CZ299889B6 - Protilátka proti fosforylovanému VASP (fosfoprotein stimulovaný vazodilátorem), hybridomové bunky pro její prípravu a použití této protilátky jako diagnostického cinidla - Google Patents

Protilátka proti fosforylovanému VASP (fosfoprotein stimulovaný vazodilátorem), hybridomové bunky pro její prípravu a použití této protilátky jako diagnostického cinidla Download PDF

Info

Publication number
CZ299889B6
CZ299889B6 CZ20001684A CZ20001684A CZ299889B6 CZ 299889 B6 CZ299889 B6 CZ 299889B6 CZ 20001684 A CZ20001684 A CZ 20001684A CZ 20001684 A CZ20001684 A CZ 20001684A CZ 299889 B6 CZ299889 B6 CZ 299889B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
vasp
antibody
antibodies
phosphorylated
fragments
Prior art date
Application number
CZ20001684A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ20001684A3 (cs
Inventor
Eigenthaler@Martin
Hoschützky@Heinz
Walter@Ulrich
Original Assignee
Vasopharm Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE19749091A external-priority patent/DE19749091C1/de
Application filed by Vasopharm Gmbh filed Critical Vasopharm Gmbh
Publication of CZ20001684A3 publication Critical patent/CZ20001684A3/cs
Publication of CZ299889B6 publication Critical patent/CZ299889B6/cs

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5064—Endothelial cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6842—Proteomic analysis of subsets of protein mixtures with reduced complexity, e.g. membrane proteins, phosphoproteins, organelle proteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/866—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof involving immunoglobulin or antibody fragment, e.g. fab', fab, fv, fc, heavy chain or light chain

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)

Abstract

Rešení se týká protilátek proti VASP (fosfoprotein stimulovaný vazodilátorem), které se váží na VASP jako na antigen pouze tehdy, je-li VASP prítomenve fosforylované forme, a dále se týká hybridomových bunek pro prípravu protilátek a použití techtoprotilátek nebo jejich fragmentu jako diagnostického cinidla nebo prípadne léciva. Konkrétne se týká monoklonální protilátky 16C2, která je produkována hybridomovou bunecnou linií s prírustkovým císlem DSM ACC2330, a jejich fragmentu, které jsou schopné vázat vazodilátorem stimulovaný fosfoprotein (VASP) jen tehdy, když je fosforylovaný v poloze serinu 239 (fosfoserin-239-VASP).

