JP6015147B2

JP6015147B2 - 組換えタンパク質の抽出試薬

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Publication number: JP6015147B2
Application number: JP2012129732A
Authority: JP
Inventors: 陽介寺尾; 半澤　敏; 敏半澤; 直紀山中
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Priority date: 2012-06-07
Filing date: 2012-06-07
Publication date: 2016-10-26
Anticipated expiration: 2032-06-07
Also published as: JP2013252099A

Description

本発明は、組換えタンパク質を発現可能な形質転換体から、前記タンパク質を効率的に抽出可能な試薬、および前記試薬を用いた前記タンパク質の製造方法に関する。

タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いて大腸菌を形質転換して得られる形質転換体を培養し、当該培養した形質転換体内から前記タンパク質を抽出する方法として、従来より超音波破砕処理やフレンチプレス処理等の物理的破砕による方法や、市販の抽出試薬を用いた化学的処理による方法が知られている。しかしながら、これらの方法を用いて、前記タンパク質を工業的に抽出しようとすると、物理的破砕による方法では超音波破砕装置やフレンチプレス等の破砕装置の設置に莫大な費用がかかる問題があり、化学的処理による方法では高価な抽出試薬を大量に用いる問題があった。

前記タンパク質を抽出する方法としては、前述した方法以外にも、非イオン界面活性剤と陰イオン界面活性剤を含んだ試薬で抽出する方法（特許文献１）や、陽イオン界面活性剤を含む試薬で抽出する方法（特許文献２）等が知られている。しかしながら、前記タンパク質がヒトＦｃ受容体等のヒト由来のタンパク質である場合、効率的な抽出ができないという問題があった。

特開２０１１−０５１９４３号公報特開２００６−３２０３１３号公報

本発明の目的は、タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いて大腸菌を形質転換して得られる形質転換体を培養し、当該培養した形質転換体内から前記タンパク質を抽出する際に、前記タンパク質を効率的に抽出可能な試薬、および前記試薬を用いた前記タンパク質の製造方法を提供することにある。

本発明者らは、前記課題を解決するため鋭意検討した結果、抽出試薬に添加する界面活性剤を最適化することで、前記タンパク質の形質転換体内からの抽出を効率的に行なえることを見出し、本発明を完成させた。また前記抽出試薬を用いた抽出操作時のｐＨについても鋭意検討した結果、最適なｐＨ範囲を見出した。

すなわち本発明は以下の発明を包含する：
（１）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いて大腸菌を形質転換して得られる形質転換体を培養し、当該培養した形質転換体内から前記タンパク質を抽出するのに用いる抽出試薬であって、少なくとも非イオン界面活性剤と陽イオン界面活性剤を含む前記試薬。

（２）非イオン界面活性剤が終濃度１．５％（ｗ／ｖ）以上のＴｒｉｔｏｎＸ−１００（商品名）であり、陽イオン界面活性剤が終濃度０．１％（ｗ／ｖ）から０．７％（ｗ／ｖ）の臭化セチルトリメチルアンモニウムである、（１）に記載の試薬。

（３）さらに陰イオン界面活性剤を含む、（１）または（２）に記載の試薬。

（４）さらに核酸分解酵素を含む、（１）から（３）のいずれかに記載の試薬。

（５）タンパク質がヒトＦｃ結合性タンパク質である、（１）から（４）のいずれかに記載の試薬。

（６）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いて大腸菌を形質転換して得られる形質転換体を培養する工程と、培養した前記形質転換体に、少なくとも非イオン界面活性剤と陽イオン界面活性剤を含む抽出試薬を用いて、前記形質転換体内から前記タンパク質を抽出させる工程とを含む、前記タンパク質の製造方法。

（７）前記抽出させる工程をｐＨ７．０から１０．０の条件下で実施する、（６）に記載の製造方法。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明の抽出試薬は、タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いて大腸菌を形質転換して得られた形質転換体の細胞壁を溶かすことで、当該形質転換体内に発現した前記タンパク質を機械的な破砕処理をせずに抽出可能な試薬であり、少なくとも非イオン界面活性剤と陽イオン界面活性剤を含むことを特徴としている。

