DE68918312T2

DE68918312T2 - Menschlicher Nervenwachstumsfaktor.

Info

Publication number: DE68918312T2
Application number: DE68918312T
Authority: DE
Inventors: Lanfranco Dr Callegaro; Valle Francesco Dr Della; Silvana Lorenzi
Original assignee: Fidia SpA
Current assignee: Fidia SpA
Priority date: 1988-03-18
Filing date: 1989-03-14
Publication date: 1995-03-16
Anticipated expiration: 2009-03-15
Also published as: DK129089D0; EP0333574B1; JPH0228199A; EP0333574A3; EP0333574A2; IT1219874B; DE68918312D1; AU3143589A; CA1339791C; ZA891962B; US5210185A; DK129089A; IT8847745A0; JP2798413B2; ATE111740T1; AU627717B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft den durch Reinigung aus menschlicher Plazenta erhaltenen menschlichen Nervenwachstumsfaktor (hNGF) und insbesondere eine biologische Untereinheit (β-NGF).

Stand der Technik

Der Nervenwachstumsfaktor (NGF) wurde ursprünglich in Maus-Sarkom-Tumoren entdeckt (Levi-Montalcini R. et al., J. Exp. Zool. 116 (1951), 321) und dann aus submandibularen Speicheldrüsen männlicher Mäuse (Varon S. et al., Biochemistry 6 (1967), 2202) sowie aus Schlangengift (Angeletti R.H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 65 (1970), 668) bis zur Homogenität gereinigt. Es wurde von vielen anderen relativ reichhaltigen NGF-Quellen berichtet, einschließlich der Meerschweinchen- Prostata (Harper G.P. et al., Nature 279 (1979), 160) und menschlicher Plazenta (Goldstein L.D. et al., Neurochem. Res. 3 (1978), 175; Walker P. et al., Life Science 26 (1980), 195; Calissano P. et al., Hormonal Prot. Peptides XII (1984), 2). Es wurde berichtet, daß kleine NGF-Mengen in anderen Geweben vorhanden sind, einschließlich dem zentralen Nervensystem der Säuger (Varon S., Discussions in Neuroscience, Vol. II, Nr. 3 (1985); Hefti F. et al., Neuroscience 14 (1985), 55). Die physiologische Beziehung zwischen diesen potentiellen NGF- Quellen und den ersichtlichen Wirkorten ist nicht sehr offensichtlich. Es wird jedoch allgemein angenommen, daß NGF von verschiedenen, peripheren Geweben sekretiert wird, die eine Innervation durch auf NGF reagierenden Zellen benötigen.
Das Sequenzieren und Clonieren von aus submandibularen Drüsen männlicher Mäuse erhaltenem NGF wurde ebenfalls durchgeführt (Scott J. et al., Nature 302 (1983), 538; Ulrich A. et al., Nature 303 (1983), 821). Das menschliche β-NGF-Gen wurde ebenfalls erfolgreich isoliert und cloniert (Ulrich A. et al., Nature 303 (1983), 821; Europäisches Patent Nr. 0121338).
Der aus den submandibularen Drüsen von Mäusen erhaltene NGF war der am vollständigsten charakterisierte NGF-Typ. Der aus Mausdrüsen stammende NGF wirkt als ein aus drei verschiedenen Untereinheiten (α,ß, γ ), einschließlich Zn&spplus; bestehender 7 S- Proteinkomplex (Molekulargewicht etwa 140000 Daltons). Die NGF-Aktivität ist ausschließlich mit der Untereinheit β (als 2.5S-NGF bekannt) assoziiert. Es handelt sich um ein basisches, dimeres Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 25300 Daltons (nach 5-minütiger Reduktion mit β-Mercaptoethanol bei 100ºC zeigt es bei einer Elektrophorese auf einem SDS in hoher Konzentration enthaltenden Gel ein Molekulargewicht von etwa 12650 Daltons), dessen isoelektrischer Punkt bei annährend 9.3 liegt. Von den β-NGF-Aminosäuresequenzen aus den submandibularen Drüsen männlicher Mäuse und menschlicher Herkunft wurde berichtet (Scott J. et al., Nature 302 (1983), 538; Ulrich A. et al., Nature 303 (1983), 821).
Aus einer submandibularen Mausdrüse stammender NGF wurde für die meisten der in vivo- und in vitro-Studien der NGF- Aktivität verwendet. Der Bereich der biologischen NGF-Aktivität wurde in vitro mittels primärer, neuronaler- und clonaler-Zellkulturen bestimmt. Die primären, neuronalen Zellen, von denen berichtet wurde, daß sie auf NGF in vitro reagieren, beinhalten fetale sensorische Neurone (embryonaler Tag 8-12) in dorsalen Rückenmarkswurzel-Ganglien, noradrenerge fetale Neurone in sympathischen Ganglien, cholinerge fetale Neurone im Septum und chromaffine Nebennierenzellen in der Entwicklung. Während sensorische und sympathische Neurone hinsichtlich des Überlebens und der Entwicklung von NGF abhängig sind, scheinen cholinerge Neurone keinen NGF zum überleben, sondern nur für ihre Differenzierung zu benötigen, d.h. die Expression von charakteristischen an den Neurotransmitter gebundenen phänotypischen Eigenschaften. Der Zusatz von NGF zu den chromaffinen Nebennierenzellen (aus der Neuralleiste stammende Zellen) im Anfangsstadium ihrer Entwicklung bewirkt die Expression neuronaler Phänotypen. Die clonalen Zellen, von denen berichtet wurde, daß sie in vitro auf NGF reagieren, beinhalten chromaffine, suprarenale aus Tumoren der Neuralleiste stammende Zellen, die als Pheochromocytom- Zellen (PC 12) bekannt sind und menschliche Neuroblostomzellen. Nach der Behandlung mit NGF schalten diese Zellen von einer hohe Proliferation aufweisenden Form auf einen postmitotischen neuronalen Zustand um.
