CN102952788A - 一种大菱鲆c型溶菌酶及其构建和应用 - Google Patents

一种大菱鲆c型溶菌酶及其构建和应用 Download PDF

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孙黎
于兰萍
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Abstract

本发明涉及分子微生物学领域，具体的说是一种大菱鲆C型溶菌酶及其构建和应用。溶菌酶为序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列所示。具体为：以大菱鲆cDNA为模板PCR扩增溶菌酶基因，将PCR产物与载体pEASY-E2连接，将连接液转化大肠杆菌BL21(DE3)，得转化子BL21/pSmLysC，经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导后，利用亲和层析柱纯化重组蛋白，即得C型溶菌酶。本发明的溶菌酶可以有效裂解多种革兰氏阳性菌，因而可以用于防控革兰氏阳性菌相关疾病。

Description

一种大菱鲆C型溶菌酶及其构建和应用
技术领域
本发明涉及分子微生物学领域，具体的说是一种大菱鲆C型溶菌酶及其构建和应用。
背景技术
溶菌酶（lysozyme），又称为胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，它能降解细菌细胞壁中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，从而破坏细胞壁，使得胞内容物释放，由此导致细菌死亡。根据其序列结构特点，溶菌酶可分为六大类，其中C型溶菌酶(C-type lysozyme)在动物中是一种主要类群，广泛存在哺乳动物、鸟类、鱼类等。溶菌酶是一种重要的天然免疫因子，在抗病原感染过程中发挥重要作用，因此在临床上，溶菌酶用于抗细菌和病毒感染以及消肿止痛等。另外，溶菌酶在食品工业中被用作防腐剂。
发明内容
本发明目的在于提供一种大菱鲆C型溶菌酶及其构建和应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种大菱鲆C型溶菌酶，溶菌酶为序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列所示。
大菱鲆C型溶菌酶的制备方法，
1）菌株BL21/pSmLysC的构建：
以大菱鲆cDNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增，PCR产物纯化后与载体pEASY-E2于室温连接2－8小时，连接混合液转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选转化子，即为BL21/pSmLysC；所述F1为5’-GATATCATGAAAGTCTTCGAACGCTGT-3’，R1为5’-GATATCCACACCACATCCTGCCAC-3’；
2）溶菌酶的表达和制备
将上述步骤1）的BL21/pSmLysC在含有安卡青霉素的LB培养基上培养至OD600为0.5,加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷使其终浓度达到1mM，28℃继续摇动培养5－6小时，而后用亲和层析柱纯化重组蛋白，即为SEQ IDNo.1中氨基酸序列所示。
大菱鲆C型溶菌酶的应用，所述溶菌酶可作为革兰氏阳性菌的抑菌剂。所述革兰氏阳性菌为藤黄微球菌（Micrococcus luteus）、海豚链球菌（Strep tococcus iniae）或金黄色葡萄球菌（Staphyl ococcus aureus）。
本发明具有如下优点：本发明的溶菌酶可以有效裂解多种革兰氏阳性菌，因而可以用于防控革兰氏阳性菌相关疾病。
附图说明
图1为本发明实施例纯化得到的溶菌酶电泳图谱（其中，纯化得到的溶菌酶为泳道2；泳道1：分子量marker。）。
图2为本发明实施例溶菌酶的杀菌效应例图（其中，图A为本发明实施例制备的溶菌酶产生的抑菌圈；图B为PBS阴性对照）。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。
在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法：
1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化、DNA片段从凝胶中回收皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相应试剂盒。
2.大肠杆菌用Hanahan方法（Sambrook and Russell:MolecularCloning:A Laboratory Mannual.Cold Spring Harbor Laboratory Press2001）；酵母转化按Invitrogen公司的方法（Catalog no.V175-20）；聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）按照Sambrook and Russell:MolecularCloning:A Laboratory Mannual.Cold Spring Harbor Laboratory Press2001。
3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“纽英伦生物技术有限公司”，北京。
实施例1
本发明的溶菌酶为序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列。
序列表SEQ ID No.1为：
MRCLLLLLLVPVPGAKVFERCEWARLLKRNGMSNYRGISLADWVCLSQWESSYNTRATNRNTDGSTDYGIFQINSRWWCDNGQTPTSNACGISCSALLTDDVGAAIICAKHVVRDPNGIGAWVAWKRHCQGQDLSSYVAGCGV
（a）序列特征：
●长度：143
●类型：氨基酸序列
●链型：单链
●拓扑结构：线性
（b）分子类型：蛋白质
（c）假设：否
（d）反义：否
（e）最初来源：大菱鲆
空间结构：该蛋白含有1个C型溶菌酶结构域，由氨基酸16－141构成。
实施例2
溶菌酶的制备方法：
1）菌株BL21/pSmLysC的构建：
以大菱鲆cDNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增。PCR条件为：94°C60s预变性模板DNA,然后94°C 40s,55°C 60s,72°C 60s,5个循环后改为94°C 40s,63°C 60s,72°C 60s,25个循环后再在72°C延伸反应7－10min。PCR产物纯化后与载体pEASY-E2（购于北京全式金生物技术有限公司）于室温连接2－8小时，连接混合液转化大肠杆菌BL21(DE 3)（购于天根生化科技(北京)有限公司），在含安卡青霉素(50ug/ml)、Xga l(40ug/ml)、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(24ug/ml)的LB培养基上培养18－24小时,筛选转化子，即为BL21/pSmLysC。
所述LB组成成分按重量百分比计：1.0％蛋白胨,0.5％酵母粉,1.0％氯化钠,97.5％蒸馏水。所述F1为5’-GATATCATGAAAGTCTTCGAACGCTGT-3’；R1为5’-GATATCCACACCACATCCTGCCAC-3’。
2）溶菌酶的表达和制备
将BL21/pSmLysC在含有卡那霉素的LB培养基中于37℃培养至OD600为0.5,加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷使其终浓度达到1mM，28℃继续摇动培养5－6小时，而后用GE Healthcare（美国）公司的nickel-nitrilotriacetic acid亲和层析柱纯化重组蛋白（层析条件：用4－5ml洗涤液洗柱两次，随后用0.5－1ml洗脱缓冲液洗柱，收集所有洗脱液）。将重组蛋白用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）分析，发现其分子量与表SEQ ID No.1中序列的G3BP分子量一致（参见图1）。将重组蛋白进行质谱分析，证实其与序列表SEQ ID No.1中序列一致。
上述洗涤液成分为：50mM NaH2PO4,300mM NaCl,20mM imidazole,pH8.0;上述洗脱缓冲液成分为：50mM NaH2PO4,300mM NaCl,250mM imidazole,pH 8.0.
实施例3
溶菌酶的杀菌检测
1）细菌平板制备。在LB培养基中培养内分别培养革兰氏阳性菌藤黄微球菌（Micrococcus luteus）、海豚链球菌（Streptococcus inie）(保存于CGMCC，编号为CGMCC 1984）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）（保存于CGMCC，编号为CGMCC 1.363）分别培养至OD600为0.5,将上述各菌种与含有0.8％（质量百分比）琼脂的LB混合；将混合液倒入培养皿，凝固后即为细菌平板。
2）溶菌酶的杀菌效应。将高压灭菌处理过的滤纸片（直径5mm）置于细菌平板上。将实施例2制备的溶菌酶在PBS中稀释至1mg/ml，将10ul溶菌酶或PBS（阴性对照）加至细菌平板的滤纸片上。将平板于28°C保温24－32h后观察发现，在含有溶菌酶的滤纸片周围形成明显的抑菌圈（即无细菌生长），而含有PBS的滤纸片周围则无抑菌圈（参见图2）。因此本发明的溶菌酶对于革兰氏阳性菌具有明显的杀菌效应，可望作为抑菌剂用于防治革兰氏阳性菌细菌性病害。
Figure IDA00002379841000011
Figure IDA00002379841000021

