検出に関する。本発明はさらに、インテグリンアンタゴニストおよび／またはアゴニスト存在下でインテグリンに結合する薬物依存性抗体（ＤＤＡＢ）の、患者体液試料中での検出に有用なアッセイ、ならびにインテグリンアンタゴニスト／アゴニスト仲介性疾患状態を誘発する傾向がより低いインテグリンアンタゴニスト／アゴニストを同定するための方法にも関する。本発明はさらに、体液中のインテグリンを対象とする抗体の回収率を高め、その結果ＤＤＡＢ検出アッセイの感度と特異性とを増大させる方法、および、血小板表面からＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａの抗体を解離させ、それにより血小板上清からの回収率を高める、血液試料処理法にも関する。本発明はさらに、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト／アゴニストによる治療中に血小板減少症を早期に発症するリスクを有する患者を同定するために相異なるＧＰＩＩｂ／ＧＰＩＩＩａ調製物を使用し、それにより抗体検出の特異性を増大させることにも関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、インテグリンアンタゴニスト／アゴニスト仲介性疾患状態を発症す
るリスクを有する患者の検出に関する。本発明は、インテグリンアンタゴニスト
／アゴニスト存在下、インテグリンまたはインテグリン関連蛋白質またはその複
合体に結合する薬物依存性抗体の、患者体液試料中での検出に有用なアッセイに
関する。本発明はさらに、インテグリンアゴニストおよび／またはアンタゴニス
ト存在下、血小板糖蛋白質ＩＩｂ／ＩＩＩａ（ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ）を含むイ
ンテグリンに結合する薬物依存性抗体（ＤＤＡＢ）の、患者体液試料中での検出
に有用なアッセイにも関する。本発明はさらに、インテグリンアンタゴニスト／
アゴニスト仲介性疾患状態を誘発する傾向がより低いインテグリンアンタゴニス
ト／アゴニストを同定するための方法にも関する。
【０００２】 本発明はさらに、体液中のインテグリンを対象とする抗体（ｉｎｔｅｇｒｉｎ
-ｄｉｒｅｃｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）の回収率を高め、その結果ＤＤＡ Ｂ検出アッセイの感度と特異性とを増大させる方法にも関する。本発明は、血小
板表面からＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに対する抗体を解離させ、それにより血小板上
清からの回収率を高める、血液試料処理法にも関する。本発明はさらに、ＧＰＩ
Ｉｂ／ＩＩＩａアンタゴニストによる治療において血小板減少症／血栓塞栓症合
併症の早期発症のリスクを有する患者を同定するために、異なるＧＰＩＩｂ／Ｉ
ＩＩａ調製物を使用し、それにより抗体検出の特異性を増大させることに関する
。
【０００３】 本発明はさらに、ＤＤＡＢアッセイのための陽性対照および較正標準としての
ＤＤＡＢの使用にも関する。
【０００４】 このような方法およびアッセイは、インテグリンアンタゴニスト／アゴニスト
を用いた治療によって仲介される疾患状態発症のリスクを有する可能性のある患
者を同定するために有用である。
【０００５】 （発明の背景） 安定および不安定狭心症、心筋梗塞、卒中（ｓｔｒｏｋｅ）ならびに肺塞栓症
を含む血栓塞栓症は、多くの先進国における障害および死亡の主因である。最近
、これらの患者群を治療するために、ＧＰＩＩｂ／ＧＰＩＩＩａインテグリンへ
のリガンドの結合を妨害することを目的とした治療戦略が探究されている。血小
板ＧＰＩＩｂ／ＧＰＩＩＩａは、フィブリノゲンや、フィブロネクチン、ビトロ
ネクチンおよびフォン・ビルブラント因子を含むその他の接着性糖蛋白質の主な
血小板受容体である。この受容体とリガンドとの結合の妨害は、血栓塞栓症の動
物モデル（Ｃｏｌｌｅｒ，Ｂ．Ｓ．ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ Ａｎｔａｇｏｎｉｓ
ｔ：Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｉ
ｎｓｉｇｈｔｓ Ｆｒｏｍ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ Ｃ７Ｅ３ ＦＡＢ．Ｔｈｒ
ｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．７８：１，７３０−７３５，１９９７）、およびヒト
対象を含む限られた試験（Ｗｈｉｔｅ，Ｈ．Ｄ．Ｕｎｍｅｔ Ｔｈｅｒａｐｅｕ
ｔｉｃ Ｎｅｅｄｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ａｃｕｔｅ
Ｉｘｃｈｅｍｉａ．Ａｍ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ．８０：４Ａ，２Ｂ−１０Ｂ，
１９９７；Ｔｃｈｅｎ，Ｊ．Ｅ．Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ＩＩｂ／ＩＩＩａ
Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：Ｐｕｔｔｉｎｇ ＥＰＩＣ，ＩＭ
ＰＡＣＴ ＩＩ，ＲＥＳＴＯＲＥ，ａｎｄ ＥＰＩＬＯＧ Ｔｒｉａｌｓ Ｉｎ
ｔｏ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ．Ａｍ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ．７８：３Ａ，３５
−４０，１９９６）で有益であることが明らかにされている。
【０００６】 細胞外マトリックスリガンドまたはその他の細胞接着性蛋白質リガンドに結合
し、それにより細胞−細胞および細胞−マトリックス接着プロセスを仲介する、
インテグリンまたは接着性蛋白質受容体と呼ばれるいくつかの細胞表面受容体蛋
白質が同定されている。インテグリンは、遺伝子スーパーファミリーに属する遺
伝子によってコードされ、一般にはα−およびβ−サブユニットを含むヘテロダ
イマー膜貫通蛋白質からなっている。インテグリンサブファミリーは異なるα−
サブユニットと結合した共通のβ−サブユニットを含み、特異性の異なる接着性
蛋白質受容体を形成する。ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに加えて、いくつかのその他の
インテグリン細胞表面受容体が同定されている。例えば、β１サブファミリーに
含まれる、α４β１およびα５β１は、慢性関節リウマチ、アレルギー、喘息お
よび自己免疫異常を含む種々の炎症性プロセスに関係している。
【０００７】 インテグリンＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａは血小板フィブリノゲン受容体とも呼ばれ
ており、血小板凝集を仲介する膜蛋白質である。活性化された血小板におけるＧ
ＰＩＩｂ／ＩＩＩａは、４つの可溶性のＲＧＤ含有接着性蛋白質、すなわちフィ
ブリノゲン、フォン・ビルブラント因子、フィブロネクチン、およびビトロネク
チンと結合することが知られている。「ＲＧＤ」という用語はＡｒｇ−Ｇｌｙ−
Ａｓｐのアミノ酸配列を意味する。フィブリノゲンおよびフォン・ビルブラント
因子のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａへの結合によって血小板が凝集する。フィブリノゲ
ンの結合は部分的に、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａと結合する接着性蛋白質に共通のＲ
ＧＤ認識配列によって仲介される。ＲＧＤペプチド様ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアン
タゴニスト化合物は、フィブリノゲン結合を阻止し、血小板凝集および血小板血
栓の形成を防止することが知られている。ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト
は血栓塞栓症治療のための抗血小板療法に対する重要な新アプローチである。
【０００８】 ある種のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト投与を受けている患者の約１％
が、生命を脅かす血小板減少症を発症する。これらの血小板減少症の主因は、薬
物依存性抗血小板抗体の存在による、免疫仲介性と考えられている（Ｂｅｒｋｏ
ｗｉｔｚ，Ｓ．Ｄ．，Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｒ．Ａ．，Ｒｕｎｄ，Ｍ．Ｍ．，
ａｎｄ Ｔｃｈｅｎｇ，Ｊ．Ｅ．Ａｃｕｔｅ Ｐｒｏｆｏｕｎｄ Ｔｈｒｏｍｂ
ｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ Ａｆｔｅｒ Ｃ７Ｅ３ ＦＡＢ（ａｂｃｉｘｉｍａｂ）
Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９５：８０９−８１３，１９９７）
。しかし、このような薬物依存性抗血小板抗体は、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害剤
治療を受けているすべての患者で見られているわけではなく、ＧＰＩＩｂ／ＩＩ
Ｉａ阻害剤依存性血小板減少症のその他の原因があるであろうと推測される。
【０００９】 薬物依存性血小板減少症／血栓塞栓症の合併症の一般的現象は周知である。多
くの薬物の関連が示唆されている（Ｋｅｌｔｏｎ，Ｊ．Ｇ．，Ｓｈｅｒｉｄａｎ
，Ｄ．Ｐ．，Ｓａｎｔｏｓ，Ａ．Ｖ．，ｅｔ ａｌ．Ｈｅｐａｒｉｎ−ｉｎｄｕ
ｃｅｄ ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｓｔｕｄ
ｉｅｓ．Ｂｌｏｏｄ，１９８８，７２：９２５−９３０；Ｃｈｏｎｇ，Ｂ．，Ｂ
ｅｒｄｔ，Ｍ．Ｈｅｐａｒｉｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅ
ｎｉａ．Ｂｌｕｔ １９８９，５８：５３−５７；Ｃｕｒｔｉｓ，Ｂ．Ｒ．，Ｍ
ｃＦａｒｌａｎｄ，Ｊ．Ｇ．，Ｗｕ，Ｇ−Ｇ．，Ｖｉｓｅｎｔｉｎ，Ｇ．Ｐ．，
ａｎｄ Ａｓｔｅｒ，Ｒ．Ｈ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｓｕｌｆｏｎａ
ｍｉｄｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ ｃａｌｃｉｕｍ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｐｉｔｏｐｅ
ｓ ｏｎ ｔｈｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ＩＩｂ／ＩＩＩａ ｃｏｍｐｌ
ｅｘ．Ｂｌｏｏｄ，１９９４ ８４：１７６−１８３）が、臨床上重要な例はヘ
パリン誘発性血小板減少症（ＨＩＴ）（Ａｍｉｒａｌ，Ｊ．，Ｂｒｉｄｌｅｙ，
Ｆ．，Ｗｏｌｆ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｍａｃｒ
ｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｆａｃｔｏｒ ＩＶ−ｈｅｐａｒｉ
ｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｉｎ ｈｅｐａｒｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｈｒｏｍ
ｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ：Ａ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ４４ ｃａｓｅｓ．Ｔｈｒｏ
ｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．１９９５，７３：２１−２８；Ａｎｓｅｌｌ，Ｊ．，Ｄ
ｅｙｋｉｎ，Ｄ．，Ｈｅｐａｒｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏ
ｐｅｎｉａ ａｎｄ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ｔｈｒｏｍｂｏｅｍｂｏｌｉｓｍ．
Ａｍ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１９８０，８：３２５−３３２）、およびヘパリン
誘発性血栓性血小板減少症（ＨＩＴＴ）である。ＨＩＴおよびＨＩＴＴは、ヘパ
リン／血小板第ＩＶ因子／抗体複合体の形成によって誘導される薬物依存性抗血
小板抗体の血小板への結合に関与する、免疫由来のものであると考えられている
（Ｋａｒｐａｔｉｋｉｎ，Ｓ．，Ｄｒｕｇ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｈｒｍｂｏｃｙ
ｔｏｐｅｎｉａ．１９７１，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、
２６２：６８−７８）。血小板クリアランスは、細網内皮系（ＲＥＳ）によっ
て仲介されると考えられている。このような薬物／抗体複合体が血小板を活性化
し、血小板の分泌および凝集を直接引き起こすことが報告されている症例もある
（Ａｍｉｒａｌ，Ｊ．，Ｗｏｌｆ，Ｍ．，Ｆｉｓｈｅｒ，Ａ．Ｍ．，Ｂｏｙｅｒ
−Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｃ．，Ｖｉｓｓａｃ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｍｅｙｅｒ，Ｄ．
Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ＩｇＡ ａｎｄ／ｏｒ ＩｇＭ ａｎｔｉ
ｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｈｅｐａｒｉｎ−ｐｌａｔｅｌｅｔ Ｆａｃｔｏｒ ＩＶ
ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｈｅｐａｒｉｎ−
ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ．Ｂｒｉｔｉｃｈ Ｊ．ｏ
ｆ Ｈａｅｍ．１９９６，９２：９５４−９５９）。
【００１０】 原因不明の血小板減少症の症例は特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）と呼ば
れる。ほとんどの患者で、この疾患は、血小板膜糖蛋白質に対する自己抗体（Ｇ
ｏｎｚａｌｅｚ−Ｃｏｎｅｊｅｒｏ，Ｒ．，Ｒｉｖｅｒａ，Ｊ．，Ｒｏｓｉｌｌ
ｏ，Ｍ．Ｃ．，Ｌｏｚａｎｏ，Ｍ．Ｌ．，ａｎｄ Ｇａｒｃｉａ，Ｖ．Ｖ．，Ｃ
ｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｔｏ
ｄｅｔｅｃｔ ｆｒｅｅ ｐｌａｓｍａ ａｎｔｉｐｌａｔｅｌｅｔ ａｎｔ
ｉｂｏｄｉｅｓ．Ａｃｔａ Ｈａｅｍａｔｏｌ．，９６：１３５−１３９，１９
９６；Ｓｔｏｃｋｅｌｂｅｒ，Ｄ．，Ｈｏｕ，Ｍ．，Ｊａｃｏｂｓｏｎ，Ｓ．，
Ｋｕｔｔｉ，Ｊ．，Ｗａｄｅｎｖｉｋ，Ｈ．，Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌ
ａｔｅｌｅｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｉｄｉｏｐａｔ
ｈｉｃ ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ ｐｕｒｐｕｒａ（ＩＴＰ）．Ａ
ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙ ｕｓｉｎｇ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔ
ｒｙ，ａ ｗｈｏｌｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ＥＬＩＳＡ，ａｎｄ ａｎ ａｎｔ
ｉｇｅｎ ｃａｐｔｕｒｅ ＥＬＩＳＡ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．，５
６：７２−７７，１９９６）と、おそらくは糖脂質（Ａｒｎｏｕｔ，Ｊ．Ｔｈｅ
ｐａｔｈｏｇｅｎｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ
ｓｙｎｄｒｏｍｅ：Ａ ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｐａｒａ
ｌｌｅｌｉｓｍｓ ｗｉｔｈ ｈｅｐａｒｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｈｒｏｍｂ
ｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ．Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉ
ｓ，７５：５３６−５４１，１９９６，Ｇｕａｄｒａｄｏ，Ｍ．Ｊ．，Ｍｕｊｉ
ｃ，Ｆ．，Ｍｕｎｏｚ，Ｅ．，Ｋｈａｍａｓｈｔａ，Ｍ．Ａ．，Ｈｕｇｈｅｓ，
Ｇ．Ｒ．Ｖ．，Ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ ｉｎ ｔｈｅ ａｎｔｉｐ
ｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｒ
ｈｅｕｍａｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，５６：１９４−１９６，１９９７）とが
原因であると考えられ、ＲＥＳによるＩｇＧ感作血小板の除去が伴う。
【００１１】 ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト依存性薬物依存性抗体（ＤＤＡＢ）は、
本明細書では、（ａ）ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト存在下で血小板に結
合するが、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト非存在下では血小板に結合しな
い、または（ｂ）ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト非存在下で血小板に結合
するが、その結合もしくは血小板の活性化を誘導する能力がＧＰＩＩｂ／ＩＩＩ
ａアンタゴニストによって強化される、抗体と定義される。
【００１２】 ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ ＤＤＡＢは、例えば、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴ
ニストのＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａへの結合によって仲介または誘導される、ＧＰＩ
Ｉｂ／ＩＩＩａおよび／またはＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ関連蛋白質もしくは複合体
中の安定なネオエピトープに結合することができる。ＤＤＡＢはさらに、ＧＰＩ
Ｉｂ／ＩＩＩａおよび／またはＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ関連蛋白質もしくは複合体
と、アンタゴニストとの両方の一定の存在を必要とする不安定なネオエピトープ
、あるいはＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａおよび／またはＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ関連蛋白
質もしくは複合体と、アンタゴニスト／アゴニスト自体とからなる構造物にも結
合することができる。
【００１３】 患者はＤＤＡＢおよび／またはその他の薬物依存性メカニズムによって仲介さ
れる血小板減少症の症状を発現することがあるため、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアン
タゴニスト／アゴニストの使用に伴う合併症によって、それらの使用、一般には
インテグリンアンタゴニスト／アゴニストが厳しく制限されることがある。
【００１４】 前述の考察から、このようなＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａを対象とするＤＤＡＢを検
出することができる感度が高く特異的なアッセイは、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアン
タゴニストによる治療の前からＤＤＡＢを有し、かつ／またはＧＰＩＩｂ／ＩＩ
Ｉａアンタゴニストの投与後に発生するかもしくは抗体価（ｔｉｔｅｒ）が高め
られた抗体を有する患者を同定するのに有益であろうということになる。ＤＤＡ
Ｂ価が既に存在している、または生じつつある患者は、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａア
ンタゴニストの投与後に血小板減少症の症状を発現するリスクがより高いと考え
られる。ＤＤＡＢが既に存在していると判定された患者は、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩ
ａアンタゴニストによる治療から除外するか、またはＤＤＡＢの結合を強める傾
向のより低い化合物で治療してもよい。あるいは、ＤＤＡＢ価が生じた場合、臨
床上重大な血小板減少症の発症前に治療を停止することもできる。ＤＤＡＢが既
に存在している患者は、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストによる治療中に血
小板減少症の症状を発現するリスクを有すると考えられる。
【００１５】 低い抗体価の既に存するＤＤＡＢは、一般集団の比較的高い割合で認められる
可能性がある。その結果、ＤＤＡＢ陽性集団における血小板減少症／血栓塞栓症
合併症のリスクの高い患者を同定することを目的とする方法によって、特定のＧ
ＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストによる治療からこの「ハイリスク」集団を除
外すること、化学的に異なるＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストによる治療、
または治療中に広範なモニタリングを必要とする患者の同定が容易になるであろ
う。血小板減少症／血栓塞栓症合併症を早期に発症する傾向の高い患者を同定す
るための、特定の型（例えば、ＲＧＤ保持および非保持）のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩ
ａの使用は、当技術分野で教示されていない。
【００１６】 ＤＤＡＢ価が発生または増大している患者において、臨床上重大な血小板減少
症の発症前に特定のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストによる治療を停止する
ために、そのような増大をできるだけ早い時点で同定することが必要である。血
小板関連抗体の回収を目的としたいくつかの方法が当技術分野で知られている。
これらの方法では、全血からの血小板の単離と低ｐＨもしくは高ｐＨ処理、また
は蛋白質変性が必要である。これらの方法は専門的な実験室において新しく調製
された生物試料（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅ）でしか実施することが
できない。さらに、得られた血小板溶出液の信頼性の高い機能分析を除き、特異
的抗体が本来不安定であるため、結果が偽陰性となることが予想される。単離し
た血小板のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）処理によりＧＰＩＩｂ／ＩＩＩ
ａ複合体が解離したことが報告されており、また立体配座的に（ｃｏｎｆｏｒｍ
ａｔｉｎａｌｌｙ）影響されやすいネズミ抗体のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａへの結合
の低減が観察されている。ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに対するヒト自己抗体またはＧ
ＰＩＩｂ／ＩＩＩａを対象とするＤＤＡＢを用いた全血でのＥＤＴＡ処理の使用
は報告されていない。さらに、トロンビン受容体活性化ペプチドまたはその他の
血小板アゴニストとＥＤＴＡとの組み合わせ処理は、当技術分野で教示されてい
ない。
【００１７】 ＤＤＡＢの検出を目的としたアッセイの有用性は、信頼性の高いＤＤＡＢ標準
物質が入手できれば増大しうる。標準物質はヒトＤＤＡＢと同じ二次抗体検出系
に反応性で、したがって、実験結果の較正ができるものでなければならない。こ
のような標準物質の方法および組成は当技術分野で教示されていない。
【００１８】 インテグリンアンタゴニスト／アゴニスト治療と共に用いることができる、感
度が高く、特異的で、かつ使用が容易なアッセイであって、インテグリンアンタ
ゴニスト／アゴニストの投与前に患者に存在することがある低濃度のインテグリ
ンアンタゴニスト／アゴニストＤＤＡＢの検出、および／またはインテグリンア
ンタゴニスト／アゴニストによる治療後に生じるＤＤＡＢの検出が可能なアッセ
イが求められている。本発明は、このようなインテグリンアンタゴニスト／アゴ
ニストＤＤＡＢ検出のためのアッセイを提供する。インテグリンに対する自己抗
体およびＤＤＡＢを検出する方法の感度、特異性、および使用の容易さを高める
ことが求められ続けている。本発明は、このようなインテグリンを対象とする抗
体検出のための方法を提供する。
【００１９】 Ｓａｖｏｃａらの米国特許第４７１７６５４号に、血小板減少症に関連するＤ
ＤＡＢの検出法が記載されている。開示された方法は血小板を必要とし、精製さ
れたＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａは使用しない。Ａｓｔｅｒらの米国特許第５５８５２
４３号には、患者が複数の薬物投与を受けている場合に、どの薬物が血球減少症
を引き起こすかを調べるためのアッセイが記載されている。
【００２０】 本発明はより感度が高い点で異なっている。本発明は、血小板との結合が当技
術分野で報告されているよりもはるかに低いＤＤＡＢを検出することができる。
さらに、本発明は、一般にはインテグリンアンタゴニスト／アゴニスト、特にＧ
ＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストに反応性であると考えられるＤＤＡＢの特異
的検出法であるという点で、既に存在している技術と異なっている。
【００２１】 （発明の概要） 本発明は、インテグリンアンタゴニスト／アゴニスト仲介性疾患状態の治療法
およびそのリスクを有する患者を同定するための方法を提供する。本発明は、イ
ンテグリンアンタゴニスト／アゴニスト存在下で細胞に結合する薬物依存性抗体
の、患者体液試料中での検出に有用なアッセイおよび方法を提供する。本発明は
、インテグリンアンタゴニスト／アゴニスト治療と共に用いることができる、感
度が高く、特異的で、かつ使用が容易なアッセイを提供する。これらのアッセイ
は、インテグリンアンタゴニスト／アゴニストの投与前に患者に存在することが
ある、細胞に結合する低濃度のインテグリンアンタゴニスト／アゴニスト依存性
抗体の検出、および／またはインテグリンアンタゴニスト／アゴニストによる治
療後に生じるインテグリンアンタゴニスト／アゴニスト依存性物質の検出が可能
である。
【００２２】 本発明の１つの目的は、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト存在下で血小板
に結合するＤＤＡＢの、患者体液試料中での検出のためのアッセイおよび方法を
提供する。本発明は、精製された固定化ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａを用いての酵素免
疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）およびそのアッセイにおける特定のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩ
ａアンタゴニストを提供する。本発明のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ ＤＤＡＢ ＥＬ
ＩＳＡは、既に存在するＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ ＤＤＡＢ（例えば、患者がＧＰ
ＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストの投与を受ける前に患者に既に存在するＤＤＡ
Ｂ）を検出する。本発明のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ ＤＤＡＢ ＥＬＩＳＡはさら
に、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストが患者に投与された後に抗体価が生じ
るＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ ＤＤＡＢであって、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニ
