KR20070094777A

KR20070094777A - 심혈관 질환의 치료를 위한 ｔｒｐｃ 채널의 용도

Info

Publication number: KR20070094777A
Application number: KR1020077015982A
Authority: KR
Inventors: 카르스텐 슈트뤼빙
Original assignee: 사노피-아벤티스
Priority date: 2005-01-12
Filing date: 2005-12-23
Publication date: 2007-09-21
Also published as: WO2006074802A1; US20110021377A1; CN101098709B; EP1838334A1; JP2008526905A; IL184316A0; BRPI0519807A2; US20110312874A1; US8193150B2; CN101098709A; AU2005324908A1; CA2593603A1; AU2005324908B2; US20080221025A1; US8030276B2; MX2007008428A

Abstract

본 발명은 심혈관 질환 치료용 의약의 제조를 위한, TRPC 채널, 이의 불활성화 돌연변이체 또는 TRPC 채널 또는 불활성화 돌연변이체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 용도 및 TRPC 채널 또는 이의 불활성화 돌연변이체의 조절제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

TRPC 채널, 불활성화 돌연변이체, 심혈관 질환, 죽상동맥경화증, TRPC 채널 조절제

Description

심혈관 질환의 치료를 위한 ＴＲＰＣ 채널의 용도{Use of a TRPC channel for the treatment of a cardiovascular disease}

죽상동맥경화증은 서구권에서 심혈관 질환의 주요 원인중 하나이다. 2001년에, 상기 질환은 미국에서 약 1백만명의 사망자의 원인이 되었다. 게다가, 개발도상국에서의 생활 방식의 변화로 인해서, 죽상동맥경화증 및 관련 심혈관 질환은 전세계적 유행병이 되고 있다. WHO는 심혈관 질환이 2010년까지 개발도상국에서의 주된 사망 원인이 될 것이라고 보고하고 있다.

따라서, 죽상동맥경화증을 예방 및 치료하는 신규 의약에 대한 상당한 의학적 요구가 있다. 죽상동맥경화증의 발생 및 진행은 다수의 후생학적 요인(예: 생활 방식, 영양, 운동) 및 유전적 요인에 의존하는 복잡하면서 완전하게 이해되지 못한 과정이다. 수많은 임상학적 관찰은 죽상동맥경화증의 병태생리학 및 죽종발생시 내부 혈관 벽에 정렬되어 있는 내피 세포의 기능부전을 암시한다[참조: Ross, R. N. (1999), Engl. J. Med. 340:115-126].

따라서, 내피 기능의 조절에 관여하는 단백질은 항-죽상동맥경화증 치료요법의 1차 표적이 된다. 산화질소(NO)의 생산과 같은 중요한 내피 기능이 세포내 Ca²⁺ 수준에 의해 조절되기 때문에 Ca²⁺-조절성 단백질이 특히 중요한 것으로 보인다.

이온 채널 단백질의 신규 부류인 TRPC 채널은 심혈관 및 기타 시스템에서 발현되는 Ca²⁺ 투과성 비-선택적 양이온 채널이다. 서열 상동성에 근거하여, TRPC3, TRPC6 및 TRPC7은 개별적 TRPC 서브패밀리(subfamily)를 구성한다. 발현 시스템에서, 이들 채널은 G 단백질 커플링된 수용체 또는 세포내 Ca²⁺ 저장량의 고갈에 의해 활성화된다[참조: Clapham et al. (2001), Nat. Rev. Neurosci. 2:387-396]. TRPC3은 또한 배양된 내피 세포 내의 산화적 스트레스-활성화된 양이온 전류에도 기여한다[참조: Balzer et al. (1999) Cardiovasc. Res. 42:543-549].

평활근 세포에서의 TRPC1의 기능적 역할을 연구하기 위해, WO 02/059155에서는 TRPC1의 특이적 에피토프에 대한 항체가 사용되었다. 그러나, 상기 에피토프는 다른 TRPC 채널에서는 발견되지 않는다. WO 05/049084에는 화합물 2-아미노에톡시디페닐보레이트(2-APB)를 사용한 분리된 랫트 심실 근육세포에 대한 기능적 연구가 기재되어 있다. 그러나, 상기 화합물은 특히 TRPC3에 대한 비특이적이고 의심스러운 효과를 보여준다[참조: van Rossum et al. (2000), J. Biol. Chem., 275, 28562-28568].

본 발명에 따라서, 본 발명자들은 유전적 접근법을 사용하여 죽상동맥경화증 토끼의 내피 세포에서 TRPC3, TRPC6 및 TRPC7 활성을 억제시켰다. 놀랍게도, 본 발명자들은 우성-음성(dominant-negative) TRPC3 유전자로 치료된 혈관에서 혈관 기능의 급격한 향상 및 죽상동맥경화증의 조직학적 마커의 감소를 발견하였는데, 이는 TRPC 채널, 특히 상기 언급한 채널들의 활성의 억제가 항-죽상동맥경화증 효과를 나타냄을 의미한다. 이러한 발견은 TRPC 채널과 죽상동맥경화증과 같은 심혈관 질환 사이의 신규한 연관성을 확립시킨다.

따라서, 본 발명의 하나의 주제는 심혈관 질환, 특히 죽상동맥경화증의 치료용 의약의 제조를 위한, TRPC 채널, 이의 불활성화 돌연변이체, TRPC 채널 또는 불활성화 돌연변이체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 용도에 관한 것이다.

바람직한 TRPC 채널은 TRPC3 채널, TRPC6 채널 또는 TRPC7 채널, 특히 TRPC3 채널 또는 TRPC6 채널, 특히 TRPC3 채널이다.

해당 아미노산 서열은 서열번호 1(TRPC3), 서열번호 5(TRPC6) 및 서열번호 9(TRPC7), 특히 TRPC3 채널을 암호화하는 아미노산 서열인 서열번호 1이다. 해당 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 2(TRPC3), 서열번호 6(TRPC6) 및 서열번호 10(TRPC7), 특히 TRPC3 채널을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열인 서열번호 2이다.

본 발명에 따라서, "불활성화 돌연변이체"란 용어는 양이온 채널로서 기능적으로 불활성이지만, 상동인 천연 발생 TRPC 채널의 채널 활성을 억제할 수 있는 돌연변이체를 의미한다. 억제는 천연 다량체성 채널 어셈블리내의 상동성 TRPC 채널 서브유닛을 대체함으로써 달성할 수 있으며, 이때 세포 막 내의 본질적으로 모든 천연 발생 채널이 돌연변이체 채널 서브유닛을 함유하거나 돌연변이체 채널로 전체적으로 대체되는 효과가 나타난다. 채널 서브유닛이 불활성화되게 하는 돌연변이는 바람직하게는 TRPC3의 기공 영역(서열번호 1의 아미노산 603 내지 645), TRPC6의 기공 영역(서열번호 5의 아미노산 660 내지 705) 및 TRPC7의 기공 영역(서열번호 9의 아미노산 610 내지 650)내에 위치한다. 구체적 예는 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 돌연변이체 TRPC3 채널(TRPC3^DN), 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 돌연변이체 TRPC6 채널(TRPC6^DN) 및 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 돌연변이체 TRPC7 채널(TRPC7^DN)이다. TRPC3^DN을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 4의 뉴클레오타이드 서열이고, TRPC6^DN을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 8의 뉴클레오타이드 서열이고, TRPC7^DN을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 12의 뉴클레오타이드 서열이다. 특히 바람직한 예는 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 우성-음성 돌연변이체 TRPC3^DN이다. TRPC3^DN을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 4의 뉴클레오타이드 서열이다.

게다가, "불활성화 돌연변이체"는 단백질 합성중 임의의 단계에서 천연 발생 TRPC 채널과 상호작용하거나 원형질막으로 수송됨으로써 천연 발생 TRPC 채널의 기능을 억제하는 능력을 보유하는 TRPC3, TRPC6 또는 TRPC7의 임의의 부분으로 이루어질 수 있다. 이러한 부분은 예를 들면, TRPC3(서열번호 1)의 아미노산 0 내지 302번일 수 있다[참조: Balzer et al. (1999) Cardiovasc. Res. 42:543-549].

불활성화 돌연변이체는 본원 실시예에서 예시적으로 기술하는 바와 같은 전세포 패치 클램프(whole cell patch clamp) 방법을 사용하여 검출 및/또는 분석할 수 있다.

본 발명의 다른 주제는 심혈관 질환, 특히 죽상동맥경화증의 치료용 의약으로서 TRPC 채널 조절제, 특히 억제제를 찾아내기 위한, TRPC 채널, 이의 불활성화 돌연변이체, 또는 TRPC 채널 또는 불활성화 돌연변이체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 용도에 관한 것이다.

바람직한 TRPC 채널은 앞서 상세히 기술한 TRPC3 채널, TRPC6 채널 또는 TRPC7 채널, 특히 TRPC3 채널이다.

일반적으로, TRPC 채널, 이의 불활성화 돌연변이체, 또는 TRPC 채널 또는 불활성화 돌연변이체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 시험 화합물과 접촉시키고, TRPC 채널, 이의 불활성화 돌연변이체, 또는 TRPC 채널 또는 불활성화 돌연변이체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 대한 상기 시험 화합물의 영향을 측정 또는 검출한다.

