KR100513418B1 - 인산화된 ｖａｓｐ(혈관확장제-자극된 인단백질)에 대한 항체, 이를 제조하기 위한 하이브리도마 세포 및 이를 포함하는 진단제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 VASP(혈관확장제-자극된 인단백질)가 인산화된 형태로 존재하는 경우에만 항원으로서의 VASP에 결합하는, VASP에 대한 항체, 이를 제조하기 위한 하이브리도마 세포 및 진단제 및/또는 치료제로서 항체 또는 항체 단편의 용도에 관한 것이다.

Description

인산화된 ＶＡＳＰ(혈관확장제-자극된 인단백질)에 대한 항체, 이를 제조하기 위한 하이브리도마 세포 및 이를 포함하는 진단제{Antibodies against phosphorylated VASP(vasodilator-stimulated phosphoprotein), hybridoma cells for their preparation, and diagnostic agents comprising the same}
실시예 1
포스포세린 239 VASP에 대한 모노클로날 항체의 분리
각각 세린 239 부근에 펩타이드 서열 KLRKVS239KQ 및 RKVS239KQE를 포함하는 인산화 펩타이드 및 비인산화 펩타이드를, 당해 분야의 숙련가에게 친숙한 Fmoc 화학법에 따라 어플라이드 바이오시스템스 펩타이드 합성기(Applied Biosystems peptide synthesizer; Model 431A)를 사용하여 합성한다.
인산화된 펩타이드중의 포스포세린은 칼바이오켐(Calbiochem)사의 Fmoc-세린[PO(Obzl)OH-OH]을 사용하여 펩타이드를 합성하는 동안에 혼입시킨다. MS 확인된 펩타이드를 RPC 및 VYDAC 218TP 칼럼을 사용하여 정제한다(순도는 98%를 초과함).
브로모아세트산 또는 브로모아세틱-N-하이드록시석신이미드 에스테르(시그마 제품; Sigma)로 활성화시킨 후, 상기한 방법으로 제조한 펩타이드를 티올화 KLH[키홀 림펫 헤모시아닌(Keyhole limpet hemocyanin); 나노툴즈(nanoTools) 제품]와 접합시킨다. 1차 주사액으로 프로인트 완전 보조제(Complete Freund's adjuvant)를 함유하는 KLH-포스포펩타이드(10㎍/마우스)를 암컷 Balb/c 마우스(6주령)에게 14일 간격으로 4회 피하 주사한 다음, 불완전 보조제를 3회 주사하여 면역화시킨다. 이어서(2주 후) 마우스에게 3일 연속으로 PBS(인산염 완충된 염수)중의 면역원 10㎍의 부스터(booster) 주사를 실시한다. 최종 부스터 주사를 수행한 지 1일 후, 마우스를 죽인 다음 비장을 제거한다. 비장 세포를 분리시키고, 확립된 쾨흘러/밀슈타인 방법론(Kohler/Milstein methodology)을 사용하여 비생성 골수종 세포와 융합시킨다[참조 문헌: PAI-Zellen, J.W. Stocker et al. (1982) Res. Disclosure, 21713].
인산화/비인산화 펩타이드뿐만 아니라 인산화/비인산화 재조합 사람 VASP를 사용하는 차별적 선별 방법을 사용하여 포스포세린 239 VASP에 대한 항체를 분비하는 하이브리도마 세포의 능력을 시험한다.
인산화/비인산화 펩타이드를 사용하는 시험의 경우, 이들 펩타이드를 DNA-BIND-ELISA(코스타 제품; Costar)에 공유적으로 커플링시키고, ELISA 방법을 사용하여 하이브리도마 상층액을 선별한다.
포스포펩타이드를 인지하는 상층액으로, 완전하게 인산화된 재조합[이 콜라이(E. coli) 시스템] 사람 VASP를 인지하지만 상응하게 탈인산화된 VASP를 인지하는 못하는 이의 능력을 추가로 조사한다.
상기한 방법에 의해 양성으로 확인된 하이브리도마 세포의 상층액으로부터의 모노클로날 항체는, 바람직하게는 티오필릭 흡착 크로마토그래피(thiophilic adsorption chromatography; POROS 50-OH, nanoTools)에 의해 혈청 비함유 하이브리도마 세포 배양물로부터 정제할 수 있다.
상이한 시험 방법을 사용하여, 분리된 항체중 하나가(클론 16C2), VASP가 세린 239 위치에서 인산화되는 경우에만 VASP를 인지하는 마우스 IgG1κ 부류의 모노클로날 항체인 것으로 확인되고 특성화되었다. 항체 16C2는 사용되는 조건하에 다른 단백질 및 다른 VASP 인산화 부위를 인지하지 못한다.
포스포세린 157 VASP 또는 포스포트레오닌 278 VASP를 특이적으로 인지하는 모노클로날 항체는, 각각 항원으로서 VASP 단백질의 세린 157 또는 트레오닌 278 부근에 공지된 펩타이드 서열을 포함하는 인산화 펩타이드를 사용함으로써 상기한 방법과 유사하게 분리시킬 수 있다.
Ser 239 위치에서 인산화된 VASP를 인지하는 모노클로날 항체를 생성하는 것은 또한 문헌에 기술되어 있다[참조 문헌: Smolenski et al., J. Biol. Chem., 237, 32, 20029-20035 (1998)].
실시예 2
VASP 세린 239 인산화의 유세포분석에 의한 분석
세척된 사람의 혈소판에서의 VASP 세린 239 인산화 분석
사람의 혈소판을 준비하고, 상기한 바와 같은 혈관활성 물질과 함께 배양함으로써 VASP 인산화를 자극시킨다[참조 문헌: Eigenthaler et al., Eur. J. Biochem., 205, 471-481, 1992]. 약 3.5%의 최종 농도에서 포름알데히드로 실온에서 10분 동안 고착시킴으로써 반응을 정지시킨다. 세척 공정(임의)을 수행한 후, 세포는 트리톤 X-100으로 투과가능하게 만든 다음 세척한다. 직접 형광 표지시키거나 형광 표지된 2차 항체를 사용하여 착색시킨 적절한 항체와 함께 배양시켜 염색시킨다. 편리하게는 ㎖당 0.5 내지 5㎍, 바람직하게는 1 내지 2㎍의 1차 항체를 본 목적에 사용한다. 예를 들어, Mab 16C2가 1차 항체로 사용되는 경우에는 1.7㎍/㎖이 적합하다. 항체 16C2의 결합을 측정한 다음, 예를 들어 문헌에 기술되어 있는 바와 같은 유세포분석법으로 분석한다[참조 문헌: G. Otten and W.M. Yokoyama (1992) Flow cytometry analysis using the Becton Dickinson FACScan, Current Protocols in Immunology, 5.4.1-5.4.19].