ストの存在によって強化されるようなＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ ＤＤＡＢも検出す
る。本発明のアッセイおよび方法は、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストが誘
導するＤＤＡＢを有する個人を同定するために用いることができ、血小板減少症
／血栓塞栓症合併症の発症前にＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストによる治療
法を除外、停止、および／または変更するために用いることができる。
【００２３】 本発明の別の目的は、細胞表面からのインテグリンを対象とする抗体の回収率
を高めるための方法を提供する。その結果、これらの抗体検出を目的とするアッ
セイの感度および特異性が高くなる。この方法は、相異なる温度で長時間の、Ｅ
ＤＴＡを含む強いキレート剤による細胞の処理を必要とし、その結果、インテグ
リンを対象とする抗体が細胞表面から解離され、液相から細胞成分を分離した後
の上清においてそれらが生物活性体で回収されることになる。このような処理は
全血またはその分画に対しｅｘ ｖｉｖｏで実施することができる。次いで得ら
れた試料を、インテグリンを対象とする抗体の検出が可能なアッセイによって分
析することができる。
【００２４】 本発明において、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ ＤＤＡＢ ＥＬＩＳＡで異なるＧＰ
ＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストを用いると異なるＤＤＡＢが検出されることが
明らかにされている。したがって、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ ＤＤＡＢ ＥＬＩＳ
Ａにおける異なるＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストは、患者のＤＤＡＢによ
って認識されるエピトープの形成を誘導する能力に違いがある。したがって、本
アッセイは、ＤＤＡＢを誘導する、または既に存在しているもしくは生じつつあ
るＤＤＡＢによって認識されるエピトープを誘導する可能性がより低いと考えら
れるインテグリンアンタゴニスト／アゴニストを同定するために用いることがで
きる。
【００２５】 本発明はさらに、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストによる治療において血
小板減少症／血栓塞栓症合併症の早期発症のリスクを有する患者を同定するため
に、異なるＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ調製物を使用し、それにより抗体検出の特異性
を増大させることにも関する。
【００２６】 本発明はさらに、ＤＤＡＢアッセイの標準物質としての、ＤＤＡＢおよびヒト
化キメラ抗体の使用にも関する。
【００２７】 本発明のアッセイは、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト誘発性血小板減少
症もしくは血栓塞栓症の合併症を発症するリスクを有する患者を同定し、かつ／
またはＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト誘発性血小板減少症もしくは血栓塞
栓症の合併症を発症するリスクがない患者を同定するために用いることができる
。
【００２８】 図１Ａ 化合物Ａによる治療中に血小板減少反応を示す患者由来の血漿（黒丸）と、未
治療対照群由来の血漿（白丸）とを１ｍＭ ＣａＣｌ2および０．５ｍＭ Ｍｇ Ｃｌ2０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ｖ／ｖ）ならびに０．１％カゼインを含むＰ ＢＳで希釈した。ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ ＤＤＡＢの有無を、化合物Ａの存在下
または非存在下で固定化ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａを用いたＥＬＩＳＡによって検出
した。結果を化合物Ａの存在下と非存在下でインキュベートしたウェルのＯＤ65 0nM ／分の差分で表している。血小板減少症患者の血漿濃度とシグナル強度の相 関係数（ｍＯＤ／分）は０．９５である。
【００２９】 図１Ｂ 異種混合血漿試料における患者のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ ＤＤＡＢの検出を試
験した。ＤＤＡＢを含まない一定量の血漿（１ｍＭ ＣａＣｌ2、０．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、１％ヤギ血清および０．１％カゼイン を含むＰＢＳ中で１：２０に希釈）を化合物Ａによる治療中に血小板減少反応を
示す患者の血漿の漸増量と混合し（黒丸）、図１Ａと同様にＧＰＩＩｂ／ＩＩＩ
ａ ＤＤＡＢ ＥＬＩＳＡによって分析した。結果を緩衝液で希釈した患者血漿
（白丸）と比較している。
【００３０】 図２ 化合物Ａによる治療中に血小板減少反応を示す患者由来の血漿（図１と同様）
を、健常な未治療ドナー由来のゲル濾過した血小板の漸増量と共に、化合物Ａの
存在下（黒四角）または非存在下（白四角）で予備インキュベートした。得られ
た血漿をＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ ＤＤＡＢの有無について、図１で述べたとおり
、化合物Ａを用いたＥＬＩＳＡによって試験した。ＥＬＩＳＡによるＤＤＡＢの
結果を、化合物Ａの存在下または非存在下で血小板で前もって処理していない試
料に対する抗体結合のパーセンテージで表している。血小板濃度に対するＤＤＡ
Ｂの低下の相関係数は０．８５である。ＤＤＡＢ ＥＬＩＳＡに対する生理学的
関連の比較として、化合物Ａの存在下（黒丸）または非存在下（白丸）で血小板
で処理した同じ試料をゲル濾過した血小板で再度処理し、蛍光発色セルソーター
（ＦＡＣＳ）によって分析した。結合した抗体を、化合物Ａの存在下または非存
在下で血小板で前もって処理していない試料で観察された蛍光に対する、観察さ
れた蛍光（抗体結合）のパーセンテージで表している。
【００３１】 図３ 患者のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ ＤＤＡＢ発生の時間経過［（黒四角：Ｉ型ＥＬ
ＩＳＡ（改良ＥＬＩＳＡ）；白丸：ＩＩ型ＥＬＩＳＡ（基本的ＥＬＩＳＡ）］を
ＥＬＩＳＡによってレトロスペクティブに試験した（図１参照：最大抗体価の用
量反応）。結果を化合物Ａの存在下と非存在下でインキュベートしたウェルのＯ
Ｄ650nM／分の差分で表している。血小板数を示している（黒丸）。Ｘ軸の時間 ０は、化合物Ａ（０．５ｍｇ／ｄａｙ）の投与開始を示している。基本的および
改良ＥＬＩＳＡのための血漿試料は、それぞれ１：５および１：２０に希釈した
。血小板減少症の症状発現前にＤＤＡＢ価の増大が認められる。化合物Ａの存在
下および非存在下で患者血漿で処理したドナー血小板（星）の対応するフローサ
イトメトリー分析から、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ ＥＬＩＳＡによって評価したＤ
ＤＡＢ結合と完全な血小板で見られたものとの対応が示され、ＤＤＡＢ価の増大
が血小板減少症の症状発現前に起こったことが立証される。
【００３２】 図４ 第２の患者のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ ＤＤＡＢ発生の時間経過［（黒四角：Ｉ
型ＥＬＩＳＡ（改良ＥＬＩＳＡ）；白丸：ＩＩ型ＥＬＩＳＡ（基本的ＥＬＩＳＡ
）］をＥＬＩＳＡによってレトロスペクティブに試験した（図１参照：別の患者
）。黒三角は投与前血漿の新鮮部分試料を用いた反復試験。結果を化合物Ａの存
在下と非存在下でインキュベートしたウェルのＯＤ650nM／分の差分で表してい る。血小板数を示している（黒丸）。Ｘ軸の時間０は、化合物Ａ（０．５ｍｇ／
ｄａｙ）の投与開始を示している。基本的および改良ＥＬＩＳＡのための血漿試
料は、それぞれ１：５および１：２０に希釈した。ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタ
ゴニストの投与前にＤＤＡＢ価の存在が認められる。化合物Ａの存在下および非
存在下で患者血漿で処理したドナー血小板（星）の対応するフローサイトメトリ
ー分析から、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ ＥＬＩＳＡによって評価したＤＤＡＢ結合
と完全な血小板で見られたものとの対応が示され、ＤＤＡＢ価の増大が血小板減
少症の症状発現前に起こったことが立証される。
【００３３】 図５ Ａ図：それぞれＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストの化合物Ａまたは化合物
Ｄを用いての治療中に、血小板減少症の症状発現を示している患者２名（３０７
、３３０）およびチンパンジー１頭（Ａ２６４）からクエン酸血漿を得た。得ら
れた血漿をゲル精製した血小板と共に、化合物Ａ（３０７、３３０）または化合
物Ｄ（Ａ２６４）の非存在下（黒棒）または存在下（白棒）でインキュベートし
た（室温で３０分）。血小板を遠心分離によって除去し、得られた血漿をＧＰＩ
Ｉｂ／ＩＩＩａ特異的ＤＤＡＢ ＥＬＩＳＡによって分析した。ＥＬＩＳＡによ
り、化合物Ａ（３０７、３３０）または化合物Ｄ（Ａ２６４）存在下でのＧＰＩ
Ｉｂ／ＩＩＩａへの抗体結合を求める。患者３０７および３３０は化合物Ｄに対
する、またＡ２６４は化合物Ａに対する抗体を示さない（データは示していない
）ため、結果を化合物Ａ−化合物Ｄ（３０７、３３０）および化合物Ｄ−化合物
Ａ（Ａ２６４）とインキュベートしたウェルのｍＯＤ／分の差分で表している。
ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストの存在下で血漿を血小板と処理した後に血
漿中ＤＤＡＢの回収率は低下したが、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト不在
下では低下しなかったことに留意されたい。
【００３４】 Ｂ図：化合物Ａに対するＤＤＡＢを含む、チンパンジーＡ２６４（白丸）また
は見かけ上健常なドナー（黒丸）由来のクエン酸血漿を、ゲル精製した血小板と
共に、Ａ図と同様、化合物Ｄ（Ａ２６４）または化合物Ａ（健常ドナー）の示さ
れた用量反応存在下でインキュベートした。血小板をあまり含まない血漿を調製
し、Ａ図と同様にＤＤＡＢ ＥＬＩＳＡによって分析した。結果を、ＧＰＩＩｂ
／ＩＩＩａアンタゴニスト非存在下で血小板と処理した試料と比較しての血漿中
ＤＤＡＢのパーセンテージ阻害で表している。
【００３５】 図６ チンパンジーＡ２６４からの血漿を、化合物Ｄの存在下または非存在下で、ゲ
ル精製した血小板と共にインキュベート（Ａ図）またはクエン酸ナトリウム中に
採取した健常なヒト全血と１／１０で混合した（Ｂ図）。インキュベーション期
間終了時に、血小板を多く含む血漿のカルシウム再添加（１５ｍＭ ＣａＣｌ2 、３７℃、３０分）後、血清を調製した。ＥＤＴＡ（血小板を多く含む血漿の場
合は９ｍＭ、または全血の場合は４．５ｍＭ）を加え、試料を室温でさらに１５
分間インキュベートした。血小板をあまり含まない血漿を遠心分離によって調製
し、図５と同様に化合物Ｄ特異的ＤＤＡＢの有無について分析した。血小板を多
く含む血漿または全血のＥＤＴＡ処理により、血小板をあまり含まない血漿中の
抗血小板抗体の回収率が上昇するのに対し、血清調製物によってＤＤＡＢは回収
されなかったことに留意されたい。
【００３６】 図７ 患者３０７および３３０からの血漿を、図５と同様、化合物Ａの存在下でゲル
精製した血小板と共にインキュベートした。ＥＤＴＡ（９ｍＭ）を添加し、３７
℃で２時間さらにインキュベートした後、血小板をあまり含まない血漿を調製し
、図５と同様にＤＤＡＢの有無について分析した。
【００３７】 図８ ＤＤＡＢ ＥＬＩＳＡによって、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに対する抗体の異なる
結合を各ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト存在下または非存在下で調べる。
ＥＤＴＡ処理によって、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストを血小板表面から
解離させる。全血のＥＤＴＡ処理後に正確なＤＤＡＢ価測定を容易にするために
、薬物依存性抗体を無傷に保つ条件下で遊離の化合物Ａを除去する必要がある。
化合物Ａの存在下で血中にＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに対する抗体を持つ、見かけ上
健常な志願者から血漿を採取し、化合物Ａ（５０ｎＭ）を血漿に加えた。Ｃ16樹
脂を１００％メタノールと共に充填し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、１％ヤギ血
清、および０．１％カゼインを含むリン酸緩衝化食塩水で洗浄した。樹脂を血漿
（５００μＬ）に用量反応（ｍｇはＣ18の乾燥重量を意味する）で加え、室温で
１５分間インキュベートした後、ビーズを遠心分離によって除去した。得られた
血漿をＤＤＡＢ ＥＬＩＳＡで試験し、結果をｍＯＤ／分の差分で表す（化合物
Ａ含有ウェルのｍＯＤ／分マイナス薬物無添加ウェルのｍＯＤ／分）。
【００３８】 図９ ゲル精製した血小板をチンパンジーＡ２６４からの血漿と共に、化合物Ｄ非存
在下（黒丸）、化合物Ｄ存在下（白丸）、または化合物Ｄおよび１％アジ化ナト
リウム存在下（黒四角；Ａ図）で示された時間インキュベートした。インキュベ
ーション期間終了時に、ＥＤＴＡを３７℃で１５分間かけて加え、遠心分離によ
って血小板をあまり含まない血漿を調製した。得られた血漿を図５と同様にＤＤ
ＡＢ ＥＬＩＳＡによって分析した。別の実験（Ｂ図）で、ゲル精製した血小板
を薬物非存在下（黒棒）または化合物Ｄ存在下（白棒）でＡ２６４の血漿と共に
インキュベートした。さらに、化合物Ｄで処理した試料を、室温で３０分間イン
キュベートした後（Ｂ１）、または３７℃でさらに５時間インキュベートした後
（Ｂ２）、９ｍＭ ＥＤＴＡで溶出（斜線棒）するか、または９ｍＭ ＥＤＴＡ
および５０μＭトロンビン受容体活性化ペプチドで溶出（点付き棒）した。ＥＤ
ＴＡ処理によって回収されたＤＤＡＢの量は、インキュベーション時間と共に減
少するが、ＥＤＴＡとトロンビン受容体活性化ペプチドとの組み合わせ処理によ
って増加しうることに留意されたい。
【００３９】 図１０ 実施例１９に記載のとおり、プレートをＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａおよび水または
薬物のいずれかでコーティングし、次いでブロックした。未精製ハイブリドーマ
上清を各ウェルに加え、抗マウスＩｇＧ：ＨＲＰ複合体を用いて結合した抗体を
検出した。ＥＬＩＳＡの値は、基質添加およびインキュベーション後の４０５ｎ
ｍでのシグナルを表している。薬物非存在下でのシグナルよりも有意に大きい薬
物依存性シグナルを示すクローンを、さらなる分析のために維持した。
【００４０】 図１１ 実施例２１に記載のとおり、ネズミ可変領域をヒト定常領域に連結した。組換
え重鎖および軽鎖遺伝子をｐＦａｓｔＢａｃ Ｄｕａｌベクターにクローニング
し、重鎖発現をｐＰｏｌｈプロモーターの制御下に、軽鎖発現をｐ１０プロモー
ターの制御下においた。
【００４１】 図１２ 実施例１９に記載のとおり、ＥＬＩＳＡプレートをＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａまた
はＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ：薬物複合体でコーティングし、ブロックした。組換え
またはネズミ抗体の精製した一部を適当なウェルに加え、結合した抗体を抗マウ
スＩｇＧ：ＨＲＰ複合体または抗ヒトＩｇＧ：ＨＲＰ複合体のいずれかを用いて
検出した。プロットした値は、薬物結合ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａと遊離ＧＰＩＩｂ
／ＩＩＩａの吸収測定値の差である。
【００４２】 図１３ 血小板減少症患者の血漿を実施例２３に記載のとおりに処理した。化合物Ａの
存在下および非存在下で０９９０１６血漿を血小板で処理した後、試料の残存Ｄ
ＤＡＢについて、ＤＤＡＢ ＥＬＩＳＡにおいて３工程の希釈（１／１００、１
／２５０および１／５００）で評価した。組換えＪＫ０９４をＥＬＩＳＡの陽性
対照として用いた。０９９０１６血漿をドナー血小板で処理すると、検出可能な
ＤＤＡＢの損失はなかったが、化合物Ａの存在下でドナー血小板による処理によ
ってＤＤＡＢは特異的に枯渇した。このことは、この抗血小板抗体の薬物特異的
性質を示している。化合物Ａなしで０９９０１６血漿で処理した血小板からのＥ
ＤＴＡ溶離液のＥＬＩＳＡ分析ではＤＤＡＢが全くなかったが、０９９０１６血
漿で処理した血小板からのＥＤＴＡ溶離液はＤＤＡＢの存在を示した。
【００４３】 （発明の詳細な説明） 本発明は、インテグリンアンタゴニスト／アゴニストによる治療によって仲介
される疾患状態のリスクを有する患者を同定するための方法を記載する。本発明
は、治療前および治療中にインテグリンアンタゴニスト／アゴニスト仲介性疾患
状態のリスクを有する患者を同定するための方法を提供する。本発明は、インテ
グリンアンタゴニスト／アゴニスト存在下でインテグリンを認識する薬物依存性
抗体（ＤＤＡＢ）の、患者体液試料中での検出に有用なアッセイおよび方法を提
供する。本発明は、インテグリンアンタゴニスト／アゴニスト治療と共に用いる
ことができる、感度が高く、特異的で、かつ使用が容易なアッセイであって、イ
ンテグリンアンタゴニスト／アゴニストの投与前に患者に存在することがある低
濃度のインテグリンアンタゴニスト／アゴニストＤＤＡＢの検出、および／また
はインテグリンアンタゴニスト／アゴニストによる治療後に生じるＤＤＡＢの検
出が可能なアッセイを提供する。
【００４４】 本発明は、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト存在下で血小板インテグリン
ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａを認識するＤＤＡＢの患者体液試料中での検出のためのア
ッセイおよび方法を記載する。本発明は、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト
誘発性血小板減少症／血栓塞栓症を発症するリスクを有する患者を同定し、かつ
／またはＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト誘発性血小板減少症／血栓塞栓症
を発症するリスクがない患者を同定するために用いることができる。
【００４５】 本発明は、精製した固定化ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａを用いた酵素結合免疫吸着定
量法（ＥＬＩＳＡ）および該アッセイにおける特定のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアン
タゴニストを記載する。本発明のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ ＥＬＩＳＡは、既に存
在している（ｐｒｅ−ｅｘｓｉｓｔｉｎｇ）ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ ＤＤＡＢ（
すなわち、患者がＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストの投与を受ける前に患者
に既に存在しているＤＤＡＢ）を検出する。本発明のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ Ｄ
ＤＡＢ ＥＬＩＳＡはさらに、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストが患者に投
与された後に抗体価が生じるＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ ＤＤＡＢで、ＧＰＩＩｂ／
ＩＩＩａアンタゴニストの存在によって強化されるようなＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ
ＤＤＡＢも検出する。本発明のアッセイおよび方法は、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ
アンタゴニスト誘導のＤＤＡＢを有する個人を同定するために用いることができ
、血小板減少症／血栓塞栓症合併症の発症前にＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニ
ストによる治療法を除外、停止、および／または変更するために用いることがで
きる。
【００４６】 本発明において、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ ＤＤＡＢ ＥＬＩＳＡで異なるＧＰ
ＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストを用いると異なるＤＤＡＢが検出されることが
明らかにされている。したがって、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ ＤＤＡＢ ＥＬＩＳ
Ａにおける異なるＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストは、患者のＤＤＡＢによ
って認識されるエピトープの形成を誘導する能力に違いがある。したがって、本
発明アッセイは、ＤＤＡＢを誘導する、または既に存在しているＤＤＡＢによっ
て認識されるエピトープを誘導する可能性がより低いと考えられるインテグリン
アンタゴニスト／アゴニストを同定するために用いることができる。
【００４７】 ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ ＤＤＡＢは、例えば、血小板減少症／血栓塞栓症合併
症を示す患者から、ＤＤＡＢが既に存在している未治療の患者から、またはＧＰ
ＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストの投与後にＤＤＡＢを生じる治療を受けた患者
からの血漿試料から得ることができる。さらに、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ ＤＤＡ
Ｂは、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストの存在下または非存在下でＧＰＩＩ
ｂ／ＩＩＩａによって免疫化されたヒトまたは生物から得ることができる。本発
明のアッセイは、このようなＤＤＡＢを迅速に同定するために用いることができ
る。本発明のアッセイは、インテグリン受容体を阻害するが、ＤＤＡＢのインテ
グリンへの結合を強めることはなく、したがってＤＤＡＢ応答を強める可能性が
より低いインテグリンアンタゴニスト／アゴニストを同定するためにも有用であ
る。
【００４８】 本発明は、インテグリンを認識する抗体の患者体液試料中での検出に有用な方
法およびアッセイを提供する。本発明は、患者で疾患状態におけるインテグリン
への抗体の関与を解明するために用いることができる、感度が高く、特異的で、
かつ使用が容易なアッセイであって、インテグリンを対象とする低濃度の抗体の
検出が可能なアッセイを提供する。これらの抗体は、薬物治療を受けていない患
者の血液、体液、および組織に存在することがある。典型的な例には、患者で特
発性血小板減少性紫斑病を生じうる、血小板表面抗原を対象とする自己抗体、特
にＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａが含まれる。さらに、このようなアッセイはインテグリ
ンを対象とする低濃度のＤＤＡＢの検出が可能で、血小板表面、巨核球またはそ
れらの前駆細胞上のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａを対象とする抗体も含みうる。これら
のＤＤＡＢは、インテグリンアンタゴニスト／アゴニストによる治療を含む薬物
療法の投与前に患者に存在することもあり、薬物による治療後に増加または生じ
ることもある。
【００４９】 本発明は、インテグリンを対象とする抗体の細胞表面からの回収率を高める方
法を記載する。その結果、これらの抗体の検出を目的とするアッセイの感度と特
異性が増大する。この方法は、相異なる温度で長時間の、ＥＤＴＡを含む強いキ
レート剤による細胞の処理を伴い、その結果、インテグリンを対象とする抗体が
細胞表面から解離され、液相から細胞成分を分離した後の上清中でそれらが生物
活性体で回収されることになる。このような処理は全血、その分画、その他の体
液、または組織試料に対しｅｘ ｖｉｖｏで実施することができる。得られた試
料は、インテグリンを対象とする抗体の検出が可能な、当技術分野においてよく
知られているアッセイによって分析することができる。
【００５０】 本発明において、この方法がＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに対するＤＤＡＢの血小板
表面からの回収率を高めるために有用であることが見出されている。異なるＧＰ
ＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストに対するＤＤＡＢを血小板表面から回収できる
ことが示されている。したがって、本発明は、化学的分類が異なる治療法のため
に、血漿中のインテグリンアンタゴニスト／アゴニスト依存性ＤＤＡＢの回収率
を高めるのに用いることができる。この方法は、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａを対象と
するＤＤＡＢによる血小板減少症／血栓塞栓症合併症のリスクを有する患者を同
定するために用いることができる。この技術は、特定のインテグリンアンタゴニ
スト／アゴニストによる治療を開始、継続、または停止することを決定するため
に用いることができる。この方法は、これらの抗体がないために血小板減少症／
血栓塞栓症合併症のリスクがない患者を同定するために用いることができる。
【００５１】 本発明は、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストを患者の体液から迅速に除去
するための技術を提供する。この方法は、患者の体液をＣ16樹脂と共にインキュ
ベートし、続いて得られた本質的に樹脂を含まない体液を回収することを含む。
遊離ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストを除去するために、インテグリンアン
タゴニスト／アゴニストを対象とする固相支持体に固定化された抗体を含む、そ
のその他の基材を用いることができることは、当技術分野において周知である。
本発明において、薬物の除去は、インテグリンを対象とする抗体の抗体価および
生物活性を本質的に変えることなく実施されることが示されている。したがって
、得られた生物試料を、インテグリンアンタゴニスト／アゴニスト存在下または
非存在下でインテグリンに対する抗体の分別結合を調べるアッセイシステムに用
いることができる。
【００５２】 インテグリンを対象とする抗体は、例えば、血小板減少症／血栓塞栓症合併症
を示す患者、既に存在している抗体を有する未治療の患者、またはインテグリン
アンタゴニスト／アゴニストもしくはその他の薬剤投与後にＤＤＡＢを生じる治
療を受けた患者の全血から得ることができる。
【００５３】 本発明の１つの実施形態は、対象においてインテグリンアンタゴニスト／アゴ
ニストと結合したインテグリンを認識する抗体を検出するための方法であって、 （ａ）インテグリンとインテグリンアンタゴニスト／アゴニストとの間で複合
体を形成する工程と、 （ｂ）複合体を抗体供給源と共にインキュベートする工程と、 （ｃ）結合する抗体を検出することとを含む方法を提供する。 結果はＯＤの差分［光学密度の変化］（Ｖmax＋化合物）−（Ｖmax−化合物）、
または比（Ｖmax＋化合物／Ｖmax−化合物）のいずれかで表す。
【００５４】 本発明の好ましい実施形態は、ＤＤＡＢの生成または増加を検出する方法であ
って、 （ａ）前述の方法を用いて対象からの生物試料をアッセイする工程と、 （ｂ）対象にインテグリンアンタゴニスト／アゴニストを投与する工程と、 （ｃ）前述の方法を用いて対象からの第２の生物試料をアッセイする工程と、 （ｄ）（ａ）の結果を（ｃ）の結果と比較することとを含む方法を提供する。
【００５５】 より好ましい実施形態において、インテグリンアンタゴニスト／アゴニストは
ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａを対象とする。
【００５６】 本発明の別の実施形態は、対象においてインテグリンアンタゴニスト／アゴニ
ストと結合したインテグリンを認識する抗体を検出する方法であって、 （ａ）インテグリンを固体支持体上に固定化して固定化インテグリンを形成す
