JPH06504285A - ニューロンコリン作動性分化因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、標的により誘導されるニューロンコリン作動性分化因子（ｎｅｕｒｏ ｎａｌ　ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｆａｃｔ ｏｒ：　ＮＣＤＦ）、並びにその治療および診断用途に関する。本発明は、ＮＣ ＤＦ、その誘導体、類縁体およびフラグメント、前記のものを含む医薬組成物、 並びに抗ＮＣＤＦ抗体を提供する。

２、　発明の背景 はとんどの交感神経系ニューロンはノルアドレナリン作動性である；しかしなが ら、汗腺を神経支配するニューロンを含む少数のものは、コリン作動性である。

汗腺を神経支配する交感神経系ニューロンは、さらにバソアクティブ・インテス テイナル・ペプチド（ＶＩＰ）とカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ） 免疫反応性を有することにより特徴付けられる（Ｌｕｎｄｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ 、、　１９７９゜Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ　４．１５３Ｌ１５５９；　Ｌａｎ ｄｉｓ　ａｎｄ　Ｆｒｅｄｉｅｕ、　１９８６．　ＢｒａｉｎＲｅｓ、　３７７ 、１７７−１８１；　Ｌｉｎｄｈ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９．　Ｃｅ１ｌ　Ｔ ｉ５ｓｕｅ　Ｒｅｓ。

２５６、２５９−２７３）、ところが多くのノルアドレナリン作動性ニューロン はニューロペプチドＹ　（ＮＰＹ）を含んでいる（Ｌｕｎｄｂｅｒｇ　ｅｔ　ａ ｌ、。

＋９８２．　Ａｃｔａ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　５ｃａｎｄ、　１１６．４７７− ４８０；　Ｌｕｎｄｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ、。

ｌ９８３、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　Ｌｅｔｔ、　４２．１６７−１７２；　Ｊａｒ ｖｉ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８６゜Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　Ｌｅｔｔ、　６７、２ ２３−２２７）。成熟汗腺神経支配は、機能的にコリン作動性であるが、発生中 の神経支配はノルアドレナリン作動性である（Ｌａｎｄｉｓ　ａｎｄ　Ｋｅｅｆ ｅ、　１９８３．　Ｄｅｖ、　Ｂｉｏｌ、　９８．３４９−３７２；Ｌｅｂｌａ ｎｃ　ａｎｄ　Ｌａｎｄｉｓ、　１９８６．　Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　６． ２６０−２６５；５ｔｅｖｅｎｓ　ａｎｄ　Ｌａｎｄｉｓ、１９８７．　Ｄｅｗ 、Ｂｉｏｌ、１２３．　１７９−１９０；　Ｌａｎｄｉｓｅｔ　ａｌ、、　１９ ８８．　Ｄｅｗ　Ｂｉｏｌ、　１２６．１２９−１４０）　、交感神経系軸索が 、最初に発生中の汗腺を神経支配するとき、それらは強いカテコールアミン組織 蛍光およびカテコールアミン合成酵素、チロシンヒドロキシラーゼおよびドーパ ミンβヒドロキシラーゼに対する免疫反応性を有している。腺神経支配が成熟す ると、カテコールアミン組織蛍光が消失し、チロシンおよびドーパミンβヒドロ キシラーゼ免疫反応性が減少し、モしてコリン作動性およびペプチド作動性特性 が現れる。例えば、アセチルコリンエステラーゼは、出生後７日で（Ｐ７）、Ｖ ＩＰ免疫反応性はＰＩＯで、コリンアセチルトランスフェラーゼ活性はｐＨで、 モしてコリン作動性伝達はＰＩ３で感知できる。このように、汗腺のコリン作動 性交感神経系神経支配は、出生後の発生中に神経伝達物質の特性において著しい 変化をする。

いくつかの証拠により、発生中の汗腺の神経支配におけるノルアドレナリン作動 性からコリン作動性機能への変化は、標的組織との相互作用により仲介されるこ とが示唆される。第一に、発生中の汗腺の神経支配が７−１０日遅れた場合は、 カテコールアミン組織蛍光の消失とコリン作動性特性の出現において対応する遅 れがある（Ｓｔｅｖｅｎｓ　ａｎｄ　Ｌａｎｄｉｓ、　１９８８．　Ｄｅｖ、　 Ｂｉｏｌ、　１３０．７０３−７２０）。

第二に、ノルアドレナリン作動性交感神経系ニューロンを含んでいる上類神経節 を、汗腺を含んでいる内証組織と共に眼の前房に移植すると、ニューロンは腺を 神経支配し、カテコールアミン組織蛍光とＮＰＹの発現を減少させ、そしてコリ ンアセチルトランスフェラーゼとＶＩＰに対する免疫反応性を発生させる（Ｓｔ ｅｖｅｎｓ　ａｎｄＬａｎｄｉｓ、　１９９０．　Ｄｅｖ、　Ｂｉｏｌ、　１３ ７．１０９−１２４）　、最後に、交差−神経支配実験により、標的の役割に対 する直接の証拠が提供される。

出生後早期のラットの胸部の毛のある皮膚の代わりに、内証の皮膚を移植する場 合は、移植組織は、正常の標的はパイロエレクタ−（ｐｉｌｏｅｒｅｃｔｏｒ） と血管である、交感神経系ニューロンに神経支配される。毛のある皮膚を神経支 配する交感神経系繊維はノルアドレナリン作動性であり、正常ではコリンアセチ ルトランスフェラーゼ活性、アセチルコリンエステラーゼ染色、またはＶＩＰ免 疫反応性を含まない（Ｓｃｈｏｔｘｉｎｇｅｒ　ａｎｄ　Ｌａｎｄｉｓ、　１９ ９０．　Ｃｅ１ｌ　Ｔｉ５ｓｕｅＲｅｓ、　２６０．５７５−５８７）。しかし ながら、移植した汗腺を神経支配した数週間後、繊維はカテコールアミン蛍光の 著しい減少を示し、新しい標的の神経支配の特徴である特性を示す：コリンアセ チルトランスフェラーゼ活性、アセチルコリンエステラーゼ染色、およびＶＩＰ 免疫反応性を示す（Ｓｃｈｏｔｚｉｎｇｅｒ　ａｎｄ　Ｌａｎｄｉｓ、　１９８ ８゜Ｎａｔｕｒｅ　３３５．６３７−６３９；および未発表データ）。反対に、 ノルアドレナリン作動性交感神経系ニューロンの標的である耳下腺を、汗腺の代 わりに内証に移植すると、正常では汗腺を神経支配している繊維によって優位に 神経支配され、コリン作動性となる；この場合、移植した耳下腺を神経支配する 繊維は、コリン作動性特性を獲得しはじめ、そして耳下腺の交感神経系支配の典 型であるカテコールアミン作動性特性を発現し続ける（Ｓｃｈｏｔｚｉｎｇｅｒ 　ａｎｄＬａｎｄｉｓ、　１９９０．　Ｎｅｕｒｏｎ　４．９ｌ−１００）。こ のように、汗腺神経支配におけるコリン作動性特性の正常な発現は、この特異な 標的の存在によるものであり、汗腺は、交感神経系ニューロンにおいては正常で は発現しないコリン作動性および、あるペプチド作動性特性を誘導できる。交感 神経系軸索は、直接取り囲んでいる汗腺細胞または基底層に決して接触しないの で（Ｌａｎｄｉｓ　ａｎｄ　Ｋｅｅｆｅ。

＋９８３．　Ｄｅｖ、　Ｂｉｏｌ、　９８．３４９−３７２；　Ｕｎｏ　ａｎｄ 　Ｍｏｎｔａｇｎａ、　１９７５゜Ｃｅ１ｌ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｒｅｓ、　１５８ ．１−１３；　Ｑｕｉｃｋ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８４．　Ａｎａｔ、　Ｒｅｃ 。

２０８、４９１−４９９）　、標的効果は可溶性因子により仲介されているよう に思われる。

細胞培養下において発生中の交感神経系ニューロンで、同様のノルアドレナリン 作動性からコリン作動性への転換を生じるい（つかのタンパク質が同定されてき た。これらは、汗腺により生成される分化シグナルである可能性がある候補物で ある。心臓細胞のならし培地から精製したコリン作動性分化因子（ＣＤＦ）（Ｐ ａｔＬｅｒｓｏｎ　ａｎｄ　Ｃｈｕｎ、　１９７７、　Ｄｅｗ、Ｂｉｏｌ、　５ ６．２６３−２８０；　Ｆｕｋａｄａ。

１９８５、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８２． ８７９５−８７９９）は、白血病阻止因子（ＬＩＦ）と同一であることが示され ている（Ｙａｍａｍｏｒｉ　ｅｔａｌ、、　１９８９．５ｃｉｅｎｃｅ　２４６ ．１４１２−１４１６）　。毛様神経向性因子（ＣＮＴＦ）は、初め毛様ニュー ロンの生存因子として同定され（Ａｄｌｅｒｅｔ　ａｌ、、　１９７９．５ｃｉ ｅｎｃｅ　２０４．１４３４−１４３６；　Ｂａｒｂｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１ ９８４゜Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、　４３．１４６８−１４７８：　Ｍａｎｔ ｈｏｒｐｅ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８６．　ＢｒａｉｎＲｅｓ、　３６７、２８ ２−２８６）　、そして最近クローン化されたが（Ｌｉｎ　ｅｔａｌ、、　１９ ８９．５ｃｉｅｎｃｅ　２４６．１０２３−１０２５；　５ｔｏｃｋｌｉ　ｅｔ 　ａｌ、、　１９８９゜Ｎａｔｕｒｅ　３４２．９２０−９２３）　、培養した 交感神経系ニューロンにおいてコリン作動性機能を誘導し、カテコールアミン作 動性機能を減少させる（Ｓｅａｄａｔ　ｅｔ　ａｌ、、１９８９．　Ｊ、　Ｃｅ １ｌ　Ｂｉｏｌ、　１０８．１８０７−１８１６）　。推定アミノ酸配列（Ｙａ ｍａｍｏｒｉ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９．５ｃｉｅｎｃｅ２４６、１４１２− １４１６；　５ｔｏｃｋｌｉ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９．　Ｎａｔｕｒｅ　３ ４２．９２０−９２３）およびＣＤＦ／ｌ、ＩＰとＣＮＴＦの生化学および免疫 学特性（Ｒａｏ　ｅｔａｔ、、　１９９０．　Ｄｅｖ、　Ｂｉｏｌ、　１３９． ６５−７４）の比較により、それらは異なる因子であることが示唆される。さら に、可溶５０　ｋｄコリン作動性因子が、ヘパリンアフィニティークロマトグラ フィーにより脳から得られていて（Ｋｅｓｓｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８６ ．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８３．３５２８− ３５３２）、そして膜−会合神経伝達物質刺激因子（ＭＡＮＳ）がラットのを髄 から可溶化され、部分的に精製されている。後者の活性は、２９　ｋｄタンパク 質と会合している（ｌｏｎｇ　ａｎｄＫｅｓｓｌｅｒ、１９８７．　Ｐｒｏｃ、 　Ｎａ目、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８４、８７２６−８７２９　；Ａ ｄｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、 　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８６．１０８０−１０８３）。しかしなが呟これらの因子 のコリン作動性−誘導能力が、正常の発生での根本的な機能、あるいは関連のあ る機能であるかとうかは依然不明である。これらの因子のいくつかは別の機能を 有していることが細胞培養系において示されている。例えばＣＤＦ／ＬＩＦはＭ ｌ骨髄細胞系において、増殖を阻害し、マクロファージ分化を誘導しくｆ（ｉｌ ｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８Ｂ、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１７３ ゜３５９−３６７）、そして胎児幹細胞の発生の可能性を保持する（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ　ａｌ、、　１９８８．　Ｎａｔｕｒｅ　３３６．６８８−６９０；　Ｗｉ ｌｌｉａＩＩＩｓ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８８゜Ｎａｔｕｒｅ　３３６．６８４ −６８７）；　ＣＮＴＦは、毛様ニューロンの栄養活性を有しくＢａｒｂｉｎ　 ｅｔ　ａｌ、、　１９８４．　Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、　４３．１４６８− １４７８；Ｍａｎｔｈｏｒｐｅ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８６．　Ｂｒａｉｎ　Ｒ ｅｓ、　３６７、２８２−２８６）　、そして０−２Ａ前駆細胞においてアスト ログリア特性を誘導する（Ｈｕｇｈｅｓ　ｅｔａｌ、、　１９８８．　Ｎａｔｕ ｒｅ　３３５．５Ｏ−７３）。

心臓および骨格筋細胞をならし培地により培養した交感神経系ニューロンでのコ リン作動性誘導の研究により、ニューロンが、一度誘導されコリン作動性機能を 獲得すると、誘導因子が培地から除去されても一定期間それを維持することが示 されているＣＰａｔｔｅｒｓｏｎ　ａｎｄ　Ｃｈｕｎ　１９７７、　Ｄｅｖ、　 Ｂｉｏｌ、　５６．２６３−２８０；　Ｖｉｄａｌ　ｅｔａｌ、、　１９８７． 　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　１０１．６１７−６２５）　。ペプチド作動性誘導 が、Ｃ叶几ＩＦを用いて培養した交感神経系ニューロンで観察される（Ｎａｗａ 　ｅｔ　ａｌ、、　１９９０．　Ｎｅｕｒｏｎ　４．２６９−２７７）；　ＣＤ Ｆ／ＬＩＦを回収すると、Ｐ物質含有量が対照値まで戻る。

成人の感覚性神経を含む交差−神経支配実験により、ペプチド表現型を変え得る ことが示されている（ＭｃＭａｈｏｎ　ａｎｄ　Ｇｉｂｓｏｎ。

１９８７、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　Ｉｅｔｔ、　７３．９−１５）。筋肉神経を 皮膚神経に交差−吻合させ、皮膚で標的を神経支配するように誘導する場合は、 再発生筋肉神経がＰ物質に対する免疫反応性を獲得するように見え、反対に、皮 膚神経を筋肉神経に交差−吻合させた場合は、Ｐ物質免疫反応性は皮膚神経で減 少する。

（本頁以下余白） ３、　発明の要約 本発明は、標的により誘導されるニューロンコリン作動性分化因子（ＮＣＤＦ） 　、並びにその治療および診断用途に関するものである。本発明はＮＣＤＦ、そ の誘導体、類縁体およびフラグメント、前記のものを含む医薬組成物、並びに抗 ＮＣＤＦ抗体を提供する。

本発明のＮＣＤＦは哺乳動物の汗腺の抽出物中に存在するタンパク質てあり、そ れらは熱およびトリプシン不安定性、ヘパリン−アガロースアフィニティーカラ ムへの実質的な結合性の欠如、約４．８−５．２の範囲の等電点（ｐＩ）、非膜 細胞性局在化、および１６−３２キロダルトンの範囲のおよその分子量を示す。

ＮＣＤＦタンパク質、その誘導体、類縁体およびフラグメントは、細胞培養下（ ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）において交感神経系ニューロンによるチロシンヒドロキシラ ーゼと全カテコールアミン類の発現を低下させ、一方でコリンアセチルトランス フェラーゼとバソアクティブ・インテステイナル・ペプチド（Ｖ　Ｉ　Ｐ）の発 現を高めることができる。