본 발명에 따라서, "TRPC 채널 조절제"란 용어는 TRPC 채널을 조절하는 분자("조절제"), 특히 억제성 또는 활성화 분자("억제제" 또는 "활성화제"), 특히 본 발명의 검정법에 따라 동정될 수 있는 TRPC 채널의 억제제이다. 억제제는 일반적으로, 예를 들면, 앞서 바람직하게는 상세히 기술한 바와 같은 TRPC 채널 중 하나 이상에 결합하거나, 이의 활성을 부분적으로 또는 전체적으로 차단하거나, 감소시 키거나, 방지하거나, 활성화를 지연시키거나, 불활성화시키거나, 탈감작화시키거나, 이의 활성 또는 발현을 하향 조절하는 화합물이다. 활성화제는 일반적으로 앞서 바람직하게는 상세히 기술한 바와 같은 TRPC 채널 중 하나 이상을 증가시키거나, 개방시키거나, 활성화시키거나, 촉진하거나, 이의 활성화를 증진시키거나, 감작시키거나, 효능화시키거나, 이의 활성 또는 발현을 상향 조절하는 화합물이다. 이러한 조절제는 TRPC 채널의 유전적으로 변형된 버젼, 바람직하게는 TRPC 채널의 불활성화 돌연변이체, 예를 들면, TRPC3^DM, 및 천연발생 또는 합성 리간드, 길항제, 효능제, 펩타이드, 사이클릭 펩타이드, 핵산, 항체, 안티센스 분자, 리보자임, 소형 유기 분자 등을 포함한다.

TRPC 채널 활성을 측정법의 예는

(a) TRPC 채널을 발현하는 형광 세포를 접촉시키는 단계,

(b) 형광 세포와 조절제 또는 시험 화합물을 접촉시키기 전, 접촉과 동시에 또는 접촉시킨 후 채널 활성화제를 사용하여 Ca²⁺ 유입을 자극하는 단계 및

(c) 형광에서의 변화를 측정 또는 검출하는 단계를 포함하는 검정법이다.

당해 검정의 추가의 상세사항 및 대안적 또는 바람직한 양태는 하기 및 본원의 실시예에서 기술된다.

따라서, 본 발명의 또 다른 주제는

(a) TRPC 채널 또는 이의 불활성화 돌연변이체를 발현하는 세포를 접촉시키는 단계,

(b) 세포와 시험 화합물을 접촉시키기 전, 접촉과 동시에 또는 접촉시킨 후 채널 활성화제를 사용하여 Ca²⁺ 유입을 자극하는 단계 및

(c) TRPC 채널 활성의 변화를 측정 또는 검출하는 단계를 포함하는, TRPC 채널, 이의 불활성화 돌연변이체, 또는 TRPC 채널 또는 불활성화 돌연변이체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 조절제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

바람직한 양태에서, 당해 방법은 (d) 심혈관 질환에 대한 활성을 갖는 시험 화합물을 당해 시험 화합물의 부재하에서의 TRPC 채널 활성의 변화와 비교함으로써 선별하는 단계를 추가로 포함한다.

다른 바람직한 양태에서, 세포내에서의 TRPC 채널 또는 이의 불활성화 돌연변이체의 발현은 유도성 프로모터, 바람직하게는 테트라사이클린 유도성 프로모터로부터 선택되는 프로모터에 의해 제어된다.

특히 바람직한 양태에서, 세포는 예를 들면, 하기 추가로 기술하는 바와 같은 형광 세포이다.

본 발명에 따른 바람직한 세포 또는 세포주는 MDCK, HEK 293, HEK 293 T, BHK, COS, NIH3T3, Swiss3T3 또는 CHO 세포, 특히 HEK 293 세포주이다.

TRPC 채널 활성은, 예를 들면, 패치 클램프 기술, 전세포 전류(whole cell current), 방사선표지된 이온 유입에 의해 이온 유입, 특히 Ca²⁺ 유입에서의 변화를 측정 또는 검출하거나, 전압 민감성 염료 또는 이온-민감성 염료를 사용하여 특히 형광에서의 변화를 측정 또는 검출함으로써 측정 또는 검출할 수 있다[참조: Vestergarrd-Bogind et al. (1988), J. Membrane Biol., 88:67-75; Daniel et al. (1991) J. Pharmacol. Meth. 25:185-193; Hoevinsky et al. (1994) J. Membrane Biol., 137:59-70; Ackerman et al. (1997), New Engl. J. Med., 336:1575-1595; Hamil et al. (1981), Pflugers. Archiv., 391:185].

이러한 염료의 예로는 Di-4-ANEPPS(피리디늄 4-(2(6-(디부틸아미노)-2-나프탈레닐)에테닐)-1-(3-설포프로필)하이드록사이드), CC-2-DMPE(1,2-디테트라데카노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 트리에틸암모늄), DiSBAC2(비스-(1,2-디바비투르산)-트리메틴 옥사놀), DisBAC3((비스-(1,3-디바비투르산)-트리메틴 옥사놀), SBFI-AM(1,3-벤젠디카복실산,4,4'-[1,4,10-트리옥사-7,13-디아자사이클로펜타데칸-7,13-디일비스(5-메톡시-6,12-벤조푸란디일)]비스-(테트라키스-[(아세틸옥시)메틸]에스테르)), fluo3am (1-[2-아미노-5-(2,7-디클로로-6-하이드록시-3-옥시-9-크산테닐)페녹시]-2-(2'-아미노-5'-메틸페녹시)에탄-N,N,N',N'-테트라아세트산), fluo4am (1-[2-아미노-5-(2,7-디클로로-6-하이드록시-4-옥시-9-크산테닐)페녹시]-2-(2'-아미노-5'-메틸페녹시)에탄-N,N,N',N'-테트라아세트산) 또는 fura2am (1-[2-(5'-카복시옥사졸-2'-일)-6-아미노벤조푸란-5-옥시]-2-(2'-아미노-5'-메틸-페녹시)-에탄-N,N,N',N'-테트라아세트산)가 포함된다.

채널 활성화제의 예로는 디아실글리세롤, 특히 1-올레일-2-아세틸-sn-글리세롤(OAG), 페닐에프린 및 특히 트립신과 같은 G_q-커플링된 수용체 효능제, 상피 성장 인자(EGF)와 같은 수용체 티로신 키나제를 자극하는 효능제 또는 포스포리파제 또는 이의 활성화제와 같은 디아실글리세롤 생성 효소가 있다.

채널 활성화제, 특히 OAG는 TRPC 채널의 간접적, 수용체-매개성 활성화와 비교하여 본 발명의 검정법의 부가적 이점이 되는 TRPC 채널의 직접적 자극을 위해 사용될 수 있는데, 그 이유는 예를 들면 본 발명의 검정법에서는 위양성률 결과가 실질적으로 감소되기 때문이다.

일반적으로, 예를 들면, 상기 기술한 바와 같은 유도성 프로모터하에 TRPC 채널 또는 이의 불활성화 돌연변이체를 발현하는 세포가 제공된다. 이러한 세포는 당업자에게 공지되어 있고 본원 실시예에서 기술하는 바와 같은 방법을 사용하여 생산할 수 있다. TRPC 채널 또는 이의 불활성화 돌연변이체의 발현을 유도한 후, 세포를 일반적으로 예를 들면, 미세역가 플레이트로 플레이팅하고 성장시킨다. 일반적으로, 세포는 다중웰 플레이트의 하부에서 성장하고 고정된다. 이후에 세포를 일반적으로 세척하고, 적합한 부하 완충액 중의 형광 염료, 바람직하게는 fluo4am과 같은 형광 염료를 부하한다. 부하 완충액을 제거한 후, 세포를 예를 들면, 화학적 화합물 라이브러리의 형태의 시험 화합물 또는 조절제, 특히 상기 기술한 생화학적 또는 화학적 시험 화합물과 함께 항온처리한다. 형광성 영상화 플레이트 판독기(Fluorescense Imaging Plate Reader; FLIPR)를 사용하여 Ca²⁺를 측정한다. TRPC 채널을 통한 Ca²⁺ 유입을 자극하기 위해, OAG와 같은 채널 활성화제를 일반적으로 적용해야 한다.

TRPC 채널의 대안적 활성화 방식으로서, G_q-커플링된 수용체 효능제로서 트립신을 적용할 수 있다.

억제제의 예상되는 효과는 예를 들면, 형광성 증가의 감소일 것이다. 활성화제는 예를 들면, 활성화제-유발된 형광성을 추가로 증가시키거나, 예를 들면, 활성화제-독립적 형광성 증가를 유도할 수 있다.

이후에, 적합한 조절제, 특히 억제제를 분석 및/또는 분리할 수 있다. 화학적 화합물 라이브러리의 스크리닝을 위해, 당업자에게 공지되어 있거나 시판되는 고처리량 검정의 사용이 바람직하다.

본 발명에 따라서, "화학적 화합물 라이브러리"는 화학적으로 합성된 분자 및 천연 산물 또는 조합적 화합물 라이브러리를 포함하여, 다수의 공급원 중 어느 하나로부터 어셈블리된 다수의 화학적 화합물을 의미한다.

유리하게도, 본 발명의 방법은 어레이(array) 및/또는 예를 들면, 미세유체역학을 사용한, 즉 채널식 구조화된 로봇식 플레이팅 및 로봇식 액체 수송 시스템을 포함하는 로봇식 시스템에서 수행한다.

본 발명의 다른 양태에서, 당해 방법은 고처리량 스크리닝 시스템의 형태로 수행한다. 이러한 시스템에서, 유리하게도 스크리닝 방법은 자동화되고 소형화되며, 특히 로봇에 의해 제어되는 소형화된 웰 및 미세유체역학을 사용한다.

특히 바람직한 양태에서, 본 발명의 검정/방법은 앞서 상세히 기술한 바와 같은 유도성 프로모터의 제어하에 TPRC 채널의 유전자를 함유하는 세포주에서 수행하며, 이때 채널 활성화제는 가용화된다. 예를 들면, 바람직하게는 활성화제 OAG는 혈청 알부민, 예를 들면, 소 혈청 알부민 또는 플루톤산의 존재하에 가용화된다.