실시예 3
세포 추출물에서 VASP 세린 239 인산화를 측정하기 위한 웨스턴 블롯팅의 용도
유세포분석법(실시예 2)과 병행하여, 당해 분야의 숙련가에게 친숙하고, 예를 들어 문헌[참조 문헌: Eigenthaler et al., Eur. J. Biochem., 205, 471-481, 1992]에 기술되어 있는 방법에 의해 세포 추출물에서 VASP의 인산화를 측정하는데 웨스턴 블롯팅을 사용한다. 사용되는 항체의 농도는 측정될 샘플중의 VASP 함량에 따라, 편리하게는 0.1 내지 5, 바람직하게는 0.5 내지 1.0㎍/㎖이다. 예를 들어, 사람의 제대 내피 세포의 경우에는 항체 1.0㎍/㎖를 사용하는 것이 유리하지만, 사람의 혈소판 및 랫트의 혈소판의 경우에는 항체 0.5㎍/㎖를 사용하는 것이 유리하다. 원칙적으로, 세포 추출물에서 웨스턴 블롯 분석에 의해, 그리고 고착된 세포상에서 유세포분석법에 의해 VASP 세린 239 인산화를 분석하여 동일한 결과를 수득한다.
실시예 4
전혈 또는 혈소판이 풍부한 혈장(PRP)에서 VASP 세린 239 인산화의 분석
전혈 또는 PRP를 혈관활성 물질과 함께 배양하고, 약 3.5%의 최종 농도로 포름알데히드를 사용하여 실온에서 10분 동안 고착시킴으로써 배양을 정지시킨다. PRP는 문헌에 기술되어 있는 방법에 따라 전혈로부터 제조한다[참조 문헌: 상기한 Eigenthaler et al., Eur. J. Biochem., 205, 471-481, 1992]. PRP중의 혈소판을 원심분리하여 펠릿화하고, 생리학적 완충액 속에 재현탁시킨다[참조 문헌: 상기한 Eigenthaler et al., 1992]. 혈소판을 투과가능하게 만든 다음, 세척된 혈소판을 상기한 바와 같이 염색시킨다.
실시예 5
나트륨 니트로프러사이드(SNP) 처리 후에, 세척된 사람의 혈소판에서 VASP 세린 239 인산화의 시간 경과에 따른 자극
사람의 혈소판은 100μM의 SNP로 처리한다. 세포 샘플을 0, 1, 3 및 5분 후에 채취한다. 채취한 세포 샘플의 추출물의 웨스턴 블롯 분석 및 상기한 바와 같이 고착시키고 투과가능하게 만든 사람의 혈소판에서 수행되는 유세포분석법적 측정과 병행하여, 항체 16C2를 사용하여 VASP 세린 239의 인산화를 측정한다. 웨스턴 블롯의 방사능사진은 NIH 겔-블롯팅 이미지 1.6 소프트웨어를 사용하여 정량적으로 분석한다.
항체 16C2/포스포세린 239 VASP 결합 증가(증가율; 5분 값=최대 효과=100%)는 표 1에 기록하였다.
t(분) 증가율(%) 혈소판 세포계산 세포 추출물 웨스턴 블롯팅
0 0 0
1 62.5 83.5
3 89.3 95.2
5 100.0 100.0
실시예 6
cAMP 의존적 단백질 키나제 또는 cGMP 의존적 단백질 키나제에 의해 재조합 VASP의 인산화를 분석하기 위한 항체 16C2의 용도
정제된 재조합 헥사히스티딘 표지된 VASP(25㎍/㎕)를 cAMP 단백질 키나제(cAPK)의 정제된 촉매적 소단위(11㎍/㎕) 또는 정제된 cGMP 단백질 키나제(cGPK; 24㎍/㎕)에 의해 인산화시킨다. 소정의 시간에 반응 혼합물로부터 분취액을 취하고, 즉시 SDS 함유 정지 용액과 혼합하고 비등시키고 SDS-PAGE로 분별한다. VASP의 인산화는 쿠마시 블루 염색법(Coomassie Blue staining)과 폴리클로날 VASP 항체[M4, 참조 문헌: Halbrugge M. et al. J. Biol. Chem. 265, 3088-3093 (1990); 알렉시스 코포레이션 제품(Alexis Corporation; Alte Hauensteinstrasse 4, Ch-4448 Laufelfingen, Switzerland)] 또는 모노클로날 VASP 항체 16C2를 사용하는 웨스턴 블롯팅에 의해 분석한다. 쿠마시 블루 염색에서 하위 VASP 밴드는 cAPK이고, 상위 VASP 밴드는 cGMP-PK이다. 수행된 SDS-PAGE는 세린 157의 인산화로 인해 VASP의 이동 거동이 46kDa에서 50kDa으로 변화되었음을 입증하는데, 이는 cAPK가 보다 우세하다. 세린 239의 인산(16C2 항체에 의해 검출)화는 cGMP-PK가 보다 우세하다.
실시예 7
다양한 인산화 돌연변이를 포함하는 형질감염된 VASP의 Ptk2 세포내 인산화의 분석
형질감염된 사람의 VASP 및 VASP 돌연변이의 인산화는 Ptk2 세포에서 조사한다. 야생형 VASP와 각각 돌연변이된(불활성) 인산화 부위(세린 157, 세린 238 또는 트레오닌 277의 변형)를 포함하는 VASP 돌연변이체를 사람의 cGMP 단백질 키나제 1β와 함께 Ptk2 세포내로 형질감염시키고, CMV 프로모터의 조절하에 발현시킨다. Ptk2 세포는 매우 소량의 내인성 VASP와 cGMP 단백질 키나제를 갖게 된다. 형질감염시킨지 2일 후, 세포를 8pCPT-cGMP와 함께 30분 동안 배양한 다음, 세포 추출물을 분리시킨다. 이어서, 상기 세포 추출물에서의 VASP 인산화를 폴리클로날 항체 M4 및 모노클로날 항체 16C2를 사용하여 웨스턴 블롯으로 조사한다. 46kDa에서 50kDa로의 VASP의 인산화 의존적 변화는 세린 157이 불활성화되는 경우(돌연변이 S157A)에 더이상 존재하지 않는다. 항체 16C2에 의해 인지되는 신호는 세린 239가 불활성화되는 경우(S239A))에 더이상 존재하지 않는다. 상기 분석에서, 트레오닌 277의 돌연변이는 야생형 VASP와 유사하게 거동한다.
실시예 8
다양한 혈관확장제 및 cAMP/cGMP 유사체로 자극시킨 후의 사람의 혈소판에서 VASP의 인산화 분석
세척된 사람의 혈소판(0.7×109세포/㎖)는 1μM의 Pg-I2(프로스타사이클린), 0.5mM 5,6-DCl-cBIMPS(세포막 투과성 cAMP 유사체), 10μM SNP(나트륨 니트로프러사이드) 또는 1mM 8pCPTcGMP(세포막 투과성 cGMP 유사체)와 함께 배양한다. 소정의 시간이 경과한 후에 분취액(2.8×107세포/㎖)을 취하고, SDS 정지 용액과 혼합하고 비등시킨 다음, 웨스턴 블롯팅 방법을 사용하여 VASP 인산화에 대해 조사한다. 분석은 폴리클로날 항체 M4 또는 모노클로날 항체 16C2를 사용하여 수행한다. 세린 239 인산화는 16C2 항체에 의해 생성된 신호에 의해 정량화되지만, 세린 157 인산화는 VASP가 46에서 50kDa으로 이동한 것으로 정량화된다.
