JP2561604B2 - 神経栄養性薬剤、神経成長因子および神経成長因子促進剤の検出方法 - Google Patents
神経栄養性薬剤、神経成長因子および神経成長因子促進剤の検出方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は神経栄養性因子の神経成長因子（NGF）とtrk
−がん原遺伝子タンパク質とからなる複合体に関する。
本発明はまた、NGFリガンドおよびtrk−がん原遺伝子受
容体タンパク質の存在を検出するための方法に関する。
−がん原遺伝子タンパク質とからなる複合体に関する。
本発明はまた、NGFリガンドおよびtrk−がん原遺伝子受
容体タンパク質の存在を検出するための方法に関する。
本発明はさらに、神経成長疾病および再生、例えばア
ルツハイマー病および神経芽腫の症状を診断および治療
する方法に関する。特に本発明の方法はリガンド受容体
対の検出を包含する。
ルツハイマー病および神経芽腫の症状を診断および治療
する方法に関する。特に本発明の方法はリガンド受容体
対の検出を包含する。
さらに、本発明はtrkおよびNGFに対する構造的および
機能的関連性に基づいた神経栄養性因子受容体／リガン
ド複合体を検出する方法に関する。
機能的関連性に基づいた神経栄養性因子受容体／リガン
ド複合体を検出する方法に関する。
発明の背景 脊椎動物の神経系の発達は、初期胚に明らかに均質な
神経上皮から始まり、そして成人において多様で、非常
に秩序正しく、さらに相互連結された神経細胞型の形成
を導く一連の複雑な事象により特徴づけられる。ニュー
ロンの標的化、残存、および適当なシナプス配列に要求
される限定的な拡散性因子の存在を指摘する相当に記述
的および説明的な証拠が集められている（R.W.Oppenhei
m,Studies in Developmental Neurobiology（Cowan,W.
M.編）所収,Oxford University press,74-133頁,1981;
W.D.SniderおよびE.M.Johnson,Ann.Neurol.26:489-506
（1989））。機能的神経回路は発達の間のニューロンの
初期の過剰な産生から形作られる。胚中期において、プ
ログラムされた細胞死のプロセスはニューロン数の大部
分を除去し、標的組織の神経分布に必要な適当数のニュ
ーロンをあとに残す（V.HamburgerおよびR.Levi-Montal
cini,J.Exp.Zool.111:457-502（1949）;Y.-A.Barde,Neu
ron 2:1525-1535（1989））。
神経上皮から始まり、そして成人において多様で、非常
に秩序正しく、さらに相互連結された神経細胞型の形成
を導く一連の複雑な事象により特徴づけられる。ニュー
ロンの標的化、残存、および適当なシナプス配列に要求
される限定的な拡散性因子の存在を指摘する相当に記述
的および説明的な証拠が集められている（R.W.Oppenhei
m,Studies in Developmental Neurobiology（Cowan,W.
M.編）所収,Oxford University press,74-133頁,1981;
W.D.SniderおよびE.M.Johnson,Ann.Neurol.26:489-506
（1989））。機能的神経回路は発達の間のニューロンの
初期の過剰な産生から形作られる。胚中期において、プ
ログラムされた細胞死のプロセスはニューロン数の大部
分を除去し、標的組織の神経分布に必要な適当数のニュ
ーロンをあとに残す（V.HamburgerおよびR.Levi-Montal
cini,J.Exp.Zool.111:457-502（1949）;Y.-A.Barde,Neu
ron 2:1525-1535（1989））。
神経成長因子（NGF）の発見は神経栄養性のポリペプ
チド因子の存在に対する最初の直接的証拠を提示した
（R.Levi-MontalciniおよびV.Hamburger,J.Exp.Zool.11
6:321-362（1951）;R.Levi-MontalciniおよびP.U.Angel
etti,Physiol.Rev.48:534-569（1968））。これに続
き、その他の神経栄養性因子:BDNF,CTNFおよびNT-3が近
年に記載されている（W.D.SniderおよびE.M.Johnson,An
n.Neurol.26:489-506（1989）;G.Barbin等,J.Neuroche
m.43:1468-1478（1984）;P.C.Maisonpierre等,Science
247:1446-1451（1990）参照）。NGFにより試験管内およ
び生体内で引き出される生理学的帰結は数十年の間、神
経生物学の探究の中心であった。その結果、今では末梢
および中枢神経系においてNGFに応答する細胞型につい
てかなりの情報が利用可能である。
チド因子の存在に対する最初の直接的証拠を提示した
（R.Levi-MontalciniおよびV.Hamburger,J.Exp.Zool.11
6:321-362（1951）;R.Levi-MontalciniおよびP.U.Angel
etti,Physiol.Rev.48:534-569（1968））。これに続
き、その他の神経栄養性因子:BDNF,CTNFおよびNT-3が近
年に記載されている（W.D.SniderおよびE.M.Johnson,An
n.Neurol.26:489-506（1989）;G.Barbin等,J.Neuroche
m.43:1468-1478（1984）;P.C.Maisonpierre等,Science
247:1446-1451（1990）参照）。NGFにより試験管内およ
び生体内で引き出される生理学的帰結は数十年の間、神
経生物学の探究の中心であった。その結果、今では末梢
および中枢神経系においてNGFに応答する細胞型につい
てかなりの情報が利用可能である。
NGFは、交感神経および神経堤誘導感覚ニューロンの
標的化および残存ならびに脳内のコリン作用性ニューロ
ンの選択された数に対して役割を果たすことが知られて
いる（L.A.GreeneおよびE.M.Shooter,Annu.Rev.Neurosc
i.3:353-402（1980）;H.ThoenenおよびY.-A.Barde,Phys
iol.Rev.60:1284-1335（1980）;H.Gnahn等,Dev.Brain.R
es.9:45-52（1983））。前脳基部内のNGF依存コリン作
用性ニューロンはアルツハイマー病を引き起こす細胞の
集まりに該当すると考えられる（F.Hefti,Annals of Ne
urology 13:109-110（1983）;HeftiおよびWemer,1986;J
ohnsonおよびTanuchi,1987;P.J.Whitehouse等,Science
215:1237-1239（1982））。NGFがマウス胚神経管の末梢
に注射された生体内での研究は細胞死に通常標的化され
る感覚神経節の高められた残存を生じる（V.Hamburger
等,J.Neurosci.1:60-71（1981）;I.B.Black等,Growth F
actors and Development,Current Topics in Developme
ntal Biology,24巻（Nilsen-Hamilton編）所収,161-192
頁（1990））。
標的化および残存ならびに脳内のコリン作用性ニューロ
ンの選択された数に対して役割を果たすことが知られて
いる（L.A.GreeneおよびE.M.Shooter,Annu.Rev.Neurosc
i.3:353-402（1980）;H.ThoenenおよびY.-A.Barde,Phys
iol.Rev.60:1284-1335（1980）;H.Gnahn等,Dev.Brain.R
es.9:45-52（1983））。前脳基部内のNGF依存コリン作
用性ニューロンはアルツハイマー病を引き起こす細胞の
集まりに該当すると考えられる（F.Hefti,Annals of Ne
urology 13:109-110（1983）;HeftiおよびWemer,1986;J
ohnsonおよびTanuchi,1987;P.J.Whitehouse等,Science
215:1237-1239（1982））。NGFがマウス胚神経管の末梢
に注射された生体内での研究は細胞死に通常標的化され
る感覚神経節の高められた残存を生じる（V.Hamburger
等,J.Neurosci.1:60-71（1981）;I.B.Black等,Growth F
actors and Development,Current Topics in Developme
ntal Biology,24巻（Nilsen-Hamilton編）所収,161-192
頁（1990））。
胚のNGF抗体への暴露により、後根神経節ニューロン
の低下した残存を生じ、一方、NGF抗体の新生マウスへ
の注射は交感神経ニューロンの残存を阻害する主要な作
用を有する（R.Levi-MontalciniおよびB.Booker,Proc.N
atl.Acad.Sci.USA,46:373-384または384-391（1960）;
S.Cohen,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,46:302-311（1960）;
E.M.Johnson等,Science 210:916-918（1980））。
の低下した残存を生じ、一方、NGF抗体の新生マウスへ
の注射は交感神経ニューロンの残存を阻害する主要な作
用を有する（R.Levi-MontalciniおよびB.Booker,Proc.N
atl.Acad.Sci.USA,46:373-384または384-391（1960）;
S.Cohen,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,46:302-311（1960）;
E.M.Johnson等,Science 210:916-918（1980））。
試験管内では、神経由来のいくつかの腫瘍細胞系が神
経経路に沿った分化を行うことによりNGFの存在に応答
する。ラットクロム親和性細胞腫から誘導されるPC12細
胞はこれらの細胞系の最も特徴的なものであり、そして
NGF介在応答および神経分化に対する広く受容されたモ
デルを提示する（L.A.GreeneおよびA.S.Tischler,Proc.
Natl.Acad.Sci.USA,73:2424-2428（1976））。
経経路に沿った分化を行うことによりNGFの存在に応答
する。ラットクロム親和性細胞腫から誘導されるPC12細
胞はこれらの細胞系の最も特徴的なものであり、そして
NGF介在応答および神経分化に対する広く受容されたモ
デルを提示する（L.A.GreeneおよびA.S.Tischler,Proc.
