CN104593279A - 一种基因工程菌及其应用 - Google Patents

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朱宁
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Abstract

本发明涉及一种基因工程菌，包括宿主细胞和转入宿主细胞的目的基因，其特征在于，所述目的基因为黄孢原毛平革菌溶解性多糖单加氧酶的编码基因。本发明还给出了所述的基因工程菌的构建方法以及在纤维素类原料降解中的应用。本发明所提供的基因工程菌具有较高的有CBM模块的溶解性多糖单加氧酶(溶解性多糖单加氧酶10320)分泌能力，其分泌能力能够达到1.39mg/ml，当将所述基因工程菌应用与纤维素类原料的降解处理中时，可以提高纤维素的降解速度和程度，提高葡萄糖的生成量，与内源性表达的黄孢原毛平革菌相比，提高近100倍。

Description

一种基因工程菌及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体的，涉及一种基因工程菌及其应用。
背景技术
多数情况下，要高值化利用纤维素首先必须通过多种不同的纤维素酶对其进行有效降解。目前大多数的商业操作都是将15-20种不同的酶组合到一起制成酶制剂，其中包括三种主要的纤维素酶：内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶(纤维二糖水解酶)和β-葡糖苷酶。内切葡聚糖酶先从纤维素分子内部随机分解糖苷键，产生非还原性末端后，纤维二糖水解酶与之结合，从非还原性末端水解产生纤维二糖，纤维二糖再成为β-葡糖苷酶的分解底物而被降解成可发酵的葡萄糖。除了主要的纤维素酶，商业酶制剂中还会包括一些发挥辅助作用的酶类，用来增强纤维素酶的水解能力。由于天然纤维素大多具有复杂的结晶性结构，纤维素酶等水解酶在作用于此类纤维素时酶制剂用量大、糖化效率低，所以开发具有不同机制的酶系提高纤维素酶的效力尤为重要。
溶解性多糖单加氧酶(Lytic polysaccharidemonooxygenase,LPMO)能通过氧化反应在纤维素的多糖链上添加氧基团使得其结构趋于松散更易断裂，为之后的进一步酶解提供基础。有研究发现，达到同样的水解转化率，添加溶解性多糖单加氧酶可以使纤维素酶用量减少一半。一些纤维素酶和半纤维素酶具有碳水化合物结合模块(Carbohydrate binding module,CBM)，它通过连接肽与催化结构域相连。天然木质纤维素的结构和化学性质非常复杂，所有纤维素酶作用于天然底物时都有不同程度的无效结合，而CBM可以通过靠近效应和靶标功能，特异性识别结合多糖底物，使催化结构域定位到目标底物附近，增加底物表面的有效酶浓度，提高纤维素酶的催化效率。
现有的具有内源性表达有CBM模块的溶解性多糖单加氧酶分泌能力的真菌往往具有酶分泌量很低并且不易分离纯化的缺陷，不能满足工业化生产的需求。目前，尚无具有CBM模块的溶解性多糖单加氧酶进行异源表达的报道。因此有必要开发一种具有较高的有CBM模块的溶解性多糖单加氧酶异源分泌能力的基因工程菌，从而提高纤维素类原料的处理效率，适应大规模工业化生产的需求。
发明内容
本发明的第一个目的在于克服现有技术中存在的有CBM模块的溶解性多糖单加氧酶内源性表达量低的缺陷提供一种具有CBM模块的溶解性多糖单加氧酶分泌能力高的基因工程菌。
本发明的第二个目的在于提供具有较高的有CBM模块的溶解性多糖单加氧酶分泌能力的基因工程菌的构建方法。
本发明的第三个目的在于提供所述基因工程菌的应用。
为了达到本发明的第一个目的，本发明提供了一种基因工程菌，包括宿主细胞和转入宿主细胞的目的基因，所述目的基因为黄孢原毛平革菌溶解性多糖单加氧酶的编码基因。
本发明的发明人在研究中发现，黄孢原毛平革菌的溶解性多糖单加氧酶(暂将其命名为：溶解性多糖单加氧酶10320，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示)是具有碳水化合物结合模块(CBM)的溶解性多糖单加氧酶，但是这种酶在黄孢原毛平革菌的内源性表达量低，不能适应于工业化生产的要求，为此，本发明的发明人研究提高溶解性多糖单加氧酶表达量的方法，从而提供了所述基因工程菌。
可选的，所述宿主细胞为酿酒酵母、汉森酵母或毕赤酵母。
可选的，所述宿主细胞为毕赤酵母GS115。
其中，所述基因工程菌内含有重组载体pPIC9K/Pc10320的核苷酸片段，所述Pc10320为SEQ ID NO：2所示的序列
本发明所提供的基因工程菌具有高的溶解性多糖单加氧酶10320分泌能力，并且所分泌的多糖单加氧酶10320能够对纤维素类原料进行高效的分解，葡萄糖释放量高。