실시예 9
랫트 혈소판에서의 VASP의 인산화
랫트 혈소판(0.7×109세포/㎖)는 10μM 프로스타글란딘 E1(PgE1)를 첨가하거나 이를 첨가하지 않고 100μM 나트륨 니트로프러사이드(SNP)와 함께 5분 동안 배양한다. 상기한 랫트 혈소판 추출물은 웨스턴 블롯팅으로 분석한다. 블롯은 46kDa에서 50kDa로의 VASP의 인산화 의존적 이동(세린 157 인산화)과 16C2 항체에 의해 생성된 인산화 의존적 신호(세린 239 인산화)가 또한 랫트 혈소판에서 발생한다는 것을 입증한다. 또한 마우스 혈소판을 사용하여 유사한 결과가 수득된다.
실시예 10
사람의 혈소판에서 수행되는 VASP 및 포스포-VASP의 면역형광성 조사
사람의 혈소판(혈소판이 풍부한 혈장, PRP)를 유리 슬라이드에 두고 45분 동안 방치하여 부착시키고 분산시킨다. 이들 혈소판은 100μM 8pCPTcGMP를 가하지 않거나(A 및 C) 이를 가하여(B 및 D) 15분 동안 유리 슬라이드상에서 배양한다. 세포를 45% 파라포름알데히드로 바로 고착시킨 다음, 0.2% 트리톤 X-100으로 투과가능하게 만든다. 이들을 폴리클로날 항체 M4(1:1000) 또는 모노클로날 항체 16C2와 배양한 다음, 통상의 2차 항체와 함께 배양한다. 사진은 폴리클로날 M4 항체를 사용한 신호(면역형광법에서는 분별이 되지 않기 때문에 이는 46kDa와 50kDa VASP의 합이다)은 인산화 비의존적이지만, 16C2 항체를 사용하는 경우에 인산화 의존적 신호가 나타난다는 것을 보여준다.
나노툴즈
안티쾨르페르테크닉
79211 덴츨링겐
페르디난드-포르쉐 슈트라쎄 5/1
하기 국제 기탁기관에서 정한 규칙 10.2에 따라 발행된 생존 진술서
I. 기탁자 II. 미생물 동정
성명 : 나노툴즈 안티쾨르페르테크닉 주소 : 79211 덴츨링겐 페르디난드-포르쉐 슈트라쎄 5/1 국제 기탁기관이 부여한 기탁번호: DSM ACC2330 기탁일 또는 이관일1: 1997년 11월 6일
III. 생존 진술
II란에 명시된 미생물의 생존성은 1997년 11월 6일(날짜)2에 시험되었으며 이때 상기 미생물은 (x)3 생존 상태 ( )3 비생존 상태인 것으로 입증되었다.
IV. 생존 시험 수행시의 조건4
V. 국제기탁기관
명칭 : DSMZ-도이췌 삼릉 폰 미크로오가니즈멘 운트 젤쿨투렌 게엠베하 주소 : 데-38124 브라운슈바이크 마쉐로더 벡 1베 국제 기탁기관을 대표하는 권한을 갖는 사람(들) 또는 증명관(들)의 서명(들): (서 명) 날짜 : 1997년 11월 17일
1. 원 기탁일 또는 신규 기탁이 이루어진 가장 최근의 날짜(신규 기탁일 또는 이관일)를 가리킨다.
2.규칙 10.2(a)(ii) 및 (iii)이 적용되는 경우, 가장 최근의 생존 시험을 의미한다.
3. 해당 칸에 크로스로 표시.
4. 정보가 요청되고 시험 결과가 부정적인 경우 기입한다.
Form DSMZ-BP/9(단일 페이지) 0196
나노툴즈
안티쾨르페르테크닉
79211 덴츨링겐
페르디난드-포르쉐 슈트라쎄 5/1
하기 국제 기탁기관에서 정한 규칙 7.1에 따라 발행된 원 기탁에 관한 기탁증
I. 미생물의 동정
기탁자가 첨부한 참고 동정: VASP 16C2 국제 기탁기관이 부여한 기탁번호: DSM ACC2330
II. 과학적 설명 및/또는 제안된 분류학상의 명칭
상기 I에 명시된 미생물에는 하기의 사항을 기재한 문서가 첨부되어 있다: ( ) 과학적 설명 ( ) 제안된 분류학상의 명칭 (적용되는 경우에는 크로스로 표시함)
III. 수령 및 기탁
본 국제기탁기관은 1997년 11월 6일(원 기탁일)1에 수령된 상기 I에 명시된 미생물을 기탁한다.
IV. 이관청구의 수령
본 국제기탁기관은 (원 기탁일)에 상기 I에 명시된 미생물을 수령하였고, (이관 청구 접수일)에 원 기탁물의 부다페스트 조약하의 기탁물로의 이관청구를 수령하였다.
V. 국제 기탁기관
명칭: DSMZ-도이췌 삼릉 폰 미크로오가니즈멘 운트 젤쿨투렌 게엠베하 주소: 데-38124 브라운슈바이크 마쉐로더 벡 1베 국제 기탁기관을 대표하는 권한을 갖는 사람(들) 또는 증명관(들)의 서명(들): (서 명) 날짜 : 1997년 11월 17일
1. 규칙 6.4(d)가 적용되는 경우, 이 날짜는 국제 기탁기관의 자격이 획득된 날짜이다.
Form DSMZ-BP/4(단일 페이지) 0196
본 발명은 VASP(혈관확장제-자극된 인단백질)가 인산화된 형태로 존재하는 경우에만 항원으로서의 VASP에 결합하는, VASP에 대한 항체, 이를 제조하기 위한 하이브리도마 세포, 및 진단제 및/또는 치료제로서 항체 또는 항체 단편의 용도에 관한 것이다.
혈관계 질환은 다수의 만성 질환 및 치명적 질환(예: 심장 경색, 발작, 동맥 폐색 질환 및 다수 형태의 신부전증)과 관련되어 있다.
내피 세포, 특히 혈액 응고계, 혈소판의 기능 상태, 혈관벽으로의 염증 및 종양 세포의 이동, 평활근 세포의 수축 및 성장 상태를 조절하고, 결과적으로 또한 혈압 및 혈관벽의 구조 및 또한 혈관신생화를 조절하는 내피 세포는 혈관계를 조절하는데 특히 중요하다. 상기한 혈관벽 기능의 대다수는, 최종적으로 심장 경색, 발작 및 다수 형태의 신부전증을 일으킬 수 있는 상황인 심각한 혈관 질환에 의해 저해된다.
내피는 중요 물질인 프로스타사이클린(PGI2)과 내피 유도된 이완 인자(endothelium-derived relaxing factor: EDRF)로도 공지된 일산화탄소(NO)를 형성하며, 이들 물질은 혈소판 및 혈관근 세포 모두를 억제하는 물질이다. 내피 기능은 프로스타사이클린(PGI2) 또는 EDRF(예: NO)와 같은 상기한 내피 인자에 의해 조절된다.