本発明の抽出試薬に含まれる非イオン界面活性剤は、膜タンパク質可溶化剤として通常用いられる中から適宜選択することができ、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（商品名）、ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４（商品名）、Ｂｒｉｊ５８（商品名）、Ｂｒｉｊ３５（商品名）、Ｔｗｅｅｎ２０（商品名）、Ｔｗｅｅｎ８０（商品名）、１−Ｏ−ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−ドデシル−α−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ-ジメチルアミン−Ｎ−オキシド、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド、スクロースモノドデカン酸、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−トリデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド等があげられる。

本発明の抽出試薬に含まれる陽イオン界面活性剤も、膜タンパク質可溶化剤として通常用いられる中から適宜選択することができ、アルキルトリメチルアンモニウム塩（例えば塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化ラウリルトリメチルアンモニウム、臭化ラウリルトリメチルアンモニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム）、ジアルキルジメチルアンモニウム塩（例えば塩化ジステアリルジメチルアンモニウム塩）、アルキルピリジウム塩（例えば塩化セチルピリジウム）、アルキルジメチルベンジルアンモニウム塩、塩化ベンゼトニウム、塩化ベンザルコニウム等があげられる。

なお本発明の抽出試薬に陰イオン界面活性剤をさらに含むと、形質転換体（大腸菌）の溶菌が促進されるため好ましい。本発明の抽出試薬に含んでもよい、陰イオン界面活性剤としては、膜タンパク質可溶化剤として通常用いられる中から適宜選択することができ、コール酸、デオキシコール酸、およびそれらの塩等があげられる。

本発明の抽出試薬に含まれる各界面活性剤の濃度については、培養液中の夾雑物、使用する界面活性剤の臨界ミセル濃度などを考慮し、適宜設定すればよい。一例として、非イオン界面活性剤としてＴｒｉｔｏｎＸ−１００（商品名）を、陽イオン界面活性剤として臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＭＢ）を、陰イオン界面活性剤としてデオキシコール酸ナトリウムを、それぞれ用いる場合は、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（商品名）は終濃度１．５％（ｗ／ｖ）以上に、ＣＴＭＢは終濃度０．１％（ｗ／ｖ）から０．７％（ｗ／ｖ）の範囲に、デオキシコール酸ナトリウムは終濃度０．２％（ｗ／ｖ）前後に、それぞれ設定するとよい。

本発明の抽出試薬には、前述した界面活性剤以外の成分を含んでもよく、特にＢｅｎｚｏｎａｓｅ（メルク社製）等のエンドヌクレアーゼ（核酸分解酵素）をさらに含むと、形質転換体内から、前述した界面活性剤によりタンパク質とともに抽出される、核酸による粘度上昇が抑制できるため好ましい。なお、本発明の抽出試薬に核酸分解酵素をさらに含ませる場合、助剤として２ｍＭ程度の硫酸マグネシウムを含むとよい。

核酸分解酵素以外で、本発明の抽出試薬にさらに含んでもよい成分としては、緩衝液成分、塩類があげられる。緩衝液成分としては、濃度１０ｍＭから１００ｍＭ程度の酢酸緩衝液、クエン酸−リン酸緩衝液、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、グリシン−ＮａＯＨ水溶液、ＭＥＳ緩衝液、ＡＤＡ緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液、ＡＣＥＳ緩衝液、コラミン−ＨＣｌ緩衝液、ＢＥＳ緩衝液、ＴＥＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、アセトアミドグリシン緩衝液、Ｔｒｉｃｉｎｅ緩衝液、グリシンアミド緩衝液、Ｂｉｃｉｎｅ緩衝液等があげられる。一例として抽出するタンパク質がヒトＦｃ結合性タンパク質の場合、濃度２０ｍＭから５０ｍＭ、ｐＨ６．０から８．０のリン酸緩衝液またはＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液が好ましく、濃度５０ｍＭ、ｐＨ８．０のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液がもっとも好ましい。塩類としては、終濃度１０ｍＭから１０００ｍＭの硫酸塩、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、炭酸塩、塩化物等があげられる。一例として抽出するタンパク質がヒトＦｃ結合性タンパク質の場合、終濃度５０ｍＭから８００ｍＭの塩化ナトリウムおよび終濃度５０ｍＭから８００ｍＭの塩化カルシウムが好ましく、終濃度６５０ｍＭの塩化ナトリウムおよび終濃度５０ｍＭの塩化カルシウムがもっとも好ましい。

タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いて大腸菌を形質転換して得られた形質転換体から、本発明の抽出試薬を用いて前記形質転換体内から前記タンパク質を抽出する際、タンパク質が失活しない程度のアルカリ性（具体的には、ｐＨ７．０から１０．０）条件下で抽出操作を行なうと、タンパク質抽出の効率が向上するため好ましい。一例として抽出するタンパク質がヒトＦｃ結合性タンパク質の場合、ｐＨ７．５からｐＨ９．５の条件下で抽出操作を行なうと、より効率的にヒトＦｃ結合性タンパク質を抽出することができる。

本発明の抽出試薬を用いて形質転換体内のタンパク質を抽出した後は、当該技術分野において公知の方法を用いて前記タンパク質を精製することで、前記タンパク質を製造すればよい。前記タンパク質の精製方法の一例として、液体クロマトグラフィーを用いた分離・精製があげられる。液体クロマトグラフィーとしては、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどがあげられる。これらのクロマトグラフィーを組み合わせて精製操作を行なうことによって、前記タンパク質を高純度に調製することができる。

本発明の製造方法で得られたタンパク質の分析方法は、培養液、抽出液等から安定的にかつ効率的に定量できる方法であれば特に限定はなく、ＥＬＩＳＡ法（酵素結合免疫吸着法）やウェスタンブロット法があげられる。

本発明の抽出試薬を用いて抽出するタンパク質は、タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いて大腸菌を形質転換して得られた形質転換体の菌体内に発現するタンパク質であれば特に限定されない。ここでは前記タンパク質の一例である、ヒトＦｃ結合性タンパク質について詳細に説明する。

本明細書においてヒトＦｃ結合性タンパク質は、ヒトＦｃγＲＩの細胞外領域（具体的には天然型ヒトＦｃγＲＩの場合、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１６番目から２９２番目までの領域）を構成するタンパク質のことをいう。ただし必ずしもヒトＦｃγＲＩ細胞外領域の全領域でなくてもよく、ヒトＦｃγＲＩ細胞外領域を構成するポリペプチドのうち、少なくとも抗体（ＩｇＧ）のＦｃ領域に結合する本来の機能を発現し得る領域のポリペプチドを含んでいればよい。当該ヒトＦｃ結合性タンパク質の一例として、
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含むタンパク質や、
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含み、かつ前記アミノ酸のうちの一つ以上が他のアミノ酸に置換、挿入または欠失したタンパク質、
があげられる。前記（ｉｉ）の具体例としては、特開２０１１−２０６０４６号公報に開示のＦｃ結合性タンパク質があげられる。

本発明の抽出試薬は、少なくとも非イオン界面活性剤と陽イオン界面活性剤を含むことを特徴としており、タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いて大腸菌を形質転換して得られる形質転換体内に発現した前記タンパク質を効率的に抽出することができる。本発明の抽出試薬を用いたタンパク質の抽出方法は、物理的破砕による方法や市販の抽出試薬を用いた方法と比較し、安価かつ効率的に前記タンパク質を抽出可能であることから、組換えタンパク質の工業的な製造において有用といえる。

本発明の抽出試薬（実施例１）、市販の抽出試薬（比較例１）および超音波破砕（比較例２）による、ヒトＦｃ結合性タンパク質を発現可能な形質転換体からの前記タンパク質の抽出効率を比較した結果を示す図である。抽出試薬に含まれる界面活性剤の違いによる、ヒトＦｃ結合性タンパク質を発現可能な形質転換体からの前記タンパク質の抽出効率を比較した結果を示す図である。抽出試薬に含まれる臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）濃度の違いによる、ヒトＦｃ結合性タンパク質を発現可能な形質転換体からの前記タンパク質の抽出効率を比較した結果を示す図である。抽出試薬に含まれるＴｒｉｔｏｎＸ−１００（商品名）濃度の違いによる、ヒトＦｃ結合性タンパク質を発現可能な形質転換体からの前記タンパク質の抽出効率を比較した結果を示す図である。本発明の抽出試薬を用いて抽出操作を行なう際のｐＨの違いによる、ヒトＦｃ結合性タンパク質を発現可能な形質転換体からの前記タンパク質の抽出効率を比較した結果を示す図である。抽出試薬に含まれるデオキシコール酸ナトリウムの有無の違いによる、ヒトＦｃ結合性タンパク質を発現可能な形質転換体からの前記タンパク質の抽出効率を比較した結果を示す図である。

