DE69817616T2

DE69817616T2 - Antikörper gegen vasp (vasodilator-stimulated phosphoprotein), hybridomzellen für deren gewinnung, und deren verwendung

Info

Publication number: DE69817616T2
Application number: DE69817616T
Authority: DE
Inventors: Martin Eigenthaler; Heinz Hoschützky; Ulrich Walter
Original assignee: Vasopharm Biotech GmbH
Current assignee: Biocytex SRL
Priority date: 1997-11-07
Filing date: 1998-11-06
Publication date: 2004-07-08
Anticipated expiration: 2018-11-07
Also published as: DE69817616D1; DE19749091C1

Description

Die Erfindung betrifft den Antikörper 16C2 gegen VASP (vasodilator-stimuliertes Phosphoprotein), der VASP nur dann als Antigen bindet, wenn VASP in phosphorylierter Form vorliegt, die Hybridomazelle zu seiner Herstellung sowie die Verwendung des Antikörpers bzw. Antikörperfragmente davon als Diagnostika.
Erkrankungen des Gefäßsystems sind für eine große Zahl chronischer und lebensbedrohlicher Erkrankungen wie zum Beispiel Herzinfarkt, Schlaganfall, arterielle Verschlusskrankheit und viele Formen von Nierenversagen verantwortlich.
Von besonderer Bedeutung für die Regulation des Gefäßsystems sind die Endothelzellen, die unter anderem das Blutgerinnungssystem, den funktionellen Zustand der Thrombozyten, die Migration von Entzündungs- und Tumorzellen in die Gefäßwand, den Kontraktions- und Wachstumszustand von glatten Muskelzellen und damit auch Blutdruck und Gefäßwandstruktur sowie die Gefäßneubildung kontrollieren. Viele dieser Gefäßwandfunktionen sind bei ernsten vaskulären Erkrankungen gestört, eine Situation, die letztendlich zu Herzinfarkt, Schlaganfall und vielen Formen von Nierenversagen führen kann.
Das Endothel bildet die wichtigen Substanzen Prostacyclin (PGl₂) und Stickstoffmonoxid (NO), das auch als Endothelium-Derived Relaxing Factor (EDRF) bekannt ist, welche sowohl die Thrombozyten als auch die Gefäßmuskelzellen hemmen. Die Endothelfunktionen werden durch die genannten Endothelfaktoren, wie beispielsweise Prostacyclin (PGl₂) oder EDRF, z. B. NO, kontrolliert.
Für die gezielte Behandlung von Krankheiten, die mit einer endothelialen Dysfunktion einhergehen, ist es somit erforderlich, biochemische Parameter zu entwickeln, die eine Diagnose und eine Kontrolle des Verlaufs einer endothelialen Dysfunktion ermöglichen.
Wünschenswert ist die möglichst frühzeitige Erkennung von endothelialen Dysfunktionen, also in einem Stadium, in dem sich ein durch endotheliale Dysfunktionen hervorgerufener irreversibler Schaden, wie beispielsweise atherosklerotische Läsionen, noch nicht manifestiert hat.
Eine frühzeitige Erkennung einer endothelialen Dysfunktion ermöglicht die Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze, die eine reversible Behandlung der endothelialen Dysfunktion bewirken können.
Bekannte Verfahren zur Bestimmung der in vivo Endothelfunktionen sind invasive Nachweisverfahren, wie beispielsweise die quantitative Angiographie oder aber auch nicht-invasive, bildgebende Verfahren. Nachteile dieser Verfahren sind, dass diese Untersuchungen direkt am Patienten durchgeführt werden, schwer quantifizierbar und sehr teuer sind.
Es ist daher ebenfalls wünschenswert, biochemische/ immunbiologische Verfahren zur Verfügung zu haben, die eine schnelle und einfache ex vivo Bestimmung der Endothelfunktionen in biologischem Material, beispielsweise in Zell- oder Blutproben mit Hilfe von Routineuntersuchungen im Labor, ermöglichen.
Endothelfunktionen sind solche Funktionen, die durch Endothelfaktoren, wie beispielsweise Prostacyclin (PGl₂) oder EDRF, z. B. NO, reguliert werden können.
Es ist eine Aufgabe der Erfindung, Reagenzien für die Bestimmung und Modulation der Endothelfunktion bereitzustellen. Gemäß dieser und anderer Aufgaben der Erfindung wird der Antikörper 16C2 bereitgestellt, der gegen VASP (vasodilator-stimuliertes Phosphoprotein) gerichtet ist und VASP nur dann bindet, wenn VASP an Position Serin 239 phosphoryliert ist (Phosphoserin 239 VASP).
Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, Hydridomazellen bereitzustellen, die bei der Herstellung der Antikörper der Erfindung verwendbar sind. Dieser Aufgabe der Erfindung folgend wird die Hydridomazelllinie 16C2 (DSM ACC2330) bereitgestellt, die den monoklonalen Antikörper 16C2 gegen VASP produziert, der VASP nur dann bindet, wenn es phosphoryliert ist.
Es ist noch eine weitere Aufgabe der Erfindung, Verfahren zur Bestimmung der Endothelfunktion bereitzustellen. Gemäß diesem Aspekt der Erfindung werden Verfahren zur Bestimmung des Phosphorylierungszustands von VASP bereitgestellt. In einem Aspekt der Erfindung wird biologisches Material mit dem Antikörper 16C2 gegen VASP (vasodilatorstimuliertes Phosphoprotein) in Kontakt gebracht, welcher VASP nur dann als Antigen bindet, wenn VASP an der Position Serin 239 phosphoryliert ist.
In einem anderen Aspekt der Erfindung wird ein quantitatives Verfahren bereitgestellt, das ferner die Quantifizierung der Menge des VASP Antikörpers umfasst, der das biologische Material bindet. Eine spezifische Ausführungsform umfasst ein Western Blotting-Verfahren, das es mit sich bringt, VASP mittels Elektrophorese aufzutrennen und VASP mit dem Antikörper 16C2 in Kontakt zu bringen. Eine andere Ausführungsform ist ein Durchflusscytometrie-Verfahren, das umfasst, eine Probe mit dem Antikörper 16C2 in Kontakt zu bringen.