Natl.Acad.Sci.USA,73:2424-2428（1976））。
細胞の外側でのNGFの生物学については多くのことが
わかっているけれども、NGFが細胞内で神経栄養性作用
を引き起こす機構は十分に解明されていない。NGFと細
胞受容体との相互作用は細胞内での神経栄養性信号の伝
達における必須の段階である（M.V.Chao,Handbook of E
xperimental Pharmacology,Vol.95/II Peptide Growth
Factors and Their Receptors II（Sporn,M.B.およびRo
berts,A.B.編）所収,Springer-Verlag,Heiderberg,135-
165頁（1990）参照）。細胞とのNGFの相互作用の理解に
おける主な前進はNGFを結合し、そしてNGF応答性細胞に
存在する75kDa受容体（75kNGF-R）の同定およびクロー
ニングであった。75kNGF-Rをコード化する遺伝子のクロ
ーンはいくつかの種から特徴づけられている（M.V.Chao
等,Science 232:418-421（1986）;M.J.Radeke等,Nature
325:593-597（1987））。残念なことに、75kNGF-Rの構
造的および生物学的特性は細胞内のNGF信号変換の性質
について限定された手掛かりしか与えなかった。75kNGF
-Rは外因性細胞系に発現された場合に、低親和性NGF受
容体の結合特性（Kd≒109Ｍ）を示し、そして細胞内ド
メインの分析は触媒作用の推定的なドメインを明らかに
しなかった（M.V.Chao,Handbook of Experimental Phar
macology,Vol.95/II Peptide Growth Factors and Thei
r Receptors II（Sporn,M.B.およびRoberts,A.B.編）所
収,Springer-Verlag,Heiderberg,135-165頁（199
0））。
わかっているけれども、NGFが細胞内で神経栄養性作用
を引き起こす機構は十分に解明されていない。NGFと細
胞受容体との相互作用は細胞内での神経栄養性信号の伝
達における必須の段階である（M.V.Chao,Handbook of E
xperimental Pharmacology,Vol.95/II Peptide Growth
Factors and Their Receptors II（Sporn,M.B.およびRo
berts,A.B.編）所収,Springer-Verlag,Heiderberg,135-
165頁（1990）参照）。細胞とのNGFの相互作用の理解に
おける主な前進はNGFを結合し、そしてNGF応答性細胞に
存在する75kDa受容体（75kNGF-R）の同定およびクロー
ニングであった。75kNGF-Rをコード化する遺伝子のクロ
ーンはいくつかの種から特徴づけられている（M.V.Chao
等,Science 232:418-421（1986）;M.J.Radeke等,Nature
325:593-597（1987））。残念なことに、75kNGF-Rの構
造的および生物学的特性は細胞内のNGF信号変換の性質
について限定された手掛かりしか与えなかった。75kNGF
-Rは外因性細胞系に発現された場合に、低親和性NGF受
容体の結合特性（Kd≒109Ｍ）を示し、そして細胞内ド
メインの分析は触媒作用の推定的なドメインを明らかに
しなかった（M.V.Chao,Handbook of Experimental Phar
macology,Vol.95/II Peptide Growth Factors and Thei
r Receptors II（Sporn,M.B.およびRoberts,A.B.編）所
収,Springer-Verlag,Heiderberg,135-165頁（199
0））。
しかしながら、NGFに対する生物学的応答性は高い親
和性結合成分との相互作用に依存すると広く考えられて
おり、これはその他の受容体または受容体サブユニット
がNGF応答に包含され得ることを暗示する。PC12細胞に
おいてNGF信号を伝達し得る可能性のある第２のメッセ
ンジャーの探索は、チロシンキナーゼの活性化がNGFの
存在に対するすばやい応答を提示し得ることを示す新し
い証拠を導いた（Maher 1988）。これらのデータはチロ
シンキナーゼが高い親和性受容体の成分中の候補である
ことを意味する。
和性結合成分との相互作用に依存すると広く考えられて
おり、これはその他の受容体または受容体サブユニット
がNGF応答に包含され得ることを暗示する。PC12細胞に
おいてNGF信号を伝達し得る可能性のある第２のメッセ
ンジャーの探索は、チロシンキナーゼの活性化がNGFの
存在に対するすばやい応答を提示し得ることを示す新し
い証拠を導いた（Maher 1988）。これらのデータはチロ
シンキナーゼが高い親和性受容体の成分中の候補である
ことを意味する。
trk−がん原遺伝子は、ネズミの成長の間の発現の正
しく制御された自然のパターンでもってチロシンキナー
ゼ（TK）受容体をコード化する（D.Martin-Zanca等,Gen
es Dev.4:683-694（1990）;D.Martin-Zanca等,The Avia
n Model in Developmental Biology:From Organism to
Genes,Editions du CNRS-1990所収,291-302頁（199
0））。生体内で、この遺伝子に対する転写物はマウス
成長のE17の間、末梢神経系の神経堤誘導感覚ニューロ
ンにおいてのみ観察された。証拠のいくつかの系列によ
り出願人はP12細胞NGF介在事象におけるtrkの可能な関
わりあいを調べるようになった。
しく制御された自然のパターンでもってチロシンキナー
ゼ（TK）受容体をコード化する（D.Martin-Zanca等,Gen
es Dev.4:683-694（1990）;D.Martin-Zanca等,The Avia
n Model in Developmental Biology:From Organism to
Genes,Editions du CNRS-1990所収,291-302頁（199
0））。生体内で、この遺伝子に対する転写物はマウス
成長のE17の間、末梢神経系の神経堤誘導感覚ニューロ
ンにおいてのみ観察された。証拠のいくつかの系列によ
り出願人はP12細胞NGF介在事象におけるtrkの可能な関
わりあいを調べるようになった。
trk−がん原遺伝子チロシンキナーゼ受容体がNGFとの
直接的な相互作用を介して活性化されるか否かを決定す
る必要性が当該分野に存在する。本発明はNGFリガンド
およびtrk−がん原遺伝子受容体からなる複合体を提供
する。NGFのtrk受容体への直接結合はtrk発現性細胞に
おいてNGF暴露に対して応答したチロシンリン酸化およ
びチロシンキナーゼ活性を導く。trk生理学的受容体お
よび同種のNGF複合体に関する知識は神経成長および再
生の詳細な研究を可能にする。さらに、NGF-trk受容体
複合体の立証はその他の神経親和性因子対を提示する関
連チロシンキナーゼ受容体を同定する方法を明らかにす
る。
直接的な相互作用を介して活性化されるか否かを決定す
る必要性が当該分野に存在する。本発明はNGFリガンド
およびtrk−がん原遺伝子受容体からなる複合体を提供
する。NGFのtrk受容体への直接結合はtrk発現性細胞に
おいてNGF暴露に対して応答したチロシンリン酸化およ
びチロシンキナーゼ活性を導く。trk生理学的受容体お
よび同種のNGF複合体に関する知識は神経成長および再
生の詳細な研究を可能にする。さらに、NGF-trk受容体
複合体の立証はその他の神経親和性因子対を提示する関
連チロシンキナーゼ受容体を同定する方法を明らかにす
る。
発明の要約 本発明の目的は神経成長因子（NGF）リガンドとtrk−
がん原遺伝子タンパク質受容体とからなる複合体および
該複合体を利用する方法を提供することである。
がん原遺伝子タンパク質受容体とからなる複合体および
該複合体を利用する方法を提供することである。
１つの態様において、本発明はNGFとtrk−がん原遺伝
子受容体タンパク質とからなる、天然に結合されている
タンパク質を含まない複合体に関する。
子受容体タンパク質とからなる、天然に結合されている
タンパク質を含まない複合体に関する。
別の態様において、本発明はNGFリガンドとtrk−がん
原遺伝子受容体タンパク質とからなる複合体であって、
該複合体の１種は固体支持体に結合されている前記複合
体に関する。
原遺伝子受容体タンパク質とからなる複合体であって、
該複合体の１種は固体支持体に結合されている前記複合
体に関する。
さらに別の態様において、本発明は、NGF:trk−がん
原遺伝子受容体タンパク質複合体を試料中に検出するた
めの方法であって、該複合体上のNGFまたはtrk−がん原
遺伝子受容体タンパク質のいずれかと特異的に結合する
抗体と前記試料を反応させることからなる前記方法に関
する。陽性の免疫学的反応は試料中に複合体の存在を示
すものである。
原遺伝子受容体タンパク質複合体を試料中に検出するた
めの方法であって、該複合体上のNGFまたはtrk−がん原
遺伝子受容体タンパク質のいずれかと特異的に結合する
抗体と前記試料を反応させることからなる前記方法に関
する。陽性の免疫学的反応は試料中に複合体の存在を示
すものである。
その他の態様において、本発明は、変性神経病を有す
ると予測される患者からの生物学的試料をNGF:trk−が
ん原遺伝子受容体タンパク質複合体と結合する抗体と反
応させることからなる、変性神経病を該疾病を有すると
予測される患者において診断する方法に関する。
ると予測される患者からの生物学的試料をNGF:trk−が
ん原遺伝子受容体タンパク質複合体と結合する抗体と反
応させることからなる、変性神経病を該疾病を有すると
予測される患者において診断する方法に関する。
さらに別の態様において、本発明は、患者からの生物
学的試料をNGF:trk−がん原遺伝子受容体タンパク質複
合体と結合する抗体と反応させることからなる、患者に
おいて組織が受ける神経再生を診断する方法に関する。
学的試料をNGF:trk−がん原遺伝子受容体タンパク質複
合体と結合する抗体と反応させることからなる、患者に
おいて組織が受ける神経再生を診断する方法に関する。
本発明のその他の態様は、患者からの生物学的試料を
NGF:trk−がん原遺伝子受容体タンパク質複合体と結合
する抗体と反応させることからなる、疾病の状態を該疾
病を有すると予測される患者において診断する方法に関
する。
NGF:trk−がん原遺伝子受容体タンパク質複合体と結合
する抗体と反応させることからなる、疾病の状態を該疾
病を有すると予測される患者において診断する方法に関
する。
もう１つの態様において、本発明は、試料中に存在す
るNGFの受容体への結合が行われるような条件下で試料
をtrk−がん原遺伝子受容体タンパク質と接触させ、そ
して結合されたNGFの存在を検出することからなる試料
中のNGFを検出する方法に関する。
るNGFの受容体への結合が行われるような条件下で試料
をtrk−がん原遺伝子受容体タンパク質と接触させ、そ
して結合されたNGFの存在を検出することからなる試料
中のNGFを検出する方法に関する。
その他の態様において、本発明は、試料中のtrk−が
ん原遺伝子受容体タンパク質を検出する方法であって、
試料中に存在する前記受容体のNGFへの結合が行われる
ような条件下で試料をNGFと接触させ、そして結合され
た受容体の存在を検出する段階からなる前記方法に関す
る。
ん原遺伝子受容体タンパク質を検出する方法であって、
試料中に存在する前記受容体のNGFへの結合が行われる
ような条件下で試料をNGFと接触させ、そして結合され
た受容体の存在を検出する段階からなる前記方法に関す
る。
本発明の種々のその他の目的および利点は図面および
本発明の以下の記載から明らかになるであろう。
本発明の以下の記載から明らかになるであろう。
本明細書で言及した全ての刊行物の全体の内容は参照
により本明細書に編入される。
により本明細書に編入される。
図面の簡単な説明 図１はNGFで処理されたPC12細胞およびtrk発現性NIH-
3T3細胞におけるp140trkのチロシンリン酸化を示す。図
1Aは32Ｐ−オルトホスフェートで標識されたPC12細胞ま
たはtrk発現性3T3細胞から免疫沈降したp140trkを示
す。免疫沈降はウサギ抗trk抗血清43-4（D.Martin-Zanc
a等,Mol.Cell.Biol.9:24-33（1988））を用いて、ラッ