Description

Protilátka proti fosforylovanému VASP (fos fo protein stimulovaný vazodilátorern), hvbrl· domové buňky pro její přípravu a použití této protilátky jako diagnostického činidla
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká protilátek proti fosfory lovanému VASP (vazodilátorern stimulovaný fosťoprolein), které se váží na VASP jako na antigen pouze pokud je VASP ve své fosforylované formě, dále se týká hybridomových buněk pro přípravu těchto protilátek a také použití těchto ío protilátek nebo jejich fragmentů jako diagnostického a/nebo terapeutického činidla.
Dosavadní stav techniky
Onemocnění cévního systému jsou zodpovědná za mnoho chronických a život ohrožujících nemocí jako je např. infarkt myokardu, mrtvice, arteriální okluze a mnoho forem selhání ledvin.
Endoletové buňky, které kromě jiného ovlivňují krevní koagulační systém, funkční stav tromboevtů, migraci zánětových a nádorových buněk do cévní steny, stav kontrakcí a růstu buněk hlad20 kého svalstva., a tudíž i krevní tlak, strukturu cévních stěn a také neovaskularizaci, jsou mimořádně důležité pro regulaci cévního systému, Mnohé funkce cévních stěn jsou poškozeny při vážných cévních nemocech, což je situace, vedoucí často k infarktu myokardu, mrtvici nebo k mnoha různým formám selhání ledvin.
2? Endotel vytváří důležité látky, a sice prostacyklin (PHE) a oxid dusilatý (NO), který je znám také jako uvolňující faktor pocházející z endotelu (EDRE), přičemž obě tyto látky inhibují jak trombocyly tak i svalové buňky cév. Funkce endotelu jsou kontrolovány uvedenými cndotclovými faktory jako je prostacyklin (PHE) nebo EDRE, např. NO.
so Takže aby bylo možné léčit nemoci spojené s dysfunkcí endotelu specifickým způsobem, je nezbytné nalézt takové biochemické parametry, které dovolí diagnostikovat dysfunkci endotelu a sledovat její časový průběh.
Je samozřejmě žádoucí rozpoznat dysfunkci endotelu co nejdříve jak jc to možné, tj. ve stadiu, kdy se ještě ncmanifestovala ireverzibilní poškození, jako např. aterosklerotickc leze, způsobené dysfunkcí endotelu.
Identifikace dysfunkcí endotelu v časném stadiu umožňuje vyvinout nové terapeutické přístupy, kterc mohou vést k léčení reverzibilních dysfunkcí endotelu.
Způsoby známé ke stanovení dysfunkcí endotelu in vivo jsou invazivní detekční metody, jako je např. kvantitativní angiografie, nebo neinvazivní zobrazovací metody. Nevýhodou těchto metod je, Že se vyšetření provádí přímo na pacientovi, jsou obtížné kvantifikovatelné a jsou velmi drahé.
Je tudíž také žádoucí mít k dispozici bichem icko-imunologieké metody, které umožňují stanovit funkce endotelu ry chle a jednoduše na vzorcích biologického materiálu ex vivo, např. na vzorcích krve nebo buněk rutinním laboratorním vyšetřením.
Funkce endotelu jsou takové funkce, které jsou regulovány endotelovými faktory jako jsou pro50 stacyklin (PGE) nebo EDRE, např. NO.
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález se týká činidla pro hodnocení a modulaci funkcí endotelu. Vynález poskv5 tuje protilátku, nebo její fragmenty, které jsou namířeny proti V ASP (vazodilátorem stimulovaný fosfoprotein). které se váží na V ASP jako na antigen pouze tehdy, pokud jc V ASP fosfory lován.
Vynález poskytuje protilátku, která se váže na VASP jako na antigen pouze tehdy, je-li VASP fosfory lován na šeřinu v poloze 239 (fosfoseri»-239-VASP).
io
Vynález se týká protilátky, která se váže na VASP jako na antigen pouze pokud je VASP fosforylován v poloze šeřinu 157 (fosfoserin-l 57-VASP).
K různým aspektům předkládaného vynálezu patří polyklonální protilátky, monoklonální protiis látky a také protilátkové fragmenty.
Konkrétně vynález poskytuje monoklonální protilátku produkovanou hybridomovou buněčnou linií 16C2, zejména monoklonální protilátku 16C2.
Další předmět předkládaného vynálezu poskytuje způsoby hodnocení funkce endotelu. Způsoby podle tohoto aspektu vynálezu umožňují stanovení fosfor)''lační ho stavu VASP. Podle jednoho aspektu vynálezu se biologický materiál přivede do z kontaktu s protilátkou proti VASP {vazodilátorem stimulovaný fosfoprotein), které se váží na VASP jako na antigen pouze tehdy, pokud je VASP fosfory lován.
Jiný aspekt předkládaného vynálezu poskytuje kvantitativní metodu, která zahrnuje kvantifikaci VASP protilátek, které se váží na biologický materiál. Ke specifickému provedení vynálezu patří analýza westernovým přenosem („Western blotting“), což představuje elektroforetické rozdělení VASP a pak přivedení VASP do kontaktu s protilátkou proti VASP, která se váže na VASP jen to když je VASP fosfory lovaný. Jiným provedením je analýza průtokovou cytometrií. která zahrnuje uvedení vzorku do kontaktu s protilátkou proti VASP. která se váže na VASP jen když je
VASP fosfory lovaný.
Další aspekt předkládaného vynálezu poskytuje diagnostické metody. Jedna taková metoda spo35 čivá v tom. že se vzorek přivede do kontaktu s protilátkou proti VASP, která se váže na VASP jen když je VASP fosforylovaný. V jednom provedení tato metoda obsahuje kvantitativní stanovení fosfory láce VASP ve vzorku. V jiném provedení jde o metody, kde se protilátka váže na fosfoserin-239-VASP nebo fosfoserin-l 58-V ASP. V ještě dalším provedení je vzorkem vzorek lidských trombocytů nebo vzorek úplné lidské krve.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu jsou způsoby detekce markérů funkce endotelu. Jeden aspekt vynálezu poskytuje metodu detekce látek, které ovlivňují hladinu eGMP a/nebo cAMP, přičemž tento způsob zahrnuje testování vzorku z pacienta, který byl vystaven působení látek ovlivňujících hladiny cGMP a/ncbo cAMP, a spočívá v tom, že se vzorek přivede do kon45 taktu s protilátkou proti VASP, která se váže na VASP jen když jc VASP fosforylovaný, a vyhodnotí sc fosfory lační stav VASP vztažený ke kontrolnímu vzorku.
Ještě další aspekt vynálezu poskytuje podrobně způsob detekce dysfunkce endotelu, kterýžto způsob zahrnuje přivedení vzorku z pacienta do kontaktu s protilátkou proti VASP, která sc váže na VASP jen když je VASP fosforylovaný. a vyhodnotí sc fosfory lační stav VASP vztažený ke kontrolnímu, tj. normálnímu vzorku.
Další předmět vynálezu poskytuje soupravu k provádění diagnostického způsobu podle vynálezu, fento aspekt dále poskytuje diagnostickou soupravu, která obsahuje protilátku proti VASP. která se váže na VASP jen když je VASP fosforylovaný.
. 4 .
C7. 299889 Ró
Vynález se týká léčení pacientů trpících disfunkcí endotelu. Podle tohoto předmětu vynálezu a dalších je popsána metoda léčení, kdy pacientovi, který takové léčení potřebuje, se podává terapeuticky účinné množství protilátky proti VASP, která se váže na VASP pouze je-li fosforylo5 ván.
Humánní VASP (fosfoprotein stimulovaný vazodilátorem). který je fosforylován v trombocytech a buňkách cévních stěn jako reakce na hypotenzní (vazodilatační) hormony a léčiva, byl nedávno objeven, izolován a charakterizován z hlediska molekulární genetiky (Haffner et al., EMBO J..
14, 19-27. 1995).
VASP je důležitou složkou proteinkinázové signální dráhy ANF/NO/cGMP/cGMP, která je velmi důležitá z hlediska fyziologického, patofy/iologiekého i fa rmako logického. a také cAMP/cAMP proteinkinázové signální dráhy (U. Walter, Blick 1/97, Wurzburg Univ.. str. 79-81, 1997).
VASP je exprimován téměř ve všech buňkách člověka nebo zvířat, přičemž zvláště vysoká koncentrace byla nalezena v trombocytech. buňkách hladkého svalstva cév a fibroblastcch. V buňkách buněčných kultur je výskyt VASP spojen s ohniskovými kontakty (kontaktní místa buňka/matrix), kontakty buňka/buňka, mikrotllamenty a dynamickými úseky membrány (např. tzv. vedoucí kraj membrány) (viz Walter et al., Agents and Actions 45S, 255-268, 1995).
Foslorv láce VASP v cévním systému koreluje s inhibicí adheze/agregaee tromboeytů, inhibicí kontrakce/migrace hladkého svalstva a inhibicí paracelulární permeability endotelu.
VASP jc fosfory lován a defosforylován na třech různých místech (a sice serin 157, serin 239 a threonin 278, viz Horstrup et al.. Eur. J. Biochem 225, 21-27, 1994). Serin 239 je někdy také označován serin 238, zejména pokud se do VASP nezapočítává první methionin.