る工程と、 （ｂ）工程（ａ）の固定化インテグリンを１つまたは複数の選択されたインテ
グリンアンタゴニスト／アゴニストと共にインキュベートして、固定化インテグ
リンと選択されたインテグリンアンタゴニスト／アゴニストとの間で複合体を形
成する工程と、 （ｃ）前の工程の固定化物質を対象からの抗体を含む生物試料と共にインキュ
ベートして、複合体を形成する工程と、 （ｄ）前の工程の固定化物質を標識（ｌａｂｅｌｅｄ）二次抗ヒト抗体と共に
インキュベートして、複合体を形成することとを含み、 この場合において、工程（ａ）と工程（ｂ）を組み合わせることができ、また
は工程（ｂ）と工程（ｃ）を組み合わせることができる方法を提供する。
【００５７】 好ましい実施形態において、インテグリンはＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａである。
【００５８】 好ましい実施形態において、工程（ｂ）の選択されたインテグリンアンタゴニ
ストは、次の化合物、すなわち化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃ、もしくは化合物
Ｄ、またはその活性代謝体の１つまたは複数から選択される。
【００５９】 好ましい実施形態において、標識二次抗ヒト抗体は酵素と結合した抗ヒト抗体
または蛍光標識と結合した抗ヒト抗体である。
【００６０】 好ましい実施形態において、酵素はセイヨウワサビペルオキシダーゼである。
【００６１】 好ましい実施形態において、蛍光標識はフルオレセインまたはその誘導体であ
る。
【００６２】 好ましい実施形態において、固体支持体はマイクロウェルプレートのウェルで
ある。
【００６３】 好ましい実施形態において、抗体を含む生物試料は対象から得た血漿である。
【００６４】 好ましい実施形態において、固定化する前に、インテグリンは精製され、実質
的に非インテグリン成分を含まない。
【００６５】 好ましい実施形態において、インテグリンは天然、組換えインテグリン、変異
インテグリン、インテグリン断片、またはインテグリン由来の天然、組換え、も
しくは合成ポリペプチドである。
【００６６】 本発明の別の実施形態は、インテグリンアンタゴニスト／アゴニストによる治
療後に血小板減少症／血栓塞栓症の疾患状態を発症するリスクが高い対象を同定
するための方法であって、 （ａ）インテグリンを固体支持体に固定化して固定化インテグリンを形成する
工程と、 （ｂ）前の工程（ｔｈｅ ｐｒｅｖｉｏｕｓ ｓｔｅｐ）の固定化物質を１つ
または複数の選択されたインテグリンアンタゴニスト／アゴニストと共にインキ
ュベートして、固定化インテグリンと選択されたインテグリンアンタゴニスト／
アゴニストとの間で複合体を形成する工程と、 （ｃ）前の工程の固定化物質を対象からの抗体を含む試料と共にインキュベー
トして、複合体を形成する工程と、 （ｄ）前の工程の固定化物質を標識二次抗ヒト抗体と共にインキュベートして
、複合体を形成する工程と、 （ｅ）工程（ｄ）の固定化インテグリン：インテグリンアンタゴニスト／アゴ
ニスト：抗体：標識二次抗ヒト抗体複合体の生成量を、標識二次抗ヒト抗体の標
識の検出によって測定する工程と、 （ｆ）工程（ｄ）の固定化インテグリン：インテグリンアンタゴニスト／アゴ
ニスト：抗体：標識二次抗ヒト抗体複合体の生成量を、工程（ａ）、（ｃ）、（
ｄ）および（ｅ）を実施して工程（ｂ）を省略した場合に生成される複合体の量
と比較することとを含み、 この場合において、工程（ａ）と工程（ｂ）とを組み合わせることができ、ま
たは工程（ｂ）と工程（ｃ）とを組み合わせることができる方法を提供する。
【００６７】 好ましい実施形態において、抗体を含む生物試料を対象から得て、この方法を
インテグリンアンタゴニスト／アゴニストによる対象の治療前に実施する。
【００６８】 好ましい実施形態において、抗体を含む生物試料を対象から得て、この方法を
インテグリンアンタゴニスト／アゴニストによる対象の治療と同時に実施する。
【００６９】 好ましい実施形態において、工程（ｂ）の選択されたインテグリンアンタゴニ
スト／アゴニストは、対象を治療するために用いられるインテグリンアンタゴニ
スト／アゴニストの活性体または活性代謝物を含む。
【００７０】 好ましい実施形態において、工程（ｂ）の選択されたインテグリンアンタゴニ
スト／アゴニストは次の化合物、すなわち化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃ、もし
くは化合物Ｄ、またはその活性代謝体の１つまたは複数から選択される。
【００７１】 本発明の別の実施形態は、副作用を生じる可能性がより低い治療法を同定する
ために、インテグリンアンタゴニスト／アゴニスト治療の前または治療中のＤＤ
ＡＢの生成または増加を検出する方法を提供する。
【００７２】 好ましい実施形態において、対象は次の化合物、すなわち化合物Ａ、化合物Ｂ
、化合物Ｃ、または化合物Ｄの１つまたは複数から選択されたインテグリンアン
タゴニストによって治療される。
【００７３】 本発明の別の実施形態は、固体支持体に固定化された精製インテグリン、少な
くとも１つの選択されたインテグリンアンタゴニスト／アゴニスト、陽性対照お
よび二次標識抗ヒト抗体を含む、診断用イムノアッセイキットを提供する。
【００７４】 本発明の別の実施形態は、インテグリンアンタゴニスト／アゴニストに結合し
た対象のインテグリンを認識する抗体によって認識されるエピトープの生成を選
択されたインテグリンアンタゴニスト／アゴニストが強めるかどうかを調べる方
法であって、 （ａ）インテグリンを固体支持体に固定化して固定化インテグリンを形成する
工程と、 （ｂ）工程（ａ）の固定化インテグリンを選択されたインテグリンアンタゴニ
スト／アゴニストと共にインキュベートして、固定化インテグリンと選択された
インテグリンアンタゴニスト／アゴニストとの間で複合体を形成する工程と、 （ｃ）前の工程の固定化物質を対象からの抗体を含む試料と共にインキュベー
トして、複合体を形成する工程と、 （ｄ）前の工程の物質を標識二次抗ヒト抗体と共にインキュベートして、複合
体を形成することとを含み、 この場合において、工程（ａ）と工程（ｂ）とを組み合わせることができ、ま
たは工程（ｂ）と工程（ｃ）とを組み合わせることができる方法を提供する。
【００７５】 本発明の別の実施形態は、対象においてインテグリンを認識する抗体を検出す
る方法であって、 ａ）対象からの細胞をキレート剤で処理して、生物活性体の（ｉｎ ｂｉｏｌ
ｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｆｏｒｍ）抗体を解離させる工程と、 ｂ）抗体を含む上清から細胞を除去する工程と、 ｃ）上清をインテグリンに対する抗体の有無について試験することとを含む方
法を提供する。
【００７６】 好ましい実施形態において、上清を試験することは、 （ａ）インテグリンを固体支持体に固定化して固定化インテグリンを形成する
工程と、 （ｂ）工程（ａ）の固定化インテグリンを選択されたインテグリンアンタゴニ
スト／アゴニストと共にインキュベートして、固定化インテグリンと選択された
インテグリンアンタゴニスト／アゴニストとの間で複合体を形成する工程と、 （ｃ）前の工程の固定化物質を対象からの抗体を含む試料と共にインキュベー
トして、複合体を形成する工程と、 （ｄ）前の工程の物質を標識二次抗ヒト抗体と共にインキュベートして、複合
体を形成する工程とを含み、 ただし、工程（ａ）と工程（ｂ）とを組み合わせることができ、または工程（ｂ
）と工程（ｃ）とを組み合わせることができる。
【００７７】 好ましい実施形態において、インテグリンはＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａである。
【００７８】 好ましい実施形態において、結合していない薬物は固相吸着によって除去され
る。
【００７９】 好ましい実施形態において、抗体のＲＧＤ保持または非保持ＧＰＩＩｂ／ＩＩ
Ｉａへの結合が比較される。
【００８０】 好ましい実施形態において、抗体は薬物非存在下でインテグリンに結合する。
【００８１】 好ましい実施形態において、抗体はインテグリンアンタゴニスト／アゴニスト
存在下でインテグリンに結合する。
【００８２】 好ましい実施形態において、インテグリンは天然、組換えインテグリン、変異
インテグリン、インテグリン断片、またはインテグリン由来の天然、組換え、も
しくは合成ポリペプチドである。
【００８３】 好ましい実施形態において、抗体はインテグリンアンタゴニスト／アゴニスト
を含まない薬物存在下でインテグリンに結合する。
【００８４】 本発明の別の実施形態は、インテグリンアンタゴニスト／アゴニストによる治
療後に、血小板減少症／血栓塞栓症合併症を含むＤＤＡＢ依存性疾患状態を発症
するリスクを有する対象を同定するための方法であって、前述の方法による抗体
試験を含む方法を提供する。
【００８５】 本発明の別の実施形態は、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストによる治療の
最初の１週間に血小板減少症／血栓塞栓症合併症のリスクを有する対象を同定す
るための方法であって、 ａ）対象からの生物試料を、薬物依存性抗体のＲＧＤ保持ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩ
ａとの結合について試験する工程と、 ｂ）同じ生物試料を、薬物依存性抗体のＲＧＤ非保持ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａと
の結合について試験する工程と、 ｃ）（ａ）および（ｂ）におけるＤＤＡＢ結合量を比較することとを含む方法
を提供する。
【００８６】 好ましい実施形態において、抗体を含む試料を対象から得て、この方法を対象
のインテグリンアンタゴニスト／アゴニストによる治療前に実施する。
【００８７】 好ましい実施形態において、抗体を含む試料を対象から得て、この方法を対象
のインテグリンアンタゴニスト／アゴニストによる治療と同時に実施する。
【００８８】 好ましい実施形態において、選択されたインテグリンアンタゴニスト／アゴニ
ストは、対象を治療するために用いられるアンタゴニスト／アゴニストの活性体
または活性代謝物を含む。
【００８９】 本発明の別の実施形態は、抗体をインテグリンから解離させるのに適したキレ
ート剤と、インテグリンの供給源と、陽性対照と、二次標識抗ヒト抗体と、を含
む、診断用イムノアッセイキットを提供する。
【００９０】 好ましい実施形態は、選択された非インテグリンアンタゴニスト／アゴニスト
関連薬物を含む。
【００９１】 好ましい実施形態は、選択されたインテグリンアンタゴニスト／アゴニストを
含む。
【００９２】 本発明の別の実施形態は、ＤＤＡＢを誘導する、または既に存在しているもし
くは生じつつあるＤＤＡＢによって認識されるエピトープを誘導する傾向（ｐｒ
ｏｐｅｎｓｉｔｙ）が限られているインテグリンアンタゴニスト／アゴニストを
同定するための方法であって、 （ａ）インテグリンとインテグリンアンタゴニスト／アゴニストとの間で複合
体を形成する工程と、 （ｂ）複合体を抗体供給源とインキュベートする工程と、 （ｃ）複合体に対する抗体が生じ、かつ／または存在するかどうかを調べるこ
ととを含む方法を提供する。
【００９３】 好ましい実施形態において、インテグリンはＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａである。
【００９４】 本発明の別の実施形態は、特定の既知の抗原に特異性を有し、第１の哺乳動物
種の抗体の対応する定常領域と相同性の定常領域および第２の異なる哺乳動物種
由来の抗体の可変領域と相同性の可変領域を有する、免疫グロブリン重鎖または
軽鎖を含む組成物を提供する。
【００９５】 好ましい実施形態において、免疫グロブリンはキメラである。
【００９６】 好ましい実施形態において、定常領域はヒトである。
【００９７】 好ましい実施形態において、軽鎖は配列番号１を含む。
【００９８】 好ましい実施形態において、重鎖は配列番号２を含む。
【００９９】 好ましい実施形態において、特定の既知の抗原はインテグリン：インテグリン
アゴニスト／アンタゴニスト複合体である。
【０１００】 好ましい実施形態において、インテグリン：インテグリンアゴニスト／アンタ
ゴニスト複合体はＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ：化合物Ａである。
【０１０１】 本発明の別の実施形態は、前述のアッセイにおける陽性対照として、インテグ
リンアゴニスト／アンタゴニストに結合したインテグリンを認識するキメラ抗体
を用いる方法を提供する。
【０１０２】 本発明の別の実施形態は、適当な宿主細胞に適合性のプロモーターに操作可能
に結合された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）ＤＮＡと、特定の既知の抗原
に特異性を有し、第１の哺乳動物種の抗体の対応する定常領域に相同の定常領域
および第２の異なる哺乳動物種由来の抗体の可変領域に相同の可変領域を有する
、キメラ免疫グロブリン重鎖または軽鎖をコードするＤＮＡとを含む、複製可能
な発現ベクターを提供する。
【０１０３】 好ましい実施形態において、第１の哺乳動物種はヒトである。
【０１０４】 好ましい実施形態において、特定の既知の抗原はＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ：化合
物Ａ複合体である。
【０１０５】 本発明の別の実施形態は、インテグリン：アンタゴニスト／アゴニスト複合体
に対するモノクローナル抗体を作製することを含む方法を提供する。
【０１０６】 本発明の別の実施形態は、ハイブリドーマがインテグリン：アンタゴニスト／
アゴニスト複合体に特異的な抗体を産生することができる、ハイブリドーマを提
供する。
【０１０７】 好ましい実施形態において、インテグリンはアンタゴニスト／アゴニスト複合
体の形成によって立体配座的に変化している。
【０１０８】 好ましい実施形態において、インテグリンはＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａである。
【０１０９】 ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストを含む、代表的なインテグリンアンタゴ
ニスト化合物が下記の特許および特許出願に開示されており、これらは参照とし
て本明細書に取り入れる。すなわち、ＰＣＴ特許出願第９５／１４６８３号、Ｐ
ＣＴ特許出願第９５／３２７１０号、米国特許第５３３４５９６号、米国特許第
５２７６０４９号、米国特許第５２８１５８５号、欧州特許出願第４７８３２８
号、欧州特許出願第４７８３６３号、欧州特許出願第５１２８３１号、ＰＣＴ特
許出願第９４／０８５７７号、ＰＣＴ特許出願第９４／０８９６２号、ＰＣＴ特
許出願第９４／１８９８１号、ＰＣＴ特許出願第９３／１６６９７号、カナダ特
許出願第２０７５５９０号、ＰＣＴ特許出願第９３／１８０５７号、欧州特許出
願第４４５７９６号、カナダ特許出願第２０９３７７０号、カナダ特許出願第２
０９４７７３号、カナダ特許出願第２１０１１７９号、カナダ特許出願第２０７
４６８５号、カナダ特許出願第２０９４９６４号、カナダ特許出願第２１０５９
３４号、カナダ特許出願第２１１４１７８号、カナダ特許出願第２１１６０６８
号、欧州特許出願第５１３８１０号、ＰＣＴ特許出願第９５／０６０３８号、欧
州特許出願第３８１０３３号、ＰＣＴ特許出願第９３／０７８６７号、およびＰ
ＣＴ特許出願第９４／０２４７２号。
【０１１０】 本発明において有用なインテグリンアンタゴニストは、下記の化合物から選択
される化合物またはその活性代謝物である。
【０１１１】 Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（フェニルスルホニル）−２，３−（ Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（４−メチル−フェニル−スルホニル ）−２，３−（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（ブタンスルホニル）−２，３−（Ｓ ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（プロパンスルホニル）−２，３−（ Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（エタンスルホニル）−２，３−（Ｓ ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（メチルオキシカルボニル）−２，３ −（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（エチルオキシカルボニル）−２，３ −（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（１−プロピルオキシカルボニル）− ２，３−（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（２−プロピルオキシカルボニル）− ２，３−（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（ｎ−ブチルオキシカルボニル）−２ ，３−（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（ｎ−ブチルオキシカルボニル）−２，３ −（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（ｎ−ブチルオキシカルボニル）−２，３ −（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（ｎ−ブチルオキシカルボニル）−２，３ −（Ｒ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（ｎ−ブチルオキシカルボニル）−２，３ −（Ｒ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（２−ブチルオキシカルボニル）−２ ，３−（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（１−（２−メチル）−プロピルオキ シカルボニル）−２，３−（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（２−（２−メチル）−プロピルオキ シカルボニル）−２，３−（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（ベンジルオキシカルボニル）−２， ３−（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（ベンジルオキシカルボニル）−２，３− （Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（ベンジルオキシカルボニル）−２，３− （Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（４−メチルベンジルオキシカルボニ ル）−２，３−（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（４−メトキシベンジルオキシカルボ ニル）−２，３−（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（４−クロロベンジルオキシカルボニ ル）−２，３−（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（４−ブロモベンジルオキシカルボニ ル）−２，３−（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（４−フルオロベンジルオキシカルボ ニル）−２，３−（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（４−フェノキシベンジルオキシカル ボニル）−２，３−（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（２−（メチルオキシエチル）−オキ シカルボニル）−２，３−（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（２−ピリジニルカルボニル）−２， ３−（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（３−ピリジニルカルボニル）−２， ３−（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（４−ピリジニル−カルボニル）−２ ，３−（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（２−（２−ピリジニル）−アセチル ）−２，３−（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５（ Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］− Ｎ2−（２−（３−ピリジニル）−アセチル ）−２，３−（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（２−（４−ピリジニル）−アセチル ）−２，３−（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（２−ピリジル−メチルオキシカルボ ニル）−２，３−（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（３−ピリジル−メチルオキシカルボ ニル）−２，３−（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（４−ピリジル−メチルオキシカルボ ニル）−２，３−（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（４−ブチルオキシフェニルスルホニ ル）−２，３−（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（２−チエニルスルホニル）−２，３ −（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（３−メチルフェニルスルホニル）− ２，３−（Ｒ，Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（３−メチルフェニルスルホニル）− ２，３−（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（３−メチルフェニルスルホニル）− ２，３−（Ｒ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（３−メチルフェニルスルホニル）−２， ３−（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（３−メチルフェニルスルホニル）−２， ３−（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（３−メチルフェニルスルホニル）−２， ３−（Ｒ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（３−メチルフェニルスルホニル）−２， ３−（Ｒ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（４−ヨードフェニルスルホニル）− ２，３−（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（３−トリフルオロメチルフェニルス ルホニル）−２，３−（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（３−クロロフェニルスルホニル）− ２，３−（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（３−２−メトキシカルボニルフェニ ルスルホニル）−２，３−（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（２，４，６−トリメチルフェニルス ルホニル）−２，３−（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（２−クロロフェニルスルホニル）− ２，３−（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（４−トリフルオロメチルフェニルス ルホニル）−２，３−（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（２−トリフルオロメチルフェニルス ルホニル）−２，３−（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（２−フルオロフェニルスルホニル） −２，３−（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（４−フルオロフェニルスルホニル） −２，３−（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（４−メトキシフェニルスルホニル） −２，３−（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（２，３，５，６−テトラメチルフェ ニルスルホニル）−２，３−（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（４−シアノフェニルスルホニル）− ２，３−（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（４−クロロフェニルスルホニル）− ２，３−（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（４−プロピルフェニルスルホニル） −２，３−（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（２−フェニルエチルスルホニル）− ２，３−（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（４−イソプロピルフェニルスルホニ ル）−２，３−（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（３−フェニルプロピルスルホニル） −２，３−（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（３−ピリジルスルホニル）−２，３ −（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（フェニルアミノスルホニル）−２， ３−（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（ベンジルアミノスルホニル）−２， ３−（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（ジメチルアミノスルホニル）−２， ３−（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（２−フルオロ−４−ホルムアミジノフェニル）−イソオ キサゾリン−５（Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（３−メチルフェニル スルホニル）−２，３−（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（２−ホルムアミジノ−５−ピリジニル）−イソオキサゾ リン−５（Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（ｎ−ブチルオキシカルボニ ル）−２，３−（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（２−ホルムアミジノ−５−ピリジニル）−イソオキサゾ リン−５（Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（３−メチルフェニルスルホ ニル）−２，３−（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（３−ホルムアミジノ−６−ピリジニル）−イソオキサゾ リン−５（Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（ｎ−ブチルオキシカルボニ ル）−２，３−（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（３−ホルムアミジノ−６−ピリジニル）−イソオキサゾ リン−５（Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（３−メチルフェニルスルホ ニル）−２，３−（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（フェニルアミノカルボニル）−２， ３−（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（４−フルオロフェニルアミノカルボ ニル）−２，３−（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（１−ナフチルアミノカルボニル）− ２，３−（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（ベンジルアミノカルボニル）−２， ３−（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（３−ブロモ−２−チエニルスルホニ ル）−２，３−（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（３−メチル−２−ベンゾチエニルス ルホニル）−２，３−（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（イソブチルオキシカルボニル）−２ ，３−（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（イソブチルオキシカルボニル）−２，３ −（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（イソブチルオキシカルボニル）−２，３ −（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（２−シクロプロピルエトキシカルボ ニル）−２，３−（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｒ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（２−シクロプロピルエトキシカルボニル ）−２，３−（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ （Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（２−シクロプロピルエトキシカルボニル ）−２，３−（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−グアニジノフェニル）−イソオキサゾリン−５（Ｒ ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（ｎ−ブチルオキシカルボニル）−２，３ −（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−グアニジノフェニル）−イソオキサゾリン−５（Ｒ ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（ｎ−ブチルオキシカルボニル）−２，３−（ Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−グアニジノフェニル）−イソオキサゾリン−５（Ｒ ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（３−メチルフェニルスルホニル）−２，３− （Ｓ）−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛５−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−３ （Ｒ，Ｓ）−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（ｎ−ブチルオキシカルボニル）−２ ，３−（Ｓ）−ジアミノプロパン酸； または、ジアミノプロパン酸部分の水酸基の水素が下記の基から選択される基