본 발명의 다른 주제는

(a) 상기 언급한 바와 같은 방법을 수행하는 단계,

(b) 심혈관 질환, 특히 죽상동맥경화증의 치료에 적합한 검출된 시험 화합물을 분리하는 단계 및

(c) 검출된 시험 화합물을 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 보조제 물질과 함께 제형화하는 단계를 포함하는, 죽상동맥경화증의 치료용 의약을 제조하는 방법에 관한 것이다.

약제학적으로 허용되는 담체 또는 보조제 물질은 예를 들면, 생리학적 완충 용액, 예를 들면, 염화나트륨 용액, 탈염수, 안정화제(예: 프로테아제 또는 뉴클레아제 억제제), 격리제(예: EDTA)이다.

다음 도면, 서열 및 실시예는 본 발명의 범주를 제한하지 않으면서 본 발명을 설명한다.

도 1A 및 1B는 TRPC3^DN가 기능적 이온 전류를 운반하지 않음을 도시한 것이다.

도 2A 및 2B는 TRPC3 및 TRPC6에 대한 TRPC3^DN의 우성-음성 효과를 도시한 것이다.

도 3은 죽상동맥경화증 토끼의 경동맥내 아세틸콜린-유도된 혈관반응성에 대 한 TRPC3^DN의 효과를 도시한 것이다.

도 4는 TRPC3^DN의 발현 경동맥 절편내의 유동-유도된 혈관반응성의 초음파촬영술 평가를 도시한 것이다.

도 5는 TRPC3^DN 발현 경동맥 절편내의 죽상동맥경화성 플라크의 크기를 도시한 것이다.

도 6은 죽상동맥경화성 경동맥의 평균 대식세포 밀도에 대한 TRPC3^DN 발현의 효과를 도시한 것이다.

도 7A 및 7B는 FLIPR 기술을 사용한, 유도성 TRPC3 및 TRPC6 세포주에서의 OAG-활성화된 Ca²⁺ 시그날의 검출을 도시한 것이다.

도 8A 및 8B는 FLIPR 검정을 사용한 경우에 독시사이클린-유도된 세포주에서 SKF 96365에 의한 TRPC3 및 TRPC6 억제의 IC₅₀를 예시한 것이다.

서열의 설명

서열번호 1은 TRPC3의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.

서열번호 2는 TRPC3을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 나타낸 것이다.

서열번호 3은 우성-음성 TRPC3 채널(TRPC3^DN)의 완전한 아민노산 서열을 나타낸 것이다(돌연변이된 아미노산 서열은 볼드체로 표시한다).

서열번호 4는 TRPC3^DN의 완전한 뉴클레오타이드 서열을 나타낸 것이다(돌연 변이된 뉴클레오타이드는 볼드체로 표시한다).

서열번호 5는 TRPC6의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.

서열번호 6은 TRPC6을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 나타낸 것이다.

서열번호 7은 우성-음성 TRPC6 채널(TRPC6^DN)의 아미노산 서열을 나타낸 것이다(돌연변이된 아미노산 서열은 볼드체로 표시한다).

서열번호 8은 TRPC6^DN의 완전한 뉴클레오타이드 서열을 나타낸 것이다(돌연변이된 뉴클레오타이드 서열은 볼드체로 표시한다).

서열번호 9는 TRPC7의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.

서열번호 10은 TRPC7을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 나타낸 것이다.

서열번호 11은 우성-음성 TRPC7 채널(TRPC7^DN)의 아미노산 서열을 나타낸 것이다(돌연변이된 아미노산 서열은 볼드체로 표시한다).

서열번호 12는 TRPC7^DN의 완전한 뉴클레오타이드 서열을 나타낸 것이다(돌연변이된 뉴클레오타이드는 볼드체로 표시한다).

1. TRPC3^DN의 작제 및 기능적 특성

시험관내 및 생체내에서 TRPC 채널 기능을 연구하기 위해, 본 발명자들은 우성-음성 채널 돌연변이체를 사용하여 음성 TRPC 채널 활성을 조절하였다. TRPC 채 널에 대한 이러한 접근법의 적절성은 이미 입증되었다[참조: Hofmann et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. -U.S.A., 99, 7461-7466]. 본 발명자들은 부위 지시된 돌연변이유발법에 의해 야생형 사람 TRPC3(NP_003296)의 아미노산 621 내지 623을 알라닌으로 교환하여 우성-음성 TRPC3 채널(TRPC3^DN)을 생성시켰다. 삽입체를 게이트웨이(gateway) 기술(Invitrogen, Karlsruhe, Germany)을 사용하여 변형된 pcDNA3 벡터 골격으로 클로닝하였다.

안정하게 무스카린 M₁-수용체를 발현하는 HEK 293 세포주(HM1 세포)를 본 연구에서 사용하였다[참조: Peralta et al. (1988) Nature, 334, 434-437]. 세포를37℃에서 5.5% CO₂중에서 10% 태소 혈청, 2mM 글루타민, 100 U/ml 페니실린, 100 mg/ml 스트렙토마이신(Invitrogen, Karlsruhe, Germany)이 보충된 DMEM/F12(1:1) 배지내에서 성장시켰다. G418(0.5 mg/ml)를 상기 성장 배지에 부가하였다. hTRPC3(U47050), hTRPC6(AF080394), TRPC3^DN 및 eGFP(pEGFP-N1, 제조원: BD Biosciences, Palo Alto, CA) 또는 상기 채널 단백질들의 YFP-태그된 버젼에 대한 cDNA를 제조업자의 지침에 따라서 리포펙타민(LipofectAMINE) 2000(제조원: Invitrogen, Karlsruhe, Germany)을 사용하여 형질감염시켰다.

전기생리학적 실험을 위해, 세포를 35mm 디쉬내에서 명시된 양의 cDNA로 형질감염시키고, 형질감염한지 12 내지 24시간 후에 커버슬립상으로 플레이팅하였다. 세포를 플레이팅한지 24 내지 48시간 후에 사용하였다. 달리 명시하지 않는 한, 0.4㎍ eGFP를 패치-클램프 실험용 발현 마커로서 공동 형질감염시켰다.

전세포 전류를 실온에서 HEKA EPC 10 패치 클램프 증폭기 및 PULSE 소프트웨어(HEKA, Lambrecht, Germany)를 사용하여 형광 세포로부터 기록하였다. 표준 세포외 완충액 중에서 저항성이 2 내지 5MW인 패치 피펫을 바로실리케이트 유리로부터 잡아당겼다. 유지 전위를 -70mV로 설정하고 -100 내지 +60mv의 160ms 전압 경사 동안의 전류를 6.6 kHz로 샘플링하였다. 모든 기록을 2　kHz에서 필터링하였다.

표준 외부 완충액은 NaCl 140mM, KCl 5.4mM, CaCl₂ 2mM, MgCl₂ 1mM, 글루코스 10mM, HEPES 10mM를 함유하였고, pH를 NaOH를 사용하여 7.4로 조절하였다. 표준 피펫 완충액은 CsOH 120mM, 글루콘산 120mM, MgCl₂ 2mM, CaCl₂ 3mM, Cs₄-BAPTA 5mM, HEPES 10mM를 함유하였고, pH를 글루콘산을 사용하여 7.3로 조정하였다. CaBuf 프로그램(G. Droogmans, KU Leuven)을 사용하였을 때 유리 [Ca²⁺]는 약 200nM인 것으로 계산되었다. 10μM 카바콜을 적용하여 수용체-활성화된 전류를 HM1 세포에서 유도하였다.

모든 통계학적 데이타는 평균±SEM으로 표시한다. 통계학적 분석을 SigmaStat(SPSS, Chicago, IL)을 사용하여 수행하였다. 결과를 수집하고 만-위트니(Mann-Whitney) 순위합검정을 사용하여 분석하였다. 유의 수준은 0.05 미만의 p로 설정하였다.

1.1 TRPC3^DN은 기능적 이온 전류를 운반하지 않는다.

TRPC3^DN이 음성 TRPC 채널 조절제로서 작용함을 확립하기 위해, 당해 채널 돌연변이체의 기능적 특성을 전세포 패치 클램프로 조사하였다.

3㎍ TRPC3 또는 TRPC3^DN로 형질감염된 HM1로부터의 대표적 전류 기록은 도 1A 및 1B에 도시한다. TRPC 전류는 아세틸콜린 수용체 효능제 카바콜(10μM)에 의해 유도되었다. 전류를 카바콜 전에(con) 및 카바콜의 존재하에(carb) 기록하였다.

평균적으로 TRPC3^DN 발현 세포의 전류 밀도(1.3 pA/pF, n = 11)는 음성 대조군으로서 LacZ로 형질감염된 세포의 전류 밀도(1.2 pA/pF, n = 10)와 상이하지 않았다.

도 1A 및 1B에 도시된 기록에 따르면, 음성 대조군으로서 TRPC3로 형질감염된 세포는 유의적으로 큰 전류 밀도(11.2 pA/pF, n = 11; p < 0.001)를 나타냈다. 따라서, TRPC3^DN은 현저한 이온 전류를 운반하지 않았다.

이전의 연구들은 TRPC3가 서로 직접 상호작용할 뿐만 아니라 TRPC6 및 TRPC7 와 직접 상호작용함을 시사한다[참조: Hofmann et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 99, 7461-7466]. 따라서, TRPC3^DN의 조절 효과를 야생형 TRPC3 및 TRPC6 채널과의 공동 발현으로 시험하였다.

1.2 TRPC3 및 TRPC6에 대한 TRPC3^DN의 우성-음성 효과

도 2A에 따라서, HM1 세포를 대조군으로서 7㎍ TRPC3-YFP 및 7㎍ LacZ(흰색 막대) 또는 7㎍ TRPC3^DN(회색 막대)로 공동 형질감염시켰다. 도 2B에 따라서, HM1 세포를 도 2A에서와 같이 7㎍ TRPC6-YFP 및 LacZ 또는 TRPC3^DN로 공동 형질감염시켰다.