Serin 239 ve VASP je fosforylován v intaktních humánních buňkách cév (trombocytech, endotelových buňkách, buňkách hladkého svalstva) v reakci na fyziologické nebo farmakologické dono50 rv NO. inhibitory tromboeytů a vazodilátory.
Fosfory láce šeřinu 239 ve VASP je zprostředkována zejména proteinkinázou závislou na cGMP, která je aktivována pomocí cGMP důležitými hormony, jako jsou např. natři u ret ické peptidy nebo přirozené látky či léčiva uvolňující NO. Fosfory láce šeřinu 239 ve VASP je zprostředková55 na navíc proteinkinázou závislou na cAMP, která je aktivována hormony a léčivy, která zvyšují cAMP.
I když protcinkinázy závislé na cAMP hlavně fosforylují serin v poloze 157, fosforyIují také serin v poloze 239 VASP. Bylo pozorováno, že VASP fosforylovaný na šeřinu 157 byl silně io korelován s inhibicí vazby fibrinogenu na glykoprotein 11b—lila v krevních destičkách člověka (Horstrup eta 1., Eur. .1. Biochem. 225, 21-27, 1994).
Stanovené stupně, do jakého je VASP fosforylován v biologickém materiálu, např. v extraktech tkání nebo v buňkách, zejména stanovení toho, zdaje VASP fosforylován v poloze 239 a/nebo poloze 159, je důležitý biochemický parametr, jehož měření umožňuje vyvinout diagnostický systém pro detekci všech hormonů nebo léčiv, zvyšujících cGMP a/nebo zvyšujících cAMP, jako jsou např. natři u ret ické faktory (ANF), guanilin a látky a léčiva uvolňující NO, a tím umožní vy vozovat závěry týkající se funkce endotelu in vivo.
Protilátky, které se specificky váži na rcverzibilně fosfory Iováné proteiny, byly popsány v patentových dokumentech US 5 599 681, WO 93/21230 a v publikaci U. Walter. Blick 1/97, Wurzburg Univ,, str. 79-81, 1997.
CZ 299889 Bó
Cílem předkládaného vynálezu bylo vyvinout biochemieké/imunologieké metody, které by dovolily kvalitativně stanovit fosfory lační stav V ASP v biologickém materiálu a/nebo provést toto stanovení kvantitativně a přitom rychlým a jednoduchým způsobem.
Tohoto cíle bylo dosaženo přípravou protilátek, které se váží na V ASP jako na antigen pouze, jeli V ASP ve fosforylované formě.
V popisu vynálezu se protilátkou rozumí jak polyklonální tak i monoklonálni protilátka (Mab) a jejich fragmenty, a také fragmenty SCFV nebo jakékoliv jiné syntetické nebo rekombinantní in proteinové domény, které specificky rozpoznávají fosfory lované úseky V ASP.
K fragmentům protilátek patří jakákoliv část protilátky, která je schopná vázat se na cílový antigen, v tomto případě na V ASP. nebo jeho specifickou část. K proti! útkovým fragmentům konkrétně patří fragmenty F(ab')2, Fab, Fab’ a Fv. Tyto fragmenty mohou být vytvořeny z protilátek jakékoliv třídy, ale typicky se tvoří z protilátek třídy lgG nebo ígM. Lze je připravit konvenčními technikami rekombinantní DNA nebo pomocí klasických metod, proteolytickým štěpením pomocí papainu nebo pepsinu. Viz Current Protocols in I mm u no logy. 2. Kapitola. Coligan et al. Ld., John Wiley and Sons. 1991-1992),
Fragmenty F(ab')2 jsou typicky velikosti přibližně 110 kDa (lgO) nebo 150 kDa (ÍgM) a obsahují dva úseky vázající antigen. spojené v kloubové oblasti disulfidickými vazbami (disultldickou vazbou). V podstatě celý, pokud ne úplně celý, úsek Fc v těchto fragmentech chybí.
Fragmenty Fab' mají typicky velikost 55 kDa (lgG) nebo 75 kDa (IgM) a mohou být vytvořeny např. redukcí disulfidických vazeb z fragmentu F(ab’)2. Výsledné volné sulťhydrylové skupiny se mohou využít ke konvenční konjugaci fragmentů Fab' s jinými molekulami, např. detekčními činidly (jako např. enzymy).
Fragmenty Fab jsou monovalentní a obvykle mají velikost přibližně 50 kDa (afjsou zjakchoko30 liv zdroje). Fragmenty' Fab obsahují lehký (L) a těžký (H) řetězec, variabilní {V, a Vn) a konstantní (C]. Čij) úseky části protilátky vázající antigen. Úseky H a Ljsou navzájem svázány intramolekulárním disulfidickým můstkem.
Fragmenty Fv jsou typicky velké 25 kDa (bez ohledu na zdroj) a obsahují variabilní úseky Ichkc35 ho a těžkého řetězce (V] a Vn). Úseky V| a Vti, jsou obvykle drženy pohromadě pouze nekovalentními interakcemi a tudíž mohou snadno disociovat. Mají však výhodu, žc mají malou velikost a přitom si uchovávají stejné vazebné vlastnosti jako větší fragmenty Fab. Tudíž byly vyvinuty metody jak zesilovat řetězce V, a VH, např. užitím glutaraldehydu (nebo jiných chemických zesiťovacích činidel), intramolckulámích disulfidických vazeb (inkorporací cysteinu) nebo peptidoio vými spojkami. Výsledný fragment Fv je nyní jednořetězcový (tj. fragment SCFv).
Výhodný způsob podle vynálezu zahrnuje vytváření SCFv rekombínantním způsobem, který dovoluje vytvářet Fv s novými specificitami mícháním a sestavováním variabilních řetězců z různých zdrojů. V typickém způsobu se vytvoří rekombinantní vektor, který obsahuje odpovída45 jící regulační prvky řídicí expresi v úseku kazety. Usek kazety obsahuje DNA, která kóduje peptidovou spojku (tzv. linker) s výhodnými místy jak na 5'konci tak i na 3'konci linkeru pro vytváření fúzních proteinů. DNA kódující požadovaný variabilní úsek (úseky) se může klonovat do vektoru, aby vytvořila fuzní proteiny s linkerem a tak poskytla SCFv.
Příkladem alternativního přistupu je způsob, kdy DNA kódující dva Fv sc ligují přímo do konvenčního expresního vektoru. SCFv DNA vytvořená kteroukoliv z těchto metod se může exprimovat v prokaryotických nebo eukaryotických buňkách, v závislosti na vybraném vektoru.
Výhodné podle vynálezu jsou monoklonálni protilátky a jejich fragmenty, které váží VASP jako antigen pouze tehdy, je-li VASP ve fosforylované formě.
-4 CZ 299889 Bó
Zvláště výhodné jsou dále monoklonální protilátky ajejich fragmenty, které se váží na VASP. nebo na peptidy obklopující sekvenci v okolí šeřinu 239 VASP, jako na antigen. a to pouze je-li serin v poloze 239 fosforylován (fosfoserin-239-VASP).
Termín VASP v popisu vynálezu označuje také deriváty VASP. tj. funkčně ekvivalentní molekuly. mutanty. fragmenty nebo varianty VASP, např. fosfoserin-239-VASP. který je navíc fosfory lován v poloze šeřinu 157 a/nebo threoninu 278, a také např. glykosylační mutanty a jiné kovalentní modifikace a strukturní elementy, které jsou důležité pro interakce typu pro10 tcin/protcin. Termín VASP ve smyslu vynálezu zahrnuje také humánní VASP a VASP z jiných biologických druhů, zejména savců jako je např. laboratorní potkan, myš, králík, pes, prase nebo opice.
Protilátky lze připravovat konvenčními způsoby, např. způsobem, který popsali Kohler a Millstein (Nátuře 256: 495. 1975). Ty picky, když je požadována selektivita založená na fosforylaěním stavu, protilátky se vytvářejí proti fosfory I o váným formám VASP. Izolované protilátky mohou být vyhledávány (sereenovány) konvenčními metodami kc zjištění selektivity. Výhodně protilátky se vytvoří proti peptidovým fragmentům VASP. které obsahují serin 157, serin 239 a/ncbo threonin 278.
Délka antigenního peptidu VASP není důležitá, pokud je schopen vyvolat humorální imunitní reakci. Typické antigenní peptidy jsou zpravidla kratší než přibližně 50 aminokyselin, Některé výhodné peptidy jsou kratší než 20 aminokyselin. Nejvýhodnější peptidy jsou dlouhé 6 až 12 aminokyselin. K výhodným peptidům patří KLRKVS239KQ nebo RKVS;?íKQb. Výhodně je peptid fosforylován na šeřinu 157. šeřinu 239 a/nebo threoninu 278. Peptidy mohou být získány rekombinanlním způsobem. Typicky se připravují buďto proteolytickou degradací VASP nebo syntézou in vitro a fosforylací.
Dále jsou výhodné monoklonální protilátky, které vykazují výše uvedené vlastnosti a které
3n mohou byl využity v průtokové eytometrii. To vyžaduje, aby se specifičnost nových protilátek podle vynálezu zachovala, i když je antigen vystaven podmínkám, které mohou změnit konformaci antigenu, což se dá očekávat při krocích fixace, které jsou obvyklé při průtokové cytometrií. Nové protilátky mohou být např. zkoumány, zda jsou vhodné pro použití v průtokové eytometrii jednoduše tak, žc se otestují.
5
Zvláště výhodná je monoklonální protilátka I6C2.
Nové protilátky mohou hýl připraveny metodami, které samy o sobě jsou odborníkovi známé. Jako zvláště vhodný způsob přípravy monoklonálních protilátek lze např. uvést zejména přípravu hybr i domových buněk způsobem, který popsali Kohler a Milstein (Nátuře, 256, 495. 1975). Specifičnost purifikovanych protilátek lze pak testovat, např. pomocí následujících metod:
a) Westernový přenos („Western blotting) s užitím rekombinantního VASP fosforylovaného proteinkinázou závislou na cAMP nebo cGMP v odlišném rozsahu, kdy se musí vyskytovat pozi45 tivní signál pouze v případě fosforylované VASP.
b) Westernový přenos s užitím buněčných extraktů, např. z buněk Pkt2. které byly transfekovánv lidským VASP nebo VASP, který' byl mutován různými způsoby, a kde v každém případě bylo mutováno jedno ze třech fosforylačních míst ((S157A)VASP, (S239A)VASP a (T278A)VASP)),
5(i a tím bylo eliminováno, a v každém případe humánní eGMP proteinkinázou. Ty protilátky jsou vhodné, kde pozitivní signál na westernovém přenosu je eliminován mutací S239A, ale nikoliv ostatními dvěma mutacemi.
e) Westernový přenos s užitím humánních trombocytů. kleré byly ošetřeny různými vazodilátory 55 (jako je např. prostacyklin nebo donory NO), aktivátory cAMP protcinkinázy nebo cGMP pro- s CZ 299889 B6 teinkinázy, Protilátka jc vhodná Jestliže se detekuje specifický pás pouze v extraktech s fosfory lo váným V ASP. Protilátky lze vyhledávat analogickým způsobem, když se užijí humánní fibroblasty nebo tromboeyty potkana nebo myši.
d) [munofluoreseenční vyšetření pomocí fixovaných humánních trombocytů a endotelových buněk. Pozitivní signál je pozorován Jestliže V ASP je přítomen ve fosforylované formě.
Předkládaný vynález se dále týká hybridomových buněčných linií, které produkují nové monoklonální protilátky, přičemž zvláště výhodná je linie hybridomových buněk 16C2, které produi(i kují monoklonální protilátku 16C2.
llybridomová buněčná linie 16C2, která produkuje monoklonální protilátku 16C2, byla uložena v německé sbírce mikroorganismů a buněčných kultur (Deutsche Sammlung von Mikkroorganismen und Zelikulturen), Maschcrodcr Weg lb. D—38124 Braunschweig. Německo, v souladu s
Budapešťskou dohodou, a sice dne 6. listopadu 1997 jako položka č. DSM ACC2330.
Nové protilátky podle vynálezu jsou vhodné ke kvalitativnímu a/nebo kvantitativnímu, výhodně kvalitativnímu stanovení jak fosfory lace VASP, ke které dochází v podmínkách in vitro, lak také fosforylace v podmínkách in vivo, výhodně ke stanovení fosforylace VASP na šeřinu 239 a/nebo šeřinu 157. zvláště výhodně pro stanovení fosforylace na šeřinu 239 VASP.
Kvantitativní způsoby stanovení protilátek jsou v oboru dobře známy a lze je najít např. v publikaci Current Protocols in i mm u no logy (viz výše). K těmto metodám patří test s enzymem vázaným na imunoabsorbenl (ELISA), radioimunotest (RlA) a pod.
Nové protilátky podle vynálezu jsou dále vhodné ke kvalitativnímu a/nebo kvantitativnímu stanovení. výhodně kvantitativnímu, fosforylace VASP, výhodně fosfoserinu 239 VASP a/nebo fosfoserinu 157 VASP, zvláště výhodně fosfoserinu 239 VASP, v biologickém materiálu.
K biologickému materiálu ve smyslu vynálezu patří např. buněčné extrakty, tkáňové extrakty; tkáňové řezy a buněčné preparáty, tkáně a buňky, jako jsou tromboeyty, leukocyty. endotelové buňky, buňky hladkého svalstva a fibroblasty. Biologický materiál může pocházet z člověka nebo také z jiných savců jako jsou potkan, myš, králík, pes, prase nebo opice. Výhodně biologický materiál pochází z člověka.
Nové protilátky se mohou využít ke kvantitativnímu stanovení fosforylovaného VASP, zvláště fosfoserin 157 VASP a/nebo fosfoserin 239 VASP/ v biologickém materiálu, a sice kvantitativním vyhodnocením autoradiogramů z westernového přenosu způsobem odborníkovi známým, např, pomocí programového vybavení ..NIH gel blotting Image 1,6“ a nebo pomocí imunoťluorio esccnee.
Díky korelaci, která existuje mezi ťosforylaei šeřinu 239 a šeřinu 157 VASP a aktivitou proteinkináz závislých na cGMP a/nebo cAMP, nové protilátky jsou také vhodné k použití jako činidla pro diagnostiku signálních drah cGMP a cAMP, zejména pro diagnostiku signální dráhy cGMP.
Použití nových protilátek ke stanovení fosfoserinu 239 VASP v biologickém materiálu pomocí westernového přenosu a imunofluorescence umožňuje také vyvinout diagnostické metody pro detekci látek, hormonů nebo léčiv zvyšujících cGMP. K příkladům, které lze zmínit, patří: ΑΝΓ, guanilin, látky nebo léčiva uvolňující NO. lak např. kontrola průběhu terapie donory NO může
5(i být monitorována, což kromě jiného poskytuje informaci o jakémkoliv výskytu tolerance nitrátu, která sc může vyvinout.
Vzhledem k existující korelaci mezi fosfory lácí šeřinu 157 VASP a aktivitou proteinkináz závislých na cAMP se nové protilátky mohou využít jako činidla pro diagnostiku látek, hormonů nebo léčiv zvyšujících cAMP.
-6CZ 299889 Bó
Předkládaný vynález se tudíž také týká použití nových protilátek nebo jejich fragmentů v diagnostice a/nebo terapii.
Nové diagnostické způsoby jsou takové způsoby, které se mohou provádět v laboratoři, tj. mimo tělo pacienta (tedy ex vivo}.
Nové protilátky podle vynálezu se mohou užít ke stanovení stupně fosfory laec V ASP v biologickém materiálu, který pochází z různých biologických druhů. K příkladům patří člověk, laboratorio ní potkan, myš, králík, pes, prase a opice. Výhodně se nové protilátky mohou užít ke stanovení stupně fosforvlace VASP v biologickém materiálu, který1 pochází z člověka, potkana, myši nebo psa. Zvláště výhodné je použití protilátky podle vynálezu ke stanovení stupně fosfory láce VASP v biologickém materiálu z člověka.
i? Nové protilátky podle vynálezu nebo jejich fragmenty se mohou užít také jako biosenzory. Biosenzory samy o sobě jsou odborníkovi známy. Zvláště výhodná je metoda, kdy se užívá druhy specifický vazebný partner, jako je protilátka, lektin nebo receptor. Pro detekci a kvantifikaci v tomto případě, jeden ze specifických vazebných partnerů nese dctekovatclnou značku. Tyto značky jsou odborníkovi známe a může to být např. chromofor, luminofor, fluorofor, enzym, radioaktivní izotop nebo barevná či bezbarvá částice. Výhodný je způsob, kdy se neoznačený, specifický vazebný partner konjuguje přímo nebo nepřímo, např. pomocí jiné protilátky nebo můstku biotin/avidin, na pevnou fázi způsobem, který je odborníkovi známý.
Nové protilátky nebo jejich fragmenty mohou být radioaktivně značeny způsoby, které jsou odborníkovi známy, takže pak mohou být užity pro imunoscintigrafii nebo i pro imunoterapii. Navíc tyto monoklonální protilátky mohou být užity jako nosiče účinné látky a využity v terapii nemocí, které jsou způsobeny dysfunkcí endotelu.
Po provedení analýzy úplné nukleolidové sekvence genů V monoklonální protilátky 16C2 je také so technicky možné vytvořit protilátkové konstrukty např. tak, že se vloží hypervaríabilní úseky do kostry lidské monoklonální protilátky (Jones et al.. Nátuře 321, 522-525, 1986, Verhoycn et al..
Science 239, 1534-1536. 1988).
Výhodná je kvantifikace protilátek navázaných na antigen v krevních destičkách pomocí průto55 kove cytometrie. např. prováděné na vzorcích celé krve, a pokud je to potřeba, fixovaných metodami. které jsou odborníkovi známy. Metody průtokové cytometrie jsou rovněž odborníkům dobře známy a mohou se provádět např. jak byly popsány v publikaci (i. Otten a W. M. Yokohama, 1992, Flow cytonietry analysis using the Becton Dickinson FACScan. Current Protocols in Immunology, 5.4.1. - 5.4.19.
Analýza fosforvlace VASP pomocí průtokové cytometrie, zejména fosfory láce šeřinu 239 VASP, s použitím nových protilátek podle předkládaného vynálezu, není omezena na lidské trombocyty, a může se provádět také s jinými typy buněk jako jsou lymfocyty, monocyty, leukocyty, endotelové buňky a buňky hladkého svalstva.
Použití průtokové cytometrie kc stanovení fosforvlace VASP, zejména fosfory láce šeřinu 239 VASP, u čerstvě izolovaných lidských tromboeylů pomocí nových protilátek podle vynálezu umožňuje ex vivo stanovit aktivitu in vivo endotelových faktorů jako jc NO nebo prostacyklin, a v důsledku toho hodnotit funkci endotelu nebo poznat dysfunkci endotelu při kardiovaskulární
5o nemoci, jak se vyskytují např. při arterioskleróze, hypertenzi, diabetů, srdeční nebo renální insuficicnci.
Stanovení fosforvlace VASP, zejména fosforvlace ser i nu 239 VASP. pomocí nových protilátek podle vynálezu umožňuje také kontrolovat terapii výše uvedených nemocí. Vývoj rezistence na terapii, jako je např. nitrátová tolerance, může být také sledován.