ＮＣＤＦタンパク質、その誘導体、類縁体およびフラグメントは、ニューロンに おけるコリン作動性活性を誘導するために使用される。かかるタンパク質、誘導 体、類縁体およびフラグメントは、多数のニューロン型の生存および／またはコ リン作動性分化をサポートすることが望まれる神経系の損傷または疾患を有する 轡者に治療的に投与される。

４、　図面の説明 図１．　成熟ラットの汗腺、有毛の皮膚、耳下腺、肝臓または坐骨神経から抽出 された可溶性タンパク質を、解離した交感神経系ニューロンの培養物に加えた。

抽出物を添加して数日後、ニューロンをホモジナイズし、そのアリコートについ て、Ｆｏｎｎｕｍの方法（１９６９，Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　１１５．４６５ −４７２）によりコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）活性のレベル を検定した。３通りの試料で反復実験を行った。（ａ）では、表示した組織から 抽出されたタンパク質２５０μｇを加えた。データは、抽出物を添加せずに生育 させた対照培養物中に存在するＣｈＡＴ活性に対する、ＣｈＡＴ活性の誘導倍率 として表される。（ｂ）では、坐骨神経または汗腺から抽出されたタンパク質２ ５０μｇを加えた。データは、添加したタンパク質１ｍｇあたりの比活性の誘導 倍率として表される。

図２゜ （ａ）　汗腺抽出物の濃度を増加させると、コリンアセチルトランスフェラーゼ 活性の誘導が増大した。成熟ラットの汗腺から抽出された可溶性タンパク質を、 濃度を次第に高めながら交感神経系ニューロンの培養物に加えた。抽出物を添加 して数日後、ニューロンをホモジナイズし、そのアリコートについて、Ｆｏｎｎ ｕｍの方法（１９６９，Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　１１５．４６５−４７２）に よりコリンアセチルトランスフェラーゼ活性を検定した。３通りの試料で反復実 験を行った。データは、活性のｐｍｏ　１／分／ウェル±ＳＤ（標準偏差）とし て表される。

（ｂ）　コリンアセチルトランスフェラーゼ活性の誘導の時間経過。成熟ラット の汗腺から抽出された可溶性タンパク質（１００μｇ／ｍｌ）を交感神経系ニュ ーロンの培養物に加えた。抽出物の添加後適当な間隔をおいて２通りの試料をホ モジナイズし、アセチルトランスフェラーゼ活性について検定した。データは、 活性のｐｍｏ　１／分／ウェル±ＳＤとして表される。

図３．　汗腺抽出物はチロシンヒドロキシラーゼを低下させる。

交感神経系ニューロンを、汗腺抽出物を添加しない培地（ａ）または１００μｇ ／ｍｌの汗腺抽出物を添加した培地（ｂ）で生育させた。数個のウェルからの試 料をプールし、試料緩衝液中でホモジナイズし、電気泳動し、ニトロセルロース にプロットした。

チロシンヒドロキシラーゼに対するモノクローナル抗体を用いてプロットを検索 した。対照および処理した培養物からのバンドの染色強度のレーザーデンシトメ ーター走査（吸光度６００ｎｍ）を示す。

図４゜ （ａ）　汗腺抽出物はＶＩＰの発現を調整する。成熟ラットの汗腺から抽出され た可溶性タンパク質の段階的希釈物を交感神経系ニューロンの培養物に加えた。

抽出物の添加後８日目に培養物を回収した。姉妹ウェルについて、ラジオイムノ アッセイによりＶＩＰレベルを、あるいはコリンアセチルトランスフェラーゼ活 性を検定した。２通りの試料で反復実験を行った。データは、ＶＩＰのｐｇ／ウ ェル±ＳＤ、またはコリンアセチルトランスフェラーゼ活性のｐｍｏｌ／ウェル ±ＳＤとして表される。

（ｂ）　汗腺抽出物はＮＰＹのレベルを低下させて、ＶＩＰのレベルを上昇させ る。汗腺抽出物（１００μｇ／ｍｌ）を交感神経系ニューロンの培養物に加えた 。抽出物の添加後８日目に培養物を回収した。姉妹ウェルについて、ラジオイム ノアッセイによりＮＰＹまたはＶＩＰを検定した。３通りの試料で反復実験を行 った。データは、ＶＩＰまたはＮＰＹのｐｇ／ウェル±ＳＤとして表される。

図５．　汗腺抽出物におけるコリン作動性分化活性の出現。表示した日齢の動物 から汗腺抽出物を調製した。はぼ等しいタンパク質濃度（１００μｇ／ｍｌ）を 交感神経系ニューロンの培養物に加えた。抽出物の添加後７日目に、ニューロン を回収し、アリコートのコリンアセチルトランスフェラーゼ活性について検定し た。それぞれの日齢で少なくとも３つの別個の調製物を試験した。

データは、抽出タンパク質１ｍｇあたりのコリンアセチルトランスフェラーゼの 誘導倍率±ＳＤとして表される。

図６．　汗腺抽出物中に存在するコリン作動性−誘導活性はＣＤＦ／Ｌ　Ｉ　Ｆ に対する抗体により免疫沈降されない。

（ａ）　汗腺抽出物（ＤＥＡＥ画分）をプロティンＡ−セファロース（Ａ）　、 ＣＤＦのＮ末端配列に対するアフィニティー精製抗体（Ｂ）、またはペプチド抗 原とブレインキュベートしたアフィニティー精製抗体（Ｃ）とインキュベートし た。免疫沈降後、上清を交感神経系ニューロンの培養物に加えた。抽出物の添加 後１００日目、培養物のコリンアセチルトランスフェラーゼ活性についてＦｏｎ ｎｕｍの方法（１９６９，Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　１１５．４６５−４７２） により検定した。結果は、抽出物を添加しない培地で生育させたニューロンにお いて観察された活性に対する、コリンアセチルトランスフェラーゼ活性の誘導倍 率として表される。全て、２通りの試料で反復実験を行った。

（ｂ）１２５Ｉテ標識した組換えＣＤ　Ｆ／Ｌ　Ｉ　Ｆ　（２０，０００ｃｐｍ ）を、ＣＤＦのＮ末端配列に対するアフィニティー精製抗体（レーンｌおよび３ ）と、またはペプチド抗原とブレインキュベートしたアフィニティー精製抗体（ レーン２および４）と、緩衝液中（レーンｌおよび２）であるいは成熟ラット汗 腺から抽出された可溶性タンパク質１０μｇ（レーン３および４）と共にインキ ュベートした。ＣＤＦのＮ末端配列に対するアフィニティー精製抗体による免疫 沈降後、ＳＤＳ試料緩衝液中で沸騰させて標識タンパク質を抽出し、１０％ゲル で５ＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。

７日の露出後に現像したＸ線フィルム上には、標識ＬＩＦ（矢印）が局在してい た。より高い分子量のバンドはプロティンＡ−セファロースにより免疫沈降され た標識ウシ血清アルブミンである。

図７．　ＣＮＴＦは汗腺抽出物中に検出されない。パネルａでは、１０ｎｇの組 換えＣＮＴＦをニトロセルロースにプロットした。パネルｂおよびＣでは、坐骨 神経抽出物からの（レーンｌ）、成熟ラットの有毛皮膚抽出物からの（レーン２ ）、または成熟（レーン３）もしくは２１１日目レーン４）の動物の汗腺抽出物 からの、それぞれの可溶性タンパク質（ＤＥＡＥ画分）６０μｇをニトロセルロ ースにプロットした。パネルａおよびｂでは、組換えラットＣＮＴＦに対するポ リクローナル抗血清を用いてプロットを検索し、一方パネルＣでは、１０μｍの 組換えＣＮＴＦとブレインキュベートした抗体を用いてプロットを検索した。パ ネルａは抗血清がＣＮＴＦを認識することを実証している（矢印）。

予測されたように、抗血清は坐骨神経抽出物中に存在する２４キロダルトン（ｋ 　ｄ）バンドを認識するが（レーンｌｂ、ｃ）、有毛皮膚抽出物（レーン２）や ２１１日目レーン３）または成熟（レーン４）動物からの汗腺抽出物には特定の バンドが見られなかった。ｂおよびＣの矢印は９２．３ｏおよび２２．５ｋｄの 標準を示す。

図８．ＣＮＴＦメツセージは汗腺抽出物中に検出されない。成熟ラットの坐骨神 経（ａ）、汗腺（ｂ）、肝臓（Ｃ）および視神経（ｄ）からの全ＲＮＡ　３０μ ｇを電気泳動にかけ、ナイロン膜に移行させた。次に、膜をラットＣＮＴＦに対 するオリゴヌクレオチドプローブで検索した。矢印は坐骨神経ＲＮＡを含むレー ンａに陽性の１．３ｋｂバンドを、そして視神経（ｄ）の同じ位置にかすかなバ ンドを示す。汗腺および肝臓ＲＮＡをそれぞれ含むレーンｂとＣには特異的シグ ナルが何も検出されない。

図９．　ｉｎ　５ｉｔｕハイブリダイゼーシヨン。坐骨神経の切片をラットＣＮ ＴＦに対するオリゴヌクレオチドプローブで検索した。

パネルａは坐骨神経切片中のＳｃｈｗａｎｎ細胞への特異的ハイブリダイゼーシ ョン（アンチセンスプローブを使用）を示す。パネルｂはエチジウムプロミドで 染色した同じ組織切片を示す。粒子のランダムな分布を示すパネルＣでは、セン ス（対照）プローブとの結合が見られない。パネルｄはエチジウムプロミドで染 色した同じ組織切片を示す。

図１０．　ｉｎ　５ｉｔｕハイブリダイゼーシヨン。汗腺の切片を、図９で用い たラットＣＮＴＦに対するオリゴヌクレオチドプローブで検索した。汗腺の切片 には特異的結合が見られない（パネルａ）。センス（対照）プローブとの結合も 見られない（パネルＣ）。パネルｂとｄはエチジウムプロミドで染色した切片を 表す。

図１１．　陰イオン交換クロマトグラフィー。セクション６、３．３゜に記載し たようにホモジナイズし、遠心分離した後、汗腺抽出物の上清をＤＥＡＥイオン 交換カラムにかけ、交感神経ニューロンにおけるコリンアセチルトランスフェラ ーゼ（ＣｈＡＴ）誘導活性について検定した。四角：ＣｈＡＴ誘導。菱形：Ｎａ Ｃ１勾配。

図１２．　クロマトフオーカシング。ＤＥＡＥ溶出液をＭＯＮＯＰカラムでクロ マトグラフィーにかけ、０．５ｍｌ抽出液を集め、コリン作動性活性（交感神経 ニューロンにおけるＣｈＡＴ誘導活性）について検定した。四角：ＣｈＡＴ誘導 。菱形：ｐＨ。

図１３．　（ａ）　２２−２６ｋｄと２６−３２ｋｄの範囲のＳＤＳゲル画分を 溶出し、解離した交感神経ニューロンの培養物に加えた。抽出物の添加後７日目 に、ニューロンをホモジナイズし、アリコートのコリンアセチルトランスフェラ ーゼ（ＣｈＡＴ）活性レベルをＦｏｎｎｕｍの方法により検定した。３通りの試 料で反復実験を行った。データは、抽出物を添加せずに生育させた対照培養物中 に存在する活性に対するＣｈＡＴ活性の誘導倍率として表される。

ｂては、溶出タンパク質のアリコートをＳＤＳゲルに再度かけ、クーマシーブル ーで染色した。レーンａは２２−２６ｋｄ　（下の矢印）画分を、レーンｂは２ ６−３２ｋｄ　（上の矢印）画分を示す。

５、　発明の詳細な説明 本発明は、標的により誘導されるニューロンコリン作動性分化因子（ＮＣＤＦ） 、並びにその治療および診断用途に関するものである。本発明はＮＣＤＦ、その 誘導体、類縁体およびフラグメント、前記のものを含む医薬組成物、並びに抗Ｎ ＣＤＦ抗体を提供する。

本発明のＮＣＤＦは哺乳動物の汗腺の抽出物中に存在するタンパク質であり、そ れらは熱およびトリプシン不安定性、ヘパリン−アガロースアフィニティーカラ ムへの実質的な結合性の欠如、約４．８−５．２の範囲の等電点（ｐｉ）、弁膜 細胞性局在化、および１６−３２キロダルトンの範囲のおよその分子量を示す。

ＮＣＤＦタンパク質、その誘導体、類縁体およびフラグメントは、細胞培養下（ ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）において交感神経系ニューロンによるチロシンヒドロキシラ ーゼと全カテコールアミン類の発現を低下させ、一方でコリンアセチルトランス フェラーゼとバソアクティブ・インテステイナル・ペプチド（Ｖ　Ｉ　Ｐ）の発 現を高めることができる。

ＮＣＤＦタンパク質、その誘導体、類縁体およびフラグメントは、ニューロンに おけるコリン作動性活性を誘導するために使用される。かかるタンパク質、誘導 体、類縁体およびフラグメントは、多数のニューロン型の生存および／またはコ リン作動性分化をサポートすることが望まれる神経系の損傷または疾患を有する 患者に治療的に投与される。

本発明の特定の態様において、ＮＣＤＦタンパク質はヒト汗腺の抽出物中に存在 するものである。他の態様において、ＮＣＤＦタンパク質はラット由来の汗腺抽 出物中に存在するものである。

本発明のさらに別の態様において、ＮＣＤＦタンパク質、その誘導体、類縁体お よびフラグメントは、エンケファリン、ソマトスタチン、サブスタンスＰのよう なその他のペプチドの発現を誘導しうる。

以下の実施例セクションで詳述するように、我々は培養した交感神経系ニューロ ンの伝達物質特性に及ぼす汗腺抽出物の効果を調へた。我々は汗腺に可溶性因子 （ＮＣＤＦと呼ぶ）が存在することを見いだし、この因子はカテコールアミンと チロシンヒドロキンラーゼの発現を低下させ、そしてコリンアセチルトランスフ ェラーゼとＶＩＰの発現を誘導する。

ヒト、ラット、ブタおよび他の種のＮＣＤＦ、もしくはそれらの機能的均等物が 本発明に従って用いられる。さらに、本発明はヒツジ、ウシ、ネコ、トリ、ウマ 、またはイヌ、並びに霊長類やＮＣＤＦ活性が存在する他の種から単離されたＮ ＣＤＦタンパク質にも関係する。本発明はまた、ＮＣＤＦタンパク質、そのフラ グメントおよび誘導体、またはそれらの機能的均等物を提供する。

本発明はまた、抗原決定基を含むか、あるいは機能的に活性であるＮＣＤＦタン パク質のフラグメントまたは誘導体を提供する。

ここで用いる「機能的に活性」とは、既知のＮＣＤＦ機能（例えば、ｉｎ　ｖｉ ｔｒｏて交感神経系ニューロンによるコリンアセチルトランスフェラーゼの発現 を増強する能力）に関するアッセイにおいて陽性の活性をもつことを意味する。