카바콜-유도된 전류를 -70 mV에서 측정하고 세포 정전용량에 대해 표준화시켰다. TRPC3^DN은 TRPC3 및 TRPC6 둘다를 통한 전류를 유의적으로(^***p<0.001) 억제하였다.

2. 생체내 TRPC3^DN의 항-죽상동맥경화증 효과

도 2A 및 2B에 도시된 바와 같이, TRPC3^DN은 TRPC3 및 TRPC6 채널에 대한 우성-음성 효과를 부여하였다. 서열 상동성 및 이전의 보고서[참조: Hofmann et al. (2002), supra]에 근거하여, 상동 TRPC7 채널도 TRPC3^DN에 의해 억제되는 것으로 추측될 수 있다. 따라서, 죽상동맥경화증에 미치는 TRPC3^DN 발현 및 이에 따른 TRPC3, TRPC6 및 TRPC7의 억제의 효과를 조사하기 위해, TRPC3^DN의 죽상동맥경화증 토끼의 혈관으로의 바이러스성 유전자 전달을 사용하였다.

경동맥을 TRPC3^DN 또는 대조군으로서 eGFP을 보유한 바이러스로 감염시켰다. 유전자 전달 8주 후에, 질환 상태를 기능적 파라메터 및 조직학적 파라메터로 평가하였다.

2.1 바이러스 생성 및 동물 연구

TPRC3의 우성 음성 돌연변이체를 발현하는 아데노바이러스를 대규모로 생성시키고 증폭시키고 정제하였다. 이어서, 서열의 정확성을 DNA 서열분석(Medigenomix, Martinsried, Germany)으로 점검하고, 단백질의 특이적 발현을 웨스턴 블롯팅으로 확인하였다.

20주령의 흰색 뉴질랜드 토끼에게 1% 콜레스테롤 + 5% 옥수수유를 함유한 식이를 공급하였다. 공급 1주 후, 전이유전자 발현을 카테터-기반 바이러스성 유전자 전달(하기 참조)로 유도하였다. 전체 실험 과정 동안에 콜레스테롤 공급을 지속하였다. 각 그룹에서 8마리 이상의 동물을 독립적으로 조사하였다.

혈청 콜레스테롤 수준을 공급 개시 전, 유전자 전달 직전, 유전자 전달 2, 4 및 8주 후에 평가하였다. 측정을, 수의사 혈청 측정에 대해 전문화된 적정성이 검증된 실험실(Synlab, Augsburg, Germany)에서 수행하였다. 또한, LDL 및 HDL 소분획을 표준 기술을 사용하여 측정하였다. 측정된 모든 시점에서(n= 각 그룹마다 8), TRPC3^DN 수용 동물과 대비하여 대조군에서 혈청 콜레스테롤, LDL- 또는 HDL 콜레스테롤에 대해 유의적 차이는 관찰되지 않았다(p > 0.05).

2.2 경동맥으로의 내피 유전자 전달

경동맥으로의 유전자 전달을 위해, 경부 중앙을 절개하고 좌측 총경동맥을 노출시켰다. 2개의 소형 비외상 클립(BIEMER 혈관 클립, FD 561 R)을 사용하여 4cm의 절편을 분리하였다. 약 0.2 ml TRPC3^DN 또는 eGFP 바이러스 용액(역가 10¹⁰ pfu)를 소형 바늘(0.4×20)을 사용하여, 상기 분리된 절편내로 주사하였다. 항온처리 시간은 20분이었다. 이어서, 클립을 제거하고 혈액 순환을 회복시켰다. 경부 상처를 봉합하고, 동물을 회복되게 하였다. 수술후 72시간 동안 토끼를 진통시켰다(Temgesic^R 부프레노르핀 0.01 mg/kg, 매 12시간마다 피하).

2.3 내피 혈관반응성의 측정

실험 말기에, 유전자 전달 8주 후에, 기저 혈관 직경 및 아세틸콜린-유도된 혈관반응성을 경동맥의 고해상도 초음파로 측정하였다.

내강 혈관 직경의 생체내 측정을 TRPC3^DN(빗금친 막대) 또는 eGFP(흰색 막대)로 형질감염된 죽상동맥경화증 토끼 및 건강한(비-죽상동맥경화증) 토끼(검은색 막대)의 경동맥 절편에서 수행하였다(도 3). 아세틸콜린-유도된 혈관반응성을 아세틸콜린의 소정의 용량을 주사한 후 매분마다 4회 측정하였다. TRPC3^DN 발현은 eGFP 발현 절편과 비교해 아세틸콜린-유도된 혈관반응성을 유의적으로 향상시켰다(*** p<0.001). 혈관반응성의 감소는 건강한 대조군과 대비하여 eGFP 발현 절편에서 관찰되었다(# p<0.01).

두번째 실험 세트에서는, 염화나트륨 용액 투여에 대한 반응으로서 유동-유도된 혈관반응성을 시험하였다(도 4).

경동맥 절편의 내강 혈관 직경을 TRPC3^DN(빗금친 막대) 또는 eGFP(흰색 막대)로 형질감염된 죽상동맥경화증 토끼 및 건강한(비-죽상동맥경화증) 토끼(검은색 막대)에서 측정하였다. 유동-유도된 혈관반응성을 100ml 염화나트륨 용액(5분에 걸쳐 적용됨)을 투여하는 동안 시험하였다. 80ml를 주입한 후와 전체 용적을 적용한지 1 내지 2분 후에 측정된 측정치를 도시한다. TRPC3^DN 발현은 eGFP 발현 절편과 비교해 유동-유도된 혈관반응성을 유의적으로 향상시켰다(** p<0.01).

2.4 죽상동맥경화증의 조직학적 마커의 측정

질환 진행을 조직학적으로 평가하기 위해, 동물에게 헤파린을 주사하고 희생시켰다. 경동맥을, 후두개에서 멀리, 흉골로부터 1cm 떨어진 곳에서 절개하였다. 혈관을 염수로 플러싱하고, 조심스럽게 건조시키고, 쇼크 동결시켰다. GFP 발현, HE 및 반기슨 염색 및 면역조직화학의 조사를 위해 중앙 부분으로부터 동맥 조각을 절개하였다.

동맥의 나머지는 지질 플라크를 검출하기 위한 수단 마크로염색(Sudan macrostaining)을 위해 사용하였다. 이러한 목적으로, 혈관을 2분 동안 염수로 관류시키고 중앙에서 종방향으로 절단한 후 수단 적색 염색제를 직접 도입하였다. 이후에, 혈관을 수단 염색 용액(알콜 및 아세톤에 용해된 수단 III)으로 옮겼다.

수단 적색 염색으로 상대적 플라크 크기를 측정한 다음에, TRPC3^DN 또는 eGFP로 형질감염된 경동맥 절편의 조직학적 영상 분석을 수행하였다. TRPC3^DN이 (좌측 동맥에) 투여된 토끼로부터의 우측 경동맥을 미처리된 대조군으로서 평가하였다. TRPC3^DN은 eGFP (**p < 0.01) 및 미처리된(*p < 0.05) 대조군 둘다와 대조적으로 플라크 크기를 감소시켰다.

죽상동맥경화증 진행의 또 다른 마커로서, 혈관 내막의 대식세포 침윤을 면역세포화학으로 연구하였다. 조직학적 염색을 위해, 6㎛ 절편을 지방을 제거하여 준비한 모든 혈관의 중앙으로부터 절단하였다. 상기 절편을 실온에서 10분 동안 아세톤으로 고정시키고 공기 건조시켰다. 이어서, 절편을 100% 메탄올 중에서 5분 동안 0.6% H₂O₂을 사용하여 투과성이 되게 하고, PBS로 3회 세척하고, 20% 토끼 혈청과 함께 항온처리하였다. 그 다음, 절편을 20℃에서 20 내지 30분 동안 항-대식세포 모노클로날 항체(1:100, 클론 RAM-11, DAKO, Hamburg, Germany)와 함께 항온처리하고, 다시 PBS로 3회 세척하였다. 이어서, 절편을 ABC 시약과 함께 30분 동안 항온처리하고, PBS로 세척하고, 디아미노벤지딘 및 H₂O₂로 10분 동안 염색하였다. 이어서, 해리스/헤마톡실린/에오신으로 대조염색하였다. 표준화된 계수 방법을 사용하여, 고배율(전형적으로 600배)하에 각 슬라이드에서 혈관 내막내의 단일 양성 세포를 직접 계수하여 분석을 수행하였다(도 6).

대식세포를 TRPC3^DN 또는 eGFP를 발현하는 경동맥의 내막 층에서 면역세포화학으로 동정하였다. TRPC3^DN은 eGFP 발현 혈관과 비교해 대식세포 침윤을 유의적으 로 감소시켰다(*p < 0.05).

