JP2001522865A - リン酸化ｖａｓｐ（血管拡張剤−刺激リン蛋白質）に対する抗体、その調製用のハイブリドーマ細胞およびその使用 - Google Patents

リン酸化ｖａｓｐ（血管拡張剤−刺激リン蛋白質）に対する抗体、その調製用のハイブリドーマ細胞およびその使用

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＶＡＳＰ（血管拡張剤−刺激リン蛋白質）がリン酸化形態で存在する場合に抗原としてＶＡＳＰにのみ結合する、ＶＡＳＰに対する抗体、その調製用のハイブリドーマ細胞並びに診断薬および／または治療薬としての抗体または抗体断片の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、ＶＡＳＰ（血管拡張剤−刺激リン蛋白質）がリン酸化形態で存在す
る場合に抗原としてＶＡＳＰにのみ結合する、ＶＡＳＰに対する抗体、その調製
用のハイブリドーマ細胞並びに診断薬および／または治療薬としての抗体または
抗体断片の使用に関する。
【０００２】 血管系の疾患は、心筋梗塞、脳卒中、動脈性閉塞症および多くの種類の腎不全
などの非常に多くの慢性的で生命を危うくする疾患の原因である。
【０００３】 内皮細胞、特に血液凝固系、血小板の機能状態、炎症および腫瘍細胞の血管壁
中への移動、平滑筋細胞の収縮および成長、並びにその結果の血圧および血管壁
構造の状態、およびさらに新血管形成を制御する内皮細胞は、血管系の調節に特
に重要である。最後には心筋梗塞、脳卒中および多くの型の腎不全を導き得る状
況である、重大な血管系疾患において、これら血管壁の機能の多くが妨げられる
。
【０００４】 内皮細胞は、重要な物質であるプロスタサイクリン（ＰＧｌ2）および一酸化 窒素（ＮＯ）を生成し、これは内皮由来の弛緩因子（ＥＤＲＦ）として知られ、
血小板および血管筋肉細胞の両方を阻害する物質である。内皮の機能は、プロス
タサイクリン（ＰＧｌ2）またはＥＤＲＦ、例えばＮＯのような前記内皮因子に よって制御される。 それ故に、特定の様式において内皮の機能障害に関連する疾患を治療するため
には、内皮機能障害を診断し、その経過を制御し得る生化学的パラメータを開発
する必要がある。
【０００５】 内皮機能不全により引き起こされるアテローム性動脈硬化症病変などの不可逆
的損傷を未だ認められない段階で、可能な限り早期に内皮機能不全を認識できる
のが望ましい。 初期段階での内皮機能不全の同定は、内皮機能不全の可逆的治療をもたらし得
る、新しい治療法の開発を可能にする。
【０００６】 インビボ内皮機能を測定する公知の方法は、定量的血管造影法のような観血的
検出法、あるいは非観血的な造影法である。これらの方法の欠点は、これらの検
査が直接患者に実施すること、定量が難しく且つ非常に高価なことである。 従って、生体外で生物学的物質、例えば細胞試料または血液試料において、研
究室における定型的検査によって内皮の機能を速やかに且つ簡単に測定できる、
生化学的／免疫生物学的方法を利用できるものが望ましい。 内皮の機能は、プロスタサイクリン（ＰＧｌ2）またはＥＤＲＦ、例えばＮＯ などの内皮因子によって制御可能な機能である。
【０００７】 本発明の課題は、内皮機能を評価し、且つ調節する試薬を提供することである
。本発明のこの課題および他の課題によれば、ＶＡＳＰ（血管拡張剤−刺激リン
蛋白質）に対するものであり、ＶＡＳＰがリン酸化されている場合にのみＶＡＳ
Ｐと結合する抗体が提供される。
【０００８】 本発明の一態様において、ＶＡＳＰがセリン２３９位にてリン酸化されている
場合（ホスホセリン２３９ＶＡＳＰ）にのみＶＡＳＰに結合する抗体が開示され
る。他の態様において、ＶＡＳＰがセリン１５７位にてリン酸化されている場合
（ホスホセリン１５７ＶＡＳＰ）にのみＶＡＳＰに結合する抗体が開示される。 本発明の他の態様には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体および抗体
断片が包含される。別に態様には、ハイブリドーマ細胞株１６Ｃ２により産生さ
れるモノクローナル抗体、特にＭａｂ １６Ｃ２が包含される。
【０００９】 本発明の他の課題は、本発明の抗体の製造に有用なハイブリドーマ細胞を提供
することである。さらに、本発明の課題は、リン酸化されている場合にのみＶＡ
ＳＰに結合する、ＶＡＳＰに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マ細胞系を提供することである。一態様において、ハイブリドーマ細胞株１６Ｃ
２（ＤＳＭ ＡＣＣ２３３０）が提供される。
【００１０】 本発明の別の課題は、内皮機能を評価する方法を提供することである。本発明
のこの課題によれば、ＶＡＳＰのリン酸化状態を測定する方法が提供される。本
発明の一態様において、生物学的物質は、ＶＡＳＰ（血管拡張剤−刺激リン蛋白
質）がリン酸化されている場合にのみ抗原としてＶＡＳＰと結合するＶＡＳＰに
対する抗体と接触させられる。
【００１１】 本発明の他の態様において、生物学的物質に結合するＶＡＳＰ抗体を定量する
ことをさらに包含する定量法が提供される。特別な態様には、電気泳動によりＶ
ＡＳＰを分割し、リン酸化されている場合にのみＶＡＳＰに結合する、ＶＡＳＰ
に対する抗体と接触させる、ウェスタンブロット法が包含される。他の態様は、
リン酸化されている場合にのみＶＡＳＰに結合する、ＶＡＳＰに対する抗体を試
料と接触させることを包含するフローサイトメトリー法である。
【００１２】 本発明の他の態様において、診断方法が提供される。代表的な方法は、リン酸
化されている場合にのみＶＡＳＰに結合する、ＶＡＳＰに対する抗体を試料と接
触させ、ＶＡＳＰのリン酸化状態を評価することを伴う。一態様において、この
方法は、試料中のＶＡＳＰのリン酸化を定量的に測定することを包含する。別の
態様において、抗体をホスホセリン２３９ＶＡＳＰまたはホスホセリン１５７Ｖ
ＡＳＰに結合させる方法が記載される。さらに他の態様において、試料はヒト血
小板またはヒト全血である。
【００１３】 本発明の別の課題は、内皮機能のマーカーを検出する方法を提供することであ
り、一態様において、ｃＧＭＰおよび／またはｃＡＭＰ濃度に作用する物質に曝
されている患者の試料を検査し、その試料を、リン酸化されている場合にのみＶ
ＡＳＰに結合する、ＶＡＳＰに対する抗体と接触させ、そして対照試料に対して