Kürzlich wurde es möglich, NGF und seine mRNA in verschiedenen Gehirnregionen von Ratten zu messen. Es wurde eine auffallende Korrelation zwischen der NGF-Menge und der Verteilung großzelliger, cholinerger Neurone gefunden. In durch großzell ige, cholinerge Neurone innervierten Regionen sowie in ihre Zellkörper enthaltenden Regionen z.B. der Hippocampus wurden relativ hohe NGF-Mengen gefunden, die im Bereich von den in peripheren, sympathischen Zielgeweben beobachteten lagen. Die Gehirnregionen, die nicht mit dem großzelligen, cholinergen System in Verbindung stehen, enthalten erheblich niedrigere NGF-Mengen. Die großzelligen, cholinergen Neurone des basalen Vorderhirns ragen topologisch in den Neocortex, Hippocampus und das Geruchsorgan hinein. Die Lernfähigkeit und das Gedächtnis wurde bei den Nagern mit einer altersabhängigen Abnahme der cholinergen Funktion im Vorderhirn in Verbindung gebracht. Kürzlich erhaltene Ergebnisse zeigen an, daß die cholinergen Neurone in dem großzelligen Basalganglion, dem Bereich des septalen-diagonalen Strangs und dem Striatum eine alters-abhängige Atrophie erleiden. Das räumliche Gedächtnis kann teilweise durch intraventrikuläre NGF- Injektion wiederhergestellt werden. Diese Beziehung zwischen der Unversehrtheit des cholinergen Systems des basalen Vorderhirns und den kognitiven Funktionen kann auch für die Menschen gelten. Eines der neuropathologischen Haupt-Merkmale der Alzheimer Krankheit ist der drastische Verlust der groβzelligen, cholinergen Neurone, obgleich auch andere Transmittersysteme mehrere Veränderungen erleiden. Es wurde eine Korrelation zwischen dem Ausmaß der Schädigung des cholinergen Systems und der Schwere der mentalen Defizite vorgeschlagen.
Die möglichen Verbindungen zwischen NGF und der Pathophysiologie, sowie einer potentiellen Therapie der Alzheimer Krankheit lagen so im Bereich realistischer Erwägung.
Die Beteiligung des cholinergen Systems an den klinischen Symptomen der Alzheimer Krankheit wird auch durch verschiedene experimentelle Beobachtungen unterstützt. Bei Ratten führt beispielsweise eine Unterbrechung der aufsteigenden, cholinergen Bahnen von den Basalganglien des Vorderhirns zu einer auffälligen Verminderung des Gedächtnisses und der Lernfähigkeit. Durch Injektion von NGF in den Hippocampus können diese Lern- und Gedächtnis-Defizite gebessert werden. Die von Alzheimer-Patienten und entsprechenden Tierversuchen verfügbaren pathophysiologischen Informationen eröffnen interessante Möglichkeiten zur Untersuchung der pathophysiologischen Ursachen der Alzheimer Krankheit und zu potentiellen, neuen therapeutische Vorgehensweisen.
Die Verfügbarkeit von cDNA-Sonden für menschlichen NGF, die Möglichkeit zur Herstellung von menschlichem NGF mittels biotechnologischer Verfahren, die sich daraus ergebende Herstellung von spezifischen Antikörpern gegen menschlichen NGF und die Entwicklung eines spezifischen Enzym-Immuntests sind alles Voraussetzungen für eine experimentelle Untersuchung der Frage, ob die Alzheimer Krankheit tatsächlich mit einer unzureichenden Herstellung von menschlichem NGF in Zusammenhang steht. Falls ein solcher Mangel festgestellt wird, wäre es auch notwendig zu postulieren, daß neben einer verminderten Herstellung von NGF auch eine verminderte Herstellung von weiteren, unbekannten, neurotrophen Faktoren vorliegt, die auf ebenfalls von der Alzheimer Krankheit betroffene, jedoch nicht auf NGF reagierende Neuronen-Populationen wirken.
Hinsichtlich der therapeutischen Konsequenzen legen die Vorteile der NGF-Verabreichung bei Lern-Defiziten nach experimentell erzeugten Schädigungen des cholinergen Systems nahe, daß eine gesteigerte Verfügbarkeit von NGF entweder durch exogene Applikation oder Stimulation der endogenen Herstellung, unabhängig von der Ursache der Schädigung der cholinergen Neurone, für diese Neurone wesentlich sein kann.
Da die Herstellung von menschlichem NGF mittels biotechnologischer Verfahren möglich ist, können potentielle, immunologische Schwierigkeiten einer Therapie mit nicht-menschlichem NGF eliminiert werden.
Über viele Jahre basierte die NGF-Forschung primär auf aus Speicheldrüsen der männlichen Maus gereinigtem NGF und den gegen diesen hergestelljten Antikörpern. In einem relativ frühen Stadium der NGF-Forschung wurde deutlich, daß die Injektion von Anti-Maus-NGF-Antikörpern in Hühnerembryonen nicht zu der gleichen umfangreichen Zerstörung des sympathischen Nervensystems führte, wie nach Antikörper-Injektionen in neugeborene Mäuse und Ratten beobachtet. Da die sympathischen und sensorischen Neurone von Hühnern auf Maus-NGF in vivo und in vitro in ähnlicher Weise wie die entsprechenden Maus-Neurone reagieren, war es berechtigt, daraus zu schließen, daß die für die biologische Aktivität verantwortliche Domäne des NGF-Moleküls konserviert worden sein muß, während die anderen Damänen während der Evolution verändert wurden. Diese Annahme wurde ferner nach Reinigung des Rinder-NGF aus Rinder-Spermaplasma bestätigt und ein detaillierter und umfassender Vergleich zwischen der biologischen Aktivität des Maus- und Rinder-NGF