- 7 CZ 299889 B6
Nove protilátky mohou byt využity jako terapeutická činidla, jelikož v biologickém materiálu ovlivňují fosfory lační stav V ASP a/nebo jeho interakce s proteiny.
Předkládaný vynález sc tudíž týká i farmaceutických přípravků, které obsahují alespoň jednu z nových protilátek podle vynálezu.
Nové přípravky podle vynálezu sc mohou podávat enterálné (perorálně), parenterálně (intravenóznč), rektálně nebo lokálně (topieky). Mohou se podávat formulovány do lékové formy rozío toků, prášků (tablet nebo tobolek včetně mikrotobolek) liposomových přípravků, lipidových komplexů, koloidníeh disperzí, injekčních roztoků nebo čípků. Navíc lze užít obvyklá farmaceutická kapalná nebo tuhá plnidla a nosiče, rozpouštědla, emulgační činidla, kluzná činidla, chuťová korigeneia a barviva, pufrující látky jakožto pomocné látky pro formulaci do uvedených lékových forem. Vhodné dávky jsou OJ až 100 mg na kilogram tělesné hmotnosti. Jsou podávány v is jednotkové lékové formě, která obsahuje alespoň účinnou denní dávku nové protilátky, např.
až 3000 mg.
Denní dávka, která se má podat, závisí však na tělesné hmotnosti, věku, pohlaví a stavu subjektu, kterým je savec. Avšak je možné použít také nižší nebo vyšší denní dávku. Denní dávka může
2i) být podána buďto jedenkrát denně v jednotkové lékové formě nebo několikrát denně v podobě menších lékových forem, v předem stanovených intervalech, nebo rozdělena do menších dílčích dávek.
Pro získání farmaceutického přípravku se mohou nové protilátky podle vynálezu smíchat s tera2? peuticky inertními organickými nebo anorganickými excipienty. Příkladem takových excipicntů vhodných pro tablety, potahované tablety a tvrdé želatinové tobolky jsou laktóza. kukuřičný škrob a jeho deriváty; lůj, kyselina stearová a její soli. Pro přípravu roztoků jsou vhodnými excipienty voda, polyoly, sacharóza, invertni cukr a glukóza. Pro přípravu injekčních roztoků jsou vhodnými excipienty voda, alkohol, polyoly. glycerol a rostlinné oleje. Rostlinné oleje, ztužené
3o oleje, vosky, tuky a polotuhé polyoly jsou vhodnými excipienty pro přípravu čípků. Farmaceutické přípravky podle vynálezu mohou také obsahovat konzervační činidla, rozpouštědla, stabilizující činidla, zvlhčující činidla, emulgátory. sladidla, barviva, chuťová a vonná korigeneia, soli pro úpravu osmotického tlaku, pufrující látky, polahovací činidla, antioxidanty, a kde je to třeba, i další farmaceuticky účinné látky.
Předkládaný vynález sc týká také způsobu přípravy nového farmaceutického přípravku, kdy se alespoň jedna nová protilátka podle vynálezu formuluje do vhodné lékové formy společně s farmaceuticky přijatelným a fyziologicky tolerovatelným excipientem, a kde je to třeba, i jinou vhodnou účinnou látkou, aditivy nebo pomocnými látkami.
Předkládaný vynález se dále týká. i když jen zcela obecně, diagnostického způsobu stanovení fosforylace VASP, výhodně fosforylace šeřinu 239 VASP, pomocí specifických sond jako jsou polyklonální protilátky, fragmenty SCFv nebo jiné syntetické či rekombinantní proteinové domény, které specificky rozpoznávají fosfory 1 ováné sekvence ve VASP, zejména fosfoserin-239
VASP.
Předkládaný vynález sc dále týká diagnostického způsobu stanovení fosforylace šeřinu 157 a/nebo fosforylace threoninu 278 ve VASP pomocí specifických sond jako jsou polyklonální protilátky, fragmenty SCFv nebo jiné syntetické či rekombinantní proteinové domény, které spe50 cifeky rozpoznávají sekvence ve VASP, které obsahují fosforylovaný serin 157 a/nebo threonin 278.
Tím, že se váže na peptidy bohaté na prolin, jako je zyxin a vínku!in, a současné se váže svou vlastní doménou bohatou na prolin k profil inu, VASP umožňuje vytváření vláknitého akt i nu, kdy
VASP působí jako adaptérová molekula. Narušení této interakce protein/protein může vést k
- x CZ 299889 B6 chybné agregaci trombocytů nebo vaskulární kontrakci. Tak např. vytváření můstků aktin/myosin je předpokladem pro kontrakci buněk hladkého svalstva. Bylo zjištěno, že fosforylace V ASP na šeřinu v poloze 157 koreluje s inhibicí fíbrinogenového reeeptorového glykoproteinu llB/llla (Horstrup et al., Eur. J. Biochcm. 225, 21-27. 1994), Stanovení fosforylace VASp na šeřinu v poloze 157 tudíž umožňuje systematické vyhledávání látek nebo léčiv, která ovlivňují interakci VASP s jeho vazebnými intracelulárními partnery a jsou např. vhodná pro terapii kardiovaskulárních nemocí, které jsou spojeny s poškozením cév.
Zvláště výhodná provedení předkládaného vynálezu jsou uvedena v příkladech provedení vyňalo lezu.
Následující příklady provedení vynálezu slouží pouze k lepšímu vysvětlení vynálezu avšak nijak ho neomezují.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Izolace monoklonální protilátky proti fosfoserin-239-VASP
Fosfory lovaný peptid a ne fosfory lovaný peptid, každý obsahující peplidovou sekvenci KERKVS?3ÍKQ nebo RKVS'^KQE v okolí šeřinu 239 byly syntetizovány pomocí syntetizátoru peptidů model 431A firmy Applied Biosystems. a sice odborníkovi známou chemickou metodou užívající Fmoe.
Fosfoserin do fosforylovaného peptidů byl vnesen v průběhu syntézy peptidů pomocí FmocserinLPO(Obzl)OH-OH) od firmy Calbiochem. Peptidy potvrzené MS byly purifikován v užitím
RPC na koloně VYDAC 218TP (čistota > 98 %).
Po aktivaci kyselinou bromoctovou nebo esterem bromacetyl-N-liydroxysiikcinimidu (Sigma) byly takto připravené peptidy konjugovány thiolovaným KLH (hemocynin z přílipky od firmy Nano Tools).
Samice myší Balb/c (staré 6 týdnů) byly imunizovány subkutánně 4x ve 14 denních intervalech KLI i-fosfopeptidcm (10 pg/myš) v kompletním Freundově adjuvans v první injekci a v nekompletním adjuvans ve 3 následujících injekcích. Pak byla myším (2 týdny později) aplikována zesilující injekce 10 pg imunogenu v PBS (solný roztok pufrovaný fosfátem) ve třech po sobe io jdoucích dnech, 1 den po první zesilující injekci byly myši utraceny a byla vyjmuta slezina. Buňky sleziny byly izolovány a fúzovány s neprodukuj ící mi mye lomovým i buňkami (např. buňky
PAl. J. W. Stocker et al., 1982, Res. Disdosure, 21713) známým způsobem, který popsali Kohlcr a Milstein.
K testování schopnosti hybridomových buněk vylučovat protilátky proti fosfoserin-239-VASP byla užita metoda diferenciálního screeningu s fosforylovaným/nefosforylovaným peptidem a také fosfory lovaným/nefosforylovanýin lidským rekombinantním VASP.
Pro testy s fosfory lovaným/ncfosforylovaným peptidem byly tyto peptidy kovalentně navázány so na destičky DNA BIND-EIJSA (od firmy Costar) a supernatanty hybridomů byly testovány metodou EE1SA.
Supernatanty, které rozpoznávaly fosfopeptidy, byly navíc testovány na jejich schopnost rozpoznávat plně fosfory lovaný rekombinantní (ze systému E. coli) lidský VASP, a nerozpoznávat odpovídající defosforylovaný VASP,
-9 CZ 299889 B6
Monoklonální protilátky ze supematantu hybridomovýeh buněk, které byly identifikovány výše popsaným způsobem jako pozitivní, mohou být výhodně purifikovány z kultur hybridomovýeh buněk bez přídavku séra. a sice pomocí thiofilní adsorpční chromatografie (POROS 50-OH, ? nanoTools).
Užitím různých způsobů testování bylo možné identifikovat a charakterizovat jednu, z izolovaných protilátek (klon 16C2) jako monoklonální protilátku třídy IgGIK myší. která rozpoznává VASP pouze je-li tento protein fosforylován na šeřinu v poloze 239. V použitých podmínkách io protilátka 16C2 nerozpoznává jiné proteiny ani jiná fosforylační místa VASP.
Monoklonální protilátky specificky rozpoznávající fosfoserin-157-VASP nebo fosfothreonin278-VASP lze izolovat analogickým způsobem, jak byl popsán výše. s tím. že jako antigen se užijí fosforylovanc peptidy. které obsahují známé peptidové sekvence v okolí šeřinu 157 nebo threoninu 278 z proteinu VASP.
Příprava monokíonálních protilátek rozpoznávajících VASP fosfor)dováný v poloze Ser 239 byla také popsána v publikaci Smolenski et al., Biol, Chem. 237: 32, 20029-20035, 1998.
Příklad 2
Analýza fosforylace serin—239—V ASP pomocí průtokové cytometrie
Analýza fosforylace serin-239-VASP na propláchnutých lidských trom boc y těch