以下、実施例および比較例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は当該例に限定されるものではない。

実施例１
（１）特開２０１１−１２６８２７号公報に記載の方法により、Ｆｃ結合性タンパク質を生産可能な組換え大腸菌を培養し、得られた培養液から遠心分離により大腸菌菌体（湿潤菌体）を得た。
（２）（１）で得られた湿潤菌体を１ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁させ、均一になるまで室温（２０℃から２５℃）にて撹拌後、ＮａＣｌを終濃度０．６５Ｍとなるよう添加し、さらに室温で撹拌した。
（３）希ＮａＯＨ水溶液を用いてｐＨ９．０となるよう調製し、菌体からの効率的なタンパク質抽出を促した。なお菌体内容物の漏出によりｐＨが酸性側へ移動するため、都度、希ＮａＯＨ水溶液を添加することで前記ｐＨを維持した。
（４）臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）水溶液を終濃度０．５（ｗ／ｖ）％となるよう添加し、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（商品名）水溶液を終濃度２（ｖ／ｖ）％となるよう添加し、デオキシコール酸ナトリウム水溶液を終濃度０．２（ｗ／ｖ）％となるよう添加後、室温で撹拌することで、Ｆｃ結合性タンパク質を抽出した。
（５）核酸分解酵素（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ、メルク社製）を終濃度２５０ｕｎｉｔ／Ｌとなるよう添加し、助剤として硫酸マグネシウムを終濃度２ｍＭとなるよう添加し、塩化カルシウム水溶液を終濃度５０ｍＭとなるよう添加後、４℃で撹拌することで、（４）で添加した界面活性剤により菌体内から抽出される核酸による粘度上昇を抑制した。
（６）（５）の抽出液を遠心分離操作し、上清（無細胞抽出液）を得た。
（７）（６）で得られた無細胞抽出液中のＦｃ結合性タンパク質の抽出量を以下に示したＥＬＩＳＡ法にて、Ｆｃ結合性タンパク質以外の夾雑タンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ法にて、それぞれ測定した。
（７−１）ヒト抗体であるガンマグロブリン製剤（化学及血清療法研究所製）を、９６穴マイクロプレートのウェルに１μｇ／ｗｅｌｌの濃度で固定した（４℃で１８時間）。
（７−２）固定化終了後、洗浄緩衝液（０．０５％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０（商品名）と１５０ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０））で洗浄し、０．５％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）によりブロッキングした。
（７−３）洗浄緩衝液にて洗浄後、調製したタンパク質抽出液を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で適宜希釈し、固定化ガンマグロブリンと反応させた（３０℃で１時間）。
（７−４）反応終了後、洗浄緩衝液で再度洗浄し、Ａｎｔｉ−ｈＦｃγＲ１／ＣＤ６４抗体試薬（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）を添加した（３０℃で１時間）。
（７−５）反応終了後、洗浄緩衝液で再度洗浄し、ＨｏｒｓｅｒａｄｉｓｈＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）標識のＧｏａｔａｎｔｉ−ＭｏｕｓｅＩｇＧ−ｈ＋ＩＨＲＰ抗体試薬（ＢＥＴＨＹＬ社製）を添加した。
（７−６）３０℃で１時間反応後、洗浄緩衝液で洗浄し、ＴＭＢＰｅｒｏｘｉｄａｓｅＳｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を添加し４５０ｎｍの吸光度を測定した。