で置換されている、上記化合物のプロピオン酸エステルプロドラッグ体： メチル； エチル； イソプロピル； メチルカルボニルオキシメチル−； エチルカルボニルオキシメチル−； ｔ−ブチルカルボニルオキシメチル−； シクロヘキシルカルボニルオキシメチル−； １−（メチルカルボニルオキシ）エチル−； １−（エチルカルボニルオキシ）エチル−； １−（ｔ−ブチルカルボニルオキシ）エチル−； １−（シクロヘキシルカルボニルオキシ）エチル−； ｉ−プロピルオキシカルボニルオキシメチル−； シクロヘキシルカルボニルオキシメチル−； ｔ−ブチルオキシカルボニルオキシメチル−； １−（ｉ−プロピルオキシカルボニルオキシ）エチル−； １−（シクロヘキシルオキシカルボニルオキシ）エチル−； １−（ｔ−ブチルオキシカルボニルオキシ）エチル−； ジメチルアミノエチル−； ジエチルアミノエチル−； （５−メチル−１，３−ジオキサシクロペンテン−２−オン−４−イル）メチ
ル−； （５−（ｔ−ブチル）−１，３−ジオキサシクロペンテン−２−オン−４−イ
ル）メチル−； （１，３−ジオキサ−５−フェニル−シクロペンテン−２−オン−４−イル）
メチル−； １−（２−（２−メトキシプロピル）カルボニルオキシ）エチル−。
【０１１２】 本発明において有用なさらに好ましいインテグリンアンタゴニストは、下記の
化合物から選択される化合物、またはそのエンンチオマーもしくはジアステレオ
マー、またはそのエンンチオマーもしくはジアステレオマーの混合物、またはそ
の活性代謝物、およびその塩である。
【０１１３】 Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（フェニルスルホニル）−２，３−ジアミノプロ パン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（４−メチル−フェニル−スルホニル）−２，３ −ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（ブタンスルホニル）−２，３−ジアミノプロパ ン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（プロパンスルホニル）−２，３−ジアミノプロ パン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（エタンスルホニル）−２，３−ジアミノプロパ ン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（メチルオキシカルボニル）−２，３−ジアミノ プロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（エチルオキシカルボニル）−２，３−ジアミノ プロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（１−プロピルオキシカルボニル）−２，３−ジ アミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（２−プロピルオキシカルボニル）−２，３−ジ アミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（ｎ−ブチルオキシカルボニル）−２，３−ジア ミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（１−（２−メチル）−プロピルオキシカルボニ ル）−２，３−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（２−（２−メチル）−プロピルオキシカルボニ ル）−２，３−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（ベンジルオキシカルボニル）−２，３−ジアミ ノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（４−メチルベンジルオキシカルボニル）−２， ３−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（４−メトキシベンジルオキシカルボニル）−２ ，３−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（４−クロロベンジルオキシカルボニル）−２， ３−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（４−ブロモベンジルオキシカルボニル）−２， ３−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（４−フルオロベンジルオキシカルボニル）−２ ，３−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（４−フェノキシベンジルオキシカルボニル）− ２，３−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（２−（メチルオキシエチル）−オキシカルボニ ル）−２，３−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（２−ピリジニルカルボニル）−２，３−ジアミ ノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（３−ピリジニルカルボニル）−２，３−ジアミ ノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（４−ピリジニル−カルボニル）−２，３−ジア ミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（２−（２−ピリジニル）−アセチル）−２，３ −ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（２−（３−ピリジニル）−アセチル）−２，３ −ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（２−（４−ピリジニル）−アセチル）−２，３ −ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（２−ピリジル−メチルオキシカルボニル）−２ ，３−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（３−ピリジル−メチルオキシカルボニル）−２ ，３−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（４−ピリジル−メチルオキシカルボニル）−２ ，３−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（４−ブチルオキシフェニルスルホニル）−２， ３−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（２−チエニルスルホニル）−２，３−ジアミノ プロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（３−メチルフェニルスルホニル）−２，３−ジ アミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（４−ヨードフェニルスルホニル）−２，３−ジ アミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（３−トリフルオロメチルフェニルスルホニル） −２，３−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（３−クロロフェニルスルホニル）−２，３−ジ アミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（２−メトキシカルボニルフェニルスルホニル） −２，３−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（２，４，６−トリメチルフェニルスルホニル） −２，３−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（２−クロロフェニルスルホニル）−２，３−ジ アミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（４−トリフルオロメチルフェニルスルホニル） −２，３−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（２−トリフルオロメチルフェニルスルホニル） −２，３−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（２−フルオロフェニルスルホニル）−２，３− ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（４−フルオロフェニルスルホニル）−２，３− ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（４−メトキシフェニルスルホニル）−２，３− ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（２，３，５，６−テトラメチルフェニルスルホ ニル）−２，３−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（４−シアノフェニルスルホニル）−２，３−ジ アミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（４−クロロフェニルスルホニル）−２，３−ジ アミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（４−プロピルフェニルスルホニル）−２，３− ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（２−フェニルエチルスルホニル）−２，３−ジ アミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（４−イソプロピルフェニルスルホニル）−２， ３−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（３−フェニルプロピルスルホニル）−２，３− ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（３−ピリジルスルホニル）−２，３−ジアミノ プロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（フェニルアミノスルホニル）−２，３−ジアミ ノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（ベンジルアミノスルホニル）−２，３−ジアミ ノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（ジメチルアミノスルホニル）−２，３−ジアミ ノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（２−フルオロ−４−ホルムアミジノフェニル）−イソオ キサゾリン−５−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（３−メチルフェニルスルホニル ）−２，３−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（２−ホルムアミジノ−５−ピリジニル）−イソオキサゾ リン−５−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（ｎ−ブチルオキシカルボニル）−２， ３−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（２−ホルムアミジノ−５−ピリジニル）−イソオキサゾ リン−５−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（３−メチルフェニルスルホニル）−２ ，３−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（３−ホルムアミジノ−６−ピリジニル）−イソオキサゾ リン−５−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（ｎ−ブチルオキシカルボニル）−２， ３−ジアミノプロパン酸， Ｎ3−［２−｛３−（３−ホルムアミジノ−６−ピリジニル）−イソオキサゾ リン−５−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（３−メチルフェニルスルホニル）−２ ，３−ジアミノプロパン酸， Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（フェニルアミノカルボニル）−２，３−ジアミ ノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（４−フルオロフェニルアミノカルボニル）−２ ，３−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（１−ナフチルアミノカルボニル）−２，３−ジ アミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（ベンジルアミノカルボニル）−２，３−ジアミ ノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（３−ブロモ−２−チエニルスルホニル）−２， ３−ジアミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（３−メチル−２−ベンゾチエニルスルホニル） −２，３−ジアミノプロパン酸， Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（イソブチルオキシカルボニル）−２，３−ジア ミノプロパン酸， Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（イソブチルオキシカルボニル）−２，３−ジア ミノプロパン酸， Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（イソブチルオキシカルボニル）−２，３−ジア ミノプロパン酸， Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（２−シクロプロピルエトキシカルボニル）−２ ，３−ジアミノプロパン酸， Ｎ3−［２−｛３−（４−グアニジノフェニル）−イソオキサゾリン−５−イ ル｝−アセチル］−Ｎ2−（ｎ−ブチルオキシカルボニル）−２，３−ジアミノ プロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−グアニジノフェニル）−イソオキサゾリン−５−イ ル｝−アセチル］−Ｎ2−（３−メチルフェニルスルホニル）−２，３−ジアミ ノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛５−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−３ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（ｎ−ブチルオキシカルボニル）−２，３−ジア ミノプロパン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（２−ブロモ−フェニルスルホニル）−２，３− ジアミノプロピオン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（２−メチル−フェニルスルホニル）−２，３− ジアミノプロピオン酸； Ｎ3−［２−｛３−（３−ホルムアミジノ−６−ピリジニル）−イソオキサゾ リン−５−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（３−メチルフェニルスルホニル）−２ ，３−ジアミノプロピオン酸； Ｎ3−［２−｛３−（２−ホルムアミジノ−５−ピリジニル）−イソオキサゾ リン−５−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（３−メチルフェニルスルホニル）−２ ，３−ジアミノプロピオン酸； Ｎ3−［２−｛３−（２−フルオロ−４−ホルムアミジノフェニル）−イソオ キサゾリン−５−イル｝−アセチル］−Ｎ2−（３−メチルフェニルスルホニル ）−２，３−ジアミノプロピオン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（３−ブロモ−フェニルスルホニル）−２，３− ジアミノプロピオン酸； Ｎ3−［２−｛３−（４−ホルムアミジノフェニル）−イソオキサゾリン−５ −イル｝−アセチル］−Ｎ2−（４−ブロモ−フェニルスルホニル）−２，３− ジアミノプロピオン酸； または、プロパン酸部分の水酸基の水素が下記の基から選択される基で置換さ
れている、上記化合物のプロピオン酸エステルプロドラッグ体： メチル； エチル； イソプロピル； メチルカルボニルオキシメチル−； エチルカルボニルオキシメチル−； ｔ−ブチルカルボニルオキシメチル−； シクロヘキシルカルボニルオキシメチル−； １−（メチルカルボニルオキシ）エチル−； １−（エチルカルボニルオキシ）エチル−； １−（ｔ−ブチルカルボニルオキシ）エチル−； １−（シクロヘキシルカルボニルオキシ）エチル−； ｉ−プロピルオキシカルボニルオキシメチル−； シクロヘキシルカルボニルオキシメチル−； ｔ−ブチルオキシカルボニルオキシメチル−； １−（ｉ−プロピルオキシカルボニルオキシ）エチル−； １−（シクロヘキシルオキシカルボニルオキシ）エチル−； １−（ｔ−ブチルオキシカルボニルオキシ）エチル−； ジメチルアミノエチル−； ジエチルアミノエチル−； （５−メチル−１，３−ジオキサシクロペンテン−２−オン−４−イル）メチ
ル−； （５−（ｔ−ブチル）−１，３−ジオキサシクロペンテン−２−オン−４−イ
ル）メチル−； （１，３−ジオキサ−５−フェニル−シクロペンテン−２−オン−４−イル）
メチル−； １−（２−（２−メトキシプロピル）カルボニルオキシ）エチル−。
【０１１４】 本発明のアッセイにおいて有用なさらに好ましいＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタ
ゴニストは、下記の化合物Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ、ならびにその塩、プロドラッグ
体および代謝物である。
【０１１５】 本明細書において言及される「化合物Ａ」は２（Ｓ）−［（ｎ−ブトキシカル
ボニル）アミノ］−３−［［［３−［４−（アミノイミノメチル）フェニル］イ
ソキサゾリン−５（Ｒ）−イル］メチルカルボニル］アミノ］プロピオン酸また
はそのメチルエステルである。化合物Ａの調製はＰＣＴ特許出願公開番号第ＷＯ
９５／１４６８３号に開示されている。
【０１１６】 本明細書において言及される「化合物Ｂ」は２（Ｓ）−［［（３，５−ジメチ
ルイソキサゾル−４−イル）スルホニル］アミノ］−３−［［［３−［４−（ア
ミノイミノメチル）フェニル］イソキサゾリン−５（Ｒ）−イル］メチルカルボ
ニル］アミノ］プロピオン酸である。化合物Ｂの調製は、１９９６年１１月に公
開されたＰＣＴ特許出願公開番号第ＷＯ９６／３７４８２号に開示されている。
【０１１７】 本明細書において言及される「化合物Ｃ」は２（Ｓ）−［（４−メチルフェニ
ルスルホニル）アミノ］−３−［［［５，６，７，８−テトラヒドロ−４−オキ
ソ−５−［２−（ピペルジン−４−イル）エチル］−４Ｈ−ピラゾロ−［１，５
−ａ］［１，４］ジアゼピン−２−イル］カルボニル］アミノ］プロピオン酸で
ある。化合物Ｃの調製は、ＰＣＴ特許出願公開番号第ＷＯ９４／１８９８１号に
開示されている。
【０１１８】 本明細書において言及される「化合物Ｄ」は５−［２−（ピペルジン−４−イ
ル）エチル］チエノ［２，３−ｂ］チオフェン−２−Ｎ−（３−２（Ｓ）−（３
−ピリジニルスルホニルアミノ）プロピオン酸］カルボキサミドである。化合物
Ｄの調製は、ＰＣＴ特許出願公開番号第ＷＯ９５／１４３５１号に開示されてい
る。
【０１１９】 本明細書で用いられる「インテグリン」という用語は、多くの細胞表面受容体
蛋白質のいずれをも意味し、接着性蛋白質受容体とも呼ばれ、細胞外マトリック
スリガンドまたはその他の細胞接着性蛋白質リガンドに結合し、それにより細胞
−細胞および細胞−マトリックスの接着プロセスを仲介することが確認されてい
る。インテグリンは遺伝子スーパーファミリーに属する遺伝子によってコードさ
れ、一般にはα−およびβ−サブユニットを含むヘテロダイマー膜貫通蛋白質か
らなっている。インテグリンサブファミリーは異なるα−サブユニットと結合し
た共通のβ−サブユニットを含み、特異性の異なる接着性蛋白質受容体を形成す
る。
【０１２０】 インテグリン糖蛋白質ＩＩｂ／ＩＩＩａ（本明細書ではＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ
またはＩＩｂ／ＩＩＩａまたはフィブリノゲン受容体と呼ぶ）は血小板凝集を仲
介する膜蛋白質である。活性化された血小板におけるＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａは、
４つの可溶性のＲＧＤ含有接着性蛋白質、すなわちフィブリノゲン、フォン・ビ
ルブラント因子、フィブロネクチン、およびビトロネクチンと結合することが知
られている。ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａの他に、いくつかのその他のインテグリン細
胞表面受容体、例えばαｖβ３、α４β１およびα５β１が同定されている。
【０１２１】 本発明アッセイに用いられるインテグリンは、非組換え供給源（ＧＰＩＩｂ／
ＩＩＩａについて実施例３に記載のとおり）から、または所望のインテグリンを
コードする組換え発現ベクターと宿主発現システムとを用いた組換え供給源から
得ることができる。組換えインテグリンの場合、このようなインテグリンは、イ
ンテグリンの非組換え体または天然体の断片および／または改変体、融合体もし
くは変異体であるという点で、インテグリンの非組換え体または天然体と異なる
ことができる。
【０１２２】 本明細書で用いられる「固体支持体」という用語は、ビーズもしくはマイクロ
ウェルプレートのウェル、または固定化されたインテグリンが所望のインテグリ
ンアンタゴニスト／アゴニストに結合する能力を保持するような方法でインテグ
リンを固定化するのに適した、その他の固体支持体を意味する。抗体検出のため
に、固相アッセイの代わりに溶液相アッセイを用いることができることは、当技
術分野において周知である。
【０１２３】 本明細書で用いられる「保持（ｒｅｔａｉｎｅｄ）ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ」と
いう用語は、ＲＧＤカラムに保持され、例えばＲＧＤペプチドによって特異的に
溶出することができる、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａの型（ｆｏｒｍ）を意味する。本
明細書で用いられる「非保持ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ」という用語は、ＲＧＤ親和
性基質に結合しない蛋白質の型を意味する。ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａの保持型に選
択的に結合するＤＤＡＢにより、血小板減少症／血栓塞栓症合併症のリスクの高
い患者が同定される。あるいは、休止血小板または刺激血小板のいずれかへのこ
れら抗体の結合を用いることもできる。ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａを対象とするＤＤ
ＡＢの、保持または非保持ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａのいずれかへの分別結合によっ
て、血小板減少症／血栓塞栓症合併症を非常に発症しやすい患者が識別される。
【０１２４】 本明細書で用いられる「実質的に非インテグリン成分を含まない」という用語
は、精製インテグリンが少なくとも約８０％の純度であること、例えば、インテ
グリン蛋白質が精製されたインテグリン製剤中の全蛋白質の少なくとも約８０％
を構成することを意味する。用いられるインテグリンは組換えまたは非組換え供
給源から得ることができる。
【０１２５】 本明細書で用いられる「固定化」という用語は、インテグリン蛋白質が、当技
術分野において知られている任意の種々の化学的および物理的手段によって、適
当な固体支持体に取りつけられている状態を意味する。固体支持体はビーズまた
はプレート、例えばマイクロウェルもしくはマイクロタイタープレートでもよい
が、これらに限定されることはない。このような固定化のための手段およびこの
ような固体支持体は、固定化インテグリンが所望のインテグリン阻害物質に結合
する能力を保持するように選択される。
【０１２６】 本明細書で用いられる「抗体」という用語は、抗原に応答して産生される、モ
ノクローナルまたはポリクローナル供給源からの抗体と、同様にそのような抗体
の断片、キメラ体、改変体（ａｌｔｅｒｅｄ ｆｏｒｍ）、および誘導体と、同
様にそれらの化学的および組換えによる産生体を含む。本明細書で用いられる「
抗ヒト抗体」という用語は、ヒト免疫グロブリンを認識し、これに結合する抗体
を意味する。
【０１２７】 本明細書で用いられる「検出可能な抗ヒト抗体」という用語は、当技術分野に
おいて知られている種々の手段によって直接または間接的に検出することができ
る、抗ヒト抗体を意味する。検出可能な抗ヒト抗体は、標識二次抗ヒト抗体であ
ることが好ましい。本明細書で用いられる「標識二次抗ヒト抗体」という用語は
、当技術分野において知られている種々の手段によって直接または間接的に検出
することができる標識または検出可能なマーカーにより標識された、もしくはこ