3. TRPC3, TRPC6 및 TRPC7 조절제의 고처리량 동정을 위한 검정

TRPC 채널 조절제의 동정용 검정을 개발하기 위해, 재조합 HEK 293 세포주를 유도성 프로모터의 제어하에 TRPC3(수탁번호 U47050) 또는 TRPC6(수탁번호 AF080394) cDNA를 발현하는 Flp-In T-REx 시스템(Invitrogen, Karsruhe, Germany)을 사용하여 생성시켰다. 채널 cDNA을 표준 기술로 증폭시키고 pcDNA5/FRT/TO(Invitrogen, Karlsruhe, Germany)내로 클로닝시켰다. Flp-In T-Rex 293 세포를 채널 작제물로 형질감염시킨 후, 안정한 세포주를 하이그로마이신으로 선별하였다. 세포를 제조업자의 지침에 따라서 유지시키고, 20 내지 30시간 동안 1㎍/ml 독시사이클린을 부가하여 세포의 채널 발현을 유도하였다. 세포를 실험하기 20 내지 30시간 전에 96웰 폴리-d-라이신 피복된 흑색 벽의 투명한 바닥의 미세역가 플레이트(BD Biosciences, Bedford, MA)에 40000 내지 50000개 세포/웰로 플레이팅하였다. 이어서, 세포를 세척하고, 실온에서 30 내지 45분 동안 1x HBSS(#14065-049, Invitrogen), 1mM CaCl₂, 20mM HEPES, 0.02 % Pluronic F-127 (Molecular Probes) 및 0.05% 소 혈청 알부민(pH = 7.4)을 함유하는 완충액 중에서 2μM fluo4am(Molecular Probes, Eugene, OR)을 부하하였다. 부하 완충액을 제거하고, 세포를 시험 화합물과 함께 실온에서 10분 동안 항온처리하였다. 96웰 Fluorescence Imaging Plate Reader(FLIPR)(Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA)를 사용하여 Ca²⁺ 측정을 수행하였다. TRPC3 또는 TRPC6을 통한 Ca²⁺ 유입을 자극하기 위해, 본 발명자들은 채널 활성화제 1-올레일-2-아세틸-sn-글리세롤(OAG)[참조: Hofmann et al., 1999]을 30 내지 50μM의 최종 농도에서 적용하였다. OAG를 1x HBSS (#14065-049, Invitrogen), 1 mM CaCl₂, 20 mM HEPES, 0.02 % Pluronic F-127(Molecular Probes)(pH = 7.4)를 함유하는 완충액에 용해시키고 세포에 부가하였다. 대안으로, OAG를 1x HBSS (#14065-049, Invitrogen), 1 mM CaCl₂, 20mM HEPES 및 0.1% 소 혈청 알부민(pH = 7.4)을 함유하는 완충액에 용해시킬 수 있다.

도 7A 및 7B는 OAG가 독시사이클린-처리된 세포에서만 관찰되고, 비-유도된 세포에서는 관찰되지 않았음을 나타낸다. 따라서, 이러한 결과는 OAG-활성화된 Ca²⁺ 시그날이 각각 TRPC3 또는 TRPC6에 의해 특이적으로 매개됨을 입증한다.

fluo-4 부하된 세포에서의 형광 변화를 FLIPR II를 사용하여 측정하였다. 막대는 50μM OAG의 적용을 나타낸다. 각각 9개의 웰의 평균 형광 값±SEM이 도시된다. 형광 값을 평균 기준선 형광(F₀)에 대해 표준화시켰다.

TRPC3 또는 TRPC6의 조절제를 상기한 검정을 사용하여 동정하기 위해, 유도된 세포를 사용하였고, 시험 화합물을 OAG를 적용하기 전 또는 후에 웰에 부가하였다. 억제제의 예상되는 효과는 형광 증가의 감소일 수 있다. 채널 활성화제는 OAG-유발된 시그날을 추가로 증가시킬 수 있거나 OAG-독립적 형광 증가를 유도할 수 있다. SKF 96365 (1-(β-[3-(4-메톡시페닐)프로폭시]-4-메톡시펜에틸)-1H-이미다졸-HCl)은 TRPC3 및 TRPC6을 포함하는 비선택적 양이온 채널의 억제제로서 기술 된 바 있다[참조: Boulay et al. (1997), J. Biol. Chem., 272, 29672-29680; Zhu et al. (1998), J. Biol. Chem., 273, 133-142].

도 8A 및 8B에 도시된 바와 같이, SKF 96365는 TRPC3 발현 세포에서 1.8±0.12μM(n = 8)의 IC₅₀로 OAG-활성화된 형광 반응을 억제하였으며, TRPC6 발현 세포에서 5.04±0.17μM(n = 8)의 IC₅₀로 OAG-활성화된 형광 반응을 억제하였다. 따라서, 기재된 실시예는 TRPC3 및 TRPC6 조절제를 동정할 수 있는 당해 검정의 능력을 입증한다.

TRPC3- 및 TRPC6 발현 세포에서 30μM OAG에 의해 유도된 형광 변화를 소정의 농도의 SKF 96365의 존재하에 측정하였다. 평균 억제 값±SEM을 도시한다. 억제는 SKF 96365의 부재하에 대조군 형광의 %로서 표시한다. 용량-반응 곡선을 일반적 용량-반응 방정식에 핏팅(fit)시켰다. 스플라인(spline) 곡선은 복합 데이타에 대한 최적 적합을 나타낸다.

TRPC3 및 TRPC6 채널의 대안적 활성화 방식으로서, 프로테아제-활성화된 수용체 효능제 트립신(200nM)을 유도된 Flp-In T-REx-TRPC3 및 Flp-In T-REx-TRPC6 세포에 적용하였다. 이러한 처리는 TRPC3 또는 TRPC6의 자극을 위한 G_q-커플링된 수용체 효능제의 한 예이다. 적용 후 t = 60초에서, 트립신은 비유도된 대조군과 비교해, 유도된 Flp-In T-REx-TRPC3 및 Flp-In T-REx-TRPC6 세포에서 형광의 유의적으로 큰 증가를 유도하였다(표 1). 따라서, G_q-커플링된 수용체 효능제, 예를 들면, 트립신을 TRPC3 및 TRPC6 반응을 자극하기 위해 검정에서도 사용할 수 있다.

200 nM 트립신에 대한 반응으로서 유도된 및 비-유도된 Flp-In T-REx-TRPC3 및 Flp-In T-REx-TRPC6 세포에서의 형광 변화(F/F₀)

	Flp-In T-REx-TRPC3	Flp-In T-REx-TRPC6
유도됨	2.71 ±0.022 (n = 9)	2.26±0.05 (n = 12)
비유도됨	1.65 ±0,034 (n = 9)	0.88±0.009 (n = 12)

수치는 평균 ±SEM으로서 기재된다. 유도된 그룹 및 비유도된 그룹은 유의적으로 상이하다(p< 0.001, t-시험).