結果、無細胞抽出液中の夾雑タンパク質の濃度は１８ｍｇ／ｍＬであり、Ｆｃ結合性タンパク質の抽出量は湿潤菌体１ｇあたり１．３ｍｇであった。

比較例１
（１）特開２０１１−１２６８２７号公報に記載の方法により、Ｆｃ結合性タンパク質を生産可能な組換え大腸菌を培養し、得られた培養液から遠心分離により大腸菌菌体（湿潤菌体）を得た。
（２）（１）で得られた湿潤菌体を、実施例１と同じ菌体濃度となるよう１ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁させた。
（３）市販の抽出試薬（ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ、メルク社製）を用いて、試薬に添付の標準プロトコールに従いＦｃ結合性タンパク質を抽出した。
（４）（３）の抽出液を遠心分離操作し、上清（無細胞抽出液）を得た。
（５）実施例１（７）に記載の方法により、Ｆｃ結合性タンパク質の抽出効率、および夾雑タンパク質濃度を測定した。

結果、無細胞抽出液中の夾雑タンパク質の濃度は２２ｍｇ／ｍＬであり、Ｆｃ結合性タンパク質の抽出量は湿潤菌体１ｇあたり１．０ｍｇであった。

比較例２
（１）特開２０１１−１２６８２７号公報に記載の方法により、Ｆｃ結合性タンパク質を生産可能な組換え大腸菌を培養し、得られた培養液から遠心分離により大腸菌菌体（湿潤菌体）を得た。
（２）（１）で得られた湿潤菌体を、実施例１と同じ菌体濃度となるよう１ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁させた。
（３）超音波破砕機（ＩＮＳＯＮＡＴＯＲ２０１Ｍ（久保田製作所社製）、１３０Ｗ×１０分）を用いて機械的破砕することで、Ｆｃ結合性タンパク質の抽出を行なった。
（４）（３）の抽出液を遠心分離操作し、上清（無細胞抽出液）を得た。
（５）実施例１（７）に記載の方法により、Ｆｃ結合性タンパク質の抽出効率、および夾雑タンパク質濃度を測定した。

結果、無細胞抽出液中の夾雑タンパク質の濃度は２６ｍｇ／ｍＬであり、Ｆｃ結合性タンパク質の抽出量は湿潤菌体１ｇあたり１．１ｍｇであった。

実施例１、比較例１および比較例２の結果をまとめたものを図１に示す。少なくとも非イオン界面活性剤と陽イオン界面活性剤を含んだ抽出試薬を用いて大腸菌を抽出（実施例１）することで、市販の抽出試薬を用いた方法（比較例１）や機械的破砕法（比較例２）と比較し、無細胞抽出液画分への夾雑タンパク質の溶出を抑えつつ、組換えタンパク質であるＦｃ結合性タンパク質を効率的に抽出できることがわかる。

比較例３
実施例１（４）で添加する界面活性剤を、Ｂｒｉｊ３５（商品名）およびデオキシコール酸ナトリウムとした他は、実施例１と同様な操作を行なった。結果、無細胞抽出液中の夾雑タンパク質の濃度は１１ｍｇ／ｍＬであり、Ｆｃ結合性タンパク質の抽出量は湿潤菌体１ｇあたり０．４ｍｇであった。

比較例４
実施例１（４）で添加する界面活性剤を、Ｔｗｅｅｎ２０（商品名）およびデオキシコール酸ナトリウムとした他は、実施例１と同様な操作を行なった。結果、無細胞抽出液中の夾雑タンパク質の濃度は９ｍｇ／ｍＬであり、Ｆｃ結合性タンパク質の抽出量は湿潤菌体１ｇあたり０．１ｍｇであった。

比較例５
実施例１（４）で添加する界面活性剤を、ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホナート）およびデオキシコール酸ナトリウムとした他は、実施例１と同様な操作を行なった。結果、無細胞抽出液中の夾雑タンパク質の濃度は１２ｍｇ／ｍＬであり、Ｆｃ結合性タンパク質の抽出量は湿潤菌体１ｇあたり０．８ｍｇであった。

比較例６
実施例１（４）で添加する界面活性剤を、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（商品名）およびデオキシコール酸ナトリウムとした他は、実施例１と同様な操作を行なった。結果、無細胞抽出液中の夾雑タンパク質の濃度は１１ｍｇ／ｍＬであり、Ｆｃ結合性タンパク質の抽出量は湿潤菌体１ｇあたり０．２ｍｇであった。

