DE60124915T2

DE60124915T2 - Synthetische peptide gegen neurologische krankheiten

Info

Publication number: DE60124915T2
Application number: DE60124915T
Authority: DE
Inventors: Binie V. Belaire Lipps; Frederick W. Bellaire Lipps
Original assignee: Lipps Frederick W Belaire
Current assignee: Lipps Frederick W Belaire
Priority date: 2000-07-11
Filing date: 2001-07-11
Publication date: 2007-11-29
Anticipated expiration: 2021-07-12
Also published as: EP1299724A4; EP1299724B1; AU2001276898A1; WO2002003922A2; EP1299724A2; US7264808B2; US20040077545A1; WO2002003922A3; DE60124915D1

Description

Technisches Gebiet
Die Erfindung betrifft ein synthetisches Peptid, welches die biologischen Eigenschaften des Nervenwachstumsfaktors (NGF) nachbildet und zur Behandlung neurologischer Erkrankungen verwendbar ist.
Technischer Hintergrund
Der Nervenwachstumsfaktor (NGF) wurde vor mehr als 40 Jahren von Levi-Montalcini et al. in malignen Geweben entdeckt. Danach isolierte Cohen NGF aus Schlangengift und danach aus submaxillären Drüsen der Maus, ein Homolog der Schlangengiftdrüse. Seit der Entdeckung wurde davon ausgegangen, dass NGF klinisch zur Behandlung neurologischer Erkrankungen wie Alzheimer (AD), Parkinson (PD) und anderer neurologischer Erkrankungen verwendbar ist.
Von Appel und Tomozawa wurden 1991 drei verschiedene neurotrophe Faktoren von Anhang-Putamengewebe normaler Säuger isoliert, extrahiert und gereinigt, um amyotrophe Lateralsklerose (ALS), PD und AD zu behandeln. Heinrich erzeugte rekombinantes Human (H-NGF), der in Eizellen chinesischer Hamster (CHO) erzeugt wird. Lewis et al. schlugen 1992 die Verwendung von Insulin ähnlichem Wachstumsfaktor zur Behandlung von Erkrankungen vor, der das Überleben von nichtmitotischen Zellen verbessert.
Zahlreiche Wissenschaftler haben synthetische NGF-Peptidderivate erzeugt, die den neuronalen Tod verhindern und ein Neuritenauswuchs zeigen, das Merkmal des neutrophen Faktors auf PC12-Zellen. Longo et al. (1997) erzeugten cyclisierte Peptide entsprechend der β-Schleifenregion von NGF und fanden die höchste Aktivität entsprechend einer Schleifenregion 29–35, die zur Wechselwirkung mit p75-Rezeptor in der Lage ist. Nach ihnen sind bis zum heutigen Tag keine kleinmolekularen NGF-Agonist- oder Teilagonist-Mittel beschrieben worden, von denen bekannt ist, dass sie neurotrophe Wirkungen fördern, indem sie auf NGF-Rezeptoren wirken.
Ein kleines Molekül, das sich ähnlich wie NGF verhält, wäre zur Behandlung neurologischer Erkrankungen sehr wünschenswert, da es die Blut-Hirn- Schranke überwinden könnte. Es wäre in der Lage, das Hirn über fast alle Wege zu erreichen, beispielsweise intramuskulär, intravenös, über die Mundhöhle oder Nasalinsufflation, die sich anwenden ließen, und es könnte außerdem die Auslösung einer Antikörpererzeugung vermeiden. Ein kleines Molekül, das sich ähnlich wie NGF verhält und synthetisch erzeugen lässt, wäre um so mehr wünschenswert, da dessen Erzeugung direkt und kostengünstig erfolgen würde.