トtrk遺伝子を発現する3T3細胞（trk3T3）（列１）また
は100ng/m1NGFと37℃で５分間処理したPC12細胞（列２
および４）もしくは偽装処理したPC12細胞（列３）から
調整した溶菌液から得られた。列２に示された免疫沈降
はウサギ43-4trk抗体の生成に使用されたペプチドの存
在下で調整された（Martin-Zanca等1988）。NGF処理さ
れたPC12細胞からのp140trk免疫沈降における試験管内
でリン酸化されたtrkタンパク質、またはNGF処理（＋）
もしくは未処理（−）のPC12細胞から生体内で、または
trk3T3細胞から生体内でリン酸化されたtrkタンパク質
のホスホアミノ酸分析が図1Bに示されている。ホスホセ
リン（Ｓ）、ホスホトレオニン（Ｔ）およびホスホチロ
シン（Ｙ）の位置が示されている。図1Cは生体内または
試験管内でリン酸化されたtrk3T3細胞からのtrkタンパ
ク質を示す。列1-3において、p140trk免疫沈降がP-tyr
抗体で探索された。列4-6において、p140trkタンパク質
はキナーゼアッセイにおいて試験管内でリン酸化され
た。細胞はスラミン（列２および５）または500ng/m1NG
Fと10分間処理され、次にスラミン処理を行った。110kD
aに移動するバンドはp140Drototrkのグリコシル化前駆
体である（Martin-Zanca等1988）。図の下方のバンドは
IgGである。分子量マーカーはkDaで示されている。
3T3細胞におけるp140trkのチロシンリン酸化を示す。図
1Aは32Ｐ−オルトホスフェートで標識されたPC12細胞ま
たはtrk発現性3T3細胞から免疫沈降したp140trkを示
す。免疫沈降はウサギ抗trk抗血清43-4（D.Martin-Zanc
a等,Mol.Cell.Biol.9:24-33（1988））を用いて、ラッ
トtrk遺伝子を発現する3T3細胞（trk3T3）（列１）また
は100ng/m1NGFと37℃で５分間処理したPC12細胞（列２
および４）もしくは偽装処理したPC12細胞（列３）から
調整した溶菌液から得られた。列２に示された免疫沈降
はウサギ43-4trk抗体の生成に使用されたペプチドの存
在下で調整された（Martin-Zanca等1988）。NGF処理さ
れたPC12細胞からのp140trk免疫沈降における試験管内
でリン酸化されたtrkタンパク質、またはNGF処理（＋）
もしくは未処理（−）のPC12細胞から生体内で、または
trk3T3細胞から生体内でリン酸化されたtrkタンパク質
のホスホアミノ酸分析が図1Bに示されている。ホスホセ
リン（Ｓ）、ホスホトレオニン（Ｔ）およびホスホチロ
シン（Ｙ）の位置が示されている。図1Cは生体内または
試験管内でリン酸化されたtrk3T3細胞からのtrkタンパ
ク質を示す。列1-3において、p140trk免疫沈降がP-tyr
抗体で探索された。列4-6において、p140trkタンパク質
はキナーゼアッセイにおいて試験管内でリン酸化され
た。細胞はスラミン（列２および５）または500ng/m1NG
Fと10分間処理され、次にスラミン処理を行った。110kD
aに移動するバンドはp140Drototrkのグリコシル化前駆
体である（Martin-Zanca等1988）。図の下方のバンドは
IgGである。分子量マーカーはkDaで示されている。
rtrk 3T3細胞はNIH-3T3細胞中へのラットtrk cDNAのC
aPOにより介在トランスフェクションにより生成され
た。ラットtrk cDNAはM.C.Fishmanにより親切にも提供
された胚性ラットDRG cDNAライブラリィから得られた。
得られた最長のtrk cDNA（2.4kbp）は利用可能なマウス
およびヒトtrk配列に比較してコード領域約150bpを欠失
していた。欠失塩基と最小（−50bp）５′フランキング
非コード配列はマウス第１コードエキソン配列から戻さ
れ、そして再構築された遺伝子はMSV-LTRの下流に置か
れた。PC12細胞またはrtrk 3T3細胞は（２×107）は32
Ｐオルトホスフェート（4ml中に1mCi.ml）を用いて37℃
で４時間標識された。細胞はNGFと設定された時間処理
され、洗浄され、そして１％NP40を含有する緩衝液で溶
菌され、そして溶菌液をtrk抗体43-4（Kaplan等,Cell 6
1:125-133（1990））と免疫沈降させ、そして以前記載
されたように（Kaplan等,1990）7.5％SDS-PAGEゲル上で
電気泳動を行った。図1Bのためには、リン酸化されたtr
kバンドがゲルから溶離され、そして記載されたように
（B.M.Sefton等,J.Cell 24:165-174（1981））ホスホア
ミノ酸分析が行われた。NGF処理PC12細胞からのp140trk
タンパク質は試験管内でリン酸化された。図1Cのために
は、rtrk 3T3細胞はダルベッコ変形イーグル培地（DME
M）中1mMスラミンと２時間処理するか、または偽装処理
を行った。DMEMでの細胞の十分な洗浄に続いて、NGFは
設定時間添加された。細胞は溶菌され、そして溶菌液は
trk抗体と免疫沈降された。免疫沈降はホスホチロシン
（Ptyr）モノクローナル抗体4G10（列1-3）とのイムノ
ブロット分析に供されるか、またはキナーゼアッセイで
分析された（Morrison等,Cell 58:649-657（1989）およ
びKaplan等，（1990））。同程度量のtrkタンパク質が
各列に存在していた。
aPOにより介在トランスフェクションにより生成され
た。ラットtrk cDNAはM.C.Fishmanにより親切にも提供
された胚性ラットDRG cDNAライブラリィから得られた。
得られた最長のtrk cDNA（2.4kbp）は利用可能なマウス
およびヒトtrk配列に比較してコード領域約150bpを欠失
していた。欠失塩基と最小（−50bp）５′フランキング
非コード配列はマウス第１コードエキソン配列から戻さ
れ、そして再構築された遺伝子はMSV-LTRの下流に置か
れた。PC12細胞またはrtrk 3T3細胞は（２×107）は32
Ｐオルトホスフェート（4ml中に1mCi.ml）を用いて37℃
で４時間標識された。細胞はNGFと設定された時間処理
され、洗浄され、そして１％NP40を含有する緩衝液で溶
菌され、そして溶菌液をtrk抗体43-4（Kaplan等,Cell 6
1:125-133（1990））と免疫沈降させ、そして以前記載
されたように（Kaplan等,1990）7.5％SDS-PAGEゲル上で
電気泳動を行った。図1Bのためには、リン酸化されたtr
kバンドがゲルから溶離され、そして記載されたように
（B.M.Sefton等,J.Cell 24:165-174（1981））ホスホア
ミノ酸分析が行われた。NGF処理PC12細胞からのp140trk
タンパク質は試験管内でリン酸化された。図1Cのために
は、rtrk 3T3細胞はダルベッコ変形イーグル培地（DME
M）中1mMスラミンと２時間処理するか、または偽装処理
を行った。DMEMでの細胞の十分な洗浄に続いて、NGFは
設定時間添加された。細胞は溶菌され、そして溶菌液は
trk抗体と免疫沈降された。免疫沈降はホスホチロシン
（Ptyr）モノクローナル抗体4G10（列1-3）とのイムノ
ブロット分析に供されるか、またはキナーゼアッセイで
分析された（Morrison等,Cell 58:649-657（1989）およ
びKaplan等，（1990））。同程度量のtrkタンパク質が
各列に存在していた。
図２はPC12細胞におけるtrkチロシンリン酸化の時間
経過、成長因子特異性および投与量応答性を示す。図2A
はtrkチロシンリン酸化の時間経過を示す。細胞（２×1
07）は50ng/mlNGFと37℃で処理された。図2Bはtrkチロ
シンリン酸化への成長および分化因子の影響を示す。細
胞は100ng/mlNGF、100ng/ml塩基性繊維芽細胞因子（FG
F）（ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカル
ズ）、100ng/ml表皮成長因子（EGF）（アップステイト
・バイオテクノロジー社）、100nMインシュリン（サイ
ンマン）または１μg/mlホルボル12−ミリステート12−
アセテート（PMA）（シグマ）と37℃で15分間処理され
た。図2Cはtrkチロシンリン酸化の投与量応答性を示
す。細胞は増加する濃度のNGFと37℃で30分間処理され
た。trk抗体43-4を用いて調製されたtrk免疫沈降のPtyr
抗体とのウエスタンブロット分析が示されている。
経過、成長因子特異性および投与量応答性を示す。図2A
はtrkチロシンリン酸化の時間経過を示す。細胞（２×1
07）は50ng/mlNGFと37℃で処理された。図2Bはtrkチロ
シンリン酸化への成長および分化因子の影響を示す。細
胞は100ng/mlNGF、100ng/ml塩基性繊維芽細胞因子（FG
F）（ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカル
ズ）、100ng/ml表皮成長因子（EGF）（アップステイト
・バイオテクノロジー社）、100nMインシュリン（サイ
ンマン）または１μg/mlホルボル12−ミリステート12−
アセテート（PMA）（シグマ）と37℃で15分間処理され
た。図2Cはtrkチロシンリン酸化の投与量応答性を示
す。細胞は増加する濃度のNGFと37℃で30分間処理され
た。trk抗体43-4を用いて調製されたtrk免疫沈降のPtyr
抗体とのウエスタンブロット分析が示されている。
図３は17日目のマウス胚DRGにおけるtrk発現を表す。
図3AはE17胚の胸部領域を通る矢状部分の明視野写真を
示し、図3Bは該部分の暗視野写真を示す。その場でのプ
ロトコルおよびプローブは他の文献（Martin-Zanca等19
90）に詳細に記載されている。
図3AはE17胚の胸部領域を通る矢状部分の明視野写真を
示し、図3Bは該部分の暗視野写真を示す。その場でのプ
ロトコルおよびプローブは他の文献（Martin-Zanca等19
90）に詳細に記載されている。
図４はヒト神経芽細胞腫細胞系LA-N-5,SY5Yおよびマ
ウス胚からの後根神経節におけるp140trkのNGF依存チロ
シンリン酸化を示す。図4Aは、未処理（−）もしくはNG
F処理（＋）LA-N-5細胞（K.H.SonnenfeldおよびD.N.Ish
ii,J.Neurosci.Res.8:375-391（1982））、SY5Y細胞
（K.H.SonnenfeldおよびD.N.Ishii,（1982））、NR18細
胞（M.A.Bothwell等,Cell 21:857-866（1980））または
PC12細胞から免疫沈降されたp140trkを示す。免疫沈降
はP-tyr抗体で探索された。trkタンパク質移動度の相違
はグリコシル化の違いに起因する。図4Bは13.5日または
14.5日の胚のマウスからのDRGにおけるp140trkのチロシ
ンリン酸化を示す。DRGは溶菌およびtrk抗体との免疫沈
降の前に、10分以上100ng/mlNGF中に保持された。trk免
疫沈降はP-tyr抗体で探索された。NGF処理された（＋）
PC12細胞または未処理（−）PC12細胞からのチロシンリ
ン酸化p140trkが比較のために示されている。試料は細
胞タンパク質に対して規準化された。分子量マーカーは
kDaで示されている。
ウス胚からの後根神経節におけるp140trkのNGF依存チロ
シンリン酸化を示す。図4Aは、未処理（−）もしくはNG
F処理（＋）LA-N-5細胞（K.H.SonnenfeldおよびD.N.Ish
ii,J.Neurosci.Res.8:375-391（1982））、SY5Y細胞
（K.H.SonnenfeldおよびD.N.Ishii,（1982））、NR18細
胞（M.A.Bothwell等,Cell 21:857-866（1980））または
PC12細胞から免疫沈降されたp140trkを示す。免疫沈降
はP-tyr抗体で探索された。trkタンパク質移動度の相違
はグリコシル化の違いに起因する。図4Bは13.5日または
14.5日の胚のマウスからのDRGにおけるp140trkのチロシ
ンリン酸化を示す。DRGは溶菌およびtrk抗体との免疫沈
降の前に、10分以上100ng/mlNGF中に保持された。trk免
疫沈降はP-tyr抗体で探索された。NGF処理された（＋）
PC12細胞または未処理（−）PC12細胞からのチロシンリ
ン酸化p140trkが比較のために示されている。試料は細
胞タンパク質に対して規準化された。分子量マーカーは
kDaで示されている。
細胞系は100ng/mlNGFと５分間処理され、そしてp140t