In noch einem weiteren Aspekt der Erfindung werden Diagnoseverfahren bereitgestellt. Ein repräsentatives Verfahren bringt es mit sich, eine Probe mit dem Antikörper 16C2 in Kontakt zu bringen und den Phoshorylierungszustand von VASP zu bestimmen. In einer Ausführungsform umfasst dieses Verfahren die quantitative Bestimmung der Phosphorylierung von VASP in der Probe. In noch einer weiteren Ausführungsform ist die Probe humane Thrombozyten oder humanes Blut.
Es ist noch eine weitere Aufgabe der Erfindung, Verfahren zum Nachweis vom Markern der Endothelfunktion bereitzustellen. In einem Aspekt wird ein Verfahren zum Nachweis von Substanzen, die den cGMP- und/oder cAMP-Spiegel beeinflussen, bereitgestellt, das die Untersuchung einer Probe eines Patienten, der einer Substanz ausgesetzt war, die den cGMP- und/oder cAMP-Spiegel beeinflusst, das In-Kontakt-Bringen der Probe mit dem Antikörper 16C2 und die Bestimmung des Phoshorylierungszustands von VASP bezogen auf eine Kontrollprobe umfasst.
In noch einem weiteren Aspekt wird ein Verfahren zum Nachweis der endothelialen Dysfunktion genau beschrieben, das beinhaltet, eine Probe aus einem Patienten mit dem Antikörper 16C2 in Kontakt zu bringen und den Phoshorylierungszustand von VASP bezogen auf eine normale Kontrollprobe zu bestimmen.
Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, einen geeigneten Kit zur Durchführung der hier offenbarten diagnostischen Verfahren bereitzustellen. Dieser Aufgabe folgend wird ein diagnostischer Kit bereitgestellt, der den Antikörper 16C2 enthält.
Kürzlich wurde das humane VASP (vasodilator-stimuliertes Phosphosprotein), das in Thrombozyten und Gefäßwandzellen in Antwort auf hypotensive (vasodilatorische) Hormone und Arzneimittel phosphoryliert wird, entdeckt, isoliert und molekulargenetisch charakterisiert (Haffner et al., EMBO J. 14, 19–27, 1995).
VASP ist eine wichtige Komponente des physiologisch, pathophysiologisch und pharmakologisch sehr wichtigen ANF/NO/cGMP/cGMP-Proteinkinase-Signalwegs sowie des cAMP/cAMP-Proteinkinase-Signalwegs (U. Walter, Blick 1/97 Universität Würzburg, S. 79–81, 1997). VASP wird in fast allen humanen und tierischen Zellen exprimiert, besonders hohe Konzentrationen findet man in Thrombozyten, vaskulären glatten Muskelzellen und Fibroblasten. In kultivierten Zellen ist VASP mit fokalen Kontakten (Zell/Matrix-Kontakstellen), Zell-Zell-Kontakten, Mikrofilamenten und dynamischen Membranregionen (z. B. "leading edge") assoziiert (Walter et al., Agents and Actions 455, 255–268, 1995).
Die Phosphorylierung von VASP im Gefäßsystem korreliert mit der Hemmung der Thrombozytenadhäsion/-aggregation, der Hemmung der Glattmuskelkontraktion/-migration sowie der Hemmung der parazellulären endothelialen Permeabilität.
VASP wird an drei unterschiedlichen Stellen (Serin 157, Serin 239 und Threonin 278, siehe Horstrup et al., Eur. J. Biochem. 225, 21–27 (1994)) phosphoryliert und dephosphoryliert. Serin 239 wird gelegentlich auch als Serin 238 bezeichnet, und zwar dann, wenn das erste Methionin von VASP nicht mitgezählt wird.
VASP Serin 239 wird in intakten humanen Gefäßzellen (Thrombozyten, Endothelzellen, glatte Muskelzellen) in Antwort auf physiologische und pharmakologische NO-Donatoren sowie Thrombozyteninhibitoren und Vasodilatoren phosphoryliert.
Die Phosphorylierung von VASP Serin 239 wird insbesondere von cGMP-abhängigen Proteinkinasen vermittelt, die über cGMP von wichtigen Hormonen, wie zum Beispiel natriuretische Peptide oder NO-freisetzende Substanzen und Arzneimittel aktiviert werden. Die Phosphorylierung von VASP Serin 239 wird zusätzlich auch von cAMP-abhängigen Proteinkinasen vermittelt, die über cAMP-erhöhende Hormone und Arzneimittel aktiviert werden.
Während cAMP-abhängige Proteinkinasen hauptsächlich die Position Serin 157 phosphorylieren, phosphorylieren sie auch die Position Serin 239 von VASP. Ferner wurde eine enge Korrelation der VASP-Phosphorylierung an Position Serin 157 mit der Inhibierung der Bindung von Fibrinogen an Glykoprotein IIb–IIIa in menschlichen Blutplättchen beobachtet (Horstrup et al., J. Biol. Chem. 269, 14509– 14517(1994)).
Die Bestimmung des Phosphorylierungsgrads von VASP in biologischem Material, beispielsweise in Extrakten von Geweben und Zellen, insbesondere die Bestimmung der VASP-Phosphorylierung an Position 239 und/oder Position 157 wäre ein wichtiger biochemischer Parameter, dessen Messung es ermöglichen würde, ein diagnostisches System zum Nachweis aller cGMP- und/oder cAMP-erhöhender Hormone oder Arzneimittel, wie beispielsweise atrialer natriuretischer Faktor (ANF), Guanylin, NO-freisetzende Substanzen und Arzneimittel zu entwickeln, und ferner Rückschlüsse über die in vivo Endothelfunktionen zulässt.
Antikörper, die spezifisch an reversibel phosphorylierte Proteine binden, wurden in US 5,599,681 , WO 93/21230 und U. Walter, Blick 1/97 Universität Würzburg, S. 79– 81, 1997 beschrieben.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war die Entwicklung biochemischer/immunbiologischer Methoden, die eine schnelle und einfache qualitative und/oder quantitative Bestimmung des Phosphorylierungszustands von VASP in biologischem Material ermöglicht.