Offenbarung der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein synthetisches Peptid, das aus mindestens fünf Aminosäuren von dem N-Terminal der Sequenz N L G E H P V C D S T D T W V besteht. Das synthetische Peptid bildet die biologischen Eigenschaften des Nervenwachstumsfaktors (NGF) nach, der aus 116 Aminosäuren besteht.
Das erfindungsgemäße Peptid kann einem Patienten mit einer neurologischen Erkrankung über verschiedene Wege und einschließlich Injektion sowie oral verabreicht werden. Das erfindungsgemäße Peptid erreicht das Hirn als ein kleines Molekül ohne das Blut-Hirn-Schrankenproblem, da es ausreichend klein ist, um die Blut-Hirn-Schranke zu durchdringen.
Gegen das erfindungsgemäße Peptid erzeugte Antikörper verfügen über eine höhere Bindungsaffinität für NGF menschlicher Herkunft (bezeichnet als H-NGF) als Antikörper, die gegen das 116 Aminosäure-NGF erzeugt werden, das aus dem Gift erzeugt wird (V-NGF), Antikörper ist Anti-V-NGF). Diese Tatsache beweist, dass die Zusammensetzung des erfindungsgemäßen Peptids eine konservierte Domäne der Aktivität von Human-NGF ist. Daher steht das erfindungsgemäße Peptid immunologisch dem H-NGF näher als V-NGF.
Gegen das erfindungsgemäße Peptid erzeugte Antikörper in Assay-NGF-Mengen können für diagnostische Zwecke in menschlichen Körperflüssigkeiten verwendet werden, wie beispielsweise Speichel und Urin, ohne die Notwendigkeit der Blutabnahme.
Beste Ausführungsform der Erfindung
Die erfindungsgemäßen Peptide lassen sich allgemein als Zusammensetzungen einer Substanz beschreiben, die mindestens aus den ersten fünf Aminosäuren des N-Terminals der Sequenz von N L G E H P V C D S T D T W V und aus nicht mehr als 25 Aminosäuren insgesamt besteht. Normalerweise werden die erfindungsgemäßen Peptide nicht mehr als 20 Aminosäuren und bevorzugt nicht mehr als 15 Aminosäuren enthalten. Ich habe die erfindungsgemäßen Peptide bezeichnet mit "ADESH".
ADESH, das lediglich einen Teil der Aminosäuresequenz enthält, ist bevorzugt. ADESH, das lediglich die ersten fünf Aminosäure der Sequenz enthält, wird bezeichnet als AD-5. Eine ADESH, das lediglich die ersten 10 Aminosäuren der Sequenz enthält, wird bezeichnet als AD-10 und ist die bevorzugte Spezies. ADESH, das lediglich die ersten 15 Aminosäuren der Sequenz enthält, wird bezeichnet als AD-15. AD-5, AD-10 und AD-15 sind auf PC12-Zellen getestet worden und haben sich bei der Erzeugung eines Neuritenauswuchses als biologisch wirksam erwiesen.
ADESH stellt einen Nervenwachstumsfaktor dar, der bevorzugt im Bereich von 5 bis 20 Aminosäuren aufweist und zu der Durchquerung der Blut-Hirn-Schranke in der Lage ist. Es lässt sich wirksam von Patienten mit Bedarf für Nervenwachstumsfaktor nutzen, indem es dem Blutstrom zugesetzt wird. Beispiele für Patienten, bei denen eine ADESH-Behandlung von Nutzen sein könnte, schließen solche ein, die an Alzheimerkrankheit (AD) und an der Parkinson'schen (PD) Krankheit leiden. Geeignete Verabreichungswege schließen Nasalinsufflation ein, Verabreichung in der Mundhöhle, orale Einnahme und intramuskuläre Injektion. ADESH lässt sich auch direkt in die Blutbahn injizieren.