为了达到本发明的第二个目的，本发明提供了基因工程菌的构建方法，所述方法包括以下步骤：
重组载体构建：以黄孢原毛平革菌的基因组cDNA为模板，利用SEQ ID NO：3所示的序列为上游引物，SEQ ID NO：4所示的序列为下游引物通过PCR反应获得PCR产物，再用SnaB I和Avr II对PCR产物和pPIC9K载体进行双酶切后连接获得重组载体pPIC9K/Pc10320；所述Pc10320为SEQ ID NO：2所示的序列。
重组载体的转化：利用大肠杆菌感受态细胞扩增所述重组表达载体并收集扩增产物，将所述扩增产物用Sac1进行酶切后转化宿主细胞获得基因工程菌。
为了达到本发明的第三个目的，本发明提供了基因工程菌在纤维素类原料降解中的应用。
可选的，所述应用包括微晶纤维素降解和农作物秸秆降解。
可选的，所述应用包括以下步骤：
将所述基因工程菌接种至培养基中培养至OD600＝2-6，加入诱导剂进行诱导表达，分离纯化获得溶解性多糖单加氧酶10320，与纤维素酶混合后降解微晶纤维素或农作物秸秆。
可选的，在酶解处理过程中，相对于100g的所述纤维素类原料，所述溶解性多糖单加氧酶10320的用量为8-12g。
可选的，所述培养基的组成成分为：酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、pH6.0的磷酸钾l00mM、YNB13.4g/L、生物素4×106g/L、甘油l0g/L。
可选的，诱导表达的条件为：在25-28℃，150-180rpm下培养，向培养基中添加100％甲醇至终浓度为1.0％；继续培养，每24小时添加甲醇至终浓度为1.0％，诱导72h后获得发酵液上清。
可选的，相对于100g的所述纤维素类原料，所述溶解性多糖单加氧酶10320的添加量为0.1-1g，纤维素酶的添加量为5-15g。
本发明所提供的基因工程菌具有较高的有CBM模块的溶解性多糖单加氧酶(溶解性多糖单加氧酶10320)分泌能力，相比于在毕赤酵母异源表达的PcGH61D(1.0mg/ml，The Putative endoglucanasePcGH61D from Phanerochaetechrysosporium is Is a Metal-DependentOxidative Enzyme that Cleaves Cellulose,Plos One,2011)其分泌能力能够达到1.39mg/ml，当将所述基因工程菌应用与纤维素类原料的降解处理中时，可以提高纤维素的降解速度和程度，提高葡萄糖的生成量，与内源性表达的黄孢原毛平革菌相比，提高近100倍。
附图说明
图l为目的基因DNA电泳图。
图中1为Marker，2为重组菌PCR扩增产物。
图2为毕赤酵母发酵液上清的SDS-PAGE电泳检测结果。
图中1为Marker，2为重组菌发酵液上清蛋白
图3为具有CBM模块的溶解性多糖单加氧酶促进微晶纤维素水解结果。
LPMO为：溶解性多糖单加氧酶10320
Cellulase为：纤维素酶Cellulase“Onozuka”R-10
Cellulase+LPMO为：纤维素酶Cellulase“Onozuka”R-10和溶解性多糖单加氧酶10320
图4为具有CBM模块的溶解性多糖单加氧酶促进秸秆降解结果。
LPMO为：溶解性多糖单加氧酶10320
Cellulase为：纤维素酶Cellulase“Onozuka”R-10
Cellulase+LPMO为：纤维素酶Cellulase“Onozuka”R-10和溶解性多糖单加氧酶10320
具体实施方式
下面将通过具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明提供了一种基因工程菌，包括宿主细胞和转入宿主细胞的目的基因，其特征在于，所述目的基因为黄孢原毛平革菌溶解性多糖单加氧酶10320；所述宿主细胞为酵母菌。
在本发明中，所述黄孢原毛平革菌溶解性多糖单加氧酶10320为一种具有碳水化合物结合模块(Carbohydrate binding module,CBM)的溶解性多糖单加氧酶，具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
在本发明所提供的基因工程菌中，所述宿主细胞可以为具有提高纤维素降解酶分泌量需求的菌株，一般的，所述宿主细胞为酵母菌。例如，所述酵母菌可以为酿酒酵母、汉森酵母或毕赤酵母，更优选的，所述宿主细胞为毕赤酵母GS115，毕赤酵母GS115具有高效分泌表达和高密度发酵等优点。
在本发明中，所述基因工程菌内含有重组载体pPIC9K/Pc10320的核苷酸片段。其中，所述Pc10320为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