Diese Aufgabe wurde gelöst durch die Bereitstellung des monoklonalen Antikörpers 16C2, der VASP nur dann als Antigen bindet, wenn VASP in phosphorylierter Form vorliegt, phosphoryliert an Serin 239.
Die Erfindung betrifft somit ganz allgemein Antikörper, die VASP nur dann als Antigen binden, wenn VASP in phosphorylierter Form vorliegt.
Unter Antikörper im Sinne der Erfindung ist sowohl der monoklonale Antikörper (Mab) und als auch seine Fragmente zu verstehen, und auch SCFV-Fragmente oder andere synthetische oder rekombinante Proteindomänen, die spezifisch phosphoryliertes Serin 239 in VASP erkennen.
Fragmente des Antikörpers schließen jeden Bereich des Antikörpers ein, der in der Lage ist, das Ziel-Antigen zu binden, in diesem Fall VASP oder einen spezifischen Teil davon. Antikörperfragmente umfassen speziell F(ab')₂, Fab, Fab' und Fv Fragmente. Diese können aus jeder Klasse von Antikörpern hergestellt werden, üblicherweise werden sie jedoch aus IgG oder IgM hergestellt. Sie können durch konventionelle rekombinante DNA-Techniken oder mittels des klassischen Verfahrens durch proteolytischen Verdau mit Papain oder Pepsin hergestellt werden. Siehe CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Kapitel 2, Coligan et al., Hrsg., (John Wiley & Sons, 1991–92).
F(ab')₂ Fragmente sind üblicherweise ungefähr 110 kDa (IgG) oder 150 kDa (IgM) groß und enthalten zwei antigen-bindende Regionen, durch Disulfidbindung(en) am Gelenk verbunden. In diesen Fragmenten fehlt praktisch das gesamte, wenn nicht das gesamte Fc. Fab' Fragmente sind üblicherweise ungefähr 55 kDa (IgG) oder 75 kDa (IgM) groß und können zum Beispiel durch Reduktion des (der) Disulfidbindung(en) eines F(ab')₂ Fragments gebildet werden. Die erhaltene(n) freie(n) Sulfhydrylgruppe(n) kann verwendet werden, um auf einfache Weise Fab' Fragmente an andere Moleküle, wie beispielsweise Nachweisreagenzien (z. B. Enzyme), zu konjugieren. Fab Fragmente sind monovalent und üblicherweise ungefähr 50 kDa (aus jeder Quelle) groß. Fab Fragmente enthalten die leichte (L) und schwere (H) Kette, variable (V_L bzw. V_H) und konstante (C_L bzw. C_H) Regionen des antigen-bindenden Teils des Antikörpers. Die H und L-Anteile sind durch eine intramolekulare Disulfidbrücke miteinander verbunden.
Fv Fragmente sind üblicherweise ungefähr 25 kDa groß und enthalten die variablen Regionen sowohl der leichten als auch der schweren Ketten (V_L bzw. V_H). Üblicherweise werden die V_L bzw. V_H Ketten nur durch nicht kovalente Interaktionen zusammengehalten und dissoziieren daher leicht. Sie haben allerdings den Vorteil einer geringen Größe und sie behalten die selben Bindeeigenschaften wie die größeren Fab Fragmente bei. Demzufolge sind Verfahren zum Vernetzen der V_L und V_H Ketten entwickelt worden, die zum Beispiel Glutaraldehyd (oder andere chemische Vernetzungsmittel), intramolekulare Disulfidbrücken (durch Einbau von Cysteinen) und Peptidlinker verwenden. Das resultierende Fv ist nun eine einzige Kette (d. h. SCFv).
Ein bevorzugtes Verfahren umfasst die Erzeugung von SCFvs mittels rekombinanter Methoden, was die Generierung von Fvs mit neuen Spezifitäten durch Mischen und Abgleichen variabler Ketten aus verschiedenen Antikörperquellen ermöglicht. Bei einem typischen Verfahren würde ein rekombinanter Vektor bereitgestellt, der die geeigneten regulatorischen Elemente umfasst, welche die Expression einer Kassettenregion steuert. Die Kassettenregion würde eine DNA enthalten, die einen Peptidlinker kodiert, mit geeigneten Stellen sowohl am 5'- als auch am 3'-Ende zur Generierung von Fusionsproteinen. Die DNA, welche die variable(n) Region(en) von Interesse kodiert, kann in den Vektor kloniert werden, um Fusionsproteine mit dem Linker zu bilden, wodurch ein SCFv generiert wird.
In einem beispielhaften alternativen Ansatz können DNAs, die zwei Fvs kodieren, mit der DNA ligiert werden, die den Linker kodiert, und die erhaltene dreiteilige Fusion kann direkt in einen konventionellen Expressionsvektor ligiert werden. Die durch jedwedes dieser Verfahren erzeugte SCFv DNA kann dann in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen, je nach dem ausgewählten Vektor, exprimiert werden.
Unter dem Begriff VASP im Sinne der Erfindung sind auch Derivate von VASP zu verstehen, d. h. funktionell äquivalente Teile, Mutanten, Fragmente oder Varianten von VASP, beispielsweise Phosphoserin 239 VASP, das zusätzlich an Position Serin 157 und/oder Threonin 278 phosphoryliert ist, und beispielsweise auch Glykolysierungsmutanten sowie andere kovalente Modifikationen und Strukturelemente, die für Protein/Protein-Wechselwirkungen von Bedeutung sind. Der Begriff VASP im Sinne der Erfindung umfasst sowohl menschliches VASP als auch VASP aus anderen Spezies, insbesondere von Säugetieren, wie beispielsweise Ratte, Maus, Kaninchen, Hund, Schwein oder Affe.