Lidské trombocyty byly připraveny a fosforylace VASP byla stimulována inkubací s vazoaktivními látkami, jak již bylo popsáno v publikaci Eigenthaler el al., Eur. J. Biochem 205, 471^181, 1992. Reakce byla zastavena fixováním při teplotě místnosti po dobu 10 minut ve formaldchydu s konečnou koncentraci přibližně 3,5 %. Po oplachovací proceduře (volitelná) byly buňky permeabilizovány pomocí Triton X-100 a pak opláchnuty. Barvení bylo provedeno inkubací s vhodnou protilátkou, která byla buďto přímo fluorescenčně označena nebo obarvena pomocí druhé protilátky, která byla fluorescenčně označena. Pro tento účel bylo užito 0,5 až 5 pg, výhodně 1 až 2 pg primární protilátky v 1 ml. například koncentrace 1.7 pg/ml byla vhodná, když sc užila monoklonální protilátka 16C2 jako primární protilátka. Navázání protilátky 16C2 pak bylo stanoveno a analyzováno pomocí průtokové cytometrie, jak např. popsali G. Otten a W.M. Yokohama, 1992, Flow cytomctry analysis using the Becton Dickinson FACScan. Current Protocols in immunology. 5.4.1.-5.4.19.
Příklad 3
Použití analýzy westernovým přenosem (..Western blotting“) kc stanovení fosforylace šeřinu 239 VASP v buněčných extraktech
Paralelně s průtokovou cytometrií (příklad 2) byl použit westernový přenos ke stanovení fosforylace serinu 239 VASP v buněčných extraktech metodou, která je známá odborníkům a která byla popsána v publikaci např. Eigenthaler el al., Eur, J. Biochem 205. 471-481, 1992. Použitá koncentrace protilátek byla 0,1 až 5 pg/ml. výhodně 0,5 až 1 pg/ml, v závislosti na obsahu VASP
5u ve vzorku, který se měl analyzovat. Např. pro lidské nebo myší trombocyty je výhodné užít koncentraci protilátky 0,5 pg/ml. zatímco pro endotelové buňky z lidské pupeční šňůry je výhodná koncentrace protilátky 1,0 pg/ml, V principu poskytla analýza fosforylace serinu 239 VASP v buněčných extraktech westernovým přenosem a analýza fixovaných buněk průtokovou cytometrií identické výsledky.
- 10 CZ 299889 B6
Příklad 4
Analýza fosforylace šeřinu 239 VASP v úplné krvi nebo plazmě bohaté na destičky (PRP)
Úplná krev nebo PRP byly inkubovány s vazoaktivními látkami a inkubace byla zastavena fixováním při teplotě místnosti po dobu 10 minut ve formaldehydu s konečnou koncentraci přibližně 3,5 %. PRP byla připravena z úplné krve způsobeni, který popsali Eigenthaler et al., Eur. J. Biochem 205, 471—481, 1992. Trombocyty z PRP byly poletovány centrifugám' a resuspendovány ve fyziologickém pufru (Eigenthaler et al., viz výše). Trombocyty byly permcabilizovány a pak io obarveny, jak bylo popsáno výše pro promyté trombocyty.
Příklad 5
Průběh stimulace fosfory lace šeřinu 239 VASP v opláchnutých lidských trombocytech po ošetření nitroprusidem sodným (SNP)
Lidské trombocyty byly ošetřeny 100 μΜ SNP. Vzorky buněk v byly odebrány v časech 0, 1,3 a 5 minut. Protilátka 16C2 byla užita ke stanovení fosforylace serinu 239 VASP paralelně s analý20 zou westernovým přenosem buněčných extraktu ze stejných vzorků odebraných bunčk a také pomocí průtokové cytomctrie na lidských trombocytech, které byly fixovány a permeabilizovány, jak bylo výše popsáno. Autoradiogramy z westernového přenosu byly analyzovány kvantitativně pomocí programového vybavení „Nil 1 gel blotting Image 1,6't
V tab. 1 je zaznamenáno zvýšení vazby protilátky 16C2/fosfoserin239VASP (zvýšení v %. hodnota v 5 minutách = nejvyšší účinek = 100 %).
Tabulka I
čas (ninuty) ΐ zvýšení
trcmbocyty v cytometrii buněčné extrakty western, přenesem
0 0 0
1 62,5 8 3,5
3 89, 3 95,2
5 100,0 100,0
-11CZ 299889 B6
Příklad 6
Použití protilátky I6C2 k analýze fosfory láce rekombinantního VASP proteinkinázou závislou na cAMP nebo proteinkinázou závislou na cGMP
Purifikovaný rekombinantní VASP značený hexahistidinenn (25 pq/ml) byl fosforylován purifikovanou katalytickou podjednotkou (11 pg/ml) cAMP proteinkinázy (cAPK) nebo purifikovanou cGMP proteinkinázou (cGPK. 24 pg/rnl).
L reakční směsi byly v daných časech odebrány alikvotní části, smíchány bezprostředně se zastavovacím roztokem obsahuj ícím SDS. povařeny a frakcionovány elektroforézou SDS-PAGE. Fosfory láce VASP byla analyzována pomocí barvení Coomassie modří a westernovým přenosem buďto s polyklonální VASP protilátkou (M4. Halbruggc, M. et al., J. Biol. Chem. 265, 308815 3093, 1990, získanou od Alexis Corporation, Alte (Iauensteinstrasse 4, CH-4448 Laufelfingen,
Švýcarsko) nebo monoklonální VASP protilátkou 16C2. Pás ležící pod VASP po obarvení Coomassie modří byl cAPK, zatímco pás ležící nad byl cGMP-PK. Provedená analýza SDS PAGE ukázala změnu v pohyblivosti VASP ze 46 na 50 kDa způsobenou fosforilací šeřinu 157. která je preferována cAPK. Fosforylacc serinu 239 (detekovaní protilátkou 16C2) je preferována cGMP-PK.
Příklad 7
Analýza fosfory láce různých fosfory lačn ích rnutanlů VASP transfekovaných do buněk Ptk2
Fosfory láce transfekovanélio lidského VASP a mutantů VASP byla zkoumána v buňkách Ptk2. VASP divokého typu a mutanty VASP, každý obsahující mutovaná (tj. inaktivovaná) fos fóry'lační místa (alterace serinu 157, serinu 238 nebo threoninu 277) byly transfekovány do buněk Ptk2
3o společně s lidskou cGMP proteinkinázou IB a exprimovaný pod kontrolou promotoru CMV. Buňky Ptk2 nesou velmi málo endogenního VASP a cGMP proteinkinázy. Dva dny po transfekci byly buňky ínkubovány 30 minut s 30 μΜ 8pCPT-cGMP a pak byly izolovány buněčné extrakty. Fosforylace VASP v těchto extraktech byla vyšetřována westernovými přenosy užitím polyklonální protilátky M4 a monoklonální protilátky 16C2. Změna VASP ze 46 kDa na 50 kDa závislá na fosfory láci již nadále neprobíhala, když byl serin 157 inaktivován (mutace S157A). Signál rozpoznávaný protilátkou 16C2 nebyl přítomen, když byl inaktivován serin 239 (S239A). Při těchto analýzách se rnulant s thereoninem 277 choval stejně jako VASP divokého typu.
Příklad 8
Analýza fosforylace VASP v lidských trom bocy těch po stimulaci různými vazodilátory a analogy cAMP/cGMP.'
Opláchnuté lidské trombocyty (0,7 x 10° buněk/ml) byly Ínkubovány s 1 μΜ Pg-E (prostacvklin), 0,5 mM 5,6-cBIMPS (analog CAMP procházející membránou), 10 μΜ SNP (nitroprusid sodný) nebo I mM 8pCPTcGMP (analog cGMP procházející membránou). Alikvoty (2,8 x 10' buněk) byly odebrány v daných časech, smíchány se za s ta vo v acím roztokem obsahujícím SDS a povařeny, a poté byly vyšetřeny na fosfory láci VASP metodou westernového přenosu. Analýzy byly provedeny užitím polyklonální protilátky M4 a monoklonální protilátky 16C2. Fosforvlace serinu 157 byla kvantifikována pomocí posunu VASP z 46 na 50 kDA závislého na fosfory láci. zatímco fosforylace serinu 239 byla kvantifikována prostřednictvím signálu získaného protilátkou 16C2.
-12CZ 299889 B6
Příklad 9
Fosforylace VASP trombocytů laboratorního potkana s
Trombocyty laboratorního potkana (0,7 x 10' buněk/ml) byly inkubovány 5 minut s 100 μΜ nitroprusidem sodným (SNP), 10 μΜ prostglandinern El (PgEF) nebo bez jakékoliv přidané látky. Extrakty z těchto trombocytů byly analyzovány metodou westernového přenosu. Výsledky („bloty“) ukázaly, že na fosforylací závislý posun VASP z 46 na 50 kDa (fosforylace serinu 157) io a na fosforylací závislý signál poskytnutý protilátkou 16C2 (fosforylace serinu 239) byly přítomny i v trombocytech potkanů. Podobné výsledky byly získány také s trombocyty myší.
Příklad 10
Imunofluorescenční vyšetření VASP a fos fóry lo váného VASP na lidských trombocytech
Lidské trombocyty (v plazmě obohacené destičkami, PRP) byly naneseny na podložní sklíčka a ponechány, aby sc přichytily po dobu 45 minut, Tyto trombocyty pak byly inkubovány přichytí cené na sklíčkách 15 minut, a sice buddo bez (A a C) nebo se 100 μΜ SpCPTcGMP (B a D).
Bezprostředně poté byly buňky fixovány 4% paraformaldehydein a permeabilizovány 0,2% Triton X-100. Pak byly inkubovány s polyklonální protilátkou M4 (1:1000) nebo monoklonální protilátkou 16C2 a potom s obvyklými sekundárními protilátkami. Fotografie ukázaly, žc se objevil na fosforylací závislý signál, když byla použita protilátka 16C2, zatímco signál s mono25 klonální protilátkou M4 (při imunofluoreseenci představuje souhrn Idrem 46 kDa a 50 kDa
VASP, neboť nejsou odděleny) je nezávislý na fosforylací.