所述Pc10320是以黄孢原毛平革菌的基因组cDNA为模板，利用SEQ ID NO：3所示的序列为上游引物，SEQ ID NO：4所示的序列为下游引物通过PCR反应获得的PCR产物。
所述pPIC9K为分泌型蛋白表达载体，载体大小为9276bp，启动子为AOX1，利用alpha因子分泌信号肽，在大肠杆菌中利用卡那抗性基因和氨苄抗性基因进行筛选，在毕赤酵母中利用HIS4进行筛选，多克隆位点包括SnaB I，EcoR I，Avr II和Not I。
在本发明的一种实施方式中，所述核苷酸片段为将表达载体pPIC9K与Pc10320连接后经SacⅠ酶切获得的核苷酸片段。
所述连接的方式为利用SnaB I和Avr II对Pc10320和pPIC9K载体进行双酶切后用T4DNA连接酶进行连接。
本发明还给出了所述的基因工程菌的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：
重组载体构建：以黄孢原毛平革菌的基因组cDNA为模板，利用SEQ ID NO：3所示的序列为上游引物，SEQ ID NO：4所示的序列为下游引物通过PCR反应获得PCR产物，再用SnaB I和Avr II对PCR产物和pPIC9K载体进行双酶切后连接获得重组载体pPIC9K/Pc10320；
重组载体的转化：利用大肠杆菌感受态细胞扩增所述重组表达载体并收集扩增产物，将所述扩增产物用Sac1进行酶切后转化宿主细胞获得基因工程菌。
其中，所述PCR反应体系如下：5×Phusion HF Buffer5μL，dNTPs(2.5mM)0.5μL，Phusion DNA Polymerase 0.25μL，Template1.5μL，5’primer(10μM)1.0μL，3’primer(10μM)1.0μL，ddH2O15.75μL。
所述PCR反应的条件为：
98℃预变性5min；然后进行98℃变性30s，61℃退火30s、72℃延伸30s，30次循环；72℃延伸l0min。
PCR反应结束后需要通过DNA纯化和浓缩步骤回收得到PCR产物，所述纯化和浓缩步骤可以按照本领域常规的方法进行，例如可以利用DNA纯化浓缩试剂盒，按照说明书中给出的步骤回收获得PCR产物。
本发明中，双酶切的目的是使得PCR产物和载体获得相同的粘性末端，以进行后续的连接步骤，连接的方法为在T4DNA连接酶的作用下4℃连接获得重组载体pPIC9K/Pc10320。
本发明所提供的构建方法还包括将所述重组载体转化入大肠杆菌中，具体的，将重组载体pPIC9K-Pc10320转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，获得重组菌，挑取重组菌单克隆，提取重组载体质粒。
在将重组载体pPIC9K-Pc10320转化入宿主细胞前，还包括用Sac Ⅰ进行酶切的步骤，其目的是促进重组载体pPIC9K-Pc10320有效整合进入宿主菌基因组。
酶切后的重组载体转化宿主细胞，在用MD培养基进行培养筛选后即可获得所述基因工程菌。在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为毕赤酵母GS115感受态细胞。
本发明对于转化的方法没有特别的限制，可以为本领域常规使用的转化方法，例如，可以为原生质体转化、电转化等。
在本发明中，所述MD培养基的配方为：13.4g/L YNB，4×106g/L生物素，10ml/L甲醇，18g/L琼脂。
本发明还提供了所述基因工程菌在纤维素类原料降解中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述应用包括微晶纤维素降解和农作物秸秆降解。具体的，本发明所述的应用包括将所述基因工程菌接种至培养基中诱导表达后从培养基中分离纯化获得溶解性多糖单加氧酶10320。
所述诱导表达可以按照以下步骤进行：
将所述基因工程菌接种于BMGY培养基中，28-30℃，150-180rpm培养至OD600＝2-6后收集菌体，用BMMY培养基重悬菌体，在25-28℃，150-180rpm下培养，向培养物中添加100％甲醇至终浓度为1.0％；继续培养，每24小时添加甲醇至终浓度为1.0％，诱导72h后获得发酵液上清；
其中，BMGY培养基中各组分的浓度为：酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、pH6.0的磷酸钾l00mM、YNB13.4g/L、生物素4×106g/L、甘油l0g/L；
对酶的分离纯化可以按照以下步骤进行：
1、将经0.45μm滤膜过滤的蛋白样品加入到Ni-NTA凝胶柱中，循环过柱3次；