Claims (4)

1.一种大菱鲆C型溶菌酶，其特征在于：溶菌酶为序列表SEQ I D No.1中的氨基酸序列所示。
2.一种权利要求1所述的大菱鲆C型溶菌酶的制备方法，其特征在于：
1）菌株BL21/pSmLysC的构建：
以大菱鲆cDNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增，PCR产物纯化后与载体pEASY-E2于室温连接2－8小时，连接混合液转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选转化子，即为BL21/pSmLys C；所述F1为5’-GATATCATGAAAGTCTTCGAACGCTGT-3’，R1为5’-GATATCCACACCACATCCTGCCAC-3’；
2）溶菌酶的表达和制备
将上述步骤1）的BL21/pSmLysC在含有安卡青霉素的LB培养基上培养至OD600为0.5,加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷使其终浓度达到1mM，28℃继续摇动培养5－6小时，而后用亲和层析柱纯化重组蛋白，即为SEQ IDNo.1中氨基酸序列所示。
3.一种权利要求1所述的大菱鲆C型溶菌酶的应用，其特征在于：所述溶菌酶可作为革兰氏阳性菌的抑菌剂。
4.按权利要求3所述的大菱鲆C型溶菌酶的应用，其特征在于：所述革兰氏阳性菌为藤黄微球菌（Micrococcus luteus）、海豚链球菌（Streptococcus iniae）或金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。
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