Antikörper, wie zum Beispiel 16C2, können durch konventionelle Verfahren hergestellt werden, zum Beispiel gemäß der von Köhler und Milstein beschriebenen Technik (Köhler and Milstein, Nature 256; 495, 1975). Üblicherweise werden, wo Selektivität basierend auf dem Phosphorylierungszustand gewünscht ist, Antikörper gegen die phoshorylierten Formen von VASP erzeugt. Die isolierten Antikörper können unter Verwendung konventioneller Methoden gescreent werden, um Selektivität festzustellen. Vorzugsweise werden Antikörper gegen Peptidfragmente von VASP erzeugt, die Serin 239 enthalten.
Die Länge des antigenen VASP-Peptids ist unwichtig, solange es in der Lage ist, eine humorale Antwort hervorzurufen. Typische antigene Peptide haben eine Länge von weniger als ungefähr 50 Aminosäuren. Einige bevorzugte Peptide sind weniger als ungefähr 20 Aminosäuren lang. Die am meisten bevorzugten Peptide sind zwischen ungefähr 6 bis ungefähr 12 Aminosäuren lang. Bevorzugte Peptide umfassen KLRKVS²³⁹KQ oder RKVS²³⁹KQE ein. Das Peptid ist vorzugsweise an Serin 239 phosphoryliert. Peptide können durch rekombinante Verfahren erhalten werden. Üblicherweise werden sie entweder durch proteolytischen Abbau von VASP oder durch in vitro Synthese und Phosphorylierung erhalten.
Bevorzugt sind des weiteren monoklonale Antikörper, welche die oben genannten Eigenschaften aufweisen und in der Durchflusscytometrie eingesetzt werden können. Dies setzt voraus, dass die Spezifität der neuen Antikörper auch dann erhalten bleibt, wenn das Antigen Bedingungen ausgesetzt wird, welche die Konformation des Antigens verändern können, wie es bei den in der Durchflusscytometrie üblicherweise angewandten Fixierungsschritten zu erwarten ist. Die Antikörper können beispielsweise einfach durch Austesten daraufhin untersucht werden, ob sie zum Einsatz in der Durchflusscytometrie geeignet sind.
Der monoklonale Antikörper 16C2 ist für diese Verwendung geeignet.
Die Antikörper können nach dem Fachmann per se bekannten Verfahren hergestellt werden. Für die Herstellung von monoklonalen Antikörpern sei insbesondere die Herstellung von Hybridomazellen nach der von Köhler und Milstein beschriebenen Technik genannt (Köhler and Milstein, Nature 256; 495, 1975). Die Spezifität der gereinigten Antikörper lässt sich beispielsweise durch folgende Testverfahren überprüfen:

a) Western Blotting mit rekombinantem VASP, das durch cAMP- bzw. cGMP-abhängige Proteinkinasen unterschiedlich stark phosphoryliert ist, wobei es lediglich möglich sein muss, ein positives Signal mit phosphoryliertem VASP zu beobachten.
b) Western Blotting mit Extrakten von Zellen, beispielsweise Pkt2-Zellen, die mit humanem VASP bzw. VASP, das auf unterschiedliche Weise mutiert wurde, und in dem jeweils eine der drei Phosphorylierungsstellen mutiert und dadurch eliminiert ist (S157A) VASP, (S239A)VASP und (T278A)VASP), und jeweils der humanen cGMP-Proteinkinase transfiziert wurden. Geeignet sind solche Antikörper, bei denen die positiven Signale im Western Blot durch die S239A Mutation eliminiert werden, nicht aber durch die beiden anderen Mutationen.
c) Western Blotting mit humanen Thrombozyten, die mit verschiedenen Vasodilatoren (z. B. Prostacyclin, NO-Donatoren) bzw. Aktivatoren der cAMP- oder cGMP-Proteinkinase behandelt wurden. Geeignet ist der Antikörper dann, wenn eine spezifische Bande im Extrakt nur mit phosphoryliertem VASP detektiert wird. Die Antikörper können analog auch mit humanen Fibroblasten sowie Thrombozyten der Ratte und Maus gescreent werden.
d) Immunfluoreszenzuntersuchungen mit fixierten humanen Thrombozyten und Endothelzellen. Ein positives Signal wird beobachtet, wenn VASP als Phosphoprotein vorhanden ist.

Die Erfindung betrifft ferner die Hybridomazelllinie 16C2, die den monoklonalen Antikörper 16C2 produziert.
Die Hybridomazelllinie 16C2, die den monoklonalen Antikörper 16C2 produziert, wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures), Marscheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Deutschland, entsprechend den Regeln des Budapester Vertrags am 06. November 1997 unter der folgenden Nummer hinterlegt: DSM ACC2330.
Der neue Antikörper ist zur qualitativen und/oder quantitativen, vorzugsweise quantitativen Bestimmung sowohl der Phosphorylierung von VASP unter in vitro Bedingungen als auch der unter in vivo Bedingungen geeignet, welche hier die Serin 239 Phosphorylierung von VASP ist.
Quantitative Verfahren zur Verwendung von Antikörpern sind im Stand der Technik gut bekannt und können zum Beispiel in den CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, supra gefunden werden.
Diese Verfahren umfassen Enzyme-Linked Immunosorbent Assays (ELISA), Radioimmunoassays (RIA) und dergleichen.
Der neue Antikörper ist ferner zur qualitativen und/oder quantitativen, vorzugsweise quantitativen Bestimmung von Phosphoserin 239 VASP in biologischem Material geeignet.
Unter biologischem Material wird beispielsweise verstanden: Zellextrakte, Gewebeextrakte, Zellschnitte, Zellgewebe, Zellen, wie zum Beispiel Thrombozyten, Leukozyten, Endothelzellen, glatte Muskelzellen und Fibroblasten. Das biologische Material kann vom Menschen oder auch von anderen Säugetieren, wie beispielsweise Ratte, Maus, Kaninchen, Hund, Schwein oder Affe, stammen. Biologisches Material humanen Ursprungs wird bevorzugt.
Der neue Antikörper kann zur quantitativen Bestimmung von Phosphoserin 239-VASP in biologischem Material mit Hilfe einer quantitativen Auswertung von Autoradiogrammen von Western Blots nach dem Fachmann bekannten Methoden, beispielsweise mittels NIH-gel blotting Image 1.6 Software, oder auch durch Immunfluoreszenz, verwendet werden.