2、用HIS缓冲液1(20mM Tris-HCl pH 8.0，500mM NaCl,20mM咪唑)洗柱子5个柱体积，收集样品待检测；
3、用HIS缓冲液2(20mM Tris-HCl pH 8.0，500mM NaCl,60mM咪唑)洗柱子10个柱体积，收集样品待检测；
4、用HIS缓冲液3(20mM Tris-HCl pH 8.0，500mM NaCl,300mM咪唑)洗柱子5个柱体积，收集样品待进行蛋白电泳检测。
在本发明中，酶解处理的条件可以为在40-50℃下反应60-72小时。
在所述应用中，相对于100g的所述纤维素类原料，所述溶解性多糖单加氧酶10320的添加量为0.1-1g，纤维素酶的添加量为5-15g。
在本发明的一种实施方式中，可以将诱导表达获得的上清液直接应用于纤维素类原料的降解，而不需要从发酵液中纯化蛋白。
其中，相对于100g的所述纤维素类原料，所述诱导表达获得的上清液的添加量为0.3-2.0g纤维素酶的添加量为5-15g。
下面通过实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出进是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本分发明进行各种修改和替换。
实施例1
本实施例用于说明本发明所提供的基因工程菌的构建方法。
取黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)菌丝，滤纸吸干水分，液氮研磨，按体积：质量比1:1加入GenStar公司的RNA提取试剂Trizol，振荡器振荡5min,室温静置1min；按体积：质量比0.2:1加入氯仿，振荡15s，静置2min，于4℃，12000rpm离心15min；吸取上清，按照体积比1:1加入异丙醇，-20℃沉淀30min；于4℃，12000rpm离心15min，倒掉上清，用1ml75％乙醇洗涤沉淀，于4℃，7500rpm离心5min，倒掉上清，干燥10min；加入DEPC水溶解，得到总RNA，用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA；以SEQ ID NO：3所示的序列为上游引物，SEQ ID NO:4所示的序列为下游引物，cDNA作为模板，用ABI公司的Phusion高保真酶进行PCR扩增；
PCR扩增的体系为：5×Phusion HF Buffer5μL，dNTPs(2.5mM)0.5μL，Phusion DNA Polymerase 0.25μL，Template 1.5μL，5’primer(10μM)1.0μL，3’primer(10μM)1.0μL，ddH2O 15.75μL。
反应条件：98℃预变性5min；然后进行98℃变性30s，61℃退火30s、72℃延伸30s，30次循环；72℃延伸10min；
用Zymo Research公司的DNA纯化和浓缩试剂盒DNA Clean &Concentrator(D4004)回收PCR产物，PCR产物用SnaB I和Avr II双酶切与用同样酶切的pPIC9K载体在T4DNA连接酶的作用下4℃连接，构建重组表达载体pPIC9K/Pc10320。
将重组载体pPIC9K-Pc10320转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，获得重组菌，挑取重组菌单克隆，提取质粒进行PCR扩增，产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图1所示，扩增产物中目的条带在1.5kb左右的克隆为阳性克隆，图1中，“1”为Marker，“2”为重组菌PCR扩增产物。
重组载体pPIC9K/Pc10320体用Sacl酶切后，分别电转化毕赤酵母GS115感受态细胞，获得基因工程菌，基因工程菌在28℃下用不含氨基酸的固体MD平板筛选。
MD平板培养基配方：13.4g/L YNB，4×106g/L生物素，10ml/L甲醇，18g/L琼脂。
实施例2
本实施例用于说明本发明所提供的基因工程菌的构建方法方法获得的有CBM模块的溶解性多糖单加氧酶分泌能力。
挑选实施例1获得的毕赤酵母基因工程单菌落于BMGY培养基中，28℃，150rpm培养至OD600＝2-6；收集菌体，用BMMY重悬菌体，使OD600＝1.0，向培养基中添加100％甲醇至终浓度为1.0％；每24小时添加甲醇至终浓度1.0％，24h后结束诱导，SDS-PAGE电泳检测诱导72h后发酵液上清。
BMGY培养基配方：10g/L酵母粉，20g/L蛋白胨，100mM pH6.0磷酸钾，13.4g/L YNB，4×106g/L生物素，l0g/L甘油。