rkが図１に示されるように免疫沈降された。DRGは13.5
または14.5日マウス胚に対する解剖により準備された。
100DRGはNGFと処理され、洗浄され、そして１％NP40溶
菌緩衝液中でのドウンスホモジナイゼーションに供され
た。溶菌液はtrk抗体と免疫沈降され、そしてtrkタンパ
ク質は抗ホスホチロシンイムノブロットにより分析され
た。
rkが図１に示されるように免疫沈降された。DRGは13.5
または14.5日マウス胚に対する解剖により準備された。
100DRGはNGFと処理され、洗浄され、そして１％NP40溶
菌緩衝液中でのドウンスホモジナイゼーションに供され
た。溶菌液はtrk抗体と免疫沈降され、そしてtrkタンパ
ク質は抗ホスホチロシンイムノブロットにより分析され
た。
図５はPC12細胞およびrtrk3T3細胞でのNGFのp140trk
への親和性架橋を表す。trk受容体はNSABを用いて125I-
NGFの培養細胞への架橋により標識された。分析された
細胞系はPC12細胞（列1-4）、rtrk3T3細胞（列5-9）、N
IH-3T3細胞（列10-11）およびA875ヒトミエローマ細胞
（列13-15）であった。細胞からの溶菌液は抗NGF（列1,
5,9-14）、p70trkがん遺伝子（7-4）（Martin-Zanca等1
988）に対してバクテリア中で生成された別のtrk抗体で
あるp140trk抗体7-4（列２および６）、または100μg/m
l競合trkペプチドの不在下（列2,7および15）もしくは
存在下（列４および８）でp140trk抗体43-4と免疫沈降
された。架橋は列９、11および14において過剰の非標識
NGF（５μum）の存在下で行われた。抗体7-4は抗体43-4
に比べ3-5倍少ないp1405.4trkを免疫沈降させる。分子
量マーカーはkDaで示されている。
への親和性架橋を表す。trk受容体はNSABを用いて125I-
NGFの培養細胞への架橋により標識された。分析された
細胞系はPC12細胞（列1-4）、rtrk3T3細胞（列5-9）、N
IH-3T3細胞（列10-11）およびA875ヒトミエローマ細胞
（列13-15）であった。細胞からの溶菌液は抗NGF（列1,
5,9-14）、p70trkがん遺伝子（7-4）（Martin-Zanca等1
988）に対してバクテリア中で生成された別のtrk抗体で
あるp140trk抗体7-4（列２および６）、または100μg/m
l競合trkペプチドの不在下（列2,7および15）もしくは
存在下（列４および８）でp140trk抗体43-4と免疫沈降
された。架橋は列９、11および14において過剰の非標識
NGF（５μum）の存在下で行われた。抗体7-4は抗体43-4
に比べ3-5倍少ないp1405.4trkを免疫沈降させる。分子
量マーカーはkDaで示されている。
125I-NGFは2500-3500cpm/fmolの比活性までラクトペ
ルオキシダーゼ処理により調製された。p140trkの125I-
NGFへの架橋は以前の記載に従って行われた（B.L.Hemps
tead,Science 243:373-375（1989）,1990）。細胞（２
×106/ml）は0.5nM125I-NGFと４℃で２時間培養され
た。HSAB（50μＭ）は添加され、そして反応液は長紫外
線に10分間露光された。リン酸緩衝液中の50mMリシン中
で洗浄した後、細胞を１％NP40含有緩衝液中で溶菌さ
せ、そして溶菌液を免疫沈降させ、そして記載されたよ
うに7.5％SDS-PAGE上で分析した（Kaplan等,1990）。
ルオキシダーゼ処理により調製された。p140trkの125I-
NGFへの架橋は以前の記載に従って行われた（B.L.Hemps
tead,Science 243:373-375（1989）,1990）。細胞（２
×106/ml）は0.5nM125I-NGFと４℃で２時間培養され
た。HSAB（50μＭ）は添加され、そして反応液は長紫外
線に10分間露光された。リン酸緩衝液中の50mMリシン中
で洗浄した後、細胞を１％NP40含有緩衝液中で溶菌さ
せ、そして溶菌液を免疫沈降させ、そして記載されたよ
うに7.5％SDS-PAGE上で分析した（Kaplan等,1990）。
図６はrtrk3T3細胞から調製された細胞膜におけるtrk
受容体の平衡結合分析を示す。125I-NGFの結合は記載さ
れたように（Hempstead 1989）フィルター結合により粗
製膜調製物中で分析された。反応は膜タンパク質10μｇ
を用いて30℃で１時間過剰の非標識NGFの存在下または
不在下で３回行われ、そしてミリポアHVPLフィルターに
より真空下で濾過された。非標識NGFの存在下で得られ
た値を差し引いた後に80％を越える特異的結合が検出さ
れた。図6Aは飽和結合曲線を示し、図6Bはスカッチャー
ド（Scatchard）に準拠してプロットされた図6Aのデー
タを示す。LIGANDプログラムがKdを決定するために用い
られた。
受容体の平衡結合分析を示す。125I-NGFの結合は記載さ
れたように（Hempstead 1989）フィルター結合により粗
製膜調製物中で分析された。反応は膜タンパク質10μｇ
を用いて30℃で１時間過剰の非標識NGFの存在下または
不在下で３回行われ、そしてミリポアHVPLフィルターに
より真空下で濾過された。非標識NGFの存在下で得られ
た値を差し引いた後に80％を越える特異的結合が検出さ
れた。図6Aは飽和結合曲線を示し、図6Bはスカッチャー
ド（Scatchard）に準拠してプロットされた図6Aのデー
タを示す。LIGANDプログラムがKdを決定するために用い
られた。
図７はNGF処理された（＋）または未処理（−）PC12
細胞におけるtrkおよびtrkb転写物のノーザントランス
ファー分析を示す。RNA調製およびノーザントランスフ
ァー分析は以前に記載されたように行われた（D.Martin
-Zanca等,Genes Dev.4:683-694（1990））。細胞は50ng
/mlNGF（＋）（ベーリンガー・マンハイム・バイオケミ
カルズ）と処理され、そして48時間後、分化が生じた後
に集められた。前RNA20μｇを各列に注入し、そしてフ
ィルターをtrk（Martin-Zanca等,1990）またはtrkb（Kl
ein等,Development 4:845-850,1990）の特異的プローブ
とハイブリッド形成させた。
細胞におけるtrkおよびtrkb転写物のノーザントランス
ファー分析を示す。RNA調製およびノーザントランスフ
ァー分析は以前に記載されたように行われた（D.Martin
-Zanca等,Genes Dev.4:683-694（1990））。細胞は50ng
/mlNGF（＋）（ベーリンガー・マンハイム・バイオケミ
カルズ）と処理され、そして48時間後、分化が生じた後
に集められた。前RNA20μｇを各列に注入し、そしてフ
ィルターをtrk（Martin-Zanca等,1990）またはtrkb（Kl
ein等,Development 4:845-850,1990）の特異的プローブ
とハイブリッド形成させた。
発明の詳細な説明 本発明は神経成長因子（NGF）とtrk-がん原遺伝子タ
ンパク質とからなる複合体に関する。本発明はさらに、
該複合体を利用する方法に関する。
ンパク質とからなる複合体に関する。本発明はさらに、
該複合体を利用する方法に関する。
本発明の１つの態様は、天然に結合されているタンパ
ク質を含まない、NGFとtrk−がん原遺伝子タンパク質と
の相互作用により形成される複合体に関する。trk−が
ん原遺伝子生成物は140kDa糖タンパク質チロシンキナー
ゼであり、そして高親和性NGF受容体の成分である。
ク質を含まない、NGFとtrk−がん原遺伝子タンパク質と
の相互作用により形成される複合体に関する。trk−が
ん原遺伝子生成物は140kDa糖タンパク質チロシンキナー
ゼであり、そして高親和性NGF受容体の成分である。
本発明は、NGF（リガンド）、trk-がん原遺伝子タン
パク質受容体またはリガンド−受容体複合体を同定して
診断および治療に使用され得る検出および定量方法に関
する。
パク質受容体またはリガンド−受容体複合体を同定して
診断および治療に使用され得る検出および定量方法に関
する。
中枢および末梢神経系のニューロンはそれらの継続し
た生存のためにNGFに依存している。今日までに、同定
されているNGF依存性ニューロンは感覚神経堤誘導（三
叉、上位、頸および後根神経節ニューロン）、交感神経
ニューロンおよび脳の基部、中間部中隔および斜め中隔
帯状核のコリン作用性ニューロンである。この最後の神
経型はアルツハイマー病およびハンチングトン病におい
て変性していることが見出されている。
た生存のためにNGFに依存している。今日までに、同定
されているNGF依存性ニューロンは感覚神経堤誘導（三
叉、上位、頸および後根神経節ニューロン）、交感神経
ニューロンおよび脳の基部、中間部中隔および斜め中隔
帯状核のコリン作用性ニューロンである。この最後の神
経型はアルツハイマー病およびハンチングトン病におい
て変性していることが見出されている。
trkチロシンキナーゼとの複合体を介して生じるよう
なNGF介在応答についての知識および理解は神経の残
存、再生ならびにNGF依存性ニューロンに影響を及ぼす
神経変性疾病の精確な診断および可能性のある治療の研
究に対する広範な関連を有する。
なNGF介在応答についての知識および理解は神経の残
存、再生ならびにNGF依存性ニューロンに影響を及ぼす
神経変性疾病の精確な診断および可能性のある治療の研
究に対する広範な関連を有する。
NGF依存性ニューロンはNGF-trkがん原遺伝子チロシン
キナーゼ複合体を介して応答するから、本明細書の記載
された方法はその他の神経疾病の同定を導き得る上記の
もの以外のその他の神経型を同定するための手段を提供
する。この点に関し、出願人は三叉中脳核におけるtrk
発現（およびそれ故にNGF応答ニューロン）を最近同定
した。これらのニューロンは脳全体での多くの重要な感
覚作用を仲介し、そしてまだ未同定の神経疾患に影響を
及ぼし得る。
キナーゼ複合体を介して応答するから、本明細書の記載
された方法はその他の神経疾病の同定を導き得る上記の
もの以外のその他の神経型を同定するための手段を提供
する。この点に関し、出願人は三叉中脳核におけるtrk
発現（およびそれ故にNGF応答ニューロン）を最近同定
した。これらのニューロンは脳全体での多くの重要な感
覚作用を仲介し、そしてまだ未同定の神経疾患に影響を
及ぼし得る。
本発明の方法はNGFとその受容体との相互作用の役
割、NGF信号のトランスデューサーとしてのtrkがん原遺
伝子生成物の理解を補助し得る。かなりの専門的技術お
よび情報が、核への信号変換経路である細胞内の存在す
る生化学的カスケードの存在を示すその他の生物学系
（すなわち発がんおよび細胞成長）におけるチロシンキ
ナーゼの過去の研究から利用可能である。従って、trk
へのNGF結合は、現に存在している技術や方法論を用い
た同定、研究、そしておそらく最終的には操作を修正で
きる細胞内での信号カスケードを開始する。
割、NGF信号のトランスデューサーとしてのtrkがん原遺
伝子生成物の理解を補助し得る。かなりの専門的技術お
よび情報が、核への信号変換経路である細胞内の存在す
る生化学的カスケードの存在を示すその他の生物学系
（すなわち発がんおよび細胞成長）におけるチロシンキ
ナーゼの過去の研究から利用可能である。従って、trk
へのNGF結合は、現に存在している技術や方法論を用い
た同定、研究、そしておそらく最終的には操作を修正で
きる細胞内での信号カスケードを開始する。
本発明はさらに、標識NGFをプローブとして用いて生
物学的試料中のtrkがん原遺伝子受容体を検出および定
量する方法に関する。適当な標識は例えば125Ｉのよう
な放射標識、およびフルオレセインを包含する。
物学的試料中のtrkがん原遺伝子受容体を検出および定
量する方法に関する。適当な標識は例えば125Ｉのよう
な放射標識、およびフルオレセインを包含する。
当該分野で十分に公知であり、本明細書に記載された
標準的方法を用いて、生物学的試料は非イオン性界面活
性剤で抽出され、そして非標識NGFの存在下または不在
下で標識NGFと保温され得る。生成する複合体は非複合
化（または未結合）標識物質から、例えば、複合体を特
異的ポリクローナル抗体例えば43-4または4.7ウサギ抗t
rk抗血清、およびこれと平行してtrkがん原遺伝子受容
体タンパク質またはNGF-trkがん原遺伝子受容体複合体
を認識するモノクローナル抗体例えばPtyr4G10と免疫沈
降させることにより分離され得る。生成する複合体と結