ADESH bildet die biologischen Eigenschaften von NGF nach, das vom Cobra-Schlangengift abgeleitet wird. Vom Schlangengift abgeleiteter NGF wird bezeichnet als V-NGF. Die Eigenschaft des V-NGF, die das größte Interesse auf sich zieht und von ADESH nachgebildet wird, ist die Stimulation von Neuritenauswuchs.
Die von einer der Spezies von Cobragift (Naja naja) abgeleitete Aminosäuresequenz von V-NGF lautet:
NH₂-Glu-Asp-His-Pro-Val-His-Asn-Leu-Gly-Glu-His-Pro-Val-Cys-Asx-Ser-Thr-Ash-Thr-Trp₂₀-Val-Gly-Val-Lys-Thr-Thr-Ala-Thr-Asn-Ile-Lys-Gly-Ala-Ser-Val-Ser-Val-Met-Glu-Asn₄₀-Val-Asn-Leu-Asp-Asn-Lys-Val-Tyr-Lys-Gln-Tyr-Phe-Phe-Glu-Thr-Lys-Cys-Arg-Asx-Ser₆₀-Asx-Pro-Pro-Glx-Pro-Gly-Cys-Lys-Gly-Ile-Asx-Thr-Glx-His-Trp-Asx-Ser-Tyr-Cys-Thr₈₀-Thr-Ser-Asn-Ser-Phe-Ile-Lys-Ala-Leu-Thr- Met-Asx-Glx-Gly-Gln-Ser-Ala-Trp-Arg-Phe₁₀₀-Ile-Arg-Ile-Gix-Thr-Ala-Cys-Val-Cys-Val-Ile-Thr-Lys-Lys-Gly-Asn-COOH.
In vivo bewirkt ADESH in dem immunisierten Tier die Erzeugung eines Antikörpers, der eine Bindungsaffinität zu NGF's von Körperflüssigkeiten des Menschen und eukaryotischen Zellen humaner Herkunft hat, die größer ist als die Bindungsaffinität, die von einem Antikörper gezeigt wird, der in immunologischer Reaktion auf V-NGF erzeugt wird. Synthetisches ADESH ist im gleichen Maße aktiv wie das Fragment des nativen NGF. Gegen ADESH erzeugte Antikörper (Anti-ADESH) reagieren mit V-NGF mit 116 Aminosäuren. Allerdings reagieren Antikörper, die gegen V-NGF erzeugt werden (Anti-V-NGF) mit ADESH schwach. Dieses veranschaulicht, dass die 10 Aminosäuren des ADESH besonders bedeutend für die biologische Wirksamkeit des Neuritenwachstums sind. Daher ist synthetisches ADESH, das aus 10 Aminosäuren besteht, insbesondere ein Anwärter für die Behandlung neurologischer Erkrankungen an Stelle des gesamten NGF-Moleküls.
In der Vergangenheit schlugen Versuche zur Detektion und/oder quantitativen Bestimmung von Human-NGF (H-NGF) in Humanserum fehl. Unsere Untersuchungen zeigen, dass sich H-NGF quantitativ in vitro durch Kontaktieren von Probeflüssigkeiten mit einem Anti-ADESH messen lassen. Das Kontaktieren wird bevorzugt so ausgeführt, dass eine Immunreaktion des Antikörpers mit dem in der Probeflüssigkeit enthaltenden NGF hervorgerufen wird. Der Test hat sich bei der quantitativen Messung von H-NGF als wirksam erwiesen, das in Proben von Blutserum, Speichel und Urin enthalten ist.
Experimentelles und Ergebnisse:
Reinigung von NGF von Schlangengift:
Fraktionierung von Schlangengift aus Naja kaouthia mit Hilfe der HPLC unter Anwendung einer Ionenaustauschsäule und eines Gradienten mit Trizma-HCl-Puffer pH 7,4 wurde homogenes NGF-Präparat erhalten.
Trypsin-Aufschluss von natürlichem NGF:
Es wurde ein gereinigtes homogenes Präparat von NGF mit Trypsin aufgelöst in 0,1 Mol Ammoniumhydrogencarbonat-Puffer mit pH 8,0 behandelt. Das NGF und das Trypsin wurden im Verhältnis von 40:1 und genau mit 5 mg NGF zu 0,25 mg Trypsin gemischt. Die Mischung wurde bei 37°C inkubiert, um eine Fragmentierung an den Arginin- und Lysin-Stellen zu bewirken. Nach 18 Stunden Inkubation wurde die Reaktion durch Kühlen der Mischung bei 4°C angehalten.
Trennung von Fragmenten vom Trypsin-Aufschluss:
Die mit Trypsin digerierten Fragmente wurden auf HPLC getrennt. Die Trennung erfolgte in zwei Durchläufen jeweils mit der Beladung der Hälfte der Mischung. Trypsin-digeriertes NGF wurde in zehn verschiedene Fragmente zerlegt. Die Fragmente wurden einzeln aufgenommen und gegen Wasser unter Verwendung von Cutoff-Rohr mit 500 Dalton Molekulargewicht (Spectrum USA) dialysiert. Die Proteinkonzentration jedes Fragmentes wurde unter Verwendung von Protein-Kit von Bio-Rad (USA) gemessen und die Konzentration jedes Fragmentes mit 0,05 M Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) auf 100 μg/ml eingestellt.
Biologische Wirksamkeit von PC12-Zellen der Fragmente:
Die Trypsin digerierten Fragmente in verschiedenen Konzentrationen wurden auf Neuriten-Auswuchs auf PC12-Zellen getestet. Es wurde eine Gewebekulturschale mit 24 Mulden mit 10⁵-PC12-Zellen in serumfreiem Dulbeco Modified Eagle-Medium (DMEM) beimpft. Die Ergebnisse wurden auf Neuriten-Auswuchs nach 72 Stunden abgelesen. Die Fraktion, die den stärksten Neuriten-Auswuchs bei der niedrigsten Konzentration zeigte, wurde auf ihre Aminosäure-Zusammensetzung sequenziert. Das Sequenzieren erfolgte vertragsgemäß mit dem "Protein Core Laboratory of Baylor College of Medicine", Houston, Texas. Die Sequenz für die Fraktion von dem N-Terminal wurde ermittelt als: N L G E H P V C D S T D T W V.
Synthese von ADESH:
Es wurde synthetisches ADESH (AD-10) unter Verwendung der vorgenannten Aminosäuresequenz vom N-Terminal für 10 Aminosäuren N L G E H P V C D S aufgebaut. Zwei weitere Versionen von synthetischer ADESH, bezeichnet als AD-15 und AD-5, die aus 15 bzw. 5 Aminosäuren bestanden, wurden aufgebaut; die Peptide hatten die Sequenz: N L G E H P V C D S T D T W V für AD-15 und N L G E H für AD-5.
Erzeugung von polyklonalen Antikörpern auf ADESH in Mäusen:
Es besteht der Eindruck, dass kleine synthetische Peptide keine Antikörper bei Injektion in Tieren erzeugen. Ein synthetisches Peptid kann jedoch Antikörper erzeugen, wenn es mit einem vollständigen Protein vor dem Injizieren in das Tier markiert ist. Landsteiner prägte den Begriff "Hapten" für eine niedermolekulare, chemisch definierte Verbindung, die eine Antikörperbildung nur dann erzeugen kann, wenn sie vor dem Injizieren mit einem größeren Trägerprotein-Molekül gekoppelt ist. Dadurch stellt das injizierte Tier sowohl in Bezug auf das Hapten als auch in Bezug auf das Trägerprotein Antikörper her.
Synthetisch chemisch definiertes ADESH, das fünfzehn, zehn oder fünf Aminosäuren aufweist, lässt sich als Hapten bezeichnen und sollte daher theoretisch beim Injizieren ohne ein Trägerprotein keine Antikörper erzeugen. Wir haben allerdings bei unseren anderen Projekten mit Erfolg Antikörper in Mäusen für ein synthetisches Peptid erzeugt, das aus fünf Aminosäuren bestand.