wurde möglich. Diese Experimente zeigten, daß die biologische Aktivität von Maus- und Rinder-NGF identisch war, obgleich die immunologische Kreuz-Reaktivität sehr begrenzt war. Das molekulare Clonieren des Maus-, menschlichen, Rinder- und Hühner-NGF zusammen mit der Aminosäure-Sequenzanalyse des Maus-NGF ermöglichte den Vergleich der konservierten und nicht-konservierten Domänen dieser Moleküle sowie ihrer Beziehung zu biologischer Aktivität und Antigenität. Die Gesamt-Konservierung des NGF während der Evolution ist bemerkenswert hoch. Von den 118 Aminosäuren des reifen Maus-β-NGF wurden beim Rinder-NGF nur 16, beim Hühner-NGF 19 und beim menschlichen-NGF 11 ausgetauscht. Durch Reduktion der drei S-S-Brücken des Maus-NGF kann man, wie nach vorhergehenden Beobachtungen erwartet, einen vollständigen Verlust der biologischen Aktivität erreichen. Die ersichtliche Diskrepanz zwischen der hohen Gesamt-Konservierung der Aminosäuresequenz und der geringen immunologischen Kreuzreaktivität ist dadurch bedingt, daß die Aminosäureaustausche zwischen den Spezies in Anhäufungen lokalisiert sind. Hydropathie-Plots zeigten, daß die Austausche im wesentlichen ausschließlich in den hydrophilen Domänen lokalisiert sind, von denen angenommen wurde, daß sie potentielle antigene Determinanten sind. In den NGF-Molekülen aller bisher untersuchten Spezies wurde von nur einem einzigen hydrophilen Bereich gezeigt, daß er streng konserviert ist. Diese konservierte Domäne führt zu zukünftigen Analysen mittels zielgerichteter Mutagenese und mittels gegen synthetische Peptide, die diesem Bereich entsprechen,gerichteter Antikörper.
Die Gegenwart von drei Disulfidbrücken in der korrekten Konformation innerhalb der monomeren β-Untereinheit des NGF stellt bezüglich der biologischen Aktivität und Immunogenität ein Merkmal dieses Proteins dar.
Eine genaue Charakterisierung des nativen Proteins und des von der DNA stammenden Produkts ist wesentlich, wobei beide in der aktiven Form vorliegen. Besondere Aufmerksamkeit ist der Verwendung einer Vielzahl analytischer, verschiedene physikochemische Eigenschaften des Moleküls ausnutzender Techniken zu widmen; z.B. Größe, Ladung, isoelektrischer Punkt, Aminosäurezusammensetzung und Hydrophobizität. Es kann wünschenswert sein, geeignete Tests zum Nachweis einzuschließen, daß das Produkt die gewünschte Konformation und Aggregationszustand aufweist. Für derartige Zwecke geeignete Techniken sind beispielsweise: Polyacrylamid-Gelelektrophorese; isoelektrische Focusierung; Größenausschluß-; Umkehr-Phasen-; Ionenaustausch-; hydrophobe Interaktions- und Affinitätschromatographie; Peptidsequenz-Kartierung; Aminosäureanalyse; Lichtstreuung; UV-Spektroskopie; zirkulärer Dichroismus und andere spektroskopische Techniken. Eine zusätzliche Charakterisierung des Produkts beispielsweise mittels Elektronenmikroskopie oder immunchemischen Verfahren kann wertvolle Informationen liefern. Die biologische und immunologische Charakterisierung soll eine größtmögliche Vielzahl von zur Vorhersage der biologischen Aktivität geeigneten Techniken beinhalten. Die Bestimmung der spezifischen Aktivität von hochgereinigtem Material wird von besonderem Wert sein (Aktivitätseinheiten/Gewicht des Produkts).
Während der zuvor diskutierten Abschätzung der potentiellen pharmazeutischen Anwendung des menschlichen NGF (β-Untereinheit) und den mit den aus E. coli erhaltenen von der DNA stammenden Produkten der ersten Generation korrelierten Problemen, haben die gegenwärtigen Erfinder ein Schema zur Reinigung von NGF (β-Untereinheit) aus menschlicher Plazenta entwickelt, das bei Anwendungen in großem Maßstab denkbar hilfreich ist. Dieses Material wird bezüglich chemischer, immunchemischer und biologischer Charakteristika mittels für derartige Zwecke geeigneter Techniken und Reagentien charakterisiert. Dieses Reinigungsschema oder nur ein einziger Schritt kann offensichtlich zur Reinigung von mittels der rekombinanten DNA-Technologie erhaltenem, menschlichem-NGF angewendet werden, der die gleichen chemischen, immunchemischen und biologischen Charakteristika wie der aus menschlicher Plazenta gereinigte NGF aufweist.
Erfindungsgemäße Arzneimittel umfassen aus menschlichen Geweben gereinigten β-NGF, ein β-NGF-Analogon; biologisch aktive Fragmente des β-NGF oder des β-NGF-Analogons, oder nicht-toxische Salze von diesem; in einer pharmazeutisch verträglichen Flüssigkeit dispergiert oder in einem festen Träger.
Derartige Arzneimittel können in der klinischen Human- oder Tiermedizin bei akuten oder chronischen Verabreichungen zu diagnostischen oder therapeutischen Zwecken ohne Immunogenitätsprobleme verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung zieht Vorteile:
- aus den verschiedenen isolelektrischen Punkten des nativen 75-Komplexes und der β-Untereinheit zur Isolierung und Reinigung des β-NGF mittels Kationen-Austauschharzen und
- aus der Kreuzreaktivität von menschlichem-NGF (β-Untereinheit) mit den gegen Maus-NGF (β-Untereinheit) hergestellten polyclonalen Antikörpern.