れと結合した、またはその他の方法で連結された、抗ヒト抗体を意味する。標識
二次抗ヒト抗体は、蛍光標識、または酵素が作用する基質に曝露されたときに検
出可能な反応を引き起こすセイヨウワサビペルオキシダーゼなどの酵素標識を含
むことが好ましい。
【０１２８】 本明細書で用いられる「ハイブリドーマ」という用語は、抗体産生プラスマ細
胞と骨髄腫細胞との融合によって生じる細胞を意味する。このようなハイブリッ
ド細胞は組織培養中または動物腫瘍として維持することができるクローンを産生
し、このクローンは一種類の抗体だけを分泌することができる（モノクローナル
抗体）。
【０１２９】 本明細書で用いられる「組換え体」という用語は、異なる生物からのＤＮＡの
ｉｎ ｖｉｔｒｏのライゲーション、分子クローニング、自由組み合わせ、また
は交差により、親の中で存在していたＤＮＡ以外の遺伝子を持った後代を意味す
る。
【０１３０】 本発明のアッセイで試験する抗体試料の供給源は、そのような抗体を含むいか
なる体液または組織または細胞でもよく、そのような抗体試料の供給源としては
血液または血漿が好ましい。
【０１３１】 本明細書で言及される「インテグリンアンタゴニスト」という用語（本明細書
においてインテグリン阻害物質とも呼ばれる）には、インテグリン蛋白質と、そ
のようなインテグリンの内在性蛋白質リガンドとの結合の阻害物質として作用す
る化合物（蛋白質、ペプチドおよびペプチド様化合物ならびにその他の小分子化
合物を含む）が含まれる。本明細書で用いられる「インテグリンアゴニスト」と
いう用語には、インテグリン蛋白質と、そのようなインテグリンの内在性蛋白質
リガンドとの結合の刺激物質として作用する化合物が含まれる。本発明で用いら
れる好ましいインテグリン阻害物質はＲＧＤペプチド様化合物である。本明細書
で用いられる「ＲＧＤペプチド様化合物」という用語は、インテグリンのＲＧＤ
結合領域に結合し、そのようなインテグリンへの１つまたは複数の接着性蛋白質
のＲＧＤ仲介性結合を阻止する化学的化合物を意味する。本発明で好まれるのは
、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａインテグリンのアンタゴニストである。
【０１３２】 本発明は以下の実施例を読むことによってよりよく理解することができる。実
施例中、割合およびパーセンテージは別に示す場合を除き重量による。
【０１３３】 （実施例１） 治療前にＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト仲介性血小板減少症／血栓塞栓症
疾患状態を発症するリスクを有する患者を同定する方法 冠疾患症候群（ｃｏｒｏｎａｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅｅ）を呈する患者にイン
テグリンアンタゴニスト／アゴニストを投与する計画を立てる。治療前に、血液
試料を採取し、インテグリンアンタゴニスト／アゴニストまたはその活性代謝物
存在下でのＤＤＡＢの有無について試験する。患者はＤＤＡＢ ＥＬＩＳＡで陽
性反応を示す。この患者にはインテグリンアンタゴニスト／アゴニストを投与し
ない。同じ血液試料を、５つの異なるインテグリンアンタゴニスト／アゴニスト
に対して試験する。ＤＤＡＢのインテグリンへの結合を仲介しない１つのアンタ
ゴニスト／アゴニストを同定する。患者には後者の化合物を投与する。
【０１３４】 （実施例２） 治療中にＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト仲介性血小板減少症／血栓塞栓症
疾患状態を発症するリスクを有する患者を同定する方法 冠疾患症候群を呈する患者にインテグリンアンタゴニスト／アゴニストを投与
する。治療中に、血液試料を採取し、インテグリンアンタゴニスト／アゴニスト
またはその活性代謝物存在下でのＤＤＡＢの有無について試験する。患者はＤＤ
ＡＢ ＥＬＩＳＡで陽性反応を示す。インテグリンアンタゴニスト／アゴニスト
の投与を停止し、患者はインテグリンアンタゴニスト／アゴニスト仲介性疾患状
態を発症しない。同じ血液試料を、５つの異なるインテグリンアンタゴニスト／
アゴニストに対して試験する。ＤＤＡＢのインテグリンへの結合を仲介しない１
つのアンタゴニスト／アゴニストを同定する。患者には後者の化合物を投与する
。
【０１３５】 （実施例３） ＤＤＡＢ−ＥＬＩＳＡでの使用に適したＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａの精製 ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａを市販の供給源（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から入手、または以下に概説するとおりに精製した。
古い血小板濃縮物（１００単位）をＩｎｔｅｒｓｔａｔｅ Ｂｌｏｏｄ Ｂａｎ
ｋから購入し、室温、３００ｇで５分間遠心分離して赤血球を除去した。血小板
上清を回収し、室温、１８００ｇで１５分間遠心分離して血小板をペレット状に
沈殿させた。続いて血小板を４℃で洗浄緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、
１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）中３回洗浄した。血小
板ペレットを１００ｍＬの溶解緩衝液（１％トライトンＸ−１００（ｖ／ｖ）、
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ＣａＣｌ2、１０μ
Ｍロイペプチン、０．５ｍＭ ＡＥＢＳＦ、５０μＭ Ｅ−６４、ｐＨ７．４）
に再度懸濁し、実験用振盪機上、４℃で１６時間インキュベートした。溶解産物
を３０，０００ｇで１時間遠心分離して膜細胞骨格を除去した。溶解産物をさら
に処理するまで−７０℃で保存した。コンカナバリンＡセファロース４Ｂ（性能
：２０ｍｇ糖蛋白質／ｍＬゲル、２５ｍＬ［Ｓｉｇｍａ］）を緩衝液Ａ（１％ト
ライトンＸ−１００（ｖ／ｖ）、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2、１ｍＭ ＣａＣｌ2、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で平衡化した。
典型的精製において、５０単位の血小板からの凍結溶解産物を３０，０００ｇで
１時間遠心分離して粒子を除去した。続いて上清をコンカナバリンＡカラムに室
温、流速１ｍＬ／分で吸着させた。カラムを吸着床容積の５倍の緩衝液Ａで洗浄
し、１００ｍＭメチル−ａ−Ｄ−マンノピラノシド（Ｓｉｇｍａ）を含む緩衝液
Ａにより流速０．５ｍＬ／分で溶出して、２ｍＬの分画を集めた。溶出分画（５
０ｍＬ）を緩衝液Ａに対して４℃で１８時間透析し、限外濾過（ＹＭ１００メン
ブレン［Ａｍｉｃｏｎ]）によって約４倍に濃縮した。製造者の指示に従って６ −アミノヘキサン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｓｉｇｍａ）で活
性化した１５ｇのセファロース−４Ｂを４００ｍｇのＲＧＤＳペプチド（Ｂａｃ
ｈｅｍ）と反応させることにより、Ｌ−アルギニン−Ｌ−グリシン−Ｌ−アスパ
ラギン−Ｌ−セリン［ＲＧＤＳ］アフィニティーカラムを調製した。コンカナバ
リンＡ保持蛋白質を流速０．２ｍＬ／分でＲＧＤＳアフィニティーカラム（２．
３×１０ｃｍ）にアプライした。カラムを緩衝液Ａで洗浄し、結合蛋白質を３ｍ
ＭのＲＧＤＳペプチド／緩衝液Ａで溶出し、４℃で１８時間緩衝液Ａに対してよ
く透析した。溶出された保持ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａを使用前に−８０℃で保存し
た。ＲＧＤＳカラムの素通り相（非保持ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ）を限外濾過（Ｙ
Ｍ１００）によって８ｍＬまで濃縮し、さらにＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００
カラム（３．０×１１５ｃｍ）のサイズ排除クロマトグラフィにかけた。カラム
を室温で緩衝液Ａを用い、流速１００ｍＬ／時で展開し、５ｍＬの分画を集めた
。カラム分画を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の後、クーマシーブルーＲ２５０染色によって分析した。Ｇ
ＰＩＩｂ／ＩＩＩａを含むピークの分画を集めて、再度−８０℃で保存した。保
持および非保持ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａの最終調製物の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
により還元条件下と非還元条件下の両方で評価した。この精製の収量は、非保持
ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ約１５ｍｇおよび保持ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ５ｍｇであっ
た。いくつかの実験では、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ調製物中の痕跡量の混入ヒトＩ
ｇＧを蛋白質Ｇアフィニティークロマトグラフィ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によっ
て除去した。簡単に言うと、蛋白質を緩衝液Ａ中４℃で１時間バッチ吸着させた
後、１，０００ｇ（４℃）で遠心分離して蛋白質Ｇセファロースを回収した。枯
渇がうまくいったことをＳＤＳ−ＰＡＧＥと、続いてペルオキシダーゼ標識した
ヤギ抗ヒトＩｇＧ（１：１０，０００希釈、Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒ
ｒｙ）を用いたイムノブロッティング、およびＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）によ
る検出によってモニターした。
【０１３６】 最終調製物中の界面活性剤濃度を２８０ｎｍの吸光度によって求め、蛋白質濃
度をＢＣＡアッセイによって求めた。界面活性剤／蛋白質濃度が高すぎた場合、
過剰の界面活性剤をＥＸＴＲＡＣＴ−Ｇｅｌ（Ｐｉｅｒｃｅ）への吸着によって
除去した。
【０１３７】 （実施例４） 血漿試料の調製 試験には見かけ上健常な志願者（施設内ドナーおよびアメリカ赤十字のドナー
から採取した血液）と、化合物Ａを用いた臨床試験の参加者が含まれた。血液は
静脈穿刺によって採取し、３．２％クエン酸ナトリウム中に１：１０の体積比で
集めた。血漿を１，８００ｇの遠心分離を１５分間行って調製した。得られた血
漿を等分し、分析まで−８０℃で保存した。臨床試験中、血小板数をコールター
カウンターで計数した。さらに、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストである化
合物Ｄ投与後に血小板減少反応を示したチンパンジーと健常なチンパンジーとか
らも全血を採取した。化合物Ａの代謝物を標準的方法を用いてラット尿から得た
。
【０１３８】 （実施例５） ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ ＤＤＡＢ ＥＬＩＳＡ 最初の一連の実験（一般集団におけるＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａのＤＤＡＢ）を、
本明細書において２型ＥＬＩＳＡと呼ぶＥＬＩＳＡを用いて実施したが、これは
後に感度および特異性を増大させるよう変更した。ＥＬＩＳＡ法の変法は本明細
書において１型ＥＬＩＳＡと呼ぶ。
【０１３９】 ２型ＥＬＩＳＡ法において、Ｃｏｓｔａｒエンザイムイムノアッセイ／ラジオ
イムノアッセイ［ＥＩＡ／ＲＩＡ］９６穴平底プレート（中等度の結合［＃３５
９１］）を、１ｍＭ ＣａＣｌ2および０．５ｍＭ ＭｇＣｌ2を含むリン酸緩衝
食塩水（ＰＢＳ）（ＰＢＳ／Ｃａ／Ｍｇ）中、示されたＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａア
ンタゴニスト（１００ｎＭ）存在下または非存在下で２５０ｎｇのＧＰＩＩｂ／
ＩＩＩａによってコーティングした（４℃、１６時間）。３洗浄工程（０．０５
％ ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ／Ｃａ／Ｍｇ）の後、血漿を０．０５
％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ／Ｃａ／Ｍｇで１：５に希釈し、示されたＧＰＩ
Ｉｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト（１００ｎＭ）非存在下または存在下でコーティ
ングされたウェルに加え、室温で１時間放置した。ウェルを洗浄（０．０５％
ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ／Ｃａ／Ｍｇ）し、ペルオキシダーゼ標識
したヤギ抗ヒトＩｇＧ（ｙ）（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ）と共に
室温で１時間インキュベートした。ウェルを洗浄（０．０５％ ｖ／ｖ Ｔｗｅ
ｅｎ２０を含むＰＢＳ／Ｃａ／Ｍｇ）し、ｏ−フェニレンジアミン［ＯＰＤ］（
過ホウ酸ナトリウムを含むリン酸クエン酸緩衝液中０．４ｍｇ／ｍＬ［Ｓｉｇｍ
ａ］）で顕色させた。吸光度の変化を、標準的ＥＬＩＳＡ読みとり器を用い、４
５０ｎＭで１５分間速度論的に測定した。結果をＯＤの差分［光学密度の変化］
（Ｖmax＋化合物）−（Ｖmax−化合物）、または比（Ｖmax＋化合物／Ｖmax−化
合物）のいずれかで表す。
【０１４０】 １型ＥＬＩＳＡ法において、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａによるコーティング後、プ
レートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ／Ｃａ／Ｍｇ中、１％ヤギ血
清（ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および０．１％カゼイン（Ｓｉｇｍａ）に
よって、室温で３０分間ブロックし、続いて血漿（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、
１％ ｖ／ｖ ヤギ血清、０．１％カゼインを含むＰＢＳ／Ｃａ／Ｍｇで希釈）
を加えて室温で１時間放置した。二次抗体を０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０および０
．１％カゼインを含むＰＢＳ／Ｃａ／Ｍｇで１：１０，０００に希釈して加え、
室温で１時間放置した。結合したペルオキシダーゼ標識ＩｇＧを３，３’，５，
５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ、基質キット、Ｐｉｅｒｃｅ）によって
検出し、吸光度の変化を６５０ｎＭで５分間測定した。さらに、１型ＥＬＩＳＡ
法では、すべてのインキュベーションおよび洗浄工程を通して、それぞれのＧＰ
ＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト（１００ｎＭ）が適当なウェルに存在した。ブ
ロッキング条件を最適化した１型ＥＬＩＳＡ法とＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａのさらな
る精製とを組み合わせることによってバックグラウンドが低下し、シグナル対ノ
イズ比が増大することになった。ＤＤＡＢの免疫グロブリンクラスを、ヒトＩｇ
に対するペルオキシダーゼ標識したネズミモノクローナル抗体（Ｚｙｍｅｄ）を
ＥＬＩＳＡプロトコル変法の検出工程に用いて、決定した。これらの実験では、
健常なヤギの血清の代わりに健常なネズミの血清（Ｚｙｍｅｄ）を用いた。
【０１４１】 ＤＤＢＡ ＥＬＩＳＡの溶液相吸着のために、ゲル濾過した血小板を調製した
。血液を健常志願者から３．２％クエン酸ナトリウム中に１：１０の体積比で採
取し、１５０ｇで１０分間遠心分離した。得られた血小板を多く含む血漿を、変
更したＨＥＰＥＳタイロード緩衝液（５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ ＮａＣ
ｌ、０．４ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、１２ｍＭ ＮａＨＣＯ3、５．５ｍＭグルコー ス、０．３５％ＢＳＡ、ｐＨ７．４）で平衡化したセファロースＣＬ４Ｂカラム
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に充填した。血小板を含む分画を手動で集め、血小板濃
度をコールターカウンターを用いて測定した。いくつかの実験では、血小板凝集
および蛋白分解酵素を防止するために下記の阻害物質を加えた。すなわち、プロ
スタグランジンＩ2（０．１３ｍＭ）、アピラーゼ（２６３μｇ／ｍＬ）、ヒル ジン（６．５μｇ／ｍＬ）、およびロイペプチン（１．３ｍＭ）である。血小板
をマイクロタイターウェル中で化合物Ａ（１０μＭ）の存在下または非存在下、
５分間予備インキュベートし、１，８００ｇで５分間遠心分離してペレット状と
した。血漿を血小板ペレットに化合物Ａ（１０μＭ）の存在下または非存在下で
加え、室温で１時間放置した。血小板を１，８００ｇで１０分間遠心分離してペ
レット状とし、得られた吸着された血漿を、ＥＬＩＳＡアッセイを用いてＤＤＡ
Ｂの有無について分析した。いくつかの実験では、ゲル精製した血小板を個々の
ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストならびに血液および／または血漿と直接混
合して示された時間放置した後、血小板を遠心分離によって除去した。
【０１４２】 （実施例６） ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ ＤＤＡＢ ＥＬＩＳＡの感度および特異性 化合物Ａによる治療中に血小板減少症の症状発現が認められた患者から採取し
た血漿を、ＤＤＡＢの有無について分析した。マイクロタイターウェルを、化合
物Ａの存在下または非存在下のいずれかで精製ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａでコーティ
ングした。次いでウェルに患者血漿の緩衝液による連続希釈液（図１Ａ、黒丸）
または対照血漿の緩衝液希釈液（図１Ａ、白丸）を加えてインキュベートした。
結合したＩｇＧを、ペルオキシダーゼ標識したヒトＩｇＧに対する抗体（ｇ）を
用いて検出した。ＤＤＡＢは患者血漿中で容易に検出可能であった。シグナルは
患者血漿を１：２，５００希釈した工程で消失した。ＥＬＩＳＡにおけるシグナ
ル強度は、血漿濃度に関して用量依存的であることに留意されたい。患者血漿の
シグナル強度対血漿希釈度の相関係数は０．９５であった。対照的に、同じ濃度
範囲で、対照血漿ではＤＤＡＢは検出不可能であった（図１Ａ）。
【０１４３】 異種血漿における陽性抗体価の検出を試験した（図１Ｂ）。ＤＤＡＢを含まな
い一定量の対照血漿を、患者血漿の漸増量と混合した。ＤＤＡＢ ＥＬＩＳＡに
おけるシグナル強度（図１Ｂ、黒丸）を、血漿＃３３０の緩衝液単独による連続
希釈液（図１Ｂ、白丸）と比較した。用いた濃度範囲で、対照血漿からＤＤＡＢ
は定量的に回収された。３名の異なるドナーからの血漿で、同様の結果が得られ
た。これらの結果は、血漿構成成分は低いＤＤＡＢ価の検出を妨げないことを示
している。
【０１４４】 ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａの生理学的に関連した供給源である血小板の、固定化Ｇ
ＰＩＩｂ／ＩＩＩａに対するＤＤＡＢの結合と競合する能力を試験した（図２）
。患者からの血漿を、健常志願者由来の、示された濃度の代謝的に阻害された（
ＭＩ）ゲル濾過血小板（１０μＭ ＰＧＩ2、１Ｕ／ｍＬヒルジン、１ｍＭロイ ペプチンおよび４０μｇ／ｍＬアピラーゼで阻害）と共に、化合物Ａの存在下ま
たは非存在下で予備インキュベートした。患者血漿を遠心分離によって回収し、
ＤＤＡＢの残存抗体価についてＤＤＡＢ ＥＬＩＳＡで試験した。患者血漿を血
小板と薬物非存在下であらかじめインキュベートしても、抗体価は低下しなかっ
た（図２、白丸）。対照的に、血小板インキュベーション中に化合物Ａを加える
と、抗体価が有意に低下した（図２、黒丸）。抗体価の低下は吸着実験中に用い
た血小板濃度に関して用量依存的であった。吸着中のＥＬＩＳＡシグナルの低下
対血小板数の相関係数は０．８５であった。
【０１４５】 ＤＤＡＢ ＥＬＩＳＡに対する生理学的関連の比較として、化合物Ａの存在下
または非存在下で血小板で処理した同じ試料を、ゲル濾過した血小板で次のとお
りに再度処理した。すなわち、ＭＩ阻害されたゲル濾過血小板を患者血漿に最終
血小板濃度２×１０7／ｍＬで総体積１００μＬとなるように再懸濁した。１時 間後、結合していない抗体を１５００×Ｇの遠心分離によって除去し、血小板ペ
レットを１００μＬのフロー緩衝液（ＦＢ）（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ
ＫＣｌ、１６８ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2）中に再懸濁した。この血 小板懸濁液４０μＬを、１／２００希釈のＦＩＴＣ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗
体を含むＦＢで１／１０に希釈した。血小板をＦＡＣＳｓｃａｎフローサイトメ
ーターで計数し、ＦＩＴＣの蛍光を１０，０００事象について定量した。所定の
試料の結果を、化合物Ａの存在下または非存在下で血小板で予め処理していない
試料で観察された蛍光に対する、観察された蛍光（特異的な化合物Ａ依存性の抗
体結合）のパーセンテージで表している。ＥＬＩＳＡ分析によって得られた結果
と同様に、薬物非存在下で患者血漿を血小板とあらかじめインキュベートしても
、抗体価を低下させることはなかった（図２、白四角）が、血小板インキュベー
ト中に化合物Ａを加えると、抗体価は有意に低下した（図２、黒四角）。ＤＤＡ
Ｂ結合のフローサイトメトリーによるデータとＥＬＩＳＡ ＤＤＡＢとの間に密
接な相関があることから、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ ＤＤＡＢ ＥＬＩＳＡは薬物
依存性抗血小板抗体結合を正確に反映していることが示される。これらの結果は
さらに、血小板ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａが固定化された精製ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ
に対するＤＤＡＢの結合と競合することも示している。さらに、吸着中に存在す
る血小板ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａの濃度とプレート上に固定化されたものとを比較
することにより、溶液相と固相ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａのモル濃度がほぼ等しい場
合に、ＤＤＡＢ ＥＬＩＳＡのシグナルの５０％低下が得られることが示唆され
る。さらに、これらの知見から、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａの精製および固定化によ
って血小板表面に存在しないＤＤＡＢのネオエピトープが作られることはなく、
それによりアッセイにおいて可能性のある偽陽性の発生が避けられることが示唆
される。
【０１４６】 （実施例７） ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストによる治療後のＤＤＡＢ価発生を検出する
ためのＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ ＤＤＡＢ ＥＬＩＳＡの使用 実施例４における患者血中のＤＤＡＢ発生の時間経過をレトロスペクティブに
分析した。化合物Ａ投与前には、ＤＤＡＢは存在しないか、またはＤＤＡＢ Ｅ
ＬＩＳＡの検出限界よりも低かった（図３、黒四角（１型ＥＬＩＳＡ）、白丸（
２型ＥＬＩＳＡ）。抗体価の最初の上昇は、第８日に検出されたが、その時点で
血中の血小板濃度（黒丸）は有意に低下していなかった。第１６日に、中等度の
血小板減少症のために化合物Ａによる治療が停止された。この時点で、ＤＤＡＢ
価のさらなる上昇が認められ、これは第１８日まで比較的変わらずに推移した。
ＤＤＡＢ ＥＬＩＳＡの生理学的関連性を確立するために、ＤＤＡＢの発生の時
間経過も、実施例６に記載のとおりにＭＩ阻害された血小板でフローサイトメト
リーによって分析した。図３（星）に示すとおり、全血小板データ（蛍光の差分
）とＤＤＡＢ ＥＬＩＳＡデータとの密接な相関が認められ、ＧＰＩＩｂ／ＩＩ
Ｉａ ＤＤＡＢ ＥＬＩＳＡは薬物依存性抗血小板抗体結合を正確に反映してい
ることが示される。血小板減少症発症前に検出可能な抗体価が発生したこと（第
８日）から、本発明のアッセイを、ＤＤＡＢ価の上昇をきたし、血小板減少症発
症のリスクを有すると考えられる患者を同定するために、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ
アンタゴニスト治療中に患者をモニターするために利用できることが示唆される
。このような患者においては、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト治療を停止
してもよく、または治療を患者のＤＤＡＢのＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａへの結合を強
化することのないＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストに切り換えてもよい（表
１参照）。表１は、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストの構造に基づき、ＤＤ
ＡＢを区別するＤＤＡＢ ＥＬＩＳＡの能力を示している。
【０１４７】 表１は、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ ＤＤＡＢがＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニ
ストの構造に依存しており、ＤＤＡＢ ＥＬＩＳＡによって区別できることを示
している。患者およびチンパンジー由来の血漿中に存在するＤＤＡＢが、種々の
ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト存在下で固定化ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに結
合する能力を比較した。結果はそれぞれの化合物存在下と非存在下におけるｍＯ
Ｄ／分の比で表している。
【０１４８】
【表１】
【０１４９】 （実施例８） 既に存在しているＤＤＡＢ価を検出するためのＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ ＤＤＡＢ
ＥＬＩＳＡの使用 化合物Ａによる治療中に有意な血小板減少症を発症した患者由来の血漿試料を
、ＤＤＡＢ ＥＬＩＳＡによってレトロスペクティブに分析した。この患者では
、治療前に中程度の抗体価がすでに存在していた（図４、白丸［２型ＥＬＩＳＡ
］、黒四角［１型ＥＬＩＳＡ］）、黒三角［１型ＥＬＩＳＡ］、投与前の繰り返
し。化合物Ａの最初の投与後、ＤＤＡＢはＥＬＩＳＡアッセイで検出できなかっ
た。このＤＤＡＢ価低下の理由は不明である。化合物Ａの投与後に抗体が血小板
表面に再分布し、血小板に結合して、そのため血液の血漿画分中に回収されなか
った可能性がある。ＤＤＡＢは最初の投与後、早い時点で分析した血漿試料では
検出不可能であった。図４に示すとおり、抗体価の上昇は第８日に検出可能であ
った。この時点で、血小板数は中程度に低下したにすぎなかった。その２日後、
血小板減少症のために化合物Ａによる治療を停止し、血小板輸注後患者は速やか
に回復した。ＤＤＡＢ価はさらに上昇して第１８日に最大値を示し、その後ゆっ
くりと低下した。患者血漿を、実施例６に記載のとおりフローサイトメトリーに
よって全血小板についても分析した。図４（星）に示すとおり、全血小板データ
（蛍光の差分）とＤＤＡＢ ＥＬＩＳＡデータとの密接な相関が認められ、ＧＰ
ＩＩｂ／ＩＩＩａ ＤＤＡＢ ＥＬＩＳＡは薬物依存性抗血小板抗体結合を正確
に反映していることが示される。前向き試験において、この既に存在しているＤ
ＤＡＢを有する患者は試験から除外して、臨床上重大な血小板減少症の症状発現
を防止することになった。
【０１５０】 （実施例９） 異なるＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストおよびその代謝物を識別するための
ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ ＤＤＡＢ ＥＬＩＳＡの使用 患者の血漿および血小板減少症のチンパンジーの種々のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ
アンタゴニストとの反応性をＤＤＡＢ ＥＬＩＳＡで比較した（上記表１）。患
