PL191400B1 - Sposób izolowania neurotrofiny z mieszaniny białek i kompozycja neurotrofiny - Google Patents

Sposób izolowania neurotrofiny z mieszaniny białek i kompozycja neurotrofiny

Info

Publication number
PL191400B1
PL191400B1 PL333460A PL33346097A PL191400B1 PL 191400 B1 PL191400 B1 PL 191400B1 PL 333460 A PL333460 A PL 333460A PL 33346097 A PL33346097 A PL 33346097A PL 191400 B1 PL191400 B1 PL 191400B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
neurotrophin
ngf
cells
arg
thr
Prior art date
Application number
PL333460A
Other languages
English (en)
Other versions
PL333460A1 (en
Inventor
Louis E. Burton
Charles H. Schmelzer
Joanne T. Beck
Original Assignee
Genentech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genentech Inc filed Critical Genentech Inc
Publication of PL333460A1 publication Critical patent/PL333460A1/xx
Publication of PL191400B1 publication Critical patent/PL191400B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/48—Nerve growth factor [NGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators

Abstract

1. Sposób izolowania neurotrofiny z mieszaniny bialek, znamienny tym, ze oddziela sie neuro- trofine od innych bialek z wykorzystaniem zywicy bedacej zelem krzemionkowym poprzez elucje neurotrofiny za pomoca buforu elucyjnego zawierajacego TMAC lub TEAC buforowanego do pH 3,5 do 8,0 w nieobecnosci alkoholowego lub polarnego rozpuszczalnika aprotonowego. 2. Kompozycja neurotrofiny, znamienna tym, ze zostala wytworzona sposobem jak okreslono w zastrz. 1 i zawiera neurotrofine o czystosci przynajmniej 95%, która ma sekwencje aminokwasowa w ponad 90% homologiczna z sekwencja aminokwasowa neurotrofiny wybrana sposród prepro czynnika wzrostu nerwów o sekwencji SEQ ID NO: 1 (prepro-NGF), rekombinowanego ludzkiego czynnika wzrostu nerwów o sekwencji SEQ ID NO: 2 (rhNGF), rekombinowanego ludzkiego po- chodzacego z mózgu czynnika neurotropowego o sekwencji SEQ ID NO: 4 (BDNF), neurotrofiny-3 o sekwencji SEQ ID NO:5 (NT-3) i neurotrofiny-4/5 o sekwencji SEQ ID NO: 6 (NT-4/5). PL PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób izolowania neurotrofiny z mieszaniny białek i kompozycja neurotrofiny.
Wytwarzanie dużych ilości stosunkowo czystych, biologicznie aktywnych polipeptydów i białek jest ekonomicznie ważne dla produkcji preparatów farmaceutycznych dla ludzi i zwierząt, enzymów i innych specjalnych odczynników chemicznych. Do wytwarzania wielu białek metodą z wyboru stały się techniki rekombinacji DNA, ponieważ duże ilości egzogennych białek mogą ulegać ekspresji w ssaczych komórkach gospodarza, bakteriach i innych komórkach gospodarza.
Pierwszorzędową strukturę ssaczego NGF (NGF myszy) po raz pierwszy określili Angeletti i Bradshaw, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 68: 2417 (1971). Pierwszorzędową strukturę jego prekursora, pre-pro-NGF, przewidziano na podstawie sekwencji nukleotydowej cDNA NGF myszy (Scott i in., Naturę 302: 538 (1983); Ullrich i in., Naturę 303: 821 (1983)).
Zidentyfikowano również homologiczny gen NGF człowieka (hNGF) (Ullrich, Symp. on Quan. Biol., Cold Spring Harbor 48: 435 (1983); opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5,288,622, wydany 22 lutego 1994 r., włączony do niniejszego opisu poprzez odnośnik literaturowy). Jego homologia do mysiego NGF wynosi około 90% i 87% na odpowiednich poziomach sekwencji aminokwasowej i nukleotydowej. Z powodu małej obfitości naturalnie występującego NGF, nie przygotowano go ze źródeł naturalnych w ilościach wystarczających do szczegółowego scharakteryzowania biochemicznego.
Dotychczas zidentyfikowano dodatkowe czynniki neurotroficzne zbliżone do NGF. Obejmują one mózgopochodny czynnik neurotroficzny (BDNF) (Leibrock i in., Nature, 341: 149-152 (1989)), neurotrofinę-3 (NT-3) (Kaisho i in., FEBS Lett., 266: 187 (1990); Maisonpierre i in., Science, 247: 1446 (1990); Rosenthal i in., Neuron, 4: 767 (1990)) oraz neurotrofinę-4/5 (NT-4/5) (Berkmeier i in., Neuron, 7: 857-866 (1991)). GDNF, członek nadrodziny TGF-β o niewielkim podobieństwie, oraz neurturyna („NTN”) są dwoma ostatnio zidentyfikowanymi, strukturalnie zbliżonymi, silnymi czynnikami zapewniającymi przeżycie dla neuronów czuciowych współczulnego układu nerwowego i neuronów ośrodkowego układu nerwowego (Lin i in., Science 260: 1130-1132 (1993); Henderson i in., Science 266: 1062-1064 (1994); Buj-Bello i in., Neuron 15: 821-828 (1995); Kotzbauer i in., Nature 384: 467-470)).
Wytwarzanie zrekombinowanych białek obejmuje transfekowanie komórek gospodarza DNA kodującym białko i hodowania komórek w warunkach sprzyjających ekspresji zrekombinowanego białka. Prokariotyczny organizm, E. coli, jest zalecanym gospodarzem, ponieważ można go zmodyfikować tak, aby wytwarzał zrekombinowane białka z wysoką wydajnością przy niskich kosztach. Istnieją liczne opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki dotyczące ogólnej ekspresji w bakteriach DNA kodujących białka, włącznie z opisem patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4,565,785 dotyczącym zrekombinowanej cząsteczki DNA obejmującej gen bakteryjny zewnątrzkomórkowego lub periplazmatycznego białka nośnikowego oraz gen niebakteryjny; opisem patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4,673,641 dotyczącym współ-wytwarzania obcego polipeptydu z polipeptydem tworzącym agregaty; opisem patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4,738,921 dotyczącym wektora ekspresyjnego z promotorem/operatorem trp i fuzją trp LE z takim polipeptydem, jak IGF-I; opisem patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4,795,706 dotyczącym sekwencji kontrolujących ekspresję do stosowania z obcym białkiem oraz opisem patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4,710,473 dotyczącym określonych kolistych plazmidów DNA, takich jak te kodujące IGF-I, oraz publikacją patentową WO 92/22665 ujawniającą sposób wytwarzania i odzyskiwania rekombinowanej neurotrofiny w komórkach nie-zwierzęcych transformowanych rekombinowaną cząsteczką DNA obejmującą sekwencje regulujące ekspresję połączone operacyjnie z sekwencją DNA kodującą neurotrofinę, w wyniku którego otrzymuje się cząsteczki neurotrofiny z takim samym aminokwasem N-końcowym.
Uzyskane technikami inżynierii genetycznej środki farmaceutyczne pochodzenia biologicznego zazwyczaj oczyszcza się z supernatantu zawierającego szereg różnych zanieczyszczeń pochodzących z komórek gospodarza. W szczególności, donoszono o oczyszczaniu NGF w różnym stopniu, przy różnych nakładach i efektach, z zastosowaniem licznych różnych metod. Patrz, na przykład, Longo i in., IBRO Handbook, tom 12, str. 3-30 (1989); opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5,082,774, który ujawnia wytwarzanie NGF w komórkach CHO; Bruce i Heinrich (Neurobio. Aging 10: 89-94 (1989); Schmelzer i in., J. Neurochem. 59: 1675-1683 (1992); Burton i in., J. Neurochem. 59: 1937-1945 (1992). Próby te przeprowadzano na skalę laboratoryjną. Zobacz ponadto przykładowo publikację patentową WO 92/05254 dotyczącą oczyszczania neurotrofin i pokrewnych cząsteczek
PL 191 400 B1 z wykorzystaniem żywicy krzemionkowej oraz publikację patentową WO 05/16701 ujawniającą sposób selektywnego oddzielania polipeptydu od innych składników kompozycji na żelu krzemionkowym, na podstawie zróżnicowanej hydrofobowości rozdzielanych składników, przy zastosowaniu elucji rozpuszczalnikiem alkoholowym lub polarnym rozpuszczalnikiem aprotonowym.
Jednakże nie powiodło się preparatywne wyizolowanie zrekombinowanego ludzkiego NGF zasadniczo wolnego od wariantów, w wyniku którego można by było uzyskać czystość farmaceutyczną i wysoką wydajność.
A zatem, istnieje w tej dziedzinie potrzeba efektywnego protokołu dotyczącego selektywnego oddzielania neurotrofin, szczególnie NGF i rodziny NGF neurotrofin, od ich wariantów i innych cząsteczek oraz od innych polipeptydów o wysokim pl. Dla zaspokojenia potrzeb klinicznych, sposób oczyszczania neurotrofin na dużą skalę powinien mieć zastosowanie do materiału wyjściowego z różnych źródeł, włącznie z brzeczką fermentacyjną, zlizowanymi komórkami bakteryjnymi lub ssaczymi.
Przedmiotem wynalazku jest sposób izolowania neurotrofiny z mieszaniny białek polegający na tym, że oddziela się neurotrofinę od innych białek z wykorzystaniem żywicy będącej żelem krzemionkowym poprzez elucję neurotrofiny za pomocą buforu elucyjnego zawierającego TMAC lub TEAC buforowanego do pH 3,5 do 8,0 w nieobecności alkoholowego lub polarnego rozpuszczalnika aprotonowego.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto kompozycja neurotrofiny charakteryzująca się tym, że została wytworzona sposobem określonym powyżej i zawiera neurotrofinę o czystości przynajmniej 95%, która ma sekwencję aminokwasową w ponad 90% homologiczną z sekwencją aminokwasową neurotrofiny wybraną spośród prepro czynnika wzrostu nerwów o sekwencji SEQ ID NO: 1 (prepro-NGF), rekombinowanego ludzkiego czynnika wzrostu nerwów o sekwencji SEQ ID NO: 2 (rhNGF), rekombinowanego ludzkiego pochodzącego z mózgu czynnika neurotropowego o sekwencji SEQ ID NO: 4 (BDNF), neurotrofiny-3 o sekwencji SEQ ID NO: 5 (NT-3) i neurotrofiny-4/5 o sekwencji SEQ ID NO: 6 (NT-4/5).
Korzystnie kompozycja zawiera nośnik i neurotrofinę, która jest zasadniczo czysta i wolna od innych białek, przy czym neurotrofina stanowi przynajmniej 95% białka kompozycji.
Korzystniej kompozycja jest jałowa.
Sposób izolacji neurotrofiny według wynalazku może być stosowany do oczyszczania neurotrofin, szczególnie tych z rodziny NGF, bardziej szczegółowo czynnika wzrostu nerwów (NGF) i neurotrofiny-4/5 (NT-4/5) oraz neurotrofiny-3 (NT-3), od towarzyszących im zanieczyszczeń, zwłaszcza, jeśli wytworzono je przez fermentację w komórkach bakteryjnych lub ssaczych.
W jednej postaci realizacji sposób izolacji neurotrofiny, szczególnie neurotrofiny z rodziny NGF, włącznie z NGF, NT-3, NT-4/5 i BDNF, których cechą wspólną jest rozpoznawanie przez wykazującą wysoką homologię rodzinę receptorów (trks), dogodnie rhNGF, rNT-3, rhNT-4/5, rhBDNF oraz ich pożądanych uzyskanych technikami inżynierii genetycznej form, może obejmować zastosowanie chromatografii oddziaływań hydrofobowych (HIC). NGF posiada jedno miejsce N-glikozylacji w pozycji Asn45. W przypadku ulegającej ekspresji w bakteriach, ponownie ufałdowywanej rhNT-4/5, HIC rozdziela właściwie ufałdowaną postać NT-4/5 od postaci niewłaściwie ufałdowanych. W wyniku przeprowadzania sposobu opisanego w niniejszym opisie, neurotrofina jest zasadniczo wolna od tych wariantów. Do oczyszczania neurotrofin zalecaną grupą funkcyjną żywicy HIC jest grupa fenylowa, chociaż użyteczne mogą być grupy oktylowa i butylowa. Szczególnie zalecane rozwiązania obejmują żywice HIC Phenyl Toyopearl, Phenyl Sepharose Fast Flow Low Substitution, TSK-Phenyl 5PW lub podobne.
W innej postaci realizacji sposób izolacji neurotrofiny, szczególnie neurotrofiny z rodziny NGF, dogodnie rhNGF, rNT-3, rhNT-4/5 lub rhNT-4/5, rhBDNF oraz ich pożądanych uzyskanych technikami inżynierii genetycznej form, może obejmować zastosowanie preparatywnej chromatografii kationowymiennej, która rozdziela warianty o zmodyfikowanym ładunku, takie jak postacie utlenione, izoasparaginianowe lub zdeamidowane, od dojrzałej neurotrofiny. Szczególnie zalecane rozwiązania wykorzystują SP-Sepharose High Performance, Fractogel EMD SO3 lub żywicę z kwasem poliasparaginowym, z których szczególnie zalecana jest PolyCAT A. Najdogodniej, na dużą skalę stosuje się żywice SP-Sepharose High Performance lub Fractogel EMD SO3.
W jednej postaci realizacji sposób oddzielania neurotrofin, szczególnie tych z rodziny NGF, dogodnie zrekombinowanych ludzkich NGF, NT-3, NT-4/5 oraz ich pożądanych postaci uzyskanych technikami inżynierii genetycznej może obejmować oddzielanie zbliżonych niepożądanych wariantów, np. powstających podczas fermentacji wariantów różniących się rozszczepieniem przez proteazę, wariantów glikolizacyjnych, wariantów niewłaściwie ufałdowanych, za pomocą chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami. W postaci bardziej zalecanej, NGF jest postacią homodimeru 120/120 lub 118/118.
PL 191 400 B1
W wyniku przeprowadzania sposobu opisanego w niniejszym opisie, neurotrofina jest najdogodniej zasadniczo wolna od wariantów.
W innej postaci realizacji sposób izolacji neurotrofiny, szczególnie tych z rodziny NGF, od zbliżonych wariantów może obejmować zastosowanie warunków elucji obejmujących fizjologiczne pH.
W jeszcze innej postaci realizacji sposób izolacji neurotrofiny może skutkować znaczącą poprawą jej homogenności.
W jednej postaci realizacji sposób według wynalazku obejmuje etap chromatografii na żelu krzemionkowym, który efektywnie usuwa białka komórek gospodarza z frakcji neurotrofiny, którą jest dogodnie frakcja NGF.
W jednej postaci realizacji sposób według wynalazku może obejmować etap, w którym NGF o długości 120 aminokwasów poddaje się traktowaniu proteazą podobną do trypsyny w celu selektywnego usunięcia terminalnego dipeptydu RA z C-końca VRRA, dla otrzymania rodzaju 118. Zalecana jest kolumna z immobilizowaną trypsyną.
Dogodnie, w pewnej postaci realizacji zapewnia się dojrzały NGF człowieka, dojrzałą NT-3 człowieka lub szczura i dojrzałą NT-4/5 człowieka. W zalecanej postaci realizacji NGF jest rodzajem 120, a dogodniej postacią 118, najdogodniej homodimerem, np. 118/118.
Figura 1 przedstawia chromatogram z SP-Sepharose HP. Zawierającą NGF mieszaninę pochodzącą z fermentacji o objętości 12 000 litrów, po chromatografii HIC, nałożono na żywicę SP-Sepharose High Performance (wymiary kolumny 1,0 x 35 cm; objętość złoża 27,5 ml), żywicę 25 omnifit SPSHP. Buforem A był 0,2 M NaCl, 20 mM bursztynian, pH 6,0 (23 ms). Buforem B był 0,7 M NaCl, 20 mM bursztynian, pH 6,0 (63 ms). Kolumnę najpierw zrównoważono Buforem A. Połączone frakcje po HIC o objętości 345 ml i stężeniu 0,24 mg/ml doprowadzono do 25 mM stężenia bursztynianu, pH 6,0 (17 ms), z czego nałożono 362 ml w ilości 3 mg/ml żywicy; nałożono 82,5 mg NGF. Szybkość nakładania wynosiła 40 cm na godzinę. NGF wyeluowano stosując gradient 22 objętości kolumny od 30% do 85% Buforu B (0,35 do 0,60 M NaCl; 37 do 57 ms). Szybkość elucji wynosiła 60 cm na godzinę. Wykreślono jednostki absorbancji (280 nm) i mS/cm wobec numerów frakcji i objętości elucji w ml. Określono frakcje zawierające NGF i połączono je. W tym przypadku połączono frakcje od 43 do 60 otrzymując próbkę o objętości 99 ml i stężeniu NGF 0,38 mg/ml, uzyskując około 46% odzysk.
Figura 2 przedstawia analizę przez kationowymienną SP-NPR HPLC (HPIEX) połączonych frakcji z rozdziału na Phenyl Sepharose Fast Flow i połączonych frakcji z rozdziału na SP-Sepharose HP. Dla każdej z nich chromatogramy oznaczono.
Figura 3 przedstawia analizę przez C4 RP-HPLC wybranych frakcji (części głównej, części wstępującej i części zstępującej głównego piku) z etapu chromatografii na SP-Sepharose HP. Trzy sygnały nałożono na siebie i oznaczono je. Jak można stwierdzić, główny pik (zawierający dojrzały NGF) oddzielony jest od kilku mniejszych pików, które zawierają warianty NGF.
Figura 4 przedstawia sekwencję prepro-NGF człowieka (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 1). Na figurze wskazano pierwszy aminokwas dojrzałego NGF (pozycja 1) i ostatni aminokwas postaci 120 NGF (pozycja 120). Zalecaną sekwencją aminokwasową NGF jest ta dojrzałej postaci 118 (od pozycji 1 do pozycji 118). Przedstawiono również warianty postaci: dojrzałą 120 (od pozycji 1 do pozycji 120); dojrzałą 117 (od pozycji 1 do 117); R120 (od pozycji 1 do 120) i innych postaci o niewłaściwych miejscach trawienia, które występują na końcach N i C, włącznie z dojrzałymi wariantami 114 (aminokwasy od 1 do 114), 115 (aminokwasy od 1 do 115) i 117 (aminokwasy od 1 do 117). Główny nie-właściwie strawiony wariant, niewłaściwie strawiony proteolitycznie, posiada N-końcowe rozszczepienie pomiędzy amino-kwasami R(-39) i S(-38) w prosekwencji NGF. Prawdopodobną inicjującą Met podkreślono. Inne warianty N-końcowe obejmują skrócone postaci NGF, przy czym najczęstsze posiadają rozszczepienie pomiędzy aminokwasami H8 i R9 oraz R9 i G10.
Figura 5 przedstawia sekwencje aminokwasowe neurotrofin: NGF człowieka (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 2), NGF myszy (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 3), BDNF (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 4), NT-3 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 5) oraz NT-4/5 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 6). Regiony w ramkach wskazują zawierające cysteiny regiony zaangażowane w motywie węzła cysteinowego (De Young i in., Protein Sci. 5(8): 1554-66 (1996)).
Figura 6 przedstawia wzór chromatograficzny rhNT-4/5 na kolumnie z żywicą DEAE-Sepharose Fast Flow (DEFF). Chromatogram oznaczony „NT45DE1:1_UV” jest pomiarem absorbancji UV przy długości fali 280 nm. Chromatogram oznaczony „NT45DE1:1_Cond1” jest pomiarem przewodności eluowanych frakcji. Zawierające neurotrofinę frakcje, które połączono, wskazano poziomą strzałką oznaczoną „Połączone frakcje”.
PL 191 400 B1
Figura 7 przedstawia wzór chromatograficzny rhNT-4/5 na kolumnie z żywicą SP-Sepharose
Fast Flow. Chromatogram oznaczony „NT45SFF1:1_UV” jest pomiarem absorbancji UV przy długości fali 280 nm. Chromatogram oznaczony „NT45SFF1:1_Cond1” jest pomiarem przewodności eluowanych frakcji. Zawierające neurotrofinę frakcje, które połączono, wskazano poziomą strzałką oznaczoną „Połączone frakcje”.