Material und Methoden

In vitro-Studien wurden mittels "dissozierter" fetaler Hühner-E8-Zellen des dorsalen Rückenmarkswurzelganglions durchgeführt (Skaper S. et al., Exp. Neurol. 76 (1982), 655). Mittels des vorstehenden in vitro-Modellsystems wurde die Studie der gegen Maus-NGF gerichteten Antikörper bezüglich der Hemmung der biologischen Aktivität von aus menschlicher Plazenta gereinigtem NGF ausgewertet.
Die Reinheit des aus menschlicher Plazenta stammenden NGF (β- Untereinheit) wurde mittels der SDS-Flachgelelektrophorese- Technik (Laemmli U.K. Nature 227 (1970), 680) abgeschätzt. Die Immunreaktivität wurde mittels der Immunblot-Technik überprüft (Gershoni J.M. et al., Anal. Biochem. 131 (1983), 1).
Polyclonale Antikörper gegen NGF wurden mittels Affinitätschromatographie gereinigt unter Verwendung von an Sepharose 4B gebundenem 2.5S Maus-NGF (Stoeckel K. et al., J. Neurochem. 26 (1976), 1207).
Monoclonale Anti-Maus-NGF-Antikörper wurden durch Fusion von immunisierten Milzzellen aus der Ratte mit P3-X 63/AG8 Maus- Myelomzellen erhalten (Köhler G. et al., Nature 256 (1975), 495).