Claims (12)

1. Monoklonální protilátka 16C2, která je produkována hybridomovou buněčnou linií s přírust35 kovým číslem DSM ACC 2330, nebo její fragmenty, které jsou schopné vázat vazodilátorem stimulovaný fosfoprotein (VASP) jen tehdy, když je fosforylovány v poloze serinu 239 (fosfoserin 239 VASP).
2. Použití protilátky 16C2 nebo jejich fragmentů podle nároku 1 jako diagnostického činidla.
3. Použití podle nároku 2 pro kvalitativní nebo kvantitativní stanovení fosťoserin-239-VASP v biologickém materiálu.
4. Použití podle nároku 3, kdy biologickým materiálem jsou lidské trombocyty nebo lidská 45 krev.
5. Použití podle nároku 3 nebo 4, kdy se stanovení fosfoserinu 239 provádí metodou westernového přenosu.
5d
6. Použití podle nároku 3 nebo 4, kdy se stanovení fosfoserinu 239 provádí průtokovou cytoinctrií,
7. Použití podle kteréhokoliv z nároků 2 až 6 pro detekci látek, které ovlivňují hladinu cGMP a/nebo cAMP v biologickém materiálu.
- 13 CZ 299889 B6
8. Použití podle kteréhokoliv z nároku 2 až 6 pro stanovení in vivo aktivity endotelových faktoru.
9. Použití podle kteréhokoliv z nároku 2 až 8 pro detekci dysfunkce endotelu.
10. Hybridomová buněčná linie DSM ACC 2330, která produkuje monoklonální protilátku 16C2?
11. Diagnostická souprava, vyznačující se t í m . že obsahuje protilátku 16C2 nebo její i0 fragmenty podle nároku 1,
12. Diagnostický způsob in vitro, vyznačující se t í m , Že zahrnuje krok, kdy se použije protilátka 16C2 nebo její fragmenty ke stanovení nebo ovlivnění fosfory 1 ač ního stavu fosfoserinu 239 ve VASP a/nebo proteinových interakcí VASP v biologickém materiálu.
CZ20001684A 1997-11-07 1998-11-06 Protilátka proti fosforylovanému VASP (fosfoprotein stimulovaný vazodilátorem), hybridomové bunky pro její prípravu a použití této protilátky jako diagnostického cinidla CZ299889B6 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19749091A DE19749091C1 (de) 1997-11-07 1997-11-07 Antikörper gegen phosphoryliertes VASP (Vasodilator-Stimuliertes Phosphoprotein), Hybridomzellen zu dessen Herstellung sowie dessen Anwendung
US7937598P 1998-03-26 1998-03-26