BMMY培养基配方：10g/L酵母粉，20g/L蛋白胨，100mM pH6.0磷酸钾，13.4g/L YNB，4×106g/L生物素，10ml/L甲醇。
SDS-PAGE电泳结果如图2所示，在分子量35kDa处有明显的条带，表达量为0.78mg/ml。
实施例3
本实施例用于说明本发明所提供的基因工程菌在纤维素类原料降解中的应用。
在20g微晶纤维素为底物中加入2g纤维素酶和0.1g实施例2中获得的溶解性多糖单加氧酶10320，在50℃下反应72小时，葡萄糖释放量达11.5g/L，比单一添加纤维素酶(纤维素酶Cellulase“Onozuka”R-10)的葡萄糖释放量提高30％(图3)。
实施例4
本实施例用于说明本发明所提供的基因工程菌在纤维素类原料降解中的应用。
按照与实施例3相同的方法降解纤维素类原料，不同的是，以20g秸秆为底物，加入2g纤维素酶和0.1g实施例2中获得的溶解性多糖单加氧酶10320，在50℃下反应72小时，葡萄糖释放量达3.2g/L，比单一添加纤维素酶(纤维素酶Cellulase“Onozuka”R-10)的葡萄糖释放量提高20％结果见图4。
实施例5
本实施例用于说明本发明所提供的基因工程菌在纤维素类原料降解中的应用。
在20g微晶纤维素为底物中加入2g纤维素酶和0.3g实施例2中获得的含有溶解性多糖单加氧酶10320的发酵液上清，在50℃下反应72小时，葡萄糖释放量达9.8g/L，比单一添加纤维素酶(纤维素酶Cellulase“Onozuka”R-10)的葡萄糖释放量提高12％。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种基因工程菌，包括宿主细胞和转入宿主细胞的目的基因，其特征在于，所述目的基因为黄孢原毛平革菌溶解性多糖单加氧酶的编码基因。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述宿主细胞为酿酒酵母、汉森酵母或毕赤酵母；优选为毕赤酵母；更优选的，所述宿主细胞为毕赤酵母GS115。
3.根据权利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌内含有重组载体pPIC9K/Pc10320的核苷酸片段，所述Pc10320为SEQ ID NO.2所示的序列。
4.权利要求1-3中所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
重组载体构建：以黄孢原毛平革菌的基因组cDNA为模板，利用SEQ ID NO：3所示的序列为上游引物，SEQ ID NO：4所示的序列为下游引物通过PCR反应获得PCR产物，再用SnaB I和Avr II对PCR产物和pPIC9K载体进行双酶切后连接获得重组载体pPIC9K/Pc10320；
重组载体的转化：利用大肠杆菌感受态细胞扩增所述重组表达载体并收集扩增产物，将所述扩增产物用SacⅠ进行酶切后转化宿主细胞获得基因工程菌。
5.权利要求1-3中所述的基因工程菌或者根据权利要求4所述的构建方法构建获得的基因工程菌在纤维素类原料降解中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用包括微晶纤维素降解和农作物秸秆降解。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
将所述基因工程菌接种至培养基中培养至OD600为2-6，加入诱导剂进行诱导表达，分离纯化获得溶解性多糖单加氧酶10320，与纤维素酶混合后降解微晶纤维素或农作物秸秆。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述培养基的组成成分为：酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、pH6.0的磷酸钾l00mM、YNB13.4g/L、生物素4×106g/L、甘油l0g/L。
9.根据权利要求5-8中任意一项所述的应用，其特征在于，诱导表达的条件为：在25-28℃，150-180rpm下培养，向培养基中添加100％甲醇至终浓度为1.0％；继续培养，每24小时添加甲醇至终浓度为1.0％，诱导72h后获得发酵液上清。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，相对于100g的所述纤维素类原料，所述溶解性多糖单加氧酶10320的添加量为0.1-1g，纤维素酶的添加量为5-15g。
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