Reinigung des menschlichen β-NGF

Das Isolierungsverfahren wurde wie folgt durchgeführt:

Schritt 1:

Das Kotyledonengewebe einer einzigen menschlichen Plazenta wurde 1-3 Minuten mit kaltem (4ºC) deionisiertendestillierten Wasser in einem Hochgeschwindigkeits-Sorvall- "Amnimixer" homogenisiert. Das Homogenat wurde 35 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde anschließend lyophilisiert, in 0.02 M Natriumphosphat-Puffer pH 6.8 resuspendiert und 16 Stunden bei 4ºC gegen zweimal 4 Liter der gleichen Pufferlösung dialysiert. Alle weiteren Schritte wurden bei der gleichen Temperatur durchgeführt.

Schritt 2:

Der dialysierte Überstand wurde mit einem in 0.02 M Phosphatpuffer pH 6.8 equilibrierten CM-Celluloseharz gemischt. Der feste Träger wurde mit dem gleichen Puffer gewaschen bis die Absorption des Eluats bei 280 nm unter 0.1 sank. Das Eluat wurde dann zur Reduktion der Pufferkapazität der Lösung über einen Zeitraum von 24 Stunden gegen zweimal 4 Liter eines 0.25 mM Phosphatpuffers pH 6.8 dialysiert.

Schritt 3:

Zu der dialysierten Lösung wurde zum schnellen Absenken des pH-Werts, Dissoziieren des 7S-NGF und Einstellen einer Pufferendkonzentration von 0.05 M ein Neuntel des Lösungsvolumens Natriumacetatpuffer pH 4.0 zugesetzt. Zum Einstellen der NaCl-Endkonzentration auf 0.4 M wurde ausreichend festes NaCl zugesetzt. Die Lösung wurde nach 5-minütigem Stehenlassen zur Präzipitatbildung und nach Verwerfen des Pellets 30 Minuten bei 27000 g zentrifugiert.

Schritt 4:

Die angesäuerte Lösung wurde sofort auf eine zweite mit 0.05 M Natriumacetatpuffer pH 4.0 equilibrierte, 0.4 M NaCl enthaltende CM-Cellulosesäule gegeben. Das nicht- adsorbierte Material wurde mit 400 ml des gleichen Puffers von der Säule eluiert. Nach dem Waschen der Säule mit 50 ml 0.05 M Natriumacetatpuffer pH 4.0 wurde das zurückgebliebene Protein in zwei Schritten eluiert. Die Elution mit 0.05 M Tris-HCl Puffer pH 9.0 (ca. 200 ml) erzeugte eine rotgefärbte, die Hälfte des zurückgebliebenen Proteins enthaltende Fraktion. Die partiell gereinigte menschliche NGF-Fraktion wurde zuletzt mit 0.5 M NaCl enthaltendem 0.05 M Tris-HCl pH 9.0 eluiert. Das eluierte Material wurde über Nacht gegen 0.2 M NaCl enthaltendes 0.5 M Natriumacetat pH 5.0 dialysiert.

Schritt 5:

Die Lösung wurde 15 Minuten bei 27000 g zentrifugiert und der Überstand auf eine mit 0.2 M NaCl enthaltendem 0.05 M Natriumacetat pH 5.0 equilibrierte CM-Cellulosesäule geladen. Die Säule wurde schrittweise mit 0.4 M NaCl und 0.5 M NaCl enthaltendem 0.05 M Natriumacetat pH 5.0 gewaschen. Das mit der biologischen Aktivität assoziierte Material wurde mittels 1.0 M NaCl enthaltendem 0.05 M Natriumacetat pH 5.0 von der Säule eluiert. Das Material wurde gegen 2 Liter- Einheiten 0.05 M Natriumacetat pH 5.5 dialysiert.