Figura 8 przedstawia typowy wzór chromatograficzny preparatywnej C4-RP-HPLC rhNT-4/5 w warunkach opisanych w tekście. Monitorowano absorbancję przy długości fali 280 nm. Frakcje zawierające neurotrofinę, które połączono, oznaczano poziomą strzałką oznaczoną „Połączone frakcje”.
Figura 9 przedstawia wzór chromatograficzny analitycznej HPLC próbek NT4/5 monitorowanych podczas ponownego ufałdowywania przy wskazanych czasach. Warunki rozdziału na kolumnie opisano w tekście. „NT-4/5 Std.” wskazuje wzór elucji właściwie ufałdowanej, nienaruszonej NT-4/5 zastosowanej jako standard. Wzór oznaczony „SSFF (0,5m)” przedstawia analizę NT-4/5 eluowanej 0,5 M NaCl z kolumny S-Sepharose Fast Flow przed ponownym ufałdowywaniem. W miarę jak NT-4/5 ulega ponownemu ufałdowywaniu, wzór elucji zbliża się do wzoru standardu.
Figura 10 przedstawia typowy wzór chromatografii preparatywnej rhNT-4/5 na żywicy polyCAT A w warunkach opisanych w tekście.
Figura 11 przedstawia analizę przez 16% SDS-PAGE (układ Tris-glicyna, wstępnie oczyszczony, z Novex, Inc., San Diego, CA) w warunkach redukujących dla oceny czystości i homogenności próbek pobranych na wskazanych etapach opisanego w tekście procesu oczyszczania rhNT4/5. Żel wybarwiono Coomassie-R250 dla wykrycia białka (Andrews, Electrophoresis, Oxford University Press, Nowy Jork, 1986). Ścieżka oznaczona „Nakładane na DE” zawiera próbkę mieszaniny PEI, którą nałożono na kolumnę z DE-Sepharose Fast Flow; ścieżka oznaczona „DE FT” zawiera próbkę frakcji nie wiążącej się z kolumną DE-Sepharose Fast Flow; ścieżka „Połączone frakcje S” zawiera próbkę z połączonych frakcji zawierających NT-4/5 wyeluowaną z kolumny z żywicą S-Sepharose Fast Flow, przed ponownym ufałdowywaniem; ścieżka „Frakcja po ponownym ufałdowywaniu” zawiera próbkę frakcji po zakończeniu ufałdowywania; ścieżka „Połączone frakcje C4” zawiera próbkę połączonych frakcji po preparatywnej C4 RP-HPLC; a ścieżka „Połączone frakcje PolyCAT A” zawiera próbkę z połączonych frakcji NT-4/5 z kolumny HPLC PolyCAT A.
Figura 12 przedstawia wzór absorbancji UV frakcji z chromatografii mieszaniny zawierającej wytworzoną w bakteriach, sulfonylowaną rhNT-3 na S-Sepharose Fast Flow.
Figura 13 przedstawia chromatografię połączonych frakcji rhNT-3 po HIC na SP-Sepharose High Performance.
Definicje
W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie, „neurotrofina” odnosi się do neurotrofiny, dogodnie neurotrofiny z rodziny NGF, włącznie z NGF, NT-3, NT-4/5 i BDNF, z jakiegokolwiek gatunku, włącznie mysim, bydlęcym, owczym, świńskim, końskim, małpim, a dogodnie ludzkim, w postaci sekwencji natywnej lub uzyskanej technikami inżynierii genetycznej, i z jakiegokolwiek źródła, włącznie z naturalną, syntetyczną lub wytworzoną rekombinacyjnie. Na przykład, „NGF” odnosi się do czynnika wzrostu nerwów z jakiegokolwiek gatunku, włącznie z mysim, bydlęcym, owczym, świńskim, końskim, małpim, a dogodnie ludzkim, w postaci sekwencji natywnej lub uzyskanej technikami inżynierii genetycznej, i z jakiegokolwiek źródła, włącznie z naturalną, syntetyczną lub wytworzoną rekombinacyjnie. Dogodnie, neurotrofina jest wytworzona rekombinacyjnie. W zalecanym sposobie, neurotrofinę klonuje się i przeprowadza się ekspresję jej DNA, np. w komórkach ssaczych, w komórkach bakteryjnych. Sposób i metody podane w niniejszym opisie można również stosować do neurotrofin GDNF i neurturyny.
Do stosowania dla człowieka odpowiedni jest dojrzały NGF człowieka o natywnej sekwencji, dogodniej sekwencji o długości 120 aminokwasów, a nawet dogodniej sekwencji o długości 118 aminokwasów. Dogodniej, ten NGF o natywnej sekwencji wytworzony jest rekombinacyjnie. Dogodne sekwencje aminokwasowe pre-pro-NGF człowieka i dojrzałego NGF człowieka dostarczono w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5,288,622, który włączono do niniejszego opisu poprzez odnośnik literaturowy. Postać o długości 120 aminokwasów, bez dodatkowych modyfikacji potranslacyjnych, jest zalecaną postacią występującą jako homodimer (tj. 120/120). Nawet bardziej zalecana jest postać 118, bez dodatkowych modyfikacji potranslacyjnych, szczególnie jako homodimer (tj. 118/118).
Przez „zasadniczo czystą” rozumie się stopień czystości całkowitej neurotrofiny, np. NGF, do białka całkowitego, w którym neurotrofina stanowi co najmniej 70%, dogodniej 80%, a nawet dogodniej jej ilość wzrasta do co najmniej 90%, 95% lub 99%. Szczególnie zalecana czystość wynosi około 95%.
PL 191 400 B1
Przez „zasadniczo czystą” rozumie się, że kompozycja zawiera co najmniej w 90% lub więcej pożądanej neurotrofiny.
Przez „zasadniczo wolną od wariantu neurotrofiny” rozumie się kompozycję, w której procent pożądanego rodzaju neurotrofiny w stosunku do całkowitej neurotrofiny (włącznie z mniej pożądanymi rodzajami neurotrofiny) wynosi co najmniej 70% pożądanego rodzaju neurotrofiny, dogodniej co najmniej 80%, a nawet dogodniej wzrasta do co najmniej 90%, 93%, 95% lub 99%. Przez „zasadniczo wolną” rozumie się, że kompozycja zawiera co najmniej 90% lub więcej pożądanej neurotrofiny. Szczególnie zalecanym poziomem jest co najmniej 95% pożądanej neurotrofiny, tj. właściwie ufałdowanego, nienaruszonego rodzaju 118/118 rhNGF. Jak ujawniono w niniejszym opisie, innymi niepożądanymi rodzajami lub postaciami mogą być niewłaściwie strawione postacie lub warianty chemiczne, np. warianty o zmienionym ładunku, powstające w wyniku fermentacji lub procesu oczyszczania bądź dogodnie wszystkie z wyżej wymienionych. Na przykład, jeśli NGF jest ufałdowywany in vitro po syntezie w bakteriach, „rodzaje” lub „warianty” mogą obejmować niewłaściwie ufałdowane lub częściowo ufałdowane postacie.
Przez „niewłaściwie ufałdowany” wariant rozumie się wariant neurotrofiny, który różni się od neurotrofiny sparowaniem jej reszt cysteinowych lub określonymi resztami cysteinowymi, które są wolne lub zablokowane. Niewłaściwie ufałdowane warianty mogą również posiadać tak samo sparowane cysteiny, jak neurotrofina, ale posiadać inną konformację przestrzenną powstającą w wyniku niewłaściwego ufałdowania.
Przez wariant „chemiczny” rozumie się wariant, który różni się chemicznie od neurotrofiny, na przykład posiadaniem zmienionego ładunku, karbamylacją, deamidacją, utlenieniem, glikozylacją lub rozszczepieniem proteolitycznym.
Bufory do kolum, w aspekcie tego wynalazku, generalnie posiadają pH w zakresie około 5 do 8. Bufory, które będą utrzymywać pH w tym zakresie obejmują, na przykład, bufory cytrynianowy, bursztynia-nowy, fosforanowy, MES, ADA, BIS-TRIS-propanowy, PIPES, ACES, imidazolowy, kwasu dietylomalo-nowego, MOPS, MOPSO, TES, bufor TRIS, taki jak TRIS-HCl, HEPES, HEPPS, TRICINE, amidu glicy-nowego, BICINE, glicyno-glicynowy i boranowy. Zalecanym buforem jest bufor MOPSO.
W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie, terminy „alkohole” i „rozpuszczalniki alkoholowe” należy odnosić do powszechnie stosowanej terminologii dla alkoholi, dogodnie alkoholi posiadających 1 do 10 atomów węgla, dogodnie metanolu, etanolu, izopropanolu, n-propanolu lub t-butanolu, jak również glicerolu, glikolu propylenowego, glikolu etylenowego, glikolu heksylenowego, glikolu polipropylenowego, a najdogodniej etanolu lub izopropanolu. Takie alkohole są rozpuszczalnikami, które, po dodaniu do roztworu wodnego, zwiększają hydrofobowość roztworu przez zmniejszanie jego polarności.
MOPSO jest kwasem 3-(N-morfolino)-2-hydroksypropanosulfonowym. HEPES jest kwasem N-2-hydroksyetylopiperazyno-N'-2-etanosulfonowym. Alkohol czysty do analizy zawiera 95 części objętościowych alkoholu (specjalnie denaturowany alkohol o formule 3A i 5 części objętościowych alkoholu izopropylowego). MESjest kwasem 2-(N-morfolino)etanosulfonowym. UF/DF oznacza ultrafiltrację/diafiltrację. TMAC jest chlorkiem tetrametyloamonowym. TEAC jest chlorkiem tetra-etyloamonowym. NGF-120 oznacza pełnej długości czynnik wzrostu nerwów 120/120. NGF-118 oznacza homodimeryczną dojrzałą cząsteczkę NGF o długości 118 reszt. Utleniony NGF oznacza wariant cząsteczki NGF, metylosulfotlenkowy37, który zgodnie z tym co się podaje w niniejszym opisie jest w około 80% aktywny biologicznie jak dojrzały, natywny NGF. Izoasparaginianowy NGF oznacza wariant będący izomerem cząsteczki NGF, Asp93. Dezaminowany NGF oznacza NGF posiadający Asn45 przekształconą w Asp45. RNGF oznacza cząsteczkę NGF z dodatkową resztą argininy na jej końcu N. CHO oznacza komórki jajnika chomika chińskiego.
Opisane w niniejszym opisie żywice obejmują kationowymienną MACROPREP HIGH S (BIORAD Laboratories; silna wymiana kationów; grupa funkcyjna SO3, nominalna wielkość cząstek 50 m; nominalna wielkość porów 1000 A); Żel krzemionkowy (nie przeprowadzony w pochodne); Phenyl Sepharose Fast Flow Low Substitution (Pharmacia; w znacznym stopniu usieciowana 6% agaroza; wielkość cząstek 45-165 mikronów); SP-Sepharose HP (Pharmacia; w znacznym stopniu usieciowana 6% agaroza; wielkość cząstek 34 mikrony); Phenyl Toyopearl 650 M (TosoHaas; wielkość cząstek 40-90 mikronów) oraz Fractogel EMD SO3-650 S (EM Separations, filia E. Merck (Niemcy) w Stanach Zjednoczonych Ameryki; wielkość cząstek 25-40 m).
Neurotrofiny należą do rodziny małych, zasadowych białek, które odgrywają zasadniczą rolę w rozwoju i utrzymywaniu układu nerwowego. Najwcześniej zidentyfikowanym i prawdopodobnie najlepiej zrozumianym członkiem tej rodziny jest czynnik wzrostu nerwów (NGF). Patrz opis patentowy
PL 191 400 B1
Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5,169,762, wydany 8 grudnia 1992 r. Ostatnio zidentyfikowano sekwencyjnie zbliżone, ale odrębne polipeptydy o funkcjach podobnych do NGF. Na przykład, Leibrock i in. (Nature, 341: 49-152 [1989]) sklonowali i zsekwencjonowali mózgopochodny czynnik neurotroficzny (BDNF), określany również jako neurotrofina-2 (NT-2).Kilka grup zidentyfikowało czynnik neurotroficzny pierwotnie nazwany czynnikiem neuronalnym (NF), a obecnie określanym jako neurotrofina-3 (NT3). (Ernfors i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 5454-5458 [1990]; Hohn i in., Nature, 344: 339 [1990]; Maisonpierre i in., Science, 247:1446 [1990]; Rosenthal i in., Neuron, 4: 767 [1990]; Jones i Reichardt, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 8060-8064 [1990]; Kaisho i in., FEBS Lett. 266: 187 [1990]). Zidentyfikowano neurotrofinę-4/5 (określaną jako albo NT4, albo NT5) (Hallbook i in., Neuron 6: 845-858 [1991]; Berkmeier i in., Neuron, 7: 857-866 [1991]; Ip i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 3060-3064 [1992]). Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5,364,769, wydany 15 listopada 1994 r., ujawnia NT-4/5 człowieka oraz sposób ekspresji rekombinacyjnej neurotrofiny, i jest włączony do niniejszego opisu poprzez odnośnik literaturowy. Donoszono również o neurotrofinach chimerycznych i pantropowych, takich jak te opisywane w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5,488,099, wydanym 30 stycznia 1996 r., w Urfer i in., EMBO J. 13 (24): 5896-909 (1994) oraz w publikacji patentowej WO 95/33829, opublikowanej 14 listopada 1995 r. (włączonym do niniejszego opisu poprzez odnośnik literaturowy), w których neurotrofinę tak zmodyfikowano, aby wiązała się z więcej niż jednym receptorem lub wykazywała aktywność wiązania receptora nie występującą w znaczącym stopniu w natywnej neurotrofinie. Szczególnie interesujące są neurotrofiny oznaczone MNTS-1 i D15A NT3. Szczególnie interesujące są również neurotrofiny posiadające szkielet aminokwasowy NGF, ale tak zmodyfikowane, aby wiązały receptory inne niż trkA, takie jak trkB lub trkC. Zalecane są te, w których w NGF dokonano podstawień aminokwasowych aminokwasem z odpowiadającej pozycji w NT-3, która jest odpowiedzialna za wiązanie receptora trk dla NT-3. Takie mutanty NGF posiadają podobną do NT-3 aktywność wiązania receptora, z jednoczesnym zachowaniem farmakokinetyki i zachowywania się podczas oczyszczania NGF (Urfer i in., Biochemistry 36 (16): 4775-4781 (1997)). Te mutanty NGF mogą być również pozbawione aktywności wiązania trkA (Shih i in., J. Biol. Chem. 269 (44): 27679-86 (1994)). Takie mutanty NGF są szczególnie zalecanymi neurotrofinami do stosowania w wynalazku opisanym w niniejszym opisie.
Izolowanie zrekombinowanej neurotrofiny ludzkiej, np. rhNGF, obejmuje oddzielanie białka od szeregu różnych zanieczyszczeń z komórek gospodarza. Każdy etap obejmuje stosowanie specjalnych buforów, które umożliwiają zachodzenie wystarczającego oddzielania. Końcowy lub przedostatni etap procesu prowadzącego do otrzymania neurotrofiny komplikuje obecność kilku wariantów neurotrofiny, które ulegają współ-oczyszczaniu przy zastosowaniu konwencjonalnych złóż chromatograficznych. Jeśli do procesu odzyskiwania i oczyszczania włączono etap ponownego ufałdowywania, to warianty obejmują niewłaściwie ufałdowane postacie neurotrofiny. Warianty mogą również obejmować te różniące się chemicznie od neurotrofiny, takie jak postacie karbamylowane, dezaminowane lub rozszczepione proteolitycznie. W przypadku NGF, te rodzaje składają się przede wszystkim z postaci dimerycznych - homodimerów, np.120/120 lub 117/117, gdy pożądany jest 118/118, bądź heterodimerów, np. 120/118, 117/118, wariantów zmodyfikowanych chemicznie - wariantów izoasparaginianowych, monoutlenionych, glikozylowanych, postaci o skróconym końcu N i C oraz ich dimerów.
Wynalazek umożliwia wytwarzanie neurotrofin, szczególnie NGF, na dużą skalę, w ilościach wystarczających do zastosowań leczniczych, takich jak, na przykład, leczenie choroby Alzheimera, neuropatii obwodowych, włącznie z neuropatiami cukrzycowymi i związanymi z AIDS, oraz podobnych.
Jak opisano poniżej, sposoby opisane w niniejszym opisie zastosowano z powodzeniem wobec rhNGF, rhNT-3 i rhNT-4,5. Na przykład, rhNT-4,5, którą przygotowano w E. coli, wyizolowano w ciałach inkluzyjnych, a następnie rozpuszczono i zredukowano. Zredukowaną NT-4/5 częściowo oczyszczono przez chromatografię na DE Sepharose Fast Flow i S-Sepharose Fast Flow. Połączone frakcje po S-Sepharose Fast Flow ponownie ufałdowywano w buforze zawierającym guanidynę w ciągu 24 godzin. Niewłaściwie ufałdowane postacie NT-4/5 usunięto przez chromatografię na dużą skalę, jak ujawniono w niniejszym opisie. Karbamylowane i skrócone (postacie niewłaściwie strawione) NT-4/5 usunięto przez wysokosprawną chromatografię kationowymienną na żywicy PolyCat A HPLC lub żywicy SP-Sepharose HP, z zastosowaniem kolumny, na dużą skalę. Oczyszczoną rhNT-4/5 poddano ultrafiltracji i diafiltracji do kwaśnego buforu w celu nadawania postaci farmaceutycznej.
Neurotrofiny odpowiednie do stosowania w tu przedstawianych rozwiązaniach można przygotowywać jakimkolwiek sposobem, ale dogodnie przygotowuje się ją rekombinacyjnie. Cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą omawiane w niniejszym opisie neurotrofiny dostępne są z kilku źródeł,
PL 191 400 B1 na przykład można je uzyskać przez syntezę chemiczną znanej sekwencji DNA lub przez zastosowanie standardowych technik klonowania znanych specjalistom w tej dziedzinie. Klony cDNA zawierające sekwencję kodującą neurotrofinę, np. hNGF, można zidentyfikować poprzez zastosowanie oligonukleotydowych sond hybrydyzacyjnych, specjalnie zaprojektowanych w oparciu o znaną sekwencję neurotrofiny.
Po otrzymaniu cząsteczki posiadającej sekwencję kodującą neurotrofinę, cząsteczkę wstawia się do wektora klonującego odpowiedniego do ekspresji w wybranej komórce gospodarza. Wektor klonujący konstruuje się w taki sposób, aby zapewnić właściwe funkcje regulujące wymagane do wydajnej transkrypcji, translacji i modyfikacji proteolitycznej sekwencji kodującej.
Jeśli neurotrofinę wytwarza się rekombinacyjnie, komórkami gospodarza odpowiednimi do ekspresji DNA kodującego neurotrofinę są komórki prokariotyczne, drożdży lub wyższych organizmów eukariotycznych. Odpowiednie do tego celu prokarionty obejmują bakterie, takie jak archebakterie lub bakterie właściwe. Zalecanymi bakteriami są bakterie właściwe, takie jak organizmy Gram-ujemne lub Gram-dodatnie, na przykład Enterobacteriaceae, takie jak Escherichia, np. E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, np. Salmonella typhimurium, Serratia, np. Serratia marcescans, i Shigella; Bacillus, takie jak B. subtilis i B. licheniformis (np. B. licheniformis 41P, ujawniony w opisie patentowym DD numer 266 710, opublikowanym 12 kwietnia 1989 r.); Pseudomonas, taki jak P. aeruginosa; Streptomyces; Azotobacter; Rhizobia; Vitreoscilla i Paracoccus. Odpowiedni gospodarze E. coli obejmują E. coli W3110 (ATCC 27 325), E. coll94 (ATCC 31 446), E. colIB i E. collX1776 (ATCC 31 537). Przykłady te są raczej ilustrujące, niż ograniczające.
Do niniejszego opisu włączono w całości publikację PCT publikacji patentowej WO 95/30686, opublikowaną 16 listopada 1995 r. Publikacja dotyczy szczególnie opisu bakteryjnej syntezy i ufałdowywania in vitro NGF. Produkty powstałe w wyniku przeprowadzania tego procesu można poddawać oczyszczaniu sposobami tu opisanymi.
Można również wykorzystywać zmutowane komórki którejkolwiek z wymienionych powyżej bakterii. Konieczne jest, oczywiście, wybranie odpowiednich bakterii, biorąc pod uwagę zdolność do replikacji replikonu w komórkach bakterii. Na przykład, jeśli do dostarczenia replikonu stosuje się dobrze znane plazmidy, takie jak pBR322, pACYA177 lub pKN410, jako gospodarza można odpowiednio stosować gatunki E. coli, Serratia lub Salmonella. Szczep E. coli W3110 jest zalecanym gospodarzem lub gospodarzem macierzystym, ponieważ jest on powszechnym szczepem gospodarza do przeprowadzania fermentacji produktu zrekombinowanego DNA. Dogodnie, komórka gospodarza wydziela minimalną ilość enzymów proteolitycznych. Na przykład, szczep W3110 można modyfikować w celu uzyskania mutacji genetycznej w genach kodujących endogenne białka gospodarza; przykłady takich gospodarzy obejmują szczep 1A2 E. coli W3110, który posiada pełny genotyp tonAA; szczep 9E4 E. coli W3110, który posiada pełny genotyp ton A Δ ptr3; szczep 27C7 E. coli W3110 (ATCC 55 244), który posiada pełny genotyp tonA ptr3 phoA Δ E15 Δ (argF-lac)169 Δ degP Δ ompT kan<r>; szczep 37D6 E. coli W 3110, który posiada pełny genotyp tonA ptr3 phoA Δ E15 Δ (argF-lac)169 Δ degP Δ ompT Δ rbs7 ilvG kan r; szczep 40 B4 E. coli W3110, który jest nieopornym na kanamycynę szczepem 37D6 z mutacją delecyjną degP; oraz szczep E. coli posiadający zmutowaną proteazę periplazmatyczną, ujawnioną w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4,946,786, wydanym 7 sierpnia 1990 r.