Aufgrund der Korrelation, die zwischen der Phosphorylierung von Serin 239 und Serin 157 des VASP und der Aktivität cGMP- bzw. cAMP-abhängiger Proteinkinasen besteht, eignet sich der neue Antikörper auch zur Verwendung als Diagnostikum für cGMP-Signalwege und cAMP-Signalwege, insbesondere zur Diagnose von cGMP-Signalwegen.
Die Verwendung des neuen Antikörpers zur Bestimmung von Phosphoserin 239 VASP in biologischem Material mittels Western Blotting-Technik und Immunfluoreszenz ermöglicht es auch, diagnostische Verfahren zum Nachweis cGMP-erhöhender Substanzen, Hormone oder Arzneimittel zu entwickeln. Beispielsweise seien genannt: ANF, Guanylin, NO-freisetzende Substanzen oder Arzneimittel. Beispielsweise kann die Kontrolle des Verlaufs und der Therapie von NO-Donatoren verfolgt werden, was unter anderem Erkenntnisse über sich eventuell entwickelnde Nitrattoleranzphänomene erlaubt.
Aufgrund der Korrelation zwischen der Phosphorylierung von Serin 157 von VASP und der Aktivität cAMP-abhängiger Proteinkinasen kann der erfindungsgemäße Antikörper auch als Diagnostikum für cAMP-erhöhende Substanzen, Hormone oder Arzneimittel eingesetzt werden.
Die Erfindung betrifft somit auch die Verwendung des neuen Antikörpers oder Fragmente davon in der Diagnostik.
Die neuen diagnostischen Verfahren sind Verfahren, die im Labor außerhalb des menschlichen Körpers (ex vivo) durchgeführt werden können.
Der neue Antikörper kann zur Bestimmung des Phosphorylierungsgrads von VASP in biologischem Material eingesetzt werden, das von verschiedenen Spezies stammt. Beispielhaft seien genannt: Mensch, Ratte, Maus, Kaninchen, Hund, Schwein oder Affe. Bevorzugt ist die Verwendung des neuen Antikörpers zur Bestimmung von phosphoryliertem VASP in biologischem Material von Mensch, Ratte, Maus oder Hund. Besonders bevorzugt ist die Verwendung des neuen Antikörpers zur Bestimmung von phosphoryliertem VASP in biologischem Material des Menschen.
Der neue Antikörper oder Fragmente davon können auch in Biosensoren verwendet werden. Biosensoren sind dem Fachmann per se bekannt. Besonders bevorzugt ist ein Verfahren, wobei ein zweiter spezifischer Bindungspartner, wie z. B. ein Antikörper, ein Lectin oder ein Rezeptor eingesetzt wird. Zum Nachweis und zur Quantifizierung kann in diesem Fall einer der spezifischen Bindungspartner ein nachweisbares Label tragen. Diese Label sind dem Fachmann per se bekannt und können z. B. ein Chromophor, ein Luminophor, ein Fluorophor, ein Enzym, ein radioaktives Isotop oder ein gefärbtes oder auch ungefärbtes Partikel sein. Bevorzugt ist ein Verfahren, in dem der nicht-markierte spezifische Bindungspartner nach dem Fachmann per se bekannten Verfahren, direkt oder indirekt, z. B. über einen weiteren Antikörper oder eine Biotin/Avidin Brücke an eine Festphase gekoppelt ist.
Der neue Antikörper oder dessen Fragmente können auch nach dem Fachmann bekannten Methoden radioaktiv markiert werden, um sie für die Immunszintigraphie bzw. auch für die Immuntherapie zu verwenden. Zusätzlich können diese monoklonalen Antikörper als Wirkstoffträger eingesetzt und zur Therapie von durch endotheliale Dysfunktionen hervorgerufen Erkrankungen verwendet werden.
Nach der Analyse der vollständigen Nukleotidsequenz der V-Gene von Mab 16C2 ist auch die Erzeugung von Antikörperkonstrukten, z. B. durch Einsetzen der hypervariablen Regionen in ein humanes Mab-Gerüst technisch möglich (Jones et al., Nature 321: 522–525, 1986; Verhoyen et al., Science 239, 1534–1536, 1988).
Bevorzugt ist die Quantifizierung des antigen-gebundenen Antikörpers in Blutplättchen mittels Durchflusscytometrie, die beispielsweise an Vollblutproben ausgeführt, die gegebenenfalls nach dem Fachmann bekannten Methoden fixiert wurden. Verfahren für die Durchflusscytometrie sind dem Fachmann bekannt und können, wie zum Beispiel in G. Otten und W. M. Yokoyama (1992) Flow cytometry analysis using the Becton Dickinson FACScan, Current Protocols in Immunology, 5.4.1–5.4.19 beschrieben, durchgeführt werden.
Die durchflusscytometrische Analyse der VASP-Phosphorylierung, hier der VASP Serin 239-Phosphorylierung mit Hilfe des neuen Antikörpers ist nicht auf humane Thrombozyten beschränkt, sondern kann auch an anderen Zelltypen durchgeführt werden, wie zum Beispiel Lymphozyten, Monozyten, Leukozyten, Endothelzellen und glatte Muskelzellen.
Die Verwendung der Durchflusscytometrie zur Bestimmung der Phosphorylierung von VASP, hier von Phosphoserin 239 VASP, mit Hilfe des neuen Antikörpers in frisch entnommenen humanen Thrombozyten erlaubt es, die in vivo Aktivität von Endothelfaktoren, wie zum Beispiel NO und Prostacyclin, zu bestimmen und infolgedessen die Endothelfunktion oder Endotheldysfunktion bei kardiovaskulären Erkrankungen, wie man sie beispielsweise bei Arteriosklerose, Hypertonie, Diabetes, Herzinsuffizienz und Nierensuffizienz findet, ex vivo zu beurteilen.
Die Bestimmung der VASP-Phosphorylierung, hier der VASP Serin 239-Phosphorylierung mit Hilfe des neuen Antikörpers ermöglicht ferner, die Therapie der obengenannten Krankheiten zu kontrollieren. Auch kann die Entwicklung von Therapieresistenzen, wie zum Beispiel Nitrattoleranz, bestimmt werden.