결과적으로, 특별한 방식으로 내피 기능부전과 관련된 질환을 치료하기 위해, 내피 기능부전을 진단할 수 있고 이의 과정을 조절할 수 있는 생화학적 매개변수를 개발할 필요가 있다.
내피 기능부전에 의해 유발되는, 아테롬성 동맥경화증 병변과 같이 비가역적 손상 자체가 아직 나타나지 않은 상태에서는, 가능한한 빨리 내피 기능부전을 인지할 수 있는 것이 바람직하다.
초기 상태에서 내피 기능부전을 확인하는 것은, 내피 기능부전의 가역적 치료를 이끌어낼 수 있는 신규한 치료법의 개발을 가능하게 한다.
생체내 내피 기능을 측정하는 공지된 방법으로는 침입 검출법(예: 정량적 혈관 조영법) 또는 비침입 영상 제공법이 있다. 상기한 방법들의 단점은 조사를 환자에게서 직접 수행해야 하고 정량화가 어려우며 비용이 많이 든다는 것이다.
따라서, 생체외 생물학적 물질(예: 세포 샘플 또는 혈액 샘플)에서 내피 기능을 실험실에서 통상적인 조사법으로 신속하고 간단하게 측정할 수 있도록 하는 유용한 생화학적/면역생물학적 방법을 수득하는 것이 또한 요구되고 있다.
내피 기능은 프로스타사이클린(PGI2) 또는 EDRF(예: NO)와 같은 내피 인자에 의해 조절될 수 있는 기능이다.
본 발명의 목적은 내피 기능을 평가하고 조절하기 위한 시약을 제공하는 것이다. 본 발명의 상기한 목적 및 다른 목적에 따라서, VASP(혈관확장제-자극된 인단백질)가 인산화되는 경우에만 VASP에 대해 지시되고 VASP에 결합하는 항체가 제공된다.
본 발명의 한가지 양태에서, 항체는 VASP가 세린 239 위치에서 인산화되는 경우(포스포세린 239 VASP)에만 VASP에 결합한다. 본 발명의 또다른 양태에서는, VASP가 세린 157 위치에서 인산화되는 경우(포스포세린 157 VASP)에만 VASP에 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명의 다른 양태는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 및 항체 단편을 포함한다. 다른 양태는 하이브리도마 세포주 16C2에 의해 생성되는 모노클로날 항체 및 특히 Mab 16C2를 포함한다.
본 발명의 추가 목적은 본 발명의 항체를 제조하는데 유용한 하이브리도마 세포를 제공하는 것이다. 본 발명의 추가 목적은 VASP가 인산화되는 경우에만 VASP에 결합하는, VASP에 대한 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주를 제공하는 것이다. 다른 양태에서는, 하이브리도마 세포주 16C2(DSM ACC2330)를 제공한다.
본 발명의 또다른 목적은 내피 기능을 평가하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 상기한 목적에 따라서, VASP의 인산화 상태를 측정하는 방법이 제공된다. 본 발명의 한가지 양태에서, VASP(혈관확장제-자극된 인단백질)가 인산화되는 경우에만 항원으로서의 VASP에 결합하는, VASP에 대한 항체를 생물학적 물질과 접촉시킨다.
본 발명의 또다른 양태에서는, 생물학적 물질과 결합하는 VASP 항체의 양을 정량화하는 것을 추가로 포함하는 방법을 제공한다. 특이적인 양태에는, 전기영동에 의해 VASP를 분해하고, VASP가 인산화되는 경우에만 VASP에 결합하는, VASP에 대한 항체를 VASP와 접촉시키는 웨스턴 블롯팅 방법(Western blotting method)이 포함된다. 다른 양태는 VASP가 인산화되는 경우에만 VASP에 결합하는, VASP에 대한 항체를 샘플과 접촉시킴을 포함하는 유세포분석법(flow cytometry method)이다.
본 발명의 또다른 양태에서는 진단 방법을 제공한다. 대표적인 진단 방법에는 VASP가 인산화되는 경우에만 VASP에 결합하는, VASP에 대한 항체를 샘플과 접촉시켜 VASP의 인산화 상태를 평가하는 것이 포함된다. 한가지 양태에서, 상기 방법은 샘플중에서의 VASP의 인산화를 정량적으로 측정하는 것을 포함한다. 다른 양태에서는, 항체를 포스포세린 239 VASP 또는 포스포세린 157 VASP에 결합시키는 방법을 기술하고 있다. 여전히 또다른 양태에서, 샘플은 사람의 혈소판 또는 사람의 전혈이다.
본 발명의 또다른 목적은 내피 기능의 마커를 검출하는 방법을 제공하는 것이다. 한가지 양태에서는, cGMP 및/또는 cAMP 수준에 영향을 미치는 물질에 노출시킨 환자의 샘플을 시험하고, 상기 샘플을 VASP가 인산화되는 경우에만 VASP에 결합하는, VASP에 대한 항체와 접촉시키고, 대조 샘플과 비교하여 VASP의 인산화 상태를 평가하는 것을 포함하여, cGMP 및/또는 cAMP 수준에 영향을 미치는 물질을 검출하는 방법을 제공한다.
추가의 한가지 양태에서는, 환자의 샘플을 VASP가 인산화되는 경우에만 VASP에 결합하는, VASP에 대한 항체와 접촉시키고, 정상 대조 샘플과 비교하여 VASP의 인산화 상태를 평가함을 포함하는, 내피 기능부전을 검출하는 방법을 상세히 설명한다.
본 발명의 추가 목적은 본원에서 기술하는 진단 방법을 수행하기 위한 편리한 키트를 제공한다. 상기 목적 외에도, VASP가 인산화되는 경우에만 VASP에 결합하는, VASP에 대한 항체를 포함하는 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 다른 목적은 내피 기능부전으로 고통받는 환자를 치료하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 상기 목적 및 다른 치료 목적에 따라서, 치료가 필요한 환자에게, VASP가 인산화되는 경우에만 VASP에 결합하는, VASP에 대한 항체의 치료적 유효량을 투여하는 치료 방법을 기술하고 있다.
저혈압(혈관확장) 호르몬 및 약물에 반응하여 혈소판 및 혈관벽에서 인산화되는 사람의 VASP(혈관확장제-자극된 인단백질)는 분자 유전학적 관점에서 최근에 발견되었고 분리되었으며 특성화되었다[참조 문헌: Haffner et al., EMBO J. 14, 19-27, 1995].
VASP는 생리학적, 병리생리학적 및 약리학적으로 매우 중요한 ANF/NO/cGMP/cGMP 단백질 키나제 신호 경로와 또한 cAMP/cAMP 단백질 키나제 신호 경로의 중요 성분이다[참조 문헌: U. Walter, Blick 1/97 Wurzburg University, pp. 79-81, 1997]. VASP는 거의 모든 사람 및 동물의 세포에서 발현되는데, 특히 혈소판, 혈관 평활근 세포 및 섬유아세포에서 고농도로 발견된다. 배양된 세포에서, VASP는 접착반(focal contact:세포/매트릭스 접촉 부위), 세포/세포 접촉, 미세섬유 및 운동성 막 영역[예: 전연(leading edge)]과 연관되어 있다[참조 문헌: Walter et al., Agents and Actions 45S, 255-268, 1995].