合した標識の存在から生じる全体の信号が偽装試料から
の信号と比較される。偽装試料は生物学的試料と同じ方
法で処理した既知量の精製trkがん原遺伝子受容体タン
パク質を用いて調製される。
標準的方法を用いて、生物学的試料は非イオン性界面活
性剤で抽出され、そして非標識NGFの存在下または不在
下で標識NGFと保温され得る。生成する複合体は非複合
化（または未結合）標識物質から、例えば、複合体を特
異的ポリクローナル抗体例えば43-4または4.7ウサギ抗t
rk抗血清、およびこれと平行してtrkがん原遺伝子受容
体タンパク質またはNGF-trkがん原遺伝子受容体複合体
を認識するモノクローナル抗体例えばPtyr4G10と免疫沈
降させることにより分離され得る。生成する複合体と結
合した標識の存在から生じる全体の信号が偽装試料から
の信号と比較される。偽装試料は生物学的試料と同じ方
法で処理した既知量の精製trkがん原遺伝子受容体タン
パク質を用いて調製される。
また、複合体はポリエチレングリコールで沈殿させる
ことにより非複合物質から分離されてもよい。両方の方
法論において、免疫沈降または沈殿される標識の量は生
物学的試料中の複合体の量に直接関連づけられる。
ことにより非複合物質から分離されてもよい。両方の方
法論において、免疫沈降または沈殿される標識の量は生
物学的試料中の複合体の量に直接関連づけられる。
本発明はまた、標識されたtrkがん原遺伝子受容体を
プローブとして用いて生物学的試料中のNGFを検出およ
び定量する方法に関する。該方法は、NGFまたはNGF-trk
がん原遺伝子受容体複合体を特異的に認識するものを抗
体として置き代えることを除いて上記方法論に従って逆
結合アッセイとして行われる。NGFに対する抗体は当該
分野では十分に公知である。
プローブとして用いて生物学的試料中のNGFを検出およ
び定量する方法に関する。該方法は、NGFまたはNGF-trk
がん原遺伝子受容体複合体を特異的に認識するものを抗
体として置き代えることを除いて上記方法論に従って逆
結合アッセイとして行われる。NGFに対する抗体は当該
分野では十分に公知である。
本発明はまた、生物学的試料中のNGF-trkがん原遺伝
子タンパク質受容体複合体を検出および定量する方法に
さらに関する。１つの面において、複合体はNGF、trkが
ん原遺伝子受容体タンパク質またはNGF−受容体複合体
に対して導かれた抗体を用いて検出および定量される。
抗体はポリクローナルまたはモノクローナルであってよ
く；両方の例は上記され、そして下の実施例の部分に記
載されている。試料は非イオン性界面活性剤で抽出さ
れ、そして標識NGFまたはtrkがん原遺伝子受容体タンパ
ク質と保温されてもよい。保温後、試料は脂肪親和性で
光親和性の架橋剤、例えばHSABと共有結合で架橋結合さ
れる。化学架橋剤、例えばジスクシンイミジルスベレー
ト（DSS）がこの方法において使用されてもよい。試料
は特異的抗体で免疫沈降されるか、またはポリエチレン
グリコールと沈殿される。定量には、例えばオートラジ
オグラフィーにより続けられるゲル電気電気泳動による
クロマトグラフによる分離が必要となる。
子タンパク質受容体複合体を検出および定量する方法に
さらに関する。１つの面において、複合体はNGF、trkが
ん原遺伝子受容体タンパク質またはNGF−受容体複合体
に対して導かれた抗体を用いて検出および定量される。
抗体はポリクローナルまたはモノクローナルであってよ
く；両方の例は上記され、そして下の実施例の部分に記
載されている。試料は非イオン性界面活性剤で抽出さ
れ、そして標識NGFまたはtrkがん原遺伝子受容体タンパ
ク質と保温されてもよい。保温後、試料は脂肪親和性で
光親和性の架橋剤、例えばHSABと共有結合で架橋結合さ
れる。化学架橋剤、例えばジスクシンイミジルスベレー
ト（DSS）がこの方法において使用されてもよい。試料
は特異的抗体で免疫沈降されるか、またはポリエチレン
グリコールと沈殿される。定量には、例えばオートラジ
オグラフィーにより続けられるゲル電気電気泳動による
クロマトグラフによる分離が必要となる。
本発明はまた、上記の方法を用いる診断方法論に関す
る。本発明の方法により診断される疾患は、例えばアル
ツハイマー病およびハンチングトン病のようなNGF依存
性ニューロンに影響を及ぼす神経変性疾病を包含する。
本発明の診断方法はまた、いまだ未同定の神経疾患の診
断を導いてもよい、これまで記載された神経細胞型から
誘導される組織における神経疾患を測定するために使用
され得る。
る。本発明の方法により診断される疾患は、例えばアル
ツハイマー病およびハンチングトン病のようなNGF依存
性ニューロンに影響を及ぼす神経変性疾病を包含する。
本発明の診断方法はまた、いまだ未同定の神経疾患の診
断を導いてもよい、これまで記載された神経細胞型から
誘導される組織における神経疾患を測定するために使用
され得る。
さらに、本発明はtrk/NGF複合体を検出するために上
で利用されたものと同様の方法を用いて、その他のtrk
関連受容体およびNGF関連神経栄養性因子複合体を検出
する方法に関する。trk遺伝子は現在少なくとも３つの
構成員が同定されている（trk,trk bおよびtrk c）構造
的に関連する遺伝子ファミリーの一員である。同様に、
その数が増加している神経栄養性因子はNGFに対する類
似の構造および作用に基づいて、例えばBDNFおよびNT-3
等が出現してきている。trk/NGF複合体を同定するため
に使用される方法はその他のtrkおよびNGF関連遺伝子に
関して同様の発見を導くであろうことは非常に可能性が
高い。これらのtrk関連/NGF関連複合体（すなわち:trk
b/BDNF）の同定、特徴づけおよび研究に使用される戦略
は上記の発見を基にされるだろう。実際段階または治療
段階でのあらゆる関係はこれらの神経栄養性因子に当て
はまるであろう。trk関連/NGF関連複合体、例えばtrk b
/BDNFに関する知識はNGFに依存するものに対する神経細
胞の異なる一群の残存能力への洞察を与えるであろう。
trk/NGF複合体を検出するために考え出されるか、また
は工夫されたものと同様のこれまでに記載されたアッセ
イおよび戦略は、例えばtrk関連/NGF関連複合体を免疫
沈降させるためのホスホチロシンおよびtrk b抗体を使
用して、関連複合体の検出に当てはまるであろう。
で利用されたものと同様の方法を用いて、その他のtrk
関連受容体およびNGF関連神経栄養性因子複合体を検出
する方法に関する。trk遺伝子は現在少なくとも３つの
構成員が同定されている（trk,trk bおよびtrk c）構造
的に関連する遺伝子ファミリーの一員である。同様に、
その数が増加している神経栄養性因子はNGFに対する類
似の構造および作用に基づいて、例えばBDNFおよびNT-3
等が出現してきている。trk/NGF複合体を同定するため
に使用される方法はその他のtrkおよびNGF関連遺伝子に
関して同様の発見を導くであろうことは非常に可能性が
高い。これらのtrk関連/NGF関連複合体（すなわち:trk
b/BDNF）の同定、特徴づけおよび研究に使用される戦略
は上記の発見を基にされるだろう。実際段階または治療
段階でのあらゆる関係はこれらの神経栄養性因子に当て
はまるであろう。trk関連/NGF関連複合体、例えばtrk b
/BDNFに関する知識はNGFに依存するものに対する神経細
胞の異なる一群の残存能力への洞察を与えるであろう。
trk/NGF複合体を検出するために考え出されるか、また
は工夫されたものと同様のこれまでに記載されたアッセ
イおよび戦略は、例えばtrk関連/NGF関連複合体を免疫
沈降させるためのホスホチロシンおよびtrk b抗体を使
用して、関連複合体の検出に当てはまるであろう。
本発明はさらに、NGF介在神経再生または残存を高め
る治療方法論および試験キットまたは薬剤の発見に関す
る。これは操作の質を検定するためのtrk抗体およびホ
スホリロリシン抗体の使用に依存するであろう。チロシ
ンリン酸化を高めるか、または阻害する薬剤の発見が可
能性のある治療的評価の点で最も明らかである。trkは
メッセンジャー分子のチロシン上でのリン酸化を介する
伝達を媒介するので、その信号伝達は細胞において要求
されるように変更され得る。これらの研究は、何らかの
可能性のある適用に先だって、組織または細胞培養系に
おいて最初に開発および評価されるであろう。薬剤はtr
k発現性組織培養細胞に、NGFと一緒か、もしくはNGF不
在下で添加され、そしてチロシンリン酸化により測定さ
れるようなtrk活性化の状態が評価され得る。これらの
薬剤の開発における進歩はtrkおよび／またはリン酸化
チロシンを認識する抗体を用いて最も有効に追跡される
であろう。従って、この領域でのあらゆる有用な治療の
開発はtrkおよび／またはその下流の基質の活性化状態
を同定する能力に依存するであろう。次に、動物モデル
（ラットまたはマウス）は特定の神経網が崩壊されて使
用され、有望な薬剤が投与され、そして最後に殺した動
物の分析は、上記のようにtrk/NGFまたはtrk関連、NGF
関連抗体アッセイを用いて神経の再生を評価するために
行われる。
る治療方法論および試験キットまたは薬剤の発見に関す
る。これは操作の質を検定するためのtrk抗体およびホ
スホリロリシン抗体の使用に依存するであろう。チロシ
ンリン酸化を高めるか、または阻害する薬剤の発見が可
能性のある治療的評価の点で最も明らかである。trkは
メッセンジャー分子のチロシン上でのリン酸化を介する
伝達を媒介するので、その信号伝達は細胞において要求
されるように変更され得る。これらの研究は、何らかの
可能性のある適用に先だって、組織または細胞培養系に
おいて最初に開発および評価されるであろう。薬剤はtr
k発現性組織培養細胞に、NGFと一緒か、もしくはNGF不
在下で添加され、そしてチロシンリン酸化により測定さ
れるようなtrk活性化の状態が評価され得る。これらの
薬剤の開発における進歩はtrkおよび／またはリン酸化
チロシンを認識する抗体を用いて最も有効に追跡される
であろう。従って、この領域でのあらゆる有用な治療の
開発はtrkおよび／またはその下流の基質の活性化状態
を同定する能力に依存するであろう。次に、動物モデル
（ラットまたはマウス）は特定の神経網が崩壊されて使
用され、有望な薬剤が投与され、そして最後に殺した動
物の分析は、上記のようにtrk/NGFまたはtrk関連、NGF
関連抗体アッセイを用いて神経の再生を評価するために
行われる。
本発明はまた、アルツハイマー病およびハンチングト
ン病のような疾病における変性神経の刺激を高める薬剤
を設計するためのその他の治療方法に関する。
ン病のような疾病における変性神経の刺激を高める薬剤
を設計するためのその他の治療方法に関する。
trkおよび低親和性NGF受容体75/cNGF-RはNGFに対する
高親和性応答には一緒に必要とされる。高親和性複合体
を用いるNGFの検出を高めるであろう方法が工夫され得
る。trk/NGF複合体に対する存在の知識はtrk活性化を過
剰に刺激する変形されたNGF分子の開発を導くであろ
う。これらのNGF誘導体は疾病例えばアルツハイマー病
およびハンチングトン病から生じる変性性神経の刺激に
おいて重要であるかもしれない。
高親和性応答には一緒に必要とされる。高親和性複合体
を用いるNGFの検出を高めるであろう方法が工夫され得
る。trk/NGF複合体に対する存在の知識はtrk活性化を過
剰に刺激する変形されたNGF分子の開発を導くであろ
う。これらのNGF誘導体は疾病例えばアルツハイマー病
およびハンチングトン病から生じる変性性神経の刺激に
おいて重要であるかもしれない。
チロシンキナーゼの多くの基質は同定されている。tr
k特異的基質の同定は、NGF介在信号を高めるか、または
阻害するように薬学的に操作され得るNGF経路における
中間分子の発見を導き得る。
k特異的基質の同定は、NGF介在信号を高めるか、または
阻害するように薬学的に操作され得るNGF経路における
中間分子の発見を導き得る。
実施例 実施例1 NGFに応答したp140Drototrkのチロシンリン酸
化 PC12細胞へのNGF添加に応答したp140Drototrkのチロ
シンリン酸化の刺激は迅速で、特異的であり、そしてNG
Fの生理学的量の存在下で起こる。
化 PC12細胞へのNGF添加に応答したp140Drototrkのチロ
シンリン酸化の刺激は迅速で、特異的であり、そしてNG
Fの生理学的量の存在下で起こる。
この以前の研究は、p140Drototrkのチロシンリン酸化
を検出するためのホスホチロシン（P-tyr）抗体とのイ