者の血漿は化合物Ａ、化合物Ｂおよび化合物Ｄと強く反応するが、化合物Ｃに対
する反応性は認められなかった。対照的に、チンパンジーは化合物Ｄと強く反応
したが、化合物Ｃとはそれよりも弱く、化合物Ａおよび化合物Ｂに対しては反応
性は見られなかった。これらの結果は、両方の血漿中に存在するＤＤＡＢが、特
定のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストに対して高度に特異的であることを示
している。さらに、これらの結果は、ＤＤＡＢ ＥＬＩＳＡは、いくつかの構造
的に異なるＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストに特異的なＤＤＡＢを検出する
ために用いることができ、特定の化学的クラスのＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴ
ニストに限定されないことも示している。
【０１５１】 患者血漿の化合物Ａおよびその代謝物との反応性を比較した。化合物Ａの代謝
物をラットの尿から単離し、血小板を多く含む血漿中で血小板凝集を防止する能
力について試験した。患者由来血漿中に存在するＤＤＡＢが化合物Ａの示された
代謝物存在下でＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａと結合する能力を、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ
ＤＤＡＢ ＥＬＩＳＡを用いて試験した。化合物Ａの３つの代謝物はすべて、
血小板を多く含む血漿を用いたＡＤＰ誘導性血小板凝集の防止において活性であ
った。代謝物は親化合物（化合物Ａ）と１個の炭素原子のヒドロキシル化に関し
て異なっているだけであるが、患者のＤＤＡＢの代謝物Ｍ−３との反応性はわず
か５０％で、代謝物Ｍ−２との反応性は検出できなかった。この結果は、上記表
１に示す、ＤＤＡＢ ＥＬＩＳＡがそれぞれのＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニ
ストの化学的構造における小さい変化に敏感であるという前述の知見を確認し、
拡大するものである。
【０１５２】 患者のＤＤＡＢは化合物Ａの代謝物を区別して反応する。表２に、薬物依存性
抗体の化合物Ａの代謝物との区別反応を示す。
【０１５３】
【表２】
【０１５４】 （実施例１０） 特異的なＤＤＡＢ Ｉｇクラスを検出するためのＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ ＤＤＡ
Ｂ ＥＬＩＳＡの使用 ＤＤＡＢ２型ＥＬＩＳＡ法の変法において、３名の患者のＤＤＡＢが免疫グロ
ブリンのクラス特異的セイヨウワサビペルオキシダーゼ標識ネズミ抗体によって
検出された。反応性はＩｇＧ１抗体とラムダ（患者Ａ）およびカッパ（患者Ｂ）
軽鎖特異的抗体で認められた。患者Ｃの反応性は、カッパのＩｇＧ１およびＩｇ
Ｇ３に対するものであった。対照的に、モノクローナルおよびポリクローナル（
示していない）抗ヒトＩｇＭ抗体との反応性は検出されなかった。したがって、
これらの患者全員の免疫応答はモノまたはオリゴクローナルである。ＩｇＭおよ
び複数のＩｇＧクラス特異的ＤＤＡＢによって特徴付けられる一般化免疫応答は
見られない。ＩｇＧ１抗体は補体経路を活性化しうることに留意されたい。３名
の異なる患者由来の血漿をＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａでコーティングしたウェル中で
、化合物Ａの存在下または非存在下でインキュベートした。結合免疫グロブリン
は、示した免疫グロブリンクラスに特異的なモノクローナル抗体で検出した（表
３）。表３に、特異的なＩｇクラスを検出するためのＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ Ｄ
ＤＡＢ ＥＬＩＳＡの適性を示す。
【０１５５】
【表３】
【０１５６】 （実施例１１） ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ ＤＤＡＢ ＥＬＩＳＡを用いたＤＤＡＢの検出 一般集団におけるＤＤＡＢの出現率を試験した。ドナーからの血漿試料をアメ
リカ赤十字から入手し、ＤＤＡＢ２型ＥＬＩＳＡ法で化合物Ａおよび化合物Ｂと
の反応性を試験した。ドナーの大多数はＤＤＡＢ ＥＬＩＳＡで陰性であったが
、２．２％および１４．６％のドナーがそれぞれ化合物Ａおよび化合物Ｂとの反
応性（差分＞３）を示した。差分＞５の反応性は化合物Ａおよび化合物Ｂについ
てそれぞれドナーの１．３％および７．１％で見られたにとどまった。したがっ
て、既に存在しているＤＤＡＢの出現率および抗体価は一般集団では比較的低く
、用いたそれぞれのＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストによって異なる。これ
らの結果は、既に存在している抗体価を本発明のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ ＤＤＡ
Ｂ ＥＬＩＳＡによって検出可能であることを示している。本実施例は、患者を
血小板減少症／血栓塞栓症合併症を発症する傾向について予備スクリーニングす
ることが可能であることを示している。本実施例はさらに、血小板減少症／血栓
塞栓症合併症をきたす傾向の低いＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストを開発す
るために、無作為患者集団のスクリーニングを用いることができることも示して
いる。
【０１５７】 （実施例１２） 化合物Ａで治療した患者におけるＤＤＡＢの検出 化合物Ａを投与された患者で、臨床上重大な血小板減少症の症状を発現しなか
った患者からの血液試料を、既に存在しているＤＤＡＢの存在およびＤＤＡＢの
発生について本発明のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ ＤＤＡＢ ＥＬＩＳＡを用いて（
アッセイ中、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストとして化合物Ａを用いて）分
析した。既存および発生ＤＤＡＢ価出現率は、この化合物Ａ投与群において低い
ことが判明し、本発明のアッセイがＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト治療に
関連する血小板減少症の症状発現のリスクを評価する際に高い適中率を有するこ
とが示唆される。
【０１５８】 （実施例１３） ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａのＤＤＡＢはＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト存在下
で血小板表面に分布する インテグリンに対するＤＤＡＢの回収に影響をおよぼす血小板の能力について
試験した。本実施例において、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａをインテグリンのプロトタ
イプとして用いた。クエン酸血漿を、化合物Ａ投与中に血小板減少症の症状発現
を呈した患者２名（３０７、３３０）、化合物Ｄ投与後に血小板減少症を呈した
チンパンジー（Ａ２６４）、および化合物Ａに対する既に存在している抗体を有
する見かけ上健常な志願者から得た。化合物Ａはプロドラッグの活性体である。
血漿をゲル精製した血小板と共に、化合物Ａ（患者３０７、３３０、志願者）ま
たは化合物Ｄ（Ａ２６４）の存在下、室温で３０分間インキュベートした。イン
キュベーション期間終了時に、血小板を遠心分離によって除去し、得られた上清
をＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ ＤＤＡＢ ＥＬＩＳＡで分析した。結果を、血小板は
存在するが、それぞれの薬物非存在下でインキュベートした血漿と比較した（図
５、Ａ図）。患者血漿をそれぞれのＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト存在下
で血小板とインキュベートすることにより、血漿試料中のＤＤＡＢ価は劇的に低
下した。これらの結果は、インテグリンに対するＤＤＡＢが細胞表面に分布し、
液相にはわずかに回収されるだけであることを示している。ＤＤＡＢが、薬物を
投与された患者集団の全血で見られると予想される薬物濃度存在下で血小板表面
に分布するかどうかを調べるために、用量反応実験を実施した。投与された患者
で、化合物Ａの５０ｎＭまでの最大血中濃度が認められる。ＤＤＡＢが血小板表
面に完全に移行するには、化合物Ａが１ｎＭ未満であることが求められた（図５
、Ｂ図、黒丸）。化合物ＡのＩＣ50は０．３ｎＭと推定された。したがって、現
行の投与法では、インテグリンに対するＤＤＡＢは完全に血小板表面に分布する
と予想される。同様の結果が化合物ＤとチンパンジーＡ２６４の血漿でも得られ
た（図５、Ｂ図、白丸）。
【０１５９】 （実施例１４） インテグリン依存性抗体の２コンパートメントモデル 実施例１３で示されたデータは、次のインテグリンを対象とする抗体の２コン
パートメントモデルに一致している。血小板ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに対する抗体
（薬物依存性および薬物非依存性）は、ｉｎ ｖｉｖｏで少なくとも２つのコン
パートメントに分布している。第１のコンパートメントは血小板に関連するのに
対し、第２のコンパートメントは血液の細胞成分を取り巻く液相である。２つの
コンパートメント間の分布は、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに対する抗体の親和性、抗
体価、および、ＤＤＡＢの場合は血漿および血小板表面における薬物の濃度に依
存する。抗血小板抗体を検出することを目的とした現行の方法は血漿／血清を分
析するのに対し、血小板に関連するプールは血漿／血清調製中に廃棄されること
がある。その結果、血小板関連の抗体プールを回収することを目的とした方法は
、抗血小板抗体検出法の感度および特異性を増大させることになる。現行の検出
法は血漿／血清を分析するのに対し、最適な方法は血小板上および血漿／血清の
抗体濃度を求めるべきであることに留意されたい。以下の実施例は、血小板をイ
ンテグリン供給源として用いるが、この細胞表面受容体群を含むその他の細胞を
代わりに用いることもできる。ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに対する抗体は、２つのプ
ール、すなわち血小板プールおよび血漿／血清プールに分布すると予想される。
分布は抗体価、抗体の親和性、ならびにＤＤＡＢの場合は薬物濃度および薬物の
ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに対する親和性に依存する。現行の検出法は血漿プールだ
けを分析し、インテグリンを対象とする抗体のかなりの部分がこれらのアッセイ
では測定されないことを示している。最適な検出法は、抗体の血漿および血小板
プールの両方を測定すべきである。インテグリンに対する抗体の血小板プールを
回収する方法は、次の最低条件を満たさなければならない。 １．抗体は生物活性体で回収されなければならない（機能アッセイのために求め
られる）。 ２．溶出条件は現在知られているインテグリン抗体の高いパーセンテージに普遍
的に適用可能でなければならない。 ３．回収法は、必要とされる生物試料の追加の取り扱い／処理が最小限である、
またはまったく必要としないものでなければならない。 ４．方法は使用が容易で、診療所または検査室で利用可能な技術／装置により高
処理量モードで実施できるものでなければならない。 ４つの条件すべてを満たす新しい技術を実施例１５、１６、１７、および２３に
示す。
【０１６０】 （実施例１５） ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに対するＤＤＡＢを、血清の調製によってではなく、ＥＤ
ＴＡによる処理によって血小板表面から回収することができる。
【０１６１】 チンパンジーＡ２６４からの血漿を、実施例１３と同様に、ゲル精製した血小
板と化合物Ｄ非存在下（黒棒）または存在下（白棒）でインキュベートした（図
６、Ａ図）。３０分間のインキュベーション期間終了時、ＥＤＴＡを最終濃度９
ｍＭとなるように加え（斜線棒）、試料を室温でさらに１５分間インキュベート
した。血小板をあまり含まない（ｐｌａｔｅｌｅ−ｐｏｏｒ）血漿を遠心分離に
よって調製し、実施例５と同様にＤＤＡＢの有無について分析した（図６、Ａ図
）。チンパンジーＡ２６４は化合物Ａと反応しないため、薬物無添加ウェルを１
０μＭの化合物Ａの存在下で血漿とインキュベートし、固定化ＧＰＩＩｂ／ＩＩ
Ｉａへの化合物Ｄの結合と競合させた。ＥＤＴＡ処理していない試料と比較して
、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに対するＤＤＡＢの回収率増大が認められることに留意
されたい（図６、Ａ図）白棒と斜線棒とを比較されたい）。したがって、血小板
／化合物Ｄ／ＤＤＡＢ混合物のＥＤＴＡ処理により、抗体を血小板から生物活性
体で解離させることができる。対照的に、血小板、化合物Ｄ、およびＡ２６４血
漿の最初のインキュベーション後、血清をカルシウム再添加（１５ｍＭ ＣａＣ
ｌ2、３０分、３７℃）によって調製したとき、ＤＤＡＢの回収率増大は見られ なかった。この知見は、現在ルーチンで用いられている採血法（すなわち、血清
の調製またはクエン酸血漿の調製）は、液相においてインテグリンを対象とする
抗体を回収するために十分でないことを示している。その結果、現在用いられて
いるインテグリンに対する抗体の試験の多くは、偽陰性の結果を示すことが予想
される。
【０１６２】 ＥＤＴＡ溶出法が全血にも適しているかどうかを調べるために実験を行った（
図６、Ｂ図）。ＤＤＡＢ陰性のヒトドナーからのクエン酸全血に、１／１０体積
のチンパンジーＡ２６４からの血漿を化合物Ｄの非存在下（黒棒）または存在下
で補充した。次いで１組をＥＤＴＡ（４．５ｍＭ、斜線棒）で処理したのに対し
、２番目の組はＥＤＴＡ処理なし（点付き棒）で３７℃で同時インキュベートし
た。全血のＥＤＴＡ処理は全血中のＤＤＡＢの回収率を劇的に上昇させ（図６、
Ｂ図）、ＥＤＴＡ溶出法を複雑な生物試料に用いることができることを示してい
る。
【０１６３】 この技術の普遍的適用性を調べた（図７）。明らかに化合物Ａの存在下でのＧ
ＰＩＩｂ／ＩＩＩａに対するＤＤＡＢが原因の血小板減少症を呈している２名の
患者（３０７、３３０）からのクエン酸血漿を、ゲル精製した血小板と共に化合
物Ａ非存在下（黒棒）または存在下（白棒）でインキュベートした。血小板をあ
まり含まない血漿の分析によって明らかにされたとおり、ＤＤＡＢの大部分は化
合物Ａの存在下で血小板表面に再分布する。ＥＤＴＡ（９ｍＭ）を添加し、３７
℃で２時間さらにインキュベートした後、薬物依存性インテグリン対象抗体の大
部分は液相において回収された（斜線棒）。両方のＤＤＡＢの結合は化合物Ｄに
よって強化されないため、ＥＬＩＳＡにおける薬物無添加ウェルを、血漿試料添
加前に過剰の化合物Ｄ（１０μＭ）でブロックした。したがって、ＥＤＴＡ溶出
法は、３つの異なる血漿中でインテグリン対象抗体の回収率を増大させるのに適
しており、この技術はインテグリン対象抗体に普遍的に適用できることが示唆さ
れる。
【０１６４】 （実施例１６） 血小板をあまり含まない血漿からの遊離ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストの
除去 ＤＤＡＢの検出を目的とした技術の多くは、薬物存在下と非存在下での抗体の
インテグリンに対する分別結合を調べている。血小板を多く含む血漿または全血
のＥＤＴＡ処理は、ＤＤＡＢを解離させる（実施例１５）だけでなく、同時に、
液相の遊離インテグリンアンタゴニスト／アゴニストの濃度を上昇させることに
なる。さらに、インテグリンアンタゴニスト／アゴニストを投与された患者は、
体液中に遊離の薬物を有することになる。分別抗体測定の使用を容易にするため
に、生物試料中の抗体濃度には影響をおよぼさずに遊離薬物を除去する技術が探
究された。分別ＤＤＡＢ ＥＬＩＳＡをバイオアッセイとして用いて、薬物の除
去工程の成否を調べた。
【０１６５】 化合物Ａの薬理学的濃度（５０ｎＭ）を、化合物Ａの存在下でＧＰＩＩｂ／Ｉ
ＩＩａに対するＤＤＡＢ陽性のドナーからの血漿に加えた。Ｃ18樹脂を１００％
メタノールとインキュベートし、続いて０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、１％ヤギ血
清、および０．１％カゼインを含むリン酸緩衝食塩水で洗浄することによって充
填した。樹脂を血漿に用量反応（ｍｇは血漿５００μＬあたりのＣ18の乾燥重量
を意味する）で加え、室温で１５分間回転させながらインキュベートした後、ビ
ーズを遠心分離によって除去した。得られた血漿をＤＤＡＢ ＥＬＩＳＡで試験
し、結果をｍＯＤ／分の差分で表している（図８）。Ｃ18樹脂非存在下では、固
定化ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに対する抗体の分別結合は認められなかった。しかし
、Ｃ18は遊離薬物を除去し、効果は用いたＣ18の量に関して用量依存的であった
。放射性同位体標識したＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストを用いた平行実験
により、Ｃ18処理によって９０％を超える遊離薬物が除去されたことが明らかと
なった。サイズ排除クロマトグラフィを含む別法も、化合物Ａを除去するために
適していることが判明した。
【０１６６】 （実施例１７） トロンビン受容体活性化ペプチドおよびＥＤＴＡによる処理によるＤＤＡＢの内
部移行および回収 ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに対する抗体が、少なくとも２つのプール、すなわち血
小板表面関連および血小板内に存在することが報告された。ＥＤＴＡ処理は表面
関連プールだけに影響をおよぼすと予想される。この結論は、Ａ２６４血漿、ゲ
ル精製した血小板および化合物ＤをＥＤＴＡ処理前に漸増する期間インキュベー
トすることによって確認された（図９、Ａ図）。より具体的に言えば、インキュ
ベーション期間が長くなるほど、ＥＤＴＡ処理によって回収されうるＤＤＡＢの
量が低下し、抗体の内部移行が示唆される（図９、Ａ図、白丸）。対照的に、血
小板を代謝的に不活化（１％アジ化ナトリウム）すると、ＤＤＡＢの内部移行は
認められなかった（黒四角）。さらに、血小板を化合物Ｄ存在下でＡ２６４とイ
ンキュベートすると（黒丸）、ＤＤＡＢ価はインキュベーション期間中比較的安
定であった。
【０１６７】 内部移行したＤＤＡＢの回収率を上げるための方法が探究された（図９、Ｂ図
）。インキュベーション期間（５時間）終了時、トロンビン受容体活性化ペプチ
ド（５０μＭ）をＥＤＴＡ（９ｍＭ）と同時に加え、抗体の回収を試験した。血
小板のトロンビン受容体による刺激は、ＥＤＴＡ単独で処理した試料に比べてＤ
ＤＡＢの回収率を上昇させた（斜線棒［ＥＤＴＡ］と点付き棒［ＥＤＴＡおよび
トロンビン受容体活性化ペプチド］を比較されたい）。したがって、ＥＤＴＡ溶
出と血小板刺激の組み合わせは、インテグリン対象抗体の回収率をさらに上げる
のに適した方法である。
【０１６８】 （実施例１８） ＤＤＡＢの保持ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａとの選択的反応性によって血小板減少症／
血栓塞栓症合併症の早期発症のリスクを有する患者を同定する。
【０１６９】 インテグリンアンタゴニスト／アゴニストを用いて、治療前に潜在的患者集団
でＤＤＡＢについて予備スクリーニングすると、血小板減少症／血栓塞栓症合併
症の予測率よりも高いパーセンテージの抗体陽性患者が認められる。したがって
、既存抗体価および血小板減少症／血栓塞栓症合併症の発症傾向の適中率は１０
０％ではない。インテグリンに対するＤＤＡＢ存在下で血小板減少症／血栓塞栓
症合併症のリスクを有する患者を同定する方法によって、患者を血小板減少症／
血栓塞栓症合併症の高リスクに曝すことなく、より広範囲の患者に対するこれら
の化合物クラスの使用が促進される。
【０１７０】 ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａをＲＧＤアフィニティクロマトグラフィによって血小板
の膜から精製した。この方法では２つのＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ群が得られた。第
１の群（「保持ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ」）はＲＧＤアフィニティ基質に特異的に
結合しており、遊離ＲＧＤ含有ペプチドによって溶出することができる。第２の
群（「非保持ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ」）はＲＧＤカラムの素通り相（非保持分画
）に含まれる。非保持型をさらにサイズ排除クロマトグラフィによって精製した
。両方の型をＤＤＡＢ ＥＬＩＳＡのためにインテグリンアンタゴニスト／アゴ
ニスト存在下または非存在下でマイクロタイターウェルにコーティングした。患
者３０７および３３０（ｒｏｘｉｆｉｂａｎによる治療の第２週および第３週に
血小板減少症を経験した）から得た血漿はＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａのいずれの型に
も結合する（表４）。対照的に、治療１週間以内に血小板減少症を発症した患者
（３０４およびＡＮ６１）から得た血漿は、保持ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに対する
選択的反応性を示したが、非保持ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに対する結合はほとんど
認められなかった（表４）。これらの結果は、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａの２つの調
製物に対する分別結合を、インテグリンアンタゴニスト／アゴニストによる治療
中に血小板減少症／血栓塞栓症合併症の発症傾向が高い患者を同定するために用
いることができることを示している。
【０１７１】
【表４】
【０１７２】 表４ ＤＤＡＢの保持ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに対する選択的反応性により血小板
減少症／血栓塞栓症合併症の早期発症リスクの高い患者が同定される。
【０１７３】 （実施例１９） ネズミモノクローナルＤＤＡＢの生成および抗体の選択 免疫化および融合： ６週齡のＢＡＬＢ／ｃマウスを、１２、２５、または５０μｇの精製ヒトＩＩ
ｂ／ＩＩＩａ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ，）のいずれかと１
００ｎＭの化合物Ａとを合計体積１００μｌで腹腔内に単回注入することによっ
て免疫化した。受容体：薬物複合体を５０％フロイント完全アジュバント中に懸
濁した。１０日後、マウスの眼窩後静脈叢から採血し、血清をＥＬＩＳＡによっ
てＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ複合体特異的抗体についてスクリーニングした。融合の
４日前と３日前に、最高の血清反応性を示していたマウスを１２μｇのＧＰＩＩ
ｂ／ＩＩＩａと１００ｎＭの化合物Ａとの混合物の生理食塩水希釈溶液を静脈内
注入することにより免疫テストした。
【０１７４】 追加免疫マウスを屠殺して脾臓を摘出し、ケーラーおよびミルステインの方法
（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．，ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．Ｎａｔｕｒｅ ２５６
，４９５，１９７５）の変法を用いて体細胞融合を実施した。３．２×１０8個 の脾細胞を６．４×１０7個の非分泌性マウス骨髄腫ＮＳＯと（それぞれ５：１ の比で）５０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール１５００中で融合した。細胞
を、１５％ウシ胎仔血清、１０ユニット／ｍＬの粗ＩＬ−６、２ｍＭのＬグルタ
ミン、１００ＵＩ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、１
０-8Ｍヒポキサンチン、４×１０-5Ｍアミノプテリン、および１．６×１０-3チ
ミジンを補足したＩｓｃｏｖの培地で作ったＨＡＴ５０ｍＬに再懸濁した。希釈
した細胞を５つの９６穴組織培養プレートに播種し、３７℃でインキュベートし
た。細胞を融合後３日および５日間培養した。融合の約７〜１０日後、ハイブリ
ドーマの増殖を示す培養上清をＥＬＩＳＡによってＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに対す
る抗体またはＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ：化合物Ａ複合体についてスクリーニングし
た（下記参照）。
【０１７５】 ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ：化合物Ａ複合体特異的抗体を産生するクローンを、単
細胞ソーターを用いて再クローニングし、マウス支持細胞（ｆｅｅｄｅｒ ｃｅ
ｌｌｓ）（腹膜マクロファージ）でコーティングした９６穴組織培養プレートに
播種した。４〜５日以内にサブクローンが現れ始め、これを下記のＥＬＩＳＡ法
によって再スクリーニングした。単細胞クローンをＴ−５００フラスコ中で増殖
させることによって抗体上清のスケールアップを実施した。抗体サブクラスをＩ
ｓｏｔｙｐｅ Ａｂ−Ｓｔａｔキット（ＳａｎｇＳｔａｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃ
ｏｒｐ．、カリフォルニア州メンローパーク）を用いて調べた（図１０）。 ＥＬＩＳＡスクリーニング（酵素結合免疫吸着定量法）： モノクローナル抗体上清を、９６穴マイクロタイタープレートに吸着したＧＰ
ＩＩｂ／ＩＩＩａ：化合物Ａ複合体への結合についてスクリーニングした。１つ
のＥＬＩＳＡでは、プレートをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．８）中０
．５μｇ／ｍＬのＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａでコーティングした。別のＥＬＩＳＡで
は、プレートをＰＢＳ（ｐＨ７．８）中０．５μｇ／ｍＬのＧＰＩＩｂ／ＩＩＩ
ａプラス化合物Ａ化合物（最終濃度１００ｎＭ）でコーティングした。プレート
を４℃で一晩インキュベートし、各ウェルにつき３００μＬのＰＢＳで３回洗浄
した。ウェルを２００μＬの２％ｂｌｏｔｔｏ（粉乳）により室温で１時間ブロ
ックし、次いで３００μＬのＰＢＳで３回洗浄した。希釈していないハイブリド
ーマ上清（７５μＬ）を各ウェルに加え、室温で２時間インキュベートした。す
べての上清をＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａおよびＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ：化合物Ａ複合
体でコーティングしたプレート上でスクリーニングした。ウェルをＰＢＳ／０．
２％Ｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）でさらに３回洗浄
し、次いでセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ
ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ、メリーランド州ゲイサースバーグ）と結合したヤギ抗マ
ウスＩｇＧの１：３０００希釈液（ＰＢＳ）１００μＬと共に室温で１時間イン
キュベートした。プレートをＰＢＳ／０．２％Ｔｗｅｅｎ２０で６回洗浄し、１
００μＬ／ウェルのＡＢＴＳ（Ｐｉｅｒｃｅ）を加えることによって酵素活性を
生じさせた。室温で５分間インキュベートした後、４０５ｎｍで吸光度を測定し
た。複合体を形成していないＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに比べてＧＰＩＩｂ／ＩＩＩ
ａ：化合物Ａ複合体でコーティングしたプレート上で少なくとも２倍の吸光度を
示す上清を増やし、再分析した。
【０１７６】 （実施例２０） ＤＤＡＢ ＪＫ０９４のクローニング ＪＫ０９４可変領域のＲＮＡ単離とｃＤＮＡ調製： 全ＲＮＡをＪＫ０９４ハイブリドーマ細胞（約１０8細胞）からグアニジンイ ソチオシアネート抽出法を用いて単離した。ＪＫ０９４ ＲＮＡの５’末端を、
５’ Ｒａｃｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉ
ｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ、バージョン２．０（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、メリ
ーランド州ゲイサースバーグ）を製造者の指示に従って用いて増幅した。マウス
ガンマ１特異的プライマー（５’ ＡＧＧ ＣＡＴ ＣＣＣ ＡＧＧ ＧＴＣ