本発明のＮＣＤＦ誘導体、類縁体またはフラグメントとしては、配列内の残基が 機能的に均等なアミノ酸残基で置換されてサイレント変化を生ずる変異型配列を 含めて、汗腺抽出物から精製されるような、全長ＮＣＤＦタンパク質に含まれる 一部アミノ酸配列の全部または一部を含むものが挙げられるが、これらに限定さ れない。例えば、配列内の１つ以上のアミノ酸残基を、機能的均等物として作用 してサイレント変異をもたらす類似の極性の他のアミノ酸で置換することができ る。配列内のアミノ酸の置換はそのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから 選択しうる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸にはアラニン、ロイシン、イソ ロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチ オニンが含まれる。極性中性アミノ酸にはグリシン、セリン、トレオニン、シス ティン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが含まれる。正に荷電した （塩基性）アミノ酸にはアルギニン、リシンおよびヒスチジンが含まれる。負に 荷電した（酸性）アミノ酸にはアスパラギン酸やグルタミン酸が含まれる。

さらに、タンパク質加水分解切断、抗体分子や他の細胞リガンドへの結合、アセ チル化、ホルミル化、酸化、還元などによって修飾されたＮＣＤＦタンパク質、 フラグメント、類縁体または誘導体も本発明の範囲内に含まれる。

５．２．　ニューロンコリン作動性分化因子の精製ＮＣＤＦは哺乳類汗腺の入手 しうる供給源から当分野で知られた手法を用いて精製することができる。かかる 手法にはクロマトグラフィー（イオン交換、アフィニティー、サイジングカラム クロマトグラフィー）、遠心分離、分別溶解、またはタンパク質精製のための他 の標準手法が含まれるが、これらに限定されない。

例えば、限定するものではないが、次の方法によって汗腺抽出物からＮＣＤＦを 単離できると考えられる。セクション６、３．３．に記載した方法に従って汗腺 抽出物を調製する。そこに記載したようにホモジナイゼーションと遠心分離を行 った後、上清を集め、陰イオン交換カラム（例えば、ＤＥＡＥ、リン酸緩衝液で 平衡化したワットマンＤＥ５２セルロース）にかけ、そして当分野で知られた方 法によりそこから集める。その後、精製した抽出物を公知の方法でショ糖勾配遠 心にかけ、適当な画分を限外濾過で濃縮する。次に、精製したＮＣＤＦを分析用 または分離用ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかける。所望により、ポリアク リルアミドゲルからの溶出後、ＮＣＤＦは、ＨＰＬＣ逆相カラムの使用によりあ る種の緩衝液成分を精製して、取り除いてもよい。

ゲル電気泳動の例として、精製ＮＣＤＦはスラブ式５ＤＳ−ポリアクリルアミド ゲルを使って分析し得る。精製ＮＣＤＦまたは分子量標準を電気泳動にかけ、ゲ ルを切りだし、次のように処理する。つまり、ゲルを０．２５Ｍ　ＫＣｌ中でイ ンキュベートしながらタンパク質結合ＳＤＳを沈殿させ、そして標準およびＮＣ ＤＦバンドの位置を記録することにより、固定せずにポリペプチドを可視化する 。その後レーンを固定し、クーマシーブルーで染色する。他のレーンをスライス に切り、タンパク質電気泳動溶出またはトリトンｘ−ｔ　ｏ　ｏとのインキュベ ーションにより溶出し、その後溶出物のＮＣＤＦ活性を調べる。

５．３．　ＮＣＤＦバイオアッセイ ＮＣＤＦ活性はＮＣＤＦＣＤ性のｉｎ　ｖｉｖｏまたはｉｎ　ｖｉｔｒｏ系を使 って評価し得る。例えば、以下のセクション６．３．に記載するようなアッセイ 、例えば細胞培養下で交感神経系ニューロンによるコリンアセチルトランスフェ ラーゼの発現を増強するか、またはバソアクティブ・インテステイナル・ペプチ ドの発現を増強するか、もしくはチロシンヒドロキシラーゼの発現を低下させる が、あるいは全カテコールアミン類の発現を低下させる能力を検定するアッセイ を使用しつるが、これらに限定されない。

また、別の例として、ＮＣＤＦ活性は、単層培養下の胚（Ｅ８）ニワトリ毛様体 神経節（ＣＧ）ニューロンの２４時間生存を定量することによっても測定し得る 。例えば、毛様体神経節をＥ８ニワトリ胚から集め、解離しく神経節につき約２ ０，０００個の細胞が得られる）、その後Ｖａｒｏｎら（１９７９，Ｂｒａｉｎ 　Ｒｅｓ、　１７３゜２９−４５　）に記載されるように２０％のウマ血清を含 むＨＥＢＭ培地で希釈する。１ｏｏｏ個のニューロン（２０００個の細胞）を含 む細胞墾濁体約５０μｍをマイクロタイター皿にまき、その後推定上のＮＣＤＦ 活性を加える。培養プレートを５％ｃｏ！のもとて３７℃、２４時間維持する。

その後、ＨＥＢＭ培地に２００μｍの２％グルタルアルデヒドを加えて培養物を 固定し、位相差顕微鏡での直接計数により生存しているニューロンの数を肉眼で 数える。

５．４．　ＮＣＤＦの配列決定 ＮＣＤＦタンパク質はその配列が直接決定されるが、あるいは黄色ブドウ球菌（ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）Ｖ　８、トリプシン、臭化シア ンを含むがこれらに限定されない当分野で知られたプロテアーゼまたは他の化合 物で最初に切断される。ペプチドは気相マイクロシークエンサーでの自動エドマ ン分解により、Ｈｅｗｉｃｋら（１９８１，Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２ ５６．７９９０−７９９７）およびＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒら（１９８３，Ｍｅ ｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　９１．２２７−２３６）の方法に従って配列決 定しうる。その後、フェニルチオヒダントインアミノ酸の検出をＬｏｔｔｓｐｅ ｉｃｈ　（１９８５，Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　３２６．３２１−３２７ ）に従って行う。アミノ酸配列の重複フラグメントを決定し、これらを用いてよ り長い連続配列を推定することができる。

５．５．　抗ＮＣＤＦ抗体の生成 本発明によれば、ＮＣＤＦタンパク質、またはそのフラグメントもしくは誘導体 は抗ＮＣＤＦ抗体を生成するための免疫原として使用される。

当分野で知られた種々の方法を使って、ＮＣＤＦのエピトープに対するポリクロ ーナル抗体を生産することができる。抗体の生産のために、ＮＣＤＦタンパク質 、またはそのフラグメントもしくは誘導体を注入することにより、ウサギ、マウ ス、ラットなどを含むがこれらに限定されない多種の宿主動物を免疫感作するこ とができる。免疫応答を増強するために、宿主種に応じて種々のアジュバントを 用いてもよく、例えばフロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムの ような無機ゲル、リゾレシチンのような界面活性物質、プルロニックポリオール 、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、キーホール・リンベット・ヘモシ アニン、ジニトロフェノール、ＢＣＧ　（カルメットーゲラン杆菌）のような有 効でありうるヒトアジュバント、およびコリネバクテリウム・バルバム（Ｃｏｒ ｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐａｒｖｕｍ）を含むが、これらに限定されない。

所望により、抗ＮＣＤＦ免疫応答を生ずる可能性をさらに高めるために、ひとた び得られたら、ＮＣＤＦのアミノ酸配列を解析して、免疫原性の増加と関連する 分子の部分を同定し得る。例えば、アミノ酸配列をコンピュータ解析にかけ、Ｈ ｏｐｐ　ａｎｄ　Ｗｏｏｄｓの方法（１９８１，Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ ａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　７８．３８２４−３８２８）に従って表面エ ピトープを同定する。

ＮＣＤＦに対するモノクローナル抗体を生産するためには、培養下で連続細胞系 による抗体分子の生産をもたらす技法が用いられる。例えば、Ｋｏｈｌｅｒ　ａ ｎｄ　Ｍｌｌｓｔｅｌｎ　（１９７５，Ｎａｔｕｒｅ　２５８＋　４９５−４９ ７）によって最初に開発されたハイブリドーマ技法、並びにトリオーマ技法、ヒ トＢ細胞ハイブリドーマ技法（Ｋｏｚｂｏｒ　ｅｔ　ａｌ、。

１９８３、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ　４．７２）、およびヒトモノク ローナル抗体を生産するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技法（Ｃｏｌｅ　ｅｔ　 ａｌ、。

１９８５、ｉｎ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｃａ ｎｃｅｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ”。

Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ、　Ｉｎｃ、　ｐｐ、　７７−９６）などが本発明の範 囲内に入る。

治療用のモノクローナル抗体はヒトモノクローナル抗体またはキメラ・ヒト−マ ウス（あるいは他の種）モノクローナル抗体であり得よう。ヒトモノクローナル 抗体は当分野で知られた数多くの技法のどれかを用いて作ることができる（例え ば、Ｔｅｎｇ　ｅｔ　ａｌ。

、１９８３．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、 　８０．７３０８−７３１２；Ｋｏｚｂｏｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８３．１ｍ ｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ　４．７２−７９；　０１ｓｓｏｎ　ｅｔａｌ、 、　１９８２．　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　９２．３−１６）　、キメラ 抗体分子はヒト不変部と共にマウス抗原−結合ドメインを含むように作られる（ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８４．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ ｃａｄ、　Ｓｅｔ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８１゜６８５１；　Ｔａｋｅｄａ　ｅｔ　 ａｌ、、　１９８５．　Ｎａｔｕｒｅ　３１４．４５２　）。

ＮＣＤＦエピトープに対する抗体の分子クローンは既知の技法により作ることが できる。モノクローナル抗体分子あるいはその抗原結合領域をコードする核酸配 列を構築するために、組換えＤＮＡ法（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ 、、　１９８２．　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ。

Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ ｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ 　Ｙｏｒｋを参照）が用いられよう。

抗体分子は、例えば免疫吸着またはイムノアフィニティークロマトグラフィー、 Ｈｌ）ＬＣ（高性能液体クロマトグラフィー）のようなりロフトグラフ法、ある いはこれらの組合せのような、既知の手法により精製することができる。

抗体分子のイディオタイプを含む抗体フラグメントは既知の方法により作製し得 る。例えば、このようなフラグメントには、抗体分子のペプシン消化により生成 されるＦ（ａｂ’）ｐフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィ ド橋を還元することにより生成されるＦａｂ’　フラグメント、および抗体分子 をパパインと還元剤で処理することにより生成される２ＦａｂまたはＦａｂフラ グメントが含まれるが、これらに限定されない。

５．６．　発明の有用性 本発明はＮＣＤＦと、それから得られるペプチドフラグメント類縁体または誘導 体に関する。ＮＣＤＦタンパク質、ペプチドおよび誘導体、並びに抗ＮＣＤＦ抗 体は診断および治療用途に利用されよう。たいていの診断または治療目的のため に、同じ種に由来するＮＣＤＦを使うことが好ましいが、本発明の特定の態様に おいてはＮＣＤＦの交差種利用も有用であろう。

（本頁以下余白） ５．６．　１　診断への応用 本発明は、ＮＣＤＦタンパク質、ペプチドフラグメントまたは類縁体、もしくは これらから生成した誘導体、並びにこれらのＮＣＤＦタンパク質、ペプチドまた は誘導体に対する抗体に関するものであるが、また、ＮＣＤＦＣＤ型における変 化に関連していると考えられる神経系の疾病または疾患の診断に利用することが できる。

ＮＣＤＦ発現の変化に関連した様態、疾患または疾病の状況、特に、副交感ニュ ーロン、コリン作動性ニューロン、を髄ニューロン、神経芽腫細胞および副腎髄 質細胞のようなＮＣＤＦＣＤ性と考えられるニューロンの損傷および変性がもた らす様態を検出、予見、診断または観察するために、アッセイを利用することが できる。これらの疾病や様態として、外傷、梗塞、感染、神経変性症、悪性腫瘍 、または手術後の変化が含まれるが、これらに限定されるものではなく、またア ルツハイマー（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ）症、パーキンソン（Ｐａｒｋｉｓｏｎ）症 、ハンチントン（Ｈｕｎｔ　ｉｎｇｔｏｎ）舞踏病および筋萎縮性側索硬化症が 含まれるが、これらに限定されるものではない。

本発明の別の実施例として、Ｎ　Ｃ，Ｄ　Ｆタンパク質、ペプチドフラグメント 、類縁体または誘導体に対する抗体を、神経系、特にニューロン集団の疾病また は疾患、そして上記に挙げた臨床疾患および疾病の診断に使用することができる 。本発明のＮＣＤＦタンパク質に対する抗体は、例えば、この鑑定を必要とする 患者からとった組織試料を使ったｉｎ　５ｉｔｕハイブリダイゼ一シヨン手法に 使用することができる。さらに別の例として、本発明の抗体をＥ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　 Ａ操作に使用して、組織または分泌液試料中に存在するＮＣＤＦ量を検出および ／または測定することができる；同様に、組織または分泌液試料中に存在するＮ ＣＤＦ量を検出および／または測定するために、ウェスタンプロット分析法に、 本発明の抗体を使用することができる。

ＮＣＤＦタンパク質、その類縁体、誘導体またはフラグメントを検出または測定 するのに使用することができる免疫検定法には、次のような手法を用いた競合ア ッセイまたは非競合アッセイがあるが、これらに限定されるものではない；ラジ オイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベントアッセイ）、”サン ドウィッチ”イムノアッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散法、凝集 法、補体結合法、イムノラジオメトリック（ｉｍｍｕｎｏｒａｄｉｏｍｅｔｒｉ ｃ）法、蛍光イムノアッセイ、タンパク質Ａイムノアッセイおよび免疫電気泳動 法、（ｔｏ　ｎａｍｅ　ｂｕｔ　ａ　ｆｅｗ）。

本発明の別の例では、ＮＣＤＦタンパク質、ペプチドフラグメントまたは誘導体 を神経系の疾病または疾患の診断に使用することができる。限定するものではな いが、特定の例において、ＮＣＤＦレセプター発現の非正常体を同定し、結果的 に組織または細胞のＮＣＤＦＣＤ性の異常の可能性を確認するために、ＮＣＤＦ レセプターを発現する組織または細胞を同定するのに使用するこ本発明は、ＮＣ ＤＦタンパク質、ペプチドフラグメント、類似体またはこれらから生成する誘導 体、並びにＮＣＤＦタンパク質、ペプチド、類似体または誘導体に対する抗体に 関連するものであるが、ＮＣＤＦＣＤ型式の変性に関係すると考えられる神経系 、もしくはＮＣＤＦまたは抗ＮＣＤＦ抗体との接触が効果をあげると考えられる 神経系の疾病または疾患の治療に利用できる。

ＮＣＤＦそしてその誘導体、フラグメントおよび類似体は、を髄運動ニューロン 、毛様神経節の副交感ニューロンその他を含む多数のニューロン型の生存および コリン作動性分化を支援するために使用することができる。本発明のＮＣＤＦ生 成物は、いくつかの細胞集団の生存および分化をｉｎ　ｖｉｖｏで支援する点で 有用性を持つと考えられる。これには以下のニューロンが含まれるがそれに限定 されるものではない；を髄運動ニューロン、副交感ニューロン（虹彩、心臓、胃 腸管および内臓構成物に分布する毛様神経節を含む）。こうして、本発明の特定 の例では、ＮＣＤＦまたはその活性誘導体、フラグメントまたは類似体を含む医 薬品を、中枢神経系が損傷している患者に投与することができる。