ムノブロット分析を利用した。p140Drototrkのセリンま
たはトレオニンリン酸化の増強がNGFにより誘導される
否かを決定するために、そしてチロシン、セリンおよび
トレオニンリン酸化の相対量を比較するために、PC12細
胞はNGF処理およびp140Drototrkに対する抗体での免疫
沈降の前に32Ｐ−オルトホスフェートで標識された。p1
40Drototrkは、未処理細胞および50ng/mlNGFで５分間処
理された細胞からの免疫沈降においてセリン残基上で優
先的にリン酸化された。しかしながら、NGFの存在はp14
0Drototrkのthrチロシンリン酸化を20倍刺激したが、こ
れは新たに取り込まれたホスフェート残基の５％未満に
相当する。これに対し、NGF処理PC12細胞からの免疫複
合体キナーゼアッセイまたはラットtrk遺伝子でトラン
スフェクションさせた32Ｐ標識NIH-3T3細胞（r trk-3T
3）においてp140Drototrkはチロシン上で優先的に標識
された（図1A）。NIH-3T3細胞に発現されたp140
Drototrkはチロシンリン酸化はこれらの細胞により産生
されたNGFによる主とした刺激によることが実質的に明
らかだった。いくつかの成長因子のそれらの受容体への
結合を阻害し、そしてその性質を逆にするスラミン、ポ
リアニオン性化合物（M.Hosang等,J.Cell.Biochem.29:2
65-273（1985））でのrtrk-3T3細胞の処理は生体内およ
び免疫複合体キナーゼアッセイにおいてp140Drototrkの
チロシンリン酸化を著しく低下させた（図1B）。NGFが
スラミン処理細胞に10分間添加された場合、生体内およ
び試験管内で観察されたp140Drototrkのチロシンリン酸
化は少なくとも10倍刺激された（図1B）。
を検出するためのホスホチロシン（P-tyr）抗体とのイ
ムノブロット分析を利用した。p140Drototrkのセリンま
たはトレオニンリン酸化の増強がNGFにより誘導される
否かを決定するために、そしてチロシン、セリンおよび
トレオニンリン酸化の相対量を比較するために、PC12細
胞はNGF処理およびp140Drototrkに対する抗体での免疫
沈降の前に32Ｐ−オルトホスフェートで標識された。p1
40Drototrkは、未処理細胞および50ng/mlNGFで５分間処
理された細胞からの免疫沈降においてセリン残基上で優
先的にリン酸化された。しかしながら、NGFの存在はp14
0Drototrkのthrチロシンリン酸化を20倍刺激したが、こ
れは新たに取り込まれたホスフェート残基の５％未満に
相当する。これに対し、NGF処理PC12細胞からの免疫複
合体キナーゼアッセイまたはラットtrk遺伝子でトラン
スフェクションさせた32Ｐ標識NIH-3T3細胞（r trk-3T
3）においてp140Drototrkはチロシン上で優先的に標識
された（図1A）。NIH-3T3細胞に発現されたp140
Drototrkはチロシンリン酸化はこれらの細胞により産生
されたNGFによる主とした刺激によることが実質的に明
らかだった。いくつかの成長因子のそれらの受容体への
結合を阻害し、そしてその性質を逆にするスラミン、ポ
リアニオン性化合物（M.Hosang等,J.Cell.Biochem.29:2
65-273（1985））でのrtrk-3T3細胞の処理は生体内およ
び免疫複合体キナーゼアッセイにおいてp140Drototrkの
チロシンリン酸化を著しく低下させた（図1B）。NGFが
スラミン処理細胞に10分間添加された場合、生体内およ
び試験管内で観察されたp140Drototrkのチロシンリン酸
化は少なくとも10倍刺激された（図1B）。
trkチロシンリン酸化はNGF処理細胞に１分以内に生
じ、５分後に最高レベルに達し、そしてその後低下した
（図2A）。残りのリン酸化は、細胞の集まりが十分に分
化した、NGFでの処理２日後に検出された。trkチロシン
リン酸化またはNGFに対して特異的だった。PC12細胞に
おけるチロシンリン酸化を引き出すその他のペプチド成
長因子は我々のアッセイにおいて試験された（V.Hambur
ger等,J.Neurosci.1:60-71（1981）;I.B.Black等,Groet
h Factors and Development,Current Topics in Develo
pmental Biology,24巻（Nilsen-Hamilton編）所収,161-
192頁（1990））。trkを誘導しなかったEGF、塩基性FG
F、インシュリンおよびホルボルエステルPMAは塩基性FG
FおよびNGFの両方で処理された細胞中に見出された（図
2B）。これらの薬剤がc-fosおよびc-mycの転写活性化を
包含する、PC12細胞における初期応答の類似のパターン
を生じることは以前に示されている（R.Levi-Montalcin
iおよびB.Booker,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,46:302-311
（1960））。しかしながら、これらの因子のうちNGFお
よび塩基性FGFのみが神経の伸長を刺激する。
じ、５分後に最高レベルに達し、そしてその後低下した
（図2A）。残りのリン酸化は、細胞の集まりが十分に分
化した、NGFでの処理２日後に検出された。trkチロシン
リン酸化またはNGFに対して特異的だった。PC12細胞に
おけるチロシンリン酸化を引き出すその他のペプチド成
長因子は我々のアッセイにおいて試験された（V.Hambur
ger等,J.Neurosci.1:60-71（1981）;I.B.Black等,Groet
h Factors and Development,Current Topics in Develo
pmental Biology,24巻（Nilsen-Hamilton編）所収,161-
192頁（1990））。trkを誘導しなかったEGF、塩基性FG
F、インシュリンおよびホルボルエステルPMAは塩基性FG
FおよびNGFの両方で処理された細胞中に見出された（図
2B）。これらの薬剤がc-fosおよびc-mycの転写活性化を
包含する、PC12細胞における初期応答の類似のパターン
を生じることは以前に示されている（R.Levi-Montalcin
iおよびB.Booker,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,46:302-311
（1960））。しかしながら、これらの因子のうちNGFお
よび塩基性FGFのみが神経の伸長を刺激する。
trkチロシンリン酸化を引き起し得るNGFの最低濃度を
決定するために、投与量応答性実験が行われた。チロシ
ンリン酸化は0.1ng/mlNGF（50pM）で1/2最大であり（図
2C）、これはtrkリン酸化がNGFの生理学的に適切な濃度
で起こることを示す（S.Cohen,Proc.Natl.Acad.Sci.US
A,46:302-311（1960））。
決定するために、投与量応答性実験が行われた。チロシ
ンリン酸化は0.1ng/mlNGF（50pM）で1/2最大であり（図
2C）、これはtrkリン酸化がNGFの生理学的に適切な濃度
で起こることを示す（S.Cohen,Proc.Natl.Acad.Sci.US
A,46:302-311（1960））。
実施例２ 胚性感覚神経堤誘導ニューロンにおけるtrk
遺伝子の発現 trk遺伝子は後根神経節（DRG）を含む胚性感覚神経堤
誘導ニューロンにおいて発現される（図３およびMartin
-Zanca等,1990）。この発現はニューロンに制限され
（暗く染まっているグリア細胞には銀粒がないことに注
意）、そして成人において維持されている。胚性のニュ
ーロンにおけるtrkタンパク質がNGFに応答性であったか
否かを決定するために、E13.5およびE14.5マウスの胚か
らのDRGが移植され、50ng/mlNGF中で氷上に10分以上保
持され、溶菌され、そしてtrk抗体沈殿および抗ptyrイ
ムノブロット分析に供された。図3Aに示されるように、
p145Drototrkのリン酸化は14.5日DRGに検出されたが、1
3.5日DRGの２つの独立した調製物には検出されなかっ
た。チロシンリン酸化trkタンパク質は外から投与され
るNGFの不在下では検出され得なかった。
遺伝子の発現 trk遺伝子は後根神経節（DRG）を含む胚性感覚神経堤
誘導ニューロンにおいて発現される（図３およびMartin
-Zanca等,1990）。この発現はニューロンに制限され
（暗く染まっているグリア細胞には銀粒がないことに注
意）、そして成人において維持されている。胚性のニュ
ーロンにおけるtrkタンパク質がNGFに応答性であったか
否かを決定するために、E13.5およびE14.5マウスの胚か
らのDRGが移植され、50ng/mlNGF中で氷上に10分以上保
持され、溶菌され、そしてtrk抗体沈殿および抗ptyrイ
ムノブロット分析に供された。図3Aに示されるように、
p145Drototrkのリン酸化は14.5日DRGに検出されたが、1
3.5日DRGの２つの独立した調製物には検出されなかっ
た。チロシンリン酸化trkタンパク質は外から投与され
るNGFの不在下では検出され得なかった。
DRGの解剖は細胞体を主に提示し、そして神経軸索を
除き、それ故に、p145Drototrk活性化の時期および程度
に関するこれらのデータの意味は注意して理解されるべ
きである。しかしながら、14.5DRGにおける結果は、新
たに解剖された胚性DRGニューロンがNGFに応答してリン
酸化されるtrkタンパク質を含むことを決定する。
除き、それ故に、p145Drototrk活性化の時期および程度
に関するこれらのデータの意味は注意して理解されるべ
きである。しかしながら、14.5DRGにおける結果は、新
たに解剖された胚性DRGニューロンがNGFに応答してリン
酸化されるtrkタンパク質を含むことを決定する。
実施例3 NGFは種々のtrk発現性細胞型においてp140
Drototrkチロシンリン酸化を刺激する NGFに応答するp140Drototrkのリン酸化がラットPC12
細胞に特有であるか、またはその他のNGF応答性細胞系
において起こるかを決定するために、異なる種からの追
加の神経芽腫細胞系におけるtrkタンパク質の状態を検
定した。p140Drototrkチロシンリン酸化はヒト神経芽腫
細胞系LA-N-5およびマウス細胞系SY5YにおいてNGFによ
り高められることが観察された（図4B）。LA-N-5および
SY5Y細胞はPC12細胞に比べ４倍少ないtrkmRNAを発現す
るが、これはPC12細胞に比べこれらの細胞系において観
察されたチロシンリン酸化trkのより低い量の原因であ
る。
Drototrkチロシンリン酸化を刺激する NGFに応答するp140Drototrkのリン酸化がラットPC12
細胞に特有であるか、またはその他のNGF応答性細胞系
において起こるかを決定するために、異なる種からの追
加の神経芽腫細胞系におけるtrkタンパク質の状態を検
定した。p140Drototrkチロシンリン酸化はヒト神経芽腫
細胞系LA-N-5およびマウス細胞系SY5YにおいてNGFによ
り高められることが観察された（図4B）。LA-N-5および
SY5Y細胞はPC12細胞に比べ４倍少ないtrkmRNAを発現す
るが、これはPC12細胞に比べこれらの細胞系において観
察されたチロシンリン酸化trkのより低い量の原因であ
る。
PC12細胞系の誘導体はNGFへの高い親和性応答を失っ
た突然変異誘発により生成された（Bothwell等,198
1）。１つのそのような系NR18は75kNGF-Rを消失してい
る。これらの細胞への75kNGF-Rの導入は、２相のスキャ
ッチャードプロフィールおよび少なくとも部分的な機能
の再編成をもたらした（Hempstead等,J.Biol.Chem.265:
9595-9598（1990））。NR18細胞は非常に低下されたレ
ベルでtrkがん原遺伝子を発現する（Hempstead等,1991
参照）。
た突然変異誘発により生成された（Bothwell等,198
1）。１つのそのような系NR18は75kNGF-Rを消失してい
る。これらの細胞への75kNGF-Rの導入は、２相のスキャ
ッチャードプロフィールおよび少なくとも部分的な機能
の再編成をもたらした（Hempstead等,J.Biol.Chem.265:
9595-9598（1990））。NR18細胞は非常に低下されたレ
ベルでtrkがん原遺伝子を発現する（Hempstead等,1991
参照）。
出願人は次にNGFに対する非常に低下した応答性を有
するNR18細胞系上のtrk受容体のリン酸化状態を分析し