ＡＣＣ ＡＴ ３’）またはマウスカッパ特異的プライマー（５’ ＡＡＧ Ｃ
ＡＣ ＡＣＧ ＡＣＴ ＧＡＧ ＧＣＡ ＣＣ ３’）２．５ｐｍｏｌを０．５
μｇの全ＲＮＡにアニールさせた。２５μＬのプライマー、ＲＮＡ、および２０
０単位のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素を４２℃で５０分間インキュ
ベートした後、７０℃で１５分間インキュベートすることによって、逆転写を実
施した。元のＲＮＡの鋳型はリボヌクレアーゼＨおよびリボヌクレアーゼＴ１で
処理することによって分解した。ホモポリマーテイル（ｄＣＴＰ）をｃＤＮＡの
３’末端にターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼを用いて付加し
た。ｄＣテイルのｃＤＮＡを、マウスガンマ１用の第２の遺伝子特異的プライマ
ー（５’ ＡＣＡ ＧＡＴ ＧＧＧ ＧＧＴ ＧＴＣ ＧＴＴ ＴＴＧ ３’）
またはマウスカッパ用の第２の遺伝子特異的プライマー（５’ ＴＧＧ ＧＡＡ
ＧＡＴ ＧＧＡ ＴＡＣ ＡＧＴ ＴＧＧ ３’）を、もう一つの短縮アンカ
ープライマー（５’ ＧＧＣ ＣＡＣ ＧＣＧ ＴＣＧ ＡＣＴ ＡＧＴ ＡＣ
Ｇ ＧＧＩ ＩＧＧ ＧＩＩ ＧＧＧ ＩＩＧ ３’）と共に用いて増幅した。
９４℃で２分間の活性化に続き、９４℃で１分間、５５℃で１分間、および７２
℃で２分間からなる３工程サイクル３５回によってＰＣＲを実施した。最後の伸
長は７２℃で１０分間行った。増幅産物をゲル精製し、標準的方法を用いてｐＣ
Ｒ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）
中にサブクローニングした。クローニング産物を塩基配列決定によって確認した
。 ヒト定常領域の単離と特徴： ヒトガンマ４定常領域をヒト白血球ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォル
ニア州パロアルト）から、プライマー５８（５’ ＧＣＴ ＴＣＣ ＡＣＣ Ａ
ＡＧ ＧＧＣ ＣＣＡ ３’）およびプライマー５９（５’ ＧＡＴ ＣＧＡ
ＡＴＴ ＣＴＴ ＡＴＴ ＡＴＴ ＴＡＣ ＣＣＡ ＧＡＧ ＡＣＡ ＧＧＧ
ＡＧＡ ３’）を用いて増幅した。ヒトカッパ定常領域も同様にプライマー５４
（５’ ＧＧＣ ＡＣＣ ＡＡＧ ＣＴＧ ＧＡＡ ＡＴＣ ＡＡＡ ＡＣＴ
ＧＴＧ ＧＣＴ ＧＣＡ ＣＣＡ ＴＣＴ ＧＴ ３’）およびプライマー５５
（５’ ＧＡＴ ＣＧＣ ＡＴＧ ＣＴＴ ＡＴＴ ＡＡＣ ＡＣＴ ＣＴＣ
ＣＣＣ ＴＧＴ ＴＧＡ ３’）を用いて増幅した。増幅したフラグメントをゲ
ル精製し、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローニングし、塩基配列決定した。 可変領域および定常領域のＰＣＲ組換え： 増幅したマウス可変領域およびヒト定常領域を、ＰＣＲ組換えに必要な末端を
生成するプライマーと共に再増幅した。ＪＫ０９４重鎖および軽鎖可変領域を、
それぞれプライマー９４−３（５’ ＧＡＴ ＣＧＴ ＣＧＡ ＣＴＡ ＴＡＡ
ＡＴＡ ＴＧＡ ＡＡＧ ＴＧＴ ＴＧＡ ＧＴＣ ３’）、９４−５（５’
ＴＧＧ ＧＣＣ ＣＣＴ ＧＧＴ ＧＧＡ ＡＧＣ ＴＧＣ ＡＧＡ ＧＡＣ
ＡＧＴ ＧＡＣ ＣＡＧ Ａ ３’）、およびプライマー９４−１（５’ Ｇ
ＡＴ ＣＣＴ ＣＧＡ ＧＴＡ ＴＡＡ ＡＴＡ ＴＧＡ ＧＴＧ ＴＧＣ Ｃ
ＣＡ ＣＴＣ ＡＧＧ ＴＣ ３’）、９４−６（５’ ＴＴＴ ＣＡＧ ＣＴ
Ｃ ＣＡＧ ＣＴＴ ＧＧＴ ＣＣＣ ３’）を用いて再増幅した。ヒトガンマ
４およびカッパ定常領域を、それぞれプライマー５８（上記参照）およびプライ
マー９４−４（５’ ＧＡＴ ＣＴＣ ＴＡＧ ＡＴＴ ＡＴＴ ＡＴＴ ＴＡ
Ｃ ＣＣＡ ＧＡＧ ＡＣＡ ＧＧＧ ＡＧＡ ３’）、またはプライマー５５
（上記参照）およびプライマー９４−２（５’ ＧＧＧ ＡＣＣ ＡＡＧ ＣＴ
Ｇ ＧＡＧ ＣＴＧ ＡＡＡ ＡＣＴ ＧＴＧ ＧＣＴ ＧＣＡ ＣＣＡ ＴＣ
Ｔ ＧＴ ３’）を用いて再増幅した。増幅したフラグメントはすべてゲル精製
した。ＪＫ０９４重鎖可変領域およびヒトガンマ４フラグメントをプールし、プ
ライマー９４−３およびプライマー９４−４を用いて再増幅した。ＪＫ０９４軽
鎖可変領域およびヒトカッパフラグメントをプールし、プライマー９４−１およ
びプライマー５５を用いて再増幅した。得られたキメラ重鎖および軽鎖遺伝子を
ゲル精製し、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローニングしてｐＪＨ−３およびｐＪ
Ｈ−４を生成した。それぞれの完全キメラ遺伝子を塩基配列決定によって確認し
た。
【０１７７】 （実施例２１） バキュロウイルス感染昆虫細胞による組換えＪＫ０９４の産生 ＢａｃｍｉｄドナーベクターｐＪＨ−２の構築： ＢａｃｍｉｄドナープラスミドｐＪＨ２を下記のとおりｐＪＨ−３およびｐＪ
Ｈ−４から構築した。ｐＪＨ３からの１．４ｋｂのＳａｌＩ／ＸｂａＩフラグメ
ントを、ｐＦａｓｔＢａｃ Ｄｕａｌ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）のマルチクローニ
ング部位Ｉ内に位置するＳａｌＩおよびＸｂａＩ部位にクローニングし、ｒ−Ｊ
Ｋ０９４重鎖をコードする配列をバキュロウイルスポリヘドリン（ｐｏｌｙｈｅ
ｄｒｉｎ）プロモーター（ｐＰｏｌｈ）の制御下においた。同様に、ｐＪＨ４か
らの０．７ｋｂのＸｈｏＩ／ＳｐｈＩフラグメントをｐＦａｓｔＢａｃ Ｄｕａ
ｌのマルチクローニング部位ＩＩ内に位置するＸｈｏＩ／ＳｐｈＩ部位にクロー
ニングし、ｒ−ＪＫ０９４軽鎖をコードする配列をバキュロウイルスプロモータ
ーｐ１０の制御下においた（図１１）。 バキュロウイルス感染昆虫細胞によるｒＪＫ０９４抗体の産生： ｒ−ＪＫ０９４の重鎖および軽鎖に対する配列を含む組換えバキュロウイルス
を、ｂａｃｍｉｄに基づく組換え法（Ｌｕｃｋｏｗ，Ｖ．Ａ，Ｌｅｅ，Ｓ．Ｃ．
，Ｂａｒｒｙ，Ｇ．Ｆ．，ａｎｄ Ｏｌｉｎｓ，Ｐ．Ｏ．（１９９３）Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｌｏｇｙ，６７，４５６６．）を用いて単離した。簡単に
言うと、５ｎｇのｐＪＨ２を大腸菌ＤＨ１０Ｂａｃ株（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）に
転移させ、ゲンタマイシンおよびＸ−ｇａｌを含むＬＢプレートで培養した。白
色の抗生物質耐性コロニーを選択し、ＬＢに適当な抗生物質を加えた中で一晩培
養した。組換えｂａｃｍｉｄ ＤＮＡを、アルカリ性ＳＤＳ溶解法の変法を用い
て単離し、精製したＤＮＡを脂質に基づくプロトコル（ＣｅｌｌＦＥＣＴＩＮ、
Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を用いて昆虫細胞にトランスフェクトし、この細胞を２７
℃で７２時間インキュベートした。得られた組換えウイルスを細胞培養基から回
収し、４℃で保存した。ウイルスの増幅を、１Ｌのフラスコ中、２ｍＭのＬ−グ
ルタミンおよび５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシン（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を補足
したＳＦ９００−ＩＩ培地（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）５００ｍＬに、５×１０8個 のＳＦ２１−ＡＥ細胞を最終密度１×１０6細胞／ｍＬとなるように接種して実 施した。培養物を１０8ウイルス粒子を含む組換えウイルス１ｍＬで感染させ（ すなわち、感染多重度（ＭＯＩ）＝約０．１）、９０ＲＰＭで常時撹拌しながら
２７℃で３日間インキュベートした。細胞密度および生存率（％）を毎日調べた
。３０００ＲＰＭで５分間遠心分離して細胞および細片を除去することにより、
ウイルスを回収した。細胞外ウイルスを含む澄明な培地を、光を排除するために
アルミフォイルで包み、無菌条件下、４℃で保存した。増幅後１年まで保存液を
使用した。ウイルス保存液は、ＡＴＧ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（
ミネソタ州エデンプレーリー）がプラークアッセイを用いて滴定した。
【０１７８】 Ｔ．ｎｉ（ＴＮ−５Ｂ１−４）細胞を用いて下記のとおりｒＪＫ０９４を産生
した。５００ｍＬの細胞を、１Ｌの撹拌フラスコで、２ｍＭのＬ−グルタミンお
よび５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを補足したＥＣ４０５培地（ＪＲＨ Ｓｃ
ｉｅｎｔｉｆｉｃ）中、細胞密度約２×１０6細胞／ｍＬで培養した。２５〜５ ０ｍＬのｒＪＫ０９４標準ウイルス保存液（滴定値約１×１０8ＰＦＵ／ｍＬ） を用いて、細胞をＭＯＩ約５で感染させた。フラスコを９０ＲＰＭで常時撹拌し
ながら２７℃で７２時間インキュベートし、細胞密度および生存率を毎日モニタ
ーした。培養物から試料１ｍＬを取り出して、ｒＪＫ０９４の産生を毎日モニタ
ーした。細胞を遠心分離にかけてペレット状にし、澄明な培地に氷冷１００％ア
セトン２ｍＬを加えて−２０℃で２４時間放置し、蛋白質を沈殿させることによ
って回収した。沈殿した蛋白質を遠心分離にかけて回収し、試料をＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いて試験した。沈殿した
上清蛋白質のウェスタンブロッティングによって、正しい組換えキメラ蛋白質の
産生が確認された。蛋白質試料を、標準的方法を用いて１０％ポリアクリルアミ
ドゲル上で泳動させ、ＰＶＤＦメンブレン（ＮＥＮ、マサチューセッツ州ビルリ
カ）にトランスファーした。ブロットを、トリス緩衝食塩水（ＴＢＳ；１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中、５％脱脂粉乳を
用いて室温で１時間ブロックした。アルカリ性ホスファターゼ（Ｊａｃｋｓｏｎ
Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ、ペンシルバニア州ウェストグロー
ブ）に結合した抗ヒト重鎖および軽鎖抗体を用いて、キメラ抗体の２つの鎖を検
出した。抗ヒトＩｇＧ抗体を１％脱脂粉乳／ＴＢＳで１：１０００に希釈した。
抗体希釈液をブロットと共に室温で１時間インキュベートした。ブロットをＴＢ
Ｓ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。ｒＪＫ０９４の重鎖および軽鎖の
バンドを、アルカリ性ホスファターゼ基質、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（Ｋｉｒｋｅｇａ
ａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、メリーランド州ゲイ
サースバーグ）を製造者の指示に従って用いて可視化した。
【０１７９】 感染の７２時間後にＴ．ｎｉ細胞を遠心分離によって回収し、澄明な培地を精
製まで４℃で保存した。
【０１８０】 （実施例２２） ｒＪＫ０９４の精製および特徴 ＲＪＫ０９４を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ
Ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を用いて
精製した。充填された約１０ｍＬの樹脂を５０ｍＬの０．１Ｎ グリシン（ｐＨ
２．５）で２回洗浄した。樹脂を５０ｍＬのＰｉｅｒｃｅ Ｉｍｍｕｎｏｐｕｒ
ｅ（Ｇ）ＩｇＧ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロ
ックフォード）で洗浄することにより中和した。約２５０ｍＬの昆虫細胞上清を
カラムに流速２．０ｍＬ／分でのせた。同じ流速で、カラムを５０ｍＬのＰｉｅ
ｒｃｅ Ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｅ（Ｇ）ＩｇＧ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒで
洗浄した。結合したｒＪＫ０９４を、Ｐｉｅｒｃｅ Ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｅ Ｉ
ｇＧ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒで、流速１ｍＬ／分で溶出した。分画（０
．５ｍＬ）を、適当な体積の１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ無調整、２０〜３０μＬ）を
含むチューブに集めて、分画のｐＨを約７．５とした。各分画の吸光度をＡ280 でモニターし、ｒＪＫ０９４を含む分画を同定した。ｒＪＫ０９４を含む分画を
合わせ、Ｓｌｉｄｅａｌｙｚｅｒ Ｄｉａｌｙｓｉｓカセット（１０，０００Ｍ
ＷＣＯ）（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード）を用い、４℃で、５００
ｍＬのＰＢＳ（ｗ／ｏｕｔ Ｃａ+2、Ｍｇ+2）に対し２回透析した。合わせて透
析した分画の抗体濃度を、０．４５μｍのフィルターを通した後、２８０ｎｍの
吸光度を測定することによって求めた。抗体濃度は、Ａ280 1.0＝０．８ｇ／ｍＬ
の相関を用いて計算した。
【０１８１】 ｒＪＫ０９４のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ：化合物Ａ複合体に対する薬物依存性結
合を、下記のとおりＥＬＩＳＡで確認した。ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ（別に記載の
とおりに調製）を、１ｍＭ Ｃａ2+および１ｍＭ Ｍｇ2+を含むＰＢＳで、２．
５μｇ／ｍＬに希釈した。希釈した受容体９０μＬを、Ｃｏｓｔａｒ ９６穴ウ
ェルＥＬＩＳＡプレートにコーティングした。ウェルの半分に１０μＬのＨ2Ｏ を加え、残りのウェルに１０μＬの１ｕＭ化合物Ａを加えて、最終薬物濃度を１
００ｎＭとした。プレートを加湿チャンバー内、４℃で一晩インキュベートした
。受容体溶液を除去し、ウェルを１ｍＭ Ｃａ2+、１ｍＭ Ｍｇ2+、および０．
０５％Ｔｗｅｅｎ２０含むＰＢＳ中、２００μＬの０．１％ＢＬＯＴＴＯ、１％
健常ヤギ血清で、室温で振盪しながら１時間ブロックした。
【０１８２】 ＰＢＳ、１ｍＭ Ｃａ2+、１ｍＭ Ｍｇ2+、０．１％ＢＬＯＴＴＯ、０．０５
％Ｔｗｅｅｎ２０での連続希釈によって、約２μｇ／ｍＬ〜約５μｇ／ｍＬの範
囲のｒＪＫ０９４希釈液を調製した。ブロック溶液をプレートから除去し、ウェ
ルを２００μＬのＰＢＳ、１ｍＭ Ｃａ2+、１ｍＭ Ｍｇ2+、０．０５％Ｔｗｅ
ｅｎ２０で３回洗浄した。ｒＪＫ０９４の適当な希釈液９０μＬを、ＧＰＩＩｂ
／ＩＩＩａ単独でコーティングした３つのウェルと、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ＋化
合物Ａでコーティングした３つのウェルに加えた。受容体単独でコーティングし
たウェルには１０μＬのＨ2Ｏを加えたのに対し、受容体：薬物複合体でコーテ ィングしたウェルには、１０μＬの１μＭ化合物Ａを加えた。プレートを室温で
振盪しながら１時間インキュベートした。次いでウェルを２００μＬのＰＢＳ／
Ｔｗｅｅｎでさらに３回洗浄した。ＰＢＳ／１％ＢＬＯＴＴＯ／０．５％Ｔｗｅ
ｅｎ２０で１：８０００に希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ ＨＲＰ結合体（Ｋｉｒｋ
ｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ、メリーランド州ゲイサースバーグ）１００
μＬを各ウェルに加え、プレートを室温で振盪しながらさらに１時間インキュベ
ートした。ウェルを２００μＬのＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で最後に３
回洗浄し、１００μＬのＴＭＢ（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード）を
加えて、製造者に指示に従って顕色させた。ＴＭＢ添加直後から１５秒ごとに５
分間、室温で６５５ｎｍの吸光度をモニターした。薬物存在下と非存在下両方で
の顕色率を、ｒＪＫ０９４濃度の関数としてプロットした（図１２）。ｒＪＫ０
９４結合のＤＤＡＢ成分を計算するために、化合物Ａ非存在下での測定値を薬物
存在下での値から差し引いた。
【０１８３】 （実施例２３） 化合物Ａによる血小板減少症患者０９９０１６のＤＤＡＢの血小板上への特異的
分布と回収 ＤＤＡＢを枯渇するために、血小板減少症患者０９９０１６の血漿を化合物Ａ
の存在下または非存在下で血小板により処理した。０９９０１６血漿を化合物Ａ
の存在下または非存在下で血小板で処理した後、試料を３つの希釈率（１／１０
０、１／２５０および１／５００）で残存ＤＤＡＢについてＤＤＡＢ ＥＬＩＳ
Ａで評価した（図１３）。ネズミＪＫ０９４をＥＬＩＳＡの陽性対照として用い
た。０９９０１６血漿のドナー血小板による処理では検出可能なＤＤＡＢの損失
は認められなかったが、化合物Ａの存在下でのドナー血小板による処理ではＤＤ
ＡＢが特異的に枯渇した。このことはこの抗血小板抗体の薬物特異的な性質を示
している。化合物Ａなしで０９９０１６血漿により処理した血小板からのＥＤＴ
Ａ溶出液のＥＬＩＳＡ分析ではＤＤＡＢは全く認められなかったが、化合物Ａの
存在下で０９９０１６血漿により処理した血小板からのＥＤＴＡ溶出液にはＤＤ
ＡＢが認められた（図１３）。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
本発明の好ましい実施形態を例示および説明のために選んで記載したが、本発
明の範囲を限定するものではない。本発明のいくつかの態様の好ましい実施形態
を、下記の添付の図に示す。
【図１Ａ】 ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ ＥＬＩＳＡを用いた患者におけるＧＰＩＩｂ／ＩＩＩ
ａ ＤＤＡＢの検出を示す図である。
【図１Ｂ】 ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ ＥＬＩＳＡを用いた患者におけるＧＰＩＩｂ／ＩＩＩ
ａ ＤＤＡＢの検出を示す図である。
【図２】 固相ＥＬＩＳＡにおけるＤＤＡＢ結合の特異性を示す図である。
【図３】 血小板減少症の症状発現中の患者におけるＤＤＡＢ価の増大を示す図である。
【図４】 血小板減少症の症状を発現中の患者におけるＤＤＡＢ価を示す図である。
【図５】 ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに対するＤＤＡＢがＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニス
ト存在下で血小板表面に分布することを示す図である。
【図６】 ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに対するＤＤＡＢは、ＥＤＴＡによる処理によって血小
板表面から回収することができるが、血清調製物によって回収することはできな
いことを示す図である。
【図７】 血小板減少症患者からのＤＤＡＢを、ＥＤＴＡ処理によって血小板表面から回
収することができることを示す図である。
【図８】 血小板をあまり含まない血漿からの遊離ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト
の除去を示す図である。
【図９】 トロンビン受容体活性化ペプチドによる処理によるＤＤＡＢの内部移行および
回収を示す図である。
【図１０】 ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ：薬物ハイブリドーマのＥＬＩＳＡによる特徴付けを示
す図である。
【図１１】 ｒＪＫ０９４発現のための組換えウイルスを作製するために用いるバキュロウ
イルス伝達ベクター（ｐＪＨ２）の地図を示す図である。
【図１２】 ｒＪＫ０９４（黒丸）およびネズミＪＫ０９４（黒四角）のＧＰＩＩｂ／ＩＩ
Ｉａ：薬物複合体に対する結合の濃度依存性を示す図である。
【図１３】 化合物Ａによる血小板減少症患者０９９０１６のＤＤＡＢの血小板上への特異
的分布と回収を示す図である。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年３月３日（２０００．３．３）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項２６
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項４８
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項５２
【補正方法】変更
【補正内容】
【請求項５２】 前記特定の既知の抗原がＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ：２（Ｓ）
−［（ｎ−ブトキシカルボニル）アミノ］−３−［［［３−［４−（アミノイミ
ノメチル）フェニル］イソキサゾリン−５（Ｒ）−イル］メチルカルボニル］ア
ミノ］プロピオン酸またはそのメチルエステル複合体であることを特徴とする請
求項５０または請求項５１のいずれか１項に記載のベクター。
【手続補正書】
【提出日】平成１２年８月１６日（２０００．８．１６）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項２５
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 1/28 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＵ ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＪＰ， ＫＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＵＡ，ＶＮ (72)発明者 ビルハイマー ジェフリー ティー． アメリカ合衆国 19382 ペンシルベニア 州 ウェスト チェスター イースト ラ ファイエット ドライブ 580 (72)発明者 ブレス リー エイ． アメリカ合衆国 19713 デラウェア州 ニューアーク デンプセイ ドライブ 23 (72)発明者 バーン ティモシー シー． アメリカ合衆国 19707 デラウェア州 ホッケシン マリアン コート 212 (72)発明者 ディッカー イラ ビー． アメリカ合衆国 19810 デラウェア州 ウィルミントン ジェフリー ロード 1016 (72)発明者 ジョージ ヘンリー ジェイ． アメリカ合衆国 19711 デラウェア州 ニューアーク グラハム コート 12 (72)発明者 ホーリス ジーニン エム． アメリカ合衆国 19803 デラウェア州 ウィルミントン エッジウッド ロード 108 (72)発明者 ホーリス グレゴリー エフ． アメリカ合衆国 19803 デラウェア州 ウィルミントン エッジウッド ロード 108 (72)発明者 コーチー ジェニファー イー． アメリカ合衆国 19707 デラウェア州 ホッケシン パークリッジ ドライブ 606 (72)発明者 オニール カルン ティー． アメリカ合衆国 19348 ペンシルベニア 州 ケネット スクエア カークブラエ ロード 222 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA61 CA04 CA11 DA02 DA06 EA04 FA02 GA11 GA18 GA19 HA15 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ03 QQ79 QQ96 QR02 QR48 QR51 QR55 QR66 QS10 QS12 QS35 QS36 QX01 4B065 AA26X AA90X AA94Y AA95X AB01 BA02 CA24 CA46 4H045 AA11 AA20 AA30 BA41 CA42 DA75 DA76 EA50 FA72 FA74 GA15 GA26

Claims (56)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 対象においてインテグリンアンタゴニスト／アゴニストと結
    合したインテグリンを認識する抗体を検出するための方法であって、 （ａ）インテグリンとインテグリンアンタゴニスト／アゴニストとの間で複合
    体を形成する工程と、 （ｂ）前記複合体を抗体供給源と共にインキュベートする工程と、 （ｃ）結合する前記抗体を検出する工程と、 を含むことを特徴とする方法。
  2. 【請求項２】 ＤＤＡＢの生成または増加を検出する方法であって、 （ａ）請求項１記載の方法を用いて対象からの生物試料をアッセイする工程と
    、 （ｂ）前記対象にインテグリンアンタゴニスト／アゴニストを投与する工程と
    、 （ｃ）請求項１記載の方法を用いて前記対象からの第２の生物試料をアッセイ
    する工程と、 （ｄ）（ａ）の結果を（ｃ）の結果と比較する工程と、 を含むことを特徴とする方法。
  3. 【請求項３】 前記インテグリンアンタゴニスト／アゴニストがＧＰＩＩｂ
    ／ＩＩＩａを対象とすることを特徴とする請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】 対象においてインテグリンアンタゴニスト／アゴニストと結
    合したインテグリンを認識する抗体を検出する方法であって、 （ａ）前記インテグリンを固体支持体上に固定化して固定化インテグリンを形
    成する工程と、 （ｂ）工程（ａ）の固定化インテグリンを１つまたは複数の選択されたインテ
    グリンアンタゴニスト／アゴニストと共にインキュベートして、前記固定化イン
    テグリンと該選択されたインテグリンアンタゴニスト／アゴニストとの間で複合
    体を形成する工程と、 （ｃ）前の工程の固定化物質を対象からの抗体を含む生物試料と共にインキュ
    ベートして、複合体を形成する工程と、 （ｄ）前の工程の固定化物質を標識二次抗ヒト抗体と共にインキュベートして
    、複合体を形成する工程とを含み、 この場合において、工程（ａ）と工程（ｂ）を組み合わせることができ、また
    は工程（ｂ）と工程（ｃ）を組み合わせることができる、 ことを特徴とする方法。
  5. 【請求項５】 前記インテグリンがＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａであることを特徴
    とする請求項４記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記工程（ｂ）の選択されたインテグリンアンタゴニストが
    、次の化合物： ２（Ｓ）−［（ｎ−ブトキシカルボニル）アミノ］−３−［［［３−［４−（
    アミノイミノメチル）フェニル］イソオキサゾリン−５（Ｒ）−イル］メチルカ
    ルボニル］アミノ］プロピオン酸； ２（Ｓ）−［［（３，５−ジメチルイソオキサゾル−４−イル）スルホニル］
    アミノ］−３−［［［３−［４−（アミノイミノメチル）フェニル］イソオキサ
    ゾリン−５（Ｒ）−イル］メチルカルボニル］アミノ］プロピオン酸； ２（Ｓ）−［（４−メチルフェニルスルホニル）アミノ］−３−［［［５，６
    ，７，８−テトラヒドロ−４−オキソ−５−［２−（ピペリジン−４−イル）エ
    チル］−４Ｈ−ピラゾロ−［１，５−ａ］［１，４］ジアゼピン−２−イル］カ
    ルボニル］アミノ］プロピオン酸；および ５−［２−（ピペリジン−４−イル）エチル］チエノ［２，３−ｂ］チオフェ
    ン−２−Ｎ−（３−２（Ｓ）−（３−ピリジニルスルホニルアミノ）プロピオン
    酸］カルボキサミド、 またはその活性代謝体の１つまたは複数から選択されることを特徴とする請求
    項４記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記標識二次抗ヒト抗体が酵素と結合した抗ヒト抗体または
    蛍光標識と結合した抗ヒト抗体であることを特徴とする請求項４記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記酵素がセイヨウワサビペルオキシダーゼであることを特
    徴とする請求項４記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記蛍光標識がフルオレセインまたはその誘導体であること
    を特徴とする請求項４記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記固体支持体がマイクロウェルプレートのウェルである
    ことを特徴とする請求項４記載の方法。
  11. 【請求項１１】 抗体を含む前記生物試料が前記対象から得た血漿であるこ
    とを特徴とする請求項４記載の方法。
  12. 【請求項１２】 固定化する前に、前記インテグリンは精製され、実質的に
    非インテグリン成分を含まないことを特徴とする請求項４記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記インテグリンが組換えインテグリン、変異インテグリ
    ン、インテグリン断片、またはインテグリン由来の天然、組換え、もしくは合成
    ポリペプチドであることを特徴とする請求項４記載の方法。