<110> SANOFI-AVENTIS <120> Use of a TRPC channel for the treatment of a cardiovascular disease <130> DE2005/002 <150> EP 05000440.7 <151> 2005-01-12 <160> 12 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 848 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Glu Gly Ser Pro Ser Leu Arg Arg Met Thr Val Met Arg Glu Lys 1 5 10 15 Gly Arg Arg Gln Ala Val Arg Gly Pro Ala Phe Met Phe Asn Asp Arg 20 25 30 Gly Thr Ser Leu Thr Ala Glu Glu Glu Arg Phe Leu Asp Ala Ala Glu 35 40 45 Tyr Gly Asn Ile Pro Val Val Arg Lys Met Leu Glu Glu Ser Lys Thr 50 55 60 Leu Asn Val Asn Cys Val Asp Tyr Met Gly Gln Asn Ala Leu Gln Leu 65 70 75 80 Ala Val Gly Asn Glu His Leu Glu Val Thr Glu Leu Leu Leu Lys Lys 85 90 95 Glu Asn Leu Ala Arg Ile Gly Asp Ala Leu Leu Leu Ala Ile Ser Lys 100 105 110 Gly Tyr Val Arg Ile Val Glu Ala Ile Leu Asn His Pro Gly Phe Ala 115 120 125 Ala Ser Lys Arg Leu Thr Leu Ser Pro Cys Glu Gln Glu Leu Gln Asp 130 135 140 Asp Asp Phe Tyr Ala Tyr Asp Glu Asp Gly Thr Arg Phe Ser Pro Asp 145 150 155 160 Ile Thr Pro Ile Ile Leu Ala Ala His Cys Gln Lys Tyr Glu Val Val 165 170 175 His Met Leu Leu Met Lys Gly Ala Arg Ile Glu Arg Pro His Asp Tyr 180 185 190 Phe Cys Lys Cys Gly Asp Cys Met Glu Lys Gln Arg His Asp Ser Phe 195 200 205 Ser His Ser Arg Ser Arg Ile Asn Ala Tyr Lys Gly Leu Ala Ser Pro 210 215 220 Ala Tyr Leu Ser Leu Ser Ser Glu Asp Pro Val Leu Thr Ala Leu Glu 225 230 235 240 Leu Ser Asn Glu Leu Ala Lys Leu Ala Asn Ile Glu Lys Glu Phe Lys 245 250 255 Asn Asp Tyr Arg Lys Leu Ser Met Gln Cys Lys Asp Phe Val Val Gly 260 265 270 Val Leu Asp Leu Cys Arg Asp Ser Glu Glu Val Glu Ala Ile Leu Asn 275 280 285 Gly Asp Leu Glu Ser Ala Glu Pro Leu Glu Val His Arg His Lys Ala 290 295 300 Ser Leu Ser Arg Val Lys Leu Ala Ile Lys Tyr Glu Val Lys Lys Phe 305 310 315 320 Val Ala His Pro Asn Cys Gln Gln Gln Leu Leu Thr Ile Trp Tyr Glu 325 330 335 Asn Leu Ser Gly Leu Arg Glu Gln Thr Ile Ala Ile Lys Cys Leu Val 340 345 350 Val Leu Val Val Ala Leu Gly Leu Pro Phe Leu Ala Ile Gly Tyr Trp 355 360 365 Ile Ala Pro Cys Ser Arg Leu Gly Lys Ile Leu Arg Ser Pro Phe Met 370 375 380 Lys Phe Val Ala His Ala Ala Ser Phe Ile Ile Phe Leu Gly Leu Leu 385 390 395 400 Val Phe Asn Ala Ser Asp Arg Phe Glu Gly Ile Thr Thr Leu Pro Asn 405 410 415 Ile Thr Val Thr Asp Tyr Pro Lys Gln Ile Phe Arg Val Lys Thr Thr 420 425 430 Gln Phe Thr Trp Thr Glu Met Leu Ile Met Val Trp Val Leu Gly Met 435 440 445 Met Trp Ser Glu Cys Lys Glu Leu Trp Leu Glu Gly Pro Arg Glu Tyr 450 455 460 Ile Leu Gln Leu Trp Asn Val Leu Asp Phe Gly Met Leu Ser Ile Phe 465 470 475 480 Ile Ala Ala Phe Thr Ala Arg Phe Leu Ala Phe Leu Gln Ala Thr Lys 485 490 495 Ala Gln Gln Tyr Val Asp Ser Tyr Val Gln Glu Ser Asp Leu Ser Glu 500 505 510 Val Thr Leu Pro Pro Glu Ile Gln Tyr Phe Thr Tyr Ala Arg Asp Lys 515 520 525 Trp Leu Pro Ser Asp Pro Gln Ile Ile Ser Glu Gly Leu Tyr Ala Ile 530 535 540 Ala Val Val Leu Ser Phe Ser Arg Ile Ala Tyr Ile Leu Pro Ala Asn 545 550 555 560 Glu Ser Phe Gly Pro Leu Gln Ile Ser Leu Gly Arg Thr Val Lys Asp 565 570 575 Ile Phe Lys Phe Met Val Leu Phe Ile Met Val Phe Phe Ala Phe Met 580 585 590 Ile Gly Met Phe Ile Leu Tyr Ser Tyr Tyr Leu Gly Ala Lys Val Asn 595 600 605 Ala Ala Phe Thr Thr Val Glu Glu Ser Phe Lys Thr Leu Phe Trp Ser 610 615 620 Ile Phe Gly Leu Ser Glu Val Thr Ser Val Val Leu Lys Tyr Asp His 625 630 635 640 Lys Phe Ile Glu Asn Ile Gly Tyr Val Leu Tyr Gly Ile Tyr Asn Val 645 650 655 Thr Met Val Val Val Leu Leu Asn Met Leu Ile Ala Met Ile Asn Ser 660 665 670 Ser Tyr Gln Glu Ile Glu Asp Asp Ser Asp Val Glu Trp Lys Phe Ala 675 680 685 Arg Ser Lys Leu Trp Leu Ser Tyr Phe Asp Asp Gly Lys Thr Leu Pro 690 695 700 Pro Pro Phe Ser Leu Val Pro Ser Pro Lys Ser Phe Val Tyr Phe Ile 705 710 715 720 Met Arg Ile Val Asn Phe Pro Lys Cys Arg Arg Arg Arg Leu Gln Lys 725 730 735 Asp Ile Glu Met Gly Met Gly Asn Ser Lys Ser Arg Leu Asn Leu Phe 740 745 750 Thr Gln Ser Asn Ser Arg Val Phe Glu Ser His Ser Phe Asn Ser Ile 755 760 765 Leu Asn Gln Pro Thr Arg Tyr Gln Gln Ile Met Lys Arg Leu Ile Lys 770 775 780 Arg Tyr Val Leu Lys Ala Gln Val Asp Lys Glu Asn Asp Glu Val Asn 785 790 795 800 Glu Gly Glu Leu Lys Glu Ile Lys Gln Asp Ile Ser Ser Leu Arg Tyr 805 810 815 Glu Leu Leu Glu Asp Lys Ser Gln Ala Thr Glu Glu Leu Ala Ile Leu 820 825 830 Ile His Lys Leu Ser Glu Lys Leu Asn Pro Ser Met Leu Arg Cys Glu 835 840 845 <210> 2 <211> 2547 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atggagggaa gcccatccct gagacgcatg acagtgatgc gggagaaggg ccggcgccag 60 gctgtcaggg gcccggcctt catgttcaat gaccgcggca ccagcctcac cgccgaggag 120 gagcgcttcc tcgacgccgc cgagtacggc aacatcccag tggtgcgcaa gatgctggag 180 gagtccaaga cgctgaacgt caactgcgtg gactacatgg gccagaacgc gctgcagctg 240 gctgtgggca acgagcacct ggaggtgacc gagctgctgc tcaagaagga gaacctggcg 300 cgcattggcg acgccctgct gctcgccatc agcaagggct acgtgcgcat tgtagaggcc 360 atcctcaacc accctggctt cgcggccagc aagcgtctca ctctgagccc ctgtgagcag 420 gagctgcagg acgacgactt ctacgcttac gatgaggacg gcacgcgctt ctcgccggac 480 atcaccccca tcatcctggc ggcgcactgc cagaaatacg aagtggtgca catgctgctg 540 atgaagggtg ccaggatcga gcggccgcac gactatttct gcaagtgcgg ggactgcatg 600 gagaagcaga ggcacgactc cttcagccac tcacgctcga ggatcaatgc ctacaagggg 660 ctggccagcc cggcttacct ctcattgtcc agcgaggacc cggtgcttac ggccctagag 720 ctcagcaacg agctggccaa gctggccaac atagagaagg agttcaagaa tgactatcgg 780 aagctctcca tgcaatgcaa agactttgta gtgggtgtgc tggatctctg ccgagactca 840 gaagaggtag aagccattct gaatggagat ctggaatcag cagagcctct ggaggtacac 900 aggcacaaag cttcattaag tcgtgtcaaa cttgccatta agtatgaagt caaaaagttt 960 gtggctcatc ccaactgcca gcagcagctc ttgacgatct ggtatgagaa cctctcaggc 1020 ctaagggagc agaccatagc tatcaagtgt ctcgttgtgc tggtcgtggc cctgggcctt 1080 ccattcctgg ccattggcta ctggatcgca ccttgcagca ggctggggaa aattctgcga 1140 agccctttta tgaagtttgt agcacatgca gcttctttca tcatcttcct gggtctgctt 1200 gtgttcaatg cctcagacag gttcgaaggc atcaccacgc tgcccaatat cacagttact 1260 gactatccca aacagatctt cagggtgaaa accacccagt ttacatggac tgaaatgcta 1320 attatggtct gggttcttgg aatgatgtgg tctgaatgta aagagctctg gctggaagga 1380 cctagggaat acattttgca gttgtggaat 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gcatgatatg ggctgaatgt aaagaaatct ggactcaggg ccccaaggaa 1560 tatttgtttg agttgtggaa catgcttgat tttggtatgt tagcaatttt cgcagcatca 1620 ttcattgcga gattcatggc attttggcat gcttccaaag cccagagcat cattgacgca 1680 aacgatactt tgaaggactt gacgaaagta acattgggag acaatgtgaa atactacaat 1740 ttggccagga taaagtggga cccctctgat cctcaaataa tatctgaagg tctttatgca 1800 attgctgtag ttttaagttt ctctaggata gcttatattt taccagcaaa tgaaagcttt 1860 ggacctctgc agatatcact tggaagaaca gtcaaagaca tcttcaagtt catggtcata 1920 ttcattatgg tgtttgtggc ctttatgatt ggaatgttca atctctactc ctactacatt 1980 ggtgcaaaac aaaatgaagc cttcacaaca gttgaagaga gttttaagac actgttctgg 2040 gctatatttg gactttctga agtgaaatca gtggtcatca actataacca caaattcatt 2100 gaaaacattg gttacgttct ttatggagtc tataatgtta cgatggtcat tgttttgcta 2160 aatatgttaa ttgccatgat caacagttca ttccaggaaa ttgaggatga cgctgatgtg 2220 gagtggaaat ttgcaagggc caaactctgg ttttcctact ttgaggaggg cagaacactt 2280 cctgtaccct tcaatctggt gccgagtcca aagtccctgt tttatctctt actgaagctt 2340 aaaaaatgga tttctgagct gttccagggc cataaaaaag gtttccagga agatgcagag 2400 atgaacaaga taaatgaaga aaagaaactt ggaattttag gaagtcatga agacctttca 2460 aaattatcac ttgacaaaaa acaggttggg cacaataaac aaccaagtat aaggagctca 2520 gaagatttcc atctaaatag tttcaataat cctccaagac aatatcagaa aataatgaaa 2580 aggctcatta aaagatatgt actgcaggcc cagatagata aggagagtga tgaagtgaac 2640 gaaggggaac tgaaggaaat taagcaggac atctcaagtc tccgctatga actccttgaa 2700 gaaaaatctc agaatacaga agacctagca gaacttatta gagaacttgg agagaaatta 2760 tccatggaac caaatcaaga ggaaaccaat agataa 2796 <210> 7 <211> 931 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: mutant <400> 7 Met Ser Gln Ser Pro Ala Phe Gly Pro Arg Arg Gly Ser Ser Pro Arg 1 5 10 15 Gly Ala Ala Gly Ala Ala Ala Arg Arg Asn Glu Ser Gln Asp Tyr Leu 20 25 30 Leu Met Asp Ser Glu Leu Gly Glu Asp Gly Cys Pro Gln Ala Pro Leu 35 40 45 Pro Cys Tyr Gly Tyr Tyr Pro Cys Phe Arg Gly Ser Asp Asn Arg Leu 50 55 60 Ala His Arg Arg Gln Thr Val Leu Arg Glu Lys Gly Arg Arg Leu 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ttctggctgc ccactgccag gaatatgaaa ttgtgcatac cctcctgcgg 720 aagggtgcta ggattgaacg gcctcatgat tatttctgca agtgcaatga