Ekspresję ludzkiego NGF przeprowadzano w E. coli. Izolowanie i sekwencję genu kodującego podjednostkę β hNGF oraz jej ekspresję jako heterologicznego białka w E. coli opisano w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5,288,622. Zawarte w nim wskazówki odpowiednie są również do zapewnienia dojrzałego ludzkiego NGF wytwarzanego w komórkach ssaczych. Przy zastosowaniu technik rekombinacyjnych, ludzki β-NGF ulegał ekspresji wolny od innych białek ssaczych. Wynikiem ekspresji hNGF w E. coli z zastosowaniem dwóch genów, które zawierały zmienione końce aminowe, było uzyskanie białka fuzyjnego, które opisali Iwai i in., Chem. Pharm. Bull. 34: 4724 (1986).
Poza prokariontami, odpowiednimi gospodarzami ekspresyjnymi dla wektorów kodujących neurotrofiny są mikroorganizmy eukariotyczne, takie jak grzyby nitkowate lub drożdże. Najczęściej spośród mikroorganizmów będących niższymi gospodarzami eukariotycznymi stosuje się Saccharomyces cerevisiae, czyli zwykłe drożdże piekarskie. Jednakże, dostępne i użyteczne są tu liczne inne rodzaje, gatunki i szczepy, takie jak Schizosaccharomyces pombe [Beach i Nurse, Nature, 290: 140 (1981); europejski opis patentowy numer 139 383, opublikowany 2 maja 1985 r.]; gospodarze Kluyveromyces [opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4,943,529; Fleer i in., Bio/Technology, 9: 968-975 (1991)], jak np. K. lactis [MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt i in., J. Bacteriol., 737 (1983)], K. fragilis (ATCC 12 424), K. bulgaricus (ATCC 16 045), K. wickeramii (ATCC 24 178), K. waltii (ATCC 56 500),
PL 191 400 B1
K. drosophilarum [ATCC 36 906; Van der Berg i in., Bio/Technology, 8: 135 (1990)], K. thermotolerans i K. marxianus; yarrowia [europejski opis patentowy numer 402 226]; Pichia pastoris [europejski opis patentowy numer 183 070; Sreekrishna i in., J. Basic Microbiol., 28: 265-278 (1988)]; Candida; Trichoderma reesia [europejski opis patentowy numer 244 234]; Neurospora crassa [Case i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 (1979)]; Schwanniomyces, taki jak Schwanniomyces occidentalis [europejski opis patentowy numer 394 538, opublikowany 31 października 1990 r.] oraz grzyby nitkowate, takie jak np. Neurospora, Penicillium, Tolypocladium [publikacja patentowa WO 91/00357, opublikowana 10 stycznia 1991 r.] i gospodarze Aspergillus, jak A. nidulans [Ballance i in., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 (1983); Tilburn i in., Gene, 26: 205-221 (1983); Yelton i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 (1984)] i A. niger [Kelly i Hynes, EMBO J., 4: 475-479 (1985)].
Odpowiednie komórki gospodarza właściwe do ekspresji DNA kodującego neurotrofinę mogą również pochodzić z organizmów wielokomórkowych. Takie komórki gospodarza zdolne są do złożonych aktywności modyfikacji proteolitycznych i glikozylacji. W zasadzie odpowiednia jest hodowla jakichkolwiek komórek wyższego organizmu eukariotycznego, czy to pochodzące z hodowli komórek kręgowców, czy bezkręgowców. Przykłady komórek bezkręgowców obejmują komórki roślin i owadów. Zidentyfikowano liczne szczepy i odmiany bakulowirusowe i odpowiadające permisyjne owadzie komórki gospodarza, z takich gospodarzy, jak Spodoptera frugiperda (gąsienica), Aedes aegypti (komar), Aedes albopictus (komar), Drosophila melanogaster (muszka owocowa) i Bombyx mori. Patrz np. Luckow i in., Bio/Technology, 6: 47-55 (1988); Miller i in., w: Genetic Engineering, Setlow, J.K. i in., red., tom 8 (Plenum Publishing, 1986), str. 277-279 oraz Maeda i in., Nature 315, 592-594 (1985). Powszechnie dostępnych jest szereg szczepów wirusowych do transfekcji, np. odmiana L-1 NPV Autographa californica i szczep Bm-5 NPV Bombyx mori, i takie wirusy można stosować tu, szczególnie do transfekcji komórek Spodoptera frugiperda. NGF człowieka wytwarzano w komórkach owadzich, jak podano w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5,272,063, wydanym 21 grudnia 1993 r.
Jako gospodarzy można wykorzystywać hodowle roślinnych komórek bawełny, kukurydzy, ziemniaka, soi, petunii, pomidora i tytoniu. Zazwyczaj, komórki roślinne transfekuje się przez inkubację z pewnymi szczepami bakterii Agrobacterium tumefaciens, które uprzednio poddano takim manipulacjom, aby zawierały DNA kodujący neurotrofinę. Podczas inkubacji hodowli komórek roślinnych z A. tumefaciens, DNA kodujący neurotrofinę przenoszony jest do roślinnej komórki gospodarza tak, że komórka zostaje stransfekowana i będzie, w odpowiednich warunkach, eksprymować DNA kodujący neurotrofinę. Ponadto, dostępne są kompatybilne z komórkami roślinnymi sekwencje regulujące i sygnałowe, takie jak promotor syntazy nopalinowej i sekwencje sygnałów poliadenylacji (Depicker i in., J. Mol. Appl. Genet. 1: 561 (1982)). Ponadto, odcinki DNA wyizolowane z regionu przed genem 780 T-DNA zdolne są do aktywowania lub zwiększania poziomów transkrypcji zdolnych do ekspresji roślinnych genów w tkance roślinnej zawierającej zrekombinowany DNA (europejski opis patentowy numer 321 196, wydany 21 czerwca 1989 r.).
Przykładami użytecznych ssaczych linii komórek gospodarza są linia komórek nerki małpy CV1 stransformowana SV-40 (COS-7, ATCC CRL 1651); ludzka linia komórek zarodkowych nerki [komórki 293 lub 293 subklonowane dla wzrostu w hodowli zawiesinowej, Graham i in., J. Gen. Virol. 36: 59 (1977)]; komórki nerki noworodka chomika (BHK, ATCC CCL 10); komórki jajnika chomika chińskiego/-DHFR [CHO, Urlaub i Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216 (1980)]; mysie komórki Sertoli'ego [TM4, Mather, Biol. Reprod., 23: 243-251 (1980)]; komórki nerki małpy (CV1, ATCC CCL 70); komórki nerki koczkodana zielonego (VERO-76, ATCC CRL-1587), ludzkie komórki raka szyjki macicy (HELA, ATCC CCL 2); komórki nerki psa (MDCK, ATCC CCL 34); komórki wątroby szczura rasy Bufallo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); komórki płuc człowieka (W138, ATCC CCL 75); komórki wątroby człowieka (Hep G2, HP 8065); komórki nowotworu sutka myszy (MMT 060562, ATCC CCL51); komórki TRI [Mather i in., Annals N.Y. Acad. Sci., 383: 44-68 (1982)]; komórki MRC 5; komórki FS4 oraz linia komórek wątrobiaka człowieka (Hep G2). Zalecaną metodą jest ekspresja w komórkach CHO. Ekson NGF człowieka zawierający prepro-NGF można zastosować do uzyskania ekspresji wydzielanego, dojrzałego NGF (obejmującego postacie 118 i 120) przy zastosowaniu odpowiednich promotorów i wektorów (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5,288,622). Użyteczne dla celów wynalazku są stabilne hodowle komórek CHO stabilnie stransfekowanych i wydzielających dojrzałe postacie NGF, jak omówiono w przykładach w niniejszym opisie.
Komórki gospodarza transfekuje się, a dogodnie transformuje, opisanymi powyżej wektorami ekspresyjnymi lub klonującymi i hoduje w konwencjonalnych podłożach odżywczych zmodyfikowanych
PL 191 400 B1 w odpowiedni sposób do indukcji promotorów, selekcjonując transformanty lub amplifikując geny kodujące pożądane sekwencje. Transfekcja odnosi się do pobierania wektora ekspresyjnego przez komórki gospodarza, niezależnie od tego, czy jakakolwiek sekwencja kodująca rzeczywiście ulega ekspresji. Specjalistom znane są liczne metody transfekcji, na przykład CaPO4 i elektroporacja. Transfekcję generalnie uznaje się za uwieńczoną powodzeniem, jeśli w komórce występuje jakakolwiek oznaka działania tego wektora.
Transformacja oznacza wprowadzanie DNA do organizmu w taki sposób, że DNA zdolny jest do replikacji, albo w postaci elementu pozachromosomalnego, albo w postaci zintegrowanej z DNA chromosomalnym. W zależności od stosowanych komórek gospodarza, transformacji dokonuje się stosując standardowe techniki odpowiednie dla takich komórek. Traktowanie wapniem, w którym wykorzystuje się chlorek wapniowy, jak opisano w części 1.82 w Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manual [Nowy Jork: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989] lub elektroporację generalnie stosuje się w przypadku prokariontów lub innych komórek, które posiadają znaczące bariery ściany komórkowej. Zakażanie Agrobacterium tumefaciens stosuje się do transformacji niektórych komórek roślinnych, jak opisano w Shaw i in., Gene, 23: 315 (1983) oraz publikacji patentowej WO 89/05859, opublikowanym 29 czerwca 1989 r. Ponadto, rośliny można transformować stosując traktowanie ultradźwiękami, jak opisano w publikacji patentowej WO 91/00358, opublikowanej 10 stycznia 1991 r.
Dla komórek ssaczych bez takiej ściany komórkowej zalecana jest metoda wytrącania fosforanem wapniowym Grahama i van der Eba, Virology, 52: 456-457 (1978). Ogólne aspekty transformacji układów ssaczych komórek gospodarza opisał Axel w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4,399,216, wydanym 16 sierpnia 1983 r. Transformacje drożdży generalnie prowadzi się według metody Van Solingena i in., J. Bect., 130: 946 (1977) i Hsiao i in., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76: 3829 (1979). Jednakże, można również stosować inne metody wprowadzania DNA do komórek, takie jak przez mikroiniekcję dojądrową, elektroporację, fuzję protoplastów bakteryjnych z nienaruszonymi komórkami lub polikationy, np. polibren (ang. polybrene), poliornitynę itp. W celu zapoznania się z różnymi technikami transformowania komórek ssaków, patrz Keown i in., Methods in Enzymology (1990), tom 185, str. 527-537, oraz Mansour i in., Nature, 336: 348-352 (1988).
Dogodnie, gen hHGF wstawia się do wektora, tak aby posiadał dostępny metioninowy kodon inicjacji, dogodnie jeden z dwóch metioninowych kodonów inicjacji, zidentyfikowanych przez Ullricha i in., Nature, 303: 821-825 (1983)). Gen hNGF (Ullrich i in., Cold Spring Harbor Symposia on Quant. Biol. XLVIII, str. 435 (1983); opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5,288,622) posiada dwie sąsiadujące metioniny, które prawdopodobnie wykorzystywane są jako kodony inicjacji translacji (pozycja 1 odnosi się do N-końcowej reszty seryny dojrzałego NGF). W przeciwieństwie, cDNA NGF z gruczołu podżuchwowego myszy, najdokładniej badanego czynnika wzrostu nerwów, posiada metioninę w pozycji -187, poza tymi w pozycjach -121 i -119. W zalecanym rozwiązaniu ekspresji w komórkach ssaczych, obecna jest sekwencja prepro-NGF.
Jeśli do wytwarzania neurotrofiny stosuje się komórki prokariotyczne, hoduje się je w odpowiednich podłożach, w których promotor może być indukowany konstytutywnie lub sztucznie, jak ogólnie opisano w Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nowy Jork 1989). Obecne mogą być również w odpowiednich stężeniach wszelkie konieczne uzupełniające dodatki poza źródłami węgla, azotu i fosforanu nieorganicznego, wprowadzane same lub w mieszaninie z innym uzupełniającym dodatkiem lub podłożem, takie jak kompleksowe źródło azotu.
Jeśli do wytwarzania neurotrofiny stosuje się komórki ssacze, można je hodować w szeregu podłóż. Odpowiednie do hodowania komórek gospodarza są podłoża komercjalnie dostępne, takie jak podłoże Ham'a F10 (Sigma), Minimal Essential Medium ([MEM], Sigma), RPMI-1640 (Sigma) i Dulbecco's Modified Eagle's Medium ([DMEM], Sigma). Ponadto, jako podłoża hodowlane dla komórek gospodarza można stosować którekolwiek z podłóż opisanych w Ham i Wallace, Meth. Enz., 58: 44 (1979); Barnes i Sato, Anal. Biochem., 102: 255 (1980); opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach 4,767,704, 4,657,866, 4 927 762, 5 122 469 lub 4 560 655; publikacji WO 90/03430; publikacji WO 87/00195 lub opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer Re. 30 985, których ujawnienia włączono do niniejszego opisu poprzez odnośnik literaturowy. Każde z tych podłóż można uzupełnić, jeśli jest to konieczne, hormonami i/lub innymi czynnikami wzrostowymi (takimi jak insulina, transferyna lub nabłonkowy czynnik wzrostowy), solami (takimi jak chlorek sodowy, wapń, magnez i fosforan), buforami (takimi jak HEPES), nukleozydami (takimi jak adenozyna i tymidyna), antybiotykami (takimi jak gentamycyna TM), pierwiastkami śladowymi (zdefiniowanymi jako związki
PL 191 400 B1 nieorganiczne zazwyczaj obecne w stężeniach końcowych w zakresie mikromolowym) i glukozą lub równoważnym źródłem energii. Można również włączyć jakiekolwiek inne konieczne dodatki uzupełniające w odpowiednich stężeniach, które mogą być znane specjalistom w tej dziedzinie. Warunki hodowli, takie jak temperatura, pH i podobne, są te uprzednio stosowane dla komórki gospodarza wybranej do ekspresji i będą oczywiste dla specjalisty.
Ogólnie rzecz biorąc, zasady, protokoły i praktyczne techniki maksymalizowania produktywności hodowli komórek ssaków in vitro znaleźć można w Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler, red. (IRL Press at Oxford University Press, Oxford, 1991). Powyższy sposób można wykorzystywać niezależnie od tego, czy neurotrofina wytwarzana jest wewnątrzkomórkowo, wytwarzana w przestrzeni periplazmatycznej, czy bezpośrednio wydzielana do podłoża.
Zazwyczaj płyn hodowlany zbiera się po odpowiednim okresie i przeprowadza standardowe oznaczenia identyfikacji, na przykład oznaczenia immunologiczne, takie jak ELISA lub analiza przez hybrydyzację typu Western, bądź oznaczenia biologiczne, takie jak różnicowanie komórek PC12 (Greene, L.A., Trends Neurosci. 1: 91 (1986)). Oznaczenia do określania rodzajów i zakres ujawnionych w niniejszym opisie wariantów są znane w tej dziedzinie lub są podane bądź cytowane w przykładach (patrz, na przykład, Schmelzer i in., J. Neurochem. 59 (5): 1675-83 (1992) oraz Burton i in., J. Neurochem. 59 (5): 1937-45 (1992), które włączono do niniejszego opisu poprzez odnośniki literaturowe.
Kompozycję neurotrofiny przygotowaną z komórek dogodnie poddaje się co najmniej jednemu etapowi oczyszczania przed HIC. Przykłady odpowiednich etapów oczyszczania obejmują te opisane w niniejszym opisie, włącznie z chromatografią powinowactwa, innymi technikami oczyszczania białek, takimi jak chromatografia na żelu krzemionkowym, chromatografia na Sepharose z immobilizowaną heparyną, chromatografia na żywicy aniono- lub kationowymiennej (taka jak na kolumnie z żelem poliasparaginowym), chromatoogniskowanie i preparatywna SDS-PAGE, w zależności od neurotrofiny jaka ma być odzyskiwana i zastosowanej hodowli wyjściowej.
W jednym rozwiązaniu, w którym neurotrofina jest bezpośrednio wydzielana do podłoża, podłoże oddziela się od pozostałości komórkowych przez wirowanie i sklarowaną brzeczkę fermentacyjną lub podłoże stosuje się następnie do oczyszczania na żelu krzemionkowym. W przypadku chromatografii na żelu krzemionkowym, brzeczkę przepuszcza się zazwyczaj przez nie przeprowadzone w pochodne cząstki krzemionki, tak że polipeptyd neurotrofiny przywiera do cząstek krzemionki; cząstki krzemionki przemywa się dla usunięcia zanieczyszczeń i polipeptyd eluuje się z cząstek krzemionki buforem zawierającym alkoholowy lub polarny rozpuszczalnik aprotonowy i tlenki wapniowców, metale alkaliczne lub nie-organiczną sól amonową.
Nie chcąc ograniczać się żadną teorią, uważa się, że szkielet nośnika żywicy jest częściowo hydrofobowy co sprzyja niespecyficznym oddziaływaniom pomiędzy neurotrofinami i żywicą, które stanowią zaletę opisanego tu procesu. Zazwyczaj, dla buforu elucyjnego o pH od około 5 do 8, dogodniej 6 do 8, użyteczne jest 0 do 3 M stężenie TMAC. Octan sodowy, jeśli jest obecny dla zwiększenia siły jonowej buforu elucyjnego, pozwala na zastosowanie niższego stężenia TMAC. Zalecanym zamiennikiem jonu octanowego jest chlorek.
W jednym przykładzie rozwiązania, w którym neurotrofina wytwarzana jest w przestrzeni periplazmatycznej, podłoże hodowlane lub lizat wiruje się dla usunięcia cząstkowych pozostałości komórkowych. Następnie można, jeśli jest to konieczne, rozdzielić frakcje błon i białek rozpuszczalnych. Neurotrofinę można następnie oczyszczać z frakcji białek rozpuszczalnych i z frakcji błonowej lizatu hodowli, zależnie od tego, czy neurotrofina jest zawiązana z błoną, jest rozpuszczalna, czy obecna jest w postaci zagregowanej. Następnie neurotrofinę rozpuszcza się, po czym ponownie ufałdowywuje stosując odpowiedni bufor. Szczegóły tej metody izolowania z przestrzeni periplazmatycznej z wytworzeniem ponownie ufałdowanego białka opisano poniżej.
Nierozpuszczalną, nienatywną neurotrofinę izoluje się z prokariotycznych komórek gospodarza w odpowiednim buforze do izolowania jakąkolwiek odpowiednią techniką, np. obejmującą ekspozycję komórek na bufor o odpowiedniej sile jonowej do rozpuszczenia większości białek gospodarza, ale w którym zagregowana neurotrofina jest zasadniczo nierozpuszczalna, i rozbijanie komórek tak, aby zostały uwolnione ciała inkluzyjne i stały się dostępne do odzyskiwania przez, na przykład, wirowanie. Technika ta jest dobrze znana i opisano ją, na przykład, w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4,511,503.