혈관계에서 VASP의 인산화는 혈소판 부착/응집 억제, 평활근 수축/이동 억제 및 세포주위(paracellular) 내피 침투 억제와 상호연관되어 있다.
VASP는 3개의 상이한 부위에서 인산화되고 탈인산화된다[세린 157, 세린 239 및 트레오닌 278, 참조 문헌: Horstrup et al., Eur. J. Biochem 225, 21-27 (1994)]. 세린 239는 특히 VASP의 제1 메티오닌을 계산에 포함하지 않는 경우에 때때로 세린 238로도 또한 지정된다.
VASP 세린 239는 생리학적 및 약리학적 NO 공여체와 혈소판 억제제 및 혈관확장제에 반응하여 사람의 완전한 혈관 세포(혈소판, 내피 세포 및 평활근 세포)에서 인산화된다.
VASP 세린 239의 인산화는, 특히 나트륨이뇨 펩타이드와 같은 중요 호르몬 또는 N0 방출 물질 및 약물에 의해 cGAMP를 통해 활성화되는 cGMP 의존적 단백질 키나제에 의해 매개된다. VASP 세린 239의 인산화는 cAMP-증가 호르몬 및 약물에 의해 활성화되는 cAMP 의존적 단백질 키나제에 의해 추가로 매개된다.
cAMP 의존적인 단백질 키나제가 주로 세린 157 위치를 인산화시키더라도, 이들은 또한 VASP의 세린 239 위치도 인산화시킨다. 세린 157 위치에서의 VASP의 인산화는 또한 사람의 혈소판에서 당단백질 Ⅱb 내지 Ⅲa에 대한 피브리노겐의 결합 억제와 밀접한 상호관련이 있는 것으로 또한 관찰되었다[참조 문헌: Horstrup et al., Eur. J. Biochem. 225, 21-27 (1994)].
생물학적 물질, 예를 들어 조직 및 세포 추출물에서 VASP의 인산화도를 측정하는 것, 특히 239 위치 및/또는 157 위치에서 VASP의 인산화를 측정하는 것은, cGMP 증가 호르몬 및/또는 cAMP 증가 호르몬 또는 약물(예: 동맥 나트륨이뇨 인자(ANF), 구아닐린, NO 방출 물질 및 약물) 모두를 검출하기 위한 진단 시스템의 개발을 가능하게 하며, 또한 생체내 내피 기능과 관련된 결론 도출을 가능하게 한다.
항체, 특히 가역적으로 인산화되는 단백질에 결합하는 항체는 미국 특허 제5,599,681호, 제WO93/21230호 및 문헌[참조 문헌: U. Walter, Blick 1/97 Wurzburg University, pp. 79-81, 1997]에 기술되어 있다.
본 발명의 목적은 생물학적 물질에서 VASP의 인산화 상태를 신속하고 간단한 방법으로 정성적 및/또는 정량적으로 측정할 수 있는 생화학적/면역생물학적 방법을 개발하는 것이다.
상기 목적은 VASP가 인산화된 형태로 존재하는 경우에만 항원으로서의 VASP에 결합하는 항체를 제공함으로써 성취된다.
결과적으로, 본 발명은 다소 일반적으로 VASP가 인산화된 형태로 존재하는 경우에만 항원으로서의 VASP에 결합하는 항체에 관한 것이다.
본 발명의 의미내에서 항체는, VASP에서 인산화된 영역을 특이적으로 인지하는 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체(Mabs) 모두 및 이의 단편들, 및 또한 SCFV 단편 또는 다른 합성 또는 재조합 단백질 도메인으로서 이해한다.
항체 단편은 표적 항원, 이 경우 VASP 또는 이의 특이적 부분에 결합할 수 있는 항체의 어떠한 부분도 포함한다. 상세하게는 항체 단편은 F(ab')2, Fab, Fab' 및 Fv 단편을 포함한다. 이들은 임의의 항체 부류로부터 생성될 수 있지만, 통상 IgG 또는 IgM으로부터 제조된다. 이들은 통상적으로 재조합 DNA 기술로 제조하거나, 또는 파파인 또는 펩신으로 단백질분해시키는 전통적인 방법을 사용하여 제조할 수 있다[참조 문헌: CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, chapter 2, Coligan et al., eds., (John Wiley & Sons 1991-92)].
F(ab')2 단편은 전형적으로 약 110kDa(IgG) 또는 약 150kDa(IgM)이고, 디설파이드 결합(들)에 의해 힌지(hinge)에서 연결되어 있는 2개의 항원 결합 영역을 포함한다. 실질적으로 Fc는 상기 단편들에 전혀 존재하지 않는다. Fab' 단편은 전형적으로 약 55kDa(IgG) 또는 약 75kDa(IgM)이고, 예를 들어 F(ab')2 단편의 디설파이드 결합(들)을 환원시킴으로서 형성될 수 있다. 생성된 유리 설프하이드릴 그룹(들)은 검출 시약(예: 효소)과 같은 다른 분자에 Fab' 단편을 편리하게 접합시키는데 사용할 수 있다. Fab 단편은 일가이고, 일반적으로 약 50kDa(임의의 공급원으로부터도)이다. Fab 단편은 경쇄(L) 및 중쇄(H), 항체의 항원 결합 부분의 가변 영역(각각 VL 및 VH) 및 불변 영역(각각 CL 및 CH)을 포함한다. H 및 L 부분은 분자내 디설파이드 브릿지로 연결되어 있다.
Fv 단편은 통상 약 25kDa(공급원에 상관없음)이고, 경쇄 및 중쇄 둘다의 가변 영역(각각 VL 및 VH)을 포함한다. 일반적으로, VL 및 VH 쇄는 비공유 상호작용에 의해서만 함께 고정되어 있기 때문에 이들은 용이하게 분리된다. 그러나, 이들은 크기가 작다는 잇점이 있으며, 보다 큰 Fab 단편의 결합 특성과 동일한 결합 특성을 보유하고 있다. 따라서, 예를 들어 글루타르알데히드(또는 다른 화학적 가교결합제), 분자내 디설파이드 결합(시스테인의 혼입에 의함) 및 펩타이드 링커를 사용하여, VL 및 VH 쇄를 가교결합시키는 방법이 개발되고 있다. 생성된 Fv는 단쇄가 된다(즉, SCFv).
다른 바람직한 방법은 상이한 항체 공급원으로부터의 가변 쇄를 혼합하고 매칭시킴으로써 새로운 특이성을 갖는 Fv를 생성할 수 있는 재조합 방법에 의해 SCFv를 생성시키는 것을 포함한다. 전형적인 방법에서는, 카세트 영역을 발현을 촉진시키는 적절한 조절 요소를 포함하는 재조합 벡터가 제공된다. 카세트 영역은 링커의 5' 및 3' 말단 둘다에 융합 단백질을 생성시키기에 편리한 부위를 갖는 펩타이드 링커 암호화 DNA를 포함한다. 중요 가변 영역(들)을 암호화하는 DNA는 벡터내에 클로닝되어 링커를 갖는 융합 단백질을 형성함으로써 SCFv를 생성할 수 있다.