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ20001684A3 CZ20001684A3 (cs) 2000-11-15
CZ299889B6 true CZ299889B6 (cs) 2008-12-29

Family

ID=26041380

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20001684A CZ299889B6 (cs) 1997-11-07 1998-11-06 Protilátka proti fosforylovanému VASP (fosfoprotein stimulovaný vazodilátorem), hybridomové bunky pro její prípravu a použití této protilátky jako diagnostického cinidla

Country Status (16)

Country Link
US (2) US6649421B1 (cs)
EP (1) EP1042368B1 (cs)
JP (1) JP5031140B2 (cs)
KR (1) KR100513418B1 (cs)
CN (1) CN1188426C (cs)
AT (1) ATE248189T1 (cs)
AU (1) AU753557B2 (cs)
BR (1) BR9813988A (cs)
CA (1) CA2308604C (cs)
CZ (1) CZ299889B6 (cs)
ES (1) ES2205593T3 (cs)
HU (1) HU222411B1 (cs)
PL (1) PL195985B1 (cs)
RU (1) RU2218178C2 (cs)
TR (1) TR200001265T2 (cs)
WO (1) WO1999024473A1 (cs)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10029210A1 (de) * 2000-06-14 2002-01-31 Vasopharm Biotech Gmbh & Co Kg Testsystem sowie dessen Verwendung
US7176037B2 (en) * 2000-07-13 2007-02-13 The Scripps Research Institute Labeled peptides, proteins and antibodies and processes and intermediates useful for their preparation
US6951947B2 (en) * 2000-07-13 2005-10-04 The Scripps Research Institute Labeled peptides, proteins and antibodies and processes and intermediates useful for their preparation
EP1182263A1 (en) * 2000-08-11 2002-02-27 Evotec OAI AG Process for detecting threonine/serine kinase activity
US20030162230A1 (en) 2000-09-27 2003-08-28 Reagan Kevin J. Method for quantifying phosphokinase activity on proteins
JP4055579B2 (ja) * 2000-12-13 2008-03-05 大正製薬株式会社 新規抗体
WO2005088308A2 (en) * 2004-03-12 2005-09-22 The Scripps Research Institute Fluorescent signal emitting live cell biosensor molecules and dyes for detection and quantification of protein activities
CN103102411A (zh) * 2009-06-11 2013-05-15 北京华大蛋白质研发中心有限公司 一种制备针对糖基化修饰蛋白质的单克隆抗体杂交瘤的方法
FR2946756A1 (fr) * 2009-06-12 2010-12-17 Biocytex Dosage en sang total d'un biomarqueur intracellulaire appartenant a une voie de signalisation cellulaire- utilisation pour mesurer l'activation d'une population cellulaire determinee
US11149064B2 (en) 2016-09-07 2021-10-19 Vanderbilt University Vasoactive polypeptides for smooth muscle relaxation
CN112730826A (zh) * 2020-12-23 2021-04-30 中南大学湘雅三医院 一种人磷酸化血管扩张刺激磷蛋白磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其检测方法和应用
CN113238062B (zh) * 2021-07-13 2021-09-28 湖南菲思特精准医疗科技有限公司 一种用于人磷酸化血管扩张刺激磷蛋白光激化学发光均相免疫检测试剂盒及其检测方法
CN114002440B (zh) * 2021-12-30 2022-04-01 湖南菲思特精准医疗科技有限公司 一种用于人磷酸化血管扩张刺激蛋白的酶联免疫检测试剂盒及其检测方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2117913C (en) 1992-04-10 2006-05-09 Richard J. Epstein Activation-state-specific phosphoprotein immunodetection

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
U. Walter: "Biochemische Parameter der Endothelfunktion", Blick 1/97 Wurzburg University, pp. 79-81,1997 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO1999024473A1 (en) 1999-05-20
HUP0004099A1 (en) 2001-03-28
BR9813988A (pt) 2000-09-26
CN1188426C (zh) 2005-02-09
JP2001522865A (ja) 2001-11-20
KR100513418B1 (ko) 2005-09-09
PL340465A1 (en) 2001-02-12
ATE248189T1 (de) 2003-09-15
HU222411B1 (hu) 2003-06-28
JP5031140B2 (ja) 2012-09-19
US6649421B1 (en) 2003-11-18
PL195985B1 (pl) 2007-11-30
RU2218178C2 (ru) 2003-12-10
EP1042368A1 (en) 2000-10-11
CZ20001684A3 (cs) 2000-11-15
EP1042368B1 (en) 2003-08-27
AU1871299A (en) 1999-05-31
ES2205593T3 (es) 2004-05-01
CN1279691A (zh) 2001-01-10
AU753557B2 (en) 2002-10-24
TR200001265T2 (tr) 2000-09-21
US20040063914A1 (en) 2004-04-01
HUP0004099A3 (en) 2002-01-28
KR20010031830A (ko) 2001-04-16
CA2308604C (en) 2009-12-15
CA2308604A1 (en) 1999-05-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10464976B2 (en) Amyloid β(1-42) oligomers, derivatives thereof and antibodies thereto, methods of preparation thereof and use thereof
JP3315405B2 (ja) レセプター誘発結合部位に対するモノクローナル抗体
HUE028331T2 (en) N-11 truncated β-amyloid monoclonal antibody, preparation, method and use
WO1995015180A1 (en) Antibodies that mimic actions of neurotrophins
CZ299889B6 (cs) Protilátka proti fosforylovanému VASP (fosfoprotein stimulovaný vazodilátorem), hybridomové bunky pro její prípravu a použití této protilátky jako diagnostického cinidla
US20080014598A1 (en) Phospho-specific antibodies to pi3k regulatory subunit and uses thereof
JP2750423B2 (ja) ビタミンｂ１２の測定法及びビタミンｂ１２の測定試薬
NZ522460A (en) Oligopeptides derived from epimorphin for promoting hair growth
US5444158A (en) Merosin, nucleic acids encoding, fragments and uses thereof
JP2002501201A (ja) インテグリンアンタゴニスト／アゴニスト仲介性疾患のリスク評価
US7241731B2 (en) Oligopeptides for promoting hair growth
US5180809A (en) Adhesion receptor for laminin and its use
JPH06339393A (ja) ヒトの心房ナトリウム排泄増加性ペプチドに対するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ
EP0913692A1 (en) An immunoassay for procollagen-III-C-terminal propeptide
EP1388543A2 (en) Antibodies against phosphorylated VASP (vasodilator-stimulated phosphoprotein), hybridoma cells for their preparation, and their use
EP0465652B1 (en) Antibody against heavy chain of smooth muscle myosin
NO174005B (no) Monoklonalt antistoff, hybridom, og reagens for immunologisk analyse av alfa-hanp
JPH08205885A (ja) ラミニンの付着受容体およびその使用
MXPA00004331A (en) Antibodies against phosphorylated vasp (vasodilator-stimulated phosphoprotein), hybridoma cells for their preparation, and their use
US5516643A (en) Immunochemical assays for cancer-associated SCM-recognition factor
KR900008014B1 (ko) 펩타이드 항체의 제조방법
US20050008602A1 (en) Oligopeptides for promoting hair growth
JPH08313524A (ja) トロンビンレセプター発現量または活性化量の測定方法
JPH0933522A (ja) 血栓症の検出方法
JPH09238682A (ja) リン酸化されたミオシン軽鎖の測定法

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20101106