Die Erfindung betrifft ferner ganz allgemein ein diagnostisches in vitro Verfahren zur Bestimmung der Phosphoporylierung von VASP, hier der Serin 239-Phosphorylierung von VASP, mit Hilfe anderer spezifischer Sonden, wie zum Beispiel SCFV-Fragmenten oder andere synthetische oder rekombinanten Proteindomänen, die spezifisch phosphorylierte Sequenzen in VASP erkennen, insbesondere in Phosphoserin 239 VASP.
Besonders bevorzugt sind ferner die in den Ausführungsbeispielen beschriebenen Ausführungsformen.
Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung und schränken sie in keiner Weise ein.
Beispiele
Beispiel 1
Isolierung eines monoklonalen Antikörpers gegen Phosphoserin 239 VASP
Ein phosphoryliertes und nicht-phosphoryliertes Peptid, die jeweils die Peptidsequenz KLRKVS²³⁹KQ oder RKVS²³⁹KQE um Serin 239 umfassen, werden unter Verwendung eines Applied Biosystem Peptidsynthesizers (Modell 431A) gemäß der dem Fachmann geläufigen Fmoc-Chemie synthetisiert.
Das Phosphoserin im phosphorylierten Peptid wird während der Peptidsynthese mittels Fmoc-Serin [PO(Obzl)OH-OH] von Calbiochem eingebaut. MS-bestätigte Peptide werden mittels RPC und einer VYDAC 218TP-Säule gereinigt (Reinheitsgrad > 98%).
Die so hergestellten Peptide werden nach Aktivierung durch Bromessigsäure oder Bromessigsäure-N-hydroxysuccinimidester (Sigma) mit thioliertem KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin, nanoTools) konjugiert. Weibliche Balb/c Mäuse (6 Wochen alt) werden subkutan 4 × in 14-täglichen Intervallen mit dem KLH-Phosphopeptid (10 μg/Maus) immunisiert, welches komplettes Freunds-Adjuvans in der ersten bzw. imkomplettes Adjuvans in den folgenden 3 Injektionen enthält. Anschließend (2 Wochen später) erhalten die Mäuse an drei aufeinander folgenden Tagen Booster-Injektionen mit 10 mg Immunogen in PBS (phosphat-gepufferte Saline). Einen Tag nach der letzten Booster-Injektion werden die Mäuse getötet und die Milz entfernt. Milzzellen werden isoliert und unter Verwendung der etablierten Köhler/Milstein-Methodik mit nicht-produzierenden Myelomzellen (z. B. PAI-Zellen, J. W. Stocker et al. (1982) Res. Disclosure, 21713) fusioniert. Hybridomazellen werden auf ihre Fähigkeit, Antikörper gegen Phosphoserin 239 VASP zu sezernieren, mit einem differentiellen Screening-Verfahren unter Verwendung von phosphoryliertem/nicht-phosphoryliertem Peptid sowie phosphoryliertem/nicht-phosphoryliertem rekombinanten humanen VASP getestet.
Für den Test mit phosphoryliertem/nicht-phosphoryliertem Peptid werden diese Peptide an DNA-BIND-ELISA-Platten (von Costar) kovalent gekoppelt und die Hybridomaüberstände unter Verwendung des ELISA-Verfahrens gescreent.
Überstände, die das Phosphopeptid erkennen, werden zusätzlich auf ihre Fähigkeit untersucht, komplett phosphoryliertes rekombinantes (E. coli-System) humanes VASP, nicht aber das entsprechende dephosphorylierte VASP zu erkennen.
Monoklonale Antikörper aus den Überständen der Hybridomazellen, die durch die oben beschriebenen Verfahren als positiv erkannten wurden, können vorzugsweise aus serumfreien Hybridomazellkulturen durch thiophile Adsorptionschromatographie (POROS 50-OH, nanoTools) gereinigt werden.
Unter Verwendung verschiedener Testverfahren konnte einer der gewonnenen Antikörper (Klon 16C2) als monoklonaler Antikörper der Mausklasse IgG1K identifiziert und charakterisiert werden, der VASP nur dann erkennt, wenn dieses Protein an der Position Serin 239 phosphoryliert ist. Der Antikörper 16C2 erkennt unter den verwendeten Bedingungen keine andere Proteine und andere VASP-Phosphorylierungsstellen.
Monoklonale Antikörper, die spezifisch Phosphoserin 157 VASP bzw. Phosphothreonin 278 VASP erkennen, können analog dem oben beschriebenen Verfahren gewonnen werden, indem als Antigen phosphorylierte Peptide eingesetzt werden, welche die bekannten Peptidsequenzen um das Serin 157 oder Threonin 278 des VASP Proteins umfassen.
Die Generierung monoklonaler Antikörper, die an Position 239 phosphoryliertes VASP erkennen, ist ebenfalls in Smolenski et al., J. Biol. Chem. 237, 32, 20029–20035 (1998) beschrieben.
Beispiel 2
Durchflusscytometrische Analyse der VASP Serin 239-Phosphorylierung
Analyse der VASP Serin 239-Phosphorylierung in gewaschenen humanen Thrombozyten
Humane Thrombozyten werden präpariert und die VASP Phosphorylierung wird durch Inkubation mit vasoaktiven Substanzen stimuliert, wie beschrieben (Eigenthaler et al., Eur. J. Biochem., 205, 471–481, 1992). Die Reaktion wird durch Fixierung mit Formaldehyd in einer Endkonzentration von ca. 3.5% für 10 min bei Raumtemperatur gestoppt. Nach einem Waschvorgang (optional) werden die Zellen mit Triton x-100 permeabilisiert und anschließend gewaschen. Die Färbung erfolgt durch Inkubation mit dem entsprechenden Antikörper, welcher entweder direkt fluoreszenzmarkiert ist oder mittels eines fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörpers gefärbt wird. Zweckmäßigerweise werden hierzu 0.5–5 μg/ml, bevorzugt 1–2 μg/ml primärer Antikörper eingesetzt. Bei Verwendung von Mab 16C2 als primärer Antikörper sind beispielsweise 1.7 μg/ml geeignet. Die Bindung des Antikörpers 16C2 wird im Anschluss im Durchflusscytometer bestimmt und analysiert, wie beispielsweise in G. Otten und W. M. Yokoyama (1992) Flow cytometry analysis using the Becton Dickinson FACScan, Current Protocols in Immunology, 5.4.1–5.4.19 beschrieben.
