CN102061291B

CN102061291B - 一种溶菌酶及其制备和应用

Info

Publication number: CN102061291B
Application number: CN201010544907A
Authority: CN
Inventors: 孙黎; 赵璐
Original assignee: Institute of Oceanology of CAS
Current assignee: Institute of Oceanology of CAS
Priority date: 2010-11-05
Filing date: 2010-11-05
Publication date: 2012-10-03
Anticipated expiration: 2030-11-05
Also published as: CN102061291A

Abstract

本发明涉及分子微生物学领域，具体的说是一种溶菌酶(lysozyme)及其制备和应用。溶菌酶为序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列所示。制备方法：以大菱鲆cDNA为模板PCR扩增溶菌酶基因，构建质粒pLysG；将pLysG转化酵母GS115，对转化子进行诱导表达后，收集上清，浓缩后即得溶菌酶。所述溶菌酶对多种革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌具有高效杀菌作用。本发明的酵母表达系统可以稳定高效地表达溶菌酶。

Description

一种溶菌酶及其制备和应用

技术领域

本发明涉及分子微生物学领域，具体的说是一种溶菌酶(lysozyme)及其制备和应用。

背景技术

溶菌酶(EC 3.2.1.17)，又名胞壁质酶(muramidase)，是一种糖苷水解酶，能降解细菌细胞壁中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1，4糖苷键，从而破坏细胞壁，使得细菌由于渗透溶解而死亡。溶菌酶广泛存在于各种生物中，包括人类、动物、植物、鸟类等。基于其抑菌效应，溶菌酶在多种生物中皆是重要的天然免疫因子，在抵抗细菌入侵过程中发挥作用。与其它抗菌因子相比，溶菌酶具有活性稳定、可以冷冻或干燥处理、抗菌谱广等优点，因此，溶菌酶在医学和食品工业中被用作抗感染物质和防腐剂。

发明内容

本发明目的在于提供一种溶菌酶及其制备和应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种溶菌酶：溶菌酶为序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列所示。

溶菌酶的制备：

1)质粒pLysG的构建：

以大菱鲆cDNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增。PCR产物纯化后与载体pBS-T于室温连接2-8小时，连接混合液转化大肠杆菌，筛选转化子提取质粒，即为质粒pBLysG

将上述质粒pBLysG和质粒pPIC9H分别用限制性内切酶EcoRV和SnaBI酶切，回收0.58kb和9.2kb片段，将这二片段用T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌，筛选转化子提取质粒，即为质粒pLysG；

2)溶菌酶的表达和制备

将上述步骤1)的质粒pLysG转化入酵母GS115内，在含有安卡青霉素的LB培养基上培养，筛选转化子即为GS115/pLysG；

将转化子GS115/pLysG进行诱导表达后，收集上清，将上清用UltraCentrifugal Filter Devices浓缩20-25倍后，浓缩后的上清即为序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列所示的溶菌酶。

所述步骤1)中F1为5’-GATATCATGGGTTATGCAAATATCAAGG-3’；R 1为5’-GATATCAAACCCATTCCTTTTGTACCA-3’。

溶菌酶的应用：所述序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列的溶菌酶可作为抑菌剂。

所述溶菌酶可作为革兰氏阳性或革兰氏阴性菌的抑菌剂。所述溶菌酶可作为哈氏弧菌、海豚链球菌、创伤弧菌或副溶血弧菌的抑菌剂。

本发明具有如下优点：

1.稳定表达。本发明的酵母表达系统可以稳定高效地表达溶菌酶。

2.广谱、高效抑菌作用。本发明的溶菌酶可以有效裂解多种革兰氏阳性和革兰氏阴性菌，因而可以用于防控细菌性疾病。

附图说明

图1为本发明实施例纯化得到的溶菌酶田永图谱(其中，纯化得到的溶菌酶为泳道2；泳道1：分子量marker。)。

图2为本发明实施例溶菌酶的杀菌效应图。(其中，图A为本发明实施例溶菌酶产生的抑菌圈；图B为PBS阴性对照)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。

在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法：

1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化、DNA片段从凝胶中回收皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相应试剂盒。

2.大肠杆菌用Hanahan方法(Sambrook and Russell：MolecularCloning：A Laboratory Mannual.Cold Spring Harbor Laboratory Press2001)；酵母转化按Invitrogen公司的方法(Catalog no.V175-20)；聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)按照Sambrook and Russell：Molecular Cloning：A Laboratory Mannual.Cold Spring HarborLaboratory Press 2001。

3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“纽英伦生物技术有限公司”，北京。

实施例1

本发明的溶菌酶为序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列。

序列表SEQ ID No.1为：

MGYANIKDVQTTGASWKTGQQDKLGYSGVEASHTMAETDSGRMSRYKSKIFNVGQKCGIDPALIAAIISRESRAGNVLHDGWGDWNPHRNAYNAWGLMQVDVNPSGGGHTAEGAWDSEVHLCQATGILVGFIGRIRNKFPGWSGEQHLKGGIAAYNMGDGNVHSYAEVDANTTGGDYSNDVVARAQWYKRNGF

