JP5699429B2 - Fcレセプターの精製方法 - Google Patents
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(1)ヒトFcレセプターFcγRIをコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドにより形質転換された宿主の培養液から疎水クロマトグラフィー用担体を用いてヒトFcレセプターFcγRIを精製する方法であって、前記担体に吸着したヒトFcレセプターFcγRIを溶出させる際に10%(w/v)以上のグリセロールを含む緩衝液で溶出させる、ヒトFcレセプターFcγRIの精製方法。
(1)ヒトFcレセプターFcγRIをコードするDNA配列を含む発現プラスミドにより形質転換された大腸菌を2YT培地(Tryptone 16g/L、酵母エキス 10g/L、塩化ナトリウム 5g/L)に植菌し、30℃でOD(Abs:660nm)=3になるまで培養した。
(2)15℃に冷却後、IPTG(イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド)を0.05mMになるように添加し、さらに一晩培養した。
(3)培養液より菌体を回収後、抽出液(0.6% Triton X−100、0.02% デオキシコール酸ナトリウム、1mM EDTA、0.1mM PMSF、0.3mg/mL リゾチーム、0.001% Benzonaseを含む20mM Tris−HCl緩衝液(pH 8.0))に菌体を懸濁し、撹拌することで菌体内からタンパク質を抽出後、遠心分離により無細胞抽出液(アプライ液)を調製した。
(4)1mLのTOYOPEARL Phenyl−650C(東ソー株式会社製)ゲルをオープンカラムに充填し、5mLの緩衝液A(6%硫酸アンモニウムを含む20mM Tris−HCl緩衝液(pH 8.0))にてゲルを平衡化した。
(5)(3)で調製したヒトFcγRIを含む無細胞抽出液(アプライ液)10mLを導入し、10mLの緩衝液Aにより洗浄後、5mLの10%(w/v)グリセロールを含む20mM Tris−HCl緩衝液(pH 8.0)によりヒトFcγRIを溶出させた。
実施例1の(5)におけるヒトFcγRIの溶出を、5mLの20mM Tris−HCl緩衝液(pH 8.0)で行なったほかは、実施例1と同様の実験を行なった。結果、20mM Tris−HCl緩衝液(pH 8.0)で溶出したときのヒトFcγRIの回収率は30%であり、比活性は1.50であった。
実施例1の(5)におけるヒトFcγRIの溶出を、5mLの5%(w/v)グリセロールを含む20mM Tris−HCl緩衝液(pH 8.0)で行なったほかは、実施例1と同様の実験を行なった。結果、5%(w/v)グリセロールを含む20mM Tris−HCl緩衝液(pH 8.0)で溶出したときのヒトFcγRIの回収率は46%であり、比活性は4.57であった。
実施例1の(5)におけるヒトFcγRIの溶出を、5mLの10%(v/v)エタノールを含む20mM Tris−HCl緩衝液(pH 8.0)で行なったほかは、実施例1と同様の実験を行なった。結果、10%(v/v)エタノールを含む20mM Tris−HCl緩衝液(pH 8.0)で溶出したときのヒトFcγRIの回収率は45%であり、比活性は1.71であった。
実施例1の(5)におけるヒトFcγRIの溶出を、5mLの0.5M塩酸グアニジンを含む20mM Tris−HCl緩衝液(pH 8.0)で行なったほかは、実施例1と同様の実験を行なった。結果、0.5M塩酸グアニジンを含む20mM Tris−HCl緩衝液(pH 8.0)で溶出したときのヒトFcγRIの回収率は63%であり、比活性は4.69であった。
(1)実施例1の(1)から(2)の操作により得られた培養液から菌体を回収(菌体収量:1400g)した。
(2)(1)で得られた菌体を、以下の示す方法で2回に分けてヒトFcγRIを精製した(1回の処理量700g)。
(2−1)700gの菌体ペレットに5倍量となるよう抽出液(0.6% TritonX−100、0.02% デオキシコール酸ナトリウム、1mM EDTA、0.1mM PMSF、0.3mg/mL リゾチーム、0.001% Benzonaseを含む20mM Tris−HCl緩衝液(pH 8.0))を加え、室温で30分撹拌し、菌体内タンパク質を抽出した。
(2−2)遠心分離(7500rpm、30分、4℃)により菌体破砕物を除去後、上清を回収して無細胞抽出液を3500mL得た。
(2−3)無細胞抽出液に210gの硫酸アンモニウム(終濃度6%)を撹拌しながら徐々に加え、1時間撹拌を継続した。
(2−4)遠心分離(7500rpm、30分、4℃)により上清を回収後、次工程の疎水性クロマトグラフィーに供するために、pHを8.0へ調整後、全量を7000mLとなるよう希釈し、これをアプライ液とした。
(2−5)緩衝液Aで平衡化した500mLのTOYOPEARL Phenyl−650C(東ソー株式会社製)ゲルをオープンカラムに充填後、(2−4)のアプライ液を導入し、ヒトFcγRIを含むタンパク質をゲルに吸着させた。
(2−6)2000mLの緩衝液Aにてゲルを洗浄後、10%(w/v)グリセロールを含む20mM Tris−HCl緩衝液(pH 8.0)にて100mLずつの画分に溶出させた。
Claims (3)
- ヒトFcレセプターFcγRIをコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドにより形質転換された宿主の培養液から、疎水クロマトグラフィー用担体を用いてヒトFcレセプターFcγRIを精製する方法であって、
前記担体に吸着したヒトFcレセプターFcγRIを溶出させる際に、10%(w/v)グリセロールを含む緩衝液で溶出させる、ヒトFcレセプターFcγRIの精製方法。 - 宿主が大腸菌である、請求項1に記載の精製方法。
- 疎水クロマトグラフィー用担体がフェニル基を導入した担体である、請求項1または2に記載の精製方法。
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