ctgcaaccag 780 aaacagaagc atgactcgtt tagccactcc agatctagga ttaatgccta taaaggcctg 840 gcaagtccgg cttacctgtc attgtctagt gaagatccag tcatgacggc tttagaactt 900 agcaatgaac tggcagttct ggccaatatt gagaaagagt tcaagaatga ctacaaaaaa 960 ctgtcaatgc agtgcaaaga ctttgttgtt ggactccttg atctgtgcag aaacactgaa 1020 gaagtcgagg ccattctgaa tggggatgtt gaaacgctcc agagtggtga tcacggtcgc 1080 ccaaatctca gccgtttaaa acttgccatt aaatatgaag taaaaaaatt tgtagctcat 1140 ccaaactgcc aacagcaact tctctccatt tggtatgaga atctttctgg tttacgacag 1200 cagacaatgg cggtcaagtt ccttgtggtc cttgctgttg ccattggact gcccttcctg 1260 gctctcattt actggtttgc tccatgcagc aagatgggga agataatgcg tggaccattc 1320 atgaagtttg tagcacacgc agcctccttc accatttttc tgggactgct agtcatgaat 1380 gcagctgaca gatttgaagg cacaaaactc cttcctaatg aaaccagcac agataatgca 1440 aaacagctgt tcaggatgaa aacatcctgc ttctcatgga tggagatgct cattatatcc 1500 tgggtaatag gcatgatatg ggctgaatgt aaagaaatct ggactcaggg ccccaaggaa 1560 tatttgtttg agttgtggaa catgcttgat tttggtatgt tagcaatttt cgcagcatca 1620 ttcattgcga gattcatggc attttggcat gcttccaaag cccagagcat cattgacgca 1680 aacgatactt tgaaggactt gacgaaagta acattgggag acaatgtgaa atactacaat 1740 ttggccagga taaagtggga cccctctgat cctcaaataa tatctgaagg tctttatgca 1800 attgctgtag ttttaagttt ctctaggata gcttatattt taccagcaaa tgaaagcttt 1860 ggacctctgc agatatcact tggaagaaca gtcaaagaca tcttcaagtt catggtcata 1920 ttcattatgg tgtttgtggc ctttatgatt ggaatgttca atctctactc ctactacatt 1980 ggtgcaaaac aaaatgaagc cttcacaaca gttgaagaga gttttaagac agcggccgcg 2040 gctatatttg gactttctga agtgaaatca gtggtcatca actataacca caaattcatt 2100 gaaaacattg gttacgttct ttatggagtc tataatgtta cgatggtcat tgttttgcta 2160 aatatgttaa ttgccatgat caacagttca ttccaggaaa ttgaggatga cgctgatgtg 2220 gagtggaaat ttgcaagggc caaactctgg ttttcctact ttgaggaggg cagaacactt 2280 cctgtaccct tcaatctggt gccgagtcca aagtccctgt tttatctctt actgaagctt 2340 aaaaaatgga tttctgagct 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tctcagtggt gctgaaatac 1920 gaccacaaat tcatcgagaa cattggctac gttctctacg gcgtttataa cgtcaccatg 1980 gtggtagtgt tgctcaacat gctaatagcc atgataaaca actcctatca ggaaattgag 2040 gaggatgcag atgtggaatg gaagttcgcc cgagcaaaac tctggctgtc ttactttgat 2100 gaaggaagaa ctctacctgc tccttttaat ctagtgccaa gtcctaaatc attttattat 2160 ctcataatga gaatcaagat gtgcctcata aaactctgca aatctaaggc caaaagctgt 2220 gaaaatgacc ttgaaatggg catgctgaat tccaaattca agaagactcg ctaccaggct 2280 ggcatgagga attctgaaaa tctgacagca aataacactt tgagcaagcc caccagatac 2340 cagaaaatca tgaaacggct cataaaaaga tacgtcctga aagcccaggt ggacagagaa 2400 aatgacgaag tcaatgaagg cgagctgaag gaaatcaagc aagatatctc cagcctgcgc 2460 tatgagcttc ttgaggaaaa atctcaagct actggtgagc tggcagacct gattcaacaa 2520 ctcagcgaga agtttggaaa gaacttaaac aaagaccacc tgagggtgaa caagggcaaa 2580 gacatttag 2589 <210> 11 <211> 862 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: mutant <400> 11 Met Leu Arg Asn Ser Thr Phe Lys Asn Met Gln Arg Arg His 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Leu Ala Ser Ala Ala Tyr Leu Ser Leu Ser Ser Glu Asp Pro Val Leu 225 230 235 240 Thr Ala Leu Glu Leu Ser Asn Glu Leu Ala Arg Leu Ala Asn Ile Glu 245 250 255 Thr Glu Phe Lys Asn Asp Tyr Arg Lys Leu Ser Met Gln Cys Lys Asp 260 265 270 Phe Val Val Gly Val Leu Asp Leu Cys Arg Asp Thr Glu Glu Val Glu 275 280 285 Ala Ile Leu Asn Gly Asp Val Asn Phe Gln Val Trp Ser Asp His His 290 295 300 Arg Pro Ser Leu Ser Arg Ile Lys Leu Ala Ile Lys Tyr Glu Val Lys 305 310 315 320 Lys Phe Val Ala His Pro Asn Cys Gln Gln Gln Leu Leu Thr Met Trp 325 330 335 Tyr Glu Asn Leu Ser Gly Leu Arg Gln Gln Ser Ile Ala Val Lys Phe 340 345 350 Leu Ala Val Phe Gly Val Ser Ile Gly Leu Pro Phe Leu Ala Ile Ala 355 360 365 Tyr Trp Ile Ala Pro Cys Ser Lys Leu Gly Arg Thr Leu Arg Ser Pro 370 375 380 Phe Met Lys Phe Val Ala His Ala Val Ser Phe Thr Ile Phe Leu Gly 385 390 395 400 Leu Leu Val Val Asn Ala Ser Asp Arg Phe Glu Gly Val Lys Thr Leu 405 410 415 Pro Asn Glu Thr Phe Thr Asp Tyr Pro Lys Gln Ile Phe Arg Val Lys 420 425 430 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Asp His Lys Phe Ile Glu Asn Ile Gly Tyr Val Leu Tyr Gly Val Tyr 645 650 655 Asn Val Thr Met Val Val Val Leu Leu Asn Met Leu Ile Ala Met Ile 660 665 670 Asn Asn Ser Tyr Gln Glu Ile Glu Glu Asp Ala Asp Val Glu Trp Lys 675 680 685 Phe Ala Arg Ala Lys Leu Trp Leu Ser Tyr Phe Asp Glu Gly Arg Thr 690 695 700 Leu Pro Ala Pro Phe Asn Leu Val Pro Ser Pro Lys Ser Phe Tyr Tyr 705 710 715 720 Leu Ile Met Arg Ile Lys Met Cys Leu Ile Lys Leu Cys Lys Ser Lys 725 730 735 Ala Lys Ser Cys Glu Asn Asp Leu Glu Met Gly Met Leu Asn Ser Lys 740 745 750 Phe Lys Lys Thr Arg Tyr Gln Ala Gly Met Arg Asn Ser Glu Asn Leu 755 760 765 Thr Ala Asn Asn Thr Leu Ser Lys Pro Thr Arg Tyr Gln Lys Ile Met 770 775 780 Lys Arg Leu Ile Lys Arg Tyr Val Leu Lys Ala Gln Val Asp Arg Glu 785 790 795 800 Asn Asp Glu Val Asn Glu Gly Glu Leu Lys Glu Ile Lys Gln Asp Ile 805 810 815 Ser Ser Leu Arg Tyr Glu Leu Leu Glu Glu Lys Ser Gln Ala Thr Gly 820 825 830 Glu Leu Ala Asp Leu Ile Gln Gln Leu Ser Glu Lys Phe Gly Lys Asn 835 840 845 Leu Asn Lys Asp His Leu Arg Val Asn Lys Gly Lys Asp Ile 850 855 860 <210> 12 <211> 2589 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: mutant <400> 12 atgttgagga acagcacctt caaaaacatg cagcgccggc acacaacgct gagggagaag 60 ggccgtcgcc aggccatccg gggtcccgcc tacatgttca acgagaaggg caccagtctg 120 acgcccgagg aggagcgctt cctggactcg gctgagtatg gcaacatccc ggtggtccgg 180 aaaatgctgg aggagtccaa gacccttaac ttcaactgtg tggactacat ggggcagaac 240 gctctgcagc tggccgtggg caacgagcac ctagaggtca cggagctgct gctgaagaag 300 gagaacctgg cacgggtggg ggacgcgctg ctgctggcca tcagcaaggg ctatgtgcgc 360 atcgtggagg ccatcctcaa ccacccggcc ttcgcgcagg gccagcgcct gacgctcagc 420 ccgctggaac aggagctgcg cgacgacgac ttctatgcct acgacgagga cggcacgcgc 480 ttctcccacg acatcacgcc catcatcctg gcggcgcact gccaggagta tgagatcgtg 540 cacatcctgc tgctcaaggg cgcccgcatc gagcggcccc acgactactt ctgcaagtgc 600 aatgagtgca ccgagaaaca gcggaaagac tccttcagcc actcgcgctc gcgcatgaac 660 gcctacaaag gactggcgag tgctgcctac ttgtccctgt ccagcgaaga ccctgtcctc 720 accgccctgg agctcagcaa cgagttagcc agactagcca acattgagac tgaatttaag 780 aacgattaca ggaagttatc tatgcaatgc aaggattttg tagtgggcgt gctggacctg 840 tgccgagaca cagaagaggt ggaagcaatt ttaaacggtg atgtgaactt ccaagtctgg 900 tccgaccacc accgtccaag tctgagccgg atcaaactcg ccattaaata tgaagtcaag 960 aagttcgttg ctcatcctaa ctgtcagcag caattgctta ccatgtggta tgaaaatctc 1020 tcaggcttac gtcaacagtc tatcgctgtg aaattcctgg ctgtctttgg agtctccata 1080 ggcctccctt ttctcgccat agcctattgg attgctccgt gcagcaagct aggacgaacc 1140 ctgaggagcc ctttcatgaa gtttgtagct catgcagttt cttttacaat cttcttggga 1200 ttattagttg tgaatgcatc tgaccgattt gaaggtgtta aaaccctgcc aaacgaaacc 1260 ttcacagact acccaaaaca aatcttcaga gtgaaaacca cacagttctc ctggacagaa 1320 atgctcatta tgaagtgggt cttaggaatg atttggtccg aatgcaagga aatctgggag 1380 gaggggccac gggagtacgt gctgcacttg tggaacctgc tagatttcgg gatgctgtcc 1440 atcttcgtgg cctccttcac agcacgcttc atggccttcc tgaaggccac ggaggcacag 1500 ctgtacgtgg accagcacgt gcaggacgac acgctgcaca atgtctcgct tccgccggaa 1560 gtggcatact tcacctacgc cagggacaag tggtggcctt cagaccctca gatcatatcg 1620 gaagggctct acgcgatagc cgtcgtgctg agcttctctc gcattgcata cattctgcca 1680 gccaacgaga gttttgggcc cctgcagatc tcgctaggga gaactgtgaa agatatcttc 1740 aagttcatgg tcattttcat catggtattt gtggccttca tgattgggat gttcaacctg 1800 tactcttact accgaggtgc caaatacaac ccagcgttta caacggttga agaaagtttt 1860 aaaactgcgg ctgcgtccat attcggctta tctgaagtaa tctcagtggt gctgaaatac 1920 gaccacaaat tcatcgagaa cattggctac gttctctacg gcgtttataa cgtcaccatg 1980 gtggtagtgt tgctcaacat gctaatagcc atgataaaca actcctatca ggaaattgag 2040 gaggatgcag atgtggaatg gaagttcgcc cgagcaaaac tctggctgtc ttactttgat 2100 gaaggaagaa ctctacctgc tccttttaat ctagtgccaa gtcctaaatc attttattat 2160 ctcataatga gaatcaagat gtgcctcata aaactctgca aatctaaggc caaaagctgt 2220 gaaaatgacc ttgaaatggg catgctgaat tccaaattca agaagactcg ctaccaggct 2280 ggcatgagga attctgaaaa tctgacagca aataacactt tgagcaagcc caccagatac 2340 cagaaaatca tgaaacggct cataaaaaga tacgtcctga aagcccaggt ggacagagaa 2400 aatgacgaag tcaatgaagg cgagctgaag gaaatcaagc aagatatctc cagcctgcgc 2460 tatgagcttc ttgaggaaaa atctcaagct actggtgagc tggcagacct gattcaacaa 2520 ctcagcgaga agtttggaaa gaacttaaac aaagaccacc tgagggtgaa caagggcaaa 2580 gacatttag 2589