相対的なＶＡＳＰリン酸化状態を評価することを包含する、ｃＧＭＰおよび／ま
たはｃＡＭＰの濃度に作用する物質を検出する方法が提供される。
【００１４】 さらに別の態様において、患者からの試料を、リン酸化されている場合にのみ
ＶＡＳＰに結合する、ＶＡＳＰに対する抗体と接触させ、そして正常な対照試料
に対して相対的なＶＡＳＰリン酸化状態を評価することを包含する、内皮機能不
全を検出する方法が詳述される。
【００１５】 さらに本発明の課題は、本明細書に開示される診断方法を実施するための便利
なキットを提供することである。さらにこの課題に対して、リン酸化されている
場合にのみＶＡＳＰに結合する、ＶＡＳＰに対する抗体を含む診断用キットが提
供される。 さらに、本発明の別の課題は、内皮機能不全に苦しむ患者の治療方法を提供す
ることである。本発明のこのおよび別の治療の課題によれば、治療を必要とする
患者に、リン酸化されている場合にのみＶＡＳＰに結合する、ＶＡＳＰに対する
抗体の治療的に有効な量を投与する、治療方法が開示される。
【００１６】 血圧低下（血管拡張）ホルモンおよび薬剤に応答して、血小板および血管壁細
胞においてリン酸化されるヒトＶＡＳＰ（血管拡張剤−刺激リン蛋白質）は、最
近発見され、単離され、そして分子遺伝学の観点から特徴付けられた（Haffner 等，EMBOJ．14，19〜27，1995年）。
【００１７】 ＶＡＳＰは、生理学的、病態生理学的および薬理学的に非常に重要なＡＮＦ／
ＮＯ／ｃＧＭＰ／ｃＧＭＰ蛋白質キナーゼシグナル経路の重要な構成成分であり
、且つｃＡＭＰ／ｃＡＭＰ蛋白質キナーゼシグナル経路の重要な構成成分である
（U．Walter，Blick 1／97 Wurzburg University，pp.79〜81，1997年）。ＶＡ ＳＰは、ほとんど全てのヒトおよび動物細胞において発現しており、特に血小板
、血管平滑筋細胞および繊維芽細胞において高濃度で見出されている。培養細胞
においては、ＶＡＳＰはフォーカルコンタクト（細胞／基質接着部位）、細胞／
細胞接着、マイクロフィラメントおよび動的膜領域（例えばリーディングエッジ
）と関連する（Walter等，Agents and Actions 45S，255〜268，1995年）。
【００１８】 血管系におけるＶＡＳＰのリン酸化は、血小板の接着／凝結の阻害、平滑筋の
収縮／移動並びに細胞外質内皮浸透性の阻害と相関する。 ＶＡＳＰは、異なる３つの部位にてリン酸化および脱リン酸化される。（セリ
ン１５７，セリン２３９およびトレオニン２７８；Horstrup等，Eur．J．Bioche
m．225，21−27 (1994年)を参照）。セリン２３９は、特にＶＡＳＰの最初のメ チオニンが数に含まれない場合に、しばしばセリン２３８と表される。
【００１９】 ＶＡＳＰのセリン２３９は、生理学的および薬理学的なＮＯ供与体、および血
小板阻害剤および血管拡張薬に応答して、無傷なヒト血管細胞（血小板、内皮細
胞および平滑筋細胞）においてリン酸化される。 ＶＡＳＰのセリン２３９のリン酸化は特に、ｃＧＭＰ経由で、ナトリウム排泄
増加ペプチドのような重要なホルモンまたはＮＯ放出物質および薬剤により活性
化される、ｃＧＭＰ依存性蛋白質キナーゼによって媒介される。ＶＡＳＰのセリ
ン２３９のリン酸化は、さらにｃＡＭＰ増加ホルモンおよび薬剤により活性化さ
れる、ｃＡＭＰ依存性蛋白質キナーゼによって媒介される。
【００２０】 ｃＡＭＰ依存性蛋白質キナーゼは主にセリン１５７位をリン酸化するが、ＶＡ
ＳＰのセリン２３９位もまたリン酸化する。セリン１５７位におけるＶＡＳＰの
リン酸化もまた、ヒト血小板におけるフィブリノーゲンの糖蛋白質IIｂ−IIIａ との結合の阻害と密接に相関することが観察される（Horstrup等，Eur．J．Bioc
hem．225，21−27 (1994年)）。
【００２１】 生物学的物質、例えば組織および細胞の抽出物においてＶＡＳＰがリン酸化さ
れる程度の測定、特に２３９位および／または１５７位におけるＶＡＳＰのリン
酸化の測定は、重要な生化学的パラメータとなり、その測定は、心房性ナトリウ
ム排泄増加因子（ＡＮＦ）、グアニリン［guanylin］、ＮＯ−放出物質および薬
剤などのｃＧＭＰ増加および／またはｃＡＭＰ増加ホルモンまたは薬剤の全てを
検出する診断システムの開発を可能にし、さらにインビボ内皮機能に関して結論
を引き出すことを可能にする。
【００２２】 可逆的にリン酸化された蛋白質に特異的に結合する抗体は、US 5,599,681、W0
93／21230およびU．Walter，Blick 1／97 Wurzburg University，pp.79−81，1
997年に記載されている。
【００２３】 本発明の課題は、生物学的物質中におけるＶＡＳＰのリン酸化状態を迅速で単
純な手法にて定性的および／または定量的に測定し得る生化学的／免疫生物学的
方法を開発することである。 本課題は、ＶＡＳＰがリン酸化形態で存在する場合に抗原としてＶＡＳＰにの
み結合する抗体の供給によって達成される。 故に、本発明は、一般的にはＶＡＳＰがリン酸化形態で存在する場合に抗原と
してＶＡＳＰにのみ結合する抗体に関する。
【００２４】 本発明の意味においては、抗体は、ＶＡＳＰにおけるリン酸化領域を特異的に
認識する、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体（Ｍａｂ）の両方およ
びその断片、さらにＳＣＦＶ断片または他の合成もしくは組換え蛋白質領域と理
解される。
【００２５】 抗体の断片には、標的抗原、この場合ＶＡＳＰまたはその特定の部分に結合し
得る抗体の任意の部分が包含される。抗体断片には、具体的にはＦ(ａｂ′)2、 Ｆａｂ、Ｆａｂ′およびＦｖ断片が包含される。これらは、抗体の任意のクラス
から作成することができるが、典型的にはＩｇＧまたはＩｇＭから作られる。こ
れらは、慣用の組換えＤＮＡ技術によって、または古典的方法を用いるパパイン
もしくはペプシンでの蛋白質分解消化によって作成することができる。CURRENT
PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY，chapter2，Coligan等，eds.，(John Wiley & Sons 1
991−92）を参照。
【００２６】 Ｆ(ａｂ′)2断片は典型的には約１１０kDa（ＩｇＧ）または約１５０kDa（Ｉ ｇＭ）であり、そしてジスルフィド結合によってヒンジにおいて連結された２つ