Krótko, komórki zawiesza się w buforze (zazwyczaj o pH 5 do 9, dogodnie około 6 do 8, stosując siłę jonową około 0,01 do 2 M, dogodnie 0,1 do 0,2 M). Do utrzymywania dostatecznej wartości siły jonowej użyteczna jest jakakolwiek odpowiednia sól, włącznie z chlorkiem sodowym. Komórki
PL 191 400 B1 zawieszone w tym buforze, rozbija się następnie przez lizę, stosując powszechnie wykorzystywane techniki, takie jak, na przykład, metody mechaniczne, np. mikrofluidyzer-prasę Monton-Gaulin, prasę
Frencha lub oscylator ultradźwiękowy, bądź metody chemiczne lub enzymatyczne.
Przykłady chemicznych lub enzymatycznych metod rozbijania komórek obejmują tworzenie sferoplastów, co wymaga stosowania lizozymu do lizy ściany bakteryjnej (Neu i in., Biochem. Biophys. Res. Commun., 17: 215 (1964)), i szok osmotyczny, który obejmuje traktowanie zdolnych do życia komórek roztworem o wysokiej toniczności i przemywanie zimną wodą o niskiej toniczności dla uwolnienia polipeptydów (Neu i in., J. Biol. Chem., 240: 3685-3692 (1965)). Trzecia metoda, opisana w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4,680,262, obejmuje zetknięcie stransformowanych komórek bakteryjnych ze skuteczną ilością niższego alkanolu posiadającego 2 do 4 atomów węgla w ciągu czasu i w temperaturze wystarczających do zabijania i lizowania komórek.
Po rozbiciu komórek, zawiesinę zazwyczaj wiruje się w celu osadzenia ciał inkluzyjnych. W jednej postaci realizacji, etap ten można przeprowadzać przy około 500 do 15 000 x g, dogodnie około 12 000 x g, w standardowej wirówce w ciągu dostatecznego czasu, który zależy od objętości i modelu wirówki, zazwyczaj około 10 minut do 0,5 godziny. Otrzymany w wyniku osad zawiera zasadniczo całą frakcję nierozpuszczalnych polipeptydów, ale jeśli proces rozbijania komórek nie zaszedł w pełni, może również zawierać nienaruszone komórki lub fragmenty rozbitych komórek. Kompletność rozbicia komórek można oznaczać przez ponowne zawieszanie osadu w małej ilości tego samego roztworu buforu i badanie zawiesiny w mikroskopie kontrastowo-fazowym. Obecność fragmentów rozbitych komórek lub całych komórek wskazuje, że konieczne jest dodatkowe rozbijanie dla usunięcia fragmentów komórek lub komórek i towarzyszących im polipeptydów nie wchodzących w skład ciał załamujących światło. Po takim dalszym rozbijaniu, jeśli jest to wymagane, zawiesinę wiruje się ponownie i osad odzyskuje, ponownie zawiesza i analizuje. Proces powtarza się ponownie, dopóki badanie wizualne nie ujawni nieobecności fragmentów rozbitych komórek w osadzonym materiale lub dopóki dalsze traktowanie nie przestanie obniżać wielkości otrzymywanego w wyniku osadu.
W alternatywnej postaci realizacji, można neurotrofinę izolować z przestrzeni periplazmatycznej przez rozpuszczanie w odpowiednim buforze. Procedurą tą może być rozpuszczanie in situ, obejmujące bezpośrednie dodawanie odczynników do naczynia fermentacyjnego po rekombinacyjnym wytworzeniu neurotrofiny, co pozwala uniknąć dodatkowych etapów zbierania, homogenizowania i wirowania w celu otrzymania neurotrofiny. Pozostałe cząstki można usunąć przez wirowanie lub sączenie, bądź ich kombinację.
Jeśli neurotrofina jest nieufałdowana, stopień nieufałdowania odpowiednio określa się przez chromatografię nienatywnej neurotrofiny, obejmującą RP-HPLC. Wzrastające pole powierzchni piku nienatywnego materiału wskazuje, jak wiele obecnej jest nienatywnej neurotrofiny.
Po otrzymaniu rozpuszczonych ciał inkluzyjnych na późniejszym etapie oczyszczania, neurotrofinę poddaje się odpowiednio ponownemu ufałdowywaniu do konformacji aktywnej w sposób opisany poniżej.
Jeśli neurotrofina nie znajduje się już w postaci rozpuszczonej przed ufałdowywaniem, można ją rozpuścić przez inkubację w zasadowym buforze zawierającym czynnik chaotropowy i czynnik redukujący w ilościach koniecznych do znaczącego rozpuszczenia neurotrofiny. Inkubację przeprowadza się w warunkach stężenia neurotrofiny, czasu inkubacji i temperatury inkubacji, które będą pozwalać na zachodzenie rozpuszczania neurotrofiny w buforze zasadowym.
Pomiar stopnia rozpuszczenia neurotrofiny w buforze przeprowadza się odpowiednio przez określenie zmętnienia, przez analizowanie w redukujących żelach z SDS frakcjonowania neurotrofiny pomiędzy supernatant i osad po wirowaniu, przez oznaczenie białka np. zestawem do oznaczania białka Bio-Rad lub przez HPLC.
pH zasadowego buforu do rozpuszczania pozostaje zazwyczaj w zakresie co najmniej 7,5, dogodnie około 8-11. Przykłady odpowiednich buforów, które zapewniać będą pH w tym ostatnim zakresie, obejmują glicynę, CAPSO (kwas 3-[cykloheksyloamino]-2-hydroksy-1-propanosulfonowy), AMP (2-amino-2-metylo-1-propanol), CAPS (kwas 3-[cyklohelsyloamino]-1-propanosulfonowy), CHES (kwas 2-[N-cyklo-heksyloamino]etanosulfonowy) i TRIS HCl (chlorowodorek tris[hydroksymetylo]aminometanowy. Zalecanym buforem jest tu glicyna lub CAPSO, dogodnie o stężeniu około 20 mM i pH około 8,5 do 11, dogodnie około 10-11.
Stężenie neurotrofiny w zbuforowanym roztworze do rozpuszczania musi być takie, aby neurotrofina była zasadniczo rozpuszczona i częściowo lub w pełni zredukowana i zdenaturowana. Alternatywnie, neurotrofina może być początkowo nierozpuszczona. Dokładna zastosowana ilość zależeć będzie, np., od stężeń i rodzajów innych składników w zbuforowanym roztworze, szczególnie rodzaju
PL 191 400 B1 i ilości czynnika redukującego, rodzaju i ilości czynnika chaotropowego oraz pH buforu. Na przykład, stężenie neurotrofiny można zwiększyć co najmniej trzykrotnie, jeśli równocześnie zwiększa się stężenie czynnika redukującego, np. DTT, dla utrzymania stosunku DTT:neurotrofina od około 3:1 do 10:1. A zatem, zalecane stężenie neurotrofiny wynosi co najmniej 30 mg/ml, a dogodniejsze pozostaje w zakresie 30-50 mg na ml. Na przykład, neurotrofinę można rozpuścić do uzyskania stężenia około 30-50 mg/ml w 5 M do 7 M moczniku, 10 mM DTT i rozcieńczać, na przykład, do uzyskania stężenia około 1 mg/ml do ufałdowywania.
Po rozpuszczeniu neurotrofiny, umieszcza się ją w lub rozcieńcza buforem do ponownego ufałdowywania zawierającym 5-40% (obj.) rozpuszczalnika alkoholowego lub aprotonowego, czynnik redukujący i tlenki wapniowców, metale alkaliczne lub nieorganiczną sól amonową. Buforem może być jakikolwiek bufor dla pierwszego roztworu zbuforowanego, przy czym preferowane są CAPSO, glicyna i CAPS o pH 8,5-11,szczególnie o stężeniu około 20 mM, a najdogodniej CAPSO i glicyna. Neurotrofinę można rozcieńczać buforem do ponownego ufałdowywania, dogodnie co najmniej pięciokrotnie, dogodniej co najmniej około dziesięciokrotnie. Alternatywnie, neurotrofinę można dializować wobec buforu do ponownego ufałdowywania. Ponowne ufałdowywanie można przeprowadzać w temperaturze około 2°-45°, dogodniej w temperaturze około 2-8°C, w ciągu co najmniej jednej godziny. Roztwór może ewentualnie zawierać również czynnik redukujący i osmolityczny.
Czynnik redukujący odpowiednio wybiera się spośród tych opisanych powyżej dla etapu rozpuszczania w podanym zakresie stężeń. Jego stężenie zależeć będzie zwłaszcza od stężeń tlenków wapniowców, metali alkalicznych lub nieorganicznej soli amonowej, neurotrofiny i rozpuszczalnika. Dogodnie, stężenie czynnika redukującego wynosi około 0,5 do 8 mM, dogodniej około 0,5-5 mM, jeszcze dogodniej około 0,5-2 mM. Zalecanymi czynnikami redukującymi są DTT i cysteina.
Z roztworu, w którym prowadzi się ponowne ufałdowywanie można ewentualnie usuwać tlen przez dodawanie gazu obojętnego, na przykład helu lub argonu, w celu wyparcia tlenu.
Ewentualnym czynnikiem osmolitycznym jest dogodnie sacharoza (w stężeniu około 0,25-1 M) lub glicerol (w stężeniu około 1-4 M). Dogodniej, stężenie sacharozy wynosi około 1 M, a stężenie glicerolu około 4 M).
Początkowe stężenie neurotrofiny w buforze do ufałdowywania jest takie, że stosunek odzyskanego właściwie ufałdowanego konformeru do niewłaściwie ufałdowanego będzie maksymalnie wysoki, jak określono przez HPLC, RIA lub oznaczenie biologiczne. Zalecane stężenie neurotrofiny (którego wynikiem jest maksymalna wydajność właściwie ufałdowanego konformeru) pozostaje w zakresie około 0,1 do 15 mg/ml, dogodniej około 0,1 do 6 mg/ml, a najdogodniej około 0,2 do 5 mg/ml.
Stopień ponownego ufałdowania, które występuje po tej inkubacji, odpowiednio określa się przez miano neurotrofiny w RIA lub przez analizę HPLC, przy czym wzrastające miano w RIA lub wielkość piku właściwie ufałdowanej neurotrofiny są bezpośrednio skorelowane ze wzrastającą ilością właściwie ufałdowanego, aktywnego biologicznie konformeru obecnego w buforze. Inkubację przeprowadza się w celu zmaksymalizowania wydajności odzyskiwania właściwie ufałdowanego konformeru neurotrofiny i stosunku właściwie ufałdowanego konformeru neurotrofiny do niewłaściwie ufałdowanego konformeru neurotrofiny, jak określano przez RIA lub HPLC, oraz w celu zminimalizowania wydajności multimerycznej, związanej neurotrofiny, jak określano przez równowagę mas. Alternatywnie, postacie można określać metodami podanymi poniżej i w przykładach. Zalecanym czynnikiem denaturującym dla ponownego ufałdowywania jest guanidyna.
Przykładami odpowiednich procedur oczyszczania, które można stosować, pojedynczo lub w kombinacji, po ponownym ufałdowywaniu neurotrofiny dla uzyskiwania większej czystości i homogenności są następujące omawiane w niniejszym opisie procedury: frakcjonowanie na kolumnie kationowymiennej, chromatografia oddziaływań hydrofobowych (HIC) oraz chromatografia na żelu krzemionkowym.
Siła wiązania pomiędzy białkiem a złożem zależy od kilku czynników, obejmujących wielkość i hydrofobowy charakter immobilizowanych grup funkcyjnych, polarność i napięcie powierzchniowe otaczającego rozpuszczalnika oraz hydrofobowość białka. Wydajność wiązania złóż do HIC jest niska z powodu potrzeby dużych odstępów pomiędzy immobilizowanymi ligandami hydrofobowymi. Ponadto, wydajność złoża dla danego białka jest odwrotnie proporcjonalna do poziomu hydrofobowych zanieczyszczeń w preparacie próbki. W celu rozdzielenia pożądanego białka od wariantów i innych zanieczyszczeń, z jednoczesną maksymalizacją wydajności, konieczne jest zidentyfikowanie odpowiedniej fazy stałej złoża do HIC, jak również odpowiednich faz ruchomych do nakładania, przemywania i elucji.
PL 191 400 B1
W celu uzyskania elucji, stężenie soli w buforze do elucji jest zazwyczaj niższe od tego w buforze do nakładania, ale może być tym samym stężeniem, gdy kompensuje to rozpuszczalnik organiczny.
Ponadto, jak stwierdzono w niniejszym opisie, stosowanie rozpuszczalnika organicznego ma dodatkowe zalety, takie, że dodanie rozpuszczalnika organicznego poprawia wzór elucji poprzez uzyskiwanie w wyniku profili o węższych pikach. Poza etanolem, można stosować inne rozpuszczalniki organiczne omówione w niniejszym opisie, obejmujące propanol, izopropanol i niższe glikole alkilenowe, takie jak glikol propylenowy, glikol etylenowy i glikol heksylenowy. Zazwyczaj, rozpuszczalnik organiczny o stężeniu 5 do 25% (obj.), dogodniej 5 do 20% (obj.), eluował będzie właściwie ufałdowaną neurotrofinę. Elucja rozpuszczalnikiem organicznym może być albo gradientowa, albo etapowa. Zalecanym zakresem pH jest pH od prawie obojętnego do nieznacznie kwaśnego, od pH 5 do 8, dogodniej od pH 6 do 8, od pH 6,5 do 7,5, a najdogodniej pH 7. Stosować można którykolwiek z buforów omówionych w niniejszym opisie, obejmujących MOPSO, MOPS, HEPES, fosforanowy, cytrynianowy, amonowy, octanowy, o ile buforują one przy pożądanym pH.
Kompozycje otrzymywane w wyniku opisanych tu niniejszym opisie sposobów będą zasadniczo czystą neurotrofiną, częściej i dogodnie istotnie czystą, i będą zasadniczo wolne od wariantów neurotrofiny, dogodniej w istotnym stopniu wolne od wariantów neurotrofiny. Na przykład, typowa pula po SP-Sepharose po oczyszczaniu NGF z hodowli komórek CHO zawiera około 92% 118, 4,6% 120, 1% zdeamidowanego NGF, 1% utlenionego NGF i 1% izoasparaginianowej pochodnej NGF. Zwykle ilość każdego rodzaju pozostaje w zakresie od około 85 do 93% dla 118, 0 do 5% dla 120 (w dużej części zależnie od stopnia zastosowanej endogennej i/lub egzogennej proteolizy), 0 do 5% dla 117, 0 do 3% dla postaci zdeamidowanych, 0-2% dla postaci izoasparaginianowych i 0 do 2% dla postaci utlenionych. Czystość NGF (wszystkich rodzajów) jest zwykle wyższa niż 99,5%.
Po wyeluowaniu neurotrofiny z kolumny, nadaje się jej odpowiednio postać kompozycji z nośnikiem, dogodnie kompozycji farmaceutycznej z fizjologicznie dopuszczalnym nośnikiem. Kompozycje neurotrofin są korzystnie jałowe. Kompozycje neurotrofin według wynalazku mogą znaleźć również zastosowania in vitro, na przykład do pobudzania wzrostu i przeżywania neuronów w hodowli.
Badano chemiczną i fizyczną stabilność zrekombinowanego ludzkiego czynnika wzrostu nerwów (NGF) w wodnym roztworze w temperaturach pomiędzy 5 a 37°C, w zakresie pH od 4,2 do 5,8. Stabilność chemiczna NGF wzrastała ze wzrastającym pH. W buforze bursztynianowym o pH 5,8 stabilność fizyczna NGF zmniejszała się w wyniku agregacji białka. W oparciu o dane stabilności w temperaturze 5°C i badania przyspieszonej degradacji w temperaturze 37°C, stwierdzono, że optymalny jest bufor octanowy o pH 5,5 (patrz publikacja WO 97/17087, który włączono do niniejszego opisu poprzez odnośnik literaturowy. HPLC z odwróconymi fazami była podstawową metodą badania stabilności, wykazując, że przekształcenie Asn-93 do izo-Asp jest głównym szlakiem degradacji w temperaturze 5°C. Ilościową ocenę degradacji NGF przez chromatografię kationowymienną komplikowało przemieszczanie się w miarę upływu czasu wariantów monomerów NGF do różnych mieszanych dimerów (wymiana dimerów). Traktowanie próbek i kontroli rozcieńczonym kwasem szybko doprowadziło do równowagi rozmieszczenia monomerów w dimerach, umożliwiając ilościową ocenę degradacji NGF przy braku wymiany dimerów. Alkohol benzylowy i fenol oceniano pod względem ich kompatybilności i stabilności z rhNGF w dwóch płynnych preparatach do wielokrotnego użycia. Te dwa preparaty składają się z 0,1 mg/ml białka w 20 mM octanie sodowym o pH 5,5 i 136 mM chlorku sodowego z lub bez 0,01% kwasu pluronowego (F68) jako środka powierzchniowo czynnego. Końcowe stężenia alkoholu benzylowego i fenolu w każdym z tych dwóch preparatów wynosiły odpowiednio 0,9 i 0,25%. W oparciu o trwające 12 miesięcy badania stabilności, rhNGF jest bardziej stabilny w tych preparatach z alkoholem benzylowym, niż fenolem. Preparat rhNGF, z alkoholem benzylowym jako konserwantem, w obecności środka powierzchniowo czynnego jest tak samo stabilny, jak preparat bez dodanego środka powierzchniowo czynnego, wskazując, że dodawanie F58 do preparatu rhNGF do wielokrotnego dawkowania nie jest wymagane dla stabilności. Dlatego też, preparat składający się z 0,1 mg/ml białka w 20 mM octanie, 136 mM NaCl, 0,9% alkoholu benzylowego o pH 5,5 zaleca się dla rhNGF stosowanego do wielokrotnego dawkowania w III fazie prób klinicznych. Ten preparat NGF zawierający wiele dawek przeszedł test skuteczności konserwacji według USP i EP po 6 miesiącach w temperaturze 5°C i jest równie stabilny jak obecny płynny preparat o stężeniu 2 mg/ml. Jednakże, należy unikać ekspozycji preparatu na intensywne światło z powodu obecności jako środka konserwującego alkoholu benzylowego, który jest wrażliwy na światło.
PL 191 400 B1
Ogólnie rzecz biorąc, kompozycja może zawierać inne składniki w ilościach dogodnie nie zaburzających przygotowywania stabilnych, płynnych lub liofilizowanych postaci i w ilościach odpowiednich dla skutecznego, bezpiecznego podawania środka farmaceutycznego.
Neurotrofinę można preparować w postać z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem, tj. nośnikiem, który jest nietoksyczny dla biorców przy wykorzystywanych dawkowaniach i stężeniach, oraz jest kompatybilny z innymi składnikami preparatu. Na przykład, preparat dogodnie nie obejmuje czynników utleniających i innych związków, o których wiadomo, że wywierają niekorzystny wpływ na polipeptydy. Ten etap preparatyki uzyskuje się przez odsalanie lub diafiltrację z zastosowaniem standardowej technologii.
Ogólnie, preparaty przygotowuje się kontaktując w jednolity i gruntowny sposób neurotrofiny z płynnymi nośnikami lub bardzo rozdrobnionymi stałymi nośnikami, bądź obydwoma. Następnie, jeśli jest to konieczne, produktowi nadaje się kształt pożądanego preparatu. Dogodnie nośnikiem jest nośnik do podawania pozajelitowego, dogodniej roztwór, który jest izotoniczny z krwią biorcy. Przykłady takich podłóż nośnikowych obejmują wodę, sól fizjologiczną, roztwór Ringera i roztwór dekstrozy. Użyteczne w niniejszym opisie są również podłoża niewodne, takie jak oleje i oleinian etylowy, jak również liposomy.
Nośnik odpowiednio zawiera niewielkie ilości dodatków, takich jak substancje wzmacniające izotoniczność i stabilność chemiczną. Takie materiały są nietoksyczne dla biorcy przy wykorzystywanych dawkowaniach i stężeniach i obejmują bufory, takie jak fosforan, cytrynian, bursztynian, kwas octowy i inne kwasy organiczne oraz ich sole; przeciwutleniacze, takie jak kwas askorbinowy; polipeptydy o niskich masach cząsteczkowych (mniejsze niż około dziesięć reszt), np. poliargininę lub tripeptydy; białka, takie jak albumina surowicy, żelatyna lub immunoglobuliny; polimery hydrofilowe, takie jak poliwinylopirolidon; aminokwasy, takie jak glicyna, kwas glutaminowy, kwas asparaginowy lub arginina; monosacharydy, disacharydy lub inne węglowodany, włącznie z celulozą i jej pochodnymi, trehalozą, glukozą, mannozą lub dekstrynami; czynniki chelatujące, takie jak EDTA; alkohole cukrowe, takie jak mannitol lub sorbitol; przeciwjony, takie jak sodowe; i/lub niejonowe środki powierzchniowo czynne, takie jak polisorbaty, polioksamery lub PEG. Preparat końcowy może być płynem lub zliofilizowaną substancją stałą.