た（Bothwell等,Cell,21:857-866（1980））。RNA発現
データ（Hempstead等,1991参照）と一致して、これらの
細胞において、NGFに応答したp140Drototrkのリン酸化
は観察されなかった（図4B）。従って、NR18細胞におい
て、p140Drototrkのチロシンリン酸化は、生物学的応答
を引き出すNGFの低下した能力と相関関係にある。
するNR18細胞系上のtrk受容体のリン酸化状態を分析し
た（Bothwell等,Cell,21:857-866（1980））。RNA発現
データ（Hempstead等,1991参照）と一致して、これらの
細胞において、NGFに応答したp140Drototrkのリン酸化
は観察されなかった（図4B）。従って、NR18細胞におい
て、p140Drototrkのチロシンリン酸化は、生物学的応答
を引き出すNGFの低下した能力と相関関係にある。
実施例4 TrkはNGFに直接結合する NGFと処理されたいくつかのtrk発現性細胞系において
p140Drototrkの急速なリン酸化を示す上記の結果は、tr
k受容体がNGFに直接結合し得ることを示唆した。NGFがp
140Drototrkに結合し得るかどうかを決定するために、
いくつかの細胞系は親和性架橋実験において受容体−リ
ガンド複合体を沈殿させるtrk特異的抗血清の能力が分
析された（図５）。アッセイされた細胞系はラットPC1
2、ヒトLA-N-5、マウスSY5Y、マウスNIH-3T3、マウスtr
k-3T3、およびヒトAB75細胞だった。NGFはPC12、LA-N-
5、SY5Yおよびrtrk-3T3においてp140Drototrkのチロシ
ンリン酸化を誘導するが、しかし検出可能なtrkメッセ
ンジャーRNAを発現しないAB75ミエローマまたはNIH-3T3
細胞においては誘導しない。125Ｉ標識NGFは脂肪親和性
で光親和性の薬剤HSABを用いて細胞に架橋された。この
架橋剤でのこれまでの研究は、PC12細胞および交感神経
ニューロンにおいて、100kDaおよび150-160kDaの２つの
NGF含有種が観察された（J.Massague等,J.Biol.Chem.25
6:9419-9424（1981）;Hempstead等,1991;S.O.Meakinお
よびE.M.Shooter,Neuron 6:153-163（1991））。100kDa
種は75kNGF-Rに結合した125I-NGFを表す（M.Hosangおよ
びE.M.Shooter,J.Biol.Chem.260:655-662（1985））。
架橋に続き、細胞は洗浄されて未結合の125I-NGFが除去
され、界面活性剤中で溶菌され、そして溶菌液は抗体と
保温された（図４）。抗NGFまたは抗p140Drototrkにお
ける160kDa種はPC12およびrtrk-3T3細胞から免疫沈降す
るが、A875またはNIH-3T3細胞から免疫沈降しないこと
が観察された。160kDa種の免疫沈降は、抗体を生成する
のに使用されたtrk誘導化ペプチドの添加により阻害さ
れ、そして架橋に先立って、過剰な非標識NGFが125I-NG
F処理細胞に添加される場合に見られなかった。160kDa
の架橋化生成物はまたLA-N-5およびSY5Y細胞に観察され
た。架橋化100kDa種はPC12およびA875細胞中に存在して
いたが、3T3細胞系には存在せず、これはNIH-3T3細胞に
おける75kNGF-Rの発現がないことを反映している。上記
実験はNGFがp140Drototrkに結合し、そしてこの結合がN
GFに応答してp140Drototrkチロシンリン酸化を示す細胞
系においてのみ示されることを確立する。
p140Drototrkの急速なリン酸化を示す上記の結果は、tr
k受容体がNGFに直接結合し得ることを示唆した。NGFがp
140Drototrkに結合し得るかどうかを決定するために、
いくつかの細胞系は親和性架橋実験において受容体−リ
ガンド複合体を沈殿させるtrk特異的抗血清の能力が分
析された（図５）。アッセイされた細胞系はラットPC1
2、ヒトLA-N-5、マウスSY5Y、マウスNIH-3T3、マウスtr
k-3T3、およびヒトAB75細胞だった。NGFはPC12、LA-N-
5、SY5Yおよびrtrk-3T3においてp140Drototrkのチロシ
ンリン酸化を誘導するが、しかし検出可能なtrkメッセ
ンジャーRNAを発現しないAB75ミエローマまたはNIH-3T3
細胞においては誘導しない。125Ｉ標識NGFは脂肪親和性
で光親和性の薬剤HSABを用いて細胞に架橋された。この
架橋剤でのこれまでの研究は、PC12細胞および交感神経
ニューロンにおいて、100kDaおよび150-160kDaの２つの
NGF含有種が観察された（J.Massague等,J.Biol.Chem.25
6:9419-9424（1981）;Hempstead等,1991;S.O.Meakinお
よびE.M.Shooter,Neuron 6:153-163（1991））。100kDa
種は75kNGF-Rに結合した125I-NGFを表す（M.Hosangおよ
びE.M.Shooter,J.Biol.Chem.260:655-662（1985））。
架橋に続き、細胞は洗浄されて未結合の125I-NGFが除去
され、界面活性剤中で溶菌され、そして溶菌液は抗体と
保温された（図４）。抗NGFまたは抗p140Drototrkにお
ける160kDa種はPC12およびrtrk-3T3細胞から免疫沈降す
るが、A875またはNIH-3T3細胞から免疫沈降しないこと
が観察された。160kDa種の免疫沈降は、抗体を生成する
のに使用されたtrk誘導化ペプチドの添加により阻害さ
れ、そして架橋に先立って、過剰な非標識NGFが125I-NG
F処理細胞に添加される場合に見られなかった。160kDa
の架橋化生成物はまたLA-N-5およびSY5Y細胞に観察され
た。架橋化100kDa種はPC12およびA875細胞中に存在して
いたが、3T3細胞系には存在せず、これはNIH-3T3細胞に
おける75kNGF-Rの発現がないことを反映している。上記
実験はNGFがp140Drototrkに結合し、そしてこの結合がN
GFに応答してp140Drototrkチロシンリン酸化を示す細胞
系においてのみ示されることを確立する。
結合の証明と同じくらい重要であって、結合の親和性
が生理学的に適切な条件を示すかどうかを決定すること
は本質的である。スキャッチャードプロット分析はNIH-
3T3細胞において発現されたp140Drototrkに対するNGFの
親和性を決定するために行われた。粗製膜が細胞から調
製され、そして125I-NGFへの結合により検定された。rt
rk-3T3細胞から得られた膜は約10-9ＭのKdで直線状スキ
ャッチャードプロットを示した（図６）。この分析によ
り、受容体の数は約200000-500000/細胞だった。
が生理学的に適切な条件を示すかどうかを決定すること
は本質的である。スキャッチャードプロット分析はNIH-
3T3細胞において発現されたp140Drototrkに対するNGFの
親和性を決定するために行われた。粗製膜が細胞から調
製され、そして125I-NGFへの結合により検定された。rt
rk-3T3細胞から得られた膜は約10-9ＭのKdで直線状スキ
ャッチャードプロットを示した（図６）。この分析によ
り、受容体の数は約200000-500000/細胞だった。
実施例５ 種々の細胞型におけるtrkまたはtrk関連メッ
センジャーRNAの発現 trk遺伝子は関連遺伝子trk bを包含するTK受容体の遺
伝子ファミリーの一員である。trkがPC12細胞において
転写されるかどうかを決定するために、trk転写物の発
現が全長trkcDNAプローブを用いるノーザントランスフ
ァー分析によりアッセイされた（R.Klein等,Developmen
t 4:845-850（1990））。PC12細胞はtrk転写物を含んで
いた（図７）。trk転写物のレベルはNGFの添加により影
響を受けなかった。その他のtrk関連遺伝子がPC12細胞
において転写されるどうかを決定するために、mRNAは高
度に保存性のtrkTKドメインと低い厳密度でハイブリッ
ド形成された。trk転写物はLA-N-5細胞、Sy5y細胞およ
び13.5日もしくは14.5日の胚性マウスからのDRGに見出
された。mRNA分析により決定されるようにtrk b発現性
細胞系はtrk bリガンド（BDNF）との相互作用における
次の段階を決定するのを補助するであろう。
センジャーRNAの発現 trk遺伝子は関連遺伝子trk bを包含するTK受容体の遺
伝子ファミリーの一員である。trkがPC12細胞において
転写されるかどうかを決定するために、trk転写物の発
現が全長trkcDNAプローブを用いるノーザントランスフ
ァー分析によりアッセイされた（R.Klein等,Developmen
t 4:845-850（1990））。PC12細胞はtrk転写物を含んで
いた（図７）。trk転写物のレベルはNGFの添加により影
響を受けなかった。その他のtrk関連遺伝子がPC12細胞
において転写されるどうかを決定するために、mRNAは高
度に保存性のtrkTKドメインと低い厳密度でハイブリッ
ド形成された。trk転写物はLA-N-5細胞、Sy5y細胞およ
び13.5日もしくは14.5日の胚性マウスからのDRGに見出
された。mRNA分析により決定されるようにtrk b発現性
細胞系はtrk bリガンド（BDNF）との相互作用における
次の段階を決定するのを補助するであろう。
以上、本発明を明確にするため、および理解のために
ある程度詳しく記載してきたが、形態および詳細におけ
る種々の変更が本発明の真の範囲を逸脱することなくな
され得ることは、本明細書の記載から当業者により理解
されるであろう。
ある程度詳しく記載してきたが、形態および詳細におけ
る種々の変更が本発明の真の範囲を逸脱することなくな
され得ることは、本明細書の記載から当業者により理解
されるであろう。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 パラダ，ルイス エフ. アメリカ合衆国，メリーランド 21702, フレデリック，アンドーバー レーン 1586 (56)参考文献 Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄ），350 （6314），Ｐ．158−160，1991 Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃ ｉ ＵＳＡ，85（18），Ｐ．6788−91, 1988
Claims (6)
- 【請求項１】以下の段階： （ａ）trk−がん原遺伝子受容体タンパク質を発現する
細胞と推定上の神経栄養性薬剤とを、前記受容体タンパ
ク質の結合および活性化が起こり得るような条件下で接
触させ、 （ｂ）段階（ａ）により行われたtrk−がん原遺伝子受
容体タンパク質のチロシンリン酸化の量を決定し、 （ｃ）段階（ｂ）により決定されたリン酸化の前記量を
前記推定上の神経栄養性薬剤と接触されない対照trk−
がん原遺伝子受容体のものと比較し、それにより前記対
照の量に対する前者の量における増加が前記薬剤を神経
栄養性であると検出する、 からなる、対照に関して神経栄養性薬剤を検出する方
法。 - 【請求項２】段階（ａ）の前に、前記細胞を32Ｐ−オル
トホスフェートと接触させ、そして段階（ｂ）におい
て、trk−がん原遺伝子受容体タンパク質を抗trk抗体と
接触させて免疫沈降させ、そして前記trk−がん原遺伝
子受容体タンパク質に取り込まれた32Ｐ−オルトホスフ
ェートの量を測定し、それにより該測定は段階（ａ）に
より行われたtrk−がん原遺伝子受容体タンパク質のチ
ロシンリン酸化の量を決定する、ことをさらに含む請求
項１記載の方法。 - 【請求項３】前記細胞がPC12、LA-N-5、SY5Yおよびrtrk
-3T3からなる細胞系の群から選択される請求項１記載の
方法。 - 【請求項４】以下の段階： （ａ）trk−がん原遺伝子受容体タンパク質と神経成長
因子を含有することが予測される生物学的試料とを、神
経成長因子との結合が起こり得るような条件下で接触さ
せ、 （ｂ）段階（ａ）により行われたtrk−がん原遺伝子受
容体タンパク質のチロシンリン酸化の量を決定し、それ
によりtrk−がん原遺伝子受容体タンパク質のリン酸化
の前記量における増加は前記試料中の神経成長因子の存
在を示す、 からなる、試料中に神経成長因子を検出する方法。 - 【請求項５】以下の段階： （ｉ）段階（ａ）の後に、trk−がん原遺伝子受容体タ