の抗原結合部位を含む。全てではないとしても実質的に全てのＦｃがこれら断片
を欠いている。Ｆａｂ′断片は典型的には約５５kDa（ＩｇＧ）または約７５kDa
（ＩｇＭ）であり、例えばＦ(ａｂ′)2断片のジスルフィド結合を還元すること によって生成させることができる。生じた遊離のスルフヒドリル基は、都合良く
Ｆａｂ′断片を検出試薬（例えば酵素）などの他の分子と結合させるために用い
ることができる。Ｆａｂ断片は一価であり、（任意の供給源由来で）通常は約５
０kDaである。Ｆａｂ断片は、抗体の抗原結合部位の軽（Ｌ）鎖および重（Ｈ） 鎖、可変（それぞれＶLおよびＶH）領域および定常（それぞれＣL、ＣH）領域を
包含する。ＨおよびＬ部分は、分子内ジスルフィド架橋によって連結されている
。
【００２７】 Ｆｖ断片は典型的には約２５kDa（供給源を問わず）であり、軽鎖および重鎖 両方の可変領域（それぞれＶLおよびＶH）を含む。通常は、ＶL鎖およびＶH鎖は
共に非共有相互作用によってのみ保持され、故にこれらは容易に分離される。し
かし、小さいサイズの利点を有しており、より大きいＦａｂ断片と同じ結合特性
を保持する。従って、例えばグルタルアルデヒド（または他の化学的架橋剤）、
分子間ジスルフィド結合（システインの導入による）およびペプチドリンカーを
使用して、ＶL鎖およびＶH鎖を連結するために、方法が開発されてきた。生じた
Ｆｖは、単一鎖（即ち、ＳＣＦｖ）である。
【００２８】 １つの好ましい方法は、組換え法によるＳＣＦｖの生成を包含し、別の抗体源
からの可変鎖を混合および適合させることによって新規な特異性を有するＦｖの
生成が可能である。典型的な方法において、カセット領域の発現を促進する、適
当な制御エレメントを含む組換えベクターが提供される。カセット領域は、ペプ
チドリンカーをコードするＤＮＡを含み、融合蛋白質を生成するために、リンカ
ーの５′末端および３′末端の両方において好都合な部位を備える。目的の可変
領域をコードするＤＮＡをベクター中にクローニングして、リンカーを有する融
合蛋白質を生成させる、即ちＳＣＦｖを生成させることができる。
【００２９】 模範的な別法において、２つのＦｖをコードするＤＮＡを、リンカーをコード
するＤＮＡに連結することができ、そして生じた３部からなる融合物を慣用の発
現ベクター中に直接連結することができる。これらの方法のいずれかにより生成
したＳＣＦｖ ＤＮＡは、選択したベクターに依存して、原核細胞または真核細 胞において発現させることができる。
【００３０】 好ましくは、ＶＡＳＰがリン酸化形態において存在する場合にのみ抗原として
ＶＡＳＰに結合するモノクローナル抗体およびその断片が堤供される。 特に好ましくは、２３９位のセリンがリン酸化されている（ホスホセリン２３
９ ＶＡＳＰ）場合にのみ抗原としてＶＡＳＰ、またはＶＡＳＰのセリン２３９ 周辺のペプチド配列を含むペプチドに結合する、モノクローナル抗体およびその
断片がさらに提供される。
【００３１】 本発明の意味の範囲内において、用語ＶＡＳＰは、ＶＡＳＰの誘導体、即ち機
能的に等価であるＶＡＳＰの一部分、突然変異体、断片または変異型をも意味す
ると理解され、例えば、さらにセリン１５７位および／またはトレオニン２７８
位においてリン酸化されているホスホセリン２３９ ＶＡＳＰ、並びに例えば、 グリコシル化突然変異体、他の共有結合型修飾体および蛋白質／蛋白質相互作用
に対して重要な構造エレメントである。本発明の意味の範囲内において、用語Ｖ
ＡＳＰは、ヒトＶＡＳＰおよび他の種由来のＶＡＳＰ、特にラット、マウス、ウ
サギ、イヌ、ブタまたはサルなどの哺乳類由来のＶＡＳＰを包含する。
【００３２】 抗体は、慣用の方法、例えばKohlerとMilstein（KohlerとMilstein, Nature 2
56; 495, 1975年）に記載される技術に従って作製することができる。典型的に は、リン酸化部位に基づく選択性を所望する場合、抗体はＶＡＳＰのリン酸化形
態に対して生じたものである。単離した抗体は、慣用の方法を用いて選択性を確
実にするためにスクリーニングすることができる。抗体を、セリン１５７、セリ
ン２３９および／またはトレオニン２７８を含むＶＡＳＰのペプチド断片に対し
て生じさせるのが好ましい。
【００３３】 抗原性ＶＡＳＰペプチドの長さは、体液応答を引き起こし得る限り、重要では
ない。典型的な抗原性ペプチドは、約５０アミノ酸未満の長さである。いくつか
の好ましいペプチドは、約２０アミノ酸の長さ未満である。最も好ましいペプチ
ドは、約６〜約１２アミノ酸の範囲の長さである。好ましいペプチドには、ＫＬ
ＲＫＶＳ239ＫＱまたはＲＫＶＳ239ＫＱＥが包含される。ペプチドは、セリン１
５７、セリン２３９および／またはトレオニン２７８においてリン酸化されてい
るのが好ましい。ペプチドは組換え法によって得ることができる。典型的には、
ペプチドはＶＡＳＰの蛋白質分解またはインビトロ合成のいずれか、そしてリン
酸化によって作製される。
【００３４】 さらに、好ましくは上述の特性を示し、且つフローサイトメトリーに使用でき
るモノクローナル抗体が提供される。これは、フローサイトメトリーにおいて慣
用的に使用される固定工程にて予測される、抗原のコンフォメーションを変化さ
せ得る条件下に抗原を供した場合であっても、新規な抗体の特異性が保持される
ことを要求する。新規抗体は、例えばこれらを簡単に試験することにより、フロ
ーサイトメトリーにおける使用に対する適合性につき検査される。 モノクローナル抗体１６Ｃ２が特に好ましい。
【００３５】 新規抗体は、それ自体当業者に知られた方法を用いて調製することができる。
KohlerとMilstein（KohlerとMilstein, Nature 256; 495, 1975年）により記載 される技術を使用するハイブリドーマ細胞の調製は、特にモノクローナル抗体に
ついて述べる。精製した抗体の特異性は、例えば下記の試験方法を用いて調査す
ることができる： ａ) リン酸化ＶＡＳＰを用いて陽性シグナルを観察できなければならないこと
のみに関連して、ｃＡＭＰ依存性またはｃＧＭＰ依存性蛋白質キナーゼによって
異なる程度までリン酸化した、組換えＶＡＳＰを用いるウェスタンブロッティン
グ。
【００３６】 ｂ) ヒトＶＡＳＰまたは異なる様式にて突然変異させ、そしていずれの場合に