Neurotrofina przeznaczona do podawania terapeutycznego musi być jałowa. Jałowość łatwo osiąga się przez sączenie przez jałowe membrany filtracyjne (np. membrany o średnicy porów 0,2 mikrona). Terapeutyczne kompozycje neurotrofin na ogół umieszcza się w pojemniku posiadającym miejsce zapewniające jałowy dostęp, na przykład woreczku z roztworem do podawania dożylnego lub fiolce posiadającej zatyczkę możliwą do przebicia igłą do iniekcji podskórnych. Powyższe preparaty są również odpowiednie do zastosowań in vitro.
Neurotrofinę zazwyczaj będzie się przechowywać w pojemnikach do jednostkowego lub wielokrotnego dawkowania, na przykład zatopionych ampułkach lub fiolkach, w postaci roztworu wodnego lub w postaci zliofilizowanej do rekonstytucji. Jako przykład preparatu w postaci zliofilizowanej, fiolki o pojemności 10 ml wypełnia się 5 ml wyjałowionego przez sączenie 1% (wag./obj.) wodnego roztworu neurotrofiny i otrzymaną mieszaninę liofilizuje się. Roztwór do infuzji przygotowuje się przez rekonstytucję zliofilizowanej neurotrofiny z zastosowaniem bakteriostatycznej wody do iniekcji.
Terapeutycznie skuteczną dawkę preparatu neurotrofiny podaje się pacjentowi. Przez „terapeutycznie skuteczną dawkę” w niniejszym opisie rozumie się dawkę, która wywołuje efekty, dla których ją się podaje. Dokładna dawka zależeć będzie od leczonej choroby, i będzie możliwa do ustalenia przez specjalistę w tej dziedzinie z zastosowaniem znanych technik. Ogólnie rzecz biorąc, preparaty neurotrofin tu opisane można podawać w ilości około 0,01 pg/kg do około 100 mg/kh na dzień. Dogodnie, od 0,1 do 0,3 pg/kg. Ponadto, jak wiadomo w tej dziedzinie, konieczne może być dostosowanie dawki do wieku, jak również masy ciała, ogólnego stanu zdrowia, płci, diety, czasu podawania, oddziaływań międzylekowych i ciężkości choroby; będą to mogli ustalić specjaliści w tej dziedzinie na podstawie rutynowych doświadczeń. Zazwyczaj, klinicysta będzie podawał preparaty neurotrofin tu opisane do osiągnięcia dawkowania, które naprawia, utrzymuje i, optymalnie, ponownie stabilizuje działanie neuronu. Postęp tej terapii łatwo jest monitorować przez konwencjonalne oznaczenia.
Neurotrofinę można łączyć ewentualnie z, lub podawać wspólnie z innymi czynnikami neurotroficznymi, obejmującymi NGF, NT-4/5, NT-3 i/lub BDNF i stosować z innymi konwencjonalnymi terapiami stosowanymi w chorobach nerwów.
W przypadku NGF, kompozycja dogodnie zawiera farmaceutycznie skuteczną ilość czynnika wzrostu nerwów i farmaceutycznie dopuszczalny bufor zawierający octan. Kompozycja może posiadać
PL 191 400 B1 pH od 5 do 6. Buforem jest dogodnie octan sodowy. Stężenie octanu wynosi dogodnie od 0,1 do 200 mM, stężenie NGF w kompozycji wynosi dogodnie od 0,07 do 20 mg/ml. Kompozycja ewentualnie zawiera ponadto farmaceutycznie dopuszczalny środek konserwujący, taki jak alkohol benzylowy, fenol, m-krezol, metyloparaben lub propyloparaben. Dogodnie środkiem konserwującym jest alkohol benzylowy. Stężenie alkoholu benzylowego wynosi dogodnie od 0,1 do 2,0%. Kompozycja może ewentualnie zawierać farmaceutycznie dopuszczalny środek powierzchniowo czynny. Ponadto, kompozycja może ewentualnie, ale dogodnie, zawierać fizjologicznie dopuszczalne stężenie chlorku sodowego. Bardziej dogodna kompozycja może zawierać czynnik wzrostu nerwów w stężeniu co najmniej około 0,1 mg/ml i stężenie jonów octanowych od 10 mM do 50 mM. Najbardziej dogodna kompozycja może zawierać NGF w stężeniu 0,1 mg/ml, 20 mM stężenie octanu sodowego, pH 5,5, 136 mM stężenie chlorku sodowego i alkohol benzylowy w stężeniu 0,9% (obj.).
Inne rozwiązanie obejmuje stężenie NGF wynoszące 2,0 mg/ml, 10 mM stężenie octanu sodowego, pH 5,5, i 142 mM stężenie chlorku sodowego. Dogodne jest utworzenie preparatu NGF w stężeniu 0,1 mg/ml, z 20 mM octanem sodowym, 136 mM chlorkiem sodowym, 0,9% alkoholem benzylowym, o pH 5,5. Jak omówiono w niniejszym opisie, zalecaną postacią NGF jest homodimer 118/118. NGF oczyszcza się w pH około 6 do 8 dla utrzymania normalnej postaci dimeru. Jednakże, pewien procent skróconych (proteolitycznie) postaci stanowią postacie monomeryczne, które stają się widoczne i można je określić przez HPLC z odwróconymi fazami. Kwaśne warunki analitycznej HPLC powodują dysocjację dimerów. Opublikowano istnienie różnych dimerycznych postaci NGF - 120/120, 120/118, 118/118 itp. (Schmelzer i in., J. Neurochem. 59: 1675-1683 (1992), którą włączono w całości do niniejszego opisu, głównie ze względu na analitykę i oznaczenia biologiczne, które stosowano w obecnych badaniach, jak również ze względu na zawarte tam ogólne wskazówki). Publikacja donosi, że aktywności in vitro były takie same dla każdej z postaci dimerycznych. Jednakże, w przeciwieństwie, obecne badania w niniejszym opisie wykazują po raz pierwszy, wykorzystując oznaczenie radiologiczne z wykorzystaniem receptora, że dimer 120/120 jest mniej aktywny, w około 80-90% tak aktywny jak rodzaj 118/118. W jednej postaci oznaczenia, izoluje się błony komórek szczura PC-12 i stosuje do kompetycyjnego wiązania pomiędzy standardem NGF i różnymi testowanymi rodzajami. RRA posiada zarówno P75, jak i receptory trkA. Stwierdzono tu również, że rodzaj 117/117 jest tak aktywny, jak rodzaj 118/118. Ponadto, stosowanie w niniejszym opisie oznaczenia opartego na PC-12 potwierdziło wynik z oznaczenia opartego na receptorach, wykazując, że postać 120/120 jest w około 60% tak aktywna jak postać 118/118. W całości włączono również do niniejszego opisu poprzez odnośniki literaturowy pracę Burtona i in., J. Neurochem. 59: 1937-1945 (1992), głównie ze względu na analitykę i oznaczenie biologiczne, które stosowano w obecnych badaniach, jak również ze względu na zawarte w niej ogólne wskazówki.
Postać 118/118 uważana jest za bardziej dostępną biologicznie dla ludzi, niż postać 120/120. Wzrost biodostępności jest co najmniej 4- do 5-krotnego. Różnica jest znacząca, zaskakująca i nieoczekiwana w świetle dotychczasowego stanu wiedzy.
Poniższe przykłady podano w celu zilustrowania, a nie ograniczania wynalazku. Ujawnienia wszystkich cytowanych w niniejszym opisie prac włączono formalnie do niniejszego opisu poprzez odnośniki literaturowe.
Przykłady
P r z y k ł a d I. Oczyszczanie homodimeru NGF 118/118
Przykład ten ilustruje oczyszczanie NGF i racjonalne uzasadnienie dla każdego etapu. Jak w każdym z przykładów, specjalista w tej dziedzinie może łatwo określić i dopasować wymiary kolumn i szybkości przepływów do początkowych objętości hodowli i stężeń białka, jak jest dobrze znane w tej dziedzinie.
Zebrany płyn hodowli komórkowej
Zrekombinowane komórki CHO stransfekowano wektorem ekspresyjnym zawierającym sekwencję DNA kodującą ludzki NGF o długości 120 aminokwasów. Dla ułatwienia sekrecji i modyfikacji potranslacyjnych obecna była również sekwencja prepro NGF. Po hodowli zrekombinowanych komórek CHO zbierano podłoże hodowli komórkowej. Zebrany płyn hodowli komórkowej (HCCF) zawierał rodzaje NGF 120, 118 i 117. Około 40-70% NGF było zazwyczaj homodimerem 118/118, a pozostałość stanowiły heterodimery 120/118, 120/120 i mała ilość 118/117. Jak podano w niniejszym opisie, rodzaje te można rozdzielić na kolumnie SP-Sepharose HP.
Zebrany płyn hodowli komórkowej zatężono około 20-krotnie stosując membrany Millipore o granicy przepuszczalności 10 Kd (stosowano zamiennie zarówno membrany celulozowe, mieszane
PL 191 400 B1 lub polisulfonowe). Do koncentratu dodawano 0,1 objętości 1,0 M Tris, pH 8,2. Rozcieńczony materiał poddawano ultrafiltracji stosując sączek o średnicy porów 0,22 μΜ i przenoszono na 2 do 18 godzin do zbiornika do przechowywania, w którym utrzymywano temperaturę 37°C. Przekształcanie postaci 120/120 w postać 118/118 katalizuje podczas przechowywania endogenna proteaza.
Chromatografia na żelu krzemionkowym
Mikrofiltrat doprowadzano do 1 M stężenia NaCl i nakładano na kolumnę z żelem krzemionkowym zrównoważonym 1 M NaCl, 25 mM MOPSO, pH 7,0. Kolumnę przemywano 1 M NaCl, 25 mM MOPSO, pH 7,0. Odpowiedni zakres pH wynosi około 6 do 8, przy czym zalecane jest pH 7. Następnie kolumnę przemywano 25 mM MOPSO, pH 7. Przemywanie roztworem o niskiej przewodności usuwało białka komórek gospodarza. Związany NGF eluowano 50 mM MOPSO, 0,5 M TMAC, 20% bezwodnego alkoholu czystego do analizy (94-96% specjalnie denaturowany alkohol o formule 3A (5 objętości metanolu i 100 objętości 100% etanolu) i 4-6% izopropanolu). Można stosować inne alkohole, takie jak 20% propanol, 20% izopropanol i 20% metanol. W znaczeniu tu stosowanym, terminy „alkohole” i „rozpuszczalniki alkoholowe” należy odnosić do powszechnie stosowanej terminologii dla alkoholi, dogodnie alkohole o 1 do 10 atomach węgla, dogodniej metanol, etanol, izopropanol, n-propanol lub t-butanol, a najdogodniej etanol lub izopropanol. Takie alkohole są rozpuszczalnikami, które, gdy doda się je do roztworu wodnego, zwiększają hydrofobowość roztworu przez obniżanie jego polarności. Najbardziej zalecany jest etanol. Dolną granicę stężenia alkoholu wyznacza jakikolwiek procent zapewniający elucję, a górną granicę wyznacza konieczność unikania denaturacji białka. Rozpuszczalnik jest dogodnie od 5% do 25%, dogodniej od 5 do 20%, jeszcze dogodniej od 5 do 15%. TMAC jest chlorkiem tetrametyloamonowym, obecnym w celu elucji NGF. Stężenie TMAC może pozostawać w zakresie od 0,1 do 1,0 M. Najbardziej zalecany jest zakres od 0,3 do 0,7. Ilość TMAC stosowanego do elucji NGF zależy od pH i stężenia alkoholu. Im niższe jest pH, tym mniejsze ilości alkoholu i TMAC są wymagane. pH może wynosić pomiędzy około 4 i 8. W tym przykładzie zalecane pH wynosiło 7, co pozwalało na minimalne doprowadzanie pH połączonych frakcji przed nakładaniem na następną kolumnę. Górną granicę pH określa pH konieczne do nakładania na następną kolumnę, a dolną granicę użyteczność do skutecznej elucji NGF.
Chromatografia na S-Sepharose Fast Flow
Wyeluowane frakcje zawierające NGF łączono, rozcieńczano do przewodności poniżej 15,5 ms/cm oczyszczoną wodą i pH doprowadzano do 7,0. Materiał przechowywano nie dłużej niż 8 godzin, ponieważ nadal obecnych było kilka proteaz; jednakże, nie obserwowano żadnej aktywności endogennej proteazy, która przekształca NGF o długości 120 aminokwasów w postać 118. Materiał nakładano na kolumnę do chromatografii na S-Sepharose Fast Flow (kationowymienna żywica agarozowa S-SEPHAROSE TM Fast Flow TM (Pharmacia)) zrównoważoną 25 mM MOPSO, pH 7. Kolumnę przemywano następnie 0,16 M NaCl, pH 7. Związany NGF eluowano 0,5 M NaCl, pH 7. Molowość eluującej soli może pozostawać w zakresie od 0,3 do 1,0 M, dogodniej 0,4 do 0,6 M. Dolną granicę wyznacza użyteczność do eluowania całości NGF, a górną granicę wyznacza potrzeba unikania usuwania zanieczyszczeń i powodowania oddziaływań hydrofobowych na kolumnie, które mogłyby zakłócać eluowanie NGF. Można stosować inne sole, przy czym zalecaną alternatywą jest KCl. W celu otrzymania małej objętości połączonych frakcji, zalecane jest eluowanie 0,5 M NaCl, pH 7. Przy wyższych stężeniach soli, np. powyżej 1 M, elucji mogą ulegać silnie związane zanieczyszczenia.
Ewentualnie, połączone frakcje traktowano kwasem w pH poniżej 3,95 w ciągu co najmniej 15 minut dla uzyskania inaktywacji wirusowej.
P r z y k ł a d II. Oczyszczanie homodimeru NGF 120/120 na dużą skalę
Zebrany płyn hodowli komórkowej
HCCF otrzymano z hodowli komórek CHO o objętości 12 000 litrów generalnie jak opisano w przykładzie I. Rozkład rodzajów NGF w HCCF był następujący: około 40-65% homodimeru 120/120 z heterodimerem 120/118, a pozostałość stanowił homodimer 118/118. Podłoże zazwyczaj szybko przerabiano dla minimalizacji proteolitycznego przekształcania 120 w 118.
Chromatografia kationowymienna na Macroprep High S
HCCF nakładano na kolumnę do chromatografii kationowymiennej z Macroprep High S, przemywano 1,5 M octanem sodowym, 50 mM HEPES pH 7. Związany NGF eluowano 1,5 M NaCl, 0,25 M TMAC, 0,2% tiodiglikol, pH 7. Kolumnę Macroprep można rozwijać w pH 5 do 8 z doprowadzonym stężeniem octanu. Zalecanym zamiennikiem jonu octanowego jest chlorek. NGF ulegał elucji w wyniku zastosowania gradientu TMAC. TMAC jest solą posiadającą charakter zarówno jonowy, jak i hydrofobowy, co jest użyteczną właściwością, ponieważ szkielet nośnika niektórych żywic zawiera składnik
PL 191 400 B1 hydrofobowy, który sprzyja niespecyficznym oddziaływaniom pomiędzy NGF i żywicą. Zazwyczaj, użyteczny jest bufor do elucji o pH od około 6 do 8 i 0-3 M stężeniu TMAC. Frakcje zawierające NGF łączono.
Chromatografia na żelu krzemionkowym
Połączone frakcje bezpośrednio nakładano na kolumnę do chromatografii na żelu krzemionkowym. Krzemionka stanowi żywicę o mieszanych właściwościach chromatograficznych, wykazującą oddziaływania jonowe, polarne i hydrofobowe, które odgrywają rolę w sposobie wiązania białka. Kolumnę równoważono 1 M NaCl, 25 mM MOPSO, pH 7,0. Kolumnę przemywano 1 M NaCl, 25 mM MOPSO, pH 7,0 (dogodnie pH około 5,0 do 8,5, dogodniej pH 6 do 8, a najdogodniej pH 7). Związany NGF eluowano 25 mM bursztynianem, pH 3,9, 50 mM TEAC (chlorkiem tetraetyloamonowym). TEAC jest silniejszym środkiem eluującym od TMAC. pH dogodnie pozostaje w zakresie od około 3,5 do 8. Jednakże, należy unikać pH powyżej 7,5 w ciągu dłuższych okresów czasu w celu zapobiegania lub obniżania tworzenia zdeamidowanych rodzajów NGF. Generalnie, im niższe jest pH buforu, tym niższe jest stężenie soli o mieszanych właściwościach, np. TMAC lub TEAC, wymagane do elucji NGF z kolumny z żelem krzemionkowym. Odpowiednie do stosowania są bufory o wysokiej pojemności buforowej w pH bliskim 4 do 5. Obecność soli w buforze do elucji nie jest konieczna, tak że kolumnę można przemywać przed zastosowaniem buforu do elucji buforem MOPSO bez soli.
P rzy k ła d III. Częściowe oczyszczanie i ponowne ufałdowyyvanie rhNT-4/5 z bakteryjnych ciał inkluzyjnych
W przykładzie tym oczyszczano rhNTF-4/5, wychodząc z fermentacji prowadzonej w objętości 10 lub 60 litrów. Gospodarzem zastosowanym do wytwarzania zrekombinowanej ludzkiej NT-4/5 w fermentacji opisywanej w tym przykładzie był szczep E. coli oznaczony 27C7/pmNT5DT, chociaż NT-4/5 wytwarzana w innych szczepach i organizmach jest odpowiednia do opisanego tu sposobu oczyszczania. Plazmid ekspresyjny zastosowany w tym przykładzie zawierał sekwencję kodującą dojrzałą NT-4/5 pod kontrolą sekwencji kontrolujących transkrypcję i translację wymaganych do ekspresji genu NT-4/5 w E. coli. W plazmidzie ekspresyjnym NT-4/5 sekwencji transkrypcyjnych stosowanych do ekspresji genu w E. coli dostarczyła sekwencja promotora kwaśnej fosfatazy. W sąsiedztwie kodonu terminacji NT-4/5 umieszczony jest w kierunku lambda terminator transkrypcji. Sekrecją białka z cytoplazmy kierowała sekwencja sygnałowa STII. Większość nfNT-4/5 stwierdzano w przestrzeni periplazmatycznej komórek jako ciała załamujące światło. Plazmid nadawał stransformowanemu gospodarzowi oporność na tetracyklinę. Proces fermentacji prowadzono w temperaturze 35°C-39°C i w pH 7,0-7,8. Umożliwiano zachodzenie fermentacji w ciągu 25-40 godzin, po którym to czasie hodowlę schładzano przed zbieraniem. Hodowlę inaktywowano przez ogrzewanie w temperaturze 60°C stosując aparat z przepływem ciągłym lub stosując inaktywację termiczną w tej temperaturze w zbiorniku w ciągu 5-15 minut. Inaktywowaną termicznie hodowlę wirowano stosując wirówkę AX Alphalaval lub równoważną. Komórki E. coli odzyskiwano w osadzie.
Komórki E. coli, w których zachodziła ekspresja zrekombinowanej ludzkiej NT-4/5 w ciałach inkluzyjnych, lizowano standardowym sposobem przygotowywania pasty zawierającej NT-4/5 w ciałach inkluzyjnych. W buforze nie były zawarte żadne inhibitory proteaz.
W celu wyizolowania ciał inkluzyjnych z uszkodzonych komórek, pastę NT-5 E. coli ponownie zawieszano w 0,02 M Tris, pH 8, 5 mM EDTA (10 ml buforu/gram pasty) stosując obrotowe, mechaniczne urządzenia dyspergujące, na przykład Turrax. Zawiesinę komórek przepuszczano trzy razy przez mikrofluidyzer przy ciśnieniu 6000 psi. Uzyskany w wyniku homogenat wirowano w wirówce Sorvall RC-3B przy 5000 obrotów na minutę w ciągu 45 minut. Supernatant odrzucano, a osad ponownie zawieszano w 20 mM Tris, pH 8, 5 mM EDTA (bufor ekstrakcyjny) stosując Turrax w ciągu 2 do 3 minut przy maksymalnej szybkości. Homogenat wirowano jak opisano uprzednio. Otrzymany osad (otrzymane osady) (określane jako ciała inkluzyjne lub ciała załamujące światło NT-4/5) przechowywano w temperaturze -70°C.
NT-4/5 izolowano z ciał inkluzyjnych w następujący sposób. Osad ciał inkluzyjnych zawieszano w 20 mM Tris, pH 8, 6 M mocznik, 25 mM DTT (10 ml buforu/g ciał inkluzyjnych) stosując Turrax przy średniej szybkości w ciągu około 10 minut. Zawiesinę mieszano w ciągu 40 minut w temperaturze 2-8°C i wirowano w wirówce Sorvall RC3B przy 5000 obrotów na minutę w ciągu około 45 minut. Dodawano PEI (polietylenoiminę) do stężenia 0,1% w supernatancie, który mieszano w temperaturze 2-8° w ciągu 30 minut. PEI wytrąca kwas nukleinowy i inne cząsteczki naładowane ujemnie. Mieszaninę wirowano w wirówce Sorvall RC3B przy 5000 obrotów na minutę w ciągu około 45 minut. Supernatant PEI nakładano na kolumnę DEFF Sepharose Fast Flow (10 cm x 14 cm; DEFF jest żywicą z dietyloaminowymi grupami funkcyjnymi zrównoważoną 0,02 M Tris, 6 M mocznikiem, 10 mM DTT, pH 8. Na kolumnę