本発明の他の例では、ＮＣＤＦもしくはその活性誘導体、フラグメントまたは類 似体のみを、あるいは他の神経刺激因子（例えば、ＣＮＴＦ、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ 　（脳誘導神経刺激因子）またはＮＴ−３にエーロトロフィン−３））と組み合 わせて、自律神経系の損傷あるいは不均衡、過剰活性または過少活性がもたらす 病的様態、もしくはこうした自律神経系の損傷あるいは不均衡によって悪化した と思われる様態に苦しんでいる患者に投与することができる。これらの疾患につ ぎのちのがあげられるが、これに限定されるものではない；慢性無汗症および多 汗症、心臓不整脈、慢性便秘、神経性胆嚢機能障害および射精障害。

本発明の種々の例において、ＮＣＤＦタンパク質、ペプチドフラグメントまたは 誘導体を、外傷、手術、局所貧血、感染（例えばポリオまたはＡ、１．　Ｄ、　 Ｃ，）、代謝障害、栄養機能障害、悪性腫瘍または毒性試薬によって、神経系が 損傷を受けた患者に投与することができる。本発明は特に、ニューロンに損傷が 生じている様態を、ＮＣＤＦタンパク質、ペプチドフラグメント、誘導体または 類縁体の治療効果量を投与することによって、治療するのに使用することができ る。本発明の種々の特別の例において、ＮＣＤＦを、例えば外傷、梗塞、感染、 退行性疾病、または手術により損傷を受けたを髄ニューロンに投与することがで きる。

ＮＣＤＦ関連ペプチドまたはＮＣＤＦタンパク質を膜体、例えばシラスティック （ｓｉｌａｓｔｉｃ）膜に吸着させて、損傷神経に近接して埋め込むようにして 、投与するのが望ましいようである。この発明はまた、例えば、糖尿病性神経症 、例えばモノニューロパシー複合症（ｍｏｎｏｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ　ｍｕｌｔ ｉｐｌｅｘ）または交接不能、に苦しむ患者の回復を早めるのにも使用すること ができる。本発明のさらに別の例では、ＮＣＤＦタンパク質またはペプチドフラ グメント、あるいはそれらの誘導体を先天性様態または神経退行性疾患を治療す るのに使用することができる。これらには次のものが含まれるが、これに限定さ れるものではない；アルツハイマー症、老化、末梢神経症、パーキンソン症、ハ ンチントン舞踏病および運動神経細胞の疾病および疾患；特に、この発明は、コ リン作動性ニューロンの機能障害に関連した先天性または神経退行性疾患の治療 に使用することができる。

この発明の特定の例において、アルツハイマー症、筋萎縮性側索硬化症、および 他の運動神経疾病（例えばウェルドニッヒーホフマン（Ｗｅｒｄｎｉｇ−Ｈｏｆ 　ｆｍａｎ）症を含む）、そしてパーキンソン症の治療において、ＮＣＤＦタン パク質またはペプチドフラグメントあるいはそれらの誘導体を組織の外科的埋め 込みまたは他の持続性放出組成物と連関させて投与することがもくろまれている 。ＮＣＤＦはまた、先天性学習障害の他、種々の痴呆の治療にも有用であると考 えられる。

この発明のさらに他の例では、ＮＣＤＦタンパク質、フラグメントまたは誘導体 は、必要な神経刺激を行なわせるために、別のサイトカインと一緒に使用するこ とができる。例えば、これに限定するものではないが、この発明にしたがってＮ ＣＤＦを、ニューロンの生長および存続に刺激的効果を及ぼすため、ＮＧＦとと もに使用することができる。ＮＣＤＦは、中枢および末梢神経系の広い領域にわ たるニューロン副集団の生長、発生および存続に際し、まだ完全には特性が明ら かではないながら、他のＣＮＳ誘導ペプチド因子と相乗的に作用するものと考え られる。

さらにこの発明の別の例では、ＮＣＤＦタンパク質、ペプチドフラグメントまた はそれらの誘導体に対する抗体を、様々の神経性疾患および疾病に苦しみ、これ に対する治療を必要としている患者に投与することができる。例えば、ＮＣＤＦ の過剰生成に苦しむ患者はこの治療が必要であると考えられる。抗ＮＣＤＦ抗体 は、感覚性ニューロンの異常再生（例えば手術後）の抑制、または慢性苦痛症候 群の治療に使用することができる。

本発明の活性組成物は、ＮＣＤＦタンパク質、ペプチドフラグメントまたは類縁 体、もしくはこれらから生成した誘導体のすべてまたは一部、ＮＣＤＦタンパク 質、ペプチドフラグメントまたは誘導体に対する抗体（または抗体フラグメント ）、あるいはＮＣＤＦと第二の薬剤（例えばＮＧＦ）との組合せからなり、任意 の無菌性生体適合性医薬用担体とともに投与することができる。

そして、前記担体は生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロースおよび水を 含むが、これに限定されるものではない。

特定の疾患または様態の治療に有効となるＮＣＤＦタンパク質、ペプチドフラグ メント、誘導体または抗体の量は、その疾患または様態の性質に依存するもので あり、標準的な臨床試験法によって、決定することができる。可能ならば、投与 量対応答曲線を、初めに」二に述べたＮＣＤＦバイオアッセイシステムなどの１ ｎｖｉｔｒｏで決定し、人体で試験する前に、有効な動物モデル系で決定するこ とが望ましい。

導入の方法は、陵内、筋肉内、腹膜腔内、静脈内、皮下、経口および鼻内が含ま れるが、これらに限定されるものではない。さらに、この発明の医薬組成物を、 心室内およびを髄内注射を含む任意の適当な経路で、中枢神経系に導入するのが 望ましい；心室内注射は、例えばオマヤ（Ｏｍｍａｙａ）貯蔵器などの貯蔵器に 接続した心室内カテーテルによって、容易に行なうことができる。

さらに、この発明の医薬組成物を治療が必要な部位に局部的に投与することが望 ましい。これは例えば、手術中の局部的注入、注射、カテーテルの使用、埋め込 みの方法があるが、これらに限定するものではない。そして、この埋め込みは、 多孔性、非多孔性またはゲル状物質からなり、シアラスティック（ｓｉａｌａｓ ｔｉｅ）膜または繊維を含む。

この発明はまた、リポソーム、微小粒子またはマイクロカプセルによって投与さ れるＮＣＤＦタンパク質、ペプチドフラグメント、類似体または誘導体を含む医 薬組成物を提供するものである。

この発明の種々の例において、ＮＣＤＦおよびＮＣＤＦ関連生成物の持続的な放 出を達成するため、こうした組成物の使用が有効であると考えられる。

６、標的により誘導されるニューロンのコリン作動性分化因子の特性決定 ラット汗腺の交感神経支配は、発生中、ノルアドレナリン作動性からコリン作動 性およびペプチド作動性への誘導標的切り換えを行なう。培養した交感ニューロ ンを汗腺抽出物で処理すると、ｉｎ　ｖｉｖｏで見られる荷電（ｃｈａｒｇｅ） の多くを模倣する。抽出物は、添加量に対応して、ニューロン中にコリンアセチ ルトランスフェラーゼ活性と血管活性の腸内ペプチドを誘導し、カテコールアミ ン作動特性とニューロペプチドＹを減少させる。

コリン作動性の分化活性は出生後５日のラットの発生中の腺に見られ、成長した 線中にも維持される。これは熱不安定性、トリプシン感受性で酸性のタンパク質 で、ヘパリン−アガロースに結合しない。心臓細胞からのコリン作動性分化因子 （ＣＤＦ／ＬＩＦ）のＮ−末端ペプチドに対する抗血清を使用した免疫沈降試験 は、汗腺分化因子はＣＤＦ／ＬＩ　Ｆではないことを示唆している。

この汗腺活性はおそらく、ｉｎ　ｖｊｖｏで見られる交感神経伝達における標的 方向性の変化（ｔａｒｇｅｔ−ｄｉｒｅｃｔｅｄｃｈａｎｇｅ）を仲介するもの と考えられる。

発生中の汗腺神経支配に見られるアドレナリン作動性からコリン作動性への切り 換えに対応する標的因子を同定し、細胞培養物中で同定されたコリン作動性因子 と考えられる物質のｉｎ　ｖｔＶＯでの可能な役割を明らかにするため、培養し た交感ニューロンの伝達特性に及ぼす、汗腺抽出物の影響を検定した。汗腺が特 有の活性スペクトルを有する可溶性因子（ｌまたは複数）を含むことを見いだし た：これはカテコールアミンとチロシンヒドロキシラーゼの発現を減少させ、コ リンアセチルトランスフェラーゼとＶＩＰの発現を誘導する。この活性は、汗腺 神経支配の表現型が変化しているときに現われる。これらの汗腺由来のコリンア セチルトランスフェラーゼ誘導活性の初期の特性は、細胞培養物中であらかじめ 同定されたコリン作動性因子との比較を可能にする。

汗腺中に存在する可溶性因子の神経伝達状態に対する影響を調べるために、成熟 ラットの足底からの抽出物を交感ニューロン培養物１ｍｌあたり抽出タンパク質 ２５０μｇの濃度で添加した。姉妹源のニューロンを、組織抽出物を添加しない 培地、または汗腺抽出物と同し方法で調製した、同濃度の肝臓、毛表皮または翼 下線抽出物のタンパク質を含む培地で培養した。汗腺抽出物の添加は、無添加の 培地または肝臓、毛表皮または耳下腺抽出物添加の培地で培養したニューロンに 比較して、１５倍のコリンアセチルトランスフェラーゼ活性誘導をもたらした（ 図１ａ）。

汗腺抽出物中のコリン作動性誘導活性の可能な源としては、足底組織の末梢神経 叢に存在すると思われるＣＮＴＦがある。しかしながら、坐骨神経抽出物中およ び汗腺抽出物中のコリン作動性誘導活性の比較（図１ｂ）は、末梢神経叢が汗腺 組織のわずかな部分しか構成していないにも関わらず、抽出タンパク質ｍｇあた りの誘導量が等しいことを示した。この観察、そして毛表皮が交感および知覚神 経繊維と終末層を汗腺含有皮膚と同程度含んでいるにもかかわらず、毛表皮抽出 物が交感ニューロン培養物中でコリンアセチルトランスフェラーゼ誘導をもたら さないという知見から、汗腺抽出物のコリン作動性機能を誘導する能力が、シュ ワン（Ｓｃｈｗａｎｎ）細胞から派生するとされているＣＮＴＦによるものでは ないと推察される（Ｓｔｏｃｋｌｉ　ｅｔ　ａｌｌ。

、１９８９．Ｎａｔｕｒｅ３４２，９２０−９２３）。

（本頁以下余白） 表■　汗腺のコリン作動性誘導効果は血清と無関係である。

コリンアセチルトランス フェラーゼ活性 培地　ＳＧ抽出物 Ｌｉ２−Ｃｏ□十血清　１８．０５＋５．５７　１２６．０６土５．５８交感ニ ユーロンをＬｉ２−Ｃｏ２中、血清を含ませな０力λまた番よ５％ラット血清を 含ませて、汗腺抽出物３００μｇ／＋ｎｌとともに、培養した。細胞を抽出物添 加後７日で取り出し、ア１ノコートをフォナム（Ｆｏｎｎｕｍ）の方法（１９６ ９，Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、１１５．４６５−４７２）によって、コリンアセチル トランスフェラーゼ活性を試験した。試料を３通り取り出した。データ（よ基準 （ｗｅｌ＋）土ＳＥＭあたり毎分のコリンアセチルトランスフェラーゼｐｍｏ　 ｌで表している。

汗腺抽出物のコリンアセチルトランスフェラーゼ活性の誘導ｉｔ、交感ニューロ ンへの直接効果に起因していた。これらのニューロンは終始ントシンアラビノシ ドＩＯμｍ存在下で培養したので、非ニューロン細胞は事実上存在しなかった： かくして、汗腺抽出物がその効果を非ニューロン細胞を通して間接的に影響を及 ぼしたとは考えられない。さらに、交感ニューロン培養物が非ニューロン細胞を 与えない非血清含有培地中に保たれていたのに、汗腺抽出物で処理したところ、 コリン作動性が現われた（表１）。この観察によっても、通常の生育培地中に存 在するラット血清のコリン作動性の誘導を、汗腺抽出物が可能にしたものとは、 はとんど考えられない（Ｗｏｌｉｎｓｋｙ　ｅｔ　ａｌ、、１９８５゜Ｊ、Ｎｅ ｕｒｏｓｃｉ、５．１４９７−１５０８；Ｗｏｌｉｎｓｋｙ　ａｎｄ　Ｐａｔｔ ｅｒｓｏｎ、１９８３．Ｊ、Ｎｅｕｒ。

ｓｃｉ、３．１４９５−１５００）。

汗腺抽出物の、交感ニューロン培養物の生存を助ける能力について、試験を行な った。表ＩＩは、神経生長因子（ＮＧＦ）は含まず汗腺抽出物をＩｍｇ／ｍｌ含 む培地に接種したニューロンが、培養物中で３日以上は生存しなかったことを示 している。さらに、ＮＧ　Ｆ　５０　ｎｇ／ｍｌ存在下では、汗腺抽出物を含ま ない場合と、１ｍｇ／ｍｌを含ませた場合とで、培養物中のニューロンの数に、 有意な差異はなかった。解離した交感ニューロン培養物中のコリンアセチルトラ ンスフェラーゼ活性とアセチルコリン合成のレベルは、最初は極めて低いこと： 　（Ｊｏｈｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、１９７６、Ｎａｔｕｒｅ　２６２，３０８ −３１０；Ｊｏｈｎｓｏｎ、１９８０．Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、８４，６３０ −６３１；Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ　ａｎｄ　Ｃｈｕｎ、１９７７、Ｄｅｖ、Ｂｉｏ ｌ、６０，４７３−４８１）、そして５０から１００倍のコリンアセチルトラン スフェラーゼ活性誘導でも細胞数においてはさほど差がなかったことから、汗腺 抽出物存在下で見られたコリンアセチルトランスフェラーゼ活性の誘導が、最初 から存在していたコリン作動性のニューロンが選択的に生存していたことによる ものとは、到底考えられない。

表１■　交感ニューロンの生存に及ぼすＮＧＦおよび汗腺抽出物の影響 細胞数 −ＮＧＦ　−ＮＧＦ＋Ｂｘｔ　＋ＮＧＦ　＋ＮＧＦ＋Ｂｘｔ５日目　１０±１２ 　１２土１３　４６２４＋１１２　４８６７＋１２８交感ニユーロンを５６の基 本プレートで、ＮＧＦ　（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬｌ５−ＣＯ２中、２日培養 した。２日目、培養物を、ＮＧＦを含まない（−ＮＧＦ）　、ＮＧＦを含まない が１ｍｇ／ｍｌの汗腺抽出物を含む（−ＮＧＦ＋Ｅｘｔ）　、５０μｇ／ｍｌの ＮＧＦを含む（＋ＮＧＦ）　、または５０　ｎｇ／ｍｌのＮＧＦと１　ｍｇ／　 ｍ　１の汗腺抽出物を含む（＋ＮＧＦ十Ｅｘ　ｔ）培地に移した。さらに３日培 養した後、細胞数を計数した。試料を３通り取り出した。データ６、１．２．　 コリンアセチルトランスフェラーゼの誘導は投与量に依汗腺抽出物の連続希釈物 を培養した交感神経ニューロンに加え、そして７日後にウェルのコリンアセチル トランスフェラーゼ活性について検定した。誘導は、１０μｇ／ｍ１程度の低い 投与量で認められ、試験した最大投与量に至るまで抽出物の添加量が増加するの に応じて増加した（図２ａ）。１　ｍｇ／＋ｎｌよりもずっと高濃度で抽出物を 用いると、培養系にいくらか毒性が現れた。すなわち、ニューロンの数が減少し 、細胞の大きさが縮小した。毒性は、当該抽出物中の高濃度のコリン作動性誘導 活性に原因があるのかも知れない。というのは、他のコリン作動性誘導因子を高 濃度で投与した場合、同様の結果が起こることが記載されているからである（　 Ｆｕｋａｄａ、　１９８５．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、 　ＵＳＡ　８２．８７９５−８７９９；５ａａｄａｔ　■ ｔ　ａｌ、、ｌ９８９．Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、１１０８．１Ｏ０７−１０１ ６）　、そうでなければこの毒性は、調製物中の他の化合物に原因があるのかも 知れない。