Beispiel 3
Verwendung von Western-Blotting zur Bestimmung der VASP Serin 239-Phosphorylierung in Zellextrakten
Parallel zur Durchflusscytometrie (Beispiel 2) wird Western Blotting verwendet, um die Phosphorylierung von VASP in Zellextrakten mit Hilfe von Methoden zu bestimmen, die dem Fachmann geläufig sind und die beispielsweise in Eigenthaler et al. (Eur. J. Biochem., 205, 471–481, 1992) beschrieben sind. Die Konzentration des verwendeten Antikörpers beträgt zweckmäßigerweise zwischen 0.1 und 5, vorzugsweise 0.5 bis 1.0 μg/ml, je nach Gehalt des VASP in der zu bestimmenden Probe. Für menschliche Thrombozyten sowie Thrombozyten aus Ratten ist es beispielsweise vorteilhaft, 0.5 μg Antikörper/ml zu verwenden, während für menschliche Nabelschnur-Endothelzellen die Verwendung von 1.0 μg Antikörper/ml vorteilhaft ist. Die Analyse der VASP Serin 239-Phosphorylierung in Zellextrakten mittels Western-Blot Analyse sowie an fixierten Zellen mittels Durchflusscytometrie ergab im Prinzip identische Ergebnisse.
Beispiel 4
Analyse der VASP Serin 239-Phosphorylierung in Vollblut oder plättchen-reichem Plasma (PRP)
Vollblut oder PRP werden mit vasoaktiven Substanzen inkubiert und die Inkubation durch Fixierung mit Formaldehyd in einer Endkonzentration von ca. 3.5% für 10 min bei Raumtemperatur gestoppt. PRP wird aus Vollblut präpariert, wie in Eigenthaler et al. (Eur. J. Biochem., 205, 471–481, 1992) beschrieben. Thrombozyten im PRP werden durch Zentrifugation pelletiert und in physiologischem Puffer resuspendiert (Eigenthaler et al., 1992, siehe oben). Die Thrombozyten werden permeabilisiert und anschließend gefärbt, wie oben für gewaschene Thrombozyten beschrieben.
Beispiel 5
Zeitverlauf der Stimulierung der VASP Serin 239-Phosphorylierung in gewaschenen humanen Thrombozyten nach Behandlung mit Natriumnitroprussid (SNP).
Humane Thrombozyten wurden mit 100 μM SNP behandelt. Zellproben wurden zu den Zeitpunkten 0, 1, 3 und 5 Minuten entnommen. Der Antikörper 16C2 wurde zur Bestimmung der Phosphorylierung von VASP Serin 239 verwendet, parallel mittels Western Blot-Analyse von Extrakten der entnommenen Zellproben und durch durchflußzytrometische Bestimmung an humanen Thrombozyten, die wie oben beschrieben fixierten und permeabilisierten wurden. Die Autoradiogramme der Western Blots wurden quantitativ mittels NIH-gel blotting image 1.6 Software analysiert.
Die Zunahme der Antikörper 16C2/Phosphoserin 239 VASP-Bindung ist in Tabelle 1 aufgeführt (% Anstieg (5 min-Wert = Maximaleffekt = 100%)):
Tabelle 1:
Beispiel 6
Verwendung des Antikörpers 16C2 zur Analyse der Phosphorylierung von rekombinanten VASP durch cAMP- bzw. cGMP-abhängige Proteinkinase
Gereinigtes, rekombinantes hexahistidin-markiertes VASP (25 μg/ml) wurde mittels der gereinigten katalytischen Untereinheit (11 μg/ml) der cAMP-Proteinkinase (cAPK) oder mittels gereinigter cGMP-Proteinkinase (cGPK; 24 pg/ml) phosphoryliert. Aliquots wurden zu den angegebenen Zeiten aus dem Reaktionsansatz entnommen, sofort mit einer SDS-haltigen "Stop"-Lösung gemischt, gekocht und mittels SDS-PAGE fraktioniert. Die VASP-Phosphorylierung wurde durch Färbung mit Coomassie Blau und durch Western Blotting unter Verwendung eines polyklonalen VASP Antikörpers (M4, Halbrügge M. et al. J. Biol. Chem. 265, 3088–3093 (1990) erhältlich von: Alexis Corporation, Alte Hauensteinstraße 4, CH-4448 Läufelfingen, Schweiz) oder des monoklonalen VASP-Antikörpers 16C2 analysiert. Die Bande in der Coomassie-Blaufärbung unter VASP ist die cAPK, die oberhalb von VASP die cGMP-PK. Die durchgeführte SDS-PAGE zeigte die Änderung des VASP Laufverhaltens von 46 nach 50 kDA bedingt durch die Phosphorylierung von Serin 157, das von der cAPK bevorzugt wird. Die Phosphorylierung von Serin 239 (nachgewiesen durch den 16C2 Antikörper) wird von der cGMP-PK bevorzugt.