Schritt 6:

Das biologische Material wurde auf eine mit 0.05 M Natriumacetat pH 5.5 equilibrierte Kationenaustausch-Mono-S- Säule gegeben. Die Elution des biologischen Materials wurde mittels eines NaCl-Gradienten (0-1.0 M) in 50 mM Natriumacetat pH 6.6 durchgeführt. Die Durchflußrate betrug 1 ml/min. Das mit der biologischen Aktivität assoziierte Protein wurde in einem Zeitraum von 26-30 Minuten bei einer NaCl-Konzentration von 0.35-0.45 M eluiert. Das Material wurde gegen 0.1 M NaCl enthaltendes 0.05 M Natriumacetat pH 5.0 dialysiert.

Schritt 7:

Das biologische Material wurde auf eine Affinitätschromatographie-Säule gegeben, an die die polyclonalen Anti-Maus-NGF-Antikörper mittels eines kovalenten Verfahrens an den festen Träger gebunden wurden. Die Säule wurde ausgiebig mit 0.05 M Natriumacetat pH 5.0 (Equilibrationspuffer) gewaschen. Der gebundene menschliche NGF wurde mit 0.02% menschliches Serumalbumin enthaltendem 0.1 M Glycin-HCl pH 2.5 eluiert.
Die chemischen und immunchemischen Charakteristika des aus menschlicher Plazenta gereinigten hNGF (biologisch aktive Untereinheit) lauten:
a) das mittels SDS-Gelelektrophorese bestimmte Molekulargewicht des gereinigten Materials betrug annährend 24.3- 25.3 Kdaltons (Fig.1);
b) der isoelektrische Punkt dieses Materials lag annährend bei 9.3-9.8;
c) der aus menschlicher Plazenta stammende hNGF (β-Untereinheit) wies bei der Western-Blot-Technik unter Verwendung einer Konzentration van 0.5 ug/ml Affinitätsgereinigter, gegen Maus-NGF hergestellter polyclonaler Antikörper eine Kreuzreaktivität gegen dieses Reagens (Fig.2) auf.
- Bei der Verwendung eines für die biologische Stelle des Maus-NGF spezifischen monoclonalen Antikörpers in einer Konzentration von 2.0 ug/ml wurde mittels der gleichen Technik das Nicht-Auftreten dieser Kreuzreaktivität festgestellt.
- Der aus menschlicher Plazenta gereinigte hNGF (β-Untereinheit) zeigte auf DRG E8 (Fig.3) biologische Aktivität. Die in Figur 3 dargestellten Ergebnisse wurden gemäß eines in der Literatur beschriebenen Verfahrens erhalten (Skaper S. et al., Exp. Neurol. 76 (1982), 655).
Die durch den aus menschlicher Plazenta gereinigten hNGF bedingte biologische Aktivität wurde durch hohe Konzentrationen Affinitäts-gereinigter, polyclonaler Antikörper (Fig.4) und des monoclonalen Antikörpers (Fig.5) gehemmt.
Allgemein sind die für die Reinigungsschritte der vorliegenden Erfindung verwendeten Reaktionsbedingungen die im Fachgebiet bekannten, verbunden mit zur Proteinreinigung verwendeten chromatographischen Verfahren. Derartige Verfahren sind in der Literatur beschrieben, beispielsweise in: "Enzyme Purification and related Techniques", Kapitel über "Enzymes and Cellular Biochemistry", Hrsg. Jakoby W.B., National Institute of Health, Bethesda, Maryland, Academic Press (1971): L.D.- Goldstein et al., Neurochemical Research (3) (1978), 175-183; Walker P. et al., Life Sciences 26 (1980), 195-200; Mobley W.C. et al., Biochem. Vol. 15, Nr. 25, 5543-5551; Pietro Calissano et al., Hormonal Proteins and Peptides, Vol. XII, "The Nerve Growth Factor (NGF)". Die Reinigungsschritte können in einem Temperaturbereich von 20 bis 12ºC durchgeführt werden.