誘導の経時的な変化も測定された。コリンアセチルトランスフェラーゼ活性の上 昇は、早くも培養２日目に認められた。そして最後に検定された時点である１４ ４日目で上昇し続けた（図２ｂ）。

この交感神経ニューロン培養におけるコリン作動性誘導の経時的な変化は、心臓 及び筋肉細胞の調整培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ　ｍｅｄｉｕｍ）因子、おそ ら＜ＣＤＦ／ＬＩＦ　（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ　ａｎｄ　Ｃｈｕｎ、１９７７、Ｄ ｅｖ、Ｂｉｏｌ、６０゜４７３−４８１；Ｒａｙｎａｕｄ　ｅｔ　ａｔ、、１１ ９８７．Ｄｅｖ、Ｂｉｏｌ、１２１，５４８−５５８）　、並びにＣＮＴＦ（Ｓ ａａｄａｔ　ｅｔ　ａｌ、　、　１９８９．、　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　 １０８．１８０７−１８１６）において報告されている経時的な変化に似ている 。これに対して、ＭＡＮＳによって交感神経ニューロンを処理するか（Ａｄｌｅ ｒ　ｅｔ　ａｌ、、１９８９．Ｐｒ。

ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８６．１０８０−１０８３ ）　、又は骨格筋から分離された可溶性因子によってを髄培養物を処理した（Ｍ ｃＭａｎａｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、。

１９８８、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６３．５８９０−５８９７）後 では、コリンアセチルトランスフェラーゼ活性の増加が非常に早期に認められる 。

コリンアセチルトランスフェラーゼ活性は、通常の汗腺の神経分布が発達する間 に現れるだけでなく、これに付随して、チロシンヒドロキシラーゼの免疫活性と カテコールアミン組織蛍光発光の減少もまた認められる（Ｌａｎｄｉｓ　ａｎｄ 　Ｋｅｅｆｅ、　１９８３．　Ｄｅｖ、　Ｂｉｏｌ、　９８．３４９−３７２＋ Ｌａｎｄｉｓ　ｅｔ　ａｔ、　１９８Ｂ、　Ｄｅｖ、　Ｂｉｏｌ、　１２６．１ ２９−１４０）。もしも汗腺抽出物が神経伝達物質の表現型を変える役割を演す る因子を含んでいたなら、汗腺の抽出物が培養交感神経ニューロンのノルアドレ ナリン作動特性の発現を低下させると予想されよう。チロシンヒドロキンラーゼ レベルに対する汗腺抽出物の影響を検定するために、抽出物の存在下と非存在下 で成長させたニューロンの同等の蛋白質アリコートを５ＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシ ル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）に処し、ニトロセルロー ス上客こプロットし、チロシンヒドロキシラーゼに対するモノクローナル抗体（ Ｒｏｈｒｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、１９８６．Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、６．２６１６ −２６２４；エドモントン（Ｅｄｍｏｎｔｏｎ）大学のＡ、　Ａｃｈｅｓｏｎ博 士の寄贈である）で検出した。単一のバンドが期待された分子量である６２ｋｄ に現れた（Ｌａｍｏｕｒｏｕｘ　ｅｔ　ａｌ、、１９７９．Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ 、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７９．３８８１−３８８５）　。免疫プロットの 目視による検分により、免疫反応性の量は、汗腺の抽出物と共に成長させた培養 物では、顕著に減少することが示唆された（図３）。発色強度をレーザーデンシ トメーターで読むと、１００μｇ／ｍｌの汗腺抽出物と共に成長させた培養物で （よ、２．５倍のチロシンヒドロキシラーゼのレベルの減少が検出されｔこ。こ れ：こ対してポリクローナル抗血清（ケース　ウェスタン　１ノザーブ（Ｃａｓ ｅＷｅＳｔｅｒｎ　Ｒｅ５ｅｒｖｅ）大学のＬｌ、Ｒｕｔｉｓｈａｕｓｅｒ博士 の寄贈である）を用いて検出すレタ細胞表面接着分子であるＬｌ（Ｒａｔｈｊｅ ｎ　ａｎｄ　５ｃｈａｃｈｎｅｒ、　１９８４．　ＥＭＢＯ，Ｊ、　３．　ｌ− １０）の免疫活性レベルｉｔ、同様の方法で検定しても減少しなかっｂｏ チロシンヒドロキシラーゼのレベルの変化力（カテコールアミンのレベルの対応 する変化と関連するか否かを決定するために、汗腺抽出物の存在下及び非存在下 で成長させた、及び汗腺抽出物なしに成長させた交感神経ニューロンの培養物に お（Ｎてカテコールアミン量を測定した。汗腺の抽出物の存在下でインキュベー トしたウェルの全カテコールアミン量は、コントロールの全カテコールアミン量 と比較して減少していた（表Ｉ１１　）。

（本頁以下余白） 表ＩＩ＋ 汗腺の抽出物はカテコールアミンの検出可能な（＋）！１１０１／ウェル）　減 少（％）コントロール培地　１４．１５±２．３３　１汗腺の抽出物 Ａ　（１１）　１０．６５±０．９　２３．３Ｂ　（２６）　７．９５±０．１ ３　４６．５Ｃ（４７）　６．０　＋０．６　６０ 交感神経ニユーロンを汗腺抽出物（ｌｏｏμｇ＃＋１．２５０μｇ／ｍｌ、及び ｌ　ｍｇ／ｍｌ）と共に成長させた。抽出物の添加から７日後に、培養物を集め て、高速液体クロマトグラフィーでカテコールアミンの量を検定した。試料は３ 通り用いた。データは培養皿毎のカテコールアミンの平均ｐｍｏ　ｌ数±ＳＥＭ で表している。括弧内の数字は、フ埼ナム（Ｆｏｎｎｕｍ）の方法（１９６９， ８ｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　、　１１５．４６５−４７２）によって姉妹ウェルて 検定されるコリンアセチルトランスフェラーゼの誘導倍数の平均値である。

コリンアセチルトランスフェラーゼ活性とカテコールアミン量の間には逆相関関 係が認められた。すなわち、コリンアセチルトランスフェラーゼの誘導が増加す ると、カテコールアミン量が減少した。この関係は、心臓及び骨格筋細胞の調製 培地についての研究ですてに認められている（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ　ａｎｄ　Ｃ ｈｕｎ、　１９７７、　Ｄｅｖ、　Ｂｉ。

１、５６．２６３−２８０：Ｒａｙｎａｕｄ　ｅｔ　ａｌ、　、　１９８７．　 Ｄｅｖ、　Ｂｉｏｌ、　１２１．５４８−５５８）。

６．１．４　汗腺の抽出物は神経ペプチドの発現を変更する。

神経ペプチドの発現の変化は発達しつつある汗腺の神経分布で認められる。ＶＩ Ｐ免疫反応性は、当初は欠けているが、ＰＩＯによって検出可能になる。すなわ ち、かかる免疫反応性はその後の発達と共に量と強度が増加する。胸部に移植さ れた肉肚（足裏）の交感神経系の分布はＶＩＰ免疫反応性を獲得する故に、汗腺 はコリンアセチルトランスフェラーゼ活性に加えてＶＩＰの発現を誘導すること ができる（Ｓｃｈｏｔｚｉｎｇｅｒ　ａｎｄ　Ｌａｎｄｉｓ、　＋９８８．Ｎａ ｔｕｒｅ　３３５，６３７−６３９：未公開データである）。それ故に我々は、 抽出物がＶＩＰのレベルを上昇させるか否かを決定するために、汗腺抽出物で処 理した交感神経ニューロンの培養物をラジオイムノアッセイで検定した。コント ロール培地で成長させた交感神経ニューロンは、相対的にほとんどＶＩＰ免疫反 応性を示さない。汗腺の抽出物は顕著にＶＩＰを上昇させる（図４ａ）　、すな わち、１００　μｇ／ｍｌの投与てｓｏｐｇ／ウェルのＶＩＰが誘導され、コン トロール培養物に現れるＶＩＰレベルよりも４倍以上増加する。ＶＩＰ発現の誘 導は、汗腺抽出物の濃度の増加につれて増加する（図４ａ）。

多くのノルアドレナリン作動性交感神経ニューロンは、ＮＰＹ免疫反応性を示す が、汗腺に分布する神経を含めて、コリン作動性の交感神経ニューロンは、当該 免疫反応性を示さないことが従来の研究かられかっている（Ｌａｎｄｉｓ、　ｅ ｔ　ａｔ、　、　１９８８．　Ｄｅｖ、　Ｂｉｏｌ、　１２６．１２９−１４０ ；Ｌｉｎｄｈ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９．Ｃｅ１ｌ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｒｅｓ、 ２９６，２５９−２７３）　ｏそれ故、汗腺の抽出物のＮＰＹ量に及はす作用が 試験された。従来の研究で観察された通り、ＮＰＹ様免疫反応性は、コントロー ル培養物で高値を示した（Ｍａｒｅｋ　ａｎｄ　Ｍａｉｎｓ、　１９８９．　Ｊ 、　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、　５２．１８０７−１８＋６：Ｎａｗａ　＆Ｓａｈ、 　！９９０．　Ｎｅｕｒｏｎ　４．２７９−２８７）。汗腺の抽出物の存在下で 成長させた場合は、ＮＰＹ量の減少が導かれた（図４ｂ）。この減少は、ＶＩＰ 量が上昇することと著しく対照的である。そして、汗腺抽出物が２つのペプチド のレベルを別個に調節することが示唆される。汗腺の抽出物と共に成長させた交 感神経ニューロンのＮＰＹの発現の減少は、ｉｎ　ｖｉｖｏペプチド発現に対す る標的効果についての従来の研究の結果と一致する。すなわち、新生う・ソトの 上類部神経節を前眼房に移植した後、神経節が汗腺と一緒に移植されたとき、Ｎ ＰＹ−］　Ｒは現れなかった。しかし、神経節が松果腺と一緒に移植された場合 は現れる（Ｓｔｅｖｅｎｓ　ａｎｄ　Ｌａｎｄｉｓ、　１９９０．　Ｄｅｖ、　 Ｂｉ。

１、７３７．１０９−１２４）。

発達しつつある汗腺の神経分布における神経伝達物質特性の変化は生後に現れ、 Ｐ２１までに本質的に完結する。検出可能なコリン作動性誘導活性が発達中の腺 に現れる最も早い日齢を決定するために、日齢か２日〜２１日の動物の肉ＩＪＬ 　（足裏）から抽出物を調製し、当該抽出物のコリンアセチルトランスフェラー ゼ活性を誘導する能力を検定した（図５）。コリンアセチルトランスフェラーゼ のレベルの上昇は、Ｐ５の腺抽出物で処理した培養物で検出された、そしてコリ ンアセチルトランスフェラーゼ誘導活性は、それ以降のすべての日齢において現 れた。コリン作動性誘導活性が抽出蛋白質１ｍｇ当たりの検出されたコリンアセ チルトランスフェラーゼ活性として表されるとき、Ｐ５と成熟動物の内証の間の コリン作動性誘導の比活性の差異は２倍より小さいことが明らかになった。しか しながら、２０の内証から抽出した蛋白質の量は、最も若い動物と最も老いた動 物の間でほぼ１５倍変化した。このようにして、成長する開にコリンアセチルト ランスフェラーゼ誘導活性の絶対量は約３０倍に増加した。これらの結果は、コ リン作動性の分化活性が、神経分布の特性が変化する時点での成長している腺に 存在することを示している。これに加えて、Ｐ９．　ＰＩ３及びＰ２１ラットの 汗腺の抽出物ではＶＩＰの発現が増加し、チロシンヒドロキシラーゼのレベルが 減少し、並びにコリンアセチルトランスフェラーゼが増加することが認められた （データ記載なし）。

コリンアセチルトランスフェラーゼ誘導活性の予備的な特性決定を表ＩＶに要約 する。

（本頁以下余白） 表ＩＶ 温度安定性 一り０℃／−７０℃での保存　９０ 凍結−解凍　５０ 沸騰（１００℃・５分間）　０ プロテアーゼ処理 トリプシン　０ トリプシン＋インヒビター　２７ ヘバリンーアガロース　りロマトグラフィー通り抜は分　５５ 溶出液　８ セントリコン保持 １０ｋｄカツトオフ　９５ ５０ｋｄカツトオフ　５０ ＤＩＥＡＥクロマトグラフイー 通り抜は分　２ ０、２５Ｍ溶出液　５０ 汗腺の抽出物（１００μｇ／ｍｌ）のアリコートを下記のように若しくは実験的 方法に記載したようにインキュベートした。プロテアーゼ処理の影響を試験する ために、アリコートをトリプシン（１ｍｇ／ｍ１）若しくはトリブノンとトリプ シンインヒビター（３ｍｇ／ｍｌ）で１時間インキュベートした。セントリコン （Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）分離をするために、試料はりテンテート（ｒｅｔｅｎｔ ａｔｅ）の容積が２５ｍ１になるまでＳ　Ｓ　３４０−ターて遠心した。かかる リチンテートを１ｍｌに希釈し、再び遠心した。かかる遠心を３回繰り返し、通 り抜は分を集め濃縮した。培養物のコリンアセチルトランスフェラーゼ活性は、 処理済の抽出物を添加後７日目に決定した。１００％の数値は、未処理の抽出物 にさらした培養物に見られた活性を示し、０％は抽出物を添加しないで生育させ た培養物の活性を示している。