おいても３つのリン酸化部位の１つを突然変異させ、これにより消去されたＶＡ
ＳＰ、（Ｓ１５７Ａ）ＶＡＳＰ、（Ｓ２３９Ａ）ＶＡＳＰおよび（Ｔ２７８Ａ）
ＶＡＳＰ、並びにいずれの場合においてもヒトｃＧＭＰ蛋白質キナーゼをトラン
スフェクションした細胞、例えばＰｋｔ２細胞の抽出物を用いるウェスタンブロ
ッティング。これらの抗体は、ウェスタンブロッティングにおける陽性シグナル
がＳ２３９Ａ突然変異によって消去されるが、他の２つの突然変異によっては消
去されないものが適する。
【００３７】 ｃ) 異なる血管拡張剤（例えばプロスタサイクリンまたはＮＯ供与体）で処理
されたヒト血小板またはｃＡＭＰ蛋白質キナーゼまたはｃＧＭＰ蛋白質キナーゼ
の活性化剤で処理されたヒト血小板を用いるウェスタンブロッティング。その結
果、抗体は、リン酸化ＶＡＳＰを有する抽出物においてのみ特定のバンドが検出
された場合が適する。抗体はまた、ヒト繊維芽細胞を用いる類似の方法、並びに
さらにラットおよびマウスび血小板を用いる類似の方法にてスクリーニングする
ことができる。 ｄ) 固定したヒト血小板および内皮細胞を用いる免疫蛍光検査法。陽性シグナ
ルは、ＶＡＳＰがリン蛋白質として存在する場合に観察される。
【００３８】 さらに本発明は、新規モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株に
関し、モノクローナル抗体１６Ｃ２を産生するハイブリドーマ細胞株１６Ｃ２が
特に好ましい。 モノクローナル抗体１６Ｃ２を産生するハイブリドーマ細胞株１６Ｃ２は、次
の番号：DSM ACC2330において、ブタペスト条約の規定に従って、1997年11月６ 日にDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (German colle
ction of microorganisms and cell cultures)，Mascheroder Weg 1b, D-38124
Braunschweig, Germanyに寄託されている。
【００３９】 新規抗体は、好ましくはインビトロ条件下にて生じるＶＡＳＰのリン酸化およ
びインビボ条件下にて生じるＶＡＳＰのリン酸化の両方を定性的および／または
定量的、好ましくは定量的に測定し、ＶＡＳＰのセリン２３９および／またはセ
リン１５７のリン酸化を測定するのに適し、特に好ましくはＶＡＳＰのセリン２ ３９のリン酸化を測定するのに適する。
【００４０】 抗体を用いる定量法は当業者に知られており、例えば上述のCURRENT PROTOCOL
S IN IMMUNOLOGY中において見出すことができる。これらの方法には、酵素結合 免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノ検定法（ＲＩＡ）などが包含され
る。 さらに新規抗体は、生物学的物質中のリン酸化されたＶＡＳＰ、好ましくはホ
スホセリン２３９ ＶＡＳＰおよび／またはホスホセリン１５７ ＶＡＳＰ、特に
好ましくはホスホセリン２３９ ＶＡＳＰを定性的および／または定量的、好ま しくは定量的に測定するのに適する。
【００４１】 生物学的物質は、例えば血小板、白血球、内皮細胞、平滑筋細胞および繊維芽
細胞などの細胞抽出物、組織抽出物、細胞切片、細胞組織および細胞と理解され
る。生物学的物質は、ヒト由来であるか、またはラット、マウス、ウサギ、イヌ
、ブタもしくはイヌなどの哺乳類由来とすることができる。ヒト起源の生物学的
物質が好ましい。
【００４２】 新規抗体は、当業者に知られた方法に従ってウェスタンブロッティングのオー
トラジオグラムを定量的に評価する、例えばＮＩＨゲルブロッティング イメー ジ １.６［NIH gel blotting Image 1.6］ソフトウェアを用いることによって、
または免疫蛍光法によって、生物学的物質中のリン酸化ＶＡＳＰ、特にホスホセ
リン１５７ＶＡＳＰおよび／またはホスホセリン２３９ＶＡＳＰを定量的に測定
するために用いることができる。
【００４３】 ＶＡＳＰのセリン２３９およびセリン１５７のリン酸化とｃＧＭＰ依存性およ
び／またはｃＡＭＰ依存性蛋白質キナーゼとの間に存在する相関関係のために、
新規抗体は、ｃＧＭＰシグナル経路およびｃＡＭＰシグナル経路の診断、特にｃ
ＧＭＰシグナル経路の診断のための薬剤としての使用にも適する。
【００４４】 ウェスタンブロッティング技術および免疫蛍光法を用いて生物学的物質中のホ
スホセリン２３９ＶＡＳＰを測定するための新規抗体の使用は、ｃＧＭＰを増大
させる物質、ホルモンまたは薬剤を検出する診断方法の開発を可能にする。挙げ
ることのできる例は、ＡＮＦ、グアニリン、ＮＯ−放出物質または薬剤である。
例えば、ＮＯ供与体のコースの制御および治療が監視でき、特に進行しうる硝酸
耐性現象についての情報を提供する。
【００４５】 ＶＡＳＰのセリン１５７のリン酸化とｃＡＭＰ依存性蛋白質キナーゼの活性と
の間にある相関関係のため、新規抗体は、ｃＡＭＰを増大させる物質、ホルモン
または薬物を診断する薬剤としても使用することができる。 故に、本発明は、診断および／または治療における新規抗体又はその断片の使
用にも関する。 新規診断方法は、研究室において人体の外（生体外）で実施することができる
方法である。
【００４６】 新規抗体は、異なる種に由来する生物学的物質中のＶＡＳＰのリン酸化の程度
を測定するために使用することができる。述べうる例は、ヒト、ラット、マウス
、ウサギ、イヌ、ブタまたはサルである。新規抗体を、ヒト、ラット、マウスま
たはイヌからの生物学的物質中のリン酸化ＶＡＳＰを測定するために使用するの
が好ましい。新規抗体を、ヒトの生物学的物質中のリン酸化ＶＡＳＰを測定する
ために使用するのが特に好ましい。
【００４７】 新規抗体またはその断片はまた、バイオセンサーにおいて用いることができる
。バイオセンサーは、それ自体当業者に知られている。抗体、レクチンまたは受
容体などの第２特異的結合パートナーを用いる方法が特に好ましい。この場合に
おいて検出および定量するために、特異的結合パートナーの１つに検出可能な標
識を行うことができる。これらの標識はそれ自体当業者に知られており、例えば
発色団、発光団、蛍光団、酵素、放射性アイソトープまたは着色もしくは無着色
粒子とすることができる。未標識の特異的結合パートナーを直接的または間接的
に、例えば別の抗体またはビオチン／アビジン架橋によって、それ自体当業者に