Claims

심혈관 질환 치료용 의약의 제조를 위한, TRPC 채널, 이의 불활성화 돌연변이체 또는 TRPC 채널 또는 불활성화 돌연변이체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 용도.
제1항에 있어서, TRPC 채널이 TRPC3 채널, TRPC6 채널 및/또는 TRPC7 채널로부터 선택되는 용도.
제2항에 있어서, TRPC3의 아미노산 서열이 서열번호 2의 아미노산 서열이고, TRPC6의 아미노산 서열이 서열번호 5의 아미노산 서열이고, TRPC7의 아미노산 서열이 서열번호 9의 아미노산 서열인 용도.
제2항에 있어서, 불활성화 돌연변이체가 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는TRPC3^DN, 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 TRPC6^DN 또는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 TRPC7^DN인 용도.
제2항에 있어서, TRPC3을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열이고, TRPC6의 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 6의 뉴클레오 타이드 서열이고, TRPC7의 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 10의 뉴클레오타이드 서열인 용도.
제4항에 있어서, TRPC3^DN을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 4의 뉴클레오타이드 서열이고, TRPC6^DN을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 8의 뉴클레오타이드 서열이고, TRPC7^DN을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 12의 뉴클레오타이드 서열인 용도.
심혈관 질환 치료용 의약으로서 TRPC 채널 조절제를 찾아내기 위한, TRPC 채널, 이의 불활성화 돌연변이체 또는 TRPC 채널 또는 불활성화 돌연변이체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 용도.
제7항에 있어서, TRPC 채널이 TRPC3 채널, TRPC6 채널 및/또는 TRPC7 채널로부터 선택되는 용도.
제8항에 있어서, TRPC3의 아미노산 서열이 서열번호 1의 아미노산 서열이고, TRPC6의 아미노산 서열이 서열번호 5의 아미노산 서열이고, TRPC7의 아미노산 서열이 서열번호 9의 아미노산 서열인 용도.
제8항에 있어서, 불활성화 돌연변이체가 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는TRPC3^DN, 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 TRPC6^DN 또는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 TRPC7^DN인 용도.
제8항에 있어서, TRPC3을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열이고, TRPC6의 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열이고, TRPC7의 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 10의 뉴클레오타이드 서열인 용도.
제10항에 있어서, TRPC3^DN을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 4의 뉴클레오타이드 서열이고, TRPC6^DN을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 8의 뉴클레오타이드 서열이고, TRPC7^DN을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 12의 뉴클레오타이드 서열인 용도.
제5항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, TRPC 채널, 이의 불활성화 돌연변이체, 또는 TRPC 채널 또는 불활성화 돌연변이체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 시험 화합물과 접촉되고, TRPC 채널, 이의 불활성화 돌연변이체, 또는 TRPC 채널 또는 불활성화 돌연변이체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 대한 시험 화 합물의 영향이 측정 또는 검출되는 용도.
제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, 심혈관 질환이 죽상동맥경화증인 용도.
(a) TRPC 채널 또는 이의 불활성화 돌연변이체를 발현하는 세포를 접촉시키는 단계,

(b) 세포와 시험 화합물을 접촉시키기 전, 접촉과 동시에 또는 접촉시킨 후 채널 활성화제를 사용하여 Ca²⁺ 유입을 자극하는 단계 및

(c) TRPC 채널 활성의 변화를 측정 또는 검출하는 단계를 포함하는, TRPC 채널, 이의 불활성화 돌연변이체, 또는 TRPC 채널 또는 불활성화 돌연변이체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 조절제를 스크리닝하는 방법.
제15항에 있어서, (d) 심혈관 질환에 대한 활성을 갖는 시험 화합물을 당해 시험 화합물의 부재하에서의 TRPC 채널 활성의 변화와 비교함으로써 선별하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제15항 또는 제16항에 있어서, 세포에서의 TRPC 채널 또는 이의 불활성화 돌연변이체의 발현이 유도성 프로모터에 의해 제어되는 방법.
제17항에 있어서, 유도성 프로모터가 테트라사이클린-유도성 프로모터인 방법.
제15항 내지 제18항 중의 어느 한 항에 있어서, 세포가 형광 세포인 방법.
제15항 내지 제19항 중의 어느 한 항에 있어서, 세포가 MDCK, HEK 293, HEK 293 T, BHK, COS, NIH3T3, Swiss3T3 또는 CHO 세포로부터 선택되는 방법.
제15항 내지 제20항 중의 어느 한 항에 있어서, 바람직하게는 패치 클램프 기술, 전세포 전류(whole cell current), 방사선표지된 이온 유입에 의해 이온 유입, 특히 Ca²⁺ 유입에서의 변화를 측정 또는 검출하거나, 바람직하게는 전압 민감성 염료 또는 이온-민감성 염료를 사용하여 특히 형광에서의 변화를 측정 또는 검출함으로써 TRPC 채널 활성이 측정 또는 검출되는 방법.
제15항 내지 제21항 중의 어느 한 항에 있어서, 채널 활성화제가 디아실글리세롤, 특히 1-올레일-2-아세틸-sn-글리세롤(OAG), G_q-커플링된 수용체 효능제, 특히 페닐에프린 및 특히 트립신, 수용체 티로신 키나제를 자극하는 효능제, 특히 상피 성장 인자(EGF) 또는 디아실글리세롤 생성 효소, 특히 포스포리파제 또는 이의 활성화제로부터 선택되는 화합물인 방법.
제15항 내지 제22항 중의 어느 한 항에 있어서, TRPC가 TRPC3, TRPC6, TRPC7 또는 이들의 불활성화 돌연변이체로부터 선택되는 방법.
제23항에 있어서, 불활성화 돌연변이체가 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 TRPC3^DN, 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 TRPC6^DN 또는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 TRPC7^DN인 방법.
제15항 내지 제24항 중의 어느 한 항에 있어서, 시험 화합물이 화학적 화합물 라이브러리의 형태로 제공되는 방법.
제15항 내지 제25항 중의 어느 한 항에 있어서, 어레이(array)에서 수행되는 방법.
제15항 내지 제26항 중의 어느 한 항에 있어서, 로봇식 시스템에서 수행되는 방법.
제15항 내지 제27항 중의 어느 한 항에 있어서, 시험 화합물의 고처리량 스크리닝 방법인 방법.
제15항 내지 제28항 중의 어느 한 항에 있어서, 검출되는 시험 화합물이 억제제인 방법.
제15항 내지 제29항 중의 어느 한 항에 있어서, 세포가 다중-웰 시험 플레이트상으로 접종되는 방법.
(a) 제15항 내지 제30항 중의 어느 한 항에 따른 방법을 수행하는 단계,

(b) 심혈관 질환의 치료에 적합한 검출된 시험 화합물을 분리하는 단계 및

(c) 검출된 시험 화합물을 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 보조제 물질과 함께 제형화하는 단계를 포함하는, 심혈관 질환의 치료용 의약의 제조 방법.
제15항 내지 제31항 중의 어느 한 항에 있어서, 심혈관 질환이 죽상동맥경화증인 방법.