当該活性は、熱とトリプシンに対して不安定であり、１０ｋｄカツトオフのセン トリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）フィルターによって保持され、当該活性は蛋白 質のものであることを示していた。当該活性は部分的に３０ｋｄカツトオフのセ ントリコンフィルターによって保持され、低分子量の蛋白質がコリンアセチルト ランスフェラーゼの誘導の原因であることを示唆していた。かかるコリン作動性 誘導活性は、比較的安定である。すなわち、−２０℃で保存して、凍結と解凍を 繰り返してもほとんど活性は失われない。ヘパリン−アガロースカラムには活性 が全く結合されなかったので、汗腺のコリン作動性因子は、脳由来の５０ｋｄの 可溶性コリン作動性因子のようなヘパリン結合性蛋白（Ｋｅｓｓｌｅｒ　ｅｔ　 ａｔ、　、　１９８６．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ　ｔｌ、　Ａｃａ、ｄ、　Ｓｃｉ、 ＵｓＡ　８３．３５２８−３５３２）ではないらしい。はとんど全てのコリンア セチルトランスフェラーゼ誘導活性と蛋白質の３５％は、ＤＥＡＥカラムから０ ．２５Ｍ溶出液中に回収可能であり、かかる分化活性は酸性蛋白質であり、そし てこれを最初の精製工程として用い得ることを示している。当該０．２５Ｍ　Ｄ ＥＡＥ溶出液はコリンアセチルトランスフェラーゼ活性を誘導しただけてはなく 、ＶＩＰレベルを上昇させ、チロシンヒドロキシラーゼレベルを減少させた（デ ータ記載なし）。かくして、培養した交感神経ニューロンの神経伝達物質の特性 に対する、汗腺抽出物のいくつかの作用は容易に分離されない。

汗腺抽出物のコリン作動性誘導活性の一つの候補は、ＣＤＦ／ＬＩＦである。と いうのは、それか培養した交感神経の神経伝達物質特性に対して多くの同し作用 を有しているからである。ＣＤＦ／ＬＩＦのＮ末端ペプチド配列に対応する配列 の合成ペプチドに対して生成された抗血清は、心臓細胞の調整培地からの部分精 製ＤＥＡＥ画分から、コリン作動性誘導活性を免疫沈降することができる（Ｙａ ｍａｍｏｒｉ　ｅｔ　ａｌ、、１９８９，５ｃｉｅｎｃｅ　２４６．１４１２− １４１６　；　Ｒａｏ　ｅｔ　ａｌ、、１９９０．Ｄｅｖ。

Ｒｉｏｔ、　１３９．６５−７４）。かかる汗腺抽出物のＤＥＡＥ画分は、アフ ィニティ精製されたＣＤＦ／ＬＩＦ抗体で処理しても、コリンアセチルトランス フェラーゼ活性を誘導する当該抽出物の能力の検出可能な低下を示さなかった（ 図６ａ）。当該ＤＥＡＥ画分は、比較的精製度か低い故に、汗腺の抽出物中に存 在する阻害蛋白質若しくはプロテアーゼが活性物質を免疫沈降し得ない原因であ ると考えられた。しかしながら、比較実験では、汗腺の抽出物のＤＥＡＥ画分に 添加した同し抗体は、ヨウ素化した組み換えＣＤＦ／ＬＩＦ　（カルフォルニア 　インスティテユート　オン　テクノロジー（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ　Ｉｎ５ｔ ｉｔｕｔｅｏｆ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）のＴ、ヤマモリ（Ｙａｍａｍｏｒｉ） 博士からの寄贈である）をおよその２０ｋｄのバンドとして沈降させることがで きた（図６ｂ）。

かくして、汗腺抽出物中に存在する主要なコリン作動性誘導活性は、ＣＤＦ／Ｌ ＩＦではなさそうである。

（本頁以下余白） ６．１．８．　ＮＣＤＦはＣＮＴＦから区別される汗腺におけるコリン作動性誘 導活性物質の別の候補として考えられるのは毛様体神経栄養因子（ｃｉｌｉａｒ ｙ　ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ　ｆａｃｔｏｒ：ＣＮＴＦ）てあった。この可能 性を確かめるため、等量の座骨神経抽出物および汗腺抽出物からのコリン作動性 誘導活性物質を５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルに負荷して電気泳動を行い、組換えラット ＣＮＴＦに対して作成されたポリクローナル抗血清（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ　Ｐｈ ａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｔｓのＭａｒｋ　Ｆｕｒｔｈ博士より恵与された）をプ ローブとして用いた。この抗血清は組換えＣＮＴＦ　（図７ａ）および座骨神経 抽出物中に存在する２４ｋｄのバンド（図７ｂ）を認識した。抗体を組換えＣＮ ＴＦ　１０μｍとブレインキュベーションすることによって結合は完全に阻害さ れた。汗腺抽出物と座骨神経抽出物とを含むレーンは培養交感神経ニューロンの ためのコリン作動性活性物質を等量含んでいたにもかかわらず、有毛皮膚抽出物 または汗腺抽出物のいずれかを含むレーンでは何ら特異的なバンドが見られなか った（図１ｂも参照されたい）。コリン作動性誘導活性物質を１０倍多く負荷す るか、あるいはプロットを過剰染色しても汗腺抽出物を含むレーンには何ら特異 的な結合を検出することはできなかった。したがって、汗腺抽出物に存在するコ リン作動性誘導活性物質はＣＮＴＦと同じものではないと思ＣＮＴＦに対するメ ツセージを汗腺で検出できるか否か、およびＣＮＴＦ／ＣＮＴＦ一様分子を生産 することのできる細胞を同定するために、成体汗腺からのＲＮＡを調製し、ラッ トＣＮＴＦに対するプローブを用いるメツセージのためのノーザンプロットを行 った（図８）。ＣＮＴＦに対するメツセージの予測される大きさである１、３ｋ ｄのバンドが座骨神経に検出された。これとは対照的に、肝臓または汗腺からの ＲＮＡを含むレーンでは何ら特異的な結合が検出されなかった。

ＣＮＴＦ／ＣＮＴＦ一様分子を作ることのできる可能性のある細胞の型のより感 度の良い検定と（７てのｉｎ　５ｉｔｚ　ハイブリダイゼーションによって、座 骨神経および汗腺の切片を試験するために、同じプローブが用いられた。センス のコントロールとは対照的に、座骨神経中のシュワン細胞はアンチセンスプロー ブと特異的なハイブリダイゼーションシグナルをを示した（図９）。

しかしながら、汗腺組織には何ら特異的なシグナルが検出されなかった（図１０ ）。

６．１．１０．　陰イオン交換クロマトグラフィー０．２５Ｍ　ＤＥＡＥ溶出液 はＣｈＡＴおよびＶＩＰ誘導活性、並びにチロシンヒドロキシラーゼ低下活性を 有していた。はとんとすべての活性と３５％のタンパク質がＤＥＡＥカラムの０ ．２５　Ｍ溶出液中に回収され、これはこの溶出液を最初の精製工程として用い うろことを示唆している（図Ｉｆ）。

６、　１．　Ｉｌ、等電点 ＤＥＡＥ溶出液をＭＯＮＯＰカラムのクロマトグラフィーに付し、０．５ｍｌず つ画分を回収し、コリン作動性活性を検定した。図１２は、ＣｈＡＴ活性がｐＨ ４，８から５．２の間で溶出され、ｐＨ５，０に活性ピークがあることを示して おり、活性タンパク質のｐＩがこの範囲にあることを示唆している。この値は座 骨神経抽出物から精製されたＣＮＴＦで報告された値と似ており、強塩基性タン パク質であるＬＩＦの値とは異なる。

６、　１．　１２．　サイズ分画 コリン作動性誘導活性物質の分子量を測定するために、部分精製画分をサイズ分 画カラムのクロマトグラフィーに付した。各画分の交感神経ニューロン培養物に 対する活性を試験した。はとんとすべての活性は１６ｋｄと３２ｋｄのタンパク 質マーカーの間のピークに溶出され、これはＮＣＤＦが低分子量のタンパク質で あることを示唆する。

ＮＣＤＦの分子量をより正確に測定するために、クロマトフオーカシングカラム で精製した汗腺抽出物の両分（図１２）をＳＤ電気溶離器て溶離した。抽出した タンパク質のアリコートをとって活性を試験した（図１３）。活性体は２２−２ ６ｋｄの分子量をもっていた（図１３）。

コリン作動性誘導活性をもつ同じ画分を用いてチロシンヒドロキンラーゼレベル の調節能を試験した。同じ５ＤＳ−ＰＡＧＥ溶離画分がチロシンヒドロキシラー ゼ低下活性を有していた。

６．２．　議論 汗腺組織の低塩抽出物を調製し、これらの抽出物が培養交感神経ニューロンの神 経伝達物質の表現型を修飾しうるか否かを試験した。汗腺抽出物はコリンアセチ ルトランスフェラーゼ活性およびＶＩＰ一様免疫反応性のレベルを用量依存的に 増強したが、肝臓、有毛皮膚、または耳下腺からの抽出物はこれらのレベルを増 強しなかった。コリンアセチルトランスフェラーゼ活性のレベルは培養ニューロ ン中で増加するので、これに付随してカテコールアミン含量とチロシンヒドロキ シラーゼが減少する。したがって、汗腺からの可溶性タンパク質の抽出物が、ｉ ｎ　ｖｉｖｏにおける発生中の汗腺の神経分布を特徴付け、また交差神経支配実 験で腺によって誘導されるような培養交感神経ニューロンにおける多くの変化を 引き起こす。

汗腺を神経支配する繊維がノルアドレナリン作動性からコリン作動性に変化する ときに、神経伝達物質の性質を変える能力がＰ５からＰ２１の間の動物の汗腺抽 出物中に存在する（Ｌａｎｄｉｓ　ａｎｄＫｅｅｆｅ、　１９８３．　Ｄｅｖ、 　Ｂｉｏｌ、　９８．３４９−３７２；　Ｌｅｂｌａｎｃ　ａｎｄ　Ｌａｎｄｔ ｓ。

＋９８６．　Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　６．２６０−２６５；　Ｌａｎｄｉｓ 　ｅｔ　ａｌ、、　１９８８．　Ｄｅｖ、　Ｂｉｏｌ、　１２６．１２９−１４ ０）　、　Ｐ　５動物からの抽出物はコリンアセチルトランスフェラーゼ活性を 増加し、Ｐ９からＰ２１の間の動物からの腺抽出物を試験したところ、これらは 試験した３つの伝達物質の性質のすべてを変化させた。すなわち、コリンアセチ ルトラ〉スフエラーゼおよびＶＩＰ一様免疫反応性を増加し、またチロノンヒド ロキシラーゼを減少させた。さらに、培養物中ての処理の２日後にコリンアセチ ルトランスフェラーゼ活性の上昇レベルが検出てきるので、この抽出物はｉｎ　 ｖｉｖｏ研究と一致する経時的変化を誘導できる。より正確な時間的相関関係を 確立することは困難である。というのは、ｉｎ　５ｉｔｕにおける汗腺の末端叢 の神経伝達物質の性質において観察される変化は、多分多分、標的により誘導さ れるシグナルの逆行性輸送、伝達物質合成酵素およびタンパク質の発現の変更、 ならびにこれらの分子の末端への順行性輸送を反映しているからである。

成熟動物ならびに発達中の動物の汗腺にはＮＣＤＦ活性が含まれる。

ｉｎ　ｖｉｔｒｏで観察された生物活性のレベルをｉｎ　ｖｉＶＯての活性と比 較することは困難であるが、汗腺がスイッチを仲介するのに十分なコリン作動性 誘導活性を含むのか否かを評価することは興味あることである。逆行的追跡研究 の結果は、少なくとも２００個のニューロンが６個の内針（手掌）で神経分布し ているこ°とを示唆する（Ｓｉｅｇｅｌ　ａｎｄ　Ｌａｎｄｉｓ、未発表データ ）。我々の実験では、２１日齢の動物から肉Ｉｎ　（足裏）の組織１ｇ当たり約 １０ｍｇ、または当該肉ｆ［１，ｉ個当たり約８０μｇの可溶性タンパク質を得 た。コリンアセチルトランスフェラーゼ活性は、数十個のニューロンを含む培養 物中で１０μｇ／ｍｌという低濃度で誘導されるので、これには十分な量のコリ ン作動性誘導活性物質が含まれていると思われた。汗腺抽出物中に存在するコリ ン作動性誘導活性物質の濃度はを髄中の同濃度よりも太きく　（Ｗｏｎｇ　ａｎ ｄ　Ｋｅｓｓｌｅｒ、　１９８７．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ ｃｉ、　ＵＳＡ　８４．８７２６−８７２９；　Ａｄｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　 １９８９．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８６． １０５９−１０８３）、少なくとも座骨神経抽出物中の同濃度と同じ位高い（Ｓ ｅｎｄｔｎｅｒ　ｅｔ　ａｔ、、　１９８９．　Ｓａｃ、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、 　Ａｂｓ、　１５．７１０；　Ｒａｏ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９０．　Ｄｅｖ、 　Ｂｉｏｌ、　１３９．６５−７４）。

ＣＤ　Ｆ／　Ｌ　Ｉ　Ｆ　（Ｆｕｋａｄａ、　１９８５．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ ｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８２、８７９５−８７９９；　Ｙａｍａｍ ｏｒｉ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９．５ｃｉｅｎｃｅ　２４６．１４１２−１４ １６；　Ｎａｗａ　ａｎｄ　Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ、　１９９０．　Ｎｅｕｒｏｒ ＋　４．２６９−２７７）およびＣＮＴＦ　（Ｓｅｎｄｔｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、 、１９８９゜Ｓａｃ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、Ａｂｓ、１５．　１７０；　Ｅｒｎｓ ｂｅｒｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、１９８９．　Ｎｅｕｒｏｎ　２．　１２７５−１ ２８４）はコリン作動性機能を誘導し、カテコールアミン作動性機能を低下させ 、かつ交感神経ニューロンの培養物におけるＶＩＰ発現を増加させるので、１つ の分子がこれらの性質すべての変化に効果を及ぼし得ることは明らかである。本 研究からの２つの観察は、抽出物中の１つの分子に原因があるという考えと一致 する。種々の日齢の動物から調製した抽出物は検定した複数の性質に影響を与え 、さらに重要なことには、幾つかの影響は我々が実施した予備的特徴の中のはっ きりした活性に帰着させることができないことである。

かくして、１つの分子の可能性が強いのだが、それでも幾つかの因子が関与する 可能性も全く否定できる訳ではない。

汗腺抽出物中の活性物質の性質を、培養交感神経ニューロン中のコリン作動性機 能を誘導すると過去に記載された幾つかの因子と比較してみることは興味深い。

汗腺抽出物中に存在するコリン作動性誘導活性物質は低塩溶液中で容易に抽出さ れ、また検出てきる活性物質は何ら膜と結合していない（未発表データ）ので、 培養交感神経ニューロンのコリンアセチルトランスフェラーゼを誘導しくＷｏｎ ｇ　ａｎｄ　Ｋｅｓｓｌｅｒ、　１９８７．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ ｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８４、８７２６−８７２９；　Ａｄｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ 、、　＋９８９．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｉ。

ＵＳＡ　８６．　１０５９−１０８３）　、チロシンヒドロキシラーゼのレベル を低下させる（Ｒａｏ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９０．　Ｄｅｖ、　Ｂｉｏｌ、　 １３９．６５−７４；　Ｌｅｅ　ｅｔａｔ、、　１９９０．　ＥＸｐ、　Ｎｅｕ ｒ、　１０８．１０９−１１３）膜結合の因子とは関係がないように思われる。