다른 예시적인 방법으로, 2개의 Fv를 암호화하는 DNA를 링커를 암호화하는 DNA와 연결시킬 수 있으며, 3부분으로 이루어진 생성된 융합물은 통상적인 발현 벡터내에 직접 연결시킬 수 있다. 임의의 이러한 방법으로 생성되는 SCFv DNA는 선택된 벡터에 따라 원핵 세포 또는 진핵 세포에서 발현시킬 수 있다.
VASP가 인산화된 형태로 존재하는 경우에만 항원으로서의 VASP에 결합하는 모노클로날 항체 및 이의 단편이 바람직하다.
또한 특히, 239 위치의 세린이 인산화되는 경우(포스포세린 239 VASP)에 항원으로서의 VASP 또는 VASP의 세린 239 부근의 펩타이드 서열을 포함하는 펩타이드에만 결합하는 모노클로날 항체 및 이의 단편이 바람직하다.
본 발명에서, 용어 VASP는 VASP의 유도체, 즉 VASP의 기능적으로 동등한 부분, 돌연변이체, 단편 또는 변형체(예: 세린 157 및/또는 트레오닌 278 위치에서 추가로 인산화된 포스포세린 239 VASP, 및 또한 예를 들어 글리코실화 돌연변이체, 및 단백질/단백질 상호작용에 중요한 기타 공유적 개질체 및 구조적 요소)를 의미하는 것으로 이해한다. 본 발명에서, 용어 VASP는 사람의 VASP나 다른 종, 특히 랫트, 마우스, 래빗트, 개, 돼지 또는 원숭이와 같은 포유동물로부터의 VASP를 모두 포함한다.
항체는, 예를 들어 문헌에 기재되어 있는 기술에 따라서 통상적인 방법으로 제조할 수 있다[참조 문헌: Kohler and Milstein, Nature 256; 495, 1975]. 전형적으로 인산화 상태를 기본으로 하는 선택성이 요구되는 경우, VASP의 인산화 형태에 대해 항체를 유발시킨다. 분리된 항체는 선택성을 확인하는 통상적인 방법을 사용하여 선별할 수 있다. 바람직하게는, 항체를 세린 157, 세린 239 및/또는 트레오닌 278을 포함하는 VASP의 펩타이드 단편에 대해 유발시킨다.
항원성 VASP 펩타이드가 체액 반응을 발휘할 수 있는한 이의 길이는 중요하지 않다. 전형적인 항원성 펩타이드의 길이는 약 50개 아미노산 미만이다. 몇몇 바람직한 펩타이드는 길이가 약 20개 아미노산 미만이다. 가장 바람직한 펩타이드는 길이가 약 6 내지 약 12개 아미노산이다. 바람직한 펩타이드에는 KLRKVS239KQ 또는 RKVS239KQE가 포함된다. 펩타이드는 바람직하게는 세린 157, 세린 239 및/또는 트레오닌 278에서 인산화된다. 펩타이드는 재조합 방법으로 수득할 수 있다. 전형적으로, VASP의 단백질분해, 또는 시험관내 합성 및 인산화에 의해 이를 제조한다.
또한 상기한 특성을 나타내고, 유세포분석법에 이용할 수 있는 모노클로날 항체가 바람직하다. 유세포분석법에서 통상적으로 사용되는 고착 단계에서 예상할 수 있는 바와 같이, 항원의 형태를 변화시킬 수 있는 조건하에 항원을 적용하는 경우에도 신규한 항체가 특이성을 보유하는 것이 요구된다. 신규한 항체는, 예를 들어 실제로 이를 간단히 시험함으로써 유세포분석법에 사용하기에 적합한지를 측정할 수 있다.
모노클로날 항체 16C2가 특히 바람직하다.
신규한 항체는 당해 분야의 숙련가에게 자체 공지된 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 문헌에 기재되어 있는 기술을 사용한 하이브리도마 세포의 제조는, 특히 모노클로날 항체를 제조하는 경우에 언급할 수 있다[참조 문헌: Kohler and Milstein, Nature 256; 495, 1975]. 정제된 항체의 특이성은, 예를 들어 하기의 시험 방법을 사용하여 검사할 수 있다:
a) cAMP 의존적 또는 cGMP 의존적 단백질 키나제에 의해 상이한 정도로 인산화되는 재조합 VASP를 사용하는 웨스턴 블롯팅, 이 방법으로 인산화된 VASP를 사용하여 양성 신호만이 관찰될 수 있다;
b) 세포 추출물, 예를 들어 사람의 VASP, 또는 상이한 방식으로 돌연변이화되고 각 경우에서 3개의 인산화 부위중 하나가 돌연변이화되어 제거된 VASP[(S157A) VASP, (S239A) VASP 및 (T278A) VASP]와 각각의 경우에 사람의 cGMP 단백질 키나제로 형질감염시킨 Pkt2 세포 추출물을 사용하는 웨스턴 블롯팅. 웨스턴 블롯의 양성 신호가 다른 2개의 돌연변이체가 아닌 S239A 돌연변이체에 의해 제거되는 항체가 적합하다;
c) 상이한 혈관확장제(예: 프로스타사이클린 또는 NO 공여체)나 cAMP 단백질 키나제 또는 cGMP 단백질 키나제의 활성화제로 처리된 사람의 혈소판을 사용하는 웨스턴 블롯팅. 추출물에서 인산화된 VASP를 사용하는 경우에만 특이적인 밴드가 검출되는 항체가 적합하다. 항체는 또한 사람의 섬유아세포와 또한 랫트 및 마우스의 혈소판을 사용하는 유사 방법으로도 선별할 수 있다;
d) 고착된 사람의 혈소판 및 내피 세포를 사용하는 면역형광적 조사. VASP가 인단백질로서 존재하는 경우에 양성 신호가 관찰된다.
추가로 본 발명은 신규한 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주, 특히 바람직하게는 모노클로날 항체 16C2를 생성하는 하이브리도마 세포주 16C2에 관한 것이다.
모노클로날 항체 16C2를 생성하는 하이브리도마 세포주 16C2는 부다페스트 조약의 규칙에 따라 1997년 11월 6일자로 독일 데-38124 브라운슈바이크 마쉐로더 벡 1베 소재의 도이췌 삼릉 폰 미크로오가니즈멘 운트 젤쿨투렌[Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen; 저먼 콜렉션 오브 마이크로오가니즘즈 앤드 셀 컬쳐즈(German collection of microorganisms and cell cultures)]에 DSM ACC2330의 기탁 번호로 기탁되었다.
신규한 항체는 시험관내 조건 및 생체내 조건하에 발생하는 VASP의 인산화, 바람직하게는 VASP의 세린 239 및/또는 세린 157 인산화, 특히 바람직하게는 VASP의 세린 239 인산화를 정성적 및/또는 정량적으로, 바람직하게는 정량적으로 측정하는데 적합하다.