Arzneimittel

Die Formulierung von Arzneimitteln, die das aus menschlicher Plazenta stammende hNGF-Molekül (β-Untereinheit) in diesem Zusammenhang ohne, möglicherweise aber auch mit, Gangliosiden und Phospholipiden enthalten, umfaßt für die Herstellung von pharmazeutisch verträglichen Zusammensetzungen bereits bekannte Verfahren, die für die wirksame Verabreichung an den Patienten geeignet sind. Mittels dieser Verfahren wird eine wirksame Menge des hNGF-Moleküls in einem Gemisch mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger kombiniert. Geeignete Träger und ihre andere Proteine einschließende Formulierung werden beispielsweise in dem Buch "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Company, Easton, Pa., USA 1985, beschrieben. Diese Träger umfassen injizierbare "Depot-Formulierungen".
Die pharmazeutische Formulierung umfaßt, basierend auf dem Vorstehenden, jedoch nicht ausschließlich, hNGF-Lösungen oder ein gefriergetrocknetes hNGF-Pulver in Verbindung mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Trägern oder Verdünnungsmitteln. Sie ist in gepufferten Medien mit geeignetem pH enthalten und durch physiologische Flüssigkeiten isosmotisch. Tabelle 1 stellt die mögliche Zusammensetzung der Formulierungen nur zur Veranschaulichung dar ohne dadurch eingeschränkt zu sein. Diese können in Form von Lösungen zur Behandlung von Erkrankungen des Nervensystems hergestellt werden. Im Fall der gefriergetrockneten Präparationen können unterstützende Exzipienten wie Mannitol oder Glycin jedoch nicht ausschließlich verwendet werden. Es werden geeignete, gepufferte Lösungen des gewünschten Volumens bereitgestellt, so daß man adäquate isotonisch gepufferte Lösungen des gewünschten pH erhält. Ahnliche Lösungen können für Arzneimittel, die das hNGF-Molekül in isotonischen Lösungen des gewünschten Volumens enthalten, verwendet werden und umfassen jedoch nicht ausschließlich die Verwendung von mit Phosphat oder Citrat in geeigneten Konzentrationen gepufferten Kochsalzlösungen. Man erhält so jederzeit isotonische, pharmazeutische Präparationen des gewünschten pH, beispielsweise mit neutralem pH.
In den Tabellen 2 und 3 sind zur Erläuterung nochmals einige mögliche Arzneimittel zur Behandlung von Erkrankungen des Nervensystems zusammengefaßt. Bei den in den Tabellen 2 und 3 aufgelisteten Arzneimitteln handelt es sich um Präparationen, die aus zwei Fläschchen je Einzeldosis bestehen. Das erste Fläschchen enthält den aktiven Stoff. Dieser setzt sich aus etwa 0.01 bis 50 Gewichtsprozent des aktiven Stoffs gemeinsam mit einem pharmazeutisch verträglichen Exzipienten wie Glycin oder Mannitol zusammen. Das zweite Fläschchen enthält ein mit dem gewünschten Volumen Phosphat- oder Citrat-gepufferter Kochsalzlösung hergestelltes Lösungsmittel. Die Inhalte der beiden Fläschchen werden unmittelbar vor der Verabreichung gemischt, wobei der gefriergetrocknete, aktive Stoff sich schnell löst. Man erhält eine injizierbare Lösung (System Nr.5).
Die pharmazeutische Formulierung umfaßt auch Zäpfchen zur rektalen Verabreichung mit lipophilen d.h. wasserlöslichen, autoemulgierenden Exzipienten aus Glycogelatine oder anderen Typen. Diese Präparationen können hNGF in zwischen 0.01 und 1 Gewichtsprozent des Gesamtexzipienten schwankenden Mengen aufweisen. Die Zäpfchenformen können geeignete Acetylsalicylatmengen enthalten.
Tabelle 4 listet nur zur Erläuterung mögliche Zäpfchen-Präparationen zur Behandlung von Erkrankungen des Nervensystems auf.
Ferner können die pharmazeutischen hNGF-Präparationen wie vorstehend beschrieben, in gefriergetrockneter Form und als Lösungen Phospholipide oder Ganglioside in wirksamen Dosen enthalten. Die Dosen können beispielsweise (obgleich nicht ausschließlich) denen allgemein beim Menschen zur Behandlung von Reparaturen des Nervensystems bzw. Alters-bedingten Beschwerden verwendeten ähneln, und sie können von der Verabreichungsart abhängen. Die Dosierung der pharmazeutischen hNGF-Präparationen und der Zeitpunkt der Verabreichung hängen von der gewünschten Wirkung (bestimmt durch Klinikversuche) und der Verabreichungsart ab. Die Dosierung und der Zeitpunkt der Verabreichung können beispielsweise (obgleich nicht ausschließlich) denen üblicherweise bei Studien mit anderen neurotrophen Agentien verwendeten ähneln. Tabelle Beispiele von Arzneimitteln in Form injizierbarer Lösungen Präparation Nr. 1 - eine 2 ml Ampulle enthält: Aktiver Stoff Natriumchlorid Citratpuffer pH = 7 in kein Fieber erzeugendem, destillierten Wasser q.b.