  14. 【請求項１４】 インテグリンアンタゴニスト／アゴニストによる治療後に
    、血小板減少症／血栓塞栓症の疾患状態を発症するリスクが高い対象を同定する
    ための方法であって、 （ａ）前記インテグリンを固体支持体に固定化して固定化インテグリンを形成
    する工程と、 （ｂ）前の工程の固定化物質を１つまたは複数の選択されたインテグリンアン
    タゴニスト／アゴニストと共にインキュベートして、前記固定化インテグリンと
    該選択されたインテグリンアンタゴニスト／アゴニストとの間で複合体を形成す
    る工程と、 （ｃ）前の工程の固定化物質を前記対象からの抗体を含む試料と共にインキュ
    ベートして、複合体を形成する工程と、 （ｄ）前の工程の物質を標識二次抗ヒト抗体と共にインキュベートして、複合
    体を形成する工程と、 （ｅ）工程（ｄ）の固定化インテグリン：インテグリンアンタゴニスト／アゴ
    ニスト：抗体：標識二次抗ヒト抗体複合体の生成量を、標識二次抗ヒト抗体の標
    識の検出によって測定する工程と、 （ｆ）工程（ｄ）の固定化インテグリン：インテグリンアンタゴニスト／アゴ
    ニスト：抗体：標識二次抗ヒト抗体複合体の生成量を、工程（ａ）、（ｃ）、（
    ｄ）および（ｅ）を実施して工程（ｂ）を省略した場合に生成される複合体の量
    と比較する工程とを含み、 この場合において、工程（ａ）と工程（ｂ）を組み合わせることができ、また
    は工程（ｂ）と工程（ｃ）を組み合わせることができる、 ことを特徴とする方法。
  15. 【請求項１５】 抗体を含む前記生物試料を前記対象から得て、前記方法を
    インテグリンアンタゴニスト／アゴニストによる対象の治療前に実施することを
    特徴とする請求項１４記載の方法。
  16. 【請求項１６】 抗体を含む前記生物試料を前記対象から得て、前記方法を
    インテグリンアンタゴニスト／アゴニストによる対象の治療と同時に実施するこ
    とを特徴とする請求項１４記載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記工程（ｂ）の選択されたインテグリンアンタゴニスト
    ／アゴニストが、前記対象を治療するために用いられる前記インテグリンアンタ
    ゴニスト／アゴニストの活性体または活性代謝物を含むことを特徴とする請求項
    １４記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記工程（ｂ）の選択されたインテグリンアンタゴニスト
    ／アゴニストが、次の化合物： ２（Ｓ）−［（ｎ−ブトキシカルボニル）アミノ］−３−［［［３−［４−（
    アミノイミノメチル）フェニル］イソオキサゾリン−５（Ｒ）−イル］メチルカ
    ルボニル］アミノ］プロピオン酸； ２（Ｓ）−［［（３，５−ジメチルイソオキサゾル−４−イル）スルホニル］
    アミノ］−３−［［［３−［４−（アミノイミノメチル）フェニル］イソオキサ
    ゾリン−５（Ｒ）−イル］メチルカルボニル］アミノ］プロピオン酸； ２（Ｓ）−［（４−メチルフェニルスルホニル）アミノ］−３−［［［５，６
    ，７，８−テトラヒドロ−４−オキソ−５−［２−（ピペリジン−４−イル）エ
    チル］−４Ｈ−ピラゾロ−［１，５−ａ］［１，４］ジアゼピン−２−イル］カ
    ルボニル］アミノ］プロピオン酸； および ５−［２−（ピペリジン−４−イル）エチル］チエノ［２，３−ｂ］チオフェ
    ン−２−Ｎ−（３−２（Ｓ）−（３−ピリジニルスルホニルアミノ）プロピオン
    酸］カルボキサミド、 またはその活性代謝体の１つまたは複数から選択されることを特徴とする請求項
    １４記載の方法。
  19. 【請求項１９】 副作用を生じる可能性がより低い治療を同定するために、
    インテグリンアンタゴニスト／アゴニスト治療の前または治療中においてＤＤＡ
    Ｂの生成または増加を検出することを特徴とする請求項１記載の方法。
  20. 【請求項２０】 前記対象が次の化合物： ２（Ｓ）−［（ｎ−ブトキシカルボニル）アミノ］−３−［［［３−［４−（
    アミノイミノメチル）フェニル］イソオキサゾリン−５（Ｒ）−イル］メチルカ
    ルボニル］アミノ］プロピオン酸またはそのメチルエステル； ２（Ｓ）−［［（３，５−ジメチルイソオキサゾル−４−イル）スルホニル］
    アミノ］−３−［［［３−［４−（アミノイミノメチル）フェニル］イソオキサ
    ゾリン−５（Ｒ）−イル］メチルカルボニル］アミノ］プロピオン酸； ２（Ｓ）−［（４−メチルフェニルスルホニル）アミノ］−３−［［［５，６
    ，７，８−テトラヒドロ−４−オキソ−５−［２−（ピペリジン−４−イル）エ
    チル］−４Ｈ−ピラゾロ−［１，５−ａ］［１，４］ジアゼピン−２−イル］カ
    ルボニル］アミノ］プロピオン酸；および ５−［２−（ピペリジン−４−イル）エチル］チエノ［２，３−ｂ］チオフェ
    ン−２−Ｎ−（３−２（Ｓ）−（３−ピリジニルスルホニルアミノ）プロピオン
    酸］カルボキサミド の１つまたは複数から選択されるインテグリンアンタゴニストによって治療され
    ることを特徴とする請求項１９記載の方法。
  21. 【請求項２１】 固体支持体に固定化された精製インテグリンと、少なくと
    も１つの選択されたインテグリンアンタゴニスト／アゴニストと、陽性対照と、
    標識二次抗ヒト抗体と、を含むことを特徴とする、診断用イムノアッセイキット
    。
  22. 【請求項２２】 インテグリンアンタゴニスト／アゴニストに結合したイン
    テグリンを認識する対象中の抗体によって認識されるエピトープの生成を、選択
    されたインテグリンアンタゴニスト／アゴニストが強めるかどうかを調べる方法
    であって、 （ａ）前記インテグリンを固体支持体に固定化して固定化インテグリンを形成
    する工程と、 （ｂ）工程（ａ）の固定化インテグリンを選択されたインテグリンアンタゴニ
    スト／アゴニストと共にインキュベートして、前記固定化インテグリンと該選択
    されたインテグリンアンタゴニスト／アゴニストとの間で複合体を形成する工程
    と、 （ｃ）前の工程の固定化物質を対象からの抗体を含む試料と共にインキュベー
    トして、複合体を形成する工程と、 （ｄ）前の工程の物質を標識二次抗ヒト抗体と共にインキュベートして、複合
    体を形成することとを含み、 この場合において、工程（ａ）と工程（ｂ）を組み合わせることができ、また
    は工程（ｂ）と工程（ｃ）を組み合わせることができる、 ことを特徴とする方法。
  23. 【請求項２３】 対象においてインテグリンを認識する抗体を検出する方法
    であって、 ａ）前記対象からの細胞をキレート剤で処理して、生物活性体での前記抗体を
    解離させる工程と、 ｂ）前記抗体を含む上清から細胞を除去する工程と、 ｃ）インテグリンに対する抗体の存在について前記上清を試験する工程と、 を含むことを特徴とする方法。
  24. 【請求項２４】 前記上清を試験することが、 （ａ）前記インテグリンを固体支持体に固定化して固定化インテグリンを形成
    する工程と、 （ｂ）工程（ａ）の固定化インテグリンを選択されたインテグリンアンタゴニ
    スト／アゴニストと共にインキュベートして、前記固定化インテグリンと該選択
    されたインテグリンアンタゴニスト／アゴニストとの間で複合体を形成する工程
    と、 （ｃ）前の工程の固定化物質を前記対象からの抗体を含む試料と共にインキュ
    ベートして、複合体を形成する工程と、 （ｄ）前の工程の物質を標識二次抗ヒト抗体と共にインキュベートして、複合
    体を形成する工程とを含み、 この場合において、工程（ａ）と工程（ｂ）を組み合わせることができ、また
    は工程（ｂ）と工程（ｃ）を組み合わせることができる、 ことを特徴とする請求項２３記載の方法。
  25. 【請求項２５】 前記インテグリンがＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａであることを特
    徴とする請求項２３記載の方法。
  26. 【請求項２６】 非結合薬物が固相吸着によって除去されることを特徴とす
    る請求項２３記載の方法。
  27. 【請求項２７】 抗体のＲＧＤ保持または非保持ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａへの
    結合を比較することを特徴とする請求項２３記載の方法。
  28. 【請求項２８】 前記抗体が薬物非存在下で前記インテグリンに結合するこ
    とを特徴とする請求項２３記載の方法。
  29. 【請求項２９】 前記抗体がインテグリンアンタゴニスト／アゴニスト存在
    下で前記インテグリンに結合することを特徴とする請求項２３記載の方法。
  30. 【請求項３０】 前記インテグリンが組換えインテグリン、変異インテグリ
    ン、インテグリン断片、またはインテグリン由来の天然、組換え、もしくは合成
    ポリペプチドであることを特徴とする請求項２３記載の方法。
  31. 【請求項３１】 前記抗体がインテグリンアンタゴニスト／アゴニストを含
    まない薬物存在下で前記インテグリンに結合することを特徴とする請求項２３記
    載の方法。
  32. 【請求項３２】 インテグリンアンタゴニスト／アゴニストによる治療後に
    、血小板減少症／血栓塞栓症合併症を含むＤＤＡＢ依存性疾患状態を発症するリ
    スクの高い対象を同定するための方法であって、請求項２３記載の抗体試験を含
    むことを特徴とする方法。
  33. 【請求項３３】 ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストによる治療の最初の
    １週間以内に、血小板減少症／血栓塞栓症合併症を発症するリスクの高い対象を
    同定するための方法であって、 ａ）対象からの生物試料を、薬物依存性抗体のＲＧＤ保持ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩ
    ａとの結合について試験する工程と、 ｂ）同じ生物試料を、薬物依存性抗体のＲＧＤ非保持ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａと
    の結合について試験する工程と、 ｃ）（ａ）および（ｂ）におけるＤＤＡＢ結合量を比較する工程と、 を含むことを特徴とする方法。
  34. 【請求項３４】 前記抗体を含む試料を前記対象から得て、前記方法をイン
    テグリンアンタゴニスト／アゴニストによる対象の治療前に実施することを特徴
    とする請求項３３記載の方法。
  35. 【請求項３５】 前記抗体を含む試料を対象から得て、前記方法をインテグ
    リンアンタゴニスト／アゴニストによる対象の治療と同時に実施することを特徴
    とする請求項３３記載の方法。
  36. 【請求項３６】 前記選択されたインテグリンアンタゴニスト／アゴニスト
    が、前記対象を治療するために用いられる前記アンタゴニスト／アゴニストの活
    性型または活性代謝物を含むことを特徴とする請求項３３または請求項３４のい
    ずれか１項に記載の方法。
  37. 【請求項３７】 インテグリンから抗体を解離させるのに適したキレート剤
    と、インテグリンの供給源と、陽性対照と、二次標識抗ヒト抗体とを含むことを
    特徴とする、診断用イムノアッセイキット。
  38. 【請求項３８】 選択された非インテグリンアンタゴニスト／アゴニスト関
    連薬物を含むことを特徴とする請求項３７記載の診断用イムノアッセイキット。
  39. 【請求項３９】 選択されたインテグリンアンタゴニスト／アゴニストを含
    むことを特徴とする請求項３７記載の診断用イムノアッセイキット。
  40. 【請求項４０】 ＤＤＡＢを誘導する傾向が限られている、または既に存在
    しているもしくは生じつつあるＤＤＡＢによって認識されるエピトープを誘導す
    る傾向が限られているインテグリンアンタゴニスト／アゴニストを同定するため
    の方法であって、 （ａ）インテグリンとインテグリンアンタゴニスト／アゴニストとの間で複合
    体を形成する工程と、 （ｂ）前記複合体を抗体供給源とインキュベートする工程と、 （ｃ）前記複合体に対する抗体が生じ、かつ／または存在するかどうかを調べ
    る工程と、 を含むことを特徴とする方法。
  41. 【請求項４１】 前記インテグリンがＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａであることを特
    徴とする請求項４０記載の方法。
  42. 【請求項４２】 特定の既知の抗原に特異性を有し、第１の哺乳動物種の抗
    体の対応する定常領域と相同性の定常領域および第２の異なる哺乳動物種由来の
    抗体の可変領域と相同性の可変領域を有する、免疫グロブリン重鎖または軽鎖を
    含むことを特徴とする組成物。
  43. 【請求項４３】 前記免疫グロブリンがキメラであることを特徴とする請求
    項４２記載の組成物。
  44. 【請求項４４】 前記定常領域がヒトであることを特徴とする請求項４３記
    載のキメラ重鎖または軽鎖。
  45. 【請求項４５】 前記軽鎖が配列番号１を含むことを特徴とする請求項４３
    記載のキメラ抗体。
  46. 【請求項４６】 前記重鎖が配列番号２を含むことを特徴とする請求項４３
    記載のキメラ抗体。
  47. 【請求項４７】 前記特定の既知の抗原がインテグリン：インテグリンアゴ
    ニスト／アンタゴニスト複合体であることを特徴とする請求項４２または請求項
    ４３記載のいずれか１項に記載の組成物。
  48. 【請求項４８】 前記インテグリン：インテグリンアゴニスト／アンタゴニ
    スト複合体がＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ：化合物Ａであることを特徴とする請求項４
    ７記載の組成物。
  49. 【請求項４９】 インテグリンアゴニスト／アンタゴニストに結合したイン
    テグリンを認識する請求項４３記載のキメラ抗体を陽性対照として用いることを
    特徴とする方法。
  50. 【請求項５０】 複製可能な発現ベクターであって、適当な宿主細胞に適合
    したプロモーターに操作可能に結合されたＤＮＡと、特定の既知の抗原に特異性
    を有し、第１の哺乳動物種の抗体の対応する定常領域に相同性の定常領域および
    第２の異なる哺乳動物種由来の抗体の可変領域に相同性の可変領域を有する、キ
    メラ免疫グロブリン重鎖または軽鎖をコードするＤＮＡと、を含むことを特徴と
    する発現ベクター。
  51. 【請求項５１】 前記第１の哺乳動物種がヒトであることを特徴とする請求
    項５０記載のベクター。
  52. 【請求項５２】 前記特定の既知の抗原がＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ：化合物Ａ
    複合体であることを特徴とする請求項５０または請求項５１のいずれか１項に記
    載のベクター。
  53. 【請求項５３】 インテグリン：アンタゴニスト／アゴニスト複合体に対す
    るモノクローナル抗体を作製することを含むことを特徴とする方法。
  54. 【請求項５４】 インテグリン：アンタゴニスト／アゴニスト複合体に特異
    的な抗体を産生することができることを特徴とするハイブリドーマ。
  55. 【請求項５５】 前記インテグリンが前記アンタゴニスト／アゴニスト複合
    体の形成によって立体配座的に変化していることを特徴とする請求項５４記載の
    ハイブリドーマ。
  56. 【請求項５６】 前記インテグリンがＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａであることを特
    徴とする請求項５４記載のハイブリドーマ。
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Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU1196801A (en) * 1999-10-12 2001-04-23 Du Pont Pharmaceuticals Company An in vitro phagocytosis method to predict the in vivo potential of integrin antagonists/agonists to induce thrombocytopenia
WO2004017900A2 (en) * 2002-08-20 2004-03-04 University Of Massachusetts Assay for thrombocytopenia associated with administration of platelet gpiib-iiia receptor antagonists
LT3264094T (lt) 2005-04-04 2021-04-12 Biogen Ma Inc. Imuninio atsako į terapijos agentą įvertinimo būdai
US20070207141A1 (en) 2006-02-28 2007-09-06 Ivan Lieberburg Methods of treating inflammatory and autoimmune diseases with natalizumab
JP5504390B2 (ja) 2006-03-03 2014-05-28 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド ナタリズマブを用いて炎症性疾患及び自己免疫疾患を治療する方法
EP2053961A4 (en) * 2006-08-09 2013-05-01 Biogen Idec Inc METHOD FOR DISPENSING A MEDICAMENT
WO2011044553A1 (en) * 2009-10-11 2011-04-14 Biogen Idec Ma Inc. Anti-vla-4 related assays
US11287423B2 (en) 2010-01-11 2022-03-29 Biogen Ma Inc. Assay for JC virus antibodies
PL2524060T3 (pl) 2010-01-11 2018-05-30 Biogen Ma Inc. Test wykrywający przeciwciała przeciwko wirusowi jc
WO2012141737A1 (en) 2010-10-19 2012-10-18 Battelle Memorial Institute Compositions, antibodies, asthma diagnosis methods, and methods for preparing antibodies
EP2665830B1 (en) * 2011-01-20 2019-11-06 Aaron Tomer Platelet analysis system
EP3004334A4 (en) 2013-05-28 2016-12-21 Biogen Ma Inc METHODS OF EVALUATION RISK OF DEVELOPMENT OF PML
TWI604650B (zh) 2016-07-12 2017-11-01 財團法人工業技術研究院 膠態電解質與其前驅組合物及電池

Family Cites Families (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE64956T1 (de) * 1984-06-14 1991-07-15 Ciba Geigy Ag Verfahren zur herstellung von thrombininhibitoren.
US4717654A (en) 1984-06-19 1988-01-05 Akzo N.V. Process for solid phase platelet antibody assay
US5114842A (en) 1987-07-08 1992-05-19 The Scripps Research Institute Peptides and antibodies that inhibit platelet adhesion
US5770198A (en) * 1988-05-18 1998-06-23 The Research Foundation Of The State Of New York Platelet-specific chimeric 7E3 immunoglobulin
US5372933A (en) 1988-10-03 1994-12-13 The Scripps Research Institute Polypeptides that mimic receptor-induced binding sites, and methods of using same
US5338723A (en) * 1989-10-13 1994-08-16 Merck & Co., Inc. Fibrinogen receptor antagonists
NZ235564A (en) * 1989-10-13 1993-10-26 Merck & Co Inc Fibrinogen receptor antagonist and pharmaceutical compositions
NZ239846A (en) * 1990-09-27 1994-11-25 Merck & Co Inc Sulphonamide derivatives and pharmaceutical compositions thereof
US5264420A (en) * 1990-09-27 1993-11-23 Merck & Co., Inc. Fibrinogen receptor antagonists
WO1992007568A1 (en) * 1990-11-01 1992-05-14 Smithkline Beecham Corporation η-TURN PEPTIDOMIMETICS AS FIBRINOGEN ANTAGONISTS
US5177188A (en) * 1990-12-03 1993-01-05 The Scripps Research Institute Methods and compositions for diagnosing chronic immune thrombocytopenic purpura
US5256538A (en) 1991-03-08 1993-10-26 Board Of Regents, The University Of Texas System Detection of early platelet activation and prediagnosis of thrombotic events
EP0583352B1 (en) 1991-04-30 1999-09-08 The Scripps Research Institute hGPIIb FRAGMENTS AND THEIR USE IN $i(IN VITRO) METHODS FOR DETERMINING $i(IN VIVO) THROMBOTIC EVENTS
US5321034A (en) * 1991-05-07 1994-06-14 Merck & Co., Inc. Fibrinogen receptor antagonists
HUT68769A (en) * 1991-05-07 1995-07-28 Merck & Co Inc FIBRINOGéN RECEPTOR ANTAGONIST COMPOUNDS AND PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS COMPRISING THEM AS EFFECTIVE SUBSTANCE
CA2075154A1 (en) * 1991-08-06 1993-02-07 Neelakantan Balasubramanian Peptide aldehydes as antithrombotic agents
US5674863A (en) * 1991-10-18 1997-10-07 Genentech, Inc. Nonpeptidyl integrin inhibitors having specificity for the GPIIb IIIa receptor
US5272158A (en) * 1991-10-29 1993-12-21 Merck & Co., Inc. Fibrinogen receptor antagonists
US5389631A (en) * 1991-10-29 1995-02-14 Merck & Co., Inc. Fibrinogen receptor antagonists
US5312923A (en) * 1992-02-28 1994-05-17 Merck & Co., Inc. Process for preparing fibrinogen receptor antagonists
TW223629B (ja) * 1992-03-06 1994-05-11 Hoffmann La Roche
US5358956A (en) * 1992-10-14 1994-10-25 Merck & Co., Inc. Fibrinogen receptor antagonists
US5340798A (en) * 1992-10-14 1994-08-23 Merck & Co., Inc. Fibrinogen receptor antagonists
US5441952A (en) * 1993-04-05 1995-08-15 Merck & Co., Inc. Fibrinogen receptor antagonists
US5334596A (en) * 1993-05-11 1994-08-02 Merck & Co., Inc. Fibrinogen receptor antagonists
US5463011A (en) * 1993-06-28 1995-10-31 Zeneca Limited Acid derivatives
US5397791A (en) * 1993-08-09 1995-03-14 Merck & Co., Inc. Fibrinogen receptor antagonists
US5585243A (en) 1993-09-15 1996-12-17 The Blood Center Of Southeastern Wisconsin, Inc. Method of detecting cytopenia that is mediated by drug-dependent antibody binding to blood cells
US5446056A (en) * 1993-11-24 1995-08-29 The Du Pont Merck Pharmaceutical Company Isoxazoline compounds useful as fibrinogen receptor antagonists
US5514557A (en) * 1994-06-06 1996-05-07 Genetic Testing Institute Inc. Method and kit for detecting antibodies specific for HLA and/or platelet glycoproteins
US5451578A (en) * 1994-08-12 1995-09-19 Merck & Co., Inc. Fibrinogen receptor antagonists
WO1996024063A1 (en) 1995-01-30 1996-08-08 The General Hospital Corporation Methods for identifying integrin antagonists
US5763201A (en) * 1996-02-05 1998-06-09 Emory University Flow cytometry assay for heparin-induced thrombocytopenia
US5955266A (en) * 1996-04-01 1999-09-21 The Johns Hopkins University School Of Medicine Use of platelet polymorphism P1A2 to diagnose risk of thrombotic disease
WO1998022821A1 (en) 1996-11-21 1998-05-28 Merck & Co., Inc. DETECTION OF ANTAGONIST-DEPENDENT GPIIb/IIIa RECEPTOR ANTIBODIES
US6017925A (en) * 1997-01-17 2000-01-25 Merck & Co., Inc. Integrin antagonists
WO1999019463A1 (en) 1997-10-14 1999-04-22 Merck & Co., Inc. Anticoagulant test
US6063584A (en) * 1997-11-21 2000-05-16 Merck & Co., Inc. Anticoagulant test

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