知られた方法を用いて固相に結合させる方法が好ましい。
【００４８】 新規抗体またはその断片は、当業者に知られた方法によって放射線標識して、
イムノシンチグラフィまたは免疫療法に使用することができる。また、これらの
モノクローナル抗体は、活性化合物のキャリアとして用いて内皮機能不全に起因
する疾患の治療に使用することができる。 Ｍａｂ １６Ｃ２のＶ遺伝子の全ヌクレオチド配列の分析に続いて、例えば超 可変領域をヒトＭａｂ骨格に挿入することによって抗体構築物を作製することが
技術的に可能である（Jones等, Nature 321, 522-525, 1986年；Verhoyen等, Sc
ience 239, 1534-1536, 1988年）。
【００４９】 適当ならば、例えば当業者に知られた方法を用いて固定された全血試料におい
てフローサイトメトリーを実施することによって、血小板中の抗原に結合した抗
体を抗体を定量するのが好ましい。フローサイトメトリーの方法は当業者に知ら
れており、例えばG. Otten and W.M. Yokoyama (1992年), “Flow cytometry an
alysis using the Becton Dickinson FACScan", Current Protocols in Immunol
ogy, 5.4.1-5.4.19に記載されるように実施することができる。
【００５０】 新規抗体を使用する、ＶＡＳＰのリン酸化、特にＶＡＳＰセリン２３９のリン
酸化のフローサイトメトリー分析はヒト血小板に限定されるものではなく、リン
パ球、単球、白血球、内皮細胞および平滑筋細胞などの他のタイプの細胞におい
ても実施することができる。
【００５１】 フローサイトメトリーを使用して、新たに採取したヒト血小板において新規抗
体を用いてＶＡＳＰ、特にホスホセリン２３９ＶＡＳＰのリン酸化を測定するこ
とは、ＮＯおよびプロスタサイクリンなどの内皮因子のインビボ活性を生体外で
測定することを可能にし、その結果、例えば動脈硬化、高血圧、糖尿病、心不全
および腎不全などの心臓血管の疾患において観察されるような内皮の機能または
内皮の機能不全を評価することを可能にする。
【００５２】 新規抗体を用いることによってＶＡＳＰのリン酸化、特にＶＡＳＰセリン２３
９のリン酸化を測定することは、上述した疾患の治療の制御を可能にする。硝酸
許容性などの治療に対する抵抗性の進行もまた測定することができる。 新規抗体はまた、生物学的物質中においてＶＡＳＰのリン酸化状態および／ま
たはその蛋白質との相互作用に効果を示す治療薬として用いることができる。 従って、本発明は、少なくとも１つの新規抗体を含む医薬製剤に関する。
【００５３】 新規製剤は、腸内（経口）、非経口（静脈）、直腸または局所（局所）で用い
ることができる。これらは、溶液、粉末（錠剤またはマイクロカプセルを包含す
るカプセル）、リポソーム製剤、脂質複合体、コロイド状分散体、注射溶液また
は坐剤の形態で投与することができる。医薬上慣用な液体または固体充填剤およ
び増量剤、溶媒、乳化剤、滑剤、矯味薬、色素および／または緩衝物質がこの種
の製剤化に適する補助的物質である。常用量として０.１〜１００mgを体重kg当 たり投与する。これらは、適当には少なくとも新規抗体の有効な日用量、例えば
３０〜３０００mgを含む投与単位において投与される。
【００５４】 投与される日用量は、体重、年齢、性別および被検哺乳類の状態に依存する。
しかし、より高いまたはより低い日用量を指示してもよい。日用量は、一回につ
き、単一回の投与単位の形態または幾つかのより少量の投与単位の形態で投与す
るか、あるいは予め決められた間隔にて小分けされた投与量の形態で複数回で投
与することができる。
【００５５】 製剤を調製するために、新規抗体を治療上不活性な有機または無機賦形剤中に
入れることができる。ラクトース、コーンスターチまたはその誘導体、獣脂およ
びステアリン酸またはその塩が、錠剤、被覆錠剤およびハードゼラチンカプセル
に対するそのような賦形剤の例である。水、ポリオール、ショ糖、転化糖および
グルコースが溶液の調製に適する賦形剤である。水、アルコール、ポリオール、
グリセロールおよび植物油が、注射液に適する賦形剤である。植物油および硬化
油、ワックス、脂肪並びに半固体ポリオールは、坐剤に適する賦形剤である。医
薬製剤はまた、防腐剤、溶媒、安定剤、湿潤剤、乳化剤、甘味料、色素、香料、
浸透圧を変化させる塩、緩衝剤、被覆剤、酸化防止剤、および適する場合、他の
治療上活性のある化合物を含むことができる。
【００５６】 本発明はまた、少なくとも１つの新規抗体が医薬上適し且つ生理学的に許容さ
れる賦形剤、適する場合には他の適する活性化合物、添加剤または補助物質と共
に適する投与形態とされている、新規医薬の製造方法に関する。 さらに本発明は、ごく一般的には、ＶＡＳＰ特にホスホセリン２３９ ＶＡＳ Ｐのリン酸化配列を特異的に認識するポリクローナル抗体、ＳＣＦｖ断片または
他の合成もしくは組換え蛋白質ドメインなどの他の特異的なプローブを用いるこ
とよって、ＶＡＳＰのリン酸化、好ましくはＶＡＳＰのセリン２３９のリン酸化
を測定する診断方法に関する。
【００５７】 さらに本発明は、リン酸化されたセリン１５７および／またはトレオニン２７
８を含むＶＡＳＰの配列を特異的に認識する、モノクローナル抗体、ポリクロー
ナル抗体、ＳＣＦｖ断片または他の合成もしくは組換え蛋白質ドメインなどの特
異的なプローブを用いることよって、ＶＡＳＰのセリン１５７のリン酸化および
／またはトレオニン２７８のリン酸化を測定する診断方法に関する。
【００５８】 ジキシン［zyxin］およびビンクリン［vinculin］などのプロリンに富むペプ チドに結合し、そして同時にそれ自身のプロリンに富むアミノ酸ドメインがプロ
フィリンに結合することによって、アダプター分子としてのＶＡＳＰが作用する
ようになり、ＶＡＳＰは繊維状アクチンを形成させ得る。この蛋白質／蛋白質相
互作用の障害は、不完全な血小板凝結または血管収縮を導き得る。従って、アク
チン／ミオシン架橋の形成は、例えば平滑筋細胞の収縮において必須条件である
。セリン１５７位におけるＶＡＳＰのリン酸化がフィブリノーゲン受容体糖蛋白
質IIb/IIIaの阻害と相関することが見出されている（Horstrup等, Eur. J. Bioc
hem., 225, 21-27, 1994年）。故に、セリン１５７位におけるＶＡＳＰのリン酸