Beispiel 7
Analyse der Phosphorylierung von transfiziertem VASP, das verschiedene Phosphorylierungmutationen enthält, in Ptk2-Zellen
Die Phosphorylierung von transfiziertem humanem VASP und VASP Mutanten wurde in Ptk2-Zellen untersucht. Wildtyp VASP und VASP Mutanten, die jeweils mutierte (inaktivierte) Phosphorylierungsstellen (Änderung von Serin 157, Serin 238 oder Threonin 277) enthielten, wurden zusammen mit humaner cGMP-Proteinkinase 1β in Ptk2-Zellen transfiziert und unter der Kontrolle des CMV-Promotors exprimiert. Ptk2-Zellen enthalten sehr wenig endogenes VASP und cGMP-Proteinkinase. Zwei Tage nach der Transfektion wurden die Zellen mit 30 μM 8pCPT-cGMP für 30 min inkubiert und anschließend Zellextrakte gewonnen. Die Phosphorylierung von VASP in diesen Zellextrakten wurde anschließend in Western Blots unter Verwendung des polyklonalen Antikörpers M4 und des monoklonalen Antikörpers 16C2 untersucht. Eine phosphorylierungsabhängige Änderung von VASP von 46 kDa nach 50 kDa war nicht mehr vorhanden, wenn Serin 157 inaktiviert wurde (Mutation S157A). Ein Signal, das vom Antikörper 16C2 erkannt wird, war nicht mehr vorhanden, wenn Serin 239 inaktiviert wurde (S239A). In diesen Analysen verhielten sich Mutationen von Threonin 277 wie Wildtyp VASP.
Beispiel 8
Analyse der VASP-Phosphorylierung in humanen Thrombozyten nach Stimulation mit verschiedenen Vasodilatatoren und cAMP/cGMP-Analoga
Gewaschene humane Thrombozyten (0.7 × 10⁹ Zellen/ml) wurden mit 1 μM Pg-I₂ (Prostacyclin), 0,5 mM 5,6-DCI-cBIMPS (zellmembran-permeables cAMP-Analog), 10 μM SNP (Natriumnitroprussid) oder 1 mM 8pCPTcGMP (zellmembranpermeables cGMP-Analog) inkubiert. Aliquots (2,8 × 10⁷ Zellen) wurden nach den angegebenen Zeiten entnommen, mit der SDS "Stop"-Lösung gemischt und gekocht und dann hinsichtlich der VASP Phosphorylierung mittels des Western Blot-Verfahrens untersucht. Die Analyse erfolgte mit dem polyklonalen Antikörper M4 oder dem monoklonalen Antikörper 16C2. Die Serin 157 Phosphorylierung wurde durch die Verschiebung von VASP von 46 nach 50 kDa quantifiziert, während die Serin 239 Phosphorylierung über das Signal des 16C2 Antikörpers quantifiziert wurde.
Beispiel 9
VASP Phosphorylierung in Ratten-Thrombozyten
Ratten-Thrombozyten (0.7 × 10⁹ Zellen/ml) wurden für 5 min mit 100 μM Natriumnitroprussid (SNP), mit 10 μM Prostaglandin E1 (PgE1) oder ohne einen dieser Zusätze inkubiert. Die Extrakte dieser Ratten-Thrombozyten wurden durch Western Blotting analysiert. Der Blot zeigte, dass die phosphorylierungsabhängige Verschiebung von VASP von 46 kDa nach 50 kDa (Serin 157 Phosphorylierung) sowie das phosphorylierungsabhängige Signal des 16C2-Antikörpers (Serin 239 Phosphorylierung) auch in Ratten-Thrombozyten stattfand. Ähnliche Ergebnisse werden auch mit Mäuse-Thrombozyten erzielt.
Beispiel 10
Immunfluoreszenzuntersuchungen von VASP und Phospho-VASP an humanen Thrombozyten
Humane Thrombozyten (im plättchen-reichen Plasma, PRP) wurden auf einen Glasobjektträger aufgebracht und konnten sich 45 min lang ansetzen und ausbreiten. Dann wurden diese Thrombozyten auf dem Glasobjektträger 15 min lang ohne (A und C) oder mit 100 μM 8pCPT-cGMP (B und D) inkubiert. Die Zellen wurden dann sofort mit 4% Paraformaldehyd fixiert und mit 0.2% Triton X-100 permeabilisiert. Anschließend wurden sie mit dem polyklonalen Antikörper M4 (1 : 1000) oder dem monoklonalen Antikörper 16C2 inkubiert, gefolgt von den üblichen sekundären Antikörpern. Die Bilder zeigen das Auftreten des phosphorylierungsabhängigen Signals bei Verwendung des 16C2 Antikörpers, während das Signal mit dem polyklonalen M4-Antikörper (in der Immunfluoreszenz die Summe von 46 und 50 kDa VASP, da es keine Auftrennung gibt) phosphorylierungsunabhängig ist.

Claims

Monoklonaler Antikörper 16C2, der durch die Hybridomazelllinie mit der Hinterlegungsnummer DSM ACC 2330 produziert wird, oder Fragmente davon, die zur Bindung des vasodilator-stimulierten Phosphoproteins (VASP) nur imstande sind, wenn VASP an der Position Serin 239 phosphoryliert ist (Phosphoserin 239 VASP).
Verwendung des Antikörpers 16C2 oder von Fragmenten davon, wie in Anspruch 1 definiert, als diagnostisches Agens.
Verwendung gemäß Anspruch 2 zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung von Phosphoserin 239 VASP in biologischem Material.
Verwendung gemäß Anspruch 3, wobei das biologische Material humane Thrombozyten oder humanes Blut ist.
Verwendung gemäß Anspruch 3 oder 4, wobei die Bestimmung von Phosphoserin 239 mittels der Western Blotting-Technik durchgeführt wird.
Verwendung gemäß Anspruch 3 oder 4, wobei die Bestimmung von Phosphoserin 239 mittels Durchflusscytometrie durchgeführt wird.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 2–6 zum Nachweis von Substanzen, die den cGMP- und/oder cAMP-Spiegel in biologischem Material beeinflussen.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 2–6 zur Bestimmung der in vivo Aktivität von Endothelfaktoren.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 2–8 zum Nachweis einer endothelialen Dysfunktion.
Hybridomazelllinie DSM ACC 2330, die den monoklonalen Antikörper 16C2 produziert.
Diagnostischer Kit, der den Antikörper 16C2 oder ein Fragment davon, wie in Anspruch 1 definiert, enthält.
Diagnostisches in vitro Verfahren, das die Verwendung des Antikörpers 16C2 oder Fragmente davon, wie in Anspruch 1 definiert, umfasst, um den Phosphorylierungszustand von Phosphoserin 239 von VASP und/oder die Proteininteraktionen von VASP in biologischem Material zu bestimmen oder zu beeinflussen.