Präparation Nr. 2 - eine 2 ml Ampulle enthält:

Aktiver Stoff ug 10 (25000 BU)
Natriumchlorid mg 16
Citratpuffer pH = 7 ml 2
in kein Fieber erzeugendem, destillierten Wasser g.b.
Die biologische Einheit (BU) ist wie in der Veröffentlichung von Fenton E.L., Expl. Cell Res. 59 (1970), 383, definiert. Tabelle 2 Beispiele von Arzneimittelsystemen System a) Ein 2 ml Fläschchen enthält: Gefriergetrockneten, aktiven Stoff Glycin b) Ein 2 ml Lösungsmittel-Fläschchen enthält: Natriumchlorid Citratpuffer in Wasser kein Fieber erzeugendes, destilliertes Wasser g.b. Mannitol Tabelle 3 Beispiele von Arzneimittelsystemen System Nr. 4: a) Ein 3 ml Fläschchen enthält: Gefriergetrockneten, aktiven Stoff Glycin b) Ein 3 ml Lösungsmittel-Fläschchen enthält: Natriumchlorid Citratpuffer in Wasser kein Fieber erzeugendes, destilliertes Wasser g.b. System Nr. 5 (Beispiel zur subcutanen Injektion): Tabelle 4 Beispiele von Arzneimitteln in Form von Zäpfchen für den rectalen Applikationsweg Präparation Aktiver Stoff Kakaobutter Präparation Carbowax Präparation Aktiver Stoff Tween Lanolin Wasser Gelatine

Claims

1. Verfahren zur Herstellung der biologisch aktiven β- Untereinheit von menschlichem Nervenwachstumsfaktor (NGF) aus menschlicher Plazenta, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:

a) Homogenisierung des Gewebes von menschlicher Plazenta,

b) Dialyse bei pH 4, um die 75-NGF-Form zu dissoziieren,

c) chromatographische Fraktionierung der erhaltenen Lösung an einer Dreischritt-Kationenaustauschchromatographie-Säule,

d) Reinigung der erhaltenen aktiven Fraktion durch Kationenaustauschchromatographie mit einem Natriumchloridgradienten und einem pH-Gradienten von 5,5 bis 6,5, und

e) Reinigung der so erhaltenen aktiven Fraktion durch Affinitätschromatographie an polyclonalen Antikörpern, die gegen Maus-NGF gewonnen wurden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei Schritt b) bei einem pH-Wert von 3,5 bis 4,5 durchgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die aktiven Fraktionen von der Kationenaustauschchromatographie- Säule mit einem Natriumchloridgradienten eluiert werden, der in 0,05 M Acetatpuffer gelöst ist und eine NaCl-Konzentration von 0 M bis 1 M und einen pH-Wert von 5,5 bis 6,5 aufweist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die aktive Fraktion durch Affinitätschromatographie an vernetzten polyclonalen Antikörpern gereinigt wird, die gegen Maus-NGF (β- Untereinheit) produziert wurden.

5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Verfahrensschritte bei einer Temperatur von 2 bis 12ºC durchgeführt werden.

6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die aktiven Fraktionen gepoolt und gefriergetrocknet werden.

7. Verfahren nach Anspruch 1, 2 , 3 oder 4, wobei nur einer der Reinigungsschritte auf die Reinigung von hNGF angewendet werden kann, das durch rekombinante DNA-Technologie erhalten wurde.

8. Isolierte β-Untereinheit des Nervenwachstumsfaktors von menschlicher Plazenta, die ein gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7 erhältliches basisches Protein ist.

9 Isolierte β-Untereinheit des Nervenwachstumsfaktors von menschlicher Plazenta, die ein basisches Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 24 300 bis 25 300 Daltons ist und eine biologische Aktivität von mindestens 2500 BU pro 1 ug Protein an DRG-E8 aufweist, wobei die biologische Aktivität in Gegenwart von polyclonalen Antikörpern gehemmt ist.

10. Isolierte β-Untereinheit von menschlichem Nervenwachstumsfaktor nach Anspruch 8 oder 9 von menschlicher Plazenta, die einen isoelektrischen Punkt von etwa 9,3 bis 9,8 hat.

II. Arzneimittel, umfassend eine neurotrophisch wirksame Menge von hNGF (β-Untereinheit) nach den Ansprüchen 8, 9 oder 10, die ein basisches Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 25 000 Daltons und für den Menschen nicht immunogen ist, und ein pharmazeutisch verträglicher Exzipient oder ein Verdünnungsmittel.

12. Arzneimittel nach Anspruch 11, das außerdem mindestens ein Gangliosid oder mindestens ein Phospholipid umfaßt.