PL 191 400 B1 nakładano równoważnik 1 kg rozpuszczonych ciał załamujących światło. Ponieważ zredukowana i zdenaturowana NT-4/5 nie wiąże się z żywicą DEFF, zbierano niezwiązane połączone frakcje zawierające NT-4/5 i 6 M mocznik (figura 6) i pH połączonych frakcji obniżano do 5,0 kwasem octowym. Połączone niezwiązane frakcje po rozdziale na DEFF o obniżonym pH nakładano na kolumnę z S-Sepharose Fast Flow (S odnosi się do grupy funkcyjnej SO3 żywicy) zrównoważoną 20 mM octanem, pH 5, zawierającym 6 M mocznik, w których to warunkach NT-4/5 wiąże się z żywicą. Po nakładaniu kolumnę S-Sepharose Fast Flow równoważono kilkoma objętościami buforu równoważącego. Związaną NT-4/5 eluowano 0,5 M NaCl, 20 mM octanem sodowym, 6 M mocznikiem, pH 5 (figura 7). Połączone frakcje wyeluowane 0,5 M NaCl z kolumny SSFF dializowano przez noc wobec 20 mM Tris, 0,14 M NaCl, pH 8, które to warunki umożliwiają NT-4/5 ponowne ufałdowywanie, chociaż niewłaściwe. Niewłaściwie ufałdowane cząsteczki rhNT-4/5 agregowały tworząc osad.
Zagregowaną, niewłaściwie ufałdowaną rhNT-4/5 przerabiano dla otrzymania właściwie ufałdowanej NT-4/5.Zagregowaną, niewłaściwie ufałdowaną rhNT-4/5 zbierano przez wirowanie w postaci osadu. Osad zawieszano ponownie w 0,2 M Tris, pH 8, 4 M moczniku, 5 mM DTT i mieszano w temperaturze 2-8°C w ciągu 1 do 2 godzin, lub do rozpuszczenia osadu. Końcowe stężenie białka doprowadzano do około 10 mg białka/ml w oparciu o współczynnik ekstynkcji 1,8 przy długości fali 280 nm. Do roztworu rozpuszczonego osadu dodawano utleniony glutation do 20 mM stężenia końcowego, a następnie delikatnie mieszano wciągu 15 do 30 minut w temperaturze 2-8°. Utleniony glutation reaguje z grupami sulfhydrylowymi NT-4/5 dając mieszany dwusiarczek NT-4/5-S-glutation. Mieszany dwusiarczek NT-4/5-SG rozcieńczano do stężenia końcowego od 0,1 do 0,5 mg białka/ml w 100 mM Tris, 20 mM glicynie, 15% PEG-300, 1 M chlorowodorku guanidyny, pH 8,3. W celu inicjacji właściwego ponownego ufałdowywania NT-4/5, do mieszaniny poddawanej ponownemu ufałdowywaniu dodawano cysteinę do stężenia końcowego od 2 do 4 mM, a następnie napowietrzano (przez wprowadzanie gazu za pomocą bełkotki) roztwór azotem lub helem w ciągu od 5 do 60 minut przed uszczelnieniem pojemnika w celu wyparcia tlenu. Umożliwiano zachodzenie ponownego ufałdowywania NT-4/5 w ciągu 18 do 24 godzin w temperaturze od 2 do 8°C.
Alternatywnie, rhNT-4/5 ponownie ufałdowywano stosując siarczynolizę w następujący sposób. Osady ciał inkluzyjnych (110 g) zawieszano w 1,1 litra 20 mM Tris, 7 M mocznika, 10 mM glicyny, 100 mM siarczynu sodowego, 10 mM tetrationianu sodowego i rozpuszczono stosując Turrax w ciągu 10 minut przy maksymalnej szybkości. Mieszaninę (1260 ml) mieszano następnie w temperaturze od 2 do 8°C w ciągu 45 minut. Dodawano PEI do stężenia końcowego 0,1%. Mieszaninę mieszano w ciągu dodatkowych 30 minut w temperaturze 4° i wirowano w ciągu 45 minut przy 5500 obrotach na minutę w wirówce RC3B. Supernatant nakładano na kolumnę DEFF (4,4 cm x 25 cm) zrównoważoną 20 mM Tris, 6 M mocznikiem, pH 8. Niezwiązane frakcje po DEFF doprowadzano do pH 5 kwasem octowym i nakładano na kolumnę z S-Sepharose Fast Flow (4,4 cm x 25 cm) zrównoważoną 20 mM octanem, 6 M mocznikiem, pH 5. NT-4/5 eluowano 25 mM MOPSO, 0,5 M NaCl, pH 7.
Połączone frakcje wyeluowane 0,5 M chlorkiem sodowym, zawierające sulfonylowaną rhNT-4/5, rozcieńczano do stężenia białka około 0,1 mg/ml i doprowadzano do stężeń 1 M chlorowodorku guanidyny, 100 mM Tris, 20 mM glicyny, 15% PEG-300, pH 8,3. Ponowne ufałdowywanie NT-4/5 rozpoczynano przez dodanie 2 do 4 mM cysteiny. Reakcja ponownego ufałdowywania ulegała zasadniczo zakończeniu w ciągu 24 godzin. Ewentualnie, można prowadzić napowietrzanie gazem obojętnym, np. helem lub azotem, dla zastąpienia tlenu w roztworze.
P r z y k ł a d IV. Alternatywne izolowanie właściwie ufałdowanej rhNT-4/5 z wariantów konformacyjnych (niewłaściwie ufałdowanych)
Mieszaninę rhNT-4/5 po ponownym ufałdowywaniu z przykładu IV zatężano około 10-krotnie stosując układ do ultrafiltracji Millipore-Pellicon z membraną celulozową o powierzchni 20 stóp kwadratowych (albo polisulfonową, albo równoważną) o przepuszczalności do 10 kD. Zatężoną mieszaninę albo dializowano przez noc wobec 50 litrów 50 mM octanu, pH 5,5, 50 mM NaCl, albo diafiltrowano do 50 mM octanu, 50 mM NaCl, pH 5,5, przed sączeniem przez membranę o średnicy porów 0,2 mikrona.
Przesączoną mieszaninę po ponownym ufałdowywaniu doprowadzano do 2,5 M NaCl, 20 mM MOPSO, pH 7, i nakładano na kolumnę do HIC, kolumnę z Toyopearl 650 M (10 cm x 19 cm), uprzednio zrównoważoną 2,5 M NaCl, 20 mM MOPSO, pH 7,0. Kolumnę przemywano następnie buforem do równoważenia. Niektóre niewłaściwie ufałdowane postacie cząsteczki rhNT-4/5 ulegały elucji we frakcjach nie ulegających wiązaniu, podczas gdy inne niewłaściwie ufałdowane postacie ulegały elucji przy wysokich stężeniach rozpuszczalników organicznych, takich jak 20 do 40% alkohol czysty do analizy. Właściwie ufałdowaną rhNT-4/5 eluowano z kolumny z fenylowymi grupami funkcyjnymi stosując 2 M chlorek
PL 191 400 B1 sodowy, 10% alkohol czysty do analizy, pH 7. Zamiast. złoża Toyopearl można stosować inne żywice z fenylowymi grupami funkcyjnymi, takie jak Phenyl Sepharose. Można stosować omawiane w niniejszym opisie sole, obejmujące siarczan amonowy, cytrynian, octan i chlorek potasowy. Zależnie od stosowanej soli, jej stężenie wynosi zazwyczaj od 1 M do 3 M, przy czym do nakładania preferowany jest 2,5 M NaCl, a do elucji preferowany jest 2 M NaCl, gdy obecny jest rozpuszczalnik organiczny. Dogodnie, do elucji neurotrofiny i oddzielania jej od wariantów stosuje się obniżanie stężenia soli. W celu uzyskania elucji, stężenie soli w buforze elucyjnym jest zazwyczaj niższe, niż w buforze do nakładania, ale może być tym samym stężeniem, jeśli zrównoważy to rozpuszczalnik organiczny. Ponadto, stosowanie rozpuszczalnika organicznego ma, jak stwierdzono w niniejszym opisie, inną zaletę, mianowicie dodanie go polepsza wzór elucji w wyniku powstawania profili o węższych pikach. Poza etanolem, można stosować inne omawiane w niniejszym opisie rozpuszczalniki organiczne, obejmujące propanol, izopropanol i niższe glikole alkilenowe, takie jak glikol propylenowy, glikol etylenowy i glikol heksylenowy. Rozpuszczalnik organiczny o stężeniu od 5 do 25% (obj.), dogodniej od 5 do 20% (obj.), jeszcze dogodniej od 5 do 15%, będzie zazwyczaj eluować właściwie ufałdowaną neurotrofinę. Elucja rozpuszczalnikiem organicznym może być albo gradientowa, albo etapowa. pH dogodnie pozostaje w zakresie od prawie obojętnego do nieznacznie kwaśnego, od pH 5 do 8, dogodniej od 5,5 do 7,5, a najdogodniej pH 7. Można stosować którykolwiek z buforów omawianych w niniejszym opisie, obejmujących MOPSO, MOPS, HEPES, bufor fosforanowy, cytrynianowy, amonowy, octanowy, dopóki buforują one w pożądanym pH.
P r z y k ł a d V. Wstępne oczyszczanie, ponowne ufałdowywanie i ostateczne oczyszczanie rhNT-3 z bakteryjnych ciał inkluzyjnych
W celu wyizolowania ciał inkluzyjnych z uszkodzonych komórek, pastę NT-3 E. coli (1 kg) ponownie zawieszano w 10 litrach 100 mM octanu sodowego, pH 5, stosując obrotowe, mechaniczne urządzenie dyspergujące, na przykład Turrax. Zawiesinę komórek trzykrotnie przepuszczano przez mikrofluidyzer przy ciśnieniu 6000 psi. Uzyskany w wyniku homogenat wirowano w wirówce Sorvall RC-3B przy 5000 obrotów na minutę w ciągu 30 minut.
NT-3 izolowano z ciał inkluzyjnych w następujący sposób. Osady ciał inkluzyjnych zawieszano w ciągu około 10 minut w 100 mM Tris, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 100 mM siarczynie sodowym, 10 mM tetrationianie sodowym, 7,5 M moczniku, pH 8,3 (10 ml/gram ciał inkluzyjnych) stosując Turrax przy średniej szybkości. Zawiesinę mieszano w ciągu około 1 godziny w temperaturze 2-8°C. Dodawano PEI (polietylenoiminę) do 0,15% (stężenie końcowe) i mieszano w temperaturze 2-8°C w ciągu 30 minut. Mieszaninę wirowano w wirówce Sorval RC3B przy 5000 obrotów na minutę w ciągu 30 minut. Supernatant sączono przez wkład Gelman Preflow. Przesączony supernatant rozcieńczano trzema objętościami buforu do równoważenia S-Sepharose Fast Flow (50 mM octan sodowy, 5 M mocznik, pH 5). Rozcieńczony przesączony supernatant (przewodność niższa od 7 mS) nakładano na kolumnę S-Sepharose FF zrównoważoną 50 mM octanem sodowym, 5 M mocznikiem, pH 5,0. Kolumnę najpierw przemywano 50 mM octanem sodowym, 5 M mocznikiem, pH 5, a następnie 50 mM MOPS, 5 M mocznikiem, 10 mM glicyną, pH 7. Poddaną siarczynolizie NT-3 eluowano z kolumny stosując 10 objętości kolumny gradientu od 0 do 0,6 M NaCl w 50 mM MOPS, 5 M moczniku, 10 mM glicynie, pH 7.
Częściowo oczyszczoną NT-3 ponownie ufałdowywano przez rozcieńczanie połączonych frakcji po S-Sepharose do stężenia białka około 0,1 mg/ml buforem do ponownego ufałdowywania zawierającym 0,1 M Tris, 2 M mocznik, 0,1 M NaCl, 15% PEG 300, 10 mM glicynę, 25 mM etanoloaminę, pH 9,1. Ponowne ufałdowywanie rozpoczynano przez dodanie cysteiny do stężenia około 5 mM i mieszano w ciągu 2-5 dni w temperaturze 2-8°C. Ewentualnie, do buforu do ponownego ufałdowywania można wprowadzić za pomocą bełkotki HE lub argon dla obniżenia zawartości tlenu w roztworze do ponownego ufałdowywania.
pH ponownie ufałdowywanych połączonych frakcji doprowadzano do 7, sączono je i nakładano na kolumnę do chromatografii kationowymiennej na Macroprep High S, zrównoważoną 50 mM HEPES, pH 7. Po nałożeniu połączonych frakcji o doprowadzonym pH na kolumnę z Macroprep, kolumnę najpierw przemywano 50 mM MOPS, pH 7, a następnie 50 mM MOPS, 0,1 M TMAC, 0,3 M NaCl, pH 7. NT-3 eluowano 50 mM MOPS, 0,25 M TMAC, 1,5 M NaCl, pH 7.
Połączone frakcje po rozdziale na Macroprep oczyszczano dalej na kolumnie z Phenyl Sepharose Fast Flow High Substitution. Kolumnę z fenylowymi grupami funkcyjnymi równoważono 50 mM HEPES, 1,5 M NaCl, pH 7, i połączone frakcje po Macroprep bezpośrednio nakładano na nią. Kolumnę przemywano buforem do równoważenia, a następnie właściwie ufałdowaną NT-3 eluowano stosując 15 objętości kolumny rozpoczynając od 50 mM HEPES, 1,5 M NaCl, pH 7, do 50 mM HEPES, 10% alkohol
PL 191 400 B1 czysty do analizy, pH 7. Frakcje analizowano albo przez C4 HPLC, albo przez SDS-PAGE i łączono frakcje zawierające właściwie ufałdowaną NT-3.
Połączone frakcje po rozdziale na kolumnie z fenylowymi grupami funkcyjnymi rozcieńczano do przewodności poniżej 25 mS (zazwyczaj około 2 objętościami wody) i nakładano na kolumnę z SP-Sepharose HP uprzednio zrównoważoną 25 mM MOPSO. Kolumnę najpierw przemywano buforem do równoważenia i NT-3 eluowano z kolumny stosując 20 objętości kolumny gradientu rozpoczynając od 0,25 M TMAC do 0,65 M TMAC w 25 mM MOPSO, pH 7. Frakcje zawierające rhNT-3 (jak określono przez oznaczenie C4 HPLC) łączono.
Połączone frakcje po rozdziale na SP-Sepharose HP zatężano do stężenia około 1 mg/ml stosując membranę o granicy przepuszczalności 10 000, a następnie poddawano diafiltracji 6 objętościami 10 mM octanu, 140 mM NaCl, pH 5,0.
LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJA OGÓLNA:
(i) ZGŁASZAJĄCY: Genentech, Inc.
(ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Sposób izolacji neutrofiny z mieszaniny białek, i komppzycja neutrofiny (iii) LICZBA SEKWEENCI: 6 (iv) ADRES DO KORESPONDEECCI:
(A) ADRESAT: Genentech, Inc.
(B) ULICA: 1 DCA Way (C) MIASTO: South San Francisco (D) STAC: Kli-fornia (E) KRAI: STACY ZJEDNOCZONE AMERYKI (F) KOD POCZTOWY: 94080 (v) ZAPIS KOMPUTEROWY:
(A) TYP COŚCIKA: dyskietka 3,5 cala; 1,44 Mb (B) KOMPUTER: PC kompaaybilny z IBM (C) SYSTEM OPERACYJCY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOOAAIE: WinPaUn (Genentech) (vi) DACE DOTYCZĄCE AKTUALCEGO ZGŁOSZENIA:
(A) NUMER ZGŁOSZENIA:
(B) DATA ZŁOŻENIA:
(C) KIASYFIKACJA:
(vii) DACE DOTYCZĄCE UPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:
(A) CUMER ZGŁOSZENIA: 60/030838 (B) DATA ZŁOŻENIA: 15 listapada 1996 (vii) DACE DOTYCZĄCE UPRZEDCIEGO ZGŁOSZENIA:
(A) CUMER ZGŁOSZENIA: 60/047855 (B) DATA ZŁOŻENIA: 29 maja 1997 (viii) ICFORMACJA O PEŁ^^MOCHU/PRZEDSTAWICIELU:
PL 191 400 Β1 (A) NAZWISKO: dr Torchia, Timothy E.
(B) NUMER REJESTRACYJNY: 36 700 (C) NUMER, NA KTÓRY NALEŻY SIĘ POWOŁYWAĆ/NUMER W REJESTRZE: P1063R2PCT (ix) INFORMACJA TELEKOMUNIKACYJNA:
(A) TELEFON: 650/225-6674 (B) TELEFAX: 650/952-9881 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM:1: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 241 aminokwasów
(B) TYP: aminokwasowa
(D) TOPOLOGIA: liniowa
(xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE
IDENTYFIKACYJNYM:1:
Met Ser Met Leu Phe Tyr Thr Leu Ile Thr Ala Phe Leu Ile Gly
1 5 10 15
Ile Gin Ala Glu Pro His Ser Glu Ser Asn Val Pro Ala Gly His
20 25 30
Thr Ile Pro Gin Val His Trp Thr Lys Leu Gin His Ser Leu Asp
35 40 45
Thr Ala Leu Arg Arg Ala Arg Ser Ala Pro Ala Ala Ala Ile Ala
50 55 60
Ala Arg Val Ala Gly Gin Thr Arg Asn Ile Thr Val Asp Pro Arg
65 70 75
Leu Phe Lys Lys Arg Arg Leu Arg Ser Pro Arg Val Leu Phe Ser
80 85 90
Thr Gin Pro Pro Arg Glu Ala Ala Asp Thr Gin Asp Leu Asp Phe
95 100 105
Glu Val Gly Gly Ala Ala Pro Phe Asn Arg Thr His Arg Ser Lys
110 115 120
PL 191 400 B1
Arg Ser Ser Ser His 125 Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val
130 135
Cys Asp Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr
140 145 150
Asp Ile Lys Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile
155 160 165
Asn Asn Ser Val Phe Lys Gin Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg
170 175 180
Asp Pro Asn Pro Val Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys
185 190 195
His Trp Asn Ser Tyr Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala
200 205 210
Leu Thr Met Asp Gly Lys Gin Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile
215 220 225
Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu Ser Arg Lys Ala Val Arg Arg
230 235 240
Ala
241 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYMI:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 120 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ci) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE
IDFN^YTKACYYNYM:!:
Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys
PL 191 400 B1
Asp Ser Val Ser Val 20 Trp Val Gly Asp Lys 25 Thr Thr Ala Thr Asp 30
Ile Lys Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn
35 40 45
Asn Ser Val Phe Arg Gin Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp
50 55 50
Pro Asn Pro Val Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His
65 70 75
Trp Asn Ser Tyr Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu
80 85 90
Thr Met Asp Gly Lys Gln Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp
95 100 105
Thr Ala Ćys Val Cys Val Leu Ser Arg Lys Ala Val Arg Arg Ala
110 115 120 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM:3:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 120 aminokwasów (B) TYP: arninokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI. SEKWENCJA O NUMERZE
IDENTYFIKACYJNYMI:
PL 191 400 Β1
Asn Ser Val Phe Arg Gin 50 Tyr Phe Phe Glu 55 Thr Lys Cys Arg Ala 60
Ser Asn Pro Val Glu Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His
65 70 75
Trp Asn Ser Tyr Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu
80 85 90
Thr Thr Asp Glu Lys Gin Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp
95 100 105
Thr Ala Cys Val Cys Val Leu Ser Arg Lys Ala Thr Arg Arg Gly
110 115 120
(2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM:4:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 118 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE
IDENTYFIKACYJNYM:4:
His Ser Asp Pro ALa Arg Arg Gly Glu Leu Ser Val Cys Asp Ser 15 10 15
Ile Ser Glu Trp Val Thr Ala Ala Asp Lys Lys Thr Ala Val Asp 20 25 30
Met Ser Gly Gly Thr Val Thr Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser 35 40 45
Lys Gly Gin Leu Lys Gin Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro 50 55 60
Met Gly Tyr Thr Lys Glu Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys Arg His 65 70 75
PL 191 400 B1
Trp Asn Ser Gin Cys Arg Thr Thr Gin 80 Ser 85 Tyr Val Arg Ala Leu 90
Thr Met Asp Ser Lys Lys Arg Ile Gly Trp Arg Phe Ile Arg Ile
95 100 105
Asp Thr Ser Cys Val Thr Leu Thr Ile Lys Arg Gly Arg
110 115 118
(2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYMI:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 119 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE
IDEN NT Y FIEKACY JNYM :5:
Tyr Ala 1 Glu His Lys 5 Ser His Arg Gly Glu 10 Tyr Ser Val Cys Asp 15
Ser Glu Ser Leu Trp Val Thr Asp Lys Ser Ser Ala Ile Asp Ile
20 225 330
Arg Gly His Gin Val Thr Val Leu Gly Glu Ile Lys Thr Gly Asn
35 4 5 55
Ser Pro Val Lys Gin Tyr Phe Tyr Glu Thr Arg Cys Lys Glu Ala
50 55 00
Arg Pro Val Lys Asn Gly Cys Arg Gly Ile Asp Asp Lys His Trp
65 75 75
Asn Ser Gin Cys Lys Thr Ser Gin Thr Tyr Val Arg Ala Leu Thr
80 8 5 00
Ser Glu Asn Asn Lys Leu Val Gly Trp Arg Trp Ile Arg Ile Asp
95 100 105
PL 191 400 Β1
Thr Ser Cys Val Ser Ala Leu Ser Arg Lys Ile Gly Arg Thr
110 115 119 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM:6: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 130 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE
IDENTYFIKACYJNYM:6:
Gly 1 Val Ser Glu Thr 5 Ala Pro Ala Ser Arg Arg Gly Glu Leu Ala
10 15
Val Cys Asp Ala Val Ser Gly Trp Val Thr Asp Arg Arg Thr Ala
20 25 30
Val Asp Leu Arg Gly Arg Glu Val Glu Val Leu Gly Glu Val Pro
35 40 45
Ala Ala Gly Gly Ser Pro Leu Arg Gin Tyr Phe Phe Glu Thr Arg
50 55 60
Cys Lys Al a Asp Asn Ala Glu Glu Gly Gly Pro Gly Ala Gly Gly
65 70 75
Gly Gly Cys Arg Gly Val Asp Arg Arg His Trp Val Ser Glu Cys
80 85 90
Lys Ala Lys Gin Ser Tyr Val Arg Ala Leu Thr Ala His Ala Gin
95 100 105
Gly Arg ;Val Gly Trp Arg Trp Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val
110 115 120
Cys Thr Leu Leu Ser Arg Thr Gly Arg Ala
125 130