(a)序列特征：

●长度：193

●类型：氨基酸序列

●链型：单链

●拓扑结构：线性

(b)分子类型：蛋白质

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：大菱鲆

空间结构：该蛋白预期含有4个主要α-螺旋结构，分别由氨基酸30-39，62-71，118-122，以及146-151构成；另外，该蛋白的48-178氨基酸区域形成一个可溶解性转糖酶(soluble lytictransglycosylase)结构域。

实施例2

溶菌酶的制备方法：

1)质粒pLysG的构建：

以大菱鲆cDNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增。PCR条件为：94℃ 60s预变性模板DNA，然后94℃ 40s，53℃ 60s，72℃ 60s，5个循环后改为94℃ 40s，58℃ 60s，72℃ 60s，25个循环后再在72℃延伸反应7-10min。PCR产物纯化后与载体pBS-T(购于“天根生化科技(北京)有限公司”)于室温连接2-8小时，连接混合液转化大肠杆菌后在含安卡青霉素(100ug/ml)、Xgal(40ug/ml)、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(24ug/ml)的LB培养基上培养18-24小时，筛选转化子提取质粒，即为质粒pBLysG。

将上述质粒pBLysG和质粒pPIC9H(质粒pPIC9H构建过程参见Zhang M，Hu Y，Sun L.Identification and molecular analysis of a novel C-type lectinfrom Scophthalmus maximus.Fish Shellfish Immunol 2010；29：82-8.)分别用限制性内切酶EcoRV和SnaBI酶切后回收0.58kb和9.2kb片段，将这二片段用T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌，在含安卡青霉素(100ug/ml)的LB培养基上培养18-24小时，筛选转化子提取质粒，即为pLysG。

所述LB组成成分按重量百分比计：1.0％蛋白胨，0.5％酵母粉，1.0％氯化钠，97.5％蒸馏水。所述F1为5’-GATATCATGGGTTATGCAAATATCAAGG-3’；R1为5’-GATATCAAACCCATTCCTTTTGTACCA-3’。

2)溶菌酶的表达和制备

将步骤1)的质粒pLysG转化到酵母GS115内(购于美国Invitrogen公司)，在含有安卡青霉素(100ug/ml)的LB培养基上培养，筛选转化子即为GS115/pLysG。将GS115/pLysG按Invitrogen公司提供的标准方法(Catalog no.V175-20)进行诱导表达后，收集上清。将上清用UltraCentrifugal Filter Devices(购于美国Millipore公司)浓缩20倍，浓缩后的上清部分即为序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列所示的溶菌酶。而后将其用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。结果表明浓缩液中含有高纯度的溶菌酶(参见图1)，其分子量与表SEQ ID No.1中序列的分子量一致。将浓缩后所得的溶菌酶进行N-端氨基酸测序，证实其序列与表SEQ ID No.1中序列一致。

实施例3

溶菌酶的杀菌检测

1)细菌平板制备。在LB培养基中培养内分别培养哈氏弧菌(保存于CGMCC，编号为CGMCC 1985)、海豚链球菌G26(保存于CGMCC，编号为CGMCC 1984)、创伤弧菌(保存于CGMCC，编号为CGMCC 1.1758)、副溶血弧菌(保存于CGMCC，编号为CGMCC 1.2164)分别培养至OD600为0.5，将上述各菌种与含有0.8％(质量百分比)琼脂的LB混合；将混合液倒入培养皿，凝固后即为细菌平板。

2)溶菌酶的杀菌效应。将高压灭菌处理过的滤纸片(直径5mm)置于细菌平板上。将实施例2制备的溶菌酶在PBS中稀释至1mg/ml，将10ul溶菌酶或PBS(阴性对照)加至细菌平板的滤纸片上。将平板于28℃保温32-48h后观察发现，在含有溶菌酶的滤纸片周围形成20-40mm直径的抑菌圈(即无细菌生长)，而含有PBS的滤纸片周围则无抑菌圈(参见图2)。因此本发明的溶菌酶具有强性杀菌效应，可作为抑菌剂用于防治细菌性病害。

Claims

1.一种溶菌酶，其特征在于：溶菌酶为序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列所示。

2.一种权利要求1所述的溶菌酶的制备，其特征在于：

1)质粒pLysG的构建：

2)溶菌酶的表达和制备

将转化子GS115/pLysG进行诱导表达后，收集上清，将上清用Ultra Centrifugal Filter Devices浓缩20-25倍后，浓缩后的上清即为序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列所示的溶菌酶。

所述步骤1)中F1为5’-GATATCATGGGTTATGCAAATATCAAGG-3’；R1为5’-GATATCAAACCCATTCCTTTTGTACCA-3’

3.一种权利要求1所述的溶菌酶的应用，其特征在于：所述序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列的溶菌酶作为抑菌剂。

4.按权利要求3所述的溶菌酶的应用，其特征在于：所述溶菌酶作为革兰氏阳性或革兰氏阴性菌的抑菌剂。

5.按权利要求4所述的溶菌酶的应用，其特征在于：所述溶菌酶作为哈氏弧菌、海豚链球菌、创伤弧菌或副溶血弧菌的抑菌剂。