Zur Immunisierung wurden erwachsene Bald/C-Mäuse verwendet. Die Mäuse wurden unter Einhaltung der Grundsätze des US Public Health Service in Bezug auf Fürsorge und Umgang mit Tieren verwendet. Die erste Injektion bestand aus der Mischung von 100 μg jeder Version von ADESH in 0,1 ml gemischt mit gleichem Volumen von Freund Adjuvans/Maus. Die nachfolgenden Injektionen bestanden aus der Mischung von 100 μg ADESH und einem gleichen Volumen unvollständiger Freund Adjuvans/Maus. Die Mäuse wurden intramuskulär (IM) sechsmal in Abständen von zwei Wochen injiziert. Am Ende der Immunisierung wurden die Mäuse durch die ophthalmischen Venen geschröpft und das Serum separiert.
Das "Enzyme-Linked Immunosorbent Assay" (ELISA): Die Bindungsaffinität von Anti-ADESH, erzeugt gegen ADESH, bestehend aus zehn Aminosäuren (AD-10) in Bezug auf verschiedene Proben, die bekanntes NGF enthielten, wie beispielsweise tierische Gifte, Körperflüssigkeiten, Speichel, Serum, Urin usw., wurden mit Hilfe der ELISA untersucht. Die ELISA-Bindung von Anti-AD-10 wurde mit Anti-NGF verglichen, das gegen Cobragift erzeugt wurde. Die ELISA-Tests wurden in 96-Mikrotiter-Platten ausgeführt. Die Mulden der Platte wurden mit einer Konzentration von Antigen, verdünnt in PBS überzogen, wobei jede Mulde 100 μl erhielt. Die Platte wurde bei Raumtemperatur (RT) für 16 bis 18 Stunden inkubiert, wonach sie dreimal (3×) mit PBS behandelt wurde. Die Mulden der Platte wurden mit 0,25 ml/Mulde 3%igem Teleostean-Gelatine von Kaltwasserfisch (Sigma) für 0,5 Stunden bei Raumtemperatur blockiert. Es wurden Anti-AD-10 und Anti-NGF's dreifach in Gelatine verdünnt zu den entsprechenden Mulden der ELISA-Platte gegeben, einbezogen positive und negative Kontrollen. Die Platte wurde 1 bis 1,5 Stunden bei 37°C inkubiert. Nach dreimaligem Waschen wurde Meerrettichperoxidase konjugiert mit IgG, hergestellt in Ziege (Sigma) zugegeben und für 1 Stunde inkubiert. Abschließend wurde die Platte gewaschen und mit o-Phenylendiamindihydrochlorid (OPD) zur Farbentwicklung zur Reaktion gebracht. Der Test erfolgte 0,5 Stunden für ELISA-Titer.
Isolation von NGF aus Körperflüssigkeiten: Es wurden nach unserer firmeneigenen Prozedur auf HPLC konzentrierte Körperflüssigkeiten fraktioniert, wie beispielsweise Speichel, Serum und Urin. Jeder Typ der Flüssigkeit wurde in mehrere Fraktionen aufgetrennt. Die Fraktionen wurden dialysiert und auf neurotrophe Aktivität der PC12-Zellen getestet. Die identifizierte Fraktion von NGF wurde weiter gereinigt, um homogenes NGF zu erhalten. Die NGF's wurden auch von Cobra-Giftserum isoliert sowie von Honigbienengift.
Isolation von NGF aus entwickelten eukaryotischen Zellen: Die im Gewebekulturmedium DMEM aufgezogenen Zellen wurden vor dem Fraktionieren auf HPLC zur Isolation von NGF konzentriert. Jeder Typ des Zellmediums wurde in mehrere Fraktionen aufgetrennt. Die Fraktionen wurden dialysiert und auf neurotrophe Aktivität von PC12-Zellen getestet. Die identifizierte Fraktion von NGF wurde weiter gereinigt, um homogenes NGF zu erhalten. Die Zellkulturen, die zur Anwendung gelangten, waren Chang-Leber-, Vero-, PC12-, Neuroblastom- und SP/2-Zellen, wobei die Prozedur zur Isolation, die folgte, ähnlich derjenigen war, wie sie vorstehend beschrieben wurde.
Ergebnisse Tabelle I Biologische Eigenschaften verschiedener Versionen von ADESH im Vergleich zu Gift-NGF
Die Ergebnisse von Tabelle 1 zeigen, dass:

(1) das von NGF derivierte Gift bei der Konzentration von 5 μg/ml toxisch ist, während AD-15, AD-10 und AD-5 bis zu 100 μg/ml auf PC12-Zellen nichttoxisch ist;
(2) von NGF deriviertes Gift Neuriten-Auswuchs bei 5 ng/ml auf PC12 erzeugt, während jedes AD-15, AD-10 und AD-5 1.000 ng/ml, die 200-fache Konzentration von Gift-NGF, erfordert;
(3) AD-5, AD-10 und AD-15 bilden die Eigenschaft von vollständigem nativem NGF in der Erzeugung von Neuriten auf PC12-Zellen nach. Diese Eigenschaften zeigen, dass AD-5, AD-10 und AD-15 ein integraler Bestandteil von ganz molekularem NGF ist.

Die Ergebnisse der Tabelle II zeigen, dass:

(1) Anti-AD-10 reagiert mit NGF's, deriviert von Gift, menschlichen Körperflüssigkeiten; Serum, Speichel und Urin, AD-15 und AD-5.
(2) Bindungsaffinität von Anti-AD-10 ist größer an den NGF's menschlicher Herkunft als an Gift-NGF.
(3) Anti-V-NGF reagiert schwach auf AD-15, AD-10 und AD-5 im Vergleich zu Anti-H-NGF.

Die Bindungseigenschaft von Anti-AD-10 an NGF's natürlicher Herkunft veranschaulicht, dass AD-10 ein integraler Bestandteil ist und dem Human-NGF näher ist. Tabelle III ELISA-Titer von Anti-AD-10 und Anti-V-NGF an Giften
Es ist bekannt, dass Schneckengifte NGF enthalten, und vor Kurzem ist von Lipps (1999) veröffentlicht worden, dass Gifte von der Honigbiene und dem Skorpion ebenfalls NGF enthalten.
Die Ergebnisse von Tabelle III zeigen, dass:

(1) Anti-ADESH eine Bindungsaffinität an Giften ähnlich wie an Anti-V-NGF zeigt;
(2) diese Eigenschaft veranschaulicht, dass synthetisches ADESH, das aus zehn Aminosäuren besteht, ein integraler Bestandteil von V-NGF ist, dessen Homologie zu Human-NGF größer ist als 60%.

Die Ergebnisse der Tabelle IV veranschaulichen, dass:

(1) Anti-ADESH die höchste Bindungsaffinität an NGF's deriviert von menschlicher Herkunft hat (Chang, NB-Zellen), weniger an Affe- und Maus-(Vero, SP/2) und am Wenigsten an Ratte(PC12)-Zellen, deriviert von NGF;
(2) die Bindungsaffinität von Anti-ADESH ähnlich derjenigen von Anti-H-NGF ist. Dieses zeigt, dass ein synthetisches Peptid-ADESH dem Human-NGF näher ist und eine Behandlung von Menschen wohl geraten ist.

Claims

Zusammensetzung einer Substanz, aufweisend ein Peptid, das mindestens besteht aus den ersten fünf Aminosäuren der N-terminalen Sequenz NLGEHPVCDSTDTWV und aus nicht mehr als 25 Aminosäuren insgesamt.
Zusammensetzung einer Substanz nach Anspruch 1, wobei das Peptid nicht mehr hat als 15 Aminosäuren insgesamt.
Zusammensetzung einer Substanz nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Peptid NLGEHPVCDS ist.
Zusammensetzung einer Substanz nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Peptid einen Antikörper erzeugt, der eine Bindungsaffinität an NGF's von menschlichen Körperflüssigkeiten und eukariotischen Zellen menschlichen Ursprungs hat, die größer ist als die Bindungsaffinität, die ein Antikörper zeigt, der erzeugt wird in einer Immunantwort auf einen von einem Gift derivierten NGF.
Verwendung einer Substanzzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zum Herstellen eines Medikaments, das den Blutstrom des Menschen erreicht und in der Lage ist, die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden.
Verwendung einer Substanzzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zum Herstellen eines Medikaments für die Behandlung einer neurodegenerativen Erkrankung, ausgewählt aus Alzheimer-Krankheit und Parkinson-Krankheit.
Verwendung einer Substanzzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zum Herstellen eines Medikaments für die nasale Insufflation, für die bukkale Verabreichung oder intramuskuläre Injektion.
Verfahren, umfassend das Kontaktieren in vitro eines menschlichen Nervenwachstumsfaktors mit einem Antikörper, erzeugt gegen ein Peptid, das mindestens fünf Aminosäuren von der Sequenz NLGEHPVCDSTDTWV enthält und nicht mehr als 25 Aminosäuren insgesamt.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Kontaktieren so ausgeführt wird, dass der Antikörper dazu gebracht wird, immunologisch mit dem menschlichen Nervenwachstumsfaktor zu reagieren.