さらに、コリンアセチルトランスフェラーゼ活性を誘導する経時的な変化に差が ある。すなわち、汗腺抽出物で処理した培養物は２日後にわずかな活性の増加を 示すが、一方膜関連のコリン作動性誘導活性物質で処理した培養物は２日後には 高レベルの活性を示す（Ａｄｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９．　Ｐｒｏｃ、 　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８６．１０８００８３）　、　２　つの可溶性 因子であるＣＤＦ／ＬＩＦおよびＣＮＴＦは交感神経ニューロンに対する影響が 似ている。すなわち、いずれもコリンアセチルトランスフェラーゼとＶＩＰの発 現を高め、チロシンヒドロキシラーゼとカテコールアミンの量を低下させる（Ｆ ｕｋａｄａ、　１９８５．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　 ＵＳＡ　８２．８７９５−８７９９；　Ｙａｍａｍｏｒｉ　ｅｔ　ａｌ、、　１ ９８９．５ｃｉｅｎｃｅ　２４６゜１４１２−１４１６：　５ｅｎｄｔｎｅｒ　 ｅｔ　ａｌ、、　１９８９．　Ｓｏｃ、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　Ａｂｓ、　１５ ゜７１０：　Ｅｒｎｓｔｂｅｒｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９．　Ｎｅｕｒ ｏｎ　２．１２７５−１２８４；　Ｎａｗａ　ａｎｄ　ｐａｔｔｅｒｓｏｎ、　 １９９０．　Ｎｅｕｒｏｎ　４．２６９−２７７）　６さらに、汗腺抽出物と同 様に、ＣＤ　Ｆ　／　Ｌ　Ｉ　Ｆ　（Ｎａｗａ　ａｎｄ　Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ、 　１９９０．　Ｎｅｕｒｏｎ　４．２６９−２７７）およびＣＮＴＦを含む座骨 神経抽出物（未発表データ）のいずれもＮＰＹ発現を低下させる。

ＣＤ　Ｆ　／　Ｌ　Ｉ　Ｆは魅力的な候補である。すなわち、ＣＤＦ／ＬＴＦは コンセンサスなシグナル配列をもっており、グリコジル化されており、また心臓 細胞によって分泌される（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ　ａｎｄＣｈｕｎ、１９７７、　 Ｄｅｖ、　Ｂｉｏｌ、　５６．２６３−２８０；　Ｙａｍａｍｏｒｉ　ｅｔ　ａ ｌ、、１９８９゜５ｃｉｅｎｃｅ　２４６．１４１２−１４１６）　Ｑ　しかし ながら、汗腺中のコリン作動性誘導活性物質とは異なり、ＣＤＦ／Ｌ　Ｉ　Ｆは ＤＥＡＥカラムに結合しない（Ｆｕｋａｄａ、　ｔ９８５．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ ｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８２゜８７９５−８７９９）。さらに は、ＣＤＦ／ＬＩＦのＮ末端領域に対するアフィニティで精製した抗体は、心臓 細胞調整培地のＤＥＡＥまたはセファデックス画分からのコリン作動性誘導活性 物質を免疫沈降できる（Ｙａｍａｍｏｒ、ｉ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９．５ｃ ｉｅｎｃｅ　２４６．１４１２−１４１６；Ｒａｏ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９０ ．　Ｄｅｖ、　Ｂｉｏｌ、　１３９．６５−７４）が、これらの抗体は汗腺抽出 物からのコリン作動性誘導活性物質を免疫沈降しない。かくして、抽出物中の主 要なコリン作動性因子はＣＤＦ／ＬＩＦと同一ではないと思われる。

ＣＮＴＦもまた有力な候補である。ＣＮＴＦは酸性タンパク質であって、０．２ ５Ｍ　ＮａＣ１によってＤＥＡＥカラムから溶離され（Ｍａｎｔｈｏｒｐｅ　ｅ ｔ　ａｌ、、１９８０．　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、３４．６９−７５；　Ｍａｎｔ ｈｏｒｐｅ　ｅｆ　ａｌ、、　１９８６．８ｒａｉｎ　Ｒｅｓ、　３６７、２８ ２−２８６；　Ｂａｒｂｉｎ　ｅｔ　ａｌ。

、　１９８４．　Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ　４３．１４６８−１４７８）　、 汗腺抽出物中に存在するコリン作動性誘導活性物質とよく似ている。しかしなが ら、汗腺と座骨神経の２つの組織は似たようなレベルのコリン作動性誘導活性を 含んでいるではいるにもかかわらず、汗腺を含む成熟無毛皮膚のノーザンプロッ ト分析ではＣＮＴＦに対する検出可能なメツセージを示すことができなかったの に対し、座骨神経中には多くのメツセージが存在していた（Ｓｔｏｃｋｌｉ　ｅ ｔ　ａｌ、、　１９８９．　Ｎａｔｕｒｅ　３４２．９２０−９２３；　５ｅｎ ｄｔｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９．　Ｓｏｃ、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　Ａ ｂｓ、　１５．１７０）。さらに、組換えＣＮＴＦに対して作成され、これを認 識するポリクローナル抗血清を用いた免疫プロット実験では、汗腺抽出物中にＣ ＮＴＦ一様免疫活性物質を何ら検出てきなか−）た。そのうえ、ラットＣＮ　Ｔ 　Ｆプローブを用いたノーザンブロノトおよびｉｎ　５ｉｔｕハイブリダイゼー シヨンアツセイでも汗陳からの試料中に何ら特定のハイブリダイゼーションを観 察することができなかった。ＣＮＴＦが細胞質ゾルタンパク質であるらしいとい う事実（Ｓｔｏｃｋｌｉ　ｅ（ａｌ、、　１９８９．　Ｎａｔｕｒｅ　３４２． ９２０−９２３；　Ｌｉｎ　ｅｔ　ａｔ、、　１９８９．５ｃｉｅｎｃｅ　２４ ６．１０２３−１０２５）　、そして一方汗腺分化分子の候補である物質は神経 分布に影響を及はすために分泌されるよってあるという事実とを考え合わせると 、これらのデータはＣＮＴＦが汗腺由来のコリン作動性因子の候補であるとは考 えにくいことを示唆する。

要約すると我々は、コリン作動性交感神経標的組織である汗腺が、ｉｎ　ｖｉｖ ｏの交感神経ニューロン上の標的の影響を培養において模倣するコリン作動性分 化活性物質を含むことを示して来た。予備的精製および分析によると、汗腺抽出 物中に存在するコリン作動性誘導活性物質はＣＤＦ／ＬＩ　ＦやＣＮＴＦと同じ ものではなく、新規な因子であることを示唆する。かくして、汗腺抽出物中に存 在するコリン作動性誘導活性物質は、汗腺に分布する神経であるコリン作動性交 感神経ニューロンにおいて標的−誘導化表現型の変化を仲介する格好の候補であ る。

細胞培養試薬はＧＩＢＣＯ（Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、ＮＹ）から、培養プレ ートはＣｏｒｎｉｎｇ　（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）から購入した。セントリコン フィルターはＡｍ１ｃｏｎ（Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）から購入した。［３Ｈコー アセチルーＣｏＡおよびポルトン・ハンター試薬はＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎ ｕｃｌｅａｒ　（Ｗｉ　Ｉｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）から購入した。ディスパーゼ はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉ、ＩＮ） から、コラゲナーゼはＷｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ　（ Ｆｒｅｅｈｏｌｄ、ＮＪ）から購入した。ＶＩＰラジオイムノアッセイキットは Ｉｎｃｓｔａｒ　（Ｓｔ　ｉ　Ｉ　Ｉｗａｔｅｒ、ＭＮ）から、ＮＰＹラジオイ ムノアッセイ試薬はＡｍｅｒｓｈａｍから購入した。ＮＧＦ（Ｃａｓｅ　Ｗｅｓ ｔｅｒｎ　Ｒｅ５ｅｒｖｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙのに、Ｎｅａｔ博士からの恵 与）は、オスマウスの下顎腺からＢＯｃｃｈｉｎｉおよびＡ　ｎ　ｇ　ｅ　ｌ　 ｅ　ｔ　ｔ　ｉ　（１９６９，Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、 　ＵＳＡ　６４．７８７−７９４）が記載する方法によって調製した。

Ｐｉｅｒｃｅタンパク質アッセイキットはＰｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋ　ｆ　ｏ　ｒ 　ｄ、Ｉ　Ｌ）から購入した。ＩＴｓ　ＰｒｏｍｉｘはＣ０１１ａｂｏｒａｔｉ ｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ（Ｂｅｄｆｏｒｄ。

ＭＡ　’）から、５ＤＳ−ＰＡＧＥ用試薬はＢｉｏ−Ｒａｄ　（Ｒｉｃｈｍｏｎ ｄ、ＣＡ）から購入した。アビジン結合アルカリホスファターゼはＣａｐｐｅｌ 　（Ｗｅｓｔｃｈｅｓｔｅｒ、ＰＡ）から、ヤギ抗−マウスおよび抗−ウサギ第 ２抗体はＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｓ　（Ｗｅｓｔｇｒｏｖｅ 、　ＰＡ）から購入した。その他の化学試薬はＳｉｇｍａ　（Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ 、ＭＯ）から購入した。

６．３．２．　細胞培養 ラット交感神経ニューロンの培養はｌ（ａ　ｗ　ｒ　ｏ　ｔおよびＰａｔｔ　ｅ 　ｒ　ｓ　ｏ　ｎ　（＋９７９．　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｔｈｏｌ、　５８． ５７４−５８３）の記載する方法で調製した。新生ラットの上顎神経節からのニ ューロンをディスパーゼ（５ｍｇ／ｍｌ）とコラゲナーゼ（１ｍ　ｇ　／　ｍ　 ｌ　）で酵素的に解離し、ポリリシン（ｏ、１ｍｇ／ｍｌ）およびラミニン（１ ０μｇ／１５ｍ１）で順にコーティングした９６ウエルのプレートに接種した。

特に記載しない限りｌウェル当たり約２０００−３０００個（’）：−ユ　Ｏン を接種した。ＮＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ペニシリン１００Ｕ、ストレプトマ イシン１００μｇ、シトシンアラビノサイドｌＯμＭ、および５％ラット血清を 含むレイボビッツの（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ’　５）Ｌｉ２−ＣＯ２培地中てニュ ーロンを成長させ、培地は３日または４日毎に交換した。いくつかの実験では、 トランスフェリン、セレン、ウシ血清アルブミン、インシュリンおよび脂肪酸を 補充したＬｉ２−Ｃ０２中、ラット血清を含まずに細胞を成長させた。組織抽出 物は成長培地中に希釈し、０．　２μｍのフィルターを通すことにより滅菌し、 培養３日目からニューロンに加えた。培養９日から１４日の間にニューロンを回 収して検定を行った。

６、　３．　３．　組織抽出物 汗腺抽出物を調製するには、種々の生後日数と重さのラットから内針（足裏）を 抽出した。一般には２０匹の動物からの組織を一度に処理した。２０匹のラット からの内針μ（足裏）の重さは動物の年齢により０．５から５グラムであった。

組織をＰｏ１ｙｔ　ｒｏｎを含む１０ｍＭリン酸バッフｙ−（ｐＨ７，０）１０ 容量中で５秒間ホモジナイズした。次いて抽出物を１００，０００ｘｇて１時間 遠心した。上清を回収して０．２μｍのフィルターで濾過し、１０ｋｄカツトオ フのセントリコンフィルターを用いて濃縮した。タンパク質濃度はＰｉｅｒｃｅ タンパク質アッセイキットで測定した。肝臓、座骨神経および耳下腺の抽出物も 同様にして調製した。有毛抽出物を調製するには、胸部の皮膚を刺毛し、その下 にある皮部から切り離し、重量を測定した。次いでホモジェナイズして、上記の ように処理する前に皮膚を小片に切った。

６．３．４．　アッセイ コリン作動性機能の誘導は本質的にはＦｏｎｎｕｍの方法（１９６９、Ｂｉｏｃ ｈｅｍ、　Ｊ、　１１５．４６５−４７２）によりホモジエネート中ノコリンア セチルトランスフェラーゼの活性を検定することにより測定した。検定の感度を 増すために、インキュベーションは１時間行った。すべての活性はコリンアセチ ルトランスフェラーゼ活性の特異的阻害剤であるナフチルビニルピリジン５００ μＭによって阻害可能であった。タンパク質濃度はウシ血清アルブミンを標準に 用いてＬ　ＯＷｒ　ｙの方法により検定した。

カテコールアミン含量は、５μｍ孔サイズの逆相Ｃ−１８カラム（Ａｌｔｅｘ　 Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒａ−ＩＰ；Ｂｅｃｋｍａｎ、Ｂｅｒｋｌｅｙ、ＣＡ）上で の高速液体クロマトグラフィー（Ｒｉｔｔｅｎｈｏｕｓｅ　ｅｔ　ａｌ、、　＋ ９８８．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　２５．２０７−２１５）により比色検出器（５ １００Ａ、ＥＳＡ、Ｂｅｄ　ｆｏ　ｒｄ、ＭＡ）を用いて検定した。基準電極に 比べて＋０．３６、＋０．０３および−０，３８〜′の３つの電極をセットした 。既知の希釈度の標準試料（５ｐｍｏｌ）を同時に測定して濃度を推定した。ウ ェルの全カテコールアミン濃度はノルエピネフリン、ドーパミンおよび各抽出物 中に存在する代謝物であるＤＯＰＡＣのレベルを合計してめた。エピネフリンも ＤＯＰＡも検出されなかった。

培養ニューロン中に存在するチロシンヒドロキシラーゼの量はイムノプロントの 半定量的分析により決定した。細胞培養物は試料緩衝液（２％ＳＤＳ、１０％グ リセロール、０．００４％ブロモフェノールブルーおよび３％β−メルカプトエ タノールを含む５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　（ｐＨ６，８））中にホモジェナイズし、 抽出物アリコートを１０％５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルにかけて、タンパク質をニトロ セルロースにプロットした。ニトロセルロースプロットを阻害バッファー（Ｔｒ ｉｓ緩衝化食塩水（ｐＨ７，２）中の５％脱脂ミルク）中でブロックし、次いで チロシンヒドロキシラーゼに対するモノクローナル抗体（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ 　。

ｆ　Ａｌｂｅｒｔａ、ＥｄｍｏｎｔｏｎのＡｎｎ　Ａｃｈｅｓ。

ｎ博士からの恵与）とともに−夜インキユベートした。次にプロットをビオチン 化第２抗体およびアルカリホスファターゼに結合したアビジンと一緒に順次イン キュベートした。反応産物を１０ｍＭ重炭酸バッファー（ｐＨ９，５）中のニト ロブルーテトラゾリウムおよびリン酸５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル で発色させた。最適の発色が得られた後、蒸留水でリンスすることにより反応を 停止した。プロットを乾燥し、発色強度をスキャニングレーザー型濃度計（Ｓｈ ｉｍａｄｚｕ）で読んだ。平行したレーンに展開し同様に処理したサンプルで比 較を行った。

神経ペプチドのレベルはラジオイムノアッセイによって測定した。培養物をＰＢ Ｓで１度リンスして、次いで２Ｍ酢酸１００μｌ中でホモジナイズした。５分間 煮沸した後、サンプルをエツペンドルフミクロ遠心管に入れて遠心した。上清を 減圧下に乾燥して、次のアッセイに用いるまで一７０℃で保存した。他のタンパ ク質と最小の交差反応をすることがあらかじめ確かめた第１抗体をもつキットを ｌＮＣ３ＴＡＲから購入してＶＩＰアッセイに用いた。ラジオイムノアッセイに よってＮＰＹをアッセイするために、抗体、標準試料並びに標識トレーサーをＡ ｍｅｒｓｈａ、ｍから購入し、ペプチド金型は遅延型トレーサー法によって測定 した。抗体はラットＮＰＹと６４％の交差反応を示しただけてあったので、標準 試＄４をラットＮＰＹ（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ　Ｌａｂ。