Claims (4)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Sposóbizolowania neurotrofiny z mieszaninybiałek, znamienny tym, że oddziela się neurotrofinę od innych białek z wykorzystaniem żywicy będącej żelem krzemionkowym poprzez elucję neurotrofiny za pomocą buforu elucyjnego zawierającego TMAC lub TEAC buforowanego do pH 3,5 do 8,0 w nieobecności alkoholowego lub polarnego rozpuszczalnika aprotonowego.
  2. 2. 061^0^0!^^, znam ienna tym, że została wytworzona sposobem jak określono w zastrz. 1 i zawiera neurotrofinę o czystości przynajmniej 95%, która ma sekwencję aminokwasową w ponad 90% homologiczną z sekwencją aminokwasową neurotrofiny wybraną spośród prepro czynnika wzrostu nerwów o sekwencji SEQ ID NO: 1 (prepro-NGF), rekombinowanego ludzkiego czynnika wzrostu nerwów o sekwencji SEQ ID NO: 2 (rhNGF), rekombinowanego ludzkiego pochodzącego z mózgu czynnika neurotropowego o sekwencji SEQ ID NO: 4 (BDNF), neurotrofiny-3 o sekwencji SEQ ID NO:5 (NT-3) i neurotrofiny-4/5 o sekwencji SEQ ID NO: 6 (NT-4/5).
  3. 3. według zas-trz. 2, znamienna tym, że zawiera nośnik i ηβυΓούυί^, która jess zasadniczo czysta i wolna od innych białek, przy czym neurotrofina stanowi przynajmniej 95% białka kompozycji.
  4. 4. Kompozycja według zastrz. 3, znamienna tym, że jest jałowa.
PL333460A 1996-11-15 1997-11-14 Sposób izolowania neurotrofiny z mieszaniny białek i kompozycja neurotrofiny PL191400B1 (pl)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US3083896P 1996-11-15 1996-11-15
US4785597P 1997-05-29 1997-05-29
PCT/US1997/021068 WO1998021234A2 (en) 1996-11-15 1997-11-14 Purification of neurotrophins