実施例１および比較例３から６の結果をまとめたものを図２に示す。非イオン界面活性剤と陽イオン界面活性剤と陰イオン界面活性剤を含んだ抽出試薬を用いて大腸菌を抽出（実施例１）することで、界面活性剤として非イオン界面活性剤と陰イオン界面活性剤のみを含んだ抽出試薬（比較例３および４）や、界面活性剤として両性イオン界面活性剤と陰イオン界面活性剤のみを含んだ抽出試薬（比較例５および６）と比較し、組換えタンパク質であるＦｃ結合性タンパク質を効率的に抽出できることがわかる。

実施例２
実施例１（４）で添加するＣＴＡＢの終濃度を０．１％（ｗ／ｖ）とした他は、実施例１と同様な操作を行なった。結果、無細胞抽出液中の夾雑タンパク質の濃度は５ｍｇ／ｍＬであり、Ｆｃ結合性タンパク質の抽出量は湿潤菌体１ｇあたり０．７ｍｇであった。

比較例７
実施例１（４）で添加するＣＴＡＢの終濃度を１％（ｗ／ｖ）とした他は、実施例１と同様な操作を行なった。結果、無細胞抽出液中の夾雑タンパク質の濃度は２９ｍｇ／ｍＬであり、Ｆｃ結合性タンパク質の抽出量は湿潤菌体１ｇあたり０．９ｍｇであった。

実施例１、実施例２および比較例７の結果をまとめたものを図３に示す。ＣＴＡＢの終濃度を０．１％（ｗ／ｖ）（実施例２）とすると、ＣＴＡＢの終濃度を０．５％（ｗ／ｖ）としたとき（実施例１）と比較し、無細胞抽出液画分への夾雑タンパク質の溶出を３分の１以下に抑えることができるものの、組換えタンパク質であるＦｃ結合性タンパク質の抽出量も約２分の１に低下していることがわかる。一方、ＣＴＡＢの終濃度を１％（ｗ／ｖ）（比較例７）とすると、無細胞抽出液画分への夾雑タンパク質の溶出が増大し、かつ組換えタンパク質であるＦｃ結合性タンパク質の抽出量も低下しているため、好ましくないことがわかる。そのため、本発明の抽出試薬に含まれる陽イオン界面活性剤として、ＣＴＡＢを用いる場合、その濃度は０．１％（ｗ／ｖ）から０．７％（ｗ／ｖ）の範囲が好ましいといえる。

比較例８
実施例１（４）で添加するＴｒｉｔｏｎＸ−１００（商品名）の終濃度を１％（ｗ／ｖ）とした他は、実施例１と同様な操作を行なった。結果、無細胞抽出液中の夾雑タンパク質の濃度は１４ｍｇ／ｍＬであり、Ｆｃ結合性タンパク質の抽出量は湿潤菌体１ｇあたり０．４ｍｇであった。

比較例９
実施例１（４）で添加するＴｒｉｔｏｎＸ−１００（商品名）の終濃度を０．２％（ｗ／ｖ）とした他は、実施例１と同様な操作を行なった。結果、無細胞抽出液中の夾雑タンパク質の濃度は１１ｍｇ／ｍＬであり、Ｆｃ結合性タンパク質の抽出量は湿潤菌体１ｇあたり０．３ｍｇであった。

実施例１、比較例８および比較例９の結果をまとめたものを図４に示す。ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（商品名）の終濃度を１％（ｗ／ｖ）（比較例８）または０．２％（ｗ／ｖ）（比較例９）とすると、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（商品名）の終濃度を２％（ｗ／ｖ）としたとき（実施例１）と比較し、無細胞抽出液画分への夾雑タンパク質の溶出は８割（比較例８）または６割（比較例９）程度に抑えられるものの、組換えタンパク質であるＦｃ結合性タンパク質の抽出量は約３分の１（比較例８）または約４分の１（比較例９）とそれ以上に低下していた。そのため、本発明の抽出試薬に含まれる非イオン界面活性剤として、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（商品名）を用いる場合、その濃度は１．５％（ｗ／ｖ）以上が好ましいといえる。

実施例３
抽出操作時のｐＨを８．０にした他は、実施例１と同様な操作を行なった。結果、無細胞抽出液中の夾雑タンパク質の濃度は１０ｍｇ／ｍＬであり、Ｆｃ結合性タンパク質の抽出量は湿潤菌体１ｇあたり１．２ｍｇであった。