化の測定は、ＶＡＳＰとその細胞内結合パートナーとの相互作用に働き、そして
例えば血管の損傷に関連する血管疾患の治療に適する物質または薬物の体系的な
検索を可能にする。
【００５９】 特に好ましい態様を実施例に記載する。 下記の実施例は本発明を明確にするためのものであり、いずれにしても本発明
を制限するものではない。
【００６０】
【実施例】
実施例１ ホスホセリン２３９ＶＡＳＰに対するモノクローナル抗体の単離 各々、セリン２３９の周辺のペプチド配列ＫＬＲＫＶＳ239ＫＱまたはＲＫＶ Ｓ239ＫＱＥを含むリン酸化ペプチドおよび非リン酸化ペプチドを、当業者に知 られたＦｍｏｃ化学に従ってApplied Biosystems社製ペプチドシンセサイザー（
モデル ４３１Ａ）を用いて合成した。 リン酸化ペプチド中のホスホセリンは、ペプチド合成中にCalbiochemからのＦ
ｍｏｃセリン［ＰＯ(Ｏｂｚｌ)ＯＨ−ＯＨ］を用いて導入した。ＭＳ確認したペ
プチドをＲＰＣおよびＶＹＤＡＣ ２１８ＴＰカラムを用いて精製した（純度＞ ９８％）。
【００６１】 ブロモ酢酸またはブロモ酢酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Sigm
a）を用いて活性化した後に、この方法で調製したペプチドをチオール化ＫＬＨ （keyhole limpet hemocyanin, nanoTools）に結合させた。雌Balb／ｃマウス（
６週齢）を、第１回目の注射では完全なFreundのアジュバンドを、続く３回の注
射では不完全なアジュバンドを含有するＫＬＨ−ホスホペプチド（１０μｇ／マ
ウス）を用いて、１４日間隔で４回皮下注射で免疫化した。次いで、マウス（２
週間後）を連続して３日間、ＰＢＳ（リン酸塩緩衝食塩水）中の１０μｇの免疫
源の追加免疫注射に供した。最後の追加免疫注射の１日後、マウスを屠殺して脾
臓を取り出した。脾臓細胞を単離し、確立されているKohler／Milstein方法論を
用いて、非産生ミエローマ細胞（例えば、PAI-Zellen, J.W. Stocker等. (1982 年) Res. Disclosure, 21713）と融合させた。リン酸化／非リン酸化ペプチドを
リン酸化／非リン酸化組換えヒトＶＡＳＰと同様に用いるデファレンシャルスク
リーニング法を使用して、ホスホセリン２３９ＶＡＳＰに対する抗体を分泌する
能力につきハイブリドーマ細胞を試験した。
【００６２】 リン酸化／非リン酸化ペプチドを使用する試験について、これらペプチドをDN
A-BIND-ELISAプレート（Costar社製）に共有結合させ、ELISA法を用いて、ハイ ブリドーマの上清をスクリーニングした。 ホスホペプチドを認識する上清を、完全にリン酸化された組換え（E．coli系 ）ヒトＶＡＳＰを認識するが、脱リン酸化ＶＡＳＰを認識しない能力について、
さらに試験した。 上述の方法によって陽性と同定されたハイブリドーマ細胞の上清からのモノク
ローナル抗体を、親チオ酸吸着クロマトグラフィー（POROS 50-OH，nanoTools）
によって血清を含まないハイブリドーマ細胞培養物から精製するのが好ましい。
【００６３】 別の試験方法を用いて、ＶＡＳＰがセリン２３９位においてリン酸化された場
合にこの蛋白質のみを認識するマウスＩｇＧ１ｋクラスのモノクローナル抗体と
して単離した抗体の１つを（クローン １６Ｃ２）を同定し、特徴付けることが できた。抗体１６Ｃ２は、使用した条件下では他の蛋白質および他のＶＡＳＰリ
ン酸化位置を認識しない。 それぞれ抗原として、ＶＡＳＰ蛋白質のセリン１５７またはトレオニン２７８
周辺の公知のペプチド配列を含むリン酸化ペプチドを使用することによって、上
述のものと類似する方法において、ホスホセリン１５７ＶＡＳＰまたはホスホト
レオニン２７８ＶＡＳＰを特異的に認識するモノクローナル抗体を単離すること
ができる。 Ｓｅｒ２３９位においてリン酸化されたＶＡＳＰを認識するモノクローナル抗
体の作成はまた、Smolenski等, J. Biol. Chem., 237, 32, 20029-20035 (1998 年)に記載されている。
【００６４】 実施例２ ＶＡＳＰセリン２３９リン酸化のフローサイトメトリー分析 洗浄ヒト血小板におけるＶＡＳＰセリン２３９リン酸化の分析 ヒト血小板を調製し、記載（Eigenthaler等, Eur. J. Biochem., 205, 471-48
1, 1992年）のように、血管作用物質とインキュベーションすることによってＶ ＡＳＰリン酸化を刺激した。この反応は、最終濃度約３.５％のホルムアルデヒ ドで室温で１０分間固定することによって停止させる。洗浄処理（随意）後、細
胞をトリトンＸ−１００を用いて浸透化させ、次いで洗浄した。直接蛍光標識し
たかまたは蛍光標識した第２抗体を用いて着色した適当な抗体とインキュベーシ
ョンすることによって染色を行った。この目的について１ml当たり、適当には０
.５〜５μｇ、好ましくは１〜２μｇの第１抗体を使用する。例えばＭａｂ １６
Ｃ２を第１抗体として使用する場合、０.７μｇ／mlが適する。次いで、例えばB
ecton Dickinson FACScan（Current Protocols in Immunology, 5.4.1-5.4.19）
を使用したG．OttenとW.M．Yokoyama（1992年）に記載されるように、抗体１６ Ｃ２の結合をフローサイトメトリーにおいて測定し、且つ分析した。
【００６５】 実施例３ ウェスタンブロッティングを用いた細胞抽出物中のＶＡＳＰセリン２３９リン酸
化の測定 フローサイトメトリー（実施例２）と平行して、ウェスタンブロッティングを
用いて、当業者に知られ、例えばEigenthaler等（Eur. J. Biochem., 205, 471-
481, 1992年）に記載の方法によって細胞抽出物中のＶＡＳＰのリン酸化を測定 した。使用した抗体の濃度は、測定すべき試料中のＶＡＳＰの濃度に依存するが
、適当には０.１〜５μｇ／ml、好ましくは０.５〜１.０μｇ／mlの範囲である 。例えば、ヒト血小板およびラット血小板については０.５μｇ／mlの抗体を使 用するのが有利であるが、ヒト臍帯内皮細胞については１.０μｇ／mlの抗体を 使用するのが有利である。原則的には、ウェスタンブロッティング分析による細
胞抽出物中の、そしてフローサイトメトリーによる固定した細胞のＶＡＳＰセリ