항체를 사용하는 정량적 방법은 당해 기술 분야에 익히 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌에서 찾을 수 있다[참조 문헌: 상기한 CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY]. 이러한 방법에는 효소-결합 면역흡착검정(enzyme-linked immunosorbant assay; ELISA), 방사선면역측정법(radioimmunoassay; RIA) 등이 포함된다.
또한 신규한 항체는 생물학적 물질에서 인산화된 VASP, 보다 바람직하게는 포스포세린 239 VASP 및/또는 포스포세린 157 VASP, 특히 바람직하게는 포스포세린 239 VASP를 정성적 및/또는 정량적으로, 바람직하게는 정량적으로 측정하는데 적합하다.
생물학적 물질은, 예를 들어 세포 추출물, 조직 추출물, 세포 조각, 세포 조직 및 세포들(예: 혈소판, 백혈구, 내피 세포, 평활근 세포 및 섬유아세포)로서 이해한다. 생물학적 물질은, 사람이나 기타 포유동물(예: 랫트, 마우스, 래빗트, 개, 돼지 또는 원숭이)로부터 유도할 수 있다. 사람 기원의 생물학적 물질이 바람직하다.
신규한 항체는 생물학적 물질에서, 예를 들어 NIH 겔 블롯팅 이미지 1.6 소프트웨어(NIH gel blotting Image 1.6 software)를 사용하여 당해 분야의 숙련가에게 공지된 방법에 따라, 웨스턴 블롯의 방사선사진을 정량적으로 평가하거나 또는 다른 면역형광법에 의해 인산화된 VASP, 특히 포스포세린 157 VASP 및/또는 포스포세린 239 VASP를 정량적으로 측정하는데 사용할 수 있다.
VASP의 세린 239 및 세린 157의 인산화와 cGMP 의존적 및/또는 cAMP 의존적 단백질 키나제 활성 사이에 존재하는 상호연관성으로 인해, 신규한 항체는 또한 cGMP 신호 경로 및 cAMP 신호 경로, 특히 cGMP 신호 경로를 진단하기 위한 시약으로서 사용하기에 적합하다.
웨스턴 블롯팅 기술 및 면역형광법에 의해 생물학적 물질에서 포스포세린 239 VASP를 측정하는데 신규한 항체를 사용하는 것은, 또한 cGMP 의존적 물질, 호르몬 또는 약물을 검출하는 진단 방법의 개발을 가능하게 한다. 언급할 수 있는 예로는 ANF, 구아닐린, NO 방출 물질 또는 약물이 있다. 예를 들어, 특히 발생될 수 있는 임의의 니트레이트 내성 현상에 대한 정보를 제공하는, NO 공여체의 조절 과정 및 치료를 모니터할 수 있다.
VASP의 세린 157의 인산화와 cAMP 의존적 단백질 키나제 활성 사이에 존재하는 상호연관성으로 인해, 신규한 항체는 또한 cAMP 증가 물질, 호르몬 또는 약물을 진단하기 위한 시약으로 또한 사용할 수 있다.
결과적으로 본 발명은 또한 진단 및/또는 치료에서의 신규한 항체 또는 이의 단편의 용도에 관한 것이다.
신규한 진단 방법은 실험실에서 사람의 체외(생체외)에서 수행할 수 있는 방법이다.
신규한 항체는 상이한 종으로부터 유도된 생물학적 물질에서 VASP의 인산화도를 측정하는데 사용할 수 있다. 언급할 수 있는 종의 예로는 사람, 랫트, 마우스, 래빗트, 개, 돼지 또는 원숭이가 있다. 사람, 랫트, 마우스 또는 개로부터의 생물학적 물질에서 인산화된 VASP를 측정하는데 신규한 항체를 사용하는 것이 바람직하다. 사람의 생물학적 물질에서 인산화된 VASP를 측정하는데 신규한 항체를 사용하는 것이 특히 바람직하다.
신규한 항체 또는 이의 단편은 또한 바이오센서(biosensor)로도 사용할 수 있다. 바이오센서는 그 자체가 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 특히 항체, 렉틴 또는 수용체와 같은 2차 특이적 결합 파트너를 사용하는 방법이 바람직하다. 상기의 경우에서 검출 및 정량화를 위해, 특이적 결합 파트너중 하나가 검출가능한 표지를 포함할 수 있다. 상기 표지는 자체가 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있으며, 예를 들어 발색단, 발광단, 형광단, 효소, 방사능 동위원소, 또는 착색된 또는 무색 입자일 수 있다. 당해 분야의 숙련가에게 자체가 공지된 방법을 사용하여, 예를 들어 또 다른 항체 또는 바이오틴/아비딘 브릿지에 의해 비표지된 특이적 결합 파트너를 고체상에 직접 또는 간접적으로 커플링시키는 방법이 바람직하다.
신규한 항체 또는 이의 단편은 또한 당해 분야의 숙련가에게 공지된 방법에 의해 방사능으로 표지하여 면역섬광조영법 또는 또한 면역치료법에 사용할 수 있다. 또한, 상기한 모노클로날 항체는 활성 화합물 담체로서 사용할 수 있으며, 내피 기능부전에 의해 유발되는 질환을 치료하는데 사용할 수 있다.
Mab 16C2의 V 유전자의 완전한 뉴클레오타이드 서열을 분석한 다음, 예를 들어 초가변 영역을 사람의 Mab 골격에 삽임시킴으로써 또한 항체 작제물을 기술적으로 생성할 수 있다[참조 문헌: Jones et al., Nature 321, 522-525, 1986; Verhoyen et al., Science 239, 1534-1536, 1988].
경우에 따라, 예를 들어 당해 분야의 숙련가에게 공지된 방법을 사용하여 고착시킨 전혈 샘플상에서 수행되는 유세포분석법에 의해 혈소판에서 항원-결합된 항체를 정량화하는 것이 바람직하다. 유세포분석법은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌에 기술되어 있는 바대로 수행할 수 있다[참조 문헌: G. Otten and W.M. Yokoyama (1992) Flow cytometry analysis using the Becton Dickinson FACScan, Current Protocols in Immunology, 5.4.1-5.4.19].
신규한 항체를 사용하는, VASP 인산화, 특히 VASP 세린 239 인산화의 유세포분석에 의한 분석은 사람의 혈소판으로 한정되지 않으며, 또한 임파구, 단구, 백혈구, 내피 세포 및 평활근 세포와 같은 다른 세포 유형에서도 수행할 수 있다.
신규한 항체의 도움으로 바로 추출한 사람의 혈소판에서 VASP의 인산화, 특히 포스포세린 239 VASP의 인산화를 측정하는데 유세포분석법을 사용하는 것은 NO 및 프로스타사이클린과 같은 내피 인자의 생체외 및 생체내 활성의 측정을 가능하게 하여, 결과적으로는 예를 들어 아테롬성 동맥경화증, 고혈압, 당뇨병, 심부전 및 신부전에서 발견되는 것과 같은 심혈관 장애의 내피 기능 또는 내피 기능부전을 평가할 수 있다.
신규한 항체의 도움으로, VASP의 인산화, 특히 VASP 세린 239의 인산화를 측정하는 것은 상기한 질환의 치료를 조절할 수 있게 한다. 니트레이트 내성과 같이 치료에 대한 내성의 발달도 또한 측정할 수 있다.