実施例４
抽出操作時のｐＨを１０．０にした他は、実施例１と同様な操作を行なった。結果、無細胞抽出液中の夾雑タンパク質の濃度は７ｍｇ／ｍＬであり、Ｆｃ結合性タンパク質の抽出量は湿潤菌体１ｇあたり１．０ｍｇであった。

比較例１０
抽出操作時のｐＨを１１．０にした他は、実施例１と同様な操作を行なった。結果、無細胞抽出液中の夾雑タンパク質の濃度は４ｍｇ／ｍＬであり、Ｆｃ結合性タンパク質の抽出量は湿潤菌体１ｇあたり０．３ｍｇであった。

実施例１、実施例３、実施例４および比較例１０の結果をまとめたものを図５に示す。組換えタンパク質であるＦｃ結合性タンパク質の抽出量は、抽出操作時のｐＨが８．０（実施例３）のときとｐＨ９．０（実施例１）のときとで、ほぼ同等であった。一方、抽出操作時のｐＨを１１．０（比較例１０）とするとＦｃ結合性タンパク質の抽出量が大きく減少した。このことから、抽出操作時のｐＨは７．０から１０．０の範囲が好ましく、ｐＨを７．５から９．５の範囲とするとより好ましいといえる。

実施例５
実施例１（４）で添加する界面活性剤のうち、デオキシコール酸ナトリウムを添加しない他は、実施例１と同様な操作を行なった。結果、無細胞抽出液中の夾雑タンパク質の濃度は２１ｍｇ／ｍＬであり、Ｆｃ結合性タンパク質の抽出量は湿潤菌体１ｇあたり１．１ｍｇであった。

実施例１、実施例５、比較例１、比較例２の結果をまとめたものを図６に示す。陰イオン界面活性剤を含まない抽出試薬（実施例５）を用いた場合、陰イオン界面活性剤を含む抽出試薬（実施例１）を用いた場合と比較して、組換えタンパク質であるＦｃ結合性タンパク質の抽出量は減少し、夾雑タンパク質の溶出量は増大した。しかしながら夾雑タンパク質の溶出量に対するＦｃ結合性タンパク質の抽出量で比較すると、市販の抽出試薬（比較例１）や機械的破砕法（比較例２）と比較し、優れていた。したがって、少なくとも非イオン界面活性剤と陽イオン界面活性剤を含む試薬であれば、タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いて大腸菌を形質転換して得られる形質転換体から、前記タンパク質を効率的に抽出できることがわかる。

Claims

タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いて大腸菌を形質転換して得られる形質転換体を培養し、当該培養した形質転換体内から前記タンパク質を抽出するのに用いる抽出試薬であって、少なくとも非イオン界面活性剤と陽イオン界面活性剤を含み、前記タンパク質がヒトＦｃ結合性タンパク質であり、前記非イオン界面活性剤が終濃度２％（ｗ／ｖ）以上のＴｒｉｔｏｎＸ−１００（商品名）であり、前記陽イオン界面活性剤が終濃度０．１％（ｗ／ｖ）から０．５％（ｗ／ｖ）の臭化セチルトリメチルアンモニウムであり、かつｐＨが８．０〜１０．０の条件で使用される、前記試薬。
さらに陰イオン界面活性剤を含む、請求項１に記載の試薬。
さらに核酸分解酵素を含む、請求項１または２に記載の試薬。
タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いて大腸菌を形質転換して得られる形質転換体を培養する工程と、培養した前記形質転換体に、少なくとも非イオン界面活性剤と陽イオン界面活性剤とを含む抽出試薬を用いて、前記形質転換体内から前記タンパク質を抽出させる工程とを含み、前記タンパク質がヒトＦｃ結合性タンパク質であり、前記非イオン界面活性剤が終濃度２％（ｗ／ｖ）以上のＴｒｉｔｏｎＸ−１００（商品名）であり、前記陽イオン界面活性剤が終濃度０．１％（ｗ／ｖ）から０．５％（ｗ／ｖ）の臭化セチルトリメチルアンモニウムであり、かつｐＨが８．０〜１０．０の条件で前記抽出試薬を使用する、前記タンパク質の製造方法。