ン２３９リン酸化の分析では同じ結果が得られた。
【００６６】 実施例４ 全血または血小板に富む血しょう（ＰＲＰ）中におけるＶＡＳＰセリン２３９リ
ン酸化の分析 全血またはＰＲＰを血管作用物質とインキュベートし、最終濃度約３.５％の ホルムアルデヒドを用いて室温で１０分間固定することによってインキュベーシ
ョンを停止させた。ＰＲＰは、Eigenthaler等（Eur. J. Biochem., 205, 471-48
1, 1992年）に記載されるようにして全血から調製する。ＰＲＰ中の血小板を遠 心分離によってペレット化して、生理学的緩衝液（上述のEigenthaler等、1992 年を参照）中に再懸濁させる。血小板を透過処理し、次いで洗浄血小板について
上述したように染色する。
【００６７】 実施例５ ニトロプルシドナトリウム（ＳＮＰ）処理後の洗浄ヒト血小板中におけるＶＡＳ
Ｐセリン２３９のリン酸化刺激の時間経過 ヒト血小板を１００μＭ ＳＮＰで処理した。細胞試料を０、１、３および５ 分にて回収した。抗体１６Ｃ２を用いて、平行して、回収した細胞試料の抽出物
のウェスタンブロット分析、および上述のように固定し、そして浸透化させたヒ
ト血小板におけるフローサイトメトリー測定によってＶＡＳＰセリン２３９のリ
ン酸化を測定した。ＮＩＨゲル−ブロッティング イメージ１.６ ソフトウェア を使用して、ウェスタンブロットのオートラジオグラムを定量分析した。抗体１
６Ｃ２／ホスホセリン２３９ＶＡＳＰ結合における増加（％増加（５分値＝最大
効果＝１００％））を表１に示す。
【００６８】
【表１】
【００６９】 実施例６ 抗体１６Ｃ２を使用した、ｃＡＭＰ依存性蛋白質キナーゼまたはｃＧＭＰ依存性
蛋白質キナーゼによる組換えＶＡＳＰのリン酸化の分析 精製した組換えヘキサヒスチジン標識ＶＡＳＰ（２５μｇ／ml）を、精製した
ｃＡＭＰ蛋白質キナーゼ（ｃＡＰＫ）の触媒サブユニット（１１μｇ／ml）また
は精製したｃＧＭＰ蛋白質キナーゼ（ｃＧＰＫ；２４μｇ／ml）によってリン酸
化した。アリコートを所定の時間において反応混合物から取り出し、即座にＳＤ
Ｓ含有停止溶液と混合し、煮沸し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画した。ＶＡＳ
Ｐのリン酸化を、クマシーブルー染色、およびポリクローナルＶＡＳＰ抗体（M4
, Halbrugge M.等，J. Biol. Chem. 265, 3088-3093 (1990年)，Alexis Corpora
tion，Alte Hauensteinstraβe 4, CH-4448 Laufelfingen, Switzerlandから入 手可能）またはモノクローナルＶＡＳＰ抗体１６Ｃ２のいずれかを用いたウェス
タンブロッティングによって分析した。クマシーブルー染色におけるＶＡＳＰの
下のバンドはｃＡＰＫであり、ＶＡＳＰの上方はｃＧＭＰ−ＰＫである。実施し
たＳＤＳ−ＰＡＧＥは、セリン１５７のリン酸化による４６kDaから５０kDaへの
ＶＡＳＰの移動度における変化を示しており、セリン１５７のリン酸化にはｃＡ
ＰＫが好ましい。セリン２３９のリン酸化（１６Ｃ２抗体によって検出）はｃＧ
ＭＰ−ＰＫによるのが好ましい。
【００７０】 実施例７ 種々のリン酸化変異体を含有するＰｔｋ２細胞における、トランスフェクション
したＶＡＳＰのリン酸化の分析 トランスフェクションしたヒトＶＡＳＰおよびＶＡＳＰ変異体のリン酸化をＰ
ｔｋ２細胞において調査した。野生型ＶＡＳＰおよび各々突然変異（不活化）さ
せたリン酸化部位（セリン１５７，セリン２３８またはトレオニン２７７の変更
）を含有するＶＡＳＰ変異体を、ヒトｃＧＭＰ蛋白質キナーゼ１βと共にＰｔｋ
２細胞にトランスフェクションし、そしてＣＭＶプロモーターの制御下で発現さ
せた。Ｐｔｋ２細胞は、内在性ＶＡＳＰおよびｃＧＭＰ蛋白質キナーゼを非常に
わずかしか止めていない。トランスフェクションの２日後、細胞を３０μＭ ８ ｐＣＰＴ−ｃＧＭＰと共に３０分間インキュベーションして、細胞抽出物を単離
した。次にこれらの細胞抽出物中におけるＶＡＳＰのリン酸化をポリクローナル
抗体Ｍ４およびモノクローナル抗体１６Ｃ２を用いるウェスタンブロットによっ
て調査した。４６kDaから５０kDaへのＶＡＳＰのリン酸化依存性の変化は、セリ
ン１５７を不活化した場合（変異体Ｓ１５７Ａ）には存在しなかった。抗体１６
Ｃ２によって認識されるシグナルは、セリン２３９を不活化した場合（変異体Ｓ
２３９Ａ）には存在しなかった。これらの分析において、トレオニン２７７の変
異体は、野生型ＶＡＳＰと同様な挙動を示した。
【００７１】 実施例８ 種々の血管拡張剤およびｃＡＭＰ／ｃＧＭＰアナログで刺激した後のヒト血小板
におけるＶＡＳＰのリン酸化の分析 洗浄したヒト血小板（０.７×１０９個細胞／ml）を１μＭ Ｐｇ−Ｉ2（プロ スタサイクリン）、０.５mM ５,６−ＤＣＩ−ｃＢＩＭＰＳ（細胞膜浸透性ｃＡ ＭＰアナログ）、１０μＭ ＳＮＰ（ニトロプルシドナトリウム）または１mM ８
ｐＣＰＴｃＧＭＰ（細胞膜浸透性ｃＧＭＰアナログ）とインキュベートした。ア
リコート（２.８×１０7個細胞）を所定の時間後に取り出し、ＳＤＳ停止溶液と
混合し、煮沸し、次いでＶＡＳＰリン酸化についてウェスタンブロット法を用い
て調査した。ポリクローナル抗体Ｍ４またはモノクローナル抗体１６Ｃ２を用い
て分析を実施した。セリン１５７リン酸化は、４６kDaから５０kDaへのＶＡＳＰ
のシフトによって定量し、セリン２３９リン酸化は１６Ｃ２抗体によって与えら
れるシグナルによって定量した。
【００７２】 実施例９ ラット血小板中におけるＶＡＳＰのリン酸化 ラット血小板（０.７×１０9個細胞）を１００μＭニトロプルシドナトリウム
（ＳＮＰ）、１０μＭプロスタグランジンＥ１（ＰｇＥ１）またはこれらのいず
れかを添加せずに５分間インキュベートした。これらラット血小板の抽出物をウ
ェスタンブロッティングによって分析した。ブロットは、４６kDaから５０kDaへ
のＶＡＳＰのリン酸化依存性シフト（セリン１５７リン酸化）および１６Ｃ２抗
体によって与えられるリン酸化依存性シグナル（セリン２３９リン酸化）もまた
ラット血小板中において起こることを示した。同様な結果は、マウス血小板を用
いても得られる。
【００７３】 実施例１０ ヒト血小板において実施したＶＡＳＰおよびホスホ−ＶＡＳＰの免疫蛍光調査 ヒト血小板（血小板に富む血しょう中，ＰＲＰ）をガラススライド上に置き、