ｒａｔｏｒｉｅｓ）と−緒に展開し、サンプルの値を標準曲線から読み取った。

６．３，５．　ＤＥＡＥクロマトグラフィー可溶性抽出物アリコートを１０ｍＭ リン酸バッファー（＋）　ｔ（７，０）で５倍に希釈し、０．９ｘｌＯｃｍのＤ ＥＡＥカラム（Ｗｈａｔｍａｎ／Ｂｉｏｐｒｏｂｅ）に、ｔｏｍｌ／時間の流速 でかけた。カラムを等量のリン酸緩衝液で洗浄した。洗液と通り抜は分を集めて 、１Ｏｋｄカツトオフのセントリコンフィルターで濃縮した。結合タンパク質を ０．２５Ｍ　ＮａＣｌ　１０ｍ１で溶離し、同様に濃縮した。

６．３．６．　ヘパリンＡクロマトグラフィー可溶性タンパク質アリコートを緩 衝液（１０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ　（ｐＨ７，２））で希釈してヘ パリン−アガロースカラムにかけた。結合タンパク質を５ＭＮａＣｌで溶離した 。カラム結合効率を″′Ｉ−標識塩基性繊維芽細胞成長因子（Ｃａｓｅ　Ｗｅｓ ｔｅｒｎ　Ｒｅ５ｅｒｖｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの、Ｊ、Ｕｎｎｅｒｓｔａｌ 　Ｉ博士からの恵与）を用いて試験した。

６．３．７．　ＣＤＦ／’ｉ、ＩＦ抗体との免疫沈降試験各種因子の生物活性を 試験する免疫沈降試験を行うには、細胞培養検定を行うのに十分な量の組織抽出 物を緩衝液（２％ウン血清アルブミン、０．　２％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、 および０゜０２％ＰＥＧ　６０００を含むＰＢＳ　（ｐＨ７，３））に加えた、 ＣＤＦＯＮ末領域に対応する合成ベプヂドに対するアフィニティ精製した抗体（ Ｒａｏ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９０．　Ｄｅｖ、　Ｂｉｏｌ、　１９９．６５− ７４）を各バイアルに加えて最終濃度をＩＯμＭとした。−夜インキユベートし た後、抗原−抗体複合体をプロティンＡ−セファロース１０μｍに、室温でさら に２時間かけて吸着させた。結合した複合体を遠心により分離し、上清をＬ１５ ＣＯｚ培地中に希釈して細胞培養アッセイに用いた。吸着の結果の活性ロスが抗 体の特異的効果によるものであることを確認するために２つの対照実験を実施し た。抽出物アリコートを抗体を加えずにインキュベートして上記と同様に処理し 、また別のアリコートは、もともと抗原として用いた合成ペプチド５０μＭをあ らかじめ吸着させておいた抗体で処理した。

さらに別の実験では、ＣＤＦ／ＬＩＦ　（ＣａｌｉｆｏｒｎｉａＩｎｓｔｉｔｕ ｔｅ　ｏｆ　ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙのＹ　ａ　ｍ　ａｍｏｒｉ博士からの恵与） を前述した方法によりポルトン・ハンター試薬でヨウ素化した。約２０．ＯＯＯ ｃｐｍをバッファーまたは等量の汗腺抽出物のＤＥＡＥ画分に加えて、前述した ようにＮ末抗体で免疫沈降した。免疫沈降したカウントを抽出し、５ＤＳ−ＰＡ ＧＥで分析した。

６．３．８．　ＣＮＴＦ抗血清によるウェスタンプロット試験抽出物アリコート （６０Ｍｇ／レーン）を１５％５ＤＳ−ＰＡＧＥミニゲル（Ｂｉｏｒａｄ）にか けて、タンパク質を二Ｆロセルロースにプロットした。ニトロセルロースプロッ トを阻害バッファー（Ｔｒｉｓ緩衝化食塩水（ｐＨ７，２）中の５％脱脂ミルク ）中でブロックし、次いで組換えラットＣＮＴＦに対するポリクローナル抗血清 （１：１０００希釈；Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ　１ｃａｌｓ のＤｏｎｎａ　Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ博士からの恵与）と−緒に、あるいはｌＯμ Ｍ　ＣＮＴＦ　（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）とと もにあらかじめインキュベートした抗体と一緒に２時間インキュベートした。次 いてプロットをビオチン化第２抗体と１時間、アビジン結合アルカリホスファタ ーゼと３０分間順次インキュベートした。結合酵素を、１０ｍＭ重炭酸バッファ ーｐＨ９，５中のニトロブルーテトラゾリウムおよびリン酸５−ブロモ−４−ク ロロ−３−インドイルで検出した。最適の発色をさせた後、蒸留水でリンスする ことにより反応を停止した。

ノーザンブロットハイブリダイゼーションを行うために、１段階グアニジン−イ ソチオシアネート法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ　ａｎｄ　５ａｃｃｈｉ、　１９ ８７．　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１６２．１５６−１５９） を用いて肝臓、汗腺および座骨神経から全ＲＮＡを調製した。ル−ン当たり全Ｒ ＮＡ３０ｔｔｇを負荷して、Ｇｅｎｅｓｃｒｅｅｎのナイロン膜に移し取った。

１２Ｐで放射性標識したラットＣＮＴＦに対する４５塩基対のオリゴヌクレオチ ドプローブ（領域９９−１４４）でプロントをプローブした。次いてプロットを 洗浄し、オートラジオグラフィーて測定した。

（α−”Ｓｌ　ｄＡＴＰて標識した以外はノーサンプロット試験て用いたのと同 しプローブを用いて上記したｉｎ　５ｉｔｕハイブリダイゼーシヨン試験（Ｓｉ ｅｇｅｌ、　１９８９．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｎｅｕｒｏｓｅｉｅｎｃｅ、 　Ｏｎｎ　Ｐ、Ｍ、編集、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｉ、　１３６−１ ５０）を行った。

簡単に言うと、新たに冷凍した組織切片を４％ホルムアルデヒド中で１０分間固 定し、ＰＢＳスライド中で２回洗浄し、風乾してハイブリダイゼーション試験に 用いた。ハイブリダイゼーションはＩＯ“ｃｐｍ／ｍｌのプローブを用いて湿潤 容器中、４２℃で１５時間実施した。切片をＫｏｄａｋ　ＮＴＢ−３乳剤に浸し て６週間さらした。切片を現像し、固定してエチジウムプロミドで対比染色した 。

上記記載並びに添付の図面から、本明細書に示し、がっ記載したものに加えて多 くの修飾が可能であることが当業者には明らかであろう。かかる修飾は付属の請 求の範囲内に含まれる。

多くの参考文献を引用したが、その開示は参照によりその全体を本明細書に引用 するものとする。

（本頁以下余白） 輸田冊　ＢＩＩＩ／±嵜倉■↓■身○ 市是ｆＦ？５Ａ↓’ｖｑつ 全 汗腺抽出物　（μｇ／ｒｎｌ） ＦＩＧ、２Ａ 培養日数 ＦＩＧ、２Ｂ 汗腺抽出物　（岡／ｍ１） ＦＩＧ、　４Ａ 汗腺抽出物 ＦＩＧ、５ ３岨 ＦＪＧ、　６Ａ −！　嘴Ｆ Ｔ ａｂｃｄ ＦＩＧ、　８ ＦＩＧ、　９Ａ ＦＩＧ、　９８ ＦＩＧ、　９Ｃ ＦＩＧ、　１０Ａ ＦＩＧ、　１０８ ＦＩＧ、　ＩＯＣ 画分番号 ＦＩＧ、１１ 両分番号 ＦＩＧ、１２ フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ 、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ ）、ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　Ｃ３，ＦＩ、　ＨＵ、ＪＰ。

ＫＲ，ＬＫ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　Ｎｏ、　ＰＬ、　ＲＯ，ＳＤ、５Ｕ （７２）発明者　ランデイス、ストーリー　シー。

アメリカ合衆国　４４１２２　オハイオ州　シエイカー　ハイツ、ニス、ウッド ランド１８、７００

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．次の特性： （ａ）哺乳動物の汗腺の抽出物から単離できること；（ｂ）熱およびトリプシン 不安定性； （ｃ）ヘパリンアガロースアフィニティーカラムヘの実質的な結合性の欠如； （ｄ）約４．８−５．２の範囲の等電点；（ｅ）非膜細胞性局在化； （ｆ）ｉｎ　ｖｉｔｒｏで交感神経系ニューロンによるコリンアセチルトランス フェラーゼの発現を増加させる能力；および（ｇ）１６−３２キロダルトンの範 囲のおよその分子量；を有することを特徴とする実質的に精製されたタンパク質 。 ２．ｉｎ　ｖｉｔｒｏで交感神経系ニューロンによるチロシンヒドロキシラーゼ の発現を低下させる能力を有することをさらに特徴とする、請求項１記載のタン パク質。 ３．Ｉｎ　ｖｉｔｒｏで交感神経系ニューロンによるバソアクティブ・インチス テイナル・ペプチドの発現を増加させる能力を有することをさらに特徴とする、 請求項１記載のタンパク質。 ４．ｉｎ　ｖｉｔｒｏで交感神経系ニューロンによる全カテコールアミン類の発 現を低下させる能力を有することをさらに特徴とする、請求項１記載のタンパク 質。 ５．ｉｎ　ｖｉｔｒｏで交感神経系ニューロンによる全カテコールアミン類の発 現を低下させる能力を有することをさらに特徴とする、請求項２記載のタンパク 質。 ６．汗腺が成体哺乳動物のものである、請求項１記載のタンパク質。 ７．汗腺がヒトのものである、請求項１記載のタンパク質。 ８．汗腺がラットのものである、請求項１記載のタンパク質。 ９．効果的な量の請求項１のタンパク質にニューロンをさらすことからなる、ニ ューロンにおいてコリン作動性活性を誘導する方法。 １０．効果的な量の請求項２のタンパク質にニューロンをさらすことからなる、 ニューロンにおいてコリン作動性活性を誘導する方法。 １１．効果的な量の請求項３のタンパク質にニューロンをさらすことからなる、 ニューロンにおいてコリン作動性活性を誘導する方法。 １２．効果的な重の請求項４のタンパク質にニューロンをさらすことからなる、 ニューロンにおいてコリン作動性活性を誘導する方法、１３．効果的な量の請求 項５のタンパク質にニューロンをさらすことからなる、ニューロンにおいてコリ ン作動性活性を誘導する方法。 １４．効果的な量の請求項６のタンパク質にニューロンをさらすことからなる、 ニューロンにおいてコリン作動性活性を誘導する方法。 １５．効果的な量の請求項７のタンパク質にニューロンをさらすことからなる、 ニューロンにおいてコリン作動性活性を誘導する方法。 １６．効果的な量の請求項８のタンパク質にニューロンをさらすことからなる、 ニューロンにおいてコリン作動性活性を誘導する方法。 １７．ｉｎ　ｖｉｔｒＯで交感神経系ニューロンによるチロシンヒドロキシラー ゼの発現を低下させる能力を有する、請求項１のタンパク質の類縁体、誘導体ま たはフラグメント。 １８．ｉｎｖｉｔｒｏで交感神経系ニューロンによるチロシンヒドロキシラーゼ の発現を低下させる能力を有する、請求項２のタンパク質の類縁体、誘導体また はフラグメント。 １９．ｉｎ　ｖｉｔｒｏで交感神経系ニューロンによるチロシンヒドロキシラー ゼの発現を低下させる能力を有する、請求項３のタンパク質の類縁体、誘導体ま たはフラグメント。 ２０．ｉｎ　ｖｉｔｒｏで交感神経系ニューロンによるチロシンヒドロキシラー ゼの発現を低下させる能力を有する、請求項４のタンパク質の類縁体、誘導体ま たはフラグメント。 ２１．ｉｎ　ｖｉｔｒｏで交感神経系ニューロンによるコリンアセチルトランス フェラーゼの発現を増加させる能力を有する、請求項１のタンパク質の類縁体、 誘導体またはフラグメント。 ２２．ｉｎ　ｖｉｔｒｏで交感神経系ニューロンによるコリンアセチルトランス フェラーゼの発現を増加させる能力を有する、請求項２のタンパク質の類縁体、 誘導体またはフラグメント。 ２３．ｉｎ　ｖｉｔｒｏで交感神経系ニューロンによるコリンアセチルトランス フェラーゼの発現を増加させる能力を有する、請求項３のタンパク質の類縁体、 誘導体またはフラグメント。 ２４．ｉｎ　ｖｉｔｒｏで交感神経系ニューロンによるコリンアセチルトランス フェラーゼの発現を増加させる能力を有する、請求項４のタンパク質の類縁体、 誘導体またはフラグメント。 ２５．ｉｎ　ｖｉｔｒｏで交感神経系ニューロンによるバソアクティブ・インチ ステイナル・ペプチドの発現を増加させる能力を有する、請求項１のタンパク質 の類縁体、誘導体またはフラグメント。 ２６．ｉｎ　ｖｉｔｒｏで交感神経系ニューロンによるバソアクティブ・インチ ステイナル・ペプチドの発現を増加させる能力を有する、請求項２のタンパク質 の類縁体、誘導体またはフラグメント。 ２７．ｉｎ　ｖｉｔｒｏで交感神経系ニューロンによるバソアクティブ・インチ ステイナル・ペプチドの発現を増加させる能力を有する、請求項３のタンパク質 の類縁体、誘導体またはフラグメント。 ２８．ｉｎｖｉｔｒｏで交感神経系ニューロンによるバソアクティブ・インチス テイナル・ペプチドの発現を増加させる能力を有する、請求項４のタンパク質の 類縁体、誘導体またはフラグメント。 ２９．ｉｎｖｉｔｒｏで交感神経系ニューロンによる全カテコールアミン類の発 現を低下させる能力を有する、請求項１のタンパク質の類縁体、誘導体またはフ ラグメント。 ３０．ｉｎ　ｖｉｎｒｏで交感神経系ニューロンによる全カテコールアミン類の 発現を低下させる能力を有する、請求項２のタンパク質の類縁体、誘導体または フラグメント。 ３１．ｉｎ　ｖｉｔｒｏで交感神経系ニューロンによる全カテコールアミン類の 発現を低下させる能力を有する、請求項３のタンパク質の類縁体、誘導体または フラグメント。 ３２．ｉｎ　ｖｉｔｒｏで交感神経系ニューロンによる全カテコールアミン類の 発現を低下させる能力を有する、請求項４のタンパク質の額縁体、誘導体または フラグメント。 ３３．請求項１のタンパク質と特異的に結合することができる抗体。 ３４．請求項２のタンパク質と特異的に結合することができる抗体。 ３５．請求項３のタンパク質と特異的に結合することができる抗体。 ３６．請求項４のタンパク質と特異的に結合することができる抗体。 ３７．請求項５のタンパク質と特異的に結合することができる抗体。 ３８．請求項６のタンパク質と特異的に結合することができる抗体。 ３９．請求項７のタンパク質と特異的に結合することができる抗体。