신규한 항체는 또한 생물학적 샘플에서 VASP의 인산화 상태, 및/또는 이와 단백질의 상호작용에 영향을 미치는 치료제로서 사용할 수 있다.
결론적으로, 본 발명은 신규한 항체를 하나 이상 포함하는 약제학적 제제에 관한 것이다.
신규한 제제는 장용(경구), 비경구(정맥내), 직장 또는 국소(국부)적으로 사용할 수 있다. 이들은 액제, 산제(정제, 또는 미세캡슐을 포함하는 캡슐제), 리포좀 제제, 지질 복합제, 콜로이드성 분산액, 주사액 또는 좌제의 형태로 투여할 수 있다. 약제학적으로 통상적인 액체 또는 고체 충전제 및 증점제, 용매, 유화제, 활주제, 교미제(taste corrigent), 염료 및/또는 완충 물질이 본 발명의 제형을 위한 보조 물질로서 적합하다. 편리한 투여량으로서 체중 ㎏당 0.1 내지 100㎎를 투여한다. 이들은 신규한 항체의 적어도 1일 유효량(예: 30 내지 3000㎎)을 함유하는 투여 단위형으로 편리하게 투여한다.
투여될 1일 투여량은 포유동물 개체의 체중, 연령, 성별 및 상태에 좌우된다. 그러나, 보다 높거나 낮은 1일 투여량이 또한 필요할 수 있다. 1일 투여량은 단일 투여 단위 형태 또는 다수의 보다 작은 투여 단위 형태로 한번에 투여하거나, 분할된 투여형으로 미리측정한 간격을 두고 수회 투여할 수 있다.
약제학적 제제를 제조하기 위해, 신규한 항체는 치료학적으로 불활성인 유기 및 무기 부형제내에 삽입시킬 수 있다. 락토스, 옥수수 전분 또는 이의 유도체, 탈로우 및 스테아르산 또는 이의 염이 정제, 피복 정제 및 경질 젤라틴 캡슐제용 부형제의 예이다. 물, 폴리올, 수크로스, 전화당 및 글루코스는 용액을 제조하는데 적합한 부형제이다. 물, 알코올, 폴리올, 글리세롤 및 식물성유는 주사액을 제조하는데 적합한 부형제이다. 식물성유 및 경화유, 왁스, 지방 및 반고체 폴리올이 좌제용으로 적합한 부형제이다. 약제학적 제제는 또한 방부제, 용매, 안정화제, 습윤제, 유화제, 감미제, 염료, 향미제, 삼투압을 변화시키기 위한 염, 완충제, 피복제, 산화방지제, 및 경우에 따라 기타 치료적 활성 물질을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 하나 이상의 신규한 항체를 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 부형제와, 경우에 따라 기타 적합한 활성 화합물, 첨가제 또는 보조 물질과 함께 적합한 투여형으로 제조하는, 신규한 약제의 제조방법에 관한 것이다.
또한 본 발명은 VASP, 특히 포스포세린 239 VASP에서 인산화 서열을 특이적으로 인지하는 폴리클로날 항체, SCFV 단편 또는 기타 합성 또는 재조합 단백질 도메인과 같은 특이적인 프로브의 도움으로 일반적으로는 VASP의 인산화, 바람직하게는 VASP의 세린 239 인산화를 측정하기 위한 진단 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한, VASP에서 인산화된 세린 157 및/또는 트레오닌 278을 포함하는 서열을 특이적으로 인지하는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, SCFV 단편 또는 기타 합성 또는 재조합 단백질 도메인과 같은 특이적인 프로브의 도움으로 VASP의 세린 157 인산화 및/또는 트레오닌 278 인산화를 측정하기 위한 진단 방법에 관한 것이다.
VASP는 프롤린이 풍부한 펩타이드(예: 자익신 및 빈쿨린)에 결합하고, 동시에 이의 프롤린이 풍부한 아미노산 도메인이 프로필린에 결합함으로써, 어댑터 분자로서 작용하는 VASP와 함께 필라멘트상 액틴을 형성할 수 있다. 상기한 단백질/단백질 상호작용을 방해하면 혈소판 응집 또는 혈관 수축이 불완전해질 수 있다. 따라서, 액틴/미오신 브릿지의 형성은, 예를 들어 평활근 세포의 수축에 필수적이다. 세린 157 위치에서의 VASP의 인산화는 피브리노겐 수용체 당단백질 Ⅱb/Ⅲa의 억제와 상호관련이 있는 것으로 밝혀졌다[참조 문헌: Horstrup et al., Eur. J. Biochem., 225, 21-27, 1994]. 결과적으로 세린 157 위치에서 VASP의 인산화를 측정하는 것은, VASP와 이의 세포내 결합 파트너와의 상호작용에 영향을 미치고, 예를 들어 혈관 손상과 관련된 심혈관 질환의 치료에 적합한 물질 또는 약물의 전신적인 조사를 가능하게 한다.
또한 수행 실시예에 기술되어 있는 양태가 특히 바람직하다.
하기 실시예는 본 발명을 명확하게 하고, 어떤 방식으로든지 이를 제한하지는 않는다.

Claims (24)

  1. 혈관확장제-자극된 인단백질(VASP)이 세린 239 위치에서 인산화된 경우(포스포세린 239 VASP)에만 VASP에 결합할 수 있는, 수탁 번호가 DSM ACC 2330인 하이브리도마 세포주에 의해 생산되는 모노클로날 항체 16C2 또는 이의 단편.
  2. 제1항에 있어서, 생물학적 물질 중의 포스포세린 239 VASP를 정성적 또는 정량적으로 측정하기 위한 진단제로서 사용할 수 있는 모노클로날 항체 16C2 또는 이의 단편.
  3. 제2항에 있어서, 생물학적 물질이 사람의 혈소판 또는 사람의 혈액인 모노클로날 항체 16C2 또는 이의 단편.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제2항 또는 제3항에 있어서, 포스포세린 239의 측정이 웨스턴 블롯팅 기술에 의해 수행되는 모노클로날 항체 16C2 또는 이의 단편.
  7. 제2항 또는 제3항에 있어서, 포스포세린 239의 측정이 유세포분석법에 의해 수행되는 모노클로날 항체 16C2 또는 이의 단편.
  8. 제2항 또는 제3항에 있어서, 생물학적 물질중에서 cGMP 및/또는 cAMP의 수준에 영향을 미치는 물질을 검출하기 위한 모노클로날 항체 16C2 또는 이의 단편.
  9. 제2항 또는 제3항에 있어서, 내피 인자의 생체내 활성을 측정하기 위한 모노클로날 항체 16C2 또는 이의 단편.
  10. 제2항 또는 제3항에 있어서, 내피 기능부전을 검출하기 위한 모노클로날 항체 16C2 또는 이의 단편.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 모노클로날 항체 16C2를 생산하는 하이브리도마 세포주 DSM ACC 2330.
  14. 삭제
  15. 제1항에 따르는 모노클로날 항체 16C2 또는 이의 단편을 포함하는 진단 키트.
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
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