押さえつけ、そして４５分間拡げた。次にこれらの血小板をガラススライド上で
、１００μＭ ８ｐＣＰＴｃＧＭＰ無しに（ＡおよびＣ）またはこれと共に（Ｂ およびＤ）１５分間インキュベートした。次いで細胞を直ぐに４％パラホルムア
ルデヒドで固定し、０.２％トリトンＸ−１００で浸透化させた。これらをポリ クローナル抗体Ｍ４（１：１００）またはモノクローナル抗体１６Ｃ２とインキ
ュベートし、次いで通常の第２抗体とインキュベートした。写真は１６Ｃ２抗体
を用いた場合におけるリン酸化依存性シグナルの出現を示すのに対して、ポリク
ローナル抗体Ｍ４を用いたシグナル（免疫蛍光法において、分別されていないた
めに、４６kDaおよび５０kDa ＶＡＳＰの合計）は、リン酸化−非依存性である 。
【００７４】
【表２】
【００７５】
【表３】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 9/10 Ａ６１Ｐ 9/10 １０１ １０１ 9/12 9/12 13/12 13/12 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 15/02 33/68 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 33/68 15/00 Ｃ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＲ，Ｈ Ｕ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 ウルリヒ・ヴァルター ドイツ連邦共和国デー−97209ファイトス ヘーヒハイム．ライヒトアカーシュトラー セ６

Claims (24)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＶＡＳＰ（血管拡張剤−刺激リン蛋白質）がリン酸化形態で
    存在する場合に抗原としてＶＡＳＰのみと結合する、ＶＡＳＰに対する抗体。
  2. 【請求項２】 生物学的物質中のＶＡＳＰのリン酸化状態を測定するために
    使用され得る、請求項１記載の抗体。
  3. 【請求項３】 生物学的物質中のＶＡＳＰのリン酸化を定量的に測定し得る
    、請求項１または２記載の抗体。
  4. 【請求項４】 ＶＡＳＰがセリン２３９位においてリン酸化されている（ホ
    スホセリン２３９ＶＡＳＰ）場合に抗原としてＶＡＳＰのみと結合する、請求項
    １〜３のいずれか一項に記載の抗体。
  5. 【請求項５】 ＶＡＳＰがセリン１５７位においてリン酸化されている（ホ
    スホセリン１５７ＶＡＳＰ）場合に抗原としてＶＡＳＰのみと結合する、請求項
    １〜３のいずれか一項に記載の抗体。
  6. 【請求項６】 ウェスタンブロッティング法に使用し得る、請求項１〜５の
    いずれか一項に記載の抗体。
  7. 【請求項７】 フローサイトメトリーに使用し得る、請求項１〜５のいずれ
    か一項に記載の抗体。
  8. 【請求項８】 ポリクローナル抗体である、請求項１〜７のいずれか一項に
    記載の抗体。
  9. 【請求項９】 モノクローナル抗体（Ｍａｂ）またはその断片である、請求
    項１〜７のいずれか一項に記載の抗体。
  10. 【請求項１０】 ハイブリドーマ細胞株１６Ｃ２により産生される、請求項
    ９記載のモノクローナル抗体。
  11. 【請求項１１】 Ｍａｂ １６Ｃ２である、請求項９または１０記載のモノ クローナル抗体。
  12. 【請求項１２】 請求項９〜１１のいずれか一項に記載のモノクローナル抗
    体を産生するハイブリドーマ細胞株。
  13. 【請求項１３】 モノクローナル抗体１６Ｃ２を産生するハイブリドーマ細
    胞株１６Ｃ２（ＤＳＭ ＡＣＣ２３３０）。
  14. 【請求項１４】 治療薬としての請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗
    体の使用。
  15. 【請求項１５】 診断薬としての請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗
    体の使用。
  16. 【請求項１６】 生物学的物質中のＶＡＳＰのリン酸化を定性的または定量
    的に測定する、請求項１５記載の抗体の使用。
  17. 【請求項１７】 生物学的物質中のホスホセリン２３９ＶＡＳＰまたはホス
    ホセリン１５７ＶＡＳＰを定性的および／または定量的に測定する、請求項１５
    に記載の抗体の使用。
  18. 【請求項１８】 生物学的物質がヒト血小板またはヒト全血である、請求項
    １５〜１７のいずれか一項に記載の抗体の使用。
  19. 【請求項１９】 生物学的物質中においてｃＧＭＰおよび／またはｃＡＭＰ
    の濃度に作用する物質を検出する、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の抗
    体の使用。
  20. 【請求項２０】 内皮因子のインビボ活性を測定する、請求項１５〜１９の
    いずれか一項に記載の抗体の使用。
  21. 【請求項２１】 内皮の機能障害を検出する、請求項１５〜２０のいずれか
    一項に記載の抗体の使用。
  22. 【請求項２２】 ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体またはそれらの
    断片を使用して、生物学的物質中のＶＡＳＰのリン酸化状態および／または蛋白
    質相互作用を測定するかまたは促すことからなる、診断または治療方法。
  23. 【請求項２３】 請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体を使用するこ
    とからなる、生物学的物質中において、セリン１５７位、セリン２３９位および
    トレオニン２７８位の少なくとも一つにおいてリン酸化されているＶＡＳＰを定
    性的および／または定量的に検出する診断方法。
  24. 【請求項２４】 ＶＡＳＰがセリン２３９位にてリン酸化されている（ホス
    ホセリン２３９ＶＡＳＰ）、請求項２３記載の診断方法。
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