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL333460A1 PL333460A1 (en) 1999-12-20
PL191400B1 true PL191400B1 (pl) 2006-05-31

Family

ID=26706516

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL333460A PL191400B1 (pl) 1996-11-15 1997-11-14 Sposób izolowania neurotrofiny z mieszaniny białek i kompozycja neurotrofiny

Country Status (21)

Country Link
US (5) US6005081A (pl)
EP (1) EP0942930B1 (pl)
JP (3) JP4671372B2 (pl)
KR (1) KR100554332B1 (pl)
CN (1) CN1268639C (pl)
AT (1) ATE371670T1 (pl)
AU (1) AU729459B2 (pl)
BR (1) BR9713055A (pl)
CA (1) CA2268747A1 (pl)
CZ (1) CZ300296B6 (pl)
DE (1) DE69738074T2 (pl)
EA (1) EA002349B1 (pl)
ES (1) ES2293662T3 (pl)
HU (1) HU222666B1 (pl)
ID (1) ID26697A (pl)
IL (2) IL129851A0 (pl)
NO (1) NO327149B1 (pl)
NZ (1) NZ335207A (pl)
PL (1) PL191400B1 (pl)
TR (1) TR199901734T2 (pl)
WO (1) WO1998021234A2 (pl)

Families Citing this family (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HU222666B1 (hu) * 1996-11-15 2003-09-29 Genentech, Inc. Eljárás neuorotrofinok tisztítására
JP2001524670A (ja) * 1997-11-20 2001-12-04 イーエスエー・インコーポレーテッド 電気化学的分析システム
NZ507557A (en) * 1998-05-06 2003-10-31 Genentech Inc Protein purification by ion exchange chromatography
ATE461935T1 (de) 2000-03-27 2010-04-15 Genetics Inst Llc Verfahren zur reinigung von stark anionischen proteinen
NZ530025A (en) * 2001-06-05 2005-06-24 Inst Genetics Llc Methods for purifying highly anionic proteins
EP1456233A4 (en) * 2001-06-15 2006-06-21 Queensland Bioproc Technology ORMEAU HEMOCYANINE AND METHOD FOR PURIFICATION THEREOF
CA2490409A1 (en) 2002-06-28 2004-01-08 Centocor, Inc. Mammalian ch1 deleted mimetibodies, compositions, methods and uses
US7998705B2 (en) * 2002-08-06 2011-08-16 FUJIFILM Diosynth Biotechnologies U.S.A., Inc Increased dynamic binding capacity in ion exchange chromatography by addition of polyethylene glycol
AU2003902066A0 (en) * 2003-05-01 2003-05-15 Norika Holdings Extraction process for a pharmaceutical product
CA2487673C (en) * 2003-12-02 2010-11-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Improved method for the recombinant production and purification of protein kinases
EP1538201A1 (en) * 2003-12-02 2005-06-08 F.Hoffmann-La Roche Ag Method for the recombinant production and purification of protein kinases
JP2007523196A (ja) * 2004-02-20 2007-08-16 ライナット ニューロサイエンス コーポレイション Ｎｔ−４／５を用いて肥満または糖尿病を処置する方法
WO2005103087A1 (en) * 2004-04-23 2005-11-03 Conjuchem Biotechnologies Inc. Method for the purification of albumin conjugates
CN101180081B (zh) 2005-05-25 2015-08-26 诺沃-诺迪斯克有限公司 稳定的多肽制剂
EP1888117A1 (en) * 2005-05-25 2008-02-20 Novo Nordisk A/S Stabilized polypeptide formulations
SG155183A1 (en) 2005-08-26 2009-09-30 Ares Trading Sa Process for the preparation of glycosylated interferon beta
CA2625978A1 (en) * 2005-12-09 2007-06-14 Ares Trading S.A. Method for purifying fsh or a fsh mutant
CN100419422C (zh) * 2005-12-12 2008-09-17 北京三诺佳邑生物技术有限责任公司 测定神经生长因子含量的方法
AR058568A1 (es) 2005-12-20 2008-02-13 Bristol Myers Squibb Co Metodos para producir una composicion con moleculas ctla4-ig a partir de un medio de cultivo
KR101398713B1 (ko) 2005-12-20 2014-06-12 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 조성물 및 조성물의 제조 방법
KR20080091838A (ko) * 2006-02-02 2008-10-14 리나트 뉴로사이언스 코퍼레이션 Ｔｒｋｂ 작용제의 투여에 의한 원치않는 체중 감소 또는 섭식 장애의 치료 방법
US7935342B2 (en) * 2006-02-02 2011-05-03 Rinat Neuroscience Corp. Methods for treating obesity by administering a trkB antagonist
US10741034B2 (en) 2006-05-19 2020-08-11 Apdn (B.V.I.) Inc. Security system and method of marking an inventory item and/or person in the vicinity
US9790538B2 (en) * 2013-03-07 2017-10-17 Apdn (B.V.I.) Inc. Alkaline activation for immobilization of DNA taggants
MX2009006794A (es) * 2006-12-20 2009-07-02 Rinat Neuroscience Corp Agonistas del receptor tirosina quinasa b para el tratamiento de trastornos autoinmunes.
SI3597659T1 (sl) 2007-07-09 2023-04-28 Genentech, Inc. Preprečevanje redukcije disulfidne vezi med rekombinantno proizvodnjo polipeptidov
ES2666170T3 (es) * 2007-10-30 2018-05-03 Genentech, Inc. Purificación de anticuerpos mediante cromatografía de intercambio catiónico
US8447409B2 (en) * 2008-10-15 2013-05-21 Cochlear Limited Electroneural interface for a medical implant
WO2010075535A1 (en) * 2008-12-23 2010-07-01 Regents Of The University Of Minnesota Neurotrophins and uses thereof
JP5695384B2 (ja) 2009-10-05 2015-04-01 花王株式会社 毛髪形状感受性遺伝子
JP5699429B2 (ja) * 2009-12-18 2015-04-08 東ソー株式会社 Ｆｃレセプターの精製方法
DK2513135T3 (da) 2009-12-18 2020-05-18 Csl Ltd Fremgangsmåde til oprensning af polypeptider
JP5903044B2 (ja) 2010-06-25 2016-04-13 日本臓器製薬株式会社 被検物質の判定又は評価方法
CN102898514B (zh) * 2011-07-28 2015-04-29 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 重组人神经生长因子缺失突变体及其制备方法和用途
EP2594295A1 (en) 2011-11-16 2013-05-22 Servicio Andaluz De Salud Nerve implants based on a compacted biomaterial containing cells
US9266370B2 (en) 2012-10-10 2016-02-23 Apdn (B.V.I) Inc. DNA marking of previously undistinguished items for traceability
US9297032B2 (en) 2012-10-10 2016-03-29 Apdn (B.V.I.) Inc. Use of perturbants to facilitate incorporation and recovery of taggants from polymerized coatings
US9963740B2 (en) 2013-03-07 2018-05-08 APDN (B.V.I.), Inc. Method and device for marking articles
CA2926436A1 (en) 2013-10-07 2015-04-16 Judith Murrah Multimode image and spectral reader
CN103880943A (zh) * 2014-01-20 2014-06-25 厦门北大之路生物工程有限公司 一种rhNGF成熟肽的制备方法
WO2015142990A1 (en) 2014-03-18 2015-09-24 Apdn (B.V.I.) Inc. Encryped optical markers for security applications
US10745825B2 (en) 2014-03-18 2020-08-18 Apdn (B.V.I.) Inc. Encrypted optical markers for security applications
CN104195160A (zh) * 2014-08-08 2014-12-10 厦门北大之路生物工程有限公司 一种以Pro-BDNF的形式制备人脑源性神经营养因子的方法
US10760182B2 (en) 2014-12-16 2020-09-01 Apdn (B.V.I.) Inc. Method and device for marking fibrous materials
CN106279397A (zh) * 2015-06-09 2017-01-04 舒泰神（北京）生物制药股份有限公司 一种神经生长因子的提取方法
EP3442719B1 (en) 2016-04-11 2021-09-01 APDN (B.V.I.) Inc. Method of marking cellulosic products
CN106478801A (zh) * 2016-10-10 2017-03-08 未名生物医药有限公司 一种从哺乳动物细胞培养物中分离重组人神经生长因子的方法
US10995371B2 (en) 2016-10-13 2021-05-04 Apdn (B.V.I.) Inc. Composition and method of DNA marking elastomeric material
US10920274B2 (en) 2017-02-21 2021-02-16 Apdn (B.V.I.) Inc. Nucleic acid coated submicron particles for authentication
CN107973848B (zh) * 2017-12-28 2020-10-16 未名生物医药有限公司 一种从混合物中分离天然序列神经生长因子的方法
CN108467429A (zh) * 2018-03-26 2018-08-31 江苏中新医药有限公司 疏水层析动态清除重组人神经生长因子前体的方法
CN108467428A (zh) * 2018-03-26 2018-08-31 江苏中新医药有限公司 一种清除rhNGF中N端截短及异常变异体的方法
CN108239146A (zh) * 2018-03-26 2018-07-03 江苏中新医药有限公司 一种高纯度rhNGF的制备方法
WO2019207106A1 (en) * 2018-04-27 2019-10-31 Chiesi Farmaceutici Spa Production of nerve growth factor (ngf) and of muteins thereof
CN114252519B (zh) * 2020-09-23 2023-11-24 舒泰神（北京）生物制药股份有限公司 一种测定神经生长因子纯度的方法
CN114380901A (zh) * 2021-12-31 2022-04-22 华东理工大学 蛋白纳米粒子的制备方法、所得蛋白纳米粒子及其应用

Family Cites Families (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4407744A (en) * 1977-11-23 1983-10-04 Young David M Process for obtaining nerve growth factor
US4565785A (en) * 1978-06-08 1986-01-21 The President And Fellows Of Harvard College Recombinant DNA molecule
US4673641A (en) * 1982-12-16 1987-06-16 Molecular Genetics Research And Development Limited Partnership Co-aggregate purification of proteins
US5169762A (en) * 1983-03-03 1992-12-08 Genentech, Inc. Human nerve growth factor by recombinant technology
DK161152C (da) * 1983-03-03 1991-11-11 Genentech Inc Polypeptid med egenskaber som human beta-nervevaekstfaktor og fremgangsmaade til fremstilling deraf, dna-isolat omfattende en sekvens som koder for polypeptidet, replicerbar udtrykkelsesvektor for dna-sekvensen, rekombinant vaertscelle transformeret med vektoren, farmaceutisk praeparat indeholdende polypeptidet og fremg. der omfatter anvendelsen af polypeptidet til fremst. af et farmaceutisk praeparat
US4710473A (en) * 1983-08-10 1987-12-01 Amgen, Inc. DNA plasmids
US4738921A (en) * 1984-09-27 1988-04-19 Eli Lilly And Company Derivative of the tryptophan operon for expression of fused gene products
US4795706A (en) * 1985-01-31 1989-01-03 Eli Lilly And Company Novel expression control sequences
IT1219874B (it) * 1988-03-18 1990-05-24 Fidia Farmaceutici Utilizzazione del fattore di crescita nervoso umano e sue composizioni farmaceutiche
US5082774A (en) * 1988-08-30 1992-01-21 The General Hospital Corporation Recombinant human nerve growth factor
US5272063A (en) * 1988-11-22 1993-12-21 Syntex (U.S.A.) Inc. Process of making human nerve growth factor
CA2005600A1 (en) * 1988-12-20 1990-06-20 Cal-Henrik Heldin Endothelial cell growth factor
JPH04128300A (ja) * 1989-08-21 1992-04-28 Takeda Chem Ind Ltd ヒト神経成長因子蛋白質およびその製造法
EP0414151B1 (en) * 1989-08-21 1995-03-15 Takeda Chemical Industries, Ltd. Production of human nerve growth factor proteins
US5180820A (en) * 1989-08-30 1993-01-19 Barde Yves Alain Brain-derived neurotrophic factor
US5229500A (en) * 1989-08-30 1993-07-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Brain derived neurotrophic factor
US5606031A (en) * 1990-04-06 1997-02-25 Lile; Jack Production and purification of biologically active recombinant neurotrophic protein in bacteria
US5235043A (en) * 1990-04-06 1993-08-10 Synergen, Inc. Production of biologically active, recombinant members of the ngf/bdnf family of neurotrophic proteins
US5169764A (en) * 1990-08-08 1992-12-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Multitrophic and multifunctional chimeric neurotrophic factors, and nucleic acids and plasmids encoding the chimeras
US5364769A (en) * 1990-09-25 1994-11-15 Genentech, Inc. Nucleic acid encoding neurotrophic factor four (NT-4), vectors, host cells and methods of production
US5702906A (en) * 1990-09-25 1997-12-30 Genentech, Inc. Antibodies to neurotrophic factor-4 (NT-4)
JPH06501617A (ja) * 1990-09-25 1994-02-24 ジェネンテク，インコーポレイテッド 新規な神経栄養因子
DE69220259T2 (de) * 1991-02-18 1997-11-13 Takeda Chemical Industries Ltd Verfahren zur Herstellung von menschlichem NGF-2
PT100580A (pt) * 1991-06-12 1993-09-30 Regeneron Pharma Producao e recuperacao de neurotrofinas recombinantes
US5389529A (en) * 1991-06-12 1995-02-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Modified lamβ signal sequence and processes for producing recombinant neurotrophins
DE4133707A1 (de) * 1991-10-11 1993-04-15 Behringwerke Ag Verfahren zur reinigung von streptolysin o, intaktes streptolysin o erhaeltlich nach diesem verfahren und seine verwendung
JPH05211887A (ja) * 1992-01-31 1993-08-24 Hitachi Ltd 神経成長因子の生産方法
US5488099A (en) * 1992-03-06 1996-01-30 Persson, Deceased; Hakan B. Multifunctional chimeric neurotrophic factors
US5349055A (en) * 1992-03-06 1994-09-20 Persson Hakan B Nerve growth factor having altered receptor binding specificities
US5451660A (en) * 1993-12-13 1995-09-19 Genentech, Inc. Method for purifying polypeptides
US5728803A (en) * 1994-06-03 1998-03-17 Genentech, Inc. Pantropic neurotrophic factors
US5759775A (en) * 1994-10-27 1998-06-02 Genetech, Inc. Methods for detecting nucleic acids encoding AL--1 neurotrophic factor
US5733875A (en) * 1994-11-15 1998-03-31 Amgen Inc. Methods of using GDNF as a neuroprotective agent
US5650496A (en) * 1995-04-14 1997-07-22 Cephalon, Inc. IGF-I purification process
IL118201A (en) * 1995-05-11 2004-12-15 Roche Diagnostics Gmbh Preparation comprising a protein with human erythropoietin activity which is free of serum and non-recombinant mammalian protein and process for the preparation thereof
US5739307A (en) * 1995-08-28 1998-04-14 Washington University Polynucleotide encoding neurturin neurotrophic factor
HU222666B1 (hu) * 1996-11-15 2003-09-29 Genentech, Inc. Eljárás neuorotrofinok tisztítására

Also Published As

Publication number Publication date
IL129851A0 (en) 2000-02-29
HU222666B1 (hu) 2003-09-29
BR9713055A (pt) 2000-04-04
HUP9903947A3 (en) 2001-03-28
IL129851A (en) 2006-12-10
CA2268747A1 (en) 1998-05-22
JP2007302679A (ja) 2007-11-22
JP4671372B2 (ja) 2011-04-13
EP0942930B1 (en) 2007-08-29
KR20000053297A (ko) 2000-08-25
PL333460A1 (en) 1999-12-20
NO992353D0 (no) 1999-05-14
DE69738074T2 (de) 2008-05-21
US6953844B2 (en) 2005-10-11
ES2293662T3 (es) 2008-03-16
ATE371670T1 (de) 2007-09-15
AU5444898A (en) 1998-06-03
US20020137893A1 (en) 2002-09-26
EP0942930A2 (en) 1999-09-22
JP4881234B2 (ja) 2012-02-22
NO327149B1 (no) 2009-05-04
EA002349B1 (ru) 2002-04-25
NZ335207A (en) 2000-09-29
ID26697A (id) 2001-02-01
EA199900436A1 (ru) 2000-02-28
US6005081A (en) 1999-12-21
WO1998021234A2 (en) 1998-05-22
US6812330B2 (en) 2004-11-02
HUP9903947A2 (hu) 2000-03-28
CN1237184A (zh) 1999-12-01
CN1268639C (zh) 2006-08-09
JP2009040786A (ja) 2009-02-26
KR100554332B1 (ko) 2006-02-24
WO1998021234A3 (en) 1998-07-23
AU729459B2 (en) 2001-02-01
US6423831B1 (en) 2002-07-23
NO992353L (no) 1999-07-09
CZ166699A3 (cs) 1999-10-13
TR199901734T2 (xx) 2000-01-21
US6184360B1 (en) 2001-02-06
CZ300296B6 (cs) 2009-04-15
DE69738074D1 (de) 2007-10-11
US20040138431A1 (en) 2004-07-15
JP2001503779A (ja) 2001-03-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL191400B1 (pl) Sposób izolowania neurotrofiny z mieszaniny białek i kompozycja neurotrofiny
WO1998021234A9 (en) Purification of neurotrophins
JP2007302679A6 (ja) ニューロトロフィンの精製
KR101520105B1 (ko) 재조합 단백질의 리폴딩
KR101837802B1 (ko) 신규 prongf 돌연변이체 및 베타-ngf의 제조에서의 이의 용도
US5446024A (en) Purification of insulin-like growth factor
JP2008505895A (ja) シスチンノットスーパーファミリーのタンパク質を精製する方法
US6265542B1 (en) Purification of molecules
CA2306447C (en) Purification of molecules
MXPA99004339A (en) Purification of neurotrophins

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20121114