ンパク質に特異的な抗体と試料を接触させ、そして （ii）前記trk−がん原遺伝子受容体タンパク質を免疫
沈降させる、 をさらに含む請求項４記載の方法。 - 【請求項６】以下の段階： （ａ）trk−がん原遺伝子受容体タンパク質を発現する
細胞と推定上の神経栄養性薬剤とを、神経成長因子の存
在下に、前記受容体タンパク質の結合および活性化が起
こり得るような条件下で接触させ、 （ｂ）段階（ａ）により行われたtrk−がん原遺伝子受
容体タンパク質のチロシンリン酸化の量を決定し、 （ｃ）段階（ｂ）により決定されたリン酸化の前記量を
前記薬剤の不在下に神経成長因子と接触される対照trk
−がん原遺伝子受容体のものと比較し、それにより前記
対照の量に対するチロシンリン酸化の前記量における増
加が前記薬剤を神経成長因子促進剤として検出する、 からなる、神経成長因子活性を対照の活性に対して促進
する薬剤を検出する方法
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/668,298 US5231001A (en) | 1991-03-14 | 1991-03-14 | Trk tyrosine kinase receptor is the physiological receptor for nerve growth factor |
| US668,298 | 1991-03-14 | ||
| PCT/US1992/002112 WO1992016559A1 (en) | 1991-03-14 | 1992-03-16 | The trk tyrosine kinase receptor is the physiological receptor for nerve growth factor |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06500792A JPH06500792A (ja) | 1994-01-27 |
| JP2561604B2 true JP2561604B2 (ja) | 1996-12-11 |
Family
ID=24681788
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4507887A Expired - Lifetime JP2561604B2 (ja) | 1991-03-14 | 1992-03-16 | 神経栄養性薬剤、神経成長因子および神経成長因子促進剤の検出方法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5231001A (ja) |
| EP (1) | EP0575498A4 (ja) |
| JP (1) | JP2561604B2 (ja) |
| AU (1) | AU652624B2 (ja) |
| CA (1) | CA2106080C (ja) |
| WO (1) | WO1992016559A1 (ja) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5811396A (en) * | 1991-03-14 | 1998-09-22 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | TRK tyrosine kinase receptor is the physiological receptor for nerve growth factor |
| US5231001A (en) * | 1991-03-14 | 1993-07-27 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Trk tyrosine kinase receptor is the physiological receptor for nerve growth factor |
| ZA922947B (en) * | 1991-04-23 | 1993-01-27 | Regeneron Pharma | Assay systems for neurotrophin activity |
| IL101661A (en) * | 1991-04-23 | 1998-02-08 | Regeneron Pharma | Method for detecting, identifying or measuring agents having neurotrophin activity |
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| US5776755A (en) * | 1992-10-09 | 1998-07-07 | Helsinki University Licensing, Ltd. | FLT4, a receptor tyrosine kinase |
| US6107046A (en) * | 1992-10-09 | 2000-08-22 | Orion Corporation | Antibodies to Flt4, a receptor tyrosine kinase and uses thereof |
| IL109280A0 (en) * | 1993-04-15 | 1994-07-31 | Regeneron Pharma | Neurotrophins for treatment of depression |
| US5468872A (en) * | 1993-09-16 | 1995-11-21 | Cephalon, Inc. | K-252a functional derivatives potentiate neurotrophin-3 for the treatment of neurological disorders |
| US5602309A (en) * | 1993-10-04 | 1997-02-11 | University Of Kentucky Research Foundation | Transgenic mice which overexpress nerve growth factor |
| US5753225A (en) * | 1993-12-03 | 1998-05-19 | The Regents Of The University Of California | Antibodies that mimic actions of neurotrophins |
| US20040058416A1 (en) * | 1994-03-18 | 2004-03-25 | Presta Leonard G. | Human trk receptors and neurotrophic factor inhibitors |
| EP0760098A4 (en) * | 1994-06-09 | 1997-07-16 | Univ Bar Ilan | DIAGNOSIS OF THE PATHOLOGICAL PHASE OF ALZHEIMER'S DISEASE BASED ON CYONKIN SECRETIONS BY MONONUCLEAR CELLS |
| US5601820A (en) * | 1994-07-07 | 1997-02-11 | Children's Hospital Of Philadelphia | Compositions and methods of making and using human full length TRK-B |
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| ES2152900B1 (es) * | 1999-07-23 | 2001-08-16 | Palleja Xavier Estivill | Ratones transgenicos y modelo de sobreexpresion del gen ntrk3 (trkc) basado en los mismos para el estudio y monitorizacion de tratamientos de la ansiedad, depresion y enfermedades psiquiatricas relacionadas. |
| JP4669984B2 (ja) * | 2001-01-19 | 2011-04-13 | ベジェニクス リミテッド | 腫瘍画像化のターゲットとしてのＦ１ｔ４（ＶＥＧＦＲ−３）および抗腫瘍療法 |
| AR053401A1 (es) * | 2005-06-06 | 2007-05-02 | Wyeth Corp | Anticuerpos monoclonales anti- trkb y usos de los mismos |
| EP3693381A1 (en) | 2013-02-18 | 2020-08-12 | Vegenics Pty Limited | Ligand binding molecules and uses thereof |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5231001A (en) * | 1991-03-14 | 1993-07-27 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Trk tyrosine kinase receptor is the physiological receptor for nerve growth factor |
| ZA922947B (en) * | 1991-04-23 | 1993-01-27 | Regeneron Pharma | Assay systems for neurotrophin activity |
-
1991
- 1991-03-14 US US07/668,298 patent/US5231001A/en not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-03-16 EP EP9292908266A patent/EP0575498A4/en not_active Ceased
- 1992-03-16 AU AU15551/92A patent/AU652624B2/en not_active Ceased
- 1992-03-16 CA CA002106080A patent/CA2106080C/en not_active Expired - Fee Related
- 1992-03-16 JP JP4507887A patent/JP2561604B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1992-03-16 WO PCT/US1992/002112 patent/WO1992016559A1/en not_active Application Discontinuation
- 1992-05-29 US US07/890,713 patent/US6071709A/en not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄ），３５０（６３１４），Ｐ．１５８−１６０，１９９１ |
| Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，８５（１８），Ｐ．６７８８−９１，１９８８ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH06500792A (ja) | 1994-01-27 |
| AU1555192A (en) | 1992-10-21 |
| CA2106080A1 (en) | 1992-09-15 |
| EP0575498A1 (en) | 1993-12-29 |
| US5231001A (en) | 1993-07-27 |
| AU652624B2 (en) | 1994-09-01 |
| WO1992016559A1 (en) | 1992-10-01 |
| CA2106080C (en) | 1998-09-15 |
| US6071709A (en) | 2000-06-06 |
| EP0575498A4 (